CN109425666A - 一种酰氯衍生物的lc-ms分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种采用LC‑MS测定酰氯衍生物的方法，使用N,N‑二异丙基乙二胺作为衍生试剂检测酰氯衍生物，衍生反应快速完成。所述方法的特征是采用以十八烷基硅烷键合相作为固定相的色谱柱；流动相由A相和B相组成，其中以缓冲盐溶液与有机溶剂的混合物作为A相，以有机溶剂作为B相，在液相色谱‑质谱联用仪系统中进行梯度洗脱。本发明提供的方法具有高效、便捷、专属性好、灵敏度高等优点。

Description

一种酰氯衍生物的LC-MS分析方法

技术领域

本发明属于医药化工领域，更具体地涉及一种用LC-MS测定酰氯化合物的方法。

背景技术

酰氯是指含有-C(O)Cl官能团的化合物，属于酰卤的一类，是羧酸中的羟基被氯替换后形成的羧酸衍生物，酰氯非常不稳定。

常有的检测方法中，滴定法：仅用于常量化学分析方法，对于微量物质无法达到检测的要求。

气相色谱法：酰氯具有较强的反应活性，易对色谱柱的填料造成损害，直接进样对色谱柱的伤害很大；同时烷基酰氯分子量较大，沸点较高，不适用用顶空进样的方法进行分析；另外，烷基酰氯不稳定，易水解或酯化，利用气相色谱法进行检测误差相对较大。同时对于检测限度很低的样品，检测器灵敏度无法达到要求，常应用于微量分析中限度较高的物质。

液相色谱法：对于检测限度很低的样品，检测器灵敏度无法达到要求，常应用于微量分析中限度较高的物质。

气相-质谱联用法：常用分子量较小的醇如甲醇、乙醇将酰氯酯化后再检测，当检测限度很低时，衍生反应在常温下反应较慢，酰氯转化率相对较低，衍生产物的碎片离子不能确定，干扰因素较大，方法重现性较差。

液相-质谱联用法：对于检测限度要求<1.5的烷基酰氯类化合物，目前没有合适的衍生试剂使衍生产物在LC-MS中有较好的响应值。

为了检测化合物中残留烷基酰氯化合物的含量，需要开发出一种有效检测烷基酰氯化合物的方法。

发明内容

发明概述

N,N-二异丙基乙二胺中带有一个叔胺基团和一个氨基，其作为衍生试剂，在衍生反应中氨基提供活泼氢，可与酰氯化合物快速反应生成酰氯的衍生物酰胺，而衍生物的叔胺基团在LC-MS中有很强的响应值，这样，使酰氯化合物检测限很低，极大地提高了灵敏度。

本发明所述的分析方法能够有效分离检测酰氯衍生物，进而有效分离检测烷基酰氯化合物，具有分离度好，灵敏度高，操作方便等优点。

术语定义

术语“AR”是指分析纯度。

LC-MS指液相-质谱联用法。

RSD指相对标准偏差。

术语“不对称因子”是指在HPLC检测中，用于考察峰形对称性的参数，体现色谱柱效能；在液相色谱法中，当不对称因子在0.8～1.2之间认为峰形较好。

术语“约”在本发明中是指在涉及数值的±10％以内。

发明详述

本发明提供一种用LC-MS测定酰氯衍生物的方法，其通过N,N-二异丙基乙二胺作为衍生试剂与待检样品中的酰氯进行衍生反应得到衍生物酰胺，然后检测衍生物含量进而测得酰氯的含量。

在一些实施例中所述的待检样品中的酰氯结构式为

其中R为取代的或未取代的C₁-C₃₀的烷基，取代的或未取代的C₁-C₃₀的氧烷基，取代的或未取代的C₃-C₁₀的环烷基，取代的或未取代的C₆-C₁₄的芳基，取代的或未取代的C₁-C₉的杂芳基，

以上所述各烷基、环烷基、环烷基、芳基、杂芳基，分别任选地被一个或多个选自F、Cl、Br、I、CN、N₃、NO₂、氨基、羟基和巯基的取代基所取代。

在一些实施例中所述的衍生剂为N,N-二异丙基乙二胺，结构式为

在一些实施例中的衍生反应为

本发明提供的用LC-MS测定酰氯衍生物的方法，所述方法的特征还包括：采用以十八烷基硅烷键合相作为固定相的色谱柱；流动相由A相和B相组成，其中以缓冲盐溶液作为A相，以有机溶剂作为B相，将待检样品在液相色谱-质谱联用仪系统中进行梯度洗脱。

本发明所述的十八烷基硅烷键合相作为固定相的色谱柱可以选自不同厂家的色谱柱，在一些实施例中所述色谱柱是Waters XBridge^TM C18，2.1*150mm，3.5μm。

在一些实施例中，本发明所述的一种用LC-MS测定酰氯衍生物的方法，其特征是：

色谱柱：Waters XBridge^TM C18，2.1*150mm，3.5μm；

流动相A相为缓冲盐溶液和有机溶剂的混合溶液，缓冲盐溶液和有机溶剂的体积比为约8:2～10:1；B相为有机溶剂；

色谱柱柱温：不控制；

流速：0.1～1.0ml/min；

检测器：质谱检测器；

质谱条件：电喷雾离子源，正离子检测，SIM模式，提取离子数为衍生产物质量数，检测器停止时间为4min，干燥气温度350℃、干燥气流速12.0L/min、雾化气压力2329Torr、毛细管电压3500V(+)。

本发明所述有机溶剂可以是选自甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈和四氢呋喃中的一种或几种。

在一些实施例中有机溶剂为乙腈。

本发明所述缓冲盐可以是选自甲酸、乙酸、草酸、盐酸和三氟乙酸中的一种或几种。

在一些实施例中，缓冲盐溶液为0.1％三氟乙酸水溶液。

在一些实施例中，本发明所述的方法是将待检样品采用梯度洗脱程序进行的，其中梯度洗脱程序如下表1所示：

表1

本发明所述的一种酰氯衍生物的LC-MS分析方法中，

空白溶液/稀释液的配置方法为：取定量N,N-二异丙基乙二胺，至容量瓶中，摇匀即得；

对照品溶液的配置方法为：取定量对照品，精密称定，至容量瓶中，用二氯甲烷溶解并定容，摇匀即得；

检测限溶液的配置方法为：精密移取对照品溶液至容量瓶中，用稀释液定容，摇匀即得。

待检样品溶液：取定量待检样品，精密称定，至容量瓶中，用稀释液定容，摇匀即得。

本发明所述的一种酰氯衍生物的LC-MS分析方法中，含量计算公式为：

式中：A_i为待检样品溶液中测得待测溶剂的峰面积；

A_S为对照品溶液中测得待测溶剂峰面积的平均值；

W_T为待检样品溶液的称样量，mg；

W_S为配制对照品溶液所称取待测溶剂的质量，mg；

D_T为待检样品溶液的稀释倍数；

D_S为对照品溶液的稀释倍数。

在一些实施方式中，本发明所述的一种酰氯衍生物的LC-MS分析方法中，

色谱柱：Waters XBridge^TM C18，2.1*150mm，3.5μm；

流动相A：0.1％三氟乙酸水溶液；

流动相B：乙腈；

洗脱方式：梯度洗脱，

梯度程序如下：

流速：0.3mL/min；进样体积：1μL；检测器：质谱检测器；

质谱条件：电喷雾离子源，正离子检测，SIM模式，提取离子数为衍生产物质量数，检测器停止时间为4min，干燥气温度350℃、干燥气流速12.0L/min、雾化气压力2329Torr、毛细管电压3500V；

按色谱条件，空白溶液进1针，对照溶液进3针，待检样品溶液进2针，记录色谱图。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例对本发明作进一步的详细说明。

本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。

本发明所使用的分析试剂及溶液符合中国药典2010版附录的要求，另有说明的除外。

以下实施例中，供试品即待检样品。

实施例1利托那韦中氯甲酸乙酯残留方法验证

仪器、试剂、对照品及供试品：

仪器：十万分之一分析天平，液相色谱-质谱联用仪；

试剂：二氯甲烷(HPLC级别)；

对照品：氯甲酸乙酯(AR级别)

衍生剂：N,N-二异丙基乙二胺

供试品：利托那韦

溶液配制：

空白溶液/稀释液：取N,N-二异丙基乙二胺约20mg，至25ml容量瓶中，摇匀；取适量，至液相小瓶中；

对照品母液1：取氯甲酸乙酯约39.06mg(限度为1.25)，精密称定，至50mL容量瓶中，用二氯甲烷溶解并定容，摇匀；

对照品母液2：精密移取1.0mL对照品母液1至50mL容量瓶中，用二氯甲烷定容，摇匀；

对照品母液3：精密移取1.0mL对照品母液2至50mL容量瓶中，用二氯甲烷定容，摇匀；

对照品溶液：精密移取1.0mL对照品母液3至25mL容量瓶中，加入约20mg N,N-二异丙基乙二胺，用二氯甲烷定容，摇匀；

供试品溶液：取供试品约50mg，精密称定，至5mL容量瓶中，用稀释液定容，摇匀。平行配制2份。

方法参数

色谱柱：Waters XBridgeTM C18(2.1*150mm，3.5μm)；

流动相A：0.1％三氟乙酸水溶液(将1mL的三氟乙酸加入1000mL的超纯水中，使充分溶解、摇匀、过滤、超声10min脱气即得)；

流动相B：乙腈(ACN)；

洗脱方式：梯度洗脱；

流动相比例：

流速：0.3mL/min；柱温：不控制；进样体积：1μL；检测器：质谱检测器；

质谱条件：电喷雾离子源，正离子检测，SIM模式，提取离子数为衍生产物质量数，检测器停止时间为4min，干燥气温度350℃、干燥气流速12.0L/min、雾化气压力2329Torr、毛细管电压3500V(+)。

系统适用性

溶液配制：

空白溶液：配制方法同上述空白溶液配制方法，配制1份；

对照品溶液：配制方法同上述对照溶液配制方法，配制1份；

检测限溶液：精密移取3.0mL对照品溶液至100mL容量瓶中，用稀释液定容，摇匀；

操作；

待系统平衡后，取上述各溶液按上述方法参数描述的色谱条件，空白溶液和检测限溶液各进1针，对照品溶液进3针，记录色谱图。报告检测限溶液中各待测杂质的信噪比(S/N)；对照品溶液第一针中N,N-二异丙基乙基氨基甲酸乙酯峰与邻近峰的分离度，连续进样3针的各待测杂质的峰面积、峰面积均值及其RSD值。

检测结果

表2系统适用性结果

专属性

溶液配制：

空白溶液：配制方法同上述空白溶液配制，配制1份；

对照品溶液：配制方法同上述对照溶液配制，配制1份；

供试品溶液：配制方法同上述供试品溶液配制，配制1份；

供试品加标溶液：取供试品约50mg，精密称定至5mL容量瓶中，用对照品溶液溶解并定容，即得100％供试品加标溶液，平行配制3份；

操作

在系统适用性合格的前提下，取上述各溶液按上述方法参数描述的色谱条件，每份各进1针，记录色谱图。报告空白溶液、对照品溶液、供试品溶液、供试品加标溶液中各待测杂质的保留时间、峰面积及与邻近峰的分离度；按照以下公式计算供试品加标溶液的单个回收率，并计算回收率均值及其RSD值。

理论量＝C_S×V

式中：C_S为供试品加标溶液中加入的各杂质对照品溶液的浓度，μg/mL；

V为供试品加标溶液中加入的各杂质对照品溶液的体积，mL；

C_S+T为供试品加标溶液中测得的各杂质残留量；

C_i为供试品溶液中测得的各杂质残留量；

为供试品溶液中测得的各杂质残留量的平均值；

A_i为供试品溶液中各杂质峰面积；

A_S为3针对照品溶液中各杂质峰面积的平均值；

A_S+T为供试品加标溶液中各杂质的峰面积；

W_T为供试品溶液中供试品的称样量，mg；

W_S为对照品溶液中各杂质的称样量，mg；

W_S+T为供试品加标溶液中供试品的称样量，mg；

D_T为供试品溶液的稀释倍数；

D_S为对照品溶液的稀释倍数；

D_S+T为供试品加标溶液中供试品的稀释倍数。

检测结果

表3专属性结果

表4回收率结果

检测限

溶液配制：

空白溶液：配制方法同上述空白溶液配制，配制1份；

检测限溶液：配制方法上述检测限溶液配制，配制1份。

操作

在系统适用性合格的前提下，取空白溶液进样1针，检测限溶液连续进样3针，记录色谱图。报告检测限溶液中各待测杂质的峰面积、信噪比(S/N)；计算各待测杂质检测限浓度及该浓度相当于供试品溶液浓度的百分比。

检测结果

表5检测限结果

耐用性

溶液配制：

对照品溶液：配制方法同上述对照品溶液配置，配制1份；

检测限溶液：配制方法同上述检测限溶液配置，配制1份；

供试品加标溶液：配制方法同上述供试品溶液配置，配制1份。

操作

取配制好的对照品溶液、检测限溶液、和100％供试品加标溶液置于样品盘中，在室温条件下放置。按方法描述的色谱条件分别于表格中所示时间各进样1针。计算各时间点N,N-二异丙基乙基氨基甲酸乙酯峰面积与0h峰面积比值。

检测结果

表6溶液稳定性结果

实施例2阿齐沙坦酯中氯甲酸乙酯残留含量测定

仪器、试剂、对照品及供试品

仪器：十万分之一分析天平，液相色谱-质谱联用仪；

试剂：二氯甲烷(HPLC)；

对照品：氯甲酸乙酯(AR)

衍生剂：N,N-二异丙基乙二胺

供试品：阿齐沙坦

溶液配制

(1)空白溶液/稀释液：取N,N-二异丙基乙二胺约20mg，至25ml容量瓶中，加入二氯甲烷定容摇匀；取适量，至液相小瓶中；

(2)对照品母液1：取氯甲酸乙酯约37.5mg，精密称定，至10mL容量瓶中，用二氯甲烷溶解并定容，摇匀；

(3)对照品母液2：精密移取1.0mL对照品母液1至100mL容量瓶中，用二氯甲烷定容，摇匀；

(4)对照品母液3：精密移取1.0mL对照品母液2至100mL容量瓶中，用二氯甲烷定容，摇匀；

(5)对照品溶液：称取约20mg N,N-二异丙基乙二胺加入25ml容量瓶中，用对照品母液3定容，摇匀；

(6)供试品溶液：取供试品约100mg，精密称定，至10mL容量瓶中，用稀释液定容，摇匀。平行配制2份。

操作

待系统平衡后，取上述各溶液按实施例1参数方法描述的色谱条件，空白溶液进1针，对照溶液进3针，供试品溶液进2针，记录色谱图，根据峰面积归一化法计算氯甲酸乙酯含量。

含量计算公式：

式中：A_i为供试品溶液中测得待测溶剂的峰面积；

A_S为对照品溶液中测得待测溶剂峰面积的平均值；

W_T为供试品溶液的称样量，mg；

W_S为配制对照品溶液所称取待测溶剂的质量，mg；

D_T为供试品溶液的稀释倍数；

D_S为对照品溶液的稀释倍数。

检测结果

表7氯甲酸乙酯含量检测结果

结论

样品中氯甲酸乙酯的含量为33.35ppm。

实施例3雷迪帕韦中氯甲酸甲酯残留含量测定

仪器、试剂、对照品及样品

仪器：十万分之一分析天平，液相色谱-质谱联用仪；

试剂：二氯甲烷(HPLC)；

对照品：氯甲酸甲酯(AR)

衍生剂：N,N-二异丙基乙二胺

供试品：雷迪帕韦起始物料N-(甲氧羰基)-L-缬氨酸

溶液配制

(1)空白溶液/稀释液：取N,N-二异丙基乙二胺约20mg，至25ml容量瓶中，加入二氯甲烷定容摇匀；取适量，至液相小瓶中；

(2)对照品母液1：取氯甲酸甲酯约156.25mg，精密称定，至50mL容量瓶中，用二氯甲烷溶解并定容，摇匀；

(3)对照品母液2：精密移取1.0mL对照品母液1至50mL容量瓶中，用二氯甲烷定容，摇匀；

(4)对照品溶液：精密移取1.0mL对照品母液2至100mL容量瓶中，加入约20mgN,N-二异丙基乙二胺，用二氯甲烷定容，摇匀；

(5)供试品溶液：取供试品约250mg，精密称定，至10mL容量瓶中，用稀释液定容，摇匀。平行配制2份。

操作

待系统平衡后，取上述各溶液按实施例1参数方法描述的色谱条件，空白溶液进1针，对照溶液进3针，供试品溶液进2针，记录色谱图，根据峰面积归一化法计算氯甲酸甲酯含量。

检测结果

表8氯甲酸甲酯含量检测结果

结论

样品中氯甲酸乙酯的含量为0.06ppm。

本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。

Claims (10)

1.一种用LC-MS测定酰氯衍生物的方法，其特征是：通过衍生试剂与待检样品中的酰氯衍生反应得到衍生物；再采用以十八烷基硅烷键合相作为固定相的色谱柱；流动相由A相和B相组成，其中以缓冲盐溶液与有机溶剂的混合物作为A相，以有机溶剂作为B相；在液相色谱-质谱联用仪系统中进行梯度洗脱，并记录谱图。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的衍生试剂为N,N-二异丙基乙二胺。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述的所述待检样品中的酰氯结构为：

其中R为取代的或未取代的C₁-C₃₀的烷基，取代的或未取代的C₁-C₃₀的氧烷基，取代的或未取代的C₃-C₁₀的环烷基，取代的或未取代的C₆-C₁₄的芳基，取代的或未取代的C₁-C₉的杂芳基。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的色谱柱是Waters XBridge^TM C18，2.1*150mm，3.5μm。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈和四氢呋喃中的至少一种。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述的缓冲盐选自甲酸、乙酸、草酸、盐酸和三氟乙酸中的至少一种。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，缓冲盐溶液和有机溶剂的体积比为8:2～10:1。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述流动相的流速为0.1ml/min-1.0ml/min。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述方法是采用梯度洗脱程序进行的，其中梯度程序见下表：

10.根据权利要求1-9任一所述的方法，其特征是：

色谱柱：Waters XBridge^TM C18，2.1*150mm，3.5μm；

流动相A：0.1％三氟乙酸水溶液；

流动相B：乙腈；

洗脱方式：梯度洗脱，

梯度程序如下：

流速：0.3mL/min；进样体积：1μL；检测器：质谱检测器；

质谱条件：电喷雾离子源，正离子检测，SIM模式，提取离子数为衍生产物质量数，检测器停止时间为4min，干燥气温度350℃、干燥气流速12.0L/min、雾化气压力2329Torr、毛细管电压3500V；

按色谱条件，空白溶液进1针，对照溶液进3针，待检样品溶液进2针，记录色谱图。