FR3004183A1 - Anticorps anti-gluten desamide et utilisations. - Google Patents

Abstract

La présente invention est relative à un anticorps monoclonal se liant à au moins une protéine désamidée du gluten et ne présentant pas de réaction croisée avec une protéine non désamidée du gluten.

Description

Domaine de l'invention La présente invention se rapporte au domaine du contrôle de l'innocuité de certains produits contenant du gluten désamidé pour les hommes ou les animaux susceptibles de développer des réactions allergiques à ce type de gluten transformé.

Art antérieur Les protéines du gluten, lesquelles englobent les sous-unités protéiques gliadines et gluténines, sont des constituants fréquemment retrouvés dans de nombreux produits alimentaires, en particulier de produits de boulangerie ou de pâtisserie ainsi que les préparations culinaires industrielles, ou encore dans certains produits cosmétiques, ces derniers pouvant comprendre des hydrolysats de protéines et en particulier des hydrolysats de protéines de blé. Les protéines du gluten se caractérisent notamment par leur composition spécifique en acides aminés, ces protéines contenant une teneur élevée en résidus proline (environ 30 % du total des résidus d'acides aminés), et en résidus glutamine (environ 40 % du total des résidus en acides aminés). Les protéines constitutives du gluten se caractérisent aussi par la présence de séquences répétées d'acides aminés. On connait quatre classes de gliadines constitutives du gluten, respectivement les gliadines a, les gliadines (3, les gliadines w2 et les gliadines 0)5. On connaît aussi deux classes de gluténines, respectivement les gluténines de bas poids moléculaire et les gluténines de haut poids moléculaire.

Les protéines du gluten sont utilisées dans l'industrie principalement du fait de leurs propriétés de visco-élasticité et d'insolubilité. Toutefois, le caractère insoluble des protéines du gluten constitue une limitation technique pour étendre davantage leur utilisation industrielle. Une utilisation diversifiée des protéines du gluten a été rendue possible du fait de la disponibilité de glutens modifiés constituant des produits hydro-dispersibles ou hydrosolubles.

Pour l'obtention de glutens modifiés ayant des propriétés accrues d'hydro- dispersibilité ou d'hydrosolubilité, on a généralement recours à des méthodes de transformation du gluten natif par désamidation par un traitement acide ou alcalin. Toutefois, un nombre croissant de cas d'allergie aux protéines désamidées a été recensé, sans réaction allergique vis-à-vis des protéines natives. Fréquemment, les symptômes de réactions allergiques aux protéines désamidées sont sévères. Ces symptômes peuvent comprendre un angio-oedème accompagné d'une urticaire généralisée. Les réactions allergiques au gluten désamidé peuvent aussi conduire à la survenue d'un choc anaphylactique.

Des déterminants antigéniques contenus dans les protéines de gluten désamidées et reconnus par les IgE de patients allergiques ont été identifiés (voir Denery-Papini et al., 2012, Allergy, Vol. 67 : 1023-1032). Afin de prévenir les réactions allergiques au gluten désamidé chez les consommateurs, des tests cutanés de détection d'allergies au gluten désamidé ont été décrits (voir notamment Battais et al., 2006, Eur Ann Allergy Clin Immunol, Vol. 38 : 59-61). Toutefois, ces tests cutanés permettent difficilement de différencier entre l'existence d'une allergie aux protéines de blé, en particulier au gluten natif, et l'existence d'une allergie au gluten désamidé. En effet, les fractions protéiques isolées utilisées pour la réalisation de ces tests cutanés contiennent à la fois des protéines natives et des protéines désamidées. Il existe un besoin dans l'état de la technique pour la mise au point de moyens permettant de réduire ou d'éviter la survenue d'allergies au gluten désamidé chez les consommateurs.

Résumé de l'invention La présente invention fournit des molécules de liaison à l'antigène, notamment des anticorps monoclonaux et des fragments de liaison à l'antigène desdits anticorps monoclonaux, ayant la propriété de se lier à au moins une protéine désamidée du gluten, lesdites molécules de liaison à l'antigène ne présentant pas de réaction croisée avec une protéine non désamidée du gluten. Pour mémoire, le gluten comprend les protéines suivantes : gliadines a, gliadines (3, gliadines y, gliadines w2, gliadinse w5, gluténines de faible poids moléculaire et gluténines de haut poids moléculaire. Les gluténines de bas poids moléculaire possèdent un poids moléculaire inférieur à 90 000 et les gluténines de haut poids moléculaire possèdent un poids moléculaire égal ou supérieur à 90 000. En général, le gluten comprend environ 60 % à 70 % en poids de gliadines et environ 30 % à 40 % en poids de gluténines, par rapport au poids total du gluten. Les gliadines sont composées d'environ 4 % à 11 % en poids de gliadines w5, d'environ 8 % à 22 % en poids de gliadines w2, d'environ 26 % à 29 % en poids de gliadines 43 et d'environ 10 % à 26 % en poids de gliadines y, par rapport au poids total du gluten.

L'invention concerne notamment une molécule de liaison à l'antigène sous la forme d'un anticorps monoclonal ayant la propriété de se lier à au moins une protéine désamidée du gluten, lesdits anticorps monoclonaux ne présentant pas de réaction croisée avec une protéine non désamidée du gluten, lequel anticorps monoclonal est produit par l'hybridome déposé selon le Traité de Budapest à la CNCM le 25 février 2013 sous le numéro d'accès I-4717 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur de Paris. L'invention est aussi relative à une molécule de liaison à l'antigène, notamment un anticorps monoclonal, comprenant au moins une chaîne choisie parmi une chaine lourde ou une chaine légère, ladite molécule de liaison à l'antigène comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDRs qui ont été séquences selon le protocole qui est décrit à l'exemple 1 à partir des cellules de l'hybridome déposé selon le Traité de Budapest à la CNCM le 25 février 2013 sous le numéro d'accès I-4717 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur de Paris.

Selon un premier aspect, les molécules de liaison à l'antigène selon l'invention sont notamment caractérisées en ce qu'elles se lient à une protéine désamidée du gluten choisie parmi une gliadine désamidée et une gluténine désamidée et ne présentent pas de réaction croisée avec une gliadine non désamidée et une gluténine non désamidée. Selon un second aspect, les molécules de liaison à l'antigène selon l'invention sont notamment caractérisées en ce qu'elles se lient à les gliadines désamidées choisies dans le groupe comprenant les gliadines a désamidées, les gliadines (3 désamidées, les gliadines w2 désamidées et les gliadines w5 désamidées et ne présentent pas de réaction croisée avec les gliadines non désamidées correspondantes. Selon un troisième aspect, les molécules de liaison à l'antigène selon l'invention sont notamment caractérisées en ce qu'elles se lient auxgluténines de de bas poids moléculaire désamidées et ne présentent pas de réaction croisée avec les gluténines de bas poids moléculaire non désamidées. L'invention a également trait à un complexe formé entre une molécule de liaison à l'antigène telle que définie ci-dessus et une protéine de gluten désamidée.

La présente invention concerne aussi des procédés et des kits pour détecter la présence d'une protéine désamidée du gluten dans un échantillon, pour lesquels est utilisée une molécule de liaison à l'antigène selon l'invention. Description des figures La Figure 1 illustre la capacité d'un anticorps monoclonal selon l'invention à se lier à une variété de glutens désamidés sans présenter de réaction croisée avec une protéine non désamidée de gluten (la gliadine w5). En abscisse : dilutions croissantes de l'anticorps monoclonal. En ordonnées, valeur d' absorbante (DO) à 490 nanomètres. Courbes : « - » : gliadine désamidée ; « ^ » : gluten désamidé n° 1 ; « A » ; gluten désamidé n° 2 ; « X » gluten désamidé n° 3 ; « * : gliadine w5 native non désamidée. La Figure 2 illustre la capacité d'un anticorps monoclonal selon l'invention à se lier aux protéines désamidées constitutives du gluten désamidé, sans présenter de réaction croisée avec des protéines de gluten natives. En abscisse : dilutions croissantes de l'anticorps monoclonal. En ordonnées, valeur d'absorbance (DO) à 490 nanomètres. Courbes : n°1 « -- » : gliadine a native ; n° 2 « -A-y » : gliadine y native ; n° 6 « - *-w5 » : gliadine w5 native ; n° 7 « - - LMW » : gluténine de bas poids moléculaire native ; n° 9 « a-D » : gliadine désamidée ; n° 11 « ^-o2-D » : gliadine w2 désamidée ; n° 12« X -w5-D » : gliadine w5 désamidée ; n° 5 « ^-(3 » : gliadine f3 native ; n° 8 « X -w2 » : gliadine w2 native ; n° 4 « - HMW » : gluténine de haut poids moléculaire native ; n° 3« - BSA » : albumine bovine sérique native ; n° 13 « - y-D » : gliadine y désamidée ; n° 10 « A Glut. LMW-D » : gluténine de bas poids moléculaire désamidée. La Figure 3 illustre la capacité d'un anticorps monoclonal selon l'invention à se lier à des gliadines désamidées sans présenter de réaction croisée avec des gliadines natives, évaluée selon un test immunologique du type ELISA compétitif. En abscisse : pourcentage d'inhibition de la liaison de l'anticorps monoclonal au peptide LQPEEEPFPEQC (SEQ ID N° 13). Courbes : « A » : gliadines natives ; « - » : gliadines désamidées.

Description détaillée de l'invention Afin de rendre disponibles des moyens permettant de réduire ou d'éviter la survenue d'allergies au gluten désamidé chez les consommateurs, le demandeur a mis au point des moyens préventifs, sous la forme de procédés et kits permettant pour la première fois une détection fiable et reproductible de la présence de protéines désamidées de gluten dans un échantillon, comme par exemple un produit alimentaire ou un produit cosmétique. Les procédés et kits fournis par la présente invention peuvent aussi être utiles pour satisfaire les éventuelles exigences légales ou réglementaires relatives à la mesure de la présence de gluten dans les produits alimentaires. On rappelle notamment que le Codex Alimentarius établi par l'Organisation Mondiale de la Santé impose de renseigner le consommateur sur la présence ou non de gluten dans les aliments (norme ALINORM 08/31/26). Or, à la connaissance du demandeur, les tests de détection de gluten actuellement disponibles ne permettent pas de détecter avec efficacité la présence de gluten désamidé.

On précise que la disponibilité des procédés et des kits de détection de protéines désamidées de gluten qui sont spécifiés dans la présente description a été permise grâce à l'obtention par le demandeur de molécules de liaison à l'antigène, et en particulier d'anticorps monoclonaux, aptes à se lier sélectivement aux protéines de gluten désamidées.

Molécule de liaison à l'antigène La présente invention fournit en premier lieu des molécules de liaison à l'antigène se liant à au moins une protéine désamidée du gluten et ne présentant pas de réaction croisée avec une protéine non désamidée du gluten.

En particulier, l'invention fournit une molécule de liaison à l'antigène sous la forme d'un un anticorps monoclonal caractérisé en ce qu'il est produit par l'hybridome déposé selon le Traité de Budapest à la CNCM le 25 février 2013 sous le numéro d'accès I-4717 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur de Paris. Par « molécule de liaison à l'antigène », on entend selon l'invention une protéine apte à se lier sélectivement à au moins une protéine désamidée de gluten, et ne présentant pas de réaction croisée avec une protéine non désamidée du gluten. Les molécules de liaison à l'antigène englobent essentiellement, sinon exclusivement, des anticorps monoclonaux et des fragments de liaison à l'antigène provenant d'anticorps monoclonaux. Par « anticorps monoclonal », on entend selon l'invention un anticorps provenant d'une population d'anticorps pratiquement homogène ou totalement homogène. Plus précisément, dans une population d'anticorps monoclonaux, les anticorps individuels sont identiques, à l'exception de mutations survenant naturellement qui peuvent être trouvées en proportions très minimes. Ainsi, au sens de l'invention, un « anticorps monoclonal » englobe une seule molécule d'un anticorps, aussi bien qu'une population homogène d'anticorps monoclonaux, provenant de la croissance d'un seul clone cellulaire, tels qu'un hybridome, ou encore une cellule hôte eucaryote transfectée ou transformée avec un acide nucléique codant pour ledit anticorps. Par « fragment de liaison à l'antigène » ou « fragment fonctionnel » d'un anticorps, on entend selon l'invention une partie d'un anticorps parent comprenant une région impliquée dans la liaison de l'anticorps parent à l'antigène cible, c'est-à-dire à un épitope cible de l'antigène d'intérêt. Un « fragment de liaison à l'antigène » ou « fragment fonctionnel » englobe un fragment choisi parmi un fragment Fv (fragment variable), un fragment scFv (fragment variable simple chaîne), un fragment Fab, un fragment F(ab')2, un fragment Fab', un fragment Fabc, un fragment scFv-Fc, des « diabodies » ainsi que tout autre fragment d'anticorps qui a conservé l'aptitude de l'anticorps parent dont il dérive à se lier à l'antigène, dans le cas présent l'aptitude à se lier sélectivement à au moins une protéine désamidée du gluten. Selon l'invention, l'aptitude d'un anticorps monoclonal ou d'un fragment fonctionnel de celui-ci à se lier à l'antigène, en l'occurrence son aptitude à se lier à au moins une protéine désamidée du gluten, peut être vérifiée en réalisant un test ELISA, comme décrit plus loin dans la description, et encore plus spécifiquement dans les exemples. Selon l'invention, une molécule de liaison à l'antigène est caractérisée en ce qu'elle ne présente pas de réaction croisée avec une protéine non désamidée du gluten. L'absence de réaction croisée avec une protéine non désamidée du gluten est, aux fins de la présente invention, déterminée comme indiqué ci-après. On peut réaliser un test immunologique ELISA comprenant les étapes suivantes : a) fournir un support sur lequel est immobilisée une protéine du gluten à tester, b) incuber le support fourni à l'étape a) avec une molécule de liaison à l'antigène telle que définie dans la présente description, dans des conditions permettant la formation de complexes entre ladite protéine du gluten et ladite molécule de liaison à l'antigène, et c) mesurer un signal représentatif de la quantité de molécules de liaison à l'antigène liées à ladite protéine de gluten. Dans une variante particulière du test immunologique ELISA ci-dessus, l'étape c) comprend les étapes suivantes : cl) incuber le support obtenu à la fin de l'étape b) avec un ligand reconnaissant la molécule de liaison à l'antigène, préférentiellement un anticorps reconnaissant la molécule de liaison à l'antigène, ledit ligand étant marqué par une molécule détectable, et c2) mesurer le signal généré par la molécule détectable, ledit signal étant représentatif de la quantité de molécules de liaison à l'antigène liées à ladite protéine de gluten.

Dans certains modes de réalisation du test immunologique ELISA ci-dessus, la molécule détectable est une enzyme, comme par exemple la peroxydase et l'étape c2) est la suivante : c2) incuber le support obtenu à la fin de l'étape cl) avec un substrat de ladite enzyme, par exemple avec un substrat de la peroxydase, et mesurer le signal généré par le produit issu de la transformation du substrat, préférentiellement par mesure de la valeur d'absorbance de la lumière à la longueur d'onde d'absorption de la lumière par ledit produit. Un mode de réalisation spécifique du test immunologique ELISA du type ci-dessus est illustré dans les exemples. Le test immunologique est réalisé avec des gliadines désamidées de référence qui peuvent être issues d'une fraction de gliadines totales ou choisies parmi les gliadines désamidées et les gliadines f3 désamidées ou les gliadines y désamidées. De manière tout à fait préférée, les gliadines désamidées de référence sont les gliadines y désamidées. Puis on détermine le pourcentage de réaction croisée de la molécule de liaison à l'antigène avec une protéine non désamidée du gluten selon la formule (I) ci-dessous : %CROIS = Valeur du signal « Protéine X »/ Valeur du signal « GLUT-ND » (I) dans laquelle - %CROIS est la valeur de réaction croisée, - « Protéine X » est choisie parmi la gliadine a non désamidée, la gliadine p non désamidée et la gluténine de haut poids moléculaire non désamidée, - « GLUT-ND » est la protéine désamidée du gluten utilisée comme référence, et - la Valeur du signal est la valeur de mesure du signal généré par la fixation de la protéine de liaison à l'antigène sur la protéine de gluten désamidée ou non désamidée considérée, par exemple la valeur d'absorbance de la lumière d'un produit de transformation enzymatique à une longueur d'onde donnée. La molécule de liaison à l'antigène est considérée comme ne présentant pas de réaction croisée avec une protéine non désamidée du gluten lorsque la valeur « %CROIS » est inférieure ou égale à 10, et préférentiellement inférieure ou égale à 5. Selon l'invention, un « fragment de liaison à l'antigène » ou « fragment fonctionnel » englobe aussi une protéine comprenant au moins l'un des CDRs (pour «Complementary Determining Region »), c'est-à-dire l'une des régions de l'anticorps déterminant la complémentarité de l'anticorps avec l'antigène, lesquelles sont localisées dans les régions hypervariables de l'anticorps parent. Au sens de l'invention, un « CDR » est la région d'une immunoglobuline déterminant la liaison à l'antigène (pour «Complementary Determining Region ») signifie une région hypervariable des chaînes légères et des chaînes lourdes des immunoglobulines comme défini par Kabat (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5èEd., US Department of Health and Human Services, NIH, 1991). Une immunoglobuline comprend trois CDRs de chaîne lourde et trois CDRs de chaîne légère. Aux fins de la présente description, les termes « CDR » et « CDRs » signifient, selon le cas, une, plusieurs ou toutes les régions contenant la plupart des résidus d'acides aminés qui sont responsables de l'aptitude d'un anticorps à se lier sélectivement à un antigène cible, c'est-à-dire à un épitope dudit antigène cible. Selon une autre définition, « CDR » ou « CDRs » signifie les régions hypervariables des chaînes lourdes et légères des immunoglobulines, tel que définies selon la numérotation IMGT. Pour mémoire, la numérotation unique IMGT a été définie aux fins de comparer des domaines variables des immunoglobulines, indépendamment du type de récepteur à l'antigène, du type de chaîne ou de l'identité de l'espèce dont les immunoglobulines proviennent. La présente invention est notamment relative à une molécule de liaison à l'antigène comprenant au moins un CDR ayant une séquence ayant au moins 80 % d'identité en acides aminés avec un CDR choisi parmi les CDRs qui sont séquences conformément au protocole décrit à l'exemple 1, à partir de l'hybridome déposé selon le Traité de Budapest à la CNCM le 25 février 2013 sous le numéro d'accès 1-4717 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur de Paris.

Le "pourcentage d'identité " entre deux séquences d'acides aminés ou d'acides nucléiques, au sens de la présente invention, est déterminé en comparant les deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison. La partie de la séquence nucléotidique dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des " gaps ") par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal entre les deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles un acide aminé identique (ou une base nucléique identique) est observé pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux acides aminés (ou entre les deux bases nucléiques) par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité en acides aminés (ou en nucléotides) des deux séquences entre elles. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus. De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité de séquence est déterminé à l'aide du logiciel CLUSTAL W (version 1 .82) les paramètres étant fixés comme suit : (1 ) CPU MODE = ClustalW mp ; (2) ALIGNMENT = " full " ; (3) OUTPUT FORMAT = " aln w/numbers " ; (4) OUTPUT ORDER = " aligned " ; (5) COLOR ALIGNMENT = " no " ; (6) KTUP (word size) = " default " ; (7) WINDOW LENGTH = " default " ; (8) SCORE TYPE = " percent " ; (9) TOPDIAG = " default " ; (10) PAIRGAP = " default " ; (1 1 ) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = " none " ; (12) MATRIX = " default " ; (13) GAP OPEN = " default " ; (14) END GAPS = " default " ; (15) GAP EXTENSION = " default " ; (16) GAP DISTANCES = " default " ; (17) TREE TYPE = " cladogram " et (18) TREE GRAP DISTANCES = " hide ". Au sens de l'invention, une séquence d'acides aminés ayant au moins 80 % d'identité en acides aminés avec une séquence d'acides aminés de référence englobe les séquences d'acides aminés ayant au moins 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou au moins 99 % d'identité en acides aminés avec ladite séquence de référence. Au sens de l'invention, une séquence nucléotidique ayant au moins 80 % d'identité en nucléotides avec une séquence nucléotidique de référence englobe les séquences nucléotidiques 10 ayant au moins 8l% 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou au moins 99 % d'identité en nucléotides avec ladite séquence de référence. La présente invention est relative à une molécule de liaison à l'antigène, notamment un anticorps monoclonal ou un fragment de liaison à l'antigène provenant d'un anticorps 15 monoclonal, comprenant au moins une chaîne légère comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDRs séquencés de la manière précitée. La présente invention est relative à une molécule de liaison à l'antigène, notamment un anticorps monoclonal ou un fragment de liaison à l'antigène provenant d'un anticorps monoclonal, comprenant au moins une chaîne lourde comprenant au moins un CDR choisi parmi 20 les CDRs séquencés de la manière précitée. Dans certains modes de réalisation, la molécule de liaison à l'antigène consiste en un anticorps monoclonal murin, de préférence d'isotype IgGl. Préférentiellement, ledit anticorps monoclonal murin consiste en l'anticorps monoclonal produit par l'hybridome déposé à la CNCM le 25 février 2013 sous le numéro d'accès I-4717, 25 ou en un fragment fonctionnel de celui-ci. Dans certains modes de réalisation, la molécule de liaison à l'antigène comprend une chaine lourde variable (VH) et une chaine légère variable (VO liées entre elles par un peptide de liaison. Le peptide de liaison peut comprendre de 1 à 20 acides aminés de longueur, ce qui englobe 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 acides aminés de 30 longueur. Le peptide de liaison est préférentiellement constitué d'acides aminés Glycine et/ou Serine. Un exemple illustratif d'un peptide de liaison est le peptide Gly4Ser. Le peptide de liaison peut être un multimère du motif monomère Gly4Ser, par exemple (Gly4Ser)2, (Gly4Ser)3 ou encore (Gly4Ser)4.

Les molécules de liaison à l'antigène du type scFv peuvent être préparées par exemple comme décrit par Mc Cafferty et al. (1990, Nature, Vol. 348 ; 552-554) ou encore dans la demande PCT n° WO 92/01047. Dans certains modes de réalisation, la molécule de liaison à l'antigène comprend une structure peptidique sur laquelle est greffée au moins un CDR, ledit CDR étant greffé de manière à préserver tout ou partie des propriétés de reconnaissance de l'antigène cible par le paratope, comme dans l'anticorps parent dont provient ledit CDR. De préférence, dans ces modes de réalisation d'une molécule de liaison à l'antigène selon l'invention, une ou plusieurs des séquences de CDRs définies dans la présente description sont présentes au sein de la structure peptidique, de manière à reconstituer un squelette peptidique favorisant un repliement des CDRs greffés permettant la conservation des propriétés de reconnaissance de l'antigène cible par le paratope, comme dans l'anticorps parent dont provient ledit CDR. Comme structures peptidiques utiles pour le greffage de CDRs, on peut citer notamment la fibronectine, préférentiellement le domaine 10 de la fibronectine de type III, la lipocaline, l'anticaline (voir Skerra et al., 2001, J Biotechnol, Vol. 74(4) : 257-275), la protéine Z provenant du domaine B de la protéine A de Staphylococcus aureus, la thioredoxine A ou encore des protéines comprenant des motifs répétés telle que la protéine répétée ankyrine (« ankyrin repeat » - voir Khl et al., PNAS, Vol. 100 (4) : 1700-1705), les séquences répétées du type « armadillo repeat » retrouvées par exemple dans la f3 caténine, les séquences répétées riches en leucine (« leucine-rich repeat ») retrouvée par exemple dans la tropomyosine ou la tropomoduline, ou encore les séquences répétées du type « tetratricopeptide repeat » retrouvée par exemple dans la sous-unité p67phox de la NADPH oxydase. On peut aussi citer les structures peptidiques dérivées de toxines ou encore les inhibiteurs protéiques de la « neuronal NO synthase » (PIN). Une illustration de l'utilisation de la PIN comme structure peptidique pour le greffage de CDRs est décrite par Bes et al. (2006, Biochem Biophys Res Commun, Vol. 343(1) : 334-344). On peut aussi citer le greffage de CDRs sur l'une des boucles de la néocarzinostatine, comme décrit par Nicaize et al. (2004, Protein SCience, Vol. 13(7) : 18821891).

Une molécule de liaison à l'antigène selon l'invention englobe les anticorps chimériques, et le cas échéant aussi les anticorps humanisés. Les anticorps chimériques sont des anticorps contenant une région variable naturelle (chaîne lourde et chaîne légère) provenant d'un anticorps d'une première espèce donnée, en combinaison avec les régions constantes de la chaîne légère et de la chaîne lourde provenant d'un anticorps d'une seconde espèce, distincte de la première espèce. Les molécules de liaison à l'antigène selon l'invention, en particulier les anticorps selon l'invention, peuvent être préparées en utilisant les techniques de recombinaison génétique. Par exemple, un anticorps chimérique peut être préparé en clonant un ADN comprenant un promoteur et une séquence codant la région variable d'un anticorps monoclonal non-humain de l'invention, y compris d'un anticorps monoclonal murin de l'invention, et la séquence codant la région constante d'un autre anticorps, par exemple la région constante d'un autre anticorps murin ou bien la région constante d'un autre anticorps humain. Un tel anticorps chimérique selon l'invention peut être par exemple un anticorps chimérique souris-souris ou un anticorps chimérique souris-homme, la spécificité pour une protéine désamidée du gluten étant déterminée par la région variable dudit anticorps chimérique et l'isotype étant déterminé par la région constante dudit anticorps chimérique. Des anticorps chimériques ou humanisés peuvent être préparés selon les techniques décrites par Jones et al. (1986, Nature, Vol. 321 : 522-525) par Verhoeyen et al. (1988, Science, Vol. 239 : 1534-1536) ou encore par Riechmann et al. (1988, Nature, Vol. 322: 323-327). Des anticorps chimériques ou humanisés peuvent aussi être préparés selon des techniques connues de l'homme du métier telles que celles décrites par Singer et al. (1992, J Immun, Vol. 150 : 2844-2857), Mountain et al. (1992, Biotechnol Genet Eng Rev, Vol. 10 : 1-142) ou encore Bebbington et al. (1992, Bio/Technology, Vol ? 10 : 169-175).

D'autres techniques de préparation d'anticorps par recombinaison génétique pouvant être mises en oeuvre selon l'invention, ce qui inclut des techniques de greffage de CDR, sont par exemple celles décrites par dans les documents de brevet suivants : EP 0 451 216, EP 0 682 040, EP 0 939 127, EP 0 566 647, US 5,530,101, US 6,054,297, US 5,886,152 ou encore US 5,877,293.

La présente invention concerne aussi un acide nucléique codant une molécule de liaison à l'antigène telle que définie dans la présente description, et en particulier un anticorps monoclonal tel que défini dans la présente description, ou codant un fragment fonctionnel de celui-ci. En particulier, l'invention est relative à un acide nucléique codant un polypeptide comprenant un CDR d'une molécule de liaison à l'antigène définie dans la présente description, ledit CDR étant choisi parmi les CDRs ayant une séquence ayant au moins 80 % d'identité en acides aminés avec les CDRs séquencés conformément au protocole de l'exemple 1. Au sens de l'invention, les termes « acide nucléique », « séquence nucléique », « polynucléotide » peuvent être utilisés de manière interchangeable pour désigner une séquence de nucléotides, qui peut comprendre des nucléotides modifiés, qui peut être un ADN simple brin, un ADN double brin ou un produit de transcription de ces ADNs. L'invention concerne aussi des vecteurs comprenant un acide nucléique tel que spécifié dans la présente description.

Les vecteurs comprennent de préférence des éléments permettant l'expression des acides nucléiques de l'invention dans une cellule hôte. Les vecteurs comprennent un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la transcription ainsi que des séquences de régulation de la transcription appropriées. On peut citer par exemple les vecteurs et systèmes d'expression décrits dans le document de brevet EP 0 380 068.

L'invention a aussi trait à un procédé pour la production d'une molécule de liaison à l'antigène telle que définie dans la présente description, en particulier pour la production d'un anticorps monoclonal tel que défini dans la présente description, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) cultiver des cellules hôtes aptes à produire une molécule de liaison à l'antigène, b) récupérer les molécules de liaison à l'antigène produites par lesdites cellules hôtes. Ces techniques sont bien connues de l'homme du métier. A titre illustratif, les cellules hôtes aptes à produire ladite molécule de liaison à l'antigène englobent les cellules de l'hybridome déposé selon le Traité de Budapest à la CNCM le 25 février 2013 sous le numéro d'accès I-4717 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur de Paris. L'invention est également relative à des vecteurs de clonage et à des vecteurs d'expression dans lesquels est inséré un acide nucléique codant une molécule de liaison à l'antigène telle que définie dans la présente description, ou un fragment fonctionnel de ladite molécule de liaison à l'antigène.

L'invention concerne aussi des cellules hôtes, par exemple des cellules de E. coli, qui ont été transfectées avec un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus. Procédés et kits de détection Le demandeur a montré qu'une molécule de liaison à l'antigène selon l'invention, et en particulier un anticorps monoclonal selon l'invention possédait les propriétés suivantes : - ladite molécule de liaison à l'antigène, en particulier ledit anticorps monoclonal, se lie à une protéine désamidée du gluten, c'est-à-dire aux gliadines a désamidées, aux gliadines y désamidées, aux gliadines w2 désamidées, aux gliadines w5 désamidées et aux gluténines de faible poids moléculaire désamidées, - ladite molécule de liaison à l'antigène, en particulier ledit anticorps monoclonal, ne présente pas de réaction croisée, au sens de l'invention, avec une protéine non désamidée du gluten, - ladite molécule de liaison à l'antigène, en particulier ledit anticorps monoclonal, se lie avec une haute affinité à une protéine désamidée du gluten, c'est-à-dire que des complexes entre une molécule de liaison à l'antigène selon l'invention et une protéine désamidée du gluten peuvent être détectés en utilisant une quantité réduite de ladite molécule de liaison à l'antigène, en particulier une quantité réduite d'un anticorps monoclonal de l'invention. Les propriétés avantageuses ci-dessus d'une molécule de liaison à l'antigène selon l'invention, en particulier d'un anticorps monoclonal selon l'invention, ont permis au demandeur de concevoir des procédés de détection de la présence, dans un échantillon à tester, de gluten désamidé, ou de protéines désamidées du gluten. Plus particulièrement, les propriétés avantageuses de spécificité et d'affinité d'une molécule de liaison à l'antigène selon l'invention, y compris un anticorps monoclonal selon l'invention, ont permis au demandeur de mettre au point des procédés de détection de la présence de protéines désamidées du gluten possédant des caractéristiques de spécificité, de sensibilité et de reproductibilité qui sont compatibles avec un usage industriel, notamment à des fins de détection de protéines désamidées du gluten dans des produits commerciaux destinés à entrer en contact avec le corps humain ou animal, y compris les produits à usage alimentaire et les produits cosmétiques. En conséquence, la présente invention concerne aussi l'utilisation d'une molécule de liaison à l'antigène telle que définie dans la présente description, notamment un anticorps monoclonal tel que défini dans la présente description, pour la détection in vitro de la présence d'une protéine désamidée du gluten dans un échantillon. Elle est aussi relative à une molécule de liaison à l'antigène telle que définie dans la présente description, pour son utilisation dans une méthode in vitro de détection de la présence de gluten désamidé dans un échantillon. L'invention a aussi trait à un procédé pour détecter la présence d'une protéine désamidée du gluten dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes : a) fournir un échantillon à tester, b) mettre en contact ledit échantillon avec une molécule de liaison à l'antigène telle que définie dans la présente description, c) détecter les complexes éventuellement formés entre ledit échantillon et ladite molécule de liaison à l'antigène. A l'étape a), on peut utiliser tout type d'échantillon pour lequel est recherchée la présence d'au moins une protéine désamidée du gluten, y compris des produits finis alimentaires ou cosmétiques ou bien les glutens utilisés comme matières premières pour la fabrication de produits finis. Dans certains modes de réalisation, l'échantillon consiste en une suspension aqueuse obtenue à partir du produit brut à analyser. Dans d'autres modes de réalisation, l'échantillon consiste en une solution aqueuse obtenue à partir du produit brut à analyser. Dans encore d'autres modes de réalisation, l'échantillon consiste en une fraction du produit brut à analyser, ladite fraction pouvant être préparée à l'aide de toute technique permettant de séparer plusieurs constituants du produit brut à analyser et ainsi enrichir l'échantillon en protéines, ou même enrichir sélectivement l'échantillon en gluten ou en certaines protéines constitutives du gluten. De telles techniques de séparation sont nombreuses et font partie des connaissances générales de l'homme du métier. La forte sensibilité du procédé ci-dessus est permise du fait de la bonne affinité de la molécule de liaison à l'antigène pour les protéines désamidées du gluten. C'est la raison pour laquelle le procédé ci-dessus peut être réalisé en utilisant un échantillon de produit fini dans lequel la teneur en gluten est réduite.

Dans certains modes de réalisation du procédé ci-dessus, l'échantillon consiste en un échantillon de gluten qui peut être utilisé comme ingrédient dans la fabrication d'une grande variété de produits, y compris des produits alimentaires et des produits cosmétiques. Comme cela a déjà été indiqué, une molécule de liaison à l'antigène telle que définie dans la présente description peut être avantageusement utilisée pour détecter la présence de gluten désamidé dans un échantillon, à des fins légales ou réglementaires, notamment pour répondre aux exigences actuelles et futures du Codex Alimentarius établi par l'Organisation Mondiale de la Santé. La mise en oeuvre des étapes b) et c) fait partie des connaissances générales de l'homme du métier.

L'étape c) peut être aussi définie comme une étape consistant à détecter la liaison ou la fixation de ladite molécule de liaison à l'antigène sur ledit échantillon. La fixation de la molécule de liaison à l'antigène sur l'échantillon à tester peut être détectée selon une variété de techniques connues, ce qui inclut notamment les tests de type ELISA ou RIA ou encore les techniques d'immuno-empreinte (aussi appelées « Western blotting »). Dans certains modes de réalisation le procédé ci-dessus consiste en test immunologique selon la technique ELISA bien connue de l'homme du métier. A titre illustratif, le support sur lequel est immobilisé l'anticorps peut être un matériau insoluble dans l'eau poreux ou non poreux. Le support peut être hydrophile ou susceptible d'être rendu hydrophile et comprend les poudres inorganiques telles que la silice, le sulfate de magnésium et l'aluminium ; les matériaux polymères naturels, en particulier les matériaux cellulosiques et les matériaux dérivés de la cellulose ; des polymères naturels ou synthétiques tels que la nitro-cellulose, l'acétate de cellulose, le poly (chlorure de vinyle), le polyacrylamide, le dextran réticulé, l'agarose, le polyacrylate, le polyéthylène, le polypropylène, le poly (4-méthylbutène), le polystyrène, le polyméthacrylate, le poly (téréphtalate d'éthylène), le Nylon, le poly (butyrate de vinyle), certains types de verre tels que le Bioglass, ou des céramiques La fixation d'un anticorps selon l'invention sur un support peut être réalisée par des techniques bien connues de l'homme du métier. Le support peut se présenter sous des formes diverses, y compris sous forme de bandes ou de particules telles que des billes. La surface du support peut être polyfonctionnelle ou susceptible d'être polyfonctionnalisée de manière à fixer l'anticorps via des interactions covalente ou non covalente qui peuvent être spécifiques ou non spécifiques.

A titre illustratif, pour l'immobilisation d'anticorps sur un support, l'homme du métier peut avantageusement se référer au brevet n° US 4,168,146 ou encore au brevet n° US 4,347,311. A l'étape c), la détection des complexes formés entre l'échantillon et la molécule de liaison à l'antigène, c'est-à-dire la détection de la fixation de la molécule de liaison à l'antigène sur l'échantillon, peut être réalisée par mesure d'un signal généré par une molécule détectable liée à ladite molécule de liaison à l'antigène. Comme cela est connu, la molécule détectable peut être liée directement, par exemple par liaison covalente, à la molécule de liaison à l'antigène, ou bien la molécule détectable est liée à un ligand se fixant de manière non covalente à la molécule de liaison à l'antigène. Par exemple, ledit ligand peut être du type anticorps marqué avec une molécule détectable, ledit anticorps reconnaissant une région de la molécule de liaison à l'antigène autre que la région de liaison à l'antigène. Typiquement, on utilise à l'étape c) un anticorps marqué reconnaissant une région de la molécule de liaison à l'antigène qui n'est pas impliquée dans la reconnaissance de l'antigène. Dans les modes de réalisation du procédé dans lesquels la molécule de liaison à l'antigène est un anticorps monoclonal, on utilise préférentiellement un ligand se liant sélectivement sur la partie constante dudit anticorps monoclonal. Dans ces modes de réalisation, le ligand est préférentiellement est un anticorps, communément appelé « anticorps secondaire », lequel se lie à la partie constante de l'anticorps monoclonal anti-gluten désamidé.

De préférence, dans le mode de réalisation dans lequel l'un des anticorps est immobilisé sur un support, l'autre anticorps est lié de manière covalente à une molécule permettant sa détection directe, ou indirecte. La molécule détectable peut être isotopique ou non isotopique.

A titre illustratif, mais non limitatif, la molécule détectable peut intervenir dans une réaction catalytique, telle qu'une enzyme, un fragment d'enzyme, un substrat d'enzyme, un inhibiteur d'enzyme, un co-enzyme ou un catalyseur. La molécule détectable peut être également un chromogène, tel qu'un fluorophore, un colorant, une molécule chimiluminescente.

La molécule détectable peut ainsi être une molécule fluorescente telle que les molécules décrites par ICHINOSE et al. (1991) ou encore des dérivés d'isothiocyanate fluorescents, la phycoerithrine, l'isothiocyanate de rhodamine, le chlorure de dansyle ou encore le composé XRITC, la protéine GFP ( Green Fluorescent Protein ) du poisson Aequorea Victoria et ses nombreux dérivés, ou encore la protéine YFP ( Yellow Fluorescent Protein ) ainsi que la protéine luciférase. Parmi les molécules détectables possédant une activité catalytique, les molécules préférées sont les enzymes suivantes, selon la Classification Internationale I. U. B. : (i) les oxydoréductases de classe 1 et (ii) les hydrolases de la classe 3. Les oxydoréductases préférées sont (i) les déhydrogénases de la classe 1.1, plus particulièrement 1.1.1, 1.1.3 et 1.1.99 et (ii) les peroxydases de la classe 1.11 et (iii) des hydrolases de la classe 3.1, et plus particulièrement de la classe 3.1.3 et de la classe 3.2, plus particulièrement 3.2.1. Les déhydrogénases préférées sont la malate déshydrogénase, la glucose-6-phosphate déhydrogénase et la lactate déhydrogénase. L'oxydase préférée est la glucose oxydase. La peroxydase préférée est la peroxydase de raifort ( horse radish peroxydase ). Les hydrolases préférées sont les phosphatases alcalines, la ss-glucosidase et le lyzozyme. La molécule détectable peut être également une molécule marquée radioactivement, par exemple par un isotope choisi parmi [3H], [32P] et [1251]. Dans le mode de réalisation dans lequel la molécule détectable constitue un marqueur indirect, l'un des anticorps constitutifs d'une trousse de détection selon l'invention peut être lié de manière covalente à un ligand telle que la biotine ou la streptavidine. Dans ce mode de réalisation particulier, la molécule détectable est choisie de manière à ce qu'elle se fixe sur le ligand lié de manière covalente à l'anticorps. La molécule détectable peut par exemple être liée elle-même respectivement à la biotine ou à la streptavidine. Selon encore un autre mode de réalisation d'une trousse de détection selon l'invention, le moyen de révélation de la formation d'un complexe entre une protéine désamidée du gluten présente dans l'échantillon testé et une molécule de liaison à l'antigène telle que définie dans la présente description, peut être un anticorps, par exemple, dans les modes de réalisation dans lesquels la molécule de liaison à l'antigène est un anticorps monoclonal, un anticorps capable de se lier spécifiquement à la partie Fc de l'anticorps monoclonal ou encore un anticorps capable de se fixer spécifiquement à l'isotype auquel appartient l'anticorps monoclonal anti-protéine désamidée du gluten. Les molécules détectables englobent les enzymes telles que la peroxydase, la phosphatase alcaline, l'a D-galactosidase, la glucose oxydase, la glucose amylase, l'anhydrase carbonique, l'acétyl-choline estérase, le lysozyme, la malate déshydrogénase, ou encore la glucose-6- phosphate déshydrogénase. Les molécules détectables englobent aussi la biotine et la digoxigénine, la 5-bromodéoxyuridine. Les molécules détectables englobent aussi les molécules fluorescentes telles que la fluorescéine et ses dérivés, la protéine GFP (pour « Green Fluorescent Protein »), la protéine YFP (pour « Yellow Fluorescent Protein »), ou encore l'umbelliferone. Les molécules détectables englobent aussi les molécules chimiluminescentes telles que le luminol et le dioxetanen les molécules bioluminescentes telles que la luciférase et la luciférine.

Les molécules détectables englobent aussi les marqueurs radioactifs tels que l'iode123, l'iode125, l'iode126, l'iodeln, le brome'', le technetium99m, le gallium67, le gallium68, le rubenium95, le rubenium97, le rubenium163, le rubenium165, le mercure" le mercure263, le rhenium99m, le rhenium101, le rhenium165, le scandium47, le fluor18 et l'iode'''. Les méthodes de marquage de composés avec des molécules détectables sont bien connues de l'homme du métier. A titre illustratif, pour le marquage de composés avec des molécules radioactives, l'homme du métier peut se référencer à l'article de Hunter et al. (1962, Nature, Vol. 194 : 495), ou encore aux documents de brevets US 4,424,200 et US 4,479,930. De manière générale, pour la mise en oeuvre de tests de détection immunologiques, l'homme du métier peut avantageusement se référer à l'ouvrage suivant : « Immunoassay », Eds Eleftherios P Diamandis et Theodore K Christopoulos, Academic Press, 1996. En particulier, pour mettre en oeuvre des techniques de marquage d'anticorps, l'homme du métier peut se référer au chapitre 6 de l'ouvrage « Immunoassay » précité.

A titre illustratif, les exemples décrivent un mode de réalisation du procédé de détection ci-dessus dans lequel : - l'étape b) est réalisée par incubation d'un anticorps monoclonal anti-gluten désamidé (molécule de liaison à l'antigène selon l'invention) dans des puits d'une plaque dans lesquels ont été préalablement immobilisées des protéines provenant de l'échantillon à tester, par exemple le gluten constitutif de l'échantillon à tester, - l'étape c) est réalisée par incubation des puits préalablement soumis à l'étape b) avec un anticorps marqué se liant à la partie constante de la chaine lourde de l'anticorps monoclonal anti-gluten désamidé, en l'occurrence un anticorps anti-IgG1 marqué à la peroxydase.

Dans certains modes de réalisation du procédé de détection ci-dessus, ledit procédé consiste en un test immunologique de type « sandwich » et comprend les étapes suivantes : a) fournir un support solide sur lequel est immobilisée une molécule de liaison à l'antigène telle que définie dans la présente description, par exemple un anticorps monoclonal antigluten désamidé, b) incuber ou mettre en contact ledit support solide avec un échantillon à tester, dans des conditions appropriées pour la fixation de protéines désamidées du gluten sur ladite molécule de liaison préalablement immobilisée sur ledit support, c) incuber ou mettre en contact le support solide obtenu à la fin de l'étape b) avec une molécule de liaison à l'antigène telle que définie dans la présente description, par exemple un anticorps monoclonal anti-gluten désamidé, et d) détecter la présence éventuelle de protéines désamidées de gluten liées à ladite molécule de liaison à l'antigène. La présente invention concerne aussi des procédés de test immunologique dits « compétitifs » bien connus de l'homme du métier, dont le principe repose sur une compétition de liaison à l'anticorps entre (i) les molécules de protéines désamidées du gluten susceptibles d'être présentes dans l'échantillon à analyser et (ii) des molécules leurre, par exemple des peptides mimant des protéines désamidées de gluten. Dans les tests immunologiques compétitifs, la présence de protéines désamidées du gluten induit une inhibition de la liaison de l'anticorps anti-gluten désamidé aux peptides leurre, le niveau d'inhibition de la liaison de l'anticorps aux peptides leurre étant corrélée à la quantité de protéines désamidées du gluten qui est présente dans l'échantillon à tester. Ainsi, l'invention est également relative à un procédé pour détecter la présence d'une protéine désamidée du gluten dans un échantillon comprenant les étapes suivantes : a) fournir un échantillon à tester, b) incuber ledit échantillon avec une molécule de liaison à l'antigène telle que définie dans la présente description, notamment un anticorps monoclonal anti-gluten désamidé, dans des conditions permettant la formation de complexes entre ladite molécule de liaison à l'antigène et une protéine désamidée du gluten, afin d'obtenir une solution d'incubation, c) mettre en contact la solution d'incubation obtenue à la fin de l'étape b) avec un support sur lequel est immobilisé un peptide mimant une protéine désamidée du gluten, lequel peut aussi être appelé « peptide leurre », et d) détecter ou quantifier les complexes éventuellement formés entre (i) ledit peptide mimant une protéine désamidée du gluten qui est immobilisé sur le support et (ii) ladite molécule de liaison à l'antigène présente dans la solution d'incubation obtenue à la fin de l'étape b). Avantageusement, à l'étape d) du procédé ci-dessus, on mesure un signal généré par la formation des complexes entre (i) ledit peptide mimant une protéine désamidée du gluten qui est immobilisé sur le support et (ii) ladite molécule de liaison à l'antigène présente dans la solution d'incubation obtenue à la fin de l'étape b). La valeur dudit signal est corrélée avec la quantité desdits complexes qui sont formés à la fin de l'étape c). Ainsi, la fixation de molécules de liaison à l'antigène sur les peptides leurre peut être quantifiée à l'étape d) du procédé. la quantité de molécules de liaison à l'antigène qui sont fixées aux peptides leurre à la fin de l'étape d) peut être exprimée en Unités arbitraires représentatives du niveau de fixation, par exemple en valeur d'absorbance de la lumière (test de type ELISA) ou en valeur de radioactivité (test RIA).

Avantageusement, le procédé ci-dessus comprend une étape additionnelle (étape e)) de comparaison de la valeur quantitative obtenue à la fin de l'étape d). La valeur de référence est préférentiellement obtenue par la mise en oeuvre du procédé ci-dessus en fournissant à l'étape a) un échantillon dépourvu de protéine désamidée du gluten, ce qui englobe la mise en oeuvre du procédé ci-dessus en fournissant à l'étape a) un échantillon contenant au moins une protéine non désamidée du gluten, ledit échantillon ne contenant pas de protéine désamidée du gluten. Le rapport entre (i) la valeur de quantification mesurée à l'étape d) lorsque le procédé est réalisé avec l'échantillon à tester et (ii) la valeur de référence permet le calcul du pourcentage d'inhibition de la fixation de la molécule de liaison à l'antigène au peptide leurre. Plus la concentration de protéines désamidées du gluten dans l'échantillon à tester est grande, plus le pourcentage d'inhibition de la fixation de la molécule de liaison à l'antigène au peptide leurre est grand. Dans certains modes de réalisation du procédé, on réalise au préalable le procédé ci- dessus successivement avec une série d'échantillons de référence contenant chacun une concentration connue de protéines désamidées du gluten, afin de générer une courbe étalon des pourcentages d'inhibition. Dans ces modes de réalisation, la quantité de protéines désamidées du gluten présente dans l'échantillon à tester est déterminée sur la courbe étalon, à partir de la valeur quantitative obtenue à la fin de l'étape d) du procédé. Dans certains modes de réalisation du procédé de détection ci-dessus, le peptide mimant une protéine désamidée du gluten comprend une séquence en acides aminés choisie parmi : -EPEEPFPQ(SEQIDN° 1), -EPQEPFPE(SEQIDN° 2), -EPEQPFPE(SEQIDN° 3), -QPEEPFPE(SEQIDN°4),et -EPEEPFPE(SEQIDN° 5). Dans certains modes de réalisation du procédé de détection ci-dessus, le peptide mimant une protéine désamidée du gluten comprend une séquence en acides aminés LQPEEPFPEQC (SEQ ID N° 6). L'invention a aussi trait à un kit de détection de la présence de gluten désamidé dans un échantillon, comprenant au moins une molécule de liaison à l'antigène telle que définie dans la présente description, et le cas échéant un réactif ou une pluralité de réactifs nécessaire(s) à la réalisation d'un procédé de détection tel que défini dans la présente description. Des caractéristiques se rapportant à un kit de détection selon l'invention ont été déjà précédemment décrites en relation avec les procédés de détection de la présence de protéines désamidées du gluten. Dans certains modes de réalisation du kit de détection, la molécule de liaison à l'antigène, qui peut être un anticorps monoclonal anti-gluten désamidé tel que défini dans la présente description, est immobilisé sur un support, par exemple est immobilisés dans des puits de plaques d'un type approprié pour réaliser des tests immunologiques, par exemple dans des puits de microplaques appropriées pour réaliser des tests immunologiques ELISA ou RIA, bien connues de l'homme du métier. La présente invention est aussi illustrée, sans y être aucunement limitée, par les exemples qui suivent.

EXEMPLES Exemple 1 : Caractérisation de l'anticorps monoclonal PEE 14C7 1.1. Isotypage L'anticorps monoclonal produit par l'hybridome PEE 14C7 (hybridome déposé selon le Traité de Budapest à la CNCM le 25 février 2013 sous le numéro d'accès I-4717 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur de Paris) a fait l'objet d'un isotypage à l'aide du kit commercialisé par la Société Pierce sous la référence n° 26178, selon les recommandations du fabricant. Il a été déterminé que l'anticorps monoclonal produit par l'hybridome PEE 14C7 est d'isotype IgGl. 2.2. Séquençage L'anticorps monoclonal produit par l'hybridome PEE 14C7 a fait l'objet d'un séquençage par la Société GenScript (Piscataway, Etats-Unis). En résumé, on a procédé à une étape d'extraction de l'ARN total des cellules de l'hybridome qui avaient été préalablement congelées. L'ADNc a été synthétisé par amplification des régions codant l'anticorps, et en particulier par amplification des acides nucléiques codant les régions variables des chaînes lourdes et des chaines légères, par la technique de RT-PCR à partir de l'ARN total. Les ADNc amplifiés codant respectivement les régions variables des chaines lourdes et des chaines légères de l'anticorps monoclonal ont été clonés dans des vecteurs séparés. Puis, après criblage des colonies positives, l'ADN a été séquencé. Exemple 2 : Spécificité d'un procédé de détection mettant en oeuvre une molécule de liaison à l'antigène 2.1. Protocole de test immunologique ELISA non compétitif Au fond d'une plaque 96 puits à fonds (NUNC Maxisorb), 1001aL de protéines à 1 mg/mL dans du tampon carbonate 50 mM pH 9,6 sont incubés toute la nuit à +4°C. Après 3 lavages au PBS-Tween 20 0,05 %, une incubation avec du PBS-lait 2 % (m/v) est effectuée.

L'anticorps monoclonal PEE 14C7 (1001aL de différentes dilutions d'Ac dans du PBS-lait 0,1 % (m/v)) est incubé lh à TA. Après lavages au PBS-Tween 20 0,05 %, 100mt de l'anticorps secondaire de chèvre anti-IgG de souris couplé à la péroxydase (ref : 170-6516, Bio-Rad) dilué au 3000ème est incubé lh à TA dans les mêmes conditions que l'Ac primaire. Après 3 lavages, le substrat OPD (0-phénylènediamine, ref : P-1526, Sigma) est incubé 30 min à l'abri de la lumière. La réaction est stoppée par ajout de 50 jaL de H2504 4N. Les densités optiques sont lues en double longueur d'onde (490 nm pour la mesure de l'hydrolyse du substrat et 630 nm pour éliminer le bruit de fond) au spectromètre de plaque (Bioteck E1x808-1). 2.2. Spécificité vis-à-vis des différentes protéines désamidées du gluten La spécificité de l'anticorps PEE 14C7 a été contrôlé par ELISA indirect en déposant sur la phase solides différentes protéines purifiées à partir du gluten (protocole en annexe). Ces protéines ont subi ou non une désamidation chimique (HC1 0.1 N ; 90°C ; 1h). Les taux de desamidation de ces produits ont été déterminés par la méthode décrite par Khun et al (1996) (cf Gourbeyre et al, 2011) : Les résultats sont présentés dans le Tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 Protéines desamidées Alpha/Beta gliadines Gamma gliadines Omega 2 gliadines Omega 5 Gluténines de bas Poids Moléculaires Gliadines totales gliadines Taux de 52 % 32 % 36 % 51 % ND 53 % désamidation Brièvement, les protéines sont solubilisées à 1 mg/mL en Ethanol à 50 % (protéines natives) ou en carbonate (0.05 M) ; 0.1 % SDS avant d'être diluées à 1 1.1g/mL en carbonate 0.05 M pour le dépôt en microplaque (1 nuit à +4°C). Tous les puits de la microplaque sont ensuite saturées en PBS-Lait 0.1 % (1h à TA). Le SN de culture du clone PEE 14C7 est alors dilué en série et déposés dans les puits de la microplaque. Après lavage en PBS-Tween20 0.05 %. Les anticorps monoclonaux que se sont spécifiquement liés aux protéines déposées dans les puits sont révélés par un anticorps secondaire (Goat anti Mouse IgG ; Biorad ref 170-6516) conjugué à la péroxidase et révélé par de l'Orthophénylène Diamine et la lecture des absorbance à 490 nm. Les résultats sont présentés sur la Figure 1. Les résultats de la Figure 1 montrent que l'anticorps monoclonal PEE 14C7 reconnaît sélectivement les protéines désamidées de gluten, respectivement la gliadine a désamidée, la gliadine y désamidée, la gliadine w2 désamidée, la gliadine w5 désamidée et la gluténine de bas poids moléculaire désamidée. 2.3. L'anticorps PEE 14C7 ne présente pas de réaction croisée avec le gluten non désamidé Les pourcentages de réactivité de l'anticorps vis à vis de chaque protéine est déterminés tel que décrit dans Tranquet et al. (2012). Dans le cas présent les pourcentages sont déterminées à la dilution 1/50 du surnageant de culture (i.e. la plus forte dilution permettant d'obtenir la plus forte absorbance sur la proteine la mieux reconnue - gamma gliadines désamidées). Le pourcentage de reconnaissance d'une protéine X est obtenu en faisant le rapport absorbance Proteine X / Absorbance Gamma gliadines desamidées. Les résultats sont présentés dans le Tableau 2 ci-dessous.

Tableau 2 Protéines natives du gluten Protéines désamidés du gluten Anticorps a (3 y 0)2 0)5 HMW LMW a y des. 0)2 0)5 LMW des. PEE14C7 des. des. des. 1 % 4% 1% 39% 7% 2% 26% 76% 100% 94% 99% 97% 2.4. Spécificité vis-à-vis de divers glutens désamidés commerciaux On a testé la spécificité de l'anticorps monoclonal PEE 14C7 et du procédé de détection qui met en oeuvre cet anticorps monoclonal, vis-à-vis d'une variété de glutens désamidés commerciaux. On a aussi utilisé un gluten comparatif commercial non désamidé.

Les résultats sont représentés sur la Figure 2. Les résultats de la Figure 2 montrent que l'anticorps monoclonal PEE 14C7 reconnaît sélectivement les glutens désamidés. Exemple 3 : Sensibilité d'un procédé de détection mettant en oeuvre une molécule de liaison à l'antigène Il est avantageux d'utiliser la technique de test « ELISA Competitif ». Ce dosage basé sur l'utilisation du peptide LQPEEPFPEQC conjugué à la BSA 100 ng/puits) et du SN d'anticorps PEE14C7 dilué au 1/4000 permet de détecter spécifiquement des gliadines desamidées à une concentration comprise entre 1 et 8 ng/ml. Cette sensibilité est 25 3.1. Protocole ELISA compétitif : Le surnageant de culture du clone PEE 14C7 dilué au 1/4000ème dans du PBS-Lait 0.1 % est préincubé (1h30 à TA) avec comme compétiteur une gamme de gliadines natives ou désamidées dilués dans du PBS-Lait 0.1 % à différentes concentrations (1.6 ng/mL à 5 mg/mL 30 jag/mL) puis déposés dans une microplaque préalablement coatée avec de la BSA- LQPEEPFPEQC SEQ ID N° 13 (10Ong/puits - sur la nuit) et saturée en PBS-Lait 4 % (lh à TA). les lavages, la saturation et la détection des complexes Immuns sont réalisés avec le même protocole que l'ELISA indirect. Le pourcentage d'inhibition est calculé d'après la formule : [1 ((DO Compétiteur - DO bruit de fond surnageant) / (DO sans Competiteur positif - DO bruit de fond sérum)) * 100]. 3.2. Résultats Les résultats sont présentés sur la Figure 3. Les résultats de la Figure 3 montrent la haute sensibilité et la haute spécificité d'un procédé de détection de la présence de protéines désamidées de gluten qui met en oeuvre l'anticorps PEE 14C7. Tableau 3 : Séquences SEQ ID N° Type Description 1 peptide Leurre-1 2 peptide Leurre-2 3 peptide Leurre-3 4 peptide Leurre-4 5 peptide Leurre-5 6 peptide Leurre-ELISA compétitif15

Claims (12)

1. REVENDICATIONS1. Molécule de liaison à un antigène choisie parmi un anticorps monoclonal et un fragment de liaison à l'antigène dudit anticorps monoclonal, se liant à au moins une protéine désamidée du gluten et ne présentant pas de réaction croisée avec une protéine non désamidée du gluten.
2. 2. Molécule de liaison à un antigène selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'elle se lie à une protéine désamidée du gluten choisie parmi une gliadine désamidée et une gluténine désamidée et ne présente pas de réaction croisée avec une gliadine non 10 désamidée et une gluténine non désamidée.
3. 3. Molécule de liaison à un antigène selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'elle se lie à une gliadine désamidée choisie dans le groupe comprenant les gliadines a désamidées, les gliadines (3 désamidées, les gliadines o.)2 désamidées et les gliadines co5 désamidées et ne présente pas de réaction croisée avec les 15 gliadines non désamidées correspondantes.
4. 4. Molécule de liaison à un antigène selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'elle se lie à une gluténine de bas poids moléculaire désamidée et ne présente pas de réaction croisée avec une gluténine de bas poids moléculaire non désamidée. 20
5. 5. Molécule de liaison à l'antigène selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle est un anticorps monoclonal d'isotype IgGl.
6. 6. Molécule de liaison à un antigène selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il est produit par l'hybridome déposé selon le Traité de Budapest à la CNCM le 25 février 2013 sous le numéro d'accès I-4717 auprès de la Collection Nationale 25 de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur de Paris.
7. 7. Un complexe formé entre une molécule de liaison à l'antigène selon l'une des revendications 1 à 6 et une protéine de gluten désamidée.
8. 8. Molécule de liaison à l'antigène selon l'une des revendications 1 à 6, pour son utilisation dans une méthode de détection de la présence de gluten désamidé dans 30 un échantillon.
9. 9. Procédé pour détecter la présence d'une protéine désamidée du gluten dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes :a) fournir un échantillon à tester, b) mettre en contact ledit échantillon avec une molécule de liaison à l'antigène selon l'une des revendications 1 à 6, c) détecter les complexes éventuellement formés entre ledit échantillon et 5 ladite molécule de liaison à l'antigène.
10. 10. Procédé pour détecter la présence d'une protéine désamidée du gluten dans un échantillon comprenant les étapes suivantes : a) fournir un échantillon à tester, b) incuber ledit échantillon avec une molécule de liaison à l'antigène selon 10 l'une des revendications 1 à 6, dans des conditions permettant la formation de complexes entre ladite molécule de liaison à l'antigène et une protéine désamidée du gluten, afin d'obtenir une composition d'incubation, c) mettre en contact la solution d'incubation obtenue à la fin de l'étape b) avec un support sur lequel est immobilisé un peptide mimant une protéine désamidée du gluten, 15 et d) détecter ou quantifier les complexes éventuellement formés entre (i) ledit peptide mimant une protéine désamidée du gluten qui est immobilisé sur le support et (ii) des molécules de liaison à l'antigène présentes dans la solution d'incubation obtenue à la fin de l'étape b). 20
11. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le peptide mimant une protéine désamidée du gluten comprend une séquence en acides aminés choisie parmi : -EPEEPFPQ(SEQIDN° 1), -EPQEPFPE(SEQIDN° 2), 25 -EPEQPFPE(SEQIDN° 3), - Q P E EP FPE (SEQ ID N° 4), et -EPEEPFPE (SEQ ID N° 5).
12. 12. Procédé selon l'une des revendications 10 et 11, caractérisé en ce que le peptide mimant une protéine désamidée du gluten comprend une séquence en acides 30 aminés LQPEEPFPEQC (SEQ ID N° 6).. Un kit de détection de la présence de gluten désamidé dans un échantillon, comprenant au moins une molécule de liaison à l'antigène selon l'une des revendications 1 à 6.