KR20140032994A - 글루텐 과민성 검출 및 만성소화장애증과의 구별 방법 및 장치 - Google Patents

Abstract

고전적 만성소화장애증과 글루텐 면역 반응성 및 과민성, 무증상 만성소화장애증, 크론병 및 기타 장-관련 병리 구별에 조력하는 생물마커로서 항체를 사용한다. 본 발명의 일 양태에서, 혈청, 타액 또는 인간이나 다른 동물의 다른 샘플을 대상으로 (a) 소맥 항원, (b) 글리아딘 항원, 및 (c) 하나 이상의 소맥 배아 아글루티닌, 글루테오몰핀, 글루테닌, 탈아미드화 글루테닌, 프로디놀핀 및 디놀핀에 대한 항체 시험이 수행된다. 테스트 결과는 특히 소맥 항원 및 글리아딘 항원이 α-글리아딘-33-메르, α-글리아딘-17-메르, Y-글리아딘-15-메르, ω-글리아딘-17-메르, 및 글루테닌-21-메르로 이루어진 군으로부터 선택될 때 특히 흥미롭다. 테스트 플레이트 및 키트는 바람직하게는 적어도 3, 5, 7 또는 모든 α-글리아딘, γ-글리아딘, ω-글리아딘, 글루테닌, 소맥 배아 아글루티닌, 글루테오몰핀, 프로디놀핀, 트랜스글루타미나제, 및 글리아딘-결합 트랜스글루타미나제에 대한 항체를 테스트할 수 있다.

Description

글루텐 과민성 검출 및 만성소화장애증과의 구별 방법 및 장치{METHODS AND APPARATUS FOR DETECTION OF GLUTEN SENSITIVITY, AND ITS DIFFERENTIATION FROM CELIAC DISEASE}

본원은 전체가 참조로 통합되는 2011.1.20자 출원된 미국임시출원번호 제61/434,501호의 이익을 주장한다. 본 발명은 적어도 글루텐 면역 반응성 및 과민성, 무증상 만성소화장애증 및 크론병을 포함하여 장-관련 질환 및 병변 진단에 유용한 방법 및 키트에 관한 것이다.

소맥 알레르기, 만성소화장애증 및 글루텐 과민성은 소맥 글리아딘의 섭취에 의해 촉발되는 세 종의 구별되는 병태이다 (1, 2). 이러한 병태들에서, 글루텐에 대한 반응은 세포성 및 체액성 면역 반응에 의해 다른 증상들을 보인다. 예를 들어, 소맥 알레르기에서는 글리아딘 펩티드의 특정서열이 비만세포 및 호염구 표면에서 IgE 두 분자들을 교차 결합시켜 히스타민과 류코트리엔과 같은 중재자 방출을 촉진시킨다 (3).

이들 및 본원에서 논의된 다른 모든 외재성 물질은 전체가 참조에 의해 본원에 통합된다. 통합되는 참조문헌에서 용어 정의 또는 사용이 불일치하거나 본원에서 제공하는 용어의 정의와 배치되는 경우, 본원에서 제공되는 용어의 정의가 적용되고 참조문언에서의 해당 용어 정의는 적용되지 않는다.

만성소화장애증 (CD)는 공지된 유전적 구성체 및 글리아딘 펩티드와 같은 환경요인에 의한 자가면역질환이다. CD는 총인구의 1-2 % 사이에 발병된다. 본원에서 문맥상 반대로 명시되지 않는 한, 본원에 제시된 모든 범위는 끝점을 포함하는 것으로 해석되어야 하며, 개방 범위는 상업적으로 실제 값을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 비슷하게 문맥상 반대로 표시하지 않는 한, 모든 목록 값은 중간 값을 포함하는 것으로 간주되어야 한다.

본 질환 진단 마커는 천연 탈아미드화 글리아딘 펩티드에 대한 IgA 및 IgA 항-조직 트랜스글루타미나제 (TTG) 자가항체이다. CD에 비해, 글루텐 과민성 (GS)은 인구의 30 %까지 발병된다 (4). Sapone 등 (5, 6)에 의해 2010 년과 2011 년에 발표 된 두 가지 논문에 따르면, GS의 증상은 CD 또는 소맥 알레르기와 연관된 위장관 증상의 일부와 유사할 수 있지만, 글루텐 과민성에 대한 객관적인 진단 테스트는 현재 없다고 강조하고 있다 (5, 6). GS와 비교하여 CD의 선천적 면역 반응을 연구하면서, 연구자들은 선천성 면역과 관련된 TLR1, TLR2와 TLR4는 점막 GS에서 증가되지만 CD에서는 그렇지 않고, IFN-g, IL-21, 및 IL-17A와 같은 후천 면역의 생물마커들은 CD에 있는 점막 조직에서 발현되지만 GS에서는 그렇지 않다는 것을 알았다. 톨-유사 수용체 및 IFN-γ, IL-21 및 IL-17A을 측정하면 매우 침습적이며 생검을 필요로 하는 방법으로 CD와 GS (5, 6)를 구별 할 수 있을 것이라고 믿었다. 글루텐에 대한 즉시 유형 과민반응은 IgE에 의해 매개되고, 글루텐에 대한 지연 유형 과민반응은 항체- (IgG, IgA) 및 T-세포 매개 반응이며, 이를 만성소화장애증 또는 장병성 글루텐 과민성이라고 부른다 (7). tTg에 대한 IgG 및 IgA의 부재에서, 다양한 소맥 항원 및 펩티드에 대한 IgG 및 IgA의 상승은 소맥 펩티드에 대한 점막 면역관용의 상실 및 글루텐 과민성 진행을 나타낸다 (7). 소맥 항원과 인체 조직 사이의 항원 유사성으로 인해, CD와 GS 모두 1 형 당뇨병, 관절염, 갑상선염, 심지어 신경자가면역질환 예컨대 글루텐 실조 및 다발성 경화증을 포함하여 많은 자가면역질환을 발병시킬 수 있다 (8-10).

용어 "환자"는 의료 관리 전문가 보호 하에 있는 인간을 의미하는 것이다. 그러나, 포괄적으로는, 본원에 개시된 새로운 시험 프로토콜 및 분석은 만성소화장애증, 글루텐 과민성, 및 장-관련 자가면역을 겪고 있는 비-환자인 인간 및 다른 동물에 적용될 수 있다.

CD 환자와 비슷하게 GS 환자는, 글루텐 내성이 없고, 동일하거나 유사한 위장 증상을 일으키지만, GA에서 이러한 면역은 소장 손상에는 이르지 않는다 (5, 6). GS의 장 손상 결여 및 소장 손상과 더불어 유전적 마커 HLA DQ2/DQ8와의 CD 연관성으로 CD 진단은 GS보다 훨씬 쉽다. GS에서의 덜 심한 임상 양상, tTg 자가항체의 부재, 많은 임상에 의한 다양한 소맥 단백질과 펩티드에 대한 높아진 IgG및 IgA 항체의 중요성 일축으로 GS는 매우 위험한 질환이 될 수 있다. 염증 신호전달 유발인자 함께 장기간 혈액 중 IgG 및/또는 IgA 항체가 지속되면 본격적인 자가면역이 발생할 수 있기 때문이다. 이러한 현상이 일어나면, 결과적인 조직 손상의 심각성으로 인하여 무-글루텐 다이어트 요법으로는 다른 소맥 항원 및 펩티드에 대한 IgG와 IgA항체로 유도되는 면역반응 과정을 역전시키는데 도움이 될 수 없다.

만성소화장애증 및 글루텐 면역 반응성/과민성에 대한 비교를 도 1에 도시한다. 이 모델에 따르면, 한 명은 네가티브 유전적 구성체 (HLA DQ2/DQ8^-)를 가지고 다른 한 명은 포지티브 (HLA DQ2/DQ8⁺)를 가지는 두 아동이, 로타 바이러스, 세균독소, 및 일부 약물 또는 이들의 상승적 효과와 같은 환경 요인에 노출되면, 두 아동 모두 점막 면역 내성의 붕괴로 이어진다. 글리아딘에 대한 점막 면역내성의 유도로 인하여 천연 소맥 단백질과 펩티드에 대하여 IgA 및/또는 IgG이 생성되고, 이는 HLA DQ2/DQ8^- 및 HLA DQ2/DQ8⁺를 가지는 두 아동 모두 글루텐 과민성이 개시되는 단계이다.

그러나, 포지티브 유전적 구성체를 가지는 아동에서는, 염증의 생물마커들과 함께 글리아딘에 대한 IgG와 IgA항체는 tTg를 활성화시키고, 융모에 손상을 유발하고, 융모 위축을 초래한다. 특정 글리아딘 펩티드의 탈아미드화는 이것과 tTg 간의 복합체를 형성한다; 항원-제시 세포에 의한 이러한 복합체의 T 세포 및 B 세포로의 제시로 tTg, 탈아미드화 글리아딘 및 글리아딘-tTg 복합체에 대한 IgA 또는 IgG 생성으로 이어진다. 이러한 항체들의 형성 및 혈액에서의 검출은 CD의 특징이고, 이는 인구의 1-2 %에서 발견되는 유전 조건이다. CD가 치료되지 않으면, 자가면역 및 암으로 이어질 수 있다.

반대로, 네가티브 HLA DQ2/DQ8를 가지는 아동에서는, 면역내성 붕괴 및 이어 수반되는 천연 소맥 단백질과 펩티드에 대한 IgA 및/또는 IgG 생성은 염증 신호전달 (cascade)를 활성화 시킨다. 그러나, tTg 활성화 부재에서, 융모 위축이 발생하지는 않는다. 또한, 글리아딘 펩티드는 탈-아미드화를 거치지 않고, 따라서 IgG와 IgA항체는 천연 소맥 및 글리아딘 펩티드에 대하여만 생성된다.

소맥 항원에 대한 지속적인 노출 및 계속적인 점막 면역 관용으로, 소맥 항원과 반응성 항체는 심각한 글루텐 면역 반응성 및 과민성을 일으키는 면역복합체를 형성한다. 이러한 면역 반응성 및 과민성은 인구의 30 %에서 발견되는 비-유전적 조건이다. 이러한 장애가 확인되지 않는 경우, 소맥 항원 및 펩티드에 대한 IgG와 IgA의 장기간 노출 및 이들의 다른 조직 항원과의 교차 반응으로 다양한 자가면역 질환이 발생할 수 있다. 따라서, 심지어 CD가 없다고 할지라도, GS는 여전히 다른 장기를 공격하는 다른 글루텐-관련 자가항체에 대한 생산적인 환경을 제공할 수 있다.

또한, 일반적으로 무-글루텐 다이어트 요법은, CD의 진단 기준을 충족하는 환자들에게만 추천되고 글루텐 면역 반응성 및 과민성 환자에 대하여는 그렇지 않다. 불행하게도, 이로 인하여, 많은 글루텐 과민성 환자들은, 단지 알고만 있었다면, 무-글루텐 다이어트 요법으로 해결될 수 있는, 합병증, 병태 위험이 있는 매우 심각한 증상으로 불필요하게 고통 받고 있다.

따라서, 글루텐 면역 반응성 및 과민성, 무증상 만성소화장애증, 만성소화장애증, 및 장-관련 자가면역을 포함한 다양한 장-관련 질환들을 진단하고 구별하기 위한 새로운 패러다임이 요망된다.

본 발명은 글루텐 면역 반응성 및 과민성, 무증상 만성소화장애증, 크론병 및 기타 장-관련 병리 진단에 조력하는 생물마커로서 항체를 사용되는 장치, 시스템 및 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 소정 양태에서, 전혈, 혈청, 타액 또는 인간이나 다른 동물의 다른 샘플을 대상으로 (a) 소맥 항원, (b) 글리아딘 항원, 및 (c) 하나 이상의 소맥 배아 아글루티닌, 글루테오몰핀, 글루테닌, 탈아미드화 글루테닌, 프로디놀핀 및 디놀핀에 대한 항체 시험이 수행된다.

테스트 결과는 바람직하게는 특히 소맥 항원이 탈아미드화 되고, 글리아딘 항원이 α-글리아딘-33-메르, α-글리아딘-17-메르, Y-글리아딘-15-메르, ω-글리아딘-17-메르, 및 글루테닌-21-메르로 이루어진 군으로부터 선택될 때, 만성소화장애증에서 글루텐 면역 반응성 및 과민성 구별에 적용될 수 있다.

본 발명의 소정 양태에서, 전혈, 혈청, 타액 또는 인간이나 다른 동물의 다른 샘플을 대상으로 하나 이상의 γ-글리아딘 단백질 또는 이의 펩티드 예컨대 Y-글리아딘-15- 메르, ω-글리아딘 단백질 또는 이의 펩티드 예컨대 ω-글리아딘-17-메르, 소맥 배아 아글루티닌, 글루테오몰핀, 글루테닌 단백질 또는 이의 펩티드 예컨대 글루테닌-21-메르, 탈아미드화 글루테닌 단백질 또는 이의 펩티드, 프로디놀핀 및 디놀핀에 대한 항체 시험이 수행된다.

본 발명의 소정 측면에서, 테스트가 실시되고 및/또는 항체 테스트 결과는 글루텐 면역 반응성 및/또는 과민성, 분명한 증상적 만성소화장애증 (전형적)에 상대적인 무증상 또는 비정형 만성소화장애증, 크론병 및 만성적 면역 활성을 구별하기 위하여 분석된다. 테스트 플레이트 및 테스트 키트는 적어도 3, 5, 7 또는 모든 α-글리아딘, γ-글리아딘, ω-글리아딘, 글루테닌, 소맥 배아 아글루티닌, 글루테오몰핀, 프로디놀핀, 트랜스글루타미나제, 및 글리아딘-결합 트랜스글루타미나제 (글리아딘-트랜스글루타미나제 복합체)에 대한 항체를 테스트할 수 있다.

본 발명의 소정 측면에서, 분석장치 (assay) 또는 분석 키트는 하나 이상의 소맥 항원, α-글리아딘 단백질 또는 하나 이상의 이의 펩티드 예컨대 α-글리아딘-33-메르 및/또는 α-글리아딘-17-메르, γ-글리아딘 단백질 또는 하나 이상의 이의 펩티드 예컨대 Y-글리아딘-15-메르, ω-글리아딘 단백질 또는 하나 이상의 이의 펩티드 예컨대 ω-글리아딘-17 메르, 소맥 배아 아글루티닌, 아편유사체 펩티드 예컨대 하나 이상의 글루테오몰핀, 프로디놀핀 및/또는 디놀핀, 글루테닌 단백질 또는 하나 이상의 이의 펩티드 예컨대 글루테닌-21-메르, 탈아미드화 글루테닌 단백질 또는 하나 이상의 이의 펩티드, 글리아딘-트랜스글루타미나제 복합체, 또는 이들의 조합물에 대한 IgA 및/또는 IgG 항체를 테스트할 수 있다.

본 발명의 소정 측면에서, 항체 검출은 면역분석으로 수행되며, 제한되지는 않지만, ELISA 분석, RIA 분석, 라텍스 응집, 비드 분석, 단백질 분석 및 기타 당업자에게 알려진 면역분석법을 포함한다.

본 발명의 다양한 목적, 특징, 양태 및 장점은 동일부호는 동일 요소를 나타내는 첨부 도면과 함께 바람직한 실시태양의 하기 상세한 설명에서 더욱 명백해질 것이다.

도 1은 본 발명에서 고려되는, 만성소화장애증 (우측) 및 글루텐 면역 반응성/과민성 (좌측)과의 차이를 보여주는 개략도이다.
도 2는 12 종의 항원 및 펩티드를 가지는 12 개의 행을 가진 샘플 미량역가 플레이트의 배치를 나타내는 도면이다.
도 3은 12 종의 소맥 항원 또는 펩티드 및 관련 조직 항원 (항원 또는 펩티드는 투명)에 대하여 IgG 또는 IgA가 측정되는 샘플 미량역가 플레이트의 배치를 나타내는 도면이다.
도 4는 품질 관리 목적으로 매주 네가티브 및 포지티브 대조군 (항원 또는 펩티드는 투명)으로 IgG 또는 IgA가 측정되는 샘플 미량역가 플레이트의 배치를 나타내는 도면이다
도 5는 종래 기술에 따라 tTg 및 다양한 항원을 사용한 만성소화장애증에 대한 항체 테스트 검사 프로토콜의 다이어그램이다 (17).
도 6은 종래 기술에 따라 탈아미드화 글리아딘 펩티드를 사용한 만성소화장애증에 대한 테스트 프로토콜의 다이어그램이다 (17).
도 7은 본 발명의 소정의 양태에 따라 소맥 항원 및 펩티드를 사용한 만성소화장애증, 글루텐 면역 반응성/과민성에 대한 제안된 테스트 프로토콜의 다이어그램이다.

본 발명의 소정 양태에 의하면, 소맥 항원 및 펩티드 어레이에 대한 고전적 만성소화장애증 진단과는 달리, 본 발명은 글루텐 면역 반응성 및 과민성, 무증상 만성소화장애증, 크론병 및 기타 장-관련 병리 진단 및 구별에 조력하는 생물마커로서 항체를 사용한다.

본 발명의 소정 양태에서, 체액을 대상으로, 하나 이상의 전-소맥 항원; α-글리아딘 단백질 또는 이의 펩티드; γ-글리아딘 단백질 또는 하나 이상의 이의 펩티드; ω-글리아딘 단백질 또는 하나 이상의 이의 펩티드; 글루테닌 단백질 또는 하나 이상의 이의 펩티드; 하나 이상의 아편유사체 펩티드; 글리아딘-트랜스글루타미나제 복합체 (트랜스글루타미나제에 결합된 글리아딘); 트랜스글루타미나제; 소맥 배아 아글루티닌; 및 이들의 조합물에 대한 면역글로불린 G (IgG) 및/또는 면역글로불린 A (IgA) 항체 시험이 수행된다.

본 발명의 소정 양태에서, 전-소맥 (whole-wheat) 항원은 탈아미드화 되고 수용성 알코올-용해성 전-소맥 단백질을 결합하여 제조할 수 있다. α-글리아딘 단백질 또는 하나 이상의 이의 펩티드는 α-글리아딘-33-메르 및/또는 α-글리아딘-17-메르를 포함하고, 다른 α-글리아딘 펩티드도 고려된다. γ-글리아딘 단백질 또는 하나 이상의 이의 펩티드는 Y-글리아딘-15-메르가 포함되고, 다른 γ-글리아딘 펩티드도 고려된다. ω-글리아딘 단백질 또는 하나 이상의 이의 펩티드는 ω-글리아딘-17-메르가 포함되고, 다른 ω-글리아딘 펩티드도 고려된다. 글루테닌 단백질 또는 하나 이상의 이의 펩티드는 글루테닌-21-메르가 포함되고, 다른 글루테닌 펩티드도 고려된다. 하나 이상의 아편유사체 펩티드는 글루테오몰핀, 프로디놀핀 및/또는 디놀핀을 포함한 엑솔핀 펩티드를 포함하고, 다른 엑솔핀 펩티드도 고려된다.

본 발명의 소정 양태에서, 전혈, 혈청, 타액 또는 인간이나 다른 동물의 다른 체액 샘플을 대상으로 (a) 소맥 항원, (b) 글리아딘 항원, 및 (c) 하나 이상의 소맥 배아 아글루티닌, 글루테오몰핀, 글루테닌, 탈아미드화 글루테닌, 프로디놀핀 및 디놀핀에 대한 항체 시험이 수행된다. 테스트 결과는 특히 소맥 항원이 탈아미드화 되고, 글리아딘 항원이 α-글리아딘-33-메르, α-글리아딘-17-메르, Y-글리아딘-15-메르, ω-글리아딘-17-메르, 및 글루테닌-21-메르로 이루어진 군으로부터 선택될 때 특히 흥미롭다. 테스트 플레이트 및 키트는 바람직하게는 적어도 3, 5, 7 또는 모든 α-글리아딘, γ-글리아딘, ω-글리아딘, 글루테닌, 소맥 배아 아글루티닌, 글루테오몰핀, 프로디놀핀, 트랜스글루타미나제, 및 글리아딘-결합 트랜스글루타미나제에 대한 항체를 테스트할 수 있다.

본 발명의 소정 측면에서, 특히 관심의 분석장치 (assay) 또는 분석 키트는 하나 이상의 소맥 항원, α-글리아딘 단백질 또는 하나 이상의 이의 펩티드 예컨대 α-글리아딘-33-메르 및/또는 α-글리아딘-17-메르, γ-글리아딘 단백질 또는 하나 이상의 이의 펩티드 예컨대 Y-글리아딘-15-메르, ω-글리아딘 단백질 또는 하나 이상의 이의 펩티드 예컨대 ω-글리아딘-17 메르, 소맥 배아 아글루티닌, 아편유사체 펩티드 예컨대 하나 이상의 글루테오몰핀, 프로디놀핀 및/또는 디놀핀, 글루테닌 단백질 또는 하나 이상의 이의 펩티드 예컨대 글루테닌-21-메르, 탈아미드화 글루테닌 단백질 또는 하나 이상의 이의 펩티드, 글리아딘-트랜스글루타미나제 복합체, 또는 이들의 조합물에 대한 IgA 및/또는 IgG 항체를 테스트할 수 있다.

본 발명의 소정 측면에서, 항체 검출은 면역분석으로 수행되며, 제한되지는 않지만, ELISA 분석, RIA 분석, 라텍스 응집, 비드 분석, 단백질 분석 및 기타 당업자에게 알려진 면역분석법을 포함한다.

일부 테스트 환자들에 대한 하기 예시적 분석, 이용 및 평가가 기재된다. 본원에 기재된 것과 유사 또는 균등한 기타 재료 및 방법이 본 발명의 구현 또는 시험에 적용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 본 발명을 더욱 설명하기 위하여 예시적 기재에 설명될 것이다.

실시예 1

ELISA 분석 실험

A. 재료 및 방법 - 플레이트 및 샘플 준비:

소맥 항원 펩티드. 전-소맥 항원은 수용성 및 알코올-용해성 단백질을 결합하여 제조 하였다. α-글리아딘 33- 메르, 17-메르, γ-글리아딘 15-메르, ω-글리아딘 17-메르, 글루테오몰핀, 프로디놀핀, 트랜스글루타미나제, 및 트랜스글루타미나제에 결합된 글리아딘, 글루탐산 디카르복실라제 (GAD-65) HPLC을 포함한 다른 글리아딘 펩티드는 Bio-Synthesis Inc. (루이스빌, 텍사스)에 의해 합성되었다. 소맥 배아 아글루티닌 (WGA)는 Sigma/Aldrich (세인트 루이스, MO)에서 구입하였다.

항원 및 펩티드를 1.0 mg / ml의 농도로 메탄올에 용해하고, 0.1M 탄산-중탄산염 버퍼, pH 9.5, 및 50ul에 1:100으로 희석하고, 바닥이 평평한 폴리스티렌 ELISA 플레이트의 각 웰에 첨가하였다.

ELISA 플레이트는 4°C에서 하룻밤 배양하고, 0.05% 트윈 20 (pH 7.4)를 포함한 트리스-완충식염수 (TBS) 200ul로 3 회 세척하였다. TBS 중의2% 송아지 알부민 혈청 (BSA) 200mL를 첨가하여 면역글로불린의 비-특이적 결합을 방지하고, 4 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 플레이트를 세척하고 및 품질 관리를 실시 한 후 사용할 대까지 4°C에 보관하였다.

포함된 효소 접합체: 친화성 정제 항체 포스파타제-표지 염소 항- 인간 IgG (Jackson ImmunoResearch, Cat #109-055-008) 및 친화성 정제 항체 포스파타제-표지 염소 항-인간 IgA (Jackson ImmunoResearch, Cat #109-055 -011).

본원에 기재된 방법에 포함된 다른 추가적인 시약 및 재료는 다음을 포함한다: 인산완충식염수 분말 (시그마, Cat # P3813-10PAK), 송아지 혈청 알부민 (Biocell, Cat # 3203-00) 아지드화나트륨 (시그마, Cat # S-2002), 트윈 20 (시그마, Cat # P1379-1000ML), 글리세롤 (시그마, Cat #G5516-500ML), 수산화나트륨 (시그마, Cat #S-5881), 염화마그네슘 (시그마, Cat #8266), 디에탄올아민 (시그마, Cat #D-8885), 1.0 N 염산 용액 (시그마, Cat #H3162), 5mg 기질 정제 (tablets): P-NPP (파라-니트로페닐인산염) (시그마, Cat #S-0942) 및 증류수 (D. H₂O).

마이크로 웰 플레이트는 원하는 개수의 소맥 관련 항원 및/또는 펩티드로 코팅하였다. 하기 예시에서는, 12 종의 소맥 관련 항원 및 펩티드를 마이크로 웰 플레이트에 코팅하였다. 교정자 및 양성 대조군 및 환자 희석 샘플을 웰에 첨가하고, 다른 소맥 항원을 인식하는 자가항체는 제1 배양 과정에서 결합한다. 모든 비-결합 단백질을 제거하기 위하여 웰을 세척한 후, 정제된 알칼리성 포스파타제-표지화 토끼 항-인간 IgG / IgA 비-결합 접합체는 추가 세척 과정에서 제거되었다.

결합 접합체는 황색 반응생성물을 주는 파라-니트로페닐인산염 (PNPP) 기질로 가시화되고, 강도는 샘플 중 자가항체의 농도에 비례한다. 반응을 중지하기 위해 수산화나트륨을 각 웰에 첨가하였다. 색의 강도는 405 nm에서 판독되었다.

소정의 측면에서, 다른 샘플 채집장치가 본 분석에서 고려될 수 있지만, 밝은 적색 또는 레드 타이거 탑 (SST 튜브)이, 표본 채집을 위해 사용되었다.

혈액 샘플은 무균 정맥천자 기술을 사용하여 채혈하고 표준 절차를 적용하여 혈청을 얻었다. 소정 측면에서, 분석용으로 혈액의 약 0.5ml 이상에 해당하는 최소 약 50ul의 혈청이 바람직하다.

B. 테스트 분석 절차

글루텐 면역 반응성 및 과민성, 무증상 만성소화장애증, 크론병 및 기타 장-관련 병리 검출 및 진단을 지원하는 IgG 및/또는 IgA 항체 어레이 분석 절차를 설명한다. 일부 양태에서, 모든 시약은 테스트 분석 시작 전에 실온에 도달하도록 방치한다. 테스트 분석 절차는 원하는 유형의 소맥 관련 항원 및/또는 펩티드의 원하는 개수로 코팅된 원하는 개수의 웰 또는 플레이트를 준비하는 것을 포함한다. 미량역가 웰이 준비되면, 1:100 희석된 대조 교정자 100ul를 다중 채널 피펫을 사용하여 도 3에 도시된 바와 같이 미량역가 플레이트의 행 A와 B에 첨가한다. 약 100ul의 1:100 희석된 환자의 테스트 샘플, 여기에서는 혈청을, 임상 검체 1에 대하여는 행 C 및 D에, 임상 검체 2에 대하여는 행 E 및 F에, 임상 검체 3에 대하여는 행 G 및 H에 중복 첨가한다.

도 4와 같이 별도의 플레이트에 임상 검체와 유사하게 주기적으로 음성 및 양성대조군이 실시되었다.

플레이트는 실온에서 60분 배양하였다. 배양 후, 월을 비우고, ELISA 세척기를 이용하여 PBS로 4회 세척하였다. 최적의 희석된 알칼리성 포스파타제-표지 염소 항-인간 IgA 100ul를 IgA 플레이트에 첨가하고 또는 효소-표지 IgG 100ul를 최적의 희석 상태에서 IgG 플레이트에 첨가하였다.

각각의 플레이트를 실온에서 30-60분 배양하였다. 결합-배양이 끝나기 약 10 분 전에, p-니트로페닐인산염 정제 5mg를 기질 완충액 5ml와 혼합하고 정제가 완전히 용해될 때까지 혼합하여 기질 용액을 제조하였다. ELISA 세척기를 이용하여 PBS로 4회 세척을 반복하였다. 이후 기질 용액 약 100ul를 각 웰l에 첨가하였다. 플레이트를 직사광선 노출을 피해 실온에서 30분 배양하였다. 반응은 3N NaOH를 약 50ul 첨가하여 반응을 중지시켰다. 블랭크 웰에 대하여 405 nm에서 미량역가 플레이트 리더를 사용하여 웰의 색 강도를 판독하고, 교정자, 대조군 및 미지 샘플 흡광도 값을 기록하였다.

C. 계산 결과

405 nm에서 플레이트를 판독하여 광학밀도값 (OD405)를 얻은 후, 음성 대조군 평균 OD, 양성 대조군 평균 OD, 각각의 임상 검체의 평균 OD를 행 A 및 B의 교정자 평균 OD로 나누어 각각의 인덱스 값 (IV)를 얻었다.

각 항체에 대한 인덱스 값 (IV)는 12종의 원에 대하여 각각의 이중 샘플의 평균OD를 교정자 대조 값의 평균 OD로 나누어 계산하였다 (예를 들어, 웰 C1 및 D1의 평균 OD를 웰 A1 및 B1의 평균 OD로 나누고, 웰 C2 및 D2의 평균 OD를 웰 A2 및 B2의 평균 OD로 나누고, 웰 C3 및 D3의 평균 OD를 웰 A3 및 B3의 평균 OD로 나누고 등)

결과는 설정된 기준 범위와 비교한다.

소맥 항원 인덱스 계산

Cal 1 (OD) 0.41, Cal 2 (OD) 0.44, 샘플 3A (OD) 3.77, 샘플 3 B (OD) 3.79

인덱스 8.93

D. 결과 해석

만성소화장애증 3 명의 환자, 글루텐 면역 반응성 및 과민성 3 명의 환자, 및 글루텐 반응성 및 과민성과 중복되는 크론병 3명 환자의 IgG 및 IgA항체 패턴의 예를 표 2-7에 나타낸다. 또한 지역 장염으로 알려진 크론병은 강한 유전적 요소를 가지는 염증성 장 질환의 일종이다. 때로 면역 질환으로 설명하지만, 면역결핍 질환으로도 간주된다.

만성소화장애증 및 글루텐 면역 반응성/과민성/자가면역 간의 데이터 해석과 실험실적 구별은 표 8에 도시된다. 특히, 만성소화장애증은 무증상 만성소화장애증, 글루텐 면역 반응성/과민성 및/또는 글루텐-관련 자가면역과 구별될 수 있다는 것에 주목한다:

a. 무증상 만성소화장애증의 혈청학적 패턴은, 소맥 단백질,α-글리아딘 33-메르, 탈아미드화 α-글리아딘 33-메르, α-글리아딘 25-메르, α-글리아딘 18-메르, α-글리아딘 17-메르, γ-글리아딘 15-메르, ω-글리아딘 17-메르, 글루테닌, 탈아미드화 글루테닌, 글루테오몰핀, 프로디놀핀 및 소맥 배아 아글루티닌의 임의의 또는 조합에 대한 IgA 및/또는 IgG의 테스트 결과가 포지티브, 및 트랜스글루타미나제-2에 대한 네가티브, 및 최소한 트랜스글루타미나제-2 및 트랜스글루타미나제-6 중 하나에 대한 IgA 및 IgG 결과의 최소한 하나가 포지티브로 나타난다.

b. 글루텐 면역 반응성 및 과민성의 혈청학적 패턴은, 소맥 항원, 특히 천연 α-글리아딘, γ-글리아딘, ω-글리아딘, 글루테닌, 탈아미드화 글루테닌, 글루테오몰핀, 및 소맥 배아 아글루티닌에 대한 IgA 및/또는 IgG의 테스트 결과가 포지티브, 그러나, 탈아미드화 α-글리아딘에 대하여는 그렇지 않고 및 트랜스글루타미나제-2에 대하여는 그렇지 않은 것으로 나타난다.

c. 글루텐 면역 반응성/과민성 및 자가면역에 대한 진단은, 소맥 항원, 특히 천연 α-글리아딘, γ-글리아딘, ω-글리아딘, 글루테닌, 탈아미드화 글루테닌, 글루테오몰핀, 및 소맥 배아 아글루티닌에 대한 IgA 및/또는 IgG의 테스트 결과가 포지티브, 및 글루탐산 디카르복실라제, 소뇌조직항원 또는 펩티드 또는 다른 조직항원에 대한 임의의 IgG, IgA 또는 IgM의 결과가 포지티브 및, 및 탈아미드화 α-글리아딘, 탈아미드화 글루테닌 또는 트랜스글루타미나제-2에 대한 IgA의 결과가 네가티브, 그러나 트랜스글루타미나제-3 및/또는 트랜스글루타미나제-6에 대한 IgA 또는 IgG의 결과는 포지티브로 나타난다.

보고 범위 및 기준 범위는 수시로 업데이트 될 수 있고 표 1에 표시된다. 독자는 평균 이상의 2 표준들 (standards)에서 설정된 기준 범위와 비교할 때, tTg 및 글리아딘-tTg 복합체에 대한 IgA 항체가 높은 포지티브 (CD 진단을 확인)이지만, IgG 및 IgA항체의 패턴 및 강도는 항원마다 다르다는 것을 알 수 있다. 예를 들어, 만성소화장애증을 가진 3명의 환자에서 소맥 항원에 대한 IgG 및 IgA 모두 기준 범위보다 4-6배 높지만, α-글리아딘 33-메르에 대하여 IgG 및 IgA가 측정될 때 IgG 항체 수준은 하나에서 상당히 상승되고 IgA 수준은 3명의 환자 중 2명에서 그러하다 (표 2, 3).

글루텐 면역 반응성 및 과민성을 가진 환자에서 만성소화장애증을 가진 환자에 비해 세 환자 아무도 tTg 및 글리아딘-tTg 복합체에 대한 상당한 IgA반응을 보이지 않았지만, 소맥 항원 및 하나 이상의 소맥 펩티드 조합 (α-글리아딘, γ-글리아딘, ω-글리아딘, 글루테닌, 글루테오몰핀, 프로디놀핀 및 소맥 배아 아글루티닌)에 대한 IgG 및 IgA 항체는 크게 상승했다. 소맥 항원 및 tTg 및 글리아딘-tTg 복합체 조합의 펩티드에 대한 IgA 면역 반응은 명확하게 만성소화장애증 및 글루텐 면역 반응성/과민성 사이에서 구별되었고, IgG 및/또는 IgA항체는 다양한 소맥 항원 및 펩티드에 대하여 반응성이지만 tTg 및 글리아딘-tTg 복합체에 대하여는 그렇지 않다 (표 4, 5).

표 6과 7은 크론병을 가진 세 환자의 결과를 제시한다. tTg 및 글리아딘-tTg 복합체에 대한 IgG 및 IgA 항체의 패턴은 명확하게 이들 환자는 크론병뿐만 아니라, 또한 글루텐 면역 반응성/과민성, 아마도 또한 만성소화장애증을 앓고 있다는 것을 보인다 (표 6, 7).

사례 연구 실시예

4 가지 사례 실시예들, 첫 번째 만성소화장애증 환자, 두 번째 글루텐 과민성 환자, 세 번째 글루텐 과민성 및 자가면역 환자, 및 네 번째 크론병 중복 글루텐 과민성 환자의 사례가 하기된다.

A. 사례 실시예 # 1: 글리아딘 및 조직 트랜스글루타미나제에 대한 IgA의 적용에 의한 노인의 만성소화장애증의 진단 및 무-글루텐 다이어트에 대한 개선

장기간 소화불량, 소화불량증, 피로 및 급격한 체중 감소를 겪는 76세의 남성의 위장관 평가가 조회되었다. 혈액검사는 엽산 및 비타민 B-12의 낮은 농도로 대적혈구 빈혈을 보였다. 환자의 헤모글로빈 농도가 79g / L, 알부민 32g / L, 및 트랜스글루타미나제 212 ug/ml (정상 범위 = 0 ~ 10 ug/ml). 급히 대장내시경검사 및 십이지장 생검을 시행하였고, 현미경학적 소견은 정상이었다. FDA의 승인 키트를 사용하여 글리아딘과 트랜스글루타미나제에 대한 IgG 및 IgA 농도를 확인하였다. α-글리아딘에 대한 IgG 및 IgA 모두 매우 높았고; 트랜스글루타미나제에 대하여는 IgG가 아닌 IgA가 기준 범위보다 3.8 배 높았다. 글리아딘과 트랜스글루타미나제에 대한 IgA 포지티브 만성소화장애증 진단에 따라 2 유닛의 포장 세포 수혈과 무-글루텐 다이어트 요법 및 매일 프레드니손 20mg이 처방되었다. 6 개월 후, 체중이 12 파운드 늘었고, 거의 GI 증상을 보이지 않았다 개선되고 있으므로 환자는 무-글루텐 다이어트 요법에 전념하였다. 첫 글리아딘 및 트랜스글루타미나제에 대한 IgG 및 IgA 항체 테스트 1 년 후, 다시 이러한 항체 테스트를 의 실시하였고 결과는 네가티브였고, 이는 질환 관리와 함께 무-글루텐 다이어트 요법이 무증상 만성소화장애증의 노인 환자에게 유용하였다는 것을 보인다.

토론: Catassi 등에 따르면 (1, 1), 만성소화장애증 (CD)는 서양국가에서 가장 일반적인 평생 질환 중 하나이다. 그러나 CD의 대부분은 주로 주치의가 이러한 중요한 질환에 대한 인식 부족으로 인하여 진단되지 않는다 (논문). 만성소화장애증은 흡수장애를 동반 GI 증상이 나타나는 것으로 인지된다. 그러나 만성소화장애증을 가진 많은 환자는 GI 증상을 보이지 않는다. 이러한 개인은 무증상 또는 비정형 만성소화장애증을 가지는 것이고, 이러한 병태에서는 철분 결핍, 간 효소 상승, 골다공증 또는 신경학적 증상을 보인다 (12). 본원에서, 용어 "비정형 만성소화장애증"은 미묘한 증상만을 가지는 환자의 만성소화장애증을 지칭하며, 용어 "무증상 만성소화장애증은" 증상이 없는 환자의 만성소화장애증을 언급하는 것이다.

만성소화장애증에 대한 인식이 증가하는 것은 높은 민감도 및 특이성을 가지는 새로운 혈청학적 분석장치의 사용에 기인한다. 최근까지 만성소화장애증은 일반적이지 않고 주로 유아기 또는 아동기 중에 발견되는 것으로 잘못 인식되었다. 그러나 지금 40~60세 성인에서 CD의 대부분의 경우가 발병하는 것으로 인식된다. 이 연령 그룹의 환자는 비-전형적인 방식의 증상, 실험실 테스트 결과 및 기타 테스트 징후를 보인다. 실제로, 가장 최근의 문헌에 따르면, 일곱 환자 중 한 명은 CD로 정확하게 진단된다 (13).

따라서, 본 사례에서 보듯, 흡수 불량 증상 및 징후를 보이면, 글리아딘 및 트랜스글루타미나제에 대한 IgA 항체 테스트가 고려되어야 한다. 테스트 결과가 포지티브인 경우, 만성소화장애증은 감별 진단의 일부가 되어야 하고, 이에 따라 무-글루텐 다이어트가 권장되어야 한다. 무-글루텐 다이어트가 증상 개선을 보이면, 환자는 연령에 관계없이 다이어트에 전념하여야 한다.

B. 사례 실시예 # 2: 마취제, 항생제 및 진통제의 배합에 의해 유도된 글루텐 면역 반응성 및 과민성

46세의 여성은 매년 검진을 받았다. 건강 검진 및 정상 CBC, 간 효소 등의 화학적 결과, 자가면역 프로필에 따라, 그녀는 건강한 사람으로 분류되었다. 이 당시 글루텐 항체는 측정되지 않았다. 몇 달 후 그녀는 치아뿌리관, 골이식 및 치아이식을 위하여 치과를 방문하였다. 십일 이상 5회 방문하는 동안 마취제 (메피바케인), 항생제 및 진통제가 처방되었다. 4 개월 후 리도카인으로 국부 마취 후 항생제 (아목시실린) 및 진통제 처방으로 치아 이식 절차는 완료되었다. 4 시간 후 그녀는 특히 입술과 눈 주위 부종으로 국부적 부종이 동반된 심한 알레르기 반응을 보였다. 환자는 초조해졌고, 전신 가려움, 특히 얼굴, 손 및 발 가려움증을 보였다. 천명 동반 가슴 죄임 및 호흡 곤란은 사용된 의물 중 하나 이상에 대한 알레르기 반응의 표시였다. 즉시 근육 내로 항히스타민 치료제가 보충된 아드레날린을 체중의 kg 당 0.01 mL를 투여하였다. 알레르기 반응이 제어되었지만, 환자는 심한 구토 및 심한 복통을 동반한 설사가 8일 동안 진행되었다. 2 주 후 설사는 진정되었지만, 환자는 팽만감과 과민성 대장-유사 증후군의 복부 불쾌감이 계속되었다. GI 전문가에게 의뢰되었고 철저한 검사에도 별다른 사항이 발견되지 않았다. 이때 글루텐 과민성 가능성이 고려되었고, HLA형 검사 및 IgG와 IgA 항- 글리아딘 및 항-트랜스글루타미나제 항체 검사가 수행되었다. 면역 테스트 결과는 다음과 같았다: IgG 항-글리아딘 6.8 U / mL (정상 범위 <20 U / ㎖) IgA 항-글리아딘 4.1 U / mL (정상 범위 <20 U / ㎖), IgG 항-tTg 2.1 U / mL (정상 범위 <6 U / ㎖) IgA 항-tTg 1.2 U / mL (정상 범위 <4 U / ㎖); HLA DQ2와 DQ8는 네가티브. 이러한 결과를 기초로, 글루텐 과민성 및 만성소화장애증은 제외되었고, 환자가 마취제 및 항생제와의 상승 효과에 대한 반응과 관련된 심인성 또는 특이 체질 반응으로 고통을 받는 것으로 결론 내렸다. 90 일 이후 다음 방문 시 환자는 여전히 특히 식사 후 1~3시간에 팽만감 및 복부 통증을 호소하였다. 반복 테스트가 요청되었고, 크론병과 궤양 성 대장염을 의심하여 시행되는 ASCA 및 P-ANCA IgG와 함께 항-글리아딘 및 -tTg IgG및 IgA에 대한 기본 테스트 및 포괄 테스트가 주문되었다. 흥미롭게도, 최초 GI 불쾌감 약 100일 후에, ASCA 및 P-ANCA는 완전히 정상 범위이지만, 글리아딘에 대한 IgG와 IgA 모두는 기준 범위보다 4 내지 9 배 높았다 (글리아딘 IgG = 79 U / ML; IgA= 54 U / ㎖). 그러나, tTg에 대한 IgG 및 IgA 항체는 정상 범위 내에 있었다. 또한, IgG 및 IgA항체 검사는 소맥, 글리아딘, 글루테닌, 소맥 배아 아글루티닌, 글리아딘-tTg 복합체 및 tTg 항원에 대해 수행되었다. IgG은 12 종의 피-테스트 항원 중 8 종에서 IgA는 12 종의 피-테스트 항원 중 8 종에서 설정된 기준 범위보다 2-7배 이상에서 검출되었다. tTg 및 글리아딘-tTg 복합체에 대한 IgG 및 IgA 모두는 네가티브였다 (표 4 및 5, 샘플 # 1 참고). 트랜스글루타미나제에 대하여는 아니지만 글리아딘에 대한 기본적인 IgG와 IgA테스트의 포지티브 결과는, 환경 요인에 대한 알레르기 반응으로 인하여, 소맥 항원에 대한 내성을 상실하고 만성소화장애증은 아니지만 글루텐 과민성으로 진행하였다는 것을 보인다. tTg에 대한 IgG 및 IgA의 상승이 없을지라도, 연속적인 GI 불쾌감 및 글리아딘에 대한 상승 IgG 및 IgA으로 인하여, 무-글루텐 다이어트가 추천되고 IgG 및 IgA 모두에 대하여 WGA 수준이 상승되었으므로 영양사는 환자에게 활생균 섭취 및 무-글루텐 및 무-렉틴의 제한된 다이어트를 계속하도록 조언하였다. 다이어트 및 활생균 섭취 6개월 후, 환자의 GI 불쾌감은 진정되었고, 정상 상태로 회복되었다.

토론: 용어 글루텐 과민성은 트랜스글루타미나제에 대하여는 그렇지 않지만 글리아딘에 대한 IgG, IgA 또는 둘의 상승으로 표시되는 글루텐에 대한 강한 면역 반응의 상태를 지칭한다 (14). 글루텐 과민성은 점막 면역 항상성에 영향을 미치는 환경적 요인으로 인해 소맥 항원 및 펩티드에 대한 점막 면역 관용의 상실로 개시된다.

본 사례에서, 글루텐 과민성은, 촉발 인자가 소맥 및 관련 항원에 대한 면역 관용에 영향을 준 후 거의 100 일 후 GI 증상 및 면역 테스트, 특히 글리아딘 및 관련 단백질 및 펩티드에 대한 IgG 및 IgA로 확인되었다. 이 환자의 경우, 마취제, 항생제와 진통제의 상승 효과로 점막 면역 시스템의 조절 장애를 초래하였고, 이어 소맥 및 기타 식이 단백질 및 펩티드에 대한 면역 관용의 붕괴에 이른 것으로 보인다. 이것은 아마도 소화 효소 활성에 대한 환경 요인의 효과와 함께, 폐쇄막 개방 및 점막하, 림프절 및 혈액순환으로 소화되지 않은 소맥 단백질 및 펩티드의 진입을 유도하였다. 이러한 항원은 이후 항원 제시 세포에 의해 T 세포와 B 세포에게 제시되었다. 이 과정에서 글리아딘-특이적 B 세포는 글리아딘-특이적 T 세포에 의해 지원되어, B 세포 클론 확장과 글리아딘과 관련된 단백질과 펩티드에 대한 IgG와 IgA 항체 방출로 이어지고, 본 사례에서는 원래 외상 경험 후 100일 후에 검출된 것이었다.

마취제와 항생제 사용과 관련된 GI 불쾌감을 가진 환자에 대한 글루텐 과민성 검사는 효율적으로 글리아딘 및 관련 단백질 및 펩티드에 대한 순환 IgG와 IgA를 측정하여 쉽게 저렴하게 수행 할 수 있다. 이렇게 하지 ??않으면 환자에 대한 정확한 진단 및 무-글루텐 다이어트에 의한 적절한 치료를 기회가 없을 뿐만 아니라 관련 부작용이 동반되는 불필요한 치료를 초래할 수 있다.

C. 사례 실시예 # 3: 글루텐 면역 반응성, 과민성 및 자가 면역

본 사례는 과민성 대장 증후군으로 초기 잘못 진단되어 잘못된 치료 결과에 이른 것이다. 오진 년 후에 글루텐 면역 반응성 및 과민성에 대한 정확한 진단이 이루어졌다.

복통, 변비, 산 역류와 두통을 가진 49 세 여성 환자가 내과 검사하였다. 검사 결과 헤모글로빈 10.8 g/dl로 정상 CBC 및 간 효소 등 정상 화학적 프로파일을 보였다. 여러 방문을 통해 수행된 ANA, 류마티스 인자, T3, T4, TSH 수준 등 자세한 생화학적 및 면역학적 프로파일은 정상 범위 내에 있었다. GI 불쾌감에 대한 반복적인 불만이 있었으므로, 환자는 GI 평가를 받았다. 내시경 검사 및 헬리코박터 파이로리 (H. pylori)의 테스트 결과는 모두 정상이었다. 환자는 과민성 대장 증후군으로 진단되고 β-차단제와 넥시움이 처방되고 증상은 상당히 호전되었다. 4 년 후, 그러나, 이전 GI 증상과 두통 이외에, 권태, 흐린 시력 및 안면 발진 증상을 보였다. 간헐적으로 졸리고 짜증 및 경험적 호흡 문제가 있었다. 추가 실험실 테스트 결과는 다음과 같다: MCV 72fL과 함께 헤모글로빈 9.7 g/dl, 상승된 적혈구 침강 속도 (46mm/1 시간), ANA 1:80 (정상 범위 <40), IgA 평활근 항체의 가벼운 상승: 이중-나선 DNA와 추출 핵 항체는 음성. 가능한 증거에 기초하여, 전신홍반루푸스 (SLE)로 진단되고, 스테로이드 치료를 시작하였다. 전체적으로 일부 개선했지만 헤모글로빈 수준은 계속 낮았고, ESR은 변화 심하였다. 2 년 후 몸통과 다리에 따끔거림 감각 장애와 함께 소변에 어려움이 있어, 신경과에 의뢰되었다. 정밀 상담으로 몸통에 띠와 같은 느낌이 있고 최소한의 안구 통증이 있고 시력 감소 (우안 8/46, 좌안 8/23)이 있다는 것이 밝혀지고, 그러나 안구 운동은 정상이었다. 실험실 검사는 낮은 헤모글로빈, 비정상 MCV, 14 ㎍ / L의 낮은 혈청 페리틴 (정상 범위 10-150 ㎍ / L)를 보였고, 철분 결핍으로 확인되었다. 뇌의 MRI 검사는 전형적인 다발성 경화증이 아닌 광범위한 백질 이상을 보였으나, CSF 검사에서 이상은 발견되지 않았다. 혈액 및 CSF 검사는 결핵균, 매독, 보렐리아, EBV, CMV, HTLV, 및 헤르페스 타입-6 등의 세균과 바이러스 감염의 증거를 보이지 않았고, 시각유발전위는 시신경 양쪽에서 지연을 보였다. 이러한 비정상적 관점, 및 초기 검사에서 글루텐 과민성 테스트가 수행되지 않았으므로, 글루텐 과민성의 가능성이 고려되었다. 소맥 단백질 및 펩티드뿐 아니라 tTg 및 다양한 조직 항원에 대한 포괄적인 IgG 및 IgA 패널이 주문되었다. 포괄적인 글루텐 과민성 및 면역반응성 선별 결과, 소맥 항원, α-글리아딘 33- 및 17-메르, γ- 및 ω-글리아딘, 글루테닌, 글루테오몰핀, 프로디놀핀, 글리아딘-tTg 복합체, 소맥 배아 아글루티닌, 및 글루탐산 디카르복실라제 65 (GAD-65) 대한 IgG를 확인하였다. 소맥 항원 및 소맥 배아 아글루티닌에 대한 IgA 항체가 확인되었다 (표 4, 5 참조, 샘플 # 3). 흥미롭게도, tTg에 대하여는 IgA 및 IgG 모두 정상 범위 내에 있었다.

또한, 강글리오시드, 소뇌, 시납신, 수초 기본단백질, 콜라겐, 티로글로불린 및 갑상선 과산화효소에 대한 항체를 검사하고, 이들은 모두 기준 범위보다 2-4배 이상이었다. 상부 위장관 내시경 검사 및 조직검사 결과, 정상 조직 및 상피내 림프구를 보였다. 전체적으로 환자는 글루텐 실조, 두통, 백질 이상, 및 시각신경척수염을 포함한 관련 자가면역 및 글루텐 과민성을 가진 것으로 진단되었다. 정맥내 메틸프레드니솔론 5 일 투여 후 점차적으로, 감각, 운동 및 시각 증상이 개선되었다. 또한, 소맥 항원 및 펩티드의 레퍼토리에 대한 IgG 및 일부 IgA항체의 매우 높은 수준에 비추어, 무-글루텐 다이어트가 실시되었고, 12 주 후에 환자의 임상 증상은 놀랍게 개선된 것으로 관찰되었다. 영양사의 관리 하에 100 % 무-글루텐 다이어트를 계속하고 스테로이드 치료를 중단하였다. 다이어트 실시 6 개월 후, 소맥 항원, 펩티드 및 인체 조직에 대한 항체 테스트가 반복되었다; 항체 수준이 60 % 이상 감소되었고, 환자는 거의 증상이 사라졌다.

토론: 본 데이터로부터 비정상적인 조직 또는 편평 미란성 위염 및 만성소화장애증의 진단이 통상 이루어지는 tTg에 대한 항체가 존재하지 않아도 글루텐 면역 반응성 및 과민성이 있을 수 있다는 것을 알 수 있다. 글루텐 과민성과 면역반응성을 가진 환자는 특히 소맥 단백질 및 펩티드에 대한 IgG와 IgA항체의 적절한 실험실 테스트를 기반으로 적시에 감지되지 않은 경우, 환자의 증상들로 의사들은 루푸스, MS-유사 증후군, 시각신경척수염, 및 많은 다른 자가 면역 질환으로 오진할 수 있다. 따라서 소맥 항원 및 펩티드에 대한 IgG 및 IgA 항체 측정은 자가면역의 징후와 증상 환자에 대한 권장되어 무-글루텐 다이어트가 글루텐 면역 반응성 및 과민성과 관련된 자가면역 상태를 반전시키는 계기가 될 수 있다. 그렇지 않으면, 미-치료 및/또는 잘못된 치료로, 환자는 다중 자가 면역질환으로 진행될 수 있다.

D. 사례 실시예 # 4: 크론병과 중복된 글루텐 면역 반응성 및 과민성

크론병은 환자의 3분의2 이상이 말단 회장 (ileum)에 영향을 미치는 30-40대에 자주 발병하는 염증성 질환이다 (15). 장내세균층 이동 및 이들에 대한 기능장애 응답을 포함한 유전적 및 환경 요인의 조합으로 면역조절곤란, 장의 장벽 기능 변경, 및 잠재적 자가면역으로 이어진다고 보인다 (16).

32세 남성은 한 달에 2-3회 정도 위장관 불쾌감 및 설사를 보인다. 화학적 결과, CBC, 철, 페리틴, 트랜스페린, 비타민 B-12, 갑상선 기능, 소변 분석 등의 실험실 결과는 정상 범위의 중간 수준에 있었다. 두 번째 방문에서 GI 증상 지속으로 GI 전문가에 의한 추가 실험실 검사가 의뢰되었다. 이 테스트는 H. pylori 감염, 효모균 및 글리아딘에 대한 항체의 대변과 혈액 검사의 미생물학적 평가이다. 살모넬라균, 이질균, 예르시니아, 캄필로박터, 장병원성 및 출혈성 대장균 또는 클로스트리듐디피실레 (Clostridium difficile) 검출과 관련하여 대변 검사는 네가티브였다. 혈액 항체 검사에 대하여, H. pylori에 대한 IgG 및 효모균 및 글리아딘에 대한 IgA는 네가티브, 그러나 글리아딘에 대한 IgG는 59 U / ㎖ (정상 값 = <20 U / ㎖) 로 상승했다. IgG 항체의 상승은 비-특이적 또는 보호적인 것으로 간주되었고, 환자는 진통제가 처방되고 특정 질환의 진단 없이 귀가하였다. 3 년 후 하루에 3-5회 물 설사로 지난 두 달 체중이 12 파운드를 빠진, 환자는 다른 GI 전문가에게 갔다. 위장 및 십이지장 생검 및 내시경을 시행하였다. 상부 위장관 내시경 검사는 조직학적으로 위염을 보였으나 십이지장 생검은 음성이었다. D-자일로스 흡수 테스트가 수행되었다; 소변에서 1.89 g/5h의 결과값은 흡수장애의 암시했다. 면역학적 ANA 역가는 1: 40 이하, p-ANCA와 C-ANCA는 음성, 그러나 IgA 항-이질균 항원 (ASCA)은 85 U / ㎖ (정상 = <10 U / ㎖)에서 양성이었다. 물 설사 빈도 증가, 비정상적인 D-자일로스 흡수, 포지티브 IgA 항-ASCA에 따라, 크론병이 진단되었다. 콜레스티라민을 사용하여 치료가 시작되지만 설사의 빈도는 여전하였다. 또한 환자는 메틸프레드니솔론 230mg, 및 메살라진 2 × 1,000 mg으로 치료하였다. 이러한 치료 2년 후 환자가 말단 회장 (ileum)에 S 자로 소화-장내 누공이 생겼다. 병원에 입원 한 후, 회장의 22cm를 절제하였다. 방출 완화를 유지하기 위하여 메살라진 3 × 500 mg이 처방되었다.

이러한 치료 후 8 년 동안 설사 빈도는 증가하였고 체중은 14 파운드 빠졌다. 이 기간 동안 아스피린, 로페라미드 및 부데소니드를 적용한 몇 가지 추가적인 치료 시도는 불행하게도 임상 개선을 보이지 않았다. 또한, 환자는 월 단위로 체중이 더 빠졌다. 의료 기록을 검토한 결과 거의 13년 전 글리아딘 IgG 항체가 상승된 것으로 발견되었지만 당시에는 정상이었다는 것을 알았다. 크론병에 대한 모든 고전적인 치료가 임상 양상을 개선하는 데 실패했기 때문에, 글루텐 면역 반응성 및 과민성의 평가를 위한 포괄적인 테스트가 주문되었다. 이것은 소맥, 천연 탈아미드화 α-글리아딘 펩티드, γ-글리아딘, ω-글리아딘, 글루테닌, 글루테오몰핀, 프로디놀핀, 글리아딘-tTg 복합체, 트랜스글루타미나제, 소맥 배아 아글루티닌, 및 GAD-65에 대한 IgG 및 IgA를 포함하였다.

결과는 표 6 및 7, 샘플 #3에 나타나고, 환자는 12 종의 테스트 항원 중 11 종에 대한 IgG 항체의 상당한 상승, 소맥, α-글리아딘 33-메르, ω-글리아딘, 프로디놀핀, 소맥 배아 아글루티닌, 및 GAD-65에 대한 IgA 항체는 정상 범위보다 2-5 배로 검출되었다. 이러한 결과를 바탕으로, 크론병뿐만 아니라 글루텐 과민성으로도 진단되었다. 쌀, 감자, 기타 무-글루텐/무-효모 식품으로 구성된 식단이 즉시 시작되었고, 6 주 후 설사는 완전히 중단되었다. 무-글루텐 다이어트를 지속하면서 대변 일관성이 정상화 되었고 체중도 불었다. 일년 후에 환자는 정상상태가 되었고 체중은 80% 이상을 회복하였다.

토론: 본 사례는 만성소화장애증이 아닌 글루텐 과민성과 연관된 크론병에 대한 것이다. 무-글루텐 다이어트에 대한 인상적인 임상 반응 및 다양한 소맥 항원에 대한 IgG 및 IgA항체의 검출에 따라, 및 14 년 전에 검출된 IgG 항체 수준의 재평가로, 2차 흡수장애 및 글루텐 과민성이 있는 크론병으로 최종 확정되었다. 트랜스글루타미나제에 대하여는 아니지만 글리아딘에 대한 IgG 항체가 검출되었으므로, 환자의 질병은 크론병이 아닌 글루텐 과민성으로 개시된 것이라고 논의될 수 있었다. 크론병의 초기 진단은 글루텐 지속 노출 및 자가면역질환 제시 (Ventura A et al., Gastroenterol, 1 17: 303-310, 1999) 1999년에 공개되었음에도 이루어졌고, 이것은 무시되었다.

소맥 항원과 같은 환경 요인에 지속적으로 노출되면 장기적으로 염증을 유발할 수 있고, 이는 염증성 장 질환이나 크론병으로 이어진다고 판단된다.

사례에 관한 결론

상기 사례 연구는 만성소화장애증, 글루텐 면역 반응성/과민성, 자가면역의 진단을 확인하기 위한 적절한 실험실 테스트의 중요성을 보인다. 잘못된 테스트 및 오진은 수 년간 고통으로 이어질 수 있음을 보여준다. 그것은 하나의 질환과 다른 것을 구별하는 가장 정확한 정보 및 가장 정확한 진단을 획득하는 것이 중요하다. 도 5와 6은 볼타 등에 의해 제안된 만성소화장애증의 진단에 대한 테스트의 현재 상태 및 정확성을 위하여 제안된 미래의 방향을 요약한 것이다 (17). 도 7은 본 발명의 특정 양태에 따른 본 발명의 프로토콜을 요약하고, 만성소화장애증, 크론병, 글루텐 면역 반응성/과민성 및 자가면역에 대한 가장 정확한 정보 및 확인을 제공할 수 있는 소맥 항원 및 펩티드에 대한 테스트를 제안한 것이다.

본원에 기재된 것 외에도 많은 변형들이 본원에 발명 개념을 벗어나지 않고 가능하다는 것은 당업자에게 명백하다. 따라서 본 발명은 청구범위 주제를 제외하고는 제한되어서는 아니된다. 또한, 명세서 및 청구범위를 해석함에 있어서, 모든 용어는 문맥과 일치하는 최대한으로 광의로 해석되어야 한다. 특히, "구성하는" 및 "포함하는"은 비-배제적 방식으로 요소, 성분 또는 단계를 지칭하는 것으로 해석되어야 하고, 이는 참고된 요소, 성분 또는 단계는 명시되지 않은 다른 요소, 성분 또는 단계와 존재, 또는 활용 또는 조합될 수 있다는 것을 의미한다. 명세서 청구범위가 A, B, C ... N으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 언급하면, 본 문장은 A와 N, 또는 B와 N 등이 아닌 군의 단 하나의 요소를 필요로 하는 것으로 해석되어야 한다.

참고 문헌

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Claims (27)

1. 동물 샘플을 테스트하는 방법에 있어서,
   샘플의 제1 분획 (fraction)과 소맥 항원과의 결합에서 유래하는 제1 신호를 측정하는 단계;
   샘플의 제2 분획과 글리아딘 항원과의 결합에서 유래하는 제2 신호를 측정하는 단계; 및
   샘플의 제3 분획과 (1) 소맥 배아 아글루티닌; (2) 글루테오몰핀; (3) 글루테닌; (4) 탈아미드화 글루테닌; (5) 프로디놀핀; 및 (6) 디놀핀으로 이루어진 군에서 선택되는 항원과의 결합에서 유래하는 제3 신호를 측정하는 단계로 구성되는, 동물 샘플을 테스트하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 샘플은 혈청으로 구성되는, 방법.
3. 제1항에 있어서, 샘플은 타액으로 구성되는, 방법.
4. 제1항에 있어서, 소맥 항원은 α-글리아딘-33-메르, α-글리아딘-17-메르, γ-글리아딘-15-메르, ω-글리아딘-17-메르, 및 글루테닌-21-메르로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
5. 제4항에 있어서, 적어도 하나의 소맥 항원은 탈아미드화 된, 방법.
6. 제1항에 있어서, 동물은 인간인, 방법.
7. 인간으로부터 채취된 샘플을 분석한 테스트 결과를 이용하여 만성소화장애증과 (a) 글루텐 면역 반응성 및 과민성 및 (b) 글루텐 면역 반응성/과민성 및 자가면역 관련 진단을 구별하는 결정 방법에 있어서,
   샘플을 대상으로 탈아미드화 α-글리아딘 33-메르 또는 트랜스글루타미나제-2에 대한 IgA를 테스트 하는 단계; 및
   샘플을 대상으로 탈아미드화 글루테닌 21-메르에 대한 IgA를 테스트 하는 단계로 구성되는, 결정 방법.
8. 제7항에 있어서, 샘플을 대상으로 무증상 만성소화장애증 표시 혈청학적 패턴을 테스트 하는 단계를 더욱 포함하고, 이때,
   적어도 하나의 α-글리아딘 33-메르, 탈아미드화 α-글리아딘 33-메르, α-글리아딘 25-메르, α-글리아딘 18-메르, α-글리아딘 17-메르, γ-글리아딘 15-메르, ω-글리아딘 17-메르, 글루테닌, 탈아미드화 글루테닌, 글루테오몰핀, 프로디놀핀 및 소맥 배아 아글루티닌에 대한 적어도 하나의 IgA 및 IgG 테스트는 포지티브; 및 트랜스글루타미나제-2에 대한 IgA 및 IgG 모두의 테스트는 네가티브, 및 적어도 하나의 트랜스글루타미나제-3 및 트랜스글루타미나제-6에 대한 적어도 하나의 IgA 및 IgG 테스트는 포지티브인, 방법.
9. 제7항에 있어서, 샘플을 대상으로 글루텐 면역 반응성 및 과민성 표시 혈청학적 패턴을 테스트 하는 단계를 더욱 포함하고, 이때,
   적어도 하나의 α-글리아딘, γ-글리아딘, ω-글리아딘, 글루테닌, 탈아미드화 글루테닌, 글루테오몰핀, 및 소맥 배아 아글루티닌에 대한 적어도 하나의 IgA 및 IgG 테스트는 포지티브; 및
   탈아미드화 α-글리아딘, 탈아미드화 글루테닌 또는 트랜스글루타미나제-2에 대한 IgA 및 IgG 모두의 테스트는 네가티브인, 방법.
10. 제7항에 있어서, 샘플을 대상으로 글루텐 면역 반응성/과민성 및 자가면역 표시 혈청학적 패턴을 테스트 하는 단계를 더욱 포함하고, 이때,
    적어도 하나의 천연 α-글리아딘, γ- 글리아딘, ω-글리아딘, 글루테닌, 탈아미드화 글루테닌, 글루테오몰핀, 및 소맥 배아 아글루티닌에 대한 적어도 하나의 IgA 및 IgG 테스트는 포지티브;
    적어도 하나의 글루탐산 디카르복실라제 및 소뇌 조직에 대한 적어도 하나의 IgG, IgA 및 IgM 테스트는 포지티브; 및
    탈아미드화 α-글리아딘, 탈아미드화 글루테닌 또는 트랜스글루타미나제에 대한 IgA 테스트는 네가티브인, 방법.
11. 환자의 적어도 하나의 IgG 및 IgA 항체 선별 방법에 있어서:
    제1, 제2 및 제3 신호 측정으로부터 테스트 결과를 획득하는 단계, 여기에서 제1 신호는 샘플의 제1 분획과 소맥 항원과의 결합에서 유래하고, 제2 신호는 샘플의 제2 분획과 글리아딘 항원과의 결합에서 유래하고; 제3 신호는 샘플의 제3 분획과, (1) 소맥 배아 아글루티닌; (2) 글루테오몰핀; (3) 글루테닌; (4) 탈아미드화 글루티닌; (5) 프로디놀핀; 및 (6) 디놀핀으로 이루어진 군에서 선택되는 황원과의 결합에서 유래하고; 및
    환자가 항체를 가지는지를 확인하기 위하여 제1항의 테스트 결과를 이용하는 단계로 구성되는, 선별 방법.
12. 제11항에 있어서, 항체는 소맥 및 글리아딘 펩티드와 결합하는, 방법.
13. 제11항에 있어서, 항체는 소맥의 알코올 용해성 및/또는 수용성 성분들과 결합하고, 글리아딘 항원은 α-글리아딘-33-메르, α-글리아딘- 17-메르, γ-글리아딘-15-메르, ω-글리아딘-17-메르, 및 글루테닌-21 -메르로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
14. 제11항에 있어서, 환자가 만성소화장애증인지를 확인하기 위하여 테스트 결과를 이용하는 단계를 더욱 포함하는, 방법.
15. 제14항에 있어서, α-글리아딘, γ-글리아딘, ω-글리아딘, 글루테닌, 소맥 배아 아글루티닌, 글루테오몰핀, 프로디놀핀, 트랜스글루타미나제, 및 글리아딘-결합 트랜스글루타미나제 중 적어도 5종에 대한 샘플 항체 테스트 결과를 획득하는 단계를 더욱 포함하는, 방법.
16. 제11항에 있어서, 환자가, 분명한 증상적 만성소화장애증 와는 달리 무증상 또는 비정형 만성소화장애증인지를 확인하기 위하여 테스트 결과를 이용하는 단계를 더욱 포함하는, 방법.
17. 제16항에 있어서, α-글리아딘, γ-글리아딘, ω-글리아딘, 글루테닌, 소맥 배아 아글루티닌, 글루테오몰핀, 프로디놀핀, 트랜스글루타미나제, 및 글리아딘-결합 트랜스글루타미나제 중 적어도 5종에 대한 샘플 항체 테스트 결과를 획득하는 단계를 더욱 포함하는, 방법.
18. 제11항에 있어서 환자가 적어도 하나의 글루텐 면역 반응성 및 과민성 및 자가면역인지를 확인하기 위하여 테스트 결과를 이용하는 단계를 더욱 포함하는, 방법.
19. 제18항에 있어서, α-글리아딘, γ-글리아딘, ω-글리아딘, 글루테닌, 소맥 배아 아글루티닌, 글루테오몰핀, 프로디놀핀, 트랜스글루타미나제, 및 글리아딘-결합 트랜스글루타미나제 중 적어도 5종에 대한 샘플 항체 테스트 결과를 획득하는 단계를 더욱 포함하는, 방법.
20. 제11항에 있어서, 환자가 적어도 하나의 크론병 및 만성면역활성화인지를 확인하기 위하여 테스트 결과를 이용하는 단계를 더욱 포함하는, 방법.
21. 제20항에 있어서, α-글리아딘, γ-글리아딘, ω-글리아딘, 글루테닌, 소맥 배아 아글루티닌, 글루테오몰핀, 프로디놀핀, 트랜스글루타미나제, 및 글리아딘-결합 트랜스글루타미나제 중 적어도 5종에 대한 샘플 항체 테스트 결과를 획득하는 단계를 더욱 포함하는, 방법.
22. 환자의 IgG 및/또는 IgA 항체 존재 선별방법에 있어서, 환자의 항체와 (a) 적어도 하나의 α-글리아딘 및 트랜스글루타미나제, 및 (b) 적어도 하나의 수용성 및 알코올 용해성 소맥 성분들, 소맥 배아 아글루티닌, ω- 및 γ-글리아딘, 글루테닌, 글루테오몰핀, 및 글리아딘-결합 트랜스글루타미나제와의 결합에서 유래하는 신호 측정으로 얻은 테스트 결과를 제공하거나 획득하는 단계; 및 환자가 항체를 가지는지를 확인하기 위하여 제1항의 테스트 결과를 이용하는 단계로 구성되는, 선별 방법.
23. 수용성 및 알코올 용해성 소맥 성분들, α-글리아딘-33-메르, α-글리아딘-17-메르, γ-글리아딘-15-메르, ω-글리아딘-17-메르, 글루테닌-21-메르, 글루테오몰핀 16-메르, 프로디놀핀, 글리아딘-결합 트랜스글루타미나제, 및 소맥 배아 아글루티닌으로 이루어진 군에서 선택되는 테스트 물질이 최소한 3종 결합되어 함유되는 테스트 플레이트.
24. 제23항에 있어서, 테스트 물질이 최소한 5종 결합되어 함유되는, 테스트 플레이트.
25. 제23항에 있어서, 테스트 물질이 최소한 7종 결합되어 함유되는, 테스트 플레이트.
26. 제23항에 있어서, 테스트 물질 각각이 결합되어 함유되는, 테스트 플레이트.
27. IgG 및/또는 IgA 항체 측정을 위한 제23항의 테스트 플레이트, 및 테스트 플레이트 사용지시서를 포함하는 테스트 키트.

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