JP6970983B2 - 脳のアミロイドベータ蓄積鑑別用血中バイオマーカー - Google Patents

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Description

本願は、アルツハイマー性認知症原因物質であるアミロイドベータの脳沈着に対する血液バイオマーカーに関するものである。
脳のアミロイドベータが蓄積されて発生する代表的な疾患であるアルツハイマー病またはアルツハイマー性認知症（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ＡＤまたはＡＤＤ）は、認知症のうち最も一般的な形態であって、代表的な神経退行性疾患である。８０才以上の老人の２０％以上がアルツハイマー病の影響を受けていると推定されて、高齢化社会になるにつれその数が急激に増加している。アルツハイマー病は、アミロイド前駆体タンパク質（ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＡＰＰ）がβ、γ−セクレターゼによって順次切断されて生成されるβ−アミロイド（Ａβｐｅｐｔｉｄｅ）が脳組織に沈着される老人班（ｓｅｎｉｌｅ ｐｌａｑｕｅ）と微小管関連タンパク質であるタウ（Ｔａｕ）タンパク質の過リン酸化による神経線維の塊り（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅ：ＮＴＦ）が主な病理学的特徴である。アルツハイマー病患者の脳組織で起きる変化は、環境及び様々な病因学的な要因によるものであって、まだ明確な診断方法と治療療法がない。
現在、最も一般的なＡＤ診断方法としては、ＭＲＩ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ）、ＰＥＴ（ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）等のイメージ方法や、ミニ−認知状態検査（Ｍｉｎｉ ｍｅｎｔａｌ ｓｔａｔｅ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ：ＭＭＳＥ）、問診等の間接的な方法が用いられているが、ＭＭＳＥによる診断は、年齢、学力などによりその結果が変わるので、診断の正確性が問題になっている。ＭＲＩ及びＰＥＴは、費用が高い短所がある。またＡＤ患者の脳組織から老人班及び神経線維の塊りの２種類の病変を確認する方法も用いられているが、疾病を診断したり、進行程度を確実に把握できる方法は知られていない。
ＡＤ診断のための生化学的診断マーカーを探すための研究は、重要な研究分野であって血液、脳脊髄液などの体液を含む様々な組織において行われている。脳脊髄液（ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ：ＣＳＦ）は、脳の細胞の外部の部分と直接接触する部位で、脳のタンパク質変化を反映していて、正常老人に比べてアルツハイマー病患者のＣＳＦでＡβ４２濃度の減少、全体タウと自己リン酸化タウの増加などが報告されている。しかし、大部分のＡＤ患者が６５才以上の高齢であることを考慮すると、脳脊髄液を得るための腰椎穿刺（ｌｕｍｂｅｒ ｐｕｎｃｔｕｒｅ）の場合、相当な危険を伴う。
アルツハイマー性認知症の原因物質であり、病気の進行に応じて脳に蓄積されるアミロイドベータに対して特異的に結合する物質で近年開発されたＰｉｔｔｓｂｕｒｇｈ ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｂ（ＰＩＢ）は、アルツハイマー性認知症の診断に有用な物質である。ＰＩＢを投与した後、ＰＥＴ映像を取ることによって脳のアミロイドベータの蓄積程度を測定して、これをアルツハイマー性認知症の診断に効率的に利用することができるためである。しかし、この診断方法は、高費用と装備の制限性のために普遍的なアルツハイマー性認知症の診断方法で用いるのに限界がある。
これと比較して採取の相対的な容易性、検査の経済性、時間節約などを考慮すると、血液診断マーカーは、多くの長所がある。血液診断マーカーは、アルツハイマー病進行に応じた脳の機能的病理的変化をよく反映すべきである反面、アルツハイマー病進行に応じた様々な脳タンパク質の変化が常に血液内で感知はできないため、診断マーカーの発掘の困難を受けている。また、大慨のアルツハイマー病の進行に応じて増減する脳タンパク質が、脳脊髄液や血液内では逆の増減傾向性を示すことが通常の現象である。例えば、アルツハイマー病の進行に応じて脳アミロイドベータ４２（Ａβ４２）は増加する反面、脳脊髄液アミロイドベータ４２は減少し、トランスサイレチンは、脳では増加し血液では減少すると知られている（Ｓｃｈｅｕｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２，８６４−８７０（１９９６）；Ｇａｌａｓｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ ５５（７）：９３７−４５（１９９８）；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ３１（３５）：１２４８３−１２４９０（２０１１）；及びＨａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ２５（１）７７−８４（２０１１））。
特許文献１は、アルツハイマー病早期診断用タンパク質性マーカーに関し、ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ｂｅｔａ及びａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ（Ｉｓｏｆｏｒｍ Ｌｏｎｇ）及びｒｅｇｕｃａｌｃｉｎを利用したアルツハイマー病早期診断用マーカーを開示する。
特許文献２は、ビタミンＤ結合タンパク質を利用したアルツハイマー病の診断装置及び診断方法に関し、ビタミンＤ結合タンパク質と結合する抗体を利用した診断方法及び装置について開示する。
特許文献３は、認知障害疾患診断用多重マーカー及びその用途に関し、認知障害疾患診断マーカーとして、トランスサイレチン（Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ）、ＡｐｏＥ、アルファ―シヌクレイン（α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）、ビタミンＤ結合タンパク質、ニューログラニン（ｎｅｕｒｏｇｒａｎｉｎ）、ビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、スタスミン（ｓｔａｔｈｍｉｎ）、コンタクチン（ｃｏｎｔａｃｔｉｎ）、及びＨＤＬ−コレステロールを開示している。
しかし、アルツハイマー病は早期診断が難しく、病症が進行されると社会的費用が多くかかる正常生活が難しい深刻な疾患であることを考慮すると、血液のような手軽な試料によりアルツハイマー病の早期診断を含むアルツハイマー重症度診断だけでなく症状が現れる前である前臨床（ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ）段階でも診断できる新しいマーカーの開発の必要性がある。
近年盛んに行われる研究によって様々なアルツハイマー性認知症診断の血液バイオマーカー候補物質が発掘されているが、各バイオマーカーは、敏感度と正確性において要求基準を満たせずにいるのが現状である。
大韓民国公開特許第２０１２−００４１８２３号公報 大韓民国公開特許第２０１０−００４９３６３号公報 大韓民国公開特許第２０１４−００４２３３１号公報
本願は、血液を利用して脳のアミロイドベータプラーク蓄積の有無の予測またはこれと関連した疾患を診断することができるバイオマーカーを提供しようする。
一様態において本願は、Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＡＣＨＥ（Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）、ＴＳＰ−１（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１）、血漿アミロイドベータ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ（Ｌｅｃｔｉｎ、ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ、ｓｏｌｕｂｌｅ３ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）及びＡＣＥ（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｉ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）で構成される群から選択される一つ以上のマーカーの血液から検出用用途であって、
前記マーカー中血漿アミロイドベータ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＡＣＥ及びＡＣＨＥは、認知機能正常群の脳アミロイドベータ蓄積の有無検出用であり、前記マーカー中血漿アミロイドベータ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＡＣＥ、Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ及びＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎは、軽度認知障害患者群の脳アミロイドベータ蓄積の有無検出用であり、前記マーカー中血漿アミロイドベータ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ及びＡＣＥは、認知機能正常群及び軽度認知障害患者群を含む非認知症群の脳アミロイドベータ蓄積の有無検出用であり、前記マーカー中血漿アミロイドベータ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＡＣＥ及びＴＳＰ−１は、非認知症群及びアルツハイマー性認知症を含む認知症群を含む全周期における脳アミロイドベータ蓄積の有無検出用である。
別の様態において本願は、前記マーカーの検出用物質を含むアミロイドベータ蓄積の有無検出用組成物、キットまたは方法を提供する。
一実現例において本願に係るマーカーで前記血漿アミロイドベータはＭＰＰで処理されたものである。
一実現例において本願に係るマーカーは、血液特に血漿から検出することができる。
一実現例において本願に係るマーカーは、前記マーカーに追加してＡｐｏＥを追加で含むことができる。
一実現例において本願に係るマーカーが用いられる認知障害正常群は、特にＡＣｈＥＩ（抑制剤）未服用群である。
一実現例において本願に係るマーカーは、前記マーカーに追加して血液検査の通常の項目である燐、遊離Ｔ３及び／またはＨＤＬコレステロールをマーカーとして追加で含むことができる。
別の様態において本願に係るマーカーは、脳アミロイドベータ蓄積と関連した疾患の診断またはＰＩＢ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｂ）−ＰＥＴ（ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）検査が必要であるか否かの判断に用いられて、前記脳アミロイドベータ蓄積疾患は、アミロイドベータ蓄積による疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病認知症、レビー小体型認知症、ハンチントン病認知症、または前臨床アルツハイマー病、ダウン症候群、または認知障害を含むが、これに制限しない。
一実現例において本願に係るマーカーはさらに、アミロイドベータ蓄積疾患診断は、認知障害重症度判断に使用することができる。
別の様態において本願は、さらに脳アミロイドベータ蓄積の有無の検出が必要な検査対象者由来の血液サンプルを提供する段階；前記血液サンプルでＰｅｒｉｏｓｔｉｎ、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＡＣＨＥ（Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）、ＴＳＰ−１（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１）、血漿アミロイドベータ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ（Ｌｅｃｔｉｎ、ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ、ｓｏｌｕｂｌｅ３ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）及びＡＣＥ（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｉ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）で構成される群から選択される一つ以上のマーカーを定量する段階で、前記マーカー中血漿アミロイドベータ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＡＣＥ及びＡＣＨＥは認知機能正常群を対象者血液、前記マーカー中ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＡＣＥ、Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ及びＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ軽度認知障害患者群対象者血液、前記マーカー中血漿アミロイドベータ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ及びＡＣＥは、認知機能正常群及び軽度認知障害患者群血液、前記マーカー中血漿アミロイドベータ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＡＣＥ及びＴＳＰ−１は、全周期患者群の血液試料で脳アミロイドベータ蓄積の有無を検出して；
そして前記定量された各マーカーの量を前記対象者の脳アミロイドベータ蓄積の有無と関連させる段階を含む、血液で脳アミロイドベータ蓄積検出方法を提供する。
本願に係る方法で関連させる段階は、対照群で決定された定量結果と比較して、前記Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎは増加、ＬＧＡＬ、ＡＣＥ、ＡＣｈＥ、ＴＳＰ１、及びＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎはいずれも減少する場合、前記血液が由来された対象者は、アミロイドベータが蓄積されたと判断する段階を追加で含む。
本願に係る前記方法は、さらに脳アミロイドベータ蓄積に関連した疾患の診断、またはＰＩＢ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｂ）−ＰＥＴ（ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）検査が必要であるか否かの判断または認知障害重症度判断に使用することができる。
一実現例において本願に係る方法でマーカーは、さらに脳アミロイドベータ蓄積疾患診断は、認知障害重症度判断に使用することができる。
一実現例において本願に係る方法でマーカーは、血液特に血漿で検出することができる。
一実現例において本願に係る方法でマーカーは、前記マーカーに追加してＡｐｏＥを追加で含むことができる。
一実現例において本願に係る方法でマーカーが用いられる認知障害正常群は、特にＡＣｈＥＩ（抑制剤）未服用群である。
さらに別の様態において、本願は血液で脳アミロイドベータ蓄積の有無検出用Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＡＣＨＥ（Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）、ＴＳＰ−１（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１）、血漿アミロイドベータ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ（Ｌｅｃｔｉｎ、ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ、ｓｏｌｕｂｌｅ３ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）及びＡＣＥ（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｉ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）で構成される群から選択される一つ以上のバイオマーカーであって、前記マーカー中血漿アミロイドベータ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＡＣＥ及びＡＣＨＥは、認知機能正常群の脳アミロイドベータ蓄積の有無検出用で、前記マーカー中血漿アミロイドベータ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＡＣＥ、Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ及びＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎは、軽度認知障害患者群の脳アミロイドベータ蓄積の有無検出用で、前記マーカー中血漿アミロイドベータ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ及びＡＣＥは、認知機能正常群及び軽度認知障害患者群を含む非認知症群の脳アミロイドベータ蓄積の有無検出用で、前記マーカー中血漿アミロイドベータ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＡＣＥ及びＴＳＰ−１は非認知症群及びアルツハイマー性認知症群を含む認知症群を含む全周期で脳アミロイドベータ蓄積の有無検出用である、脳アミロイドベータ蓄積検出用バイオマーカーを提供する。
一実現例において、血漿アミロイドベータは、ＭＰＰで処理されたものである、脳アミロイドベータ蓄積検出用バイオマーカーを提供する。
一実現例において各認知機能正常群は、ＡＣｈＥ抑制剤非服用者である、脳アミロイドベータ蓄積検出用バイオマーカーを提供する。
一実現例において、各認知機能正常群、軽度認知障害患者群、非認知症群及び認知症群の脳アミロイドベータ蓄積の有無検出用マーカーは、ＡｐｏＥを追加で含むものである、脳アミロイドベータ蓄積検出用バイオマーカーを提供する。
一実現例において前記各認知機能正常群、軽度認知障害患者群、非認知症群及び認知症群の脳アミロイドベータ蓄積の有無検出用マーカーは、燐、ＨＤＬ（Ｈｉｇｈ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）及び遊離Ｔ３（ｆｒｅｅ ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ）中一つ以上のマーカーを追加で含むものである、脳アミロイドベータ蓄積検出用バイオマーカーを提供する。
一実現例において前記脳アミロイドベータ蓄積は、脳アミロイドベータ蓄積に関連した疾患の診断、またはＰＩＢ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｂ）−ＰＥＴ（ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）検査が必要であるか否かの判断に用いられて、前記脳アミロイドベータ蓄積疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病認知症、レビー小体型認知症、ハンチントン病認知症、または前臨床アルツハイマー病、ダウン症候群、または認知障害を含むものである、脳アミロイドベータ蓄積検出用バイオマーカーを提供する。
一実現例において前記脳アミロイドベータ蓄積に関連した疾患の診断は、認知障害重症度判断を含むものである、脳アミロイドベータ蓄積検出用バイオマーカーを提供する。
本願に係るバイオマーカーは、アルツハイマー性認知症原因物質であるアミロイドベータの脳蓄積を早期に血液で簡便かつ迅速に検出することができる。
脳のアミロイドベータの蓄積は、認知症や健忘症などの臨床的症状が現れる１５〜２０年前から始まるので、臨床的症状がなかったりまたは軽微な臨床的症状を示す患者の血液検査を介して脳アミロイドベータ蓄積の有無を確認できる本願に係るマーカーは、アルツハイマー認知症を早期に検出できることはもちろん、早期にその進行を遅らせたり防げて、患者の生活の質を画期的に改善することができる。
さらに、本願に係るマーカーは、認知機能程度に応じて細分化された患者群、つまり認知機能正常群、軽度であるか障害群、アルツハイマー性認知症群及び全周期群に応じて、より有効な組み合わせで構成されることができて、これを利用して正確度及び有効性がより向上する。
さらに、近年脳映像で脳アミロイドベータの蓄積を確認できる一部の大学病院だけで施行できる高価な検査であるＰＩＢ−ＰＥＴ映像に代わり、または検査が必要な患者のスクリーニングなどに効果的に使用することができる。従って、脳アミロイドベータの蓄積を血液で簡便に確認できる本願に係る血液バイオマーカーは、患者の便利性及び費用削減の側面においても効果が非常に大きい。
血液で本願のバイオマーカー検出による脳アミロイドベータ蓄積の有無鑑別のために確立されたモデルを図式的に示したもので、図１Ａは、本願でマーカー発掘試料別アミロイドベータ蓄積を撮影したＰＥＴ映像結果で、ＰＥＴ映像結果は、脳アミロイドベータ蓄積を測定する標準方法で、血液バイオマーカーと脳のベータの蓄積と関連があるか確認することができる。図１Ｂ及び図１Ｃは、細分化された患者群によるモデル別マーカーを示したものである。ＰＩＢ−ＰＥＴプロトンでＰｅｒｉｏｓｔｉｎは増加、ＬＧＡＬ、ＡＣＥ、ＡＣｈＥ、ＴＳＰ１、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎはいずれも減少する。これは、ＰＩＢ−ＰＥＴ結果と本願に係るマーカーの高い関連性を示すもので、本願に係るマーカーが、脳のアミロイドベータ蓄積に有用に用いられることを示すものである。 モデル１で認知機能正常群（ＣＮ）における脳アミロイドベータ蓄積群（ＣＮ中Ａベータ＋ ｖｓ Ａベータ−）鑑別結果を示す。 図２Ａと同様であるが、燐（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ）を追加のバイオマーカーで用いた結果である。 モデル２で軽度認知障害患者群（ＭＣＩ）における脳アミロイドベータ蓄積群（ＭＣＩ中Ａベータ＋ ｖｓ Ａベータ−）鑑別結果を示す。 図３Ａと同様であるが、燐を追加のバイオマーカーで用いた結果である。 モデル３で重症認知症でない患者群（ＣＮとＭＣＩ）における脳アミロイドベータ蓄積群（ＣＮ＋ＭＣＩ中Ａベータ＋ ｖｓ Ａベータ−）鑑別結果を示す。 図４Ａと同様であるが、燐を追加のバイオマーカーで用いた結果である。 モデル４で全周期におけるアミロイド蓄積群（認知機能関係なく全対象者でＡベータ＋ ｖｓ Ａベータ−）鑑別結果を示す。 図５Ａと同様であるが、ＨＤＬコレステロール及び遊離Ｔ３（ｆｒｅｅ ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ）を追加のバイオマーカーで用いた結果である。 認知機能正常群（ＣＮ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー性認知症群（ＡＤＤ，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｄｅｍｅｎｔｉａ）、及び全周期（ＰＩＢ− ｖｓ ＰＩＢ＋）血液でＬＧＡＬＳ３ＢＰをＥＬＩＳＡで定量した実験結果である。これは、ＬＧＡＬＳ３ＢＰの定量値を認知機能正常群、軽度認知障害、アルツハイマー性認知症群、及び全周期で各々脳アミロイドベータの蓄積陰性群（−）と陽性群（＋）を比較した時、有意な変化が見られるので、本願に係るモデル１乃至４に共に使用することができること示す。また、このような定量値は、ロジスティック回帰式を利用して統合的指数（実施例２参照）算出及びＲＯＣカーブ分析による特異性、敏感度及びＡＵＣ値決定に用いられた。 認知機能正常群（ＣＮ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー性認知症群（ＡＤＤ）、及び全周期（ＰＩＢ− ｖｓ ＰＩＢ＋）血液でＡＣＥをＥＬＩＳＡで定量した実験結果である。これは、ＡＣＥの定量値を認知機能正常群、軽度認知障害、アルツハイマー性認知症群、全周期で各々脳アミロイドベータの蓄積陰性群（−）と陽性群（＋）を比較した時、軽度認知障害及び全周期で有意な変化が見られ、正常群、アルツハイマー性認知症群で減少傾向が見られるので、本願に係るモデル１乃至４に共に使用することができることを示す。また、このような定量値は、ロジスティック回帰式を利用して統合的指数（実施例２参照）算出及びＲＯＣカーブ分析による特異性、敏感度及びＡＵＣ値決定に用いられた。 認知機能正常群（ＣＮ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー性認知症群（ＡＤＤ）、及び全周期（ＰＩＢ− ｖｓ ＰＩＢ＋）血液でＴＳＰ−１をＥＬＩＳＡで定量した実験結果である。これは、ＴＳＰ−１の定量値が認知機能正常群、軽度認知障害、アルツハイマー性認知症群、全周期で各々脳アミロイドベータの蓄積陰性群と陽性群を比較した時、全周期で有意な変化が見られたので、本願に係るモデル４に使用することができることを示す。また、このような定量値は、ロジスティック回帰式を利用して統合的指数（実施例２参照）算出及びＲＯＣカーブ分析による特異性、敏感度及びＡＵＣ値決定に用いられた。 認知機能正常群（ＣＮ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー性認知症群（ＡＤＤ）、及び全周期（ＰＩＢ− ｖｓ ＰＩＢ＋）の血液でＡＣｈＥをＥＬＩＳＡで定量した実験結果である。これは、ＡＣｈＥの定量値が認知機能正常群（ＣＮ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー性認知症群（ＡＤＤ）、全周期で各々脳アミロイドベータの蓄積陰性群（−）と陽性群（＋）を比較した時、正常群で有意な変化が見られたので、本願に係るモデル１に使用することができることを示す。また、このような定量値は、ロジスティック回帰式を利用して統合的指数（実施例２参照）算出及びＲＯＣカーブ分析による特異性、敏感度及びＡＵＣ値決定に用いられた。ＡＣｈＥ抑制剤（ＡＣｈＥＩ）未服用グループを用いた。半分以上のＭＣＩ患者やほぼすべてのＡＤ患者がＡＣｈＥ抑制剤を服用しているので、ＡＣｈＥは特異認知機能正常群のマーカーとして有用である。ＡＣｈＥ抑制剤を服用している場合、脳アミロイド蓄積によって血中ＡＣｈＥの濃度変化があるかを確認しにくく、認知機能正常群ではＡＣｈＥ抑制剤を服用しなかったので脳アミロイド蓄積との関連性を確認することができる。 認知機能正常群（ＣＮ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー性認知症群（ＡＤＤ）、及び全周期（ＰＩＢ− ｖｓ ＰＩＢ＋）血液でＭＰＰ−アミロイドベータをＥＬＩＳＡで定量した実験結果である。これは、ＭＰＰアミロイドベータ４０及び４２の定量値が正常群、軽度認知障害、アルツハイマー性認知症群、全周期で各々脳アミロイドベータの蓄積陰性群（−）と陽性群（＋）を比較した時、４２／４０比率が正常群及び全周期で有意な変化が見られたので、本願に係るモデル１乃至４に使用することができることを示す。また、このような定量値は、ロジスティック回帰式を利用して統合的指数（実施例２参照）算出及びＲＯＣカーブ分析による特異性、敏感度及びＡＵＣ値決定に用いられた。
本願は、認知機能及びＰＩＢ−ＰＥＴ映像により６つのグループの患者群で大規模コホート個別検証を実施して脳のアミロイドベータ沈着または蓄積と有意的に相関関係を示すＰｅｒｉｏｓｔｉｎ、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＡＣＨＥ（Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）、ＴＳＰ−１（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１）、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ（Ｌｅｃｔｉｎ、ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ、ｓｏｌｕｂｌｅ３ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）及びＡＣＥ（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｉ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）のバイオマーカー発掘を基にしている。さらに前記マーカーは、各細分化された患者に応じてより有効な組み合わせで構成されることができて、これを利用して正確度と有効性が向上した患者群別血中バイオマーカーの利用が可能になり、正常群、認知軽度障害群またはすべてのグループで使用可能な、脳にアミロイドが蓄積されたかを予測できるマーカーである。
そこで一様態においてＰｅｒｉｏｓｔｉｎ、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＡＣＨＥ（Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）、ＴＳＰ−１（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１）、血漿アミロイドベータ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ（Ｌｅｃｔｉｎ、ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ、ｓｏｌｕｂｌｅ３ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）及びＡＣＥ（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｉ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）で構成される群から選択される一つ以上のマーカーのアミロイドベータ蓄積の有無鑑別または判断用用途に関する。
このような用途は、前記マーカーをイン・ビトロまたはイン・ビボで検出できる検出用物質を含む組成物、キットの形態、または前記マーカー自体を含む組成物の形態、または前記マーカーを利用したアミロイドベータ蓄積検出方法の形態で具現することができる。
今までアミロイドベータプラーク蓄積の有無検出または予測は、アミロイドベータプラークの蓄積の検出は、アルツハイマー性認知症患者の死後脳組織検査によって確認されており、アルツハイマー性認知症を確診した。近年脳映像で脳アミロイドベータの蓄積を確認できるＰＩＢ−ＰＥＴなどの技術が開発されたが、これはかなり高価な検査で一部の大学病院だけで施行できる高価な装備であり、患者にも様々な不便を与える。従って脳アミロイドベータの蓄積を確認できる本願に係る血液バイオマーカーは、その重要性が非常に大きい。
脳アミロイドベータの蓄積は、認知症や健忘症などの臨床的症状が現れる１５〜２０年前から始まるので臨床的症状がないかまたは軽微な臨床的症状を示す患者の血液検査を介して脳アミロイドベータ蓄積の有無を確認できるのであれば、アルツハイマー認知症を早期診断できて早期にその進行を遅らせたり防ぐことができる。また、脳アミロイドベータが蓄積されなかったアルツハイマー病患者と確認できて、このような患者に対する治療戦略を異なるようにすることができる。
また本願に係るマーカーを利用した脳のアミロイドベータ蓄積検出は、さらにアミロイドベータが蓄積されて発生する疾患の診断に使用することができる。
具体的に、脳にアミロイドベータが蓄積されて発生する様々な疾患が知られていて（Ｈｅａｄ，Ｅ．，ａｎｄ Ｌｏｔｔ，Ｉ．Ｔ.（２００４） Ｄｏｗｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｎｄ ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｌ １７；Ｐｒｉｍａｖｅｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９９９） Ｂｒａｉｎ Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ ｉｎ Ｎｏｎ−Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ；Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．，（２００１） ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｅｎｈａｎｃｅ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｅｆｉｃｉｔｓ ｉｎ ａ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｌｉｎｋｉｎｇ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ）、従って本願に係るマーカーはさらに脳アミロイドベータ蓄積に関連した様々な疾患の診断、検出などに使用することができる。
一実現例においてこのような脳アミロイドベータ蓄積に関連した疾患は、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病認知症、レビー小体型認知症、ハンチントン病認知症、または前臨床アルツハイマー病、ダウン症候群、または認知障害を含む。
本願において「認知障害」とは、神経退行性疾患をいい、例えばアルツハイマー（ＡＤ：Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ）性認知症、パーキンソン病認知症、レビー小体型認知症またはハンチントン病認知症、アルツハイマー性認知症症状（ＡＤＤ）保有群、認知症に進行される前段階である弱い認知機能障害、つまり軽度認知障害（ＭＣＩ：Ｍｉｌｄ Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）を含むもので、このような意味で認知症または非認知症患者群をともに含むことができる。このような認知障害の重症度は、ＭＭＳＥ（Ｍｉｎｉ ｍｅｎｔａｌ ｓｔａｔｅ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ，２００６＿Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２００８＿Ｏ’Ｂｒｙａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ）スコアなどのような方法で分類することができる。
本願において「認知症」とは、アルツハイマー病、パーキンソン病認知症、レビー小体型認知症、またはハンチントン病認知症を含む。
本願において「非認知症」とは、認知機能正常群及び軽度認知障害群を含む。
本願において「認知機能正常群」とは、アミロイドベータ蓄積の有無と関係なく、上述したＭＭＳＥなどの検査を介して認知機能が正常に判別された群を意味する。認知機能が正常な場合でも、認知機能低下なく脳アミロイドベータ蓄積がある正常なヒトを含む。アミロイドベータが脳に蓄積されている場合には、軽度認知障害を経て認知症に進行され得るため、認知機能正常群におけるアミロイドベータ蓄積の有無を判別することは認知症の早期発見に大変重要である。
本願において「軽度認知障害群」とは、認知機能低下があるが、日常生活が可能な認知症の前段階であって、脳アミロイドベータ蓄積がない患者及びベータ蓄積がある患者であって認知機能低下があるが日常生活が可能な認知症の前段階を含む。
このような側面で認知機能の低下程度に応じて、認知機能正常群、軽度認知障害群及びアルツハイマー性認知症症状（ＡＤＤ）保有群を含む認知症群の順に認知機能の低下程度が深刻化される。
本願において認知症患者群は、認知機能低下があり、アルツハイマー性認知症症状（ＡＤＤ）保有群、認知症と診断された患者であって脳アミロイドベータ蓄積がない患者はもちろん認知機能低下があり認知症と診断された患者であって脳アミロイドベータ蓄積がある患者を含む。
本願において「全周期」とは、認知症と診断される過程に達するまでのすべての患者群を含むもので、認知機能正常群、軽度認知障害群及び認知症患者群を含む。またＰＩＢ−ＰＥＴ陽性及び陰性患者をともに含む。
本願に係る一実現例において特に、認知症はアルツハイマー性認知症である。
本願において「アルツハイマー性認知症」または「アルツハイマー病」とは、神経退行性脳疾患で記憶力を含む認知機能の弱化が徐々に進行される病気で、ＡＤまたはＡＤＤ（アルツハイマー性認知症）とも呼ばれる。これは、臨床症状が現れる前である前臨床（ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ）アルツハイマー病だけでなく、認知症に進行される前段階である弱い認知機能障害つまり軽度認知障害を含むことができる。大多数のアルツハイマー病患者の脳には、神経班（あるいは老人班）または神経線維束が生成されるが、神経班（あるいは老人班）は、アミロイドベータタンパク質の沈着と神経線維束はタウタンパク質（ｔａｕ ｐｒｏｔｅｉｎ）の過リン酸化、炎症反応、酸化的損傷のためであると知られている。前記前臨床アルツハイマー病は、臨床的所見は見られないが脳のアミロイドプラーク沈着が現れる段階をいう。
本願において「アミロイドベータプラーク」または「ベータアミロイドプラーク」とは、アミロイドベータを含む不溶性繊維性タンパク質凝集体であり、本願においてＡ−ベータとも表記されて、主成分は、Ａ−ベータ４０またはＡ−ベータ４２である。一実現例においては、前記アミロイドプラークは、細胞内、細胞表面に、及び／または細胞の間の空間に存在するものであり得る。特に、神経組織の細胞の間の空間に存在するものであり、アルツハイマー認知症診断の標識物質として用いられて、プラークの蓄積程度に係る認知症診断は開示されたものを参考にすることができる（Ｍａｗｕｅｎｙｅｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１０＿Ｑｕｅｒｆｕｒｔｈ ａｎｄ ＬａＦｅｒｌａ，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ）。文脈によりアミロイドベータプラークをアミロイドベータと称することができ、これは当業者が容易に判断できる。
本願において用語「診断」とは、特定疾病または疾患に対するあるオブジェクトつまり検査対象者の感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を判定すること、あるオブジェクトが特定疾病または疾患を現在有しているが否かを判定すること、特定疾病または疾患にかかった一つのオブジェクトの予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）を判定することまたはセラメトリックス（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ）（例えば、治療効能に対するインフォメーションを提供するためにオブジェクトの状態をモニタリングすること）を含む。
本願において「早期診断」とは、軽度認知障害、または臨床症状が現れる前である前臨床（ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ）段階で診断することを含む。
本発明において用語「診断用マーカーまたは診断マーカー（ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｍａｒｋｅｒ）」とは、アルツハイマー病を正常と区分して診断できる物質で、適切な対照群に比べて疾患を有する対象者の血液で増加様子を示すタンパク質などを含む。本願に係るマーカー中Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎは、アミロイドベータプラークの蓄積と共に、血中濃度が増加して、ＬＧＡＬ、ＡＣＥ、ＡＣｈＥ、ＴＳＰ１、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎは、アミロイドベータプラークの蓄積と共に、血中濃度が減少する（図６乃至図１０参照）。本願において前記マーカーに加えて追加で用いられるマーカーは、正常対照群またはＰＩＢ−ＰＥＴ陰性対象者の結果と比較して、血液の燐、Ｆｒｅｅ Ｔ３濃度は低くなり、ＨＤＬ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌの濃度は有意的に高くなる。
本願に係るマーカーＰｅｒｉｏｓｔｉｎ、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＡＣＨＥ、ＴＳＰ−１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ及びＡＣＥは、タンパク質及び核酸配列、細胞内プロセッシング、変形などは、下記の表１のように公示されており、当業者なら、前記マーカーの検出に必要な配列及び検出方法を容易に選択することができる。
Figure 0006970983
本願に係るマーカー中血漿アミロイドベータは、血漿前処理組成物（ＭＰＰ）は、プロテアーゼ抑制剤及びフォスファターゼ抑制剤を混合した混合物（Ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）で処理されたものである。これに対して、元の発明者が出願した大韓民国公開特許第２０１６−０１２９４４４号に詳細に開示されたのを参照することができる。
本願に係るマーカーは、特に血液試料から検出される。血液試料は、認知症の診断に用いられる脳脊髄液のような試料と比較して、非常に容易に得ることができ、費用の削減はもちろん便利性がかなり増大する。本願に係るマーカーが用いられる検体は、血栓、血小板、血漿または血清試料を含むが、これに制限されない。一実現例においては血漿が用いられる。本願に用いられる検体は、比較分析のために、診断または検出が必要な検査対象者の検体はもちろん、正常対照群、特定疾患を有する対照群由来の検体がさらに使用することができる。
本願のマーカーは、特に認知機能低下程度に応じて細分化された患者つまり、認知機能正常群、認知軽度障害群または全周期群に係るマーカーで組み合わせられ、正確度と有効性が向上した患者群別検出が可能である。
一実現例において本願に係るマーカー中アミロイドベータ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＡＣＥ及びＡＣＨＥは、認知機能正常群の脳アミロイドベータ蓄積の有無検出に用いられる。一実現例において、特にＡＣＨＥマーカーは、ＡＣＨＥ抑制剤未服用患者に用いられる。
別の実現例において本願に係るマーカー中アミロイドベータ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＡＣＥ、Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ及びＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎは、軽度認知障害患者群の脳アミロイドベータ蓄積の有無検出に用いられる。
さらに別の実現例において本願に係るマーカー中血漿アミロイドベータ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ及びＡＣＥは、認知機能正常群及び軽度認知障害患者群を含む非認知症群の脳アミロイドベータ蓄積の有無検出に用いられる。
さらに別の実現例において本願に係るマーカー中血漿アミロイドベータ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＡＣＥ及びＴＳＰ−１は、非認知症群及び認知症群を含む全周期の脳アミロイドベータ蓄積の有無検出に用いられる。
さらに別の実現例において血漿アミロイドベータ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＡＣＥ及びＴＳＰ−１は、非認知症群及び認知症群を含む全周期の脳アミロイドベータ蓄積の有無検出に用いられる。
さらに別の実現例において本願に係るマーカーは、前記各群の検出マーカーに、後述するＡｐｏＥ遺伝子型検査を追加で含むことができる。
さらに別の実現例において、本願に係るマーカーは、前記各群の検出マーカーに、後述する通常の血液検査で測定する項目である、燐、遊離Ｔ３及び／またはＨＤＬコレステロールを追加のマーカーで含むことができる。このようなマーカーは、ＡｐｏＥの存在または不在下に使用することができる。
また本願のマーカーは、認知障害の発病及び進行程度に対する指標になることができ、発病、疾患の進行程度、疾患の診断または予後に利用することができる。
従って別の側面で本願は、上述したような本願に係るマーカーまたはマーカーの組み合わせをアミロイドベータプラーク蓄積の予測、早期診断、またはＰＩＢ−ＰＥＴ映像検査が必要であるかを決めるのに使用することができる。例えば、本願に係るマーカーを利用した血液検査で脳にアミロイドベータが蓄積されなかったと判断された場合は、ＰＩＢ−ＰＥＴ映像を検査する必要がなく、蓄積されたと判断された場合は、確診のためにＰＩＢ−ＰＥＴ映像検査をすることができる。
本願によると、アルツハイマー性認知症の診断に広く用いられるＰＩＢ−ＰＥＴの脳映像結果に基づいたアルツハイマー性認知症の原因物質として知られるアミロイドベータプラーク蓄積結果と本願に係る血液マーカーの濃度が、高い関連性があることが明らかになった。つまりＰＩＢ−ＰＥＴ陽性対象者では、ＰＩＢ−ＰＥＴ陰性対象者の結果と比較して、血液で本願に係るマーカーの濃度が有意に増加または減少することが明らかになった。つまり図１Ａを参照すると、ＰＩＢ−ＰＥＴプロトンでＰｅｒｉｏｓｔｉｎは増加、ＬＧＡＬ、ＡＣＥ、ＡＣｈＥ、ＴＳＰ１、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎはいずれも減少する。これは本願に係るマーカーが脳のアミロイドベータ蓄積に有用に使用することができることを示すものである。本願で前記マーカーに加えて追加で用いられるマーカーは、正常対照群またはＰＩＢ−ＰＥＴ陰性対象者の結果と比較して、血液の燐、Ｆｒｅｅ Ｔ３濃度は低くなり、ＨＤＬ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌの濃度は有意に高くなる。
本願で用語「検出試薬」とは、本願に係るマーカーを検出または定量することができる試薬で、例えば本願のマーカーをタンパク質及び／または遺伝子またはｍＲＮＡのような核酸レベルで検出できる物質であるか、その他の場合、本願実施例に記載されたのを参照することができる。
本願で検出とは、定量及び／または定性分析を含むもので、存在、不存材の検出及び発現量検出を含むものでありこのような方法は当業界に公示されていて、下記の実施例を含む本願の記載を考慮して当業者なら本願の実施のために適切な方法を選択することができるはずである。例えば本願に係る各マーカーの検出方法は、例えば本願実施例に記載された方法を参考にすることができる。
例えばタンパク質レベルの検出方法及び試薬は、公示されており、例えば抗原-抗体反応、前記マーカーに特異的に結合する基質、前記マーカーと特異的に相互作用する受容体またはリガンドまたは補助因子との反応を介して検出することができる。前記本願のマーカーと特異的に相互作用または結合する試薬または物質は、チップ方式またはナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）と共に使用することができる。一実現例において抗原−抗体反応を酵素免疫吸着分析法（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＲＩＡ）、サンドイッチ免疫測定法（ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ）、ポリアクリルアミドゲルによるウェスタンブロット、イムノドットブロット分析法（Ｉｍｍｕｎｏ ｄｏｔ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｓｓａｙ）、免疫蛍光測定法（Ｉｍｍｕｎｏ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ，ＩＦＡ）、免疫発光測定法（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ）、免疫組織化学染色法または免疫クロマトグラフィー測定法（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｒａｐｉｄ）、ビーズやディスクを利用した抗原抗体反応（Ｘ−ＭＡＰ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）等を用いて行われることができる。
本願の一実現例によると、本願に係る組成物は、マーカーをタンパク質レベルでの検出に必要な試薬を含む。例えば、前記タンパク質レベルで検出できる試薬は、モノクルローナル抗体、ポリクルローナル抗体、基質、アプタマー、受容体、リガンドまたは補助因子などを含むことができる。このような試薬は、必要な場合、ナノ粒子またはチップに統合して用いることができる。
本願の別の実現例によると、検出試薬は抗体を含み、本願のマーカーの検出は、これに特異的に結合する抗体分子を利用して実施される。
本願に利用できる抗体は、ポリクルローナルまたはモノクルローナル抗体であり、好ましくはモノクルローナル抗体である。抗体は、当業界で通常実施される方法、例えば、融合方法（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６：５１１−５１９（１９７６））、組換えＤＮＡ方法（米国特許第４８１６５６号）またはファージ抗体ライブラリー方法（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８，１−５９７（１９９１））により製造することができる。抗体製造に対する一般的な過程は、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９；Ｚｏｌａ，Ｈ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９８４；及びＣｏｌｉｇａｎ，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ，１９９１に詳細に記載されていて、前記文献は本明細書に参照として組み込まれる。
別の様態において本願は、脳アミロイドベータ蓄積の有無の検出が必要な検査対象者由来の血液サンプルを提供する段階；前記血液サンプルでＰｅｒｉｏｓｔｉｎ、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＡＣＨＥ（Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）、ＴＳＰ−１（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１）、血漿アミロイドベータ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ（Ｌｅｃｔｉｎ，ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ，ｓｏｌｕｂｌｅ３ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）及びＡＣＥ（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｉ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）で構成される群から選択される一つ以上のマーカーを定量する段階で、前記マーカー中血漿アミロイドベータ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＡＣＥ及びＡＣＨＥは、認知機能正常群の脳アミロイドベータ蓄積の有無検出用であり、前記マーカー中血漿アミロイドベータ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＡＣＥ、Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ及びＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎは、軽度認知障害患者群の脳アミロイドベータ蓄積の有無検出用であり、前記マーカー中血漿アミロイドベータ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ及びＡＣＥは、認知機能正常群及び軽度認知障害患者群を含む非認知症群の脳アミロイドベータ蓄積の有無検出用であり、前記マーカー中血漿アミロイドベータ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＡＣＥ及びＴＳＰ−１は、非認知症群及び認知症群を含む全周期患者由来の血液で検出するものであり；そして前記検出されたマーカーの量を検査対象者の脳のアミロイドベータ蓄積またはこれと関連した疾患診断または予後と関連させる段階を含む、対象者の検体からマーカーを検出する方法に関する。
一実現例において前記アミロイドベータは先述した通りＭＰＰで処理されたのが用いられる。
さらに別の実現例において本願に係る方法は、ＡｐｏＥマーカーの使用を追加で含むことができる。
ＡｐｏＥ遺伝子は、ＡｐｏＥ ２、ＡｐｏＥ ３、ＡｐｏＥ ４の３つの遺伝子クイプがあるが、ＡｐｏＥ ４を有するヒトがＡＤにかかる確率が、有していないヒトに比べて非常に高いことがすでに広く知られているリスク因子である。従ってＡＤの遺伝的危険要素と知られていてこの遺伝子検査をすることで、ＡＤを予測することができる。ＡｐｏＥ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ）は、Ｅ２（ｃｙｓ１１２、ｃｙｓ１５８）、Ｅ３（ｃｙｓ１１２、ａｒｇ１５８）、及びＥ４（ａｒｇ１１２、ａｒｇ１５８）と呼ばれる３種類の対立形質が存在して、１個体の遺伝子型は、Ｅ２／Ｅ２、Ｅ２／Ｅ３、Ｅ２／Ｅ４、Ｅ３／Ｅ３、Ｅ３／Ｅ４、またはＥ４／Ｅ４型で存在する。この中でＥ４対立形質は、人口の約２０％程度で発見されて、アルツハイマー認知症発病危険度を増加させると知られている。本願によると、ＡｐｏＥ遺伝子型マーカーを本願に係るマーカーに追加して用いる場合、特異性と敏感度が向上することができる。ＡｐｏＥ遺伝子型の検出は公示された方法を利用して行われることができ、当業者なら適切なものを選択することができるはずである。本願に係る一実現例においては、実施例に開示された通り対立遺伝子特異的プライマーを利用したＰＣＲ方法が使用することができる。
さらに別の実現例において本願に係る方法は、通常の血液検査項目である、燐、遊離Ｔ３、ＨＤＬコレステロールの中の一つ以上の使用を追加で含むことができる。例えば、ＨＤＬコレステロール、遊離Ｔ３、及び燐の各マーカーは、例えば本願実施例に記載された方法を参考することができる。
本願に係る方法は、特に脳アミロイドベータ蓄積は、脳アミロイドベータ蓄積に関連した疾患の診断用で用いられて、前記脳アミロイドベータ蓄積疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病認知症、レビー小体型認知症、ハンチントン病認知症、または前臨床アルツハイマー病、ダウン症候群、または認知障害を含む。
本願に係る方法はさらに脳アミロイドベータ蓄積疾患診断は、認知障害重症度判断を含む。
本願の方法は、マーカー分析結果に追加して、患者の非タンパク質臨床インフォメーションつまり、マーカー以外の臨床インフォメーションを追加で用いることができる。このような非タンパク質臨床インフォメーションとは、例えば患者の年齢、性別、体重、食習慣、体質量、基底疾患、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、ＳＰＥＣＴ（ｓｉｎｇｌｅ−ｐｈｏｔｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｃｏｍｐｕｔｅｄ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）、またはＭＭＳＥ（ｍｉｎｉ−ｍｅｎｔａｌ ｓｔａｔｕｓ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ）またはポジトロン断層法（ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ；ＰＥＴ）の中の一つ以上を含むが、これに制限されない。
本願方法は、マーカーの検出結果を脳のアミロイドベータプラーク蓄積に関連した疾患の診断または予後と関連させる段階を含み、一実現例によると前記関連させる段階は決定された各マーカーの量を対照群と比較する。
一実現例において本願で対照群としてＰＩＢ−ＰＥＴ結果で陰性と判断されたヒトの血液試料で決定された数値を含む正常対照群で決定された前記各マーカーの検出結果との比較、例えばその増減を比較した後、これを基に蓄積を予測または診断するものである。
例えば、対照群の値と比較して本願に係るマーカーの中の一つ以上が有意に増加または減少した場合、対象者でプラークの蓄積または前記疾患が発生したと診断するインフォメーションを提供することができる。
例えば前記関連させる段階は、ＰＩＢ−ＰＥＴ結果で陰性と判断されたヒトまたは正常対照群の血液試料で決定された数値を含む定量結果と比較して、前記Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎは増加、ＬＧＡＬ、ＡＣＥ、ＡＣｈＥ、ＴＳＰ１、及びＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎはいずれも減少する。また、例えば前記関連させる段階は、決定された各マーカーの量をＰＩＢ−ＰＥＴ結果で陰性と判断されたヒトまたは正常対照群の血液試料で決定された定量結果と比較して、燐、遊離Ｔ３濃度は低くなり、ＨＤＬ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ濃度は有意に高くなる。
例えば、さらに一つ以上のマーカーを同時に用いて（多重マーカー）その増減など変化の程度を一つの数値で算出した時、数値が一定基準以上または以下である場合、脳アミロイドベータ蓄積を予測することができる。認知機能程度（つまり、認知機能正常群、軽度認知障害群、アルツハイマー性認知症群）に係る患者でアミロイドベータ蓄積のための本願に係るモデル１乃至４の多重マーカーの組み合わせは、例えば本願実施例２に開示されたような式を利用して、カットオフ数値を決めて、これをアミロイドベータ蓄積判別に使用することができる。
また、本願一実現例によると、前記関連させる段階は、正常対照群と対象者の試料を比較した後、前記各マーカーに対してプラークの蓄積予測または疾患の発病の有無を診断できるしきい値を設定した後、対象者の検出結果を前記しきい値と比較することができる。例えば、本願実施例に記載された通り、脳アミロイドベータプラークの蓄積の有無つまり陰性と陽性を判別する、つまりＰＩＢ−ＰＥＴ陰性と陽性を判別する各マーカーのしきい値は、本願に係る結果をメドカルキュレータプログラムを利用してＲＯＣカーブ分析によって決定されたＹｏｕｄｅｎ ｉｎｄｅｘを根拠に決定されることができる。前記しきい値は、脳にアミロイドベータプラーク蓄積陽性を示すもので、ＰＩＢ−ＰＥＴ検査対象者選別、脳アミロイドベータプラーク蓄積に関連した疾患の診断などに使用することができる。
ＰＩＢ−ＰＥＴ検査は患者に不便を与えるだけでなく多くの費用と時間を要するので、アミロイドプラーク蓄積の可能性が高いヒトを対象にする選別過程が切実な実情である。
別の様態において本願に係る方法は、アルツハイマー性認知症を含む脳のアミロイドベータプラーク蓄積の判断が必要な検査対象者が脳のＰＩＢ−ＰＥＴ検査が必要であるか否かに対するインフォメーションを提供するために、前記対象者由来の血液試料を提供する段階；前記血液試料で本願に係るマーカーを定量する段階；及び前記マーカーの濃度を対照群としてＰＩＢ−ＰＥＴ検査陰性と判断された対照群と比較して前記対象者をＰＩＢ−ＰＥＴ検査対象者と決める段階を含む、ＰＩＢ−ＰＥＴ検査が必要な対象者選別のためのマーカーの検出方法を提供する。例えば、本願に係るマーカーを利用した血液検査で脳にアミロイドベータが蓄積されなかったと判断された場合は、ＰＩＢ−ＰＥＴ映像を検査する必要がなく、蓄積されたと判断された場合は、確診のためにＰＩＢ−ＰＥＴ映像検査をすることができる。
これと同時に上述した本願に係るすべての方法で前記各マーカーについては上述したのを参考にすることができる。
以下、本発明の理解を助けるために実施例を提示する。しかし下記の実施例は、本発明をより理解し易くするために提供されるだけであって本発明が下記の実施例に限定されない。
実施例１．バイオマーカーの発掘及び測定方法
１−１．コホート対象者募集及び選別評価
外来／認知症支援センター／ポスター等により対象者を募集して、臨床／神経心理評価を施行して選定基準／除外基準該当の有無を評価した。この時、除外基準は満たさないのに選定基準をいずれも満たす場合にだけ、次の段階である基底評価（詳細評価）に進み、該当事項なしの場合、脱落（Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆａｉｌｕｒｅ）させた。
選定基準は、臨床診断（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｎ Ａｇｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＩＡ／ＡＡ）で発行するアルツハイマー性認知症診断臨床基準、Ｎｉｈｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ．２０１６ Ｍａｒ；７４（３）：３８６−９４等参照）を適用するので、軽度認知障害臨床基準、アルツハイマー性認知症臨床基準が適用された。軽度認知障害は、特定検査項目のｚ−ｓｃｏｒｅがｃｕｔ−ｏｆｆより低いと選定基準を満たした。Ｚ−ｓｃｏｒｅとは、素点を対象者の年齢、性別、教育年数を考慮した平均と標準偏差を適用した時（素点−平均）／（標準偏差）公式で求めた点数である。
基底評価は、上記の選別評価を通過して選定／除外基準を共に満たす群に対して脳映像評価（ＰＥＴ−ＭＲＩ）及び血液検査、詳細臨床評価及び詳細神経心理評価などその他追加的な質問用紙評価を行った。
上記のような段階を経て計４２９人の正常群、軽度認知障害及びアルツハイマー性認知症患者が選別されて、参加者に対して１２時間断食をさせた後、朝病院に来院して採血をして下記のようにＰＩＢ−ＰＥＴスキャンなどを実施した。採血した血液を利用してタンパク質を検出及び定量を実施した。
１−２．ＰＩＢ−ＰＥＴ映像スキャン
参加者は、Ｂｉｏｇｒａｐｈ ｍＭＲ ｓｃａｎｎｅｒ（Ｓｉｅｍｅｎｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ，ＵＳＡ）を利用してＴ１−強調ＭＲ及び３次元ＰＩＢ−ＰＥＴ映像を測定した。５５５ＭＢｑの１１Ｃ−ＰＩＢを静脈注入して４０分後に、３０分送出スキャンを得た。データは反復方法（２１サブセットの６反復）を用いて２５６×２５６映像マトリックスに変換して、均一性、超短波エコタイム９ＵＴＥ）−基礎減衰（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）、及び崩壊減少（ｄｅｃａｙ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）に対して校正した。Ｓａｇｉｔｔａｌ Ｔ１−強調（反復タイム−１３７０ｍｓ；エコタイム＝１．８９ｍｓ；観測視野、２５０ｎｍ；２５６×２５６ １．０ｍｍスライス厚さのマトリックス）を得た。ＭＡＴＬＡＢ ２０１４ａ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）にあるＳｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ Ｍａｐｐｉｎｇ ８（ＳＰＭ８）を用いて映像を前処理した。ＰＩＢ−ＰＥＴデータを個人Ｔ１映像で共同登録して標準Ｍｏｎｔｒｅａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＭＮＩ）テンプレートに対する変形パラメーターを計算した。Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｂｒａｉｎ Ａｔｌａｓｅｓ ｕｓｉｎｇ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ Ｍａｐｐｉｎｇソフト（ＩＢＡＳＰＭ）を用いてＡＡＬ（ａｕｔｏｍａｔｉｃ ａｎａｔｏｍｉｃ ｌａｂｅｌｉｎｇ）１１６ ａｔｌａｓ（Ｗｅｉｓｓ，１９８９）からの座標を各個体に対する個別空間に変形させる逆変形パラメーターを計算した（ｒｅｓａｍｐｌｉｎｇ ｖｏｘｅｌ ｓｉｚｅ＝１×０．９８×０.９８ｍｍ）。Ｔ１−ｃｏｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ ＰＩＢ−ＰＥＴ映像から得たｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ＡＡＬ１１６ ａｔｌａｓを用いて局所脳平均１１Ｃ−ＰＩＢアップテイクを計算したし定量的標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）のために小脳灰白質１１Ｃ−ＰＩＢアップテイク数値を用いた。ＲＯＩ（ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）を決めるために、ＡＡＬアルゴリズム及び領域−併合方式ｒｅｇｉｏｎ−ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ（Ｙａｆｆｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１）を適用して、脳領域を正面、外側頭頂葉、帯状−楔前部（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｃｉｎｇｕｌａｔｅ−ｐｒｅｃｕｎｅｕｓ，ＰＣ−ＰＲＣ）、及び顕著な１１Ｃ−ＰＩＢリテンション（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）があると報告された（Ｋｌｕｎｋ Ｗ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，２００４．Ｉｍａｇｉｎｇ ｂｒａｉｎ ａｍｙｌｏｉｄ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｗｉｔｈ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ−Ｂ．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ５５（３），３０６−３１９.）外側側頭部（ｌａｔｅｒａｌ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｒｅｇｉｏｎ）に分けた。各ＲＯＩ内のすべてのボクセル（ｖｏｘｅｌ）に対する平均値を同じ映像における平均小脳アップテイク数値で割ってＳＵＶＲ（ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ ｕｐｔａｋｅ ｖａｌｕｅ ｒａｔｉｏ）数値を計算した。４つのＲＯＩ（Ｉ．ｅ．，ｆｒｏｎｔａｌ、ｌａｔｅｒａｌ ｔｅｍｐｏｒａｌ、ｌａｔｅｒａｌ ｐａｒｉｅｔａｌ、ａｎｄ ＰＣ−ＰＲＣ）中少なくとも一つでＳＵＶＲ数値が１．４を越えるとＰＩＢ陽性（ＰＩＢ＋）に個体を分類するか、４つのＲＯＩともにＳＵＶＲ数値が１．４以下であるとＰＩＢ陰性（ＰＩＢ−）に分類した。ＰＩＢ−は、アミロイド沈着が陰性である個体を意味し、ＰＩＢ＋は、アミロイド沈着が陽性である個体を意味する。脳全体アミロイド沈着数値（ＳＵＶＲ）は、皮質全体ＲＯＩのすべてのボクセルに対する平均値を同じ映像の平均小脳アップテイク数値で割って計算した。
ＰＩＢ−ＰＥＴスキャン映像撮影結果、計４２９人中、２８２ＰＥＴ陰性、そして１４７ＰＥＴ陽性患者であることが分かった。参加者のＰＩＢ−ＰＥＴ結果（陽性陰性判別結果、ＰＩＢ−ＰＥＴの定量的結果であるＳＵＶＲ値）と血液でマーカーの定量によるＲＯＣカーブ分析から相関関係、特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）、敏感性（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）及びＡＵＣなどを分析した（実施例２参照、図１乃至図５）。
１−３．血液バイオマーカー選別
各群の患者１０人のサンプルで質量分析実験を介したグローバル及び糖鎖化プロテオミクス分析（Ｌｉ ｅｔ ａｌ，２０１４，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ １３，３４８８−３４９７）を実施して３９４８タンパク質グループを同定しこの結果をバイオインフォマティクス分析（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ５３，１５６３−１５７６）によりこの中で各群別で違いが生じるバイオマーカー候補タンパク質を選別した。同定されたバイオマーカー候補タンパク質中順位が高いタンパク質つまり、脳アミロイドベータ陰性正常群対比脳アミロイドベータ蓄積陽性群である軽度認知障害、脳アミロイドベータ蓄積陽性群であるアルツハイマー病患者で増加するか減少したタンパク質順に、血液でＥＬＩＳＡを介して定量をした結果、本願のマーカーを選別した。
１−４．血中タンパク質濃度の測定（ＥＬＩＳＡ、酵素結合免疫沈降分析法）
血中のアミロイドベータの濃度は、血漿前処理組成物の処理後、その濃度をＸ−ＭＡＰ技術を利用して測定した。血漿前処理組成物は、前記プロテアーゼ抑制剤及びフォスファターゼ抑制剤を１：１（ｖ／ｖ）で含む。さらに、ＭＰＰはプロテアーゼ抑制剤カクテル（Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ，ＰＩＣ）：ＰＭＳＦ（Ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）：フォスファターゼ抑制剤カクテルＩ：フォスファターゼ抑制剤カクテルＩＩを１：１：１：１（ｖ／ｖ）で混合したものであり得る。これは、既許可を受けた特許［血漿内アミロイドベータの濃度を通じてアルツハイマー病を臨床学的及び病理学的にモニタリングする方法、韓国特許番号１０−１７８６８５９］に詳しく記述されている。測定方法を簡単に記述すると、アミロイドベータ４２と４０の濃度を同時に測定するために、ＩＮＮＯ−ＢＩＡ ｐｌａｓｍａ Ａβｆｏｒｍｓ ｋｉｔ（富士レビオ（Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ）社）製品を用いた。抗体が結合されているビーズを先にプレートに通過させてビーズをプレートに装着後、ＭＰＰを処理した血漿溶液サンプルを３０分間インキュベーションした後、ｓｔａｎｄａｒｄ（標準濃度）サンプルと共にプレートに入れた。以後ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体が付いたビーズを入れて一日冷蔵保管した。翌日、プレートを洗浄した後、ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ抗体を入れて１時間をインキュベーションした。最後の段階でｒｅａｄｉｎｇ溶液を入れてＸ−ＭＡＰ技術を利用して血漿内ＭＰＰで前処理ざれたアミロイドベータを測定した。
血中タンパク質ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＡＣＥ、ＡＣｈＥ、ＴＳＰ１、Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ、そしてＶＥ ｃａｄｈｅｒｉｎの濃度は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫沈降分析法）方式を利用して測定した。これは抗原−抗体反応と電量分析（ｃｏｌｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）を利用して、生体試料に入っている特定タンパク質量を測定する実験方法である。詳細な実験方法は、各製品（ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ａｂｎｏｖａ社、ＫＡ０１４０；ＡＣＥ、Ｒ＆Ｄ社、ＤＡＣＥ００；ＡＣｈＥ、Ｒ＆Ｄ社、ＤＡＣＨＥ０；ＴＳＰ１、Ｒ＆Ｄ社、ＤＴＳＰ１０；Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ、ＣＵＳＡＢＩＯ社、ＣＳＢ−Ｅ１６４４４h；ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｒ＆Ｄ社、ＤＣＡＤＶ０）のマニュアルに従って実験した。簡単に説明すると、分離された血漿溶液サンプルとｓｔａｎｄａｒｄ（標準濃度）サンプルをターゲット抗体がコートされたプレートに入れて常温で１時間半から２時間インキュベーションした。インキュベーション以後、各ウェルはｗａｓｈ溶液で５回洗浄した後、ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体をいれて再び２時間インキュベーションして。もう一回各ウェルを洗浄した後、ＨＲＰの活性度を測定するためにＴｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）溶液を入れた。３０分後、飽和を防止するためにｓｔｏｐ溶液をいれて、プレートは４５０ｎｍで信号を測定した。
１−５．血液検査
（１）コレステロール：比色法（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ）
検査装備としては、ＡＤＶＩＡ １８００ Ａｕｔｏ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｉｅｍｅｎｓ，ＵＳＡ）、検査試薬は、ＨＤＬ−Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（Ｓｉｅｍｅｎｓ，ＵＫ）を用いて、参照数値（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）は４０−６０ｍｇ／ｄＬである。検査原理は次の通りである。ＨＤＬコレステロール直接測定法（Ｄ−ＨＤＬ ｍｅｔｈｏｄ）は、Ｉｚａｗａ、Ｏｋａｄａ、及びＭａｔｓｕｉが開発した手順に基づいて、前分離（ｐｒｉｏｒ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）なしに血清及び血漿内ＨＤＬコレステロールを測定した。非ＨＤＬ粒子由来のコレステロールは、反応の最初の段階で遊離されて除去された。ＨＤＬ粒子由来コレステロールはＲ２のｄｅｔｅｒｇｅｎｔによって２番目の段階で遊離されて、ＨＤＬコレステロールは、Ｔｒｉｎｄｅｒ ｒｅａｃｔｉｏｎで測定した。
前記方法は下記の二段階からなる：
ａ．コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼによるカイロミクロン、ＶＬＤＬ−コレステロール、及びＬＤＬ−コレステロールの除去。前記ルオキシダーゼによって生成された過酸化物をカタラーゼで除去した。
ｂ．試薬２の界面活性剤によるＨＤＬ−コレステロール遊離後のＨＤＬ−コレステロールのｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ。前記段階ａのカタラーゼは、Ｒ２のアジ化ナトリウムで阻害した。５９６ｎｍで測定した、Ｔｒｉｎｄｅｒ反応で生成されるキノンイミンの強度はコレステロール濃度に正比例する。
（２）遊離Ｔ３：化学発光免疫測定法（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＩＡ）
検査装備としては、ＡＤＶＩＡ Ｃｅｎｔａｕｒ ＸＰ（Ｓｉｅｍｅｎｓ，ＵＳＡ）、検査試薬は、Ｆｒｅｅ Ｔ３（Ｓｉｅｍｅｎｓ，ＵＳＡ）を用いて、参照数値（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）は、１−２３ヶ月３．３−５．２ｐｇ／ｍＬ、２−１２才３．３−４．８ｐｇ／ｍＬ、１３−２１才３．０−４．７ｐｇ／ｍＬ、＞２１才２．３０−４．２ｐｇ／ｍＬである。検査原理は次の通りである：ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔを利用したＴｗｏ−ｓｔｅｐ ｓａｎｄｗｉｃｈ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ。血清中のＦｒｔ３とＦｒｔ３ ｒｅａｇｅｎｔが競争的に結合してｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅのｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅを形成して、ここにＬｉｔｅ ｒｅａｇｅｎｔのａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ ｅｓｔｅｒ−ｌａｂｅｌｅｄ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−Ｔ３ ａｎｔｉｂｏｄｙが結合して現れるＲＬＵ（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔｓ）を測定した。
（３）燐：比色法（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ）
検査装備としては、ＡＤＶＩＡ １８００ Ａｕｔｏ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｉｅｍｅｎｓ，ＵＳＡ）、検査試薬はＰｉ（Ｓｉｅｍｅｎｓ、ＵＫ）を用いて、参照数値（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）は２．４−５．１ｍｇ／ｄＬである。検査原理は次の通りである。無機燐は硫酸存在時にアンモニウムモリブデートと反応して非還元ホスホモリブデート複合体を生成するが、終結反応としての前記複合体を３４０／６５８ｎｍで測定した。
１−６．ＭＰＰ−処理されたアミロイドベータ測定
大韓民国公開特許２０１６−０１２９４４４「血漿内アミロイドベータの濃度を通じてアルツハイマー病を臨床学的及び病理学的にモニタリングする方法」に記載された方法を参照した。用いられた試薬は次の通りである。ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＰＩ）、ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ，ａ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ＣＡ，ＵＳＡ） ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（ＰＰＩ Ｉ ａｎｄ ＩＩ；Ａ．Ｇ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ）で構成されたプロテアーゼ及びフォスファターゼ抑制剤（ＭＰＰ）が同じ割合で混合された混合物を用いた。Ａβペプチドは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入して、ヒト血清アルブミンはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
血液試料
一夜断食後に静脈血を採取してＫ２ ＥＤＴＡ ｔｕｂｅｓ（ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＵＫ）で収集して、７００×ｇで５分間室温で遠心分離を行った血漿を分離して、１５ｍｌ遠心分離チューブに収得した。高純度試料を得るために、血漿試料は同じ条件で再度遠心分離を行った後分注して直ちに−８０度に凍らせた。
Ａβ測定
Ａβ４２及びＡβ４０の血中濃度を同時に測定するために、ＩＮＮＯ−ＢＩＡ ｐｌａｓｍａ Ａβｆｏｒｍｓ ｋｉｔ（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｇｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を製造者の方法の通り使用した。要約すると、血漿をＭＰＰ処理された血漿希釈緩衝液またはＭＰＰ非処理された血漿希釈緩衝液で３倍希釈して室温で３０分間置いた。引き続きフィルタープレートを洗浄して、希釈されたベッドミックスをプレートの各ウェルに移した。引き続きプレートを注意しながら乾燥した後洗浄して、２５μＬのコンジュゲート１ワーキング溶液Ａ及び７５μＬの標準物質、ブランク、対照群及び血漿試料を各ウェルに追加した。引き続きプレートを摂氏４度で一夜培養して、各ウェルに１００μＬ検出溶液を追加した。１時間後にプレートを洗浄して各ウェルに読み取り溶液を追加した。血漿アミロイドベータ濃度は、Ｘ−ｍａｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｉｏｐｌｅｘ ２００ ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｂｉｏ−ｒＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を利用して測定した。
１−７．ＡｐｏＥ遺伝子型分析：対立遺伝子特異的重合酵素連鎖反応法（ＡＳＰ−ＰＣＲ：Ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）
特定遺伝子変異がある対立遺伝子を特異的に増幅できるプライマーを利用して増幅反応の有無で特定遺伝子変異を確認できる方法を用いた。
具体的に、Ｓａｌｔｉｎｇ ｏｕｔ ｍｅｔｈｏｄを利用して検体からＤＮＡを抽出した。引き続きＡｐｏＥ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｂｉｏｃｏｒｅ）を製造者の方法の通り使用して分析した。クイプに応じたＰＣＲ産物の大きさは、表２に記載されている。アルツハイマー性認知症の危険要素としてＥ４を有している場合、疾病にかかる危険が大きい。つまりＥ４／４が最も疾病にかかる危険が大きくその次はＥ４／３型である。
Figure 0006970983
実施例２．本願のバイオマーカーを組み合わせで用いた認知機能程度に係るアミロイドベータ蓄積判別
Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＡＣＨＥ（Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）、ＴＳＰ−１（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１）、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ（Ｌｅｃｔｉｎ、ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ，ｓｏｌｕｂｌｅ３ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）及びＡＣＥ（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｉ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）マーカーは、上述したようなＥＬＩＳＡ実験方式で実施例１の各患者の血液で定量して、アミロイドベータは、Ｘ−ＭＡＰ技術（２０１７ Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｈｅｒａｐｙ）で血液内濃度を定量した。
図２乃至図５では、認知機能正常群、軽度認知障害患者群及びアルツハイマー性認知症群の各群に該当する患者血液で特に有効性を示すマーカーを組み合わせた後、各マーカーの組み合わせについて、下記の式のようなロジスティック回帰分析を介してｐｉと表示される値または統合的指数を算出して、前記数値に応じて脳アミロイドベータ蓄積の有無を予測する分析を行い、算出された統合的指数Ｐｉの値がＹｏｕｄｅｎ’ｓ Ｊ ｓｔａｔｉｓｔｉｃ（Ｒｕｏｐｐ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍ Ｊ．２００８ Ｊｕｎ；５０（３）：４１９−４３０）を利用して各モデル別に決定されたｃｕｔ ｏｆｆ基準より増加時、脳アミロイドベータ蓄積陽性、低いと陰性と判別した。また、前記統合的指数を利用したＲＯＣカーブ分析を介して特異性及び敏感度を決めて予測有効性／正確度を算出した。
また、前記図２乃至図５の各マーカーの組み合わせは、ＡｐｏＥの遺伝子型検査と組み合わせで使用して判別された。
また、前記図２乃至図５の各マーカーの組み合わせは、ＡｐｏＥの存在または不在下で、燐、自由Ｔ３及び／またはＨＤＬコレステロールと共に使用されて判別された。
（数１ａ）
ln{pi／（１-pi）}=β０+β１ｘ１，i+β２ｘ２，ｉ，+…+βｍｘｍ，ｉ
（ｐｉ：予測確率、β０：定数、β１〜ｍ：変数の係数）
変数の個数は、用いられるマーカー個数により変わり、６個のマーカーを用いる場合の式は次の通りである。
（数１ｂ）
ln{pi／（１-pi）}=β０+β１ｘ１，ｉ+β２ｘ２，ｉ+β３ｘ３，ｉ+β４ｘ４，ｉ+β５ｘ５，ｉ+β６ｘ６，ｉ
（β０：回帰分析方程式モデルの定数、β１：ＭＰＰ−Ａβ４２／４０比率の係数、β２：ＬＧＡＬの係数、β３：ＡＣＥの係数、β４：ＴＳＰ−１の係数、β５：ＡＣｈＥの係数、β６：Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎの係数、ｘ１：ＭＰＰ−Ａβ４２／４０比率値、ｘ２：ＬＧＡＬの定量値、ｘ３：ＡＣＥの定量値、ｘ４：ＴＳＰ−１の定量値、ｘ５：ＡＣｈＥの定量値、ｘ６：Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎの定量値）
前記式１ａからＰｉの値は次のような式から求めた。
（数２）
Figure 0006970983
本願でＸ−ＭＡＰ技術（２０１７ Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｈｅｒａｐｙ）を介して得た血漿アミロイドベータ濃度、ＥＬＩＳＡ実験を基に得た各マーカーの血中タンパク質濃度は、統計分析を介して多重バイオマーカー変数で活用された。
統計分析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びＭｅｄＣａｌｃ（ＭｅｄＣａｌｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｏｓｔｅｎｄ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）ソフトを利用して行った。すべてのデータは、平均の標準誤差（ｍｅａｎ±ｓｔａｎｄａｒｄ ｅｒｒｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅａｎ，ＳＥＭ）で表記された。また、単一スチューデントｔ−検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）を利用して血漿内タンパク質濃度を通じてＰＩＢ−ＰＥＴ陽性または陰性群を比較した。ＡＮＯＶＡ分析後にはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５でＴｕｋｅｙ’ｓ多重比較検定を行った。診断テストの性能を評価するために、ＭｅｄＣａｌｃでＲＯＣ（Ｒｅｖｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）カーブ分析に係るロジスティック回帰分析（Ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）を行った。さらにこのデータを活用してＲＯＣ ｃｕｒｖｅを描いてＡＵＣ（Ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ）をＷｉｌｃｏｘｏｎ統計を利用して測定した。多重ロジスティック回帰分析時には、各変数を独立変数で活用して、最終的なモデルを導き出して、この時、性別と年齢といった共変数は補正変数で活用された。
また、ロジスティック回帰分析で導き出された新しい総合変数は、ＲＯＣカーブ分析を介して脳アミロイド蓄積の有無を分けるのに活用されたし、回帰分析を通じて得たｃｕｔ−ｏｆｆ値（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ値）を介してＰＩＢ−ＰＥＴ陽性とＰＩＢ−ＰＥＴ陰性を区別することの基準点で活用された。
結果は、図２乃至図５に開示されている。図２乃至図５は、各々各モデルの特異性及び敏感度、正確度を決めるＡＵＣ（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｃｕｒｖｅ）数値を示す。またＡｐｏＥを追加で含む場合の特異性と敏感度が向上する結果を示す。
前記各モデルでＹｏｕｄｅｎ’ｓ Ｊ ｓｔａｔｉｓｔｉｃを介して決定されたＰｉカットオフ値は次の通りである：モデル１：０．６３、モデル１（ＡｐｏＥ追加）：０．６７；モデル２：０．４６、モデル２（ＡｐｏＥ追加）：０．６８；モデル３：０．５１、モデル３（ＡｐｏＥ対加）：０．５９；モデル４：０．４９、モデル４（ＡｐｏＥ追加）：０．５８。
しかし、前記カットオフ値は一例であり、検査目的などにより変動する。例えば、健康診断でのスクリーニング目的で行う場合には、可能なすべての対象者を包括するため、カットオフ値を低く取ることができる。
本発明で用いられるすべての技術用語は、特に定義されない限り、本発明の関連分野で通常の当業者が一般的に理解するような意味で用いられる。本明細書に参考文献と記載されるすべての刊行物の内容は本発明に導入される。

Claims (13)

  1. 血漿アミロイドベータ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＡＣＥ及びＡＣＨＥのそれぞれを検出するための血液での複数種の検出用物質を含む、認知機能正常群の脳アミロイドベータ蓄積の有無検出用組成物。
  2. 前記血漿アミロイドベータは、ＭＰＰで処理されたものである、請求項１に記載の認知機能正常群の脳アミロイドベータ蓄積の有無検出用組成物。
  3. 前記各認知機能正常群は、ＡＣｈＥ抑制剤非服用者である、請求項１に記載の認知機能正常群の脳アミロイドベータ蓄積の有無検出用組成物。
  4. ＡｐｏＥを検出するための血液での検出用物質を追加で含むものである、請求項１に記載の認知機能正常群の脳アミロイドベータ蓄積の有無検出用組成物。
  5. 燐、ＨＤＬ（Ｈｉｇｈ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）及び遊離Ｔ３（ｆｒｅｅ ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ）の中の一つ以上のマーカーを検出するための血液での検出用物質を追加で含むものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の認知機能正常群の脳アミロイドベータ蓄積の有無検出用組成物。
  6. 脳アミロイドベータ蓄積の有無の検出が必要な認知機能正常群の検査対象者由来の血液サンプルを提供する段階；
    前記血液サンプルで検出用マーカーとして、血漿アミロイドベータ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＡＣＥ及びＡＣＨＥを定量する段階；及び
    前記定量する各検出用マーカーの量を前記対象者の脳アミロイドベータ蓄積の有無と関連させる段階を含む、血液で認知機能正常群の脳アミロイドベータ蓄積検出方法。
  7. 前記血漿アミロイドベータは、ＭＰＰで処理されたものである、請求項６に記載の血液で認知機能正常群の脳アミロイドベータ蓄積検出方法。
  8. 前記各認知機能正常群は、ＡＣｈＥ抑制剤非服用者である、請求項６または７に記載の血液で認知機能正常群の脳アミロイドベータ蓄積検出方法。
  9. 前記定量する段階において、検出用マーカーとして、ＡｐｏＥを追加で定量する、請求項６〜８のいずれか１項に記載の血液で認知機能正常群の脳アミロイドベータ蓄積検出方法。
  10. 前記定量する段階において、検出用マーカーとして、燐、ＨＤＬ（Ｈｉｇｈ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）及び遊離Ｔ３中一つ以上のマーカーを追加で定量する、請求項６〜９のいずれか１項に記載の血液で認知機能正常群の脳アミロイドベータ蓄積検出方法。
  11. 前記定量する段階において、検出用マーカーとして、燐、ＨＤＬ（Ｈｉｇｈ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）及び遊離Ｔ３のマーカーを追加で定量する、請求項１０に記載の血液で認知機能正常群の脳アミロイドベータ蓄積検出方法。
  12. 前記関連させる段階は、対照群で決定された定量結果と比較して、前記ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＡＣＥ及びＡＣｈＥのすべてが減少する場合、前記血液が由来した対象者は、アミロイドベータが蓄積されたと判断する段階を追加で含むものである、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の血液で認知機能正常群の脳アミロイドベータ蓄積検出方法。
  13. 前記関連させる段階は、対照群で決定された定量結果と比較して、前記燐及び遊離Ｔ３の濃度は減少して、且つＨＤＬの濃度は増加する場合、前記検査対象者を脳アミロイドベータ蓄積されたと判断する段階を追加で含むものである、請求項１１に記載の血液で認知機能正常群の脳アミロイドベータ蓄積検出方法。
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