WO2014132204A1 - Anticorps anti-gluten desamide et utilisations - Google Patents

Anticorps anti-gluten desamide et utilisations Download PDF

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WO2014132204A1
WO2014132204A1 PCT/IB2014/059269 IB2014059269W WO2014132204A1 WO 2014132204 A1 WO2014132204 A1 WO 2014132204A1 IB 2014059269 W IB2014059269 W IB 2014059269W WO 2014132204 A1 WO2014132204 A1 WO 2014132204A1
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gluten
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Sandra DENERY
Olivier TRANQUET
Colette Larre
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Institut National De La Recherche Agronomique (Inra)
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Definitions

  • the present invention relates to the field of the control of the safety of certain products containing gluten deamid for humans or animals likely to develop allergic reactions to this type of processed gluten.
  • Gluten proteins which include the gliadin and glutenin protein subunits, are constituents frequently found in many food products, in particular bakery products as well as industrial culinary preparations, or in certain cosmetic products, the latter may comprise protein hydrolysates and in particular hydrolysates of wheat proteins.
  • Gluten proteins are particularly characterized by their specific amino acid composition, these proteins contain a high content of proline residues (about 30% of total amino acid residues), and glutamine residues (about 40% of total residues). in amino acids).
  • the constitutive proteins of gluten are also characterized by the presence of repeated amino acid sequences.
  • Five classes of gliadins constitutive of gluten are known, respectively gliadins a, gliadins ⁇ , gliadins ⁇ , gliadins co2 and gliadins co5.
  • Two classes of glutenins, low molecular weight glutenins and high molecular weight glutenins, are also known.
  • Gluten proteins are used in industry mainly because of their viscoelasticity and insolubility properties. However, the insoluble nature of gluten proteins is a technical limitation to further extend their industrial use.
  • modified gluten proteins As water-dispersible or water-soluble products.
  • methods of converting native gluten by deamidation by acidic or alkaline treatment are generally employed.
  • an MC01 antibody is known that specifically binds to deamidated ⁇ -gliadin and does not bind to undamidated ⁇ -gliadin (see, for example, Skovbjerg et al., 2004, Biochem Biophys Acta, Vol 1690 (2001)). 3): 220-230, Skovbjerg et al., 2008, Dig Sci Dis.Vol., 53: 2917-2924).
  • the varietal origin or processing methods of known wheat flour may nevertheless lead to a final product whose content in the different gluten proteins may vary substantially, in particular because of the processing methods employed, such as comprising steps using solvents, for example an alcohol. Indeed, while gliadins are soluble in alcohol, glutenins are insoluble. Thus, the industrial processing of wheat flour can lead to an impoverishment of flour into gliadins or glutenins.
  • the known processes for processing wheat flour can result in end products comprising deamidated gluten proteins having a very variable degree of deamidation.
  • the present invention provides antigen-binding molecules, including monoclonal antibodies and antigen binding fragments of said monoclonal antibodies, having the property of specifically binding to at least one deamidated protein of gluten, said molecules antigen-binding agent, however, does not cross-react with undamaged gluten protein.
  • gluten includes the following proteins: gliadins a, gliadins ⁇ , gliadins ⁇ , gliadins co2, gliadins co5, glutenins of low molecular weight and glutenins of high molecular weight.
  • the low molecular weight glutenins have a molecular weight of less than 90,000 and the high molecular weight glutenins have a molecular weight of 90,000 or more.
  • gluten comprises about 60% to 70% by weight of gliadins and about 30% to 40% by weight of glutenins, based on the total weight of gluten.
  • Gliadins are composed of from about 4% to 11% by weight of gliadins co5, from about 8% to 22% by weight of gliadins co2, from about 26% to 29% by weight of gliadins ⁇ / ⁇ and from about 10% to 26% by weight of gliadins ⁇ , based on the total weight of gluten.
  • the invention particularly relates to an antigen-binding molecule in the form of a monoclonal antibody having the property of binding to at least one deamidated gluten protein, said monoclonal antibodies not exhibiting a cross-reaction. with a non-deamidated gluten protein, which monoclonal antibody is produced by the hybridoma deposited according to the Budapest Treaty at the CNCM on February 25, 2013 under accession number 1-4717 from the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM ) of the Pasteur Institute of Paris.
  • CNCM National Collection of Cultures of Microorganisms
  • the invention also relates to an antigen-binding molecule, selected from a monoclonal antibody and an antigen-binding fragment of said monoclonal antibody, capable of binding to deamidated proteins of gluten and having no cross-reactivity with the undamaged proteins of gluten.
  • Said monoclonal antibody is in particular produced by the hybridoma deposited according to the Budapest Treaty at the CNCM on February 25, 2013 under the accession number 1-4717 from the National Collection of Microorganism Cultures (CNCM) of the Pasteur Institute of Paris.
  • the invention also relates to an antigen-binding molecule, in particular a monoclonal antibody, comprising at least one chain selected from a heavy chain or a light chain of a variable region, said antigen-binding molecule comprising at least one CDR (for "Complementary Determining Region") chosen from the CDRs which have been sequenced according to the protocol described in Example 1 from the cells of the hybridoma deposited according to the Budapest Treaty at the CNCM on 25 February 2013 under the access number 1-4717 at the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) of the Institut Pasteur in Paris.
  • CDR for "Complementary Determining Region”
  • the invention relates to an antigen-binding molecule, in particular a monoclonal antibody, comprising at least one variable region of a heavy chain (V H ) or a variable region of a light chain (V L ), said antigen binding molecule comprising at least one CDR selected from the following CDRs:
  • the antigen binding molecules according to the invention are characterized in that they specifically bind to a deamidated gluten protein selected from a deamidated gliadin and a deamidated glutenin and do not exhibit cross-reaction with undamidated gliadin and undamidated glutenin.
  • the antigen-binding molecules according to the invention are characterized in that they bind to the deamidated gliadins chosen from the group comprising deamidated gliadins, deamidated ⁇ -gliadins and deamidated ⁇ -gliadins. the deamidated co2 gliadins and co5 deamidated gliadins and do not cross-react with the corresponding undemadridated gliadins.
  • the antigen-binding molecules according to the invention are in particular characterized in that they bind to the deamidated low molecular weight glutenins and do not cross-react with the undamidated low molecular weight glutenins. .
  • the antigen-binding molecules according to the invention are characterized in that they bind to the high-molecular-weight glutenins deamidated and do not cross-react with undemediated high molecular weight glutenins. .
  • the antigen-binding molecules according to the invention are in particular characterized in that they are capable of binding to a deamidated gliadin and a deamidated glutenin which does not cross-react with an undamidated gliadin and undamidated glutenin.
  • the invention also relates to a complex formed between an antigen-binding molecule as defined above and a deamidated gluten protein.
  • the present invention also relates to methods and kits for detecting the presence of a deamidated gluten protein in a sample, particularly deamidated gluten proteins, for which an antigen binding molecule according to the invention is used.
  • Figure 1 illustrates the ability of a monoclonal antibody according to the invention to bind to a variety of deamidated glutens without cross-reacting with a protein undiluted gluten (gliadin co5).
  • gliadin co5 protein undiluted gluten
  • OD absorbance value
  • Figure 2 illustrates the ability of a monoclonal antibody according to the invention to bind the deamidated proteins constitutive of deamidated gluten, without cross-reacting with native gluten proteins.
  • abscissa increasing dilutions of the monoclonal antibody.
  • absorbance value (OD) at 490 nanometers.
  • Figure 3 illustrates the ability of a monoclonal antibody according to the invention to bind to deamidated gliadins without crossreaction with native gliadins, evaluated according to a competitive ELISA type immunoassay.
  • abscissa percentage inhibition of the binding of the monoclonal antibody to the peptide LQPEEPFPEQC (SEQ ID No. 22).
  • FIG. 4 illustrates the lack of specificity of a monoclonal antibody according to the invention with respect to industrial flours such as wheat, rye, barley, oats, durum wheat, spelled, corn and soy.
  • industrial flours such as wheat, rye, barley, oats, durum wheat, spelled, corn and soy.
  • dilutions at 1/10 (dil 10) and at 1/20 (dil 20) of the flours tested.
  • preventive means in the form of methods and kits for the first time reliable detection and reproducible the presence of deamidated proteins of gluten in a sample, such as a food product or a cosmetic product.
  • the methods and kits provided by the present invention may also be useful in meeting any legal or regulatory requirements for measuring the presence of gluten in food products.
  • the Codex Alimentarius established by the World Health Organization requires the consumer to be informed about the presence or absence of gluten in food (standard ALINORM 08/31/26).
  • Skeritt's antibody which is directed against wheat gliadin and which recognizes high molecular weight glutenins and gliadin co, is known.
  • R5 antibody which is directed against the secalin of rye, and has a good affinity for wheat gliadin, as well as some proteins of soy and lupine.
  • the present invention firstly provides antigen-binding molecules binding to at least one deamidated gluten protein and not cross-reactive with a non-deamidated gluten protein.
  • the present invention provides an antigen-binding molecule selected from a monoclonal antibody and an antigen-binding fragment of said monoclonal antibody, capable of binding to deamidated proteins of gluten and having no cross-reactivity with the undamaged proteins of gluten.
  • a linker molecule capable of binding to deamidated gluten proteins includes a linker molecule capable of binding to any deamidated gluten protein.
  • the present invention provides an antigen-binding molecule selected from a monoclonal antibody and an antigen-binding fragment of said monoclonal antibody, capable of to bind to deamidated gliadin and deamidated glutenin not cross-reactive with undamidated gliadin and undamidated glutenin.
  • an antigen-binding molecule selected from a monoclonal antibody and an antigen binding fragment of said monoclonal antibody, according to the present invention is capable of binding to a deamidated gliadin; a deamidated gliadin, deamidated ⁇ -gliadin, deamidated gliadin ⁇ , deamidated gliadin co2, and deamidated gliadin co5, and does not cross-react with undamidated gliadin.
  • an antigen-binding molecule selected from a monoclonal antibody and an antigen-binding fragment of said monoclonal antibody, according to the present invention is capable of binding deamidated glutenin, that is, that is, deamidated high molecular weight glutenin and deseamidated low molecular weight glutenin and does not cross-react with undenadiated glutenin.
  • the invention provides an antigen-binding molecule in the form of a monoclonal antibody characterized in that it is produced by the hybridoma deposited according to the Budapest Treaty at the CNCM on February 25, 2013 under access number 1-4717 from the National Collection of Microorganism Cultures (CNCM) of the Institut Pasteur in Paris.
  • CNCM National Collection of Microorganism Cultures
  • the term "antigen-binding molecule” is intended to mean a protein capable of selectively binding to at least one deamidated gluten protein and not exhibiting a cross-reaction with a non-deamidated gluten protein.
  • antigen binding molecule is meant more particularly according to the invention a protein capable of binding selectively to deamidated gluten proteins, and not cross-reactive with non-deamidated proteins of gluten.
  • the antigen-binding molecules essentially, if not exclusively, include monoclonal antibodies and antigen-binding fragments from monoclonal antibodies.
  • a “monoclonal antibody” is meant according to the invention an antibody from a substantially homogeneous or completely homogeneous antibody population. Specifically, in a population of monoclonal antibodies, the individual antibodies are identical, except for naturally occurring mutations that can be found in very small proportions. Thus, within the meaning of the invention, a “monoclonal antibody” encompasses a single molecule of an antibody, as well as a homogenous population of monoclonal antibodies, derived from the growth of a single cell clone, such as a hybridoma, or a eukaryotic host cell transfected or transformed with an acid nucleic acid encoding said antibody.
  • antigen-binding fragment or “functional fragment” of an antibody is meant according to the invention a portion of a parent antibody comprising a region involved in the binding of the parent antibody to the target antigen that is, a target epitope of the antigen of interest.
  • an "antigen-binding fragment” or “functional fragment” encompasses a fragment selected from a fragment Fv (variable fragment), a scFv fragment (single-chain variable fragment), a Fab fragment, an F (ab ') 2 fragment , an Fab 'fragment, an Fabc fragment, an scFv-Fc fragment, "diabodies” as well as any other antibody fragment which has retained the ability of the parent antibody from which it derives to bind to the antigen, in this case the ability to bind selectively to at least one deamidated gluten protein, still more particularly the ability to bind selectively to deamidated proteins of gluten.
  • the ability of a monoclonal antibody or a functional fragment thereof to bind to the antigen in this case its ability to bind to at least one deamidated gluten protein, in particularly to bind to deamidated proteins of gluten, can be verified by carrying out an ELISA test, as described later in the description, and even more specifically in the examples.
  • an antigen-binding molecule is characterized in that it does not cross-react with a non-deamidated protein of gluten.
  • the absence of cross reaction with a non-deamidated gluten protein is, for the purpose of the present invention, determined as indicated below.
  • An ELISA immunoassay may be carried out comprising the following steps: a) providing a support on which a protein of the gluten to be tested is immobilized; b) incubating the support provided in step a) with an antigen-binding molecule such as defined herein, under conditions allowing the formation of complexes between said gluten protein and said antigen binding molecule, and c) measuring a signal representative of the amount of antigen binding molecules related to the antigen binding molecule. said gluten protein.
  • step c) comprises the following steps:
  • step b) incubating the support obtained at the end of step b) with a ligand recognizing the antigen-binding molecule, preferably an antibody recognizing the antigen-binding molecule, said ligand being labeled with a detectable molecule, and c2) measuring the signal generated by the detectable molecule, said signal being representative of the amount of antigen binding molecules bound to said gluten protein.
  • a ligand recognizing the antigen-binding molecule preferably an antibody recognizing the antigen-binding molecule, said ligand being labeled with a detectable molecule
  • c2 measuring the signal generated by the detectable molecule, said signal being representative of the amount of antigen binding molecules bound to said gluten protein.
  • the detectable molecule is an enzyme, such as peroxidase, and step c2) is as follows:
  • step c2) incubating the support obtained at the end of step c1) with a substrate of said enzyme, for example with a substrate of peroxidase, and measuring the signal generated by the product resulting from the transformation of the substrate, preferably by measurement of the absorbance value of light at the wavelength of absorption of light by said product.
  • a substrate of said enzyme for example with a substrate of peroxidase
  • the immunological test is carried out with reference deamidated gliadins which may be derived from a fraction of total gliadins or selected from deamidated gliadins and deamidated ⁇ gliadins or deamidated ⁇ gliadins. Most preferably, the reference deamidated gliadins are deamidated ⁇ gliadins.
  • Protein X is chosen from non-deamidated gliadin a, undamidated gliadin ⁇ and undamidated high molecular weight glutenin,
  • GLUT-ND is the deamidated gluten protein used as a reference
  • the signal value is the measurement value of the signal generated by the binding of the antigen-binding protein to the deamidated or undiradiated gluten protein considered, for example the absorbance value of the light of a product enzymatic transformation at a given wavelength.
  • the antigen-binding molecule is considered to be non-cross-reactive with a non-deamidated gluten protein when the "% CROSS" value is less than or equal to 10, and preferably less than or equal to 5.
  • an "antigen-binding fragment” or “functional fragment” also includes a protein comprising at least one of the CDRs (for "Complementary Determining Region"), that is to say the one of the regions of the antibody determining the complementarity of the antibody with the antigen, which are located in the hypervariable regions of the variable region of the parent antibody.
  • a “CDR” is the region of an immunoglobulin determining the binding to the antigen (for "Complementary Determining Region") and means a hypervanable region of the light chains and immunoglobulin heavy chains as defined by Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Department of Health and Human Services, NIH, 1991).
  • An immunoglobulin comprises three heavy chain CDRs and three light chain CDRs.
  • CDR and “CDRs” mean, as the case may be, one, more or all of the regions containing most of the amino acid residues that are responsible for the ability of an antibody to selectively bind to a target antigen, i.e., an epitope of said target antigen.
  • CDR or “CDRs” means the hypervariable regions of immunoglobulin heavy and light chains as defined by the IMGT numbering.
  • the unique EVIGT numbering has been defined for the purpose of comparing immunoglobulin variable domains, regardless of the type of antigen receptor, chain type or identity of the species from which the immunoglobulins originate.
  • the present invention relates in particular to an antigen-binding molecule comprising at least one CDR having a sequence having at least 80% amino acid identity with a CDR chosen from the CDRs of sequences SEQ ID NO: 2, 3 , 4, 6, 7 and 8, as defined by the EVIGT numbering system.
  • CDRS were sequenced in accordance with the protocol described in Example 1, from the hybridoma deposited according to the Budapest Treaty at the CNCM on February 25, 2013 under accession number 1-4717 with the National Collection of Cultures. of Microorganisms (CNCM) of the Pasteur Institute of Paris.
  • the "percent identity" between two amino acid or nucleic acid sequences in the sense of the present invention is determined by comparing the two optimally aligned sequences through a comparison window.
  • the part of the nucleotide sequence in the comparison window may thus comprise additions or deletions (for example "gaps") with respect to the reference sequence (which does not include these additions or deletions) so as to obtain a optimal alignment between the two sequences.
  • the percent identity is calculated by determining the number of positions at which an identical amino acid (or identical nucleic acid base) is observed for the two sequences compared, and then dividing the number of positions at which there is identity between the two amino acids. (or between the two nucleobases) by the total number of positions in the comparison window, then multiplying the result by one hundred in order to obtain the percentage of amino acid (or nucleotide) identity of the two sequences between them.
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be performed in a computer manner using known algorithms.
  • an amino acid sequence having at least 80% amino acid identity with a reference amino acid sequence includes amino acid sequences having at least 81%, 82%, 83 %, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or at least 99% % amino acid identity with said reference sequence.
  • a nucleotide sequence having at least 80% nucleotide identity with a reference nucleotide sequence includes nucleotide sequences having at least 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86% , 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or at least 99% nucleotide identity with said sequence of reference.
  • the present invention relates to an antigen-binding molecule, especially a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment derived from a monoclonal antibody, comprising at least one variable region of a heavy chain comprising at least one CDR chosen from the following CDRs:
  • the present invention relates to an antigen-binding molecule, especially a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment derived from a monoclonal antibody, comprising at least one variable region of a heavy chain comprising at least one CDR chosen from the following CDRs:
  • the present invention also relates to an antigen binding molecule, including a monoclonal antibody or an antigen binding fragment derived from a monoclonal antibody, comprising at least one variable region of a heavy chain comprising the following CDRs:
  • - V H -CDR1 comprising a sequence having at least 80% amino acid identity with the sequence SEQ ID No. 2
  • - V H -CDR2 comprising a sequence having at least 80% amino acid identity with the sequence SEQ ID No. 3
  • the present invention also relates to an antigen binding molecule, including a monoclonal antibody or an antigen binding fragment derived from a monoclonal antibody, comprising at least one variable region of a heavy chain comprising the following CDRs:
  • the present invention relates to an antigen binding molecule, especially a monoclonal antibody or an antigen binding fragment derived from a monoclonal antibody, comprising at least one variable region of a light chain comprising at least one CDR chosen from the following CDRs:
  • the present invention relates to an antigen binding molecule, especially a monoclonal antibody or an antigen binding fragment derived from a monoclonal antibody, comprising at least one variable region of a light chain comprising at least one CDR chosen from the following CDRs:
  • the invention also relates to an antigen-binding molecule, including a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment derived from a monoclonal antibody, comprising at least one variable region of a light chain comprising the following CDRs:
  • the invention also relates to an antigen-binding molecule, including a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment derived from a monoclonal antibody, comprising at least one variable region of a light chain comprising the following CDRs:
  • the present invention also relates to an antigen binding molecule, in particular a monoclonal antibody comprising:
  • V L -CDR1 comprising a sequence having at least 80% amino acid identity with the sequence SEQ ID No. 6, - V L -CDR2, comprising a sequence having at least 80% amino acid identity with the sequence SEQ ID No. 7, and
  • the present invention also relates to an antigen-binding molecule, especially a monoclonal antibody, comprising:
  • An antibody suitable for the present invention may be selected from monoclonal antibodies of mouse, rat, goat, rabbit, horse, llama, human and other primate.
  • the antigen binding molecule is a murine monoclonal antibody, preferably of IgG1 isotype.
  • said murine monoclonal antibody consists of the monoclonal antibody produced by the hybridoma deposited at the CNCM on February 25, 2013 under the access number 1-4717, or into a functional fragment thereof.
  • the invention also relates to an antigen-binding molecule, in particular a monoclonal antibody, comprising at least one heavy chain comprising a variable region, said variable region having a sequence having at least 80% amino acid identity with the sequence SEQ ID No. 1.
  • the invention also relates to an antigen-binding molecule, in particular a monoclonal antibody, comprising at least one heavy chain comprising a variable region, said variable region having a sequence comprising the sequence SEQ ID No. 1.
  • the invention also relates to an antigen-binding molecule, especially a monoclonal antibody, comprising at least one light chain comprising a variable region, said variable region having a sequence having at least 80% amino acid identity with the sequence SEQ ID No. 5.
  • the invention also relates to an antigen-binding molecule, in particular a monoclonal antibody, comprising at least one light chain comprising a variable region, said variable region having a sequence comprising the sequence SEQ ID No. 5.
  • the invention also relates to an antigen-binding molecule, which includes a monoclonal antibody, comprising at least:
  • variable region of a heavy chain having a sequence comprising at least 80% of amino acid identity with the sequence SEQ ID No. 1, and
  • variable region of a light chain having a sequence comprising at least 80% amino acid identity with the sequence SEQ ID No. 5.
  • the invention also relates to an antigen binding molecule, i.e. a monoclonal antibody, comprising at least:
  • variable region of a heavy chain comprising the sequence SEQ ID No. 1, and
  • the antigen binding molecule comprises a variable heavy chain (V H ) and a variable light chain (V L ) linked together by a linker peptide.
  • the binding peptide may comprise from 1 to 20 amino acids in length, including 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 amino acids in length.
  • the binding peptide is preferably composed of amino acids glycine and / or serine.
  • An illustrative example of a binding peptide is the Gly 4 Ser peptide.
  • the binding peptide may be a multimer of the Gly 4 Ser monomer unit, for example (Gly 4 Ser) 2 , (Gly 4 Ser) 3 or even (Gly 4 Ser).
  • the scFv-type antigen-binding molecules can be prepared, for example, as described by Me Cafferty et al. (1990, Nature, Vol 348, 552-554) or in PCT Application No. WO 92/01047.
  • the antigen-binding molecule comprises a peptide structure on which at least one CDR is grafted, said CDR being grafted with so as to preserve all or part of the recognition properties of the target antigen by the paratope, as in the parent antibody from which said CDR.
  • one or more of the CDR sequences defined in the present description are present within the peptide structure, so as to reconstitute a skeleton.
  • peptide promoting folding of grafted CDRs allowing conservation of the recognition properties of the target antigen by the paratope, as in the parent antibody from which said CDR.
  • Peptide structures useful for the grafting of CDRs include fibronectin, preferably fibronectin type III, lipocalin, anticalin (see Skerra et al, 2001, J. Biotechnol, Vol 74 ( 4): 257-275), protein Z from the B domain of Staphylococcus aureus protein A, thioredoxin A or proteins comprising repeating units such as the ankyrin repeat protein (see Kohi et al.
  • An antigen binding molecule according to the invention includes chimeric antibodies, and optionally also humanized antibodies.
  • the chimeric antibodies are antibodies containing a naturally variable region (heavy chain and light chain) from an antibody of a given first species, in combination with the constant regions of the light and heavy chains from an antibody of a second species, distinct from the first species.
  • the antigen-binding molecules according to the invention can be prepared using recombinant techniques.
  • genetic for example, a chimeric antibody may be prepared by cloning a DNA comprising a promoter and a variable region coding sequence of a non-human monoclonal antibody of the invention, including a murine monoclonal antibody of the invention, and the sequence coding for the constant region of another antibody, for example the constant region of another murine antibody or the constant region of another human antibody.
  • Such a chimeric antibody according to the invention may be, for example, a mouse-mouse chimeric antibody or a mouse-human chimeric antibody, the specificity for a deamidated gluten protein being determined by the variable region of said chimeric antibody and the isotype being determined by the constant region of said chimeric antibody.
  • Chimeric or humanized antibodies can be prepared according to the techniques described by Jones et al. (1986, Nature, Vol 321: 522-525) by Verhoeyen et al. (1988, Science, Vol 239: 1534-1536) or Riechmann et al. (1988, Nature, Vol 322: 323-327).
  • Chimeric or humanized antibodies can also be prepared according to techniques known to those skilled in the art such as those described by Singer et al. (1992, J. Immun., Vol 150: 2844-2857), Mountain et al. (1992, Biotechnol Genet Eng Rev., Vol.10: 1-142) or Bebbington et al. (1992, Biotechnology, Vol.10: 169-175).
  • the present invention also relates to a nucleic acid encoding an antigen binding molecule as defined in the present description, and in particular a monoclonal antibody as defined in the present description, or encoding a functional fragment thereof.
  • the invention relates to a nucleic acid encoding a polypeptide comprising a CDR of an antigen binding molecule defined in the present description, said CDR being selected from CDRs having a sequence having at least 80% d amino acid identity with the CDRs sequenced according to the protocol of Example 1.
  • the present invention also relates to a nucleic acid chosen from: a nucleic acid having at least 80% identity with the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 10 encoding the V H -CDR1 of sequence SEQ ID No. 2,
  • nucleic acid having at least 80% identity with the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 11 encoding the V H -CDR2 of sequence SEQ ID No. 3,
  • nucleic acid having at least 80% identity with the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 12 encoding the V H -CDR3 of sequence SEQ ID No. 4,
  • nucleic acid having at least 80% identity with the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 14 encoding the V L -CDR1 of sequence SEQ ID No. 6,
  • nucleic acid having at least 80% identity with the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 15 encoding the V L -CDR2 of sequence SEQ ID No. 7,
  • nucleic acid having at least 80% identity with the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 16 encoding the V L -CDR3 of sequence SEQ ID No. 8.
  • the present invention also relates to a nucleic acid chosen from:
  • nucleic acid having at least 80% identity with the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 9 encoding a heavy chain of sequence SEQ ID No. 1,
  • nucleic acid having at least 80% identity with the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 13 encoding a light chain of sequence SEQ ID No. 5,
  • the present invention relates to a nucleic acid chosen from:
  • nucleic acid comprising the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 10 encoding the V H -CDR1 of sequence SEQ ID No. 2,
  • nucleic acid comprising the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 11 encoding the V H -CDR2 of sequence SEQ ID No. 3,
  • nucleic acid comprising the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 12 encoding the V H -CDR3 of sequence SEQ ID No. 4,
  • nucleic acid comprising the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 14 encoding the V L -CDR1 of sequence SEQ ID No. 6,
  • nucleic acid comprising the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 15 encoding the V L -CDR2 of sequence SEQ ID No. 7,
  • nucleic acid comprising the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 16 encoding the V L -CDR3 of sequence SEQ ID No. 8.
  • the present invention also relates to a nucleic acid chosen from:
  • nucleic acid comprising the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 9 encoding the variable region of a heavy chain of sequence SEQ ID No. 1,
  • nucleic acid comprising the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 13 encoding the variable region of a light chain of sequence SEQ ID No. 5,
  • nucleic acid may be used interchangeably to designate a nucleotide sequence, which may comprise modified nucleotides, which may be a single-stranded DNA, double-stranded DNA or a transcript of these DNAs.
  • the invention also relates to vectors comprising a nucleic acid as specified in the present description.
  • the vectors preferably comprise elements allowing the expression of the nucleic acids of the invention in a host cell.
  • the vectors include a promoter, transcription initiation and termination signals as well as appropriate transcriptional regulatory sequences.
  • the vectors and expression systems described in patent document EP 0 380 068 may be mentioned.
  • the invention also relates to a process for the production of an antigen-binding molecule as defined in the present description, in particular for the production of a monoclonal antibody as defined in the present description, said method comprising the following steps:
  • the host cells capable of producing said antigen-binding molecule include the cells of the hybridoma deposited according to the Budapest Treaty at the CNCM on February 25, 2013 under the access number 1-4717 with the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) of the Pasteur Institute of Paris.
  • the invention also relates to cloning vectors and expression vectors in which is inserted a nucleic acid encoding a binding molecule to the antigen as defined in the present description, or a functional fragment of said antigen-binding molecule.
  • the invention also relates to host cells, for example E. coli cells. coli, which have been transfected with an expression vector as defined above.
  • An antigen-binding molecule according to the invention and in particular a monoclonal antibody according to the invention can be obtained by immunizing a mammal with an immunogenic compound comprising a suitable peptide.
  • a non-human mammal for example a rodent such as a mouse, a rat, a guinea pig or a rabbit, is immunized with an immunogenic composition comprising an immunogenic compound capable of inducing the production of antibodies directed to against a peptide of interest.
  • the immunogenic compound comprises the antigenic peptide of interest that is covalently bound to a carrier protein such as KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), which may be prepared according to techniques well known to those skilled in the art .
  • KLH Keyhole Limpet Hemocyanin
  • the immunogenic compound may be combined with one or more immunoadjuvant substance (s), such as Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, aluminum hydroxide, or an adjuvant presented in the form of an emulsion, such as SEPPIC.
  • immunoadjuvant substances well known to those skilled in the art are described for example by Petrovsky et al. (2004, Immunology and Cell Biology, Vol 82: 488-496) or F. Vogel (1995, A compendium of adjuvants and excipients, Pharm Biotechnol, Vol 6: 141-228).
  • the antigenic peptide of interest comprises the sequence QPEEPFPE (SEQ ID NO: 20), which may also be referred to as an "epitope sequence”.
  • a particularly suitable antigenic peptide of interest comprises the sequence LQPEEPFPEQC (SEQ ID NO: 26).
  • an antigenic peptide of interest adapted to obtain an antigen-binding molecule according to the invention, and in particular a monoclonal antibody according to the invention, is constituted by the sequence LQPEEPFPEQC (SEQ ID No. 26).
  • an antigen-binding molecule according to the invention and in particular a monoclonal antibody capable of binding to the deamidated proteins of gluten and not exhibiting a cross-reaction with the non-deamidated proteins of the invention.
  • gluten by an immunization protocol shorter than the conventionally used protocol. In the conventional protocol, at least 3 immunizations separated by 3 weeks are performed and the antibody producing lymphocytes are extracted from the spleen of an immunized mouse.
  • 17 days separate the first immunization and cell fusion to immortalize the lymphocytes secreting the antibodies of interest.
  • mice are immunized in the legs and the lymphocytes are extracted from the popliteal ganglia.
  • such a protocol is entirely suitable for producing an antigen-binding molecule according to the invention, and in particular a monoclonal antibody capable of binding to the deamidated proteins of gluten and exhibiting no cross reaction. with the undamaged proteins of gluten.
  • an antigen-binding molecule according to the invention and in particular a monoclonal antibody according to the invention, possesses the following properties: said antigen-binding molecule, in particular said monoclonal antibody, binds to a deamidated protein of gluten, and is able to bind to deamidated proteins of gluten, that is to say to deamidated gliadins, deamidated ⁇ gliadins, gamma gliadins deamidated gliadins, deamidated gliadins, deamidated gliadins, deamidated high molecular weight glutenins, and deamidated low molecular weight glutenins,
  • said antigen-binding molecule in particular said monoclonal antibody, is not cross-reactive within the meaning of the invention with a non-deamidated gluten protein,
  • said antigen-binding molecule in particular said monoclonal antibody, binds with a high affinity to a deamidated gluten protein, i.e. complexes between an antigen-binding molecule according to the invention.
  • the invention and a deamidated gluten protein may be detected using a reduced amount of said antigen binding molecule, particularly a reduced amount of a monoclonal antibody of the invention.
  • an antigen-binding molecule according to the invention in particular a monoclonal antibody according to the invention, allowed the applicant to design methods for detecting the presence, in a sample test, deamed gluten, or deamidated proteins of gluten. More particularly, the advantageous properties of specificity and affinity of an antigen-binding molecule according to the invention, including a monoclonal antibody according to the invention, allowed the applicant to develop methods for detecting the presence of gluten deamidated proteins having characteristics of specificity, sensitivity and reproducibility which are compatible with industrial use, in particular for the purpose of detecting deamidated proteins of gluten in commercial products intended to come into contact with the human body or animal, including food and cosmetic products.
  • the present invention also relates to the use of an antigen-binding molecule as defined in the present description, in particular a monoclonal antibody as defined in the present description, for the in vitro detection of the presence of a deamidated gluten protein in a sample, more particularly deamidated proteins of gluten.
  • It also relates to an antigen binding molecule as defined in the present description, for use in an in vitro method for detecting the disease. presence of deamidated gluten in a sample, more particularly deamidated proteins of gluten.
  • the invention also relates to a method for detecting the presence of a deamidated gluten protein, particularly deamidated gluten proteins, in a sample, comprising the steps of:
  • step a) it is possible to use any type of sample for which the presence of at least one deamidated protein of gluten is sought, including finished food or cosmetic products or the glutens used as raw materials for the manufacture. of finished products.
  • the sample consists of an aqueous suspension obtained from the crude product to be analyzed.
  • the sample consists of an aqueous solution obtained from the crude product to be analyzed.
  • the sample consists of a fraction of the crude product to be analyzed, said fraction being able to be prepared using any technique making it possible to separate several constituents of the crude product to be analyzed and thus to enrich the sample. in proteins, or even selectively enrich the sample with gluten or certain proteins constituting gluten.
  • separation techniques are numerous and are part of the general knowledge of those skilled in the art.
  • the high sensitivity of the above method is permitted because of the good affinity of the antigen binding molecule for deamidated proteins of gluten. This is the reason why the above process can be carried out using a finished product sample in which the gluten content is reduced.
  • the sample consists of a gluten sample that can be used as an ingredient in the manufacture of a wide variety of products, including food and cosmetics.
  • an antigen-binding molecule as defined in the present description can be advantageously used to detect the presence of deamidated gluten in a sample, more particularly deamidated proteins of the present invention.
  • gluten for legal or regulatory purposes, in particular to meet current and future requirements of the Codex Alimentarius established by the World Health Organization.
  • steps b) and c) are part of the general knowledge of the skilled person.
  • Step c) may also be defined as a step of detecting the binding or binding of said antigen binding molecule to said sample.
  • the attachment of the antigen-binding molecule to the test sample can be detected according to a variety of known techniques, which includes ELIS-type or RIA-type assays or immunoblot techniques (also called “Western blotting").
  • the above method is an immunoassay according to the ELISA technique well known to those skilled in the art.
  • the support on which the antibody is immobilized may be a material insoluble in water, porous or non-porous.
  • the carrier may be hydrophilic or hydrophilic and includes inorganic powders such as silica, magnesium sulfate and aluminum; natural polymeric materials, particularly cellulosic materials and materials derived from cellulose; natural or synthetic polymers such as nitrocellulose, cellulose acetate, polyvinyl chloride, polyacrylamide, crosslinked dextran, agarose, polyacrylate, polyethylene, polypropylene, poly (4) methylbutene), polystyrene, polymethacrylate, polyethylene terephthalate, nylon, polyvinyl butyrate, certain types of glass such as Bioglass, or ceramics.
  • inorganic powders such as silica, magnesium sulfate and aluminum
  • natural polymeric materials particularly cellulosic materials and materials derived from cellulose
  • natural or synthetic polymers such as nitrocellulose, cellulose acetate, polyvinyl chloride,
  • the attachment of an antibody according to the invention to a support can be carried out by techniques well known to those skilled in the art.
  • the support may be in various forms, including in the form of strips or particles such as beads.
  • the surface of the support may be polyfunctional or capable of being polyfunctional so as to bind the antibody via covalent or non-covalent interactions which may be specific or non-specific.
  • step c) the detection of complexes formed between the sample and the antigen-binding molecule, i.e., detecting the binding of the antigen-binding molecule to the antigen-binding molecule.
  • sample can be performed by measuring a signal generated by a detectable molecule bound to said antigen binding molecule.
  • the detectable molecule can be directly bound, for example by covalent binding, to the antigen-binding molecule, or the detectable molecule is bound to a ligand non-covalently binding to the binding molecule to the antigen.
  • said ligand may be of the labeled antibody type with a detectable molecule, said antibody recognizing a region of the antigen binding molecule other than the antigen binding region.
  • a labeled antibody is used recognizing a region of the antigen-binding molecule that is not involved in antigen recognition.
  • the ligand is preferably an antibody, commonly referred to as a "secondary antibody,” which binds to the constant portion of the deamidated anti-gluten monoclonal antibody.
  • the other antibody is covalently bound to a molecule allowing its direct or indirect detection.
  • the detectable molecule may be isotopic or non-isotopic.
  • the detectable molecule may be involved in a catalytic reaction, such as an enzyme, an enzyme fragment, an enzyme substrate, an enzyme inhibitor, a co-enzyme or a catalyst.
  • the detectable molecule may also be a chromogen, such as a fluorophore, a dye, a chemiluminescent molecule.
  • the detectable molecule may thus be a fluorescent molecule such as the molecules described by Ichinose et al. (1991, Fluorometric Analysis in Biomedical Chemistry, New York: Wiley-Interscience) or fluorescent isothiocyanate derivatives, phycoerithrin, rhodamine isothiocyanate, dansyl chloride or XRITC compound, GFP protein (Green Fluorescent Protein) of fish Aequorea Victoria and its many derivatives, or the YFP protein (Yellow Fluorescent Protein) and the protein luciferase.
  • a fluorescent molecule such as the molecules described by Ichinose et al. (1991, Fluorometric Analysis in Biomedical Chemistry, New York: Wiley-Interscience) or fluorescent isothiocyanate derivatives, phycoerithrin, rhodamine isothiocyanate, dansyl chloride or XRITC compound, GFP protein (Green Fluorescent Protein) of fish Aequorea Victoria and its many derivatives, or
  • the preferred molecules are the following enzymes, according to the International IUB Classification: (i) Class I oxidoreductases and (ii) Class 3 hydrolases.
  • the preferred oxidoreductases are (i) dehydrogenases of Class 1.1, more particularly 1.1.1, 1.1.3 and 1.1.99 and (ii) peroxidases of Class 1.11 and (iii) hydrolases of Class 3.1, and more particularly of Class 3.1.3 and Class 3.2, more specifically 3.2.1.
  • the preferred dehydrogenases are malate dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase and lactate dehydrogenase.
  • the preferred oxidase is glucose oxidase.
  • the preferred peroxidase is horseradish peroxidase (horse radish peroxidase).
  • Preferred hydrolases are alkaline phosphatases, ⁇ -glucosidase and lysozyme.
  • the detectable molecule may also be a radioactively labeled molecule
  • an isotope chosen from [H], [P] and [I].
  • one of the antibodies constituting a detection kit according to the invention may be covalently linked to a ligand such as biotin or streptavidin.
  • the detectable molecule is selected so that it binds to the ligand covalently bound to the antibody.
  • the detectable molecule may, for example, itself be bound to biotin or streptavidin, respectively.
  • the means for revealing the formation of a complex between a deamidated gluten protein present in the sample tested and an antigen binding molecule may be an antibody, for example, in embodiments in which the antigen-binding molecule is a monoclonal antibody, an antibody capable of specifically binding to the Fc portion of the monoclonal antibody or an antibody capable of binding specifically to the isotype to which the anti-deamid protein monoclonal antibody belongs.
  • Detectable molecules include enzymes such as peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -D-galactosidase, glucose oxidase, glucose amylase, carbonic anhydrase, acetylcholine esterase, lysozyme, malate dehydrogenase, or still glucose-6-phosphate dehydrogenase.
  • Detectable molecules also include biotin and digoxigenin, 5-bromodeoxyuridine.
  • the detectable molecules also include fluorescent molecules such as fluorescein and its derivatives, the protein GFP (for "Green Fluorescent Protein"), the protein YFP (for "Yellow Fluorescent Protein”), or the umbelliferone.
  • Detectable molecules also include chemiluminescent molecules such as luminol and dioxetanen bioluminescent molecules such as luciferase and luciferin. Detectable molecules
  • radioactive labels such as iodine 1 ", iodine 1 ", iodine 1ZD , iodine 1 ", bromine 77 , technetium 99m , indium 111 , gallium 67 gallium 68 , rubenium 95 , rubenium 97 , rubenium 103 , rubenium 105 , mercury 107 , mercury 203 , rhenium 99 TM, rhenium 101 , rhenium 105 , scandium 47 , fluorine 18 and iodine 131 .
  • radioactive labels such as iodine 1 ", iodine 1 ", iodine 1ZD , iodine 1 ", bromine 77 , technetium 99m , indium 111 , gallium 67 gallium 68 , rubenium 95 , rubenium 97 , rubenium 103 , rubenium 105 , mercury 107 , mercury 203 ,
  • step b) is carried out by incubation of a deamidated anti-gluten monoclonal antibody (antigen-binding molecule according to the invention) in wells of a plate in which proteins from the plate have been immobilized beforehand.
  • sample to be tested for example the constitutive gluten of the sample to be tested,
  • step c) is carried out by incubation of the wells previously subjected to step b) with a labeled antibody binding to the constant part of the heavy chain of the deamidated anti-gluten monoclonal antibody, in this case an antibody anti-IgG1 labeled with peroxidase.
  • said method consists of a sandwich type immunoassay and comprises the following steps: a) providing a solid support on which an antigen-binding molecule such as as defined in the present description, for example a deamidated anti-gluten monoclonal antibody,
  • step b) incubating or contacting the solid support obtained at the end of step b) with an antigen binding molecule as defined in the present description, for example a deamidated anti-gluten monoclonal antibody, and
  • the present invention also relates to so-called "competitive" immunoassay methods well known to those skilled in the art, the principle of which is based on an antibody binding competition between (i) the deamidated protein molecules of gluten susceptible to be present in the sample to be analyzed and (ii) decoy molecules, for example peptides mimicking deamidated proteins of gluten.
  • competitive immunoassays the presence of deamidated gluten proteins induces inhibition of the binding of the deamid anti-gluten antibody to the decoy peptides, the level of inhibition of the binding of the antibody to the decoy peptides being correlated with the amount of deamidated gluten protein that is present in the test sample.
  • the invention also relates to a method for detecting the presence of a deamidated protein of gluten, more particularly deamidated proteins of gluten, in a sample comprising the following steps:
  • step b) incubating said sample with an antigen-binding molecule as defined in the present description, in particular a deamidated anti-gluten monoclonal antibody, under conditions allowing the formation of complexes between said antigen binding molecule and a deamidated protein of gluten, in particular deamidated proteins of gluten, in order to obtain an incubation solution, c) contacting the incubation solution obtained at the end of step b) with a support on which is immobilized a peptide mimicking a deamidated gluten protein, which may also be called "decoy peptide", and
  • step b) detecting or quantifying any complexes formed between (i) said peptide mimicking a deamidated gluten protein which is immobilized on the support and (ii) said antigen binding molecule present in the incubation solution obtained at the end of step b).
  • step d) of the above process a signal generated by the formation of the complexes between (i) said peptide mimicking a deamidated gluten protein which is immobilized on the support and (ii) said binding molecule is measured. to the antigen present in the incubation solution obtained at the end of step b). The value of said signal is correlated with the quantity of said complexes which are formed at the end of step c).
  • binding of antigen-binding molecules to the decoy peptides can be quantified in step d) of the method.
  • the amount of antigen-binding molecules which are attached to the decoy peptides at the end of step d) can be expressed in arbitrary units representative of the level of fixation, for example in absorbance value of the light (test of type ELISA) or in radioactivity value (RIA test).
  • the above method comprises an additional step (step e)) of comparing the quantitative value obtained at the end of step d).
  • the reference value is preferably obtained by the implementation of the above method by providing in step a) a sample devoid of deamidated gluten protein, which includes the implementation of the above method by providing the step a) a sample containing at least one non-deamidated gluten protein, said sample containing no deamidated gluten protein.
  • the ratio between (i) the quantification value measured in step d) when the process is carried out with the sample to be tested and (ii) the reference value makes it possible to calculate the percentage of inhibition of the fixation of the molecule antigen binding to the decoy peptide.
  • the above method is carried out in sequence successively with a series of reference samples each containing a known concentration of deamidated proteins of gluten, in order to generate a standard curve of the percentages of inhibition.
  • the amount of deamidated gluten protein present in the test sample is determined on the standard curve from the quantitative value obtained at the end of step d) of the method.
  • the peptide mimicking a deamidated gluten protein comprises an amino acid sequence selected from:
  • EPQEPFPE SEQ ID No. 18
  • the peptide mimicking a deamidated gluten protein comprises an amino acid sequence LQPEEPFPEQC (SEQ ID NO: 22).
  • the invention also relates to a kit for detecting the presence of deamidated gluten in a sample, comprising at least one antigen binding molecule as defined in the present description, and where appropriate a reagent or a plurality of reagents necessary for carrying out a detection method as defined in the present description.
  • the antigen-binding molecule which may be a deamidated anti-gluten monoclonal antibody as defined herein, is immobilized on a carrier, for example is immobilized in wells. plates of a suitable type for performing immunological tests, for example in microplate wells suitable for performing ELISA or RIA immunoassays, well known to those skilled in the art.
  • the present invention thus provides an antigen binding molecule dedicated to detect the presence of deamidated gluten proteins in a sample from a product for human or veterinary food.
  • the present invention also provides an antigen binding molecule for detecting the presence of a plurality of deamidated gluten proteins present in a sample from a product for human or veterinary food.
  • the present invention also provides an antigen-binding molecule for detecting the presence of a plurality of deamidated gluten proteins, which may have varying degrees of deamidation present in a sample from a product intended for human or veterinary food.
  • the present invention thus provides an antigen-binding molecule for detecting the presence of a very small amount of a plurality of different deamidated gluten proteins present in a sample from a product intended for human or veterinary food.
  • mice are immunized in the hind paws by injection of 30 ⁇ l of a mixture (v / v) of a peptide solution of sequence SEQ ID No. 20 (QPEEPFPE) conjugated to KLH and an adjuvant solution brand TitermaxGold. 17 days after a booster takes place under the same conditions. Finally, 3 days later, the mice are killed and their popliteal ganglia are removed. The cells present in the ganglia are extracted by perfusion and fused with myeloma cells (NSI line).
  • NBI line myeloma cells
  • Hybridoma is then selected according to conventional methods of producing antibodies.
  • Example 2 Characterization of the monoclonal antibody PEE 14C7
  • the monoclonal antibody produced by the PEE14C7 hybridoma was determined to be of IgG1 isotype.
  • the monoclonal antibody produced by the PEE14C7 hybridoma was sequenced by GenScript Corporation (Piscataway, USA). In summary, a step was taken to extract the total RNA from the hybridoma cells that had previously been frozen.
  • the cDNA was synthesized by amplification of the regions encoding the antibody, and in particular by amplification of the nucleic acids encoding the variable regions of the heavy and light chains, by the RT-PCR technique from the total RNA.
  • the amplified cDNAs respectively encoding the variable regions of the heavy and light chains of the monoclonal antibody were cloned into separate vectors. Then, after screening for positive colonies, the DNA was sequenced.
  • the amino acid and nucleotide sequences corresponding to the heavy and light chains, as well as the CDRs, are respectively indicated in Tables 1 and 2 below.
  • Table 1 Amino acid sequences of heavy and light chains and corresponding CDRs.
  • the specificity of the antibody PEE 14C7 was controlled by indirect ELISA by depositing on the solid phase various proteins purified from gluten. These proteins have or have not undergone chemical deamination (0.1 N HCl, 90 ° C., 1 h). The rates of desamidation of these products were determined by the method described by Khun et al. (1996) and Gourbeyre et al. (2011): The results are shown in Table 3 below.
  • the proteins are solubilized at 1 mg / ml in 50% Ethanol (native proteins) or in carbonate (0.05 M); 0.1% SDS before being diluted to 1 ⁇ g / mL in 0.05 M carbonate for microplate deposition (1 night at 4 ° C). All wells of the microplate are then saturated with PBS-Milk 0.1% (1 h at room temperature). The culture supernatant of PEE clone 14C7 is then diluted in series and deposited in the wells of the microplate.
  • the monoclonal antibodies which specifically bound to the proteins deposited in the wells are revealed by a secondary antibody (Goat anti Mouse IgG, Biorad ref 170-6516) conjugated to peroxidase and revealed by Orthophenylene Diamine and absorbance reading at 490 nm.
  • a secondary antibody Goat anti Mouse IgG, Biorad ref 170-6516 conjugated to peroxidase and revealed by Orthophenylene Diamine and absorbance reading at 490 nm.
  • the results are shown in FIG. 1.
  • the results of FIG. 1 show that the monoclonal antibody PEE 14C7 selectively recognizes the deamidated proteins of gluten, respectively deamidated gliadin, deamidated gliadin ⁇ , deamidated gliadin co2, gliadin co5 deamidated and glutenin of low molecular weight deamidated.
  • the PEE 14C7 antibody does not cross-react with the undenatured gluten
  • the percentages of reactivity of the antibody with respect to each protein are determined as described in Tranquet et al. (2012). In the present case the percentages are determined at the 1/50 dilution of the culture supernatant (ie the highest dilution to obtain the highest absorbance on the most recognized protein - gamma gliadins deamidated).
  • the percentage recognition of a protein X is obtained by making the ratio Absorbance Protein X / Absorbance Gamma gliadins desamjans. The results are shown in Table 4 below.
  • This assay based on the use of peptide BSQ-conjugated LQPEEPFPEQC (SEQ ID NO: 22) (100 ng / well) and 1/4000 diluted PEE 14C7 antibody supernatant, specifically detected desamidated gliadins at a concentration of between 1 and 8 ng / mL.
  • the culture supernatant of the clone PEE 14C7 diluted 1/4000 in PBS-Milk 0.1% is preincubated (lh30 at room temperature) with as competitor a range of native or deamidated gliadins diluted in PBS-Milk 0.1% at different concentrations ( 1.6 ng / mL at 5 ⁇ g / mL) and then deposited in a microplate previously coated with BS-LQPEEPFPEQC SEQ ID NO: 22 (100 ng / well - overnight) and saturated with PBS-4% milk (1 hr at room temperature). The washes, the saturation and the detection of the immune complexes are carried out with the same protocol as the indirect ELISA. The percent inhibition is calculated from the formula: [1 - ((OD Competitor - OD supernatant background noise) / (OD without Positive Competitor - DO background noise serum)) * 100].
  • the results are shown in Figure 3.
  • the results of Figure 3 show the high sensitivity and high specificity of a method for detecting the presence of deamidated gluten proteins that implements the PEE 14C7 antibody.
  • Table 5 Sequences of peptides mimicking a deamidated gluten protein (lure).
  • FIG. 4 shows that for a 1/20 dilution of an extract of the flour to be tested, the percentage inhibition of the competitive ELISA test by this extract remains below 15%, that is to say below significant threshold.

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Abstract

La présente invention est relative à un anticorps monoclonal apte à se lier aux protéines désamidées du gluten et ne présentant pas de réaction croisée avec les protéines non désamidées du gluten.

Description

« Anticorps anti-gluten désamidé et utilisations »
Domaine de l'invention
La présente invention se rapporte au domaine du contrôle de l'innocuité de certains produits contenant du gluten désamidé pour les hommes ou les animaux susceptibles de développer des réactions allergiques à ce type de gluten transformé.
Art antérieur
Les protéines du gluten, lesquelles englobent les sous-unités protéiques gliadines et gluténines, sont des constituants fréquemment retrouvés dans de nombreux produits alimentaires, en particulier des produits de boulangerie ou de pâtisserie ainsi que les préparations culinaires industrielles, ou encore dans certains produits cosmétiques, ces derniers pouvant comprendre des hydrolysats de protéines et en particulier des hydrolysats de protéines de blé.
Les protéines du gluten se caractérisent notamment par leur composition spécifique en acides aminés, ces protéines contenant une teneur élevée en résidus proline (environ 30 % du total des résidus d'acides aminés), et en résidus glutamine (environ 40 % du total des résidus en acides aminés). Les protéines constitutives du gluten se caractérisent aussi par la présence de séquences répétées d'acides aminés. On connaît cinq classes de gliadines constitutives du gluten, respectivement les gliadines a, les gliadines β, les gliadines γ, les gliadines co2 et les gliadines co5. On connaît aussi deux classes de gluténines, respectivement les gluténines de bas poids moléculaire et les gluténines de haut poids moléculaire.
Les protéines du gluten sont utilisées dans l'industrie principalement du fait de leurs propriétés de visco-élasticité et d'insolubilité. Toutefois, le caractère insoluble des protéines du gluten constitue une limitation technique pour étendre davantage leur utilisation industrielle.
Une utilisation diversifiée des protéines du gluten a été rendue possible du fait de la disponibilité de glutens modifiés constituant des produits hydro-dispersibles ou hydrosolubles. Pour l'obtention de glutens modifiés ayant des propriétés accrues d'hydro- dispersibilité ou d' hydrosolubilité, on a généralement recours à des méthodes de transformation du gluten natif par désamidation par un traitement acide ou alcalin.
Toutefois, un nombre croissant de cas d'allergie aux protéines désamidées du gluten a été recensé, sans réaction allergique vis-à-vis des protéines natives. Fréquemment, les symptômes de réactions allergiques aux protéines désamidées du gluten sont sévères. Ces symptômes peuvent comprendre un angio-œdème accompagné d'une urticaire généralisée. Les réactions allergiques au gluten désamidé peuvent aussi conduire à la survenue d'un choc anaphylactique.
Des déterminants antigéniques contenus dans les protéines de gluten désamidées et reconnus par les IgE de patients allergiques ont été identifiés (voir Denery-Papini et al, 2012, Allergy, Vol. 67 : 1023-1032).
Afin de prévenir les réactions allergiques au gluten désamidé chez les consommateurs, des tests cutanés de détection d'allergies au gluten désamidé ont été décrits (voir notamment Battais et al, 2006, Eur. Ann. Allergy Clin. Immunol., Vol. 38 : 59-61). Toutefois, ces tests cutanés permettent difficilement de différencier entre l'existence d'une allergie aux protéines de blé, en particulier au gluten natif, et l'existence d'une allergie au gluten désamidé. En effet, les fractions protéiques isolées utilisées pour la réalisation de ces tests cutanés contiennent à la fois des protéines natives et des protéines désamidées.
II est par exemple connu un anticorps MC01, qui se fixe de manière spécifique à α-gliadine désamidée et ne se fixe pas à α-gliadine non désamidée (voir notamment Skovbjerg et al, 2004, Biochem. Biophys. Acta, Vol. 1690 (3) : 220-230 ; Skovbjerg et al, 2008, Dig. Dis. Sci. Vol. 53 : 2917-2924).
Cependant, l'origine vari étale ou les procédés de transformation des farines de blé connus peuvent néanmoins aboutir à un produit final dont le contenu en les différentes protéines du gluten peut sensiblement varier, en raison notamment des méthodes de transformation employées, telles que les techniques comportant des étapes mettant en œuvre des solvants, par exemple un alcool. En effet, alors que les gliadines sont solubles dans l'alcool, les gluténines y sont insolubles. Ainsi, la transformation industrielle des farines de blé peut conduire à un appauvrissement de la farine en gliadines ou en gluténines.
Il s'ensuit que l'utilisation d'anticorps spécifiques d'une protéine du gluten donnée n'est pas adaptée pour la détection globale de gluten désamidé dans un échantillon. En effet, la quantité de cette protéine désamidée du gluten donnée par rapport aux autres protéines désamidées du gluten peut être substantiellement réduite, ce qui est susceptible de rendre sa détection difficile, voire impossible.
De la même manière, les procédés connus de transformation des farines de blé peuvent aboutir à des produits finals comprenant des protéines désamidées du gluten présentant un degré très variable de désamidation.
Il existe donc un besoin pour fournir des moyens et des procédés de détection de protéines désamidées du gluten, alternatifs ou améliorés par rapport aux moyens et procédés connus.
II existe un besoin dans l'état de la technique pour la mise au point de moyens permettant de réduire ou d'éviter la survenue d'allergies au gluten désamidé chez les consommateurs.
Résumé de l'invention
La présente invention fournit des molécules de liaison à l'antigène, notamment des anticorps monoclonaux et des fragments de liaison à l'antigène desdits anticorps monoclonaux, ayant la propriété de se lier de manière spécifique à au moins une protéine désamidée du gluten, lesdites molécules de liaison à l'antigène ne présentant toutefois pas de réaction croisée avec une protéine non désamidée du gluten.
Pour mémoire, le gluten comprend les protéines suivantes : gliadines a, gliadines β, gliadines γ, gliadines co2, gliadines co5, gluténines de faible poids moléculaire et gluténines de haut poids moléculaire. Les gluténines de bas poids moléculaire possèdent un poids moléculaire inférieur à 90 000 et les gluténines de haut poids moléculaire possèdent un poids moléculaire égal ou supérieur à 90 000. En général, le gluten comprend environ 60 % à 70 % en poids de gliadines et environ 30 % à 40 % en poids de gluténines, par rapport au poids total du gluten. Les gliadines sont composées d'environ 4 % à 11 % en poids de gliadines co5, d'environ 8 % à 22 % en poids de gliadines co2, d'environ 26 % à 29 % en poids de gliadines α/β et d'environ 10 % à 26 % en poids de gliadines γ, par rapport au poids total du gluten.
L'invention concerne notamment une molécule de liaison à l'antigène sous la forme d'un anticorps monoclonal ayant la propriété de se lier à au moins une protéine désamidée du gluten, lesdits anticorps monoclonaux ne présentant pas de réaction croisée avec une protéine non désamidée du gluten, lequel anticorps monoclonal est produit par l'hybridome déposé selon le Traité de Budapest à la CNCM le 25 février 2013 sous le numéro d'accès 1-4717 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur de Paris.
L'invention concerne aussi une molécule de liaison à l'antigène, choisie parmi un anticorps monoclonal et un fragment de liaison à l'antigène dudit anticorps monoclonal, apte à se lier aux protéines désamidées du gluten et ne présentant pas de réaction croisée avec les protéines non désamidées du gluten.
Ledit anticorps monoclonal est notamment produit par l'hybridome déposé selon le Traité de Budapest à la CNCM le 25 février 2013 sous le numéro d'accès 1-4717 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur de Paris.
L'invention est aussi relative à une molécule de liaison à l'antigène, notamment un anticorps monoclonal, comprenant au moins une chaîne choisie parmi une chaîne lourde ou une chaîne légère d'une région variable, ladite molécule de liaison à l'antigène comprenant au moins un CDR (pour « Complementary Determining Région ») choisi parmi les CDRs qui ont été séquencés selon le protocole qui est décrit à l'exemple 1 à partir des cellules de l'hybridome déposé selon le Traité de Budapest à la CNCM le 25 février 2013 sous le numéro d'accès 1-4717 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur de Paris.
L'invention est relative à une molécule de liaison à l'antigène, notamment un anticorps monoclonal, comprenant au moins une région variable d'une chaîne lourde (VH) ou une région variable d'une chaîne légère (VL), ladite molécule de liaison à l'antigène comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDRs suivants :
(a) un CDR de chaîne lourde choisi parmi les CDRs suivants :
- VH-CDR1 comprenant la séquence SEQ ID N° 2,
- VH-CDR2 comprenant la séquence SEQ ID N° 3, et
- VH-CDR3 comprenant la séquence SEQ ID N° 4 ; ou
(b) un CDR de chaîne légère choisi parmi les CDRs suivants :
- VL-CDR1 comprenant la séquence SEQ ID N° 6,
- VL-CDR2 comprenant la séquence SEQ ID N° 7, et
- VL-CDR3 comprenant la séquence SEQ ID N° 8. Selon un premier aspect, les molécules de liaison à l'antigène selon l'invention sont notamment caractérisées en ce qu'elles se lient de manière spécifique à une protéine désamidée du gluten choisie parmi une gliadine désamidée et une gluténine désamidée et ne présentent pas de réaction croisée avec une gliadine non désamidée et une gluténine non désamidée.
Selon un second aspect, les molécules de liaison à l'antigène selon l'invention sont notamment caractérisées en ce qu'elles se lient à les gliadines désamidées choisies dans le groupe comprenant les gliadines a désamidées, les gliadines β désamidées, les gliadines γ désamidées, les gliadines co2 désamidées et les gliadines co5 désamidées et ne présentent pas de réaction croisée avec les gliadines non désamidées correspondantes.
Selon un troisième aspect, les molécules de liaison à l'antigène selon l'invention sont notamment caractérisées en ce qu'elles se lient aux gluténines de bas poids moléculaire désamidées et ne présentent pas de réaction croisée avec les gluténines de bas poids moléculaire non désamidées.
Selon un autre aspect, les molécules de liaison à l'antigène selon l'invention sont notamment caractérisées en ce qu'elles se lient aux gluténines de haut poids moléculaire désamidées et ne présentent pas de réaction croisée avec les gluténines de haut poids moléculaire non désamidées.
Selon un autre aspect, les molécules de liaison à l'antigène selon l'invention sont notamment caractérisées en ce qu'elles sont aptes à se lier à une gliadine désamidée et une gluténine désamidée et ne présentant pas de réaction croisée avec une gliadine non désamidée et une gluténine non désamidée.
L'invention a également trait à un complexe formé entre une molécule de liaison à l'antigène telle que définie ci-dessus et une protéine de gluten désamidée.
La présente invention concerne aussi des procédés et des kits pour détecter la présence d'une protéine désamidée du gluten dans un échantillon, en particulier de protéines désamidées du gluten, pour lesquels est utilisée une molécule de liaison à l'antigène selon l'invention.
Description des figures
La Figure 1 illustre la capacité d'un anticorps monoclonal selon l'invention à se lier à une variété de glutens désamidés sans présenter de réaction croisée avec une protéine non désamidée de gluten (la gliadine co5). En abscisse : dilutions croissantes de l'anticorps monoclonal. En ordonnées, valeur d'absorbance (DO) à 490 nanomètres. Courbes : «♦ » : gliadine désamidée ; «■ » : gluten désamidé n° 1 ; «▲ » ; gluten désamidé n° 2 ; « X » gluten désamidé n° 3 ; « * : gliadine co5 native non désamidée.
La Figure 2 illustre la capacité d'un anticorps monoclonal selon l'invention à se lier aux protéines désamidées constitutives du gluten désamidé, sans présenter de réaction croisée avec des protéines de gluten natives. En abscisse : dilutions croissantes de l'anticorps monoclonal. En ordonnées, valeur d'absorbance (DO) à 490 nanomètres. Courbes : n°l « -♦ - a » : gliadine a native ; n° 2 « -Α-γ » : gliadine γ native ; n° 6 « - #-co5 » : gliadine co5 native ; n° 7 « - -\- - LMW » : gluténine de bas poids moléculaire native ; n° 9 «— α-D » : gliadine a désamidée ; n° 11 « B-co2-D » : gliadine co2 désamidée ; n° 12« X-co5-D » : gliadine co5 désamidée ; n° 5 « Β-β » : gliadine β native ; n° 8 « X-co2 » : gliadine co2 native ; n° 4 « · HMW » : gluténine de haut poids moléculaire native ; n° 3«— BSA » : albumine bovine sérique native ; n° 13 «♦ γ-D » : gliadine γ désamidée ; n° 10 «▲ Glut. LMW-D » : gluténine de bas poids moléculaire désamidée.
La Figure 3 illustre la capacité d'un anticorps monoclonal selon l'invention à se lier à des gliadines désamidées sans présenter de réaction croisée avec des gliadines natives, évaluée selon un test immunologique du type ELISA compétitif. En abscisse : pourcentage d'inhibition de la liaison de l'anticorps monoclonal au peptide LQPEEPFPEQC (SEQ ID N° 22). Courbes : « A » : gliadines natives ; «♦ » : gliadines désamidées.
La Figure 4 illustre l'absence de spécificité d'un anticorps monoclonal selon l'invention vis-à-vis des farines industrielles telles que les farines de blé, de seigle, d'orge, d'avoine, de blé dur, d'épeautre, de maïs et de soja. En abscisses, dilutions au 1/10 (dil 10) et au 1/20 (dil 20) des farines testées. En ordonnées, pourcentage d'inhibition du Test ELISA compétitif par la farine testée.
Description détaillée de l'invention
Afin de rendre disponibles des moyens permettant de réduire ou d'éviter la survenue d'allergies au gluten désamidé chez les consommateurs, le demandeur a mis au point des moyens préventifs, sous la forme de procédés et kits permettant pour la première fois une détection fiable et reproductible de la présence de protéines désamidées de gluten dans un échantillon, comme par exemple un produit alimentaire ou un produit cosmétique. Les procédés et kits fournis par la présente invention peuvent aussi être utiles pour satisfaire les éventuelles exigences légales ou réglementaires relatives à la mesure de la présence de gluten dans les produits alimentaires. On rappelle notamment que le Codex Alimentarius établi par l'Organisation Mondiale de la Santé impose de renseigner le consommateur sur la présence ou non de gluten dans les aliments (norme ALINORM 08/31/26).
Par exemple, il est connu l'anticorps de Skeritt, qui est dirigé contre la gliadine du blé et qui reconnaît les gluténines de haut poids moléculaire et la gliadine co.
Il est aussi connu l'anticorps R5, qui est dirigé contre la sécaline du seigle, et possède une bonne affinité pour la gliadine du blé, ainsi que certaines protéines du soja et du lupin.
Or, à la connaissance du demandeur, les tests de détection de gluten actuellement disponibles ne permettent pas de détecter avec efficacité la présence de gluten désamidé (Kanerva et al, 2011, J. Cereal Sci. 53, 335-339).
On précise que la disponibilité des procédés et des kits de détection de protéines désamidées de gluten qui sont spécifiés dans la présente description a été permise grâce à l'obtention par le demandeur de molécules de liaison à l'antigène, et en particulier d'anticorps monoclonaux, aptes à se lier sélectivement aux protéines de gluten désamidées.
Molécule de liaison à l'antigène
La présente invention fournit en premier lieu des molécules de liaison à l'antigène se liant à au moins une protéine désamidée du gluten et ne présentant pas de réaction croisée avec une protéine non désamidée du gluten.
En particulier, la présente invention fournit une molécule de liaison à un antigène choisie parmi un anticorps monoclonal et un fragment de liaison à l'antigène dudit anticorps monoclonal, apte à se lier aux protéines désamidées du gluten et ne présentant pas de réaction croisée avec les protéines non désamidées du gluten.
Aux fins de la présente description, une molécule de liaison apte à se lier aux protéines désamidées du gluten englobe une molécule de liaison apte à se lier à toute protéine désamidée du gluten.
La présente invention fournit une molécule de liaison à un antigène choisie parmi un anticorps monoclonal et un fragment de liaison à l'antigène dudit anticorps monoclonal, apte à se lier à une gliadine désamidée et une gluténine désamidée et ne présentant pas de réaction croisée avec une gliadine non désamidée et une gluténine non désamidée.
Dans certains modes de réalisation, une molécule de liaison à un antigène choisie parmi un anticorps monoclonal et un fragment de liaison à l'antigène dudit anticorps monoclonal, selon la présente invention, est apte à se lier à une gliadine désamidée, c'est à dire une gliadine a désamidée, gliadine β désamidée, gliadine γ désamidée, gliadine co2 désamidée et gliadine co5 désamidée, et ne présente pas de réaction croisée avec une gliadine non désamidée.
Dans certains modes de réalisation, une molécule de liaison à un antigène choisie parmi un anticorps monoclonal et un fragment de liaison à l'antigène dudit anticorps monoclonal, selon la présente invention, est apte à se lier à une gluténine désamidée, c'est-à- dire une gluténine de haut poids moléculaire désamidée et gluténine de bas poids moléculaire désamidée et ne présente pas de réaction croisée avec une gluténine non désamidée.
En particulier, l'invention fournit une molécule de liaison à l'antigène sous la forme d'un un anticorps monoclonal caractérisé en ce qu'il est produit par l'hybridome déposé selon le Traité de Budapest à la CNCM le 25 février 2013 sous le numéro d'accès 1-4717 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur de Paris.
Par « molécule de liaison à l'antigène », on entend selon l'invention une protéine apte à se lier sélectivement à au moins une protéine désamidée de gluten, et ne présentant pas de réaction croisée avec une protéine non désamidée du gluten. Par « molécule de liaison à l'antigène », on entend plus particulièrement selon l'invention une protéine apte à se lier sélectivement aux protéines désamidées de gluten, et ne présentant pas de réaction croisée avec les protéines non désamidées du gluten. Les molécules de liaison à l'antigène englobent essentiellement, sinon exclusivement, des anticorps monoclonaux et des fragments de liaison à l'antigène provenant d'anticorps monoclonaux.
Par « anticorps monoclonal », on entend selon l'invention un anticorps provenant d'une population d'anticorps pratiquement homogène ou totalement homogène. Plus précisément, dans une population d'anticorps monoclonaux, les anticorps individuels sont identiques, à l'exception de mutations survenant naturellement qui peuvent être trouvées en proportions très minimes. Ainsi, au sens de l'invention, un « anticorps monoclonal » englobe une seule molécule d'un anticorps, aussi bien qu'une population homogène d'anticorps monoclonaux, provenant de la croissance d'un seul clone cellulaire, tels qu'un hybridome, ou encore une cellule hôte eucaryote transfectée ou transformée avec un acide nucléique codant pour ledit anticorps.
Par « fragment de liaison à l'antigène » ou « fragment fonctionnel » d'un anticorps, on entend selon l'invention une partie d'un anticorps parent comprenant une région impliquée dans la liaison de l'anticorps parent à l'antigène cible, c'est-à-dire à un épitope cible de l'antigène d'intérêt. Un « fragment de liaison à l'antigène » ou « fragment fonctionnel » englobe un fragment choisi parmi un fragment Fv (fragment variable), un fragment scFv (fragment variable simple chaîne), un fragment Fab, un fragment F(ab')2, un fragment Fab', un fragment Fabc, un fragment scFv-Fc, des « diabodies » ainsi que tout autre fragment d'anticorps qui a conservé l'aptitude de l'anticorps parent dont il dérive à se lier à l'antigène, dans le cas présent l'aptitude à se lier sélectivement à au moins une protéine désamidée du gluten, encore plus particulièrement l'aptitude à se lier sélectivement aux protéines désamidées du gluten.
Selon l'invention, l'aptitude d'un anticorps monoclonal ou d'un fragment fonctionnel de celui-ci à se lier à l'antigène, en l'occurrence son aptitude à se lier à au moins une protéine désamidée du gluten, en particulier à se lier aux protéines désamidées du gluten, peut être vérifiée en réalisant un test ELISA, comme décrit plus loin dans la description, et encore plus spécifiquement dans les exemples.
Selon l'invention, une molécule de liaison à l'antigène est caractérisée en ce qu'elle ne présente pas de réaction croisée avec une protéine non désamidée du gluten. L'absence de réaction croisée avec une protéine non désamidée du gluten est, aux fins de la présente invention, déterminée comme indiqué ci-après.
On peut réaliser un test immunologique ELISA comprenant les étapes suivantes : a) fournir un support sur lequel est immobilisée une protéine du gluten à tester, b) incuber le support fourni à l'étape a) avec une molécule de liaison à l'antigène telle que définie dans la présente description, dans des conditions permettant la formation de complexes entre ladite protéine du gluten et ladite molécule de liaison à l'antigène, et c) mesurer un signal représentatif de la quantité de molécules de liaison à l'antigène liées à ladite protéine de gluten. Dans une variante particulière du test immunologique ELIS A ci-dessus, l'étape c) comprend les étapes suivantes :
cl) incuber le support obtenu à la fin de l'étape b) avec un ligand reconnaissant la molécule de liaison à l'antigène, préférentiellement un anticorps reconnaissant la molécule de liaison à l'antigène, ledit ligand étant marqué par une molécule détectable, et c2) mesurer le signal généré par la molécule détectable, ledit signal étant représentatif de la quantité de molécules de liaison à l'antigène liées à ladite protéine de gluten.
Dans certains modes de réalisation du test immunologique ELISA ci-dessus, la molécule détectable est une enzyme, comme par exemple la peroxydase et l'étape c2) est la suivante :
c2) incuber le support obtenu à la fin de l'étape cl) avec un substrat de ladite enzyme, par exemple avec un substrat de la peroxydase, et mesurer le signal généré par le produit issu de la transformation du substrat, préférentiellement par mesure de la valeur d'absorbance de la lumière à la longueur d'onde d'absorption de la lumière par ledit produit.
Un mode de réalisation spécifique du test immunologique ELISA du type ci-dessus est illustré dans les exemples.
Le test immunologique est réalisé avec des gliadines désamidées de référence qui peuvent être issues d'une fraction de gliadines totales ou choisies parmi les gliadines a désamidées et les gliadines β désamidées ou les gliadines γ désamidées. De manière tout à fait préférée, les gliadines désamidées de référence sont les gliadines γ désamidées.
Puis on détermine le pourcentage de réaction croisée de la molécule de liaison à l'antigène avec une protéine non désamidée du gluten selon la formule (I) ci-dessous :
%CROIS = Valeur du signal « Protéine X »/ Valeur du signal « GLUT- D » (I), dans laquelle :
- %CROIS est la valeur de réaction croisée,
- « Protéine X » est choisie parmi la gliadine a non désamidée, la gliadine β non désamidée et la gluténine de haut poids moléculaire non désamidée,
- « GLUT-ND » est la protéine désamidée du gluten utilisée comme référence, et
- la Valeur du signal est la valeur de mesure du signal généré par la fixation de la protéine de liaison à l'antigène sur la protéine de gluten désamidée ou non désamidée considérée, par exemple la valeur d'absorbance de la lumière d'un produit de transformation enzymatique à une longueur d'onde donnée. La molécule de liaison à l'antigène est considérée comme ne présentant pas de réaction croisée avec une protéine non désamidée du gluten lorsque la valeur « %CROIS » est inférieure ou égale à 10, et préférentiellement inférieure ou égale à 5.
Selon l'invention, un « fragment de liaison à l'antigène » ou « fragment fonctionnel » englobe aussi une protéine comprenant au moins l'un des CDRs (pour « Complementary Determining Région »), c'est-à-dire l'une des régions de l'anticorps déterminant la complémentarité de l'anticorps avec l'antigène, lesquelles sont localisées dans les régions hypervariables de la région variable de l'anticorps parent.
Au sens de l'invention, un « CDR » est la région d'une immunoglobuline déterminant la liaison à l'antigène (pour « Complementary Determining Région ») et signifie une région hypervanable des chaînes légères et des chaînes lourdes des immunoglobulines comme défini par Kabat (Kabat et al, Séquences of proteins of immunological interest, 5èEd., US Department of Health and Human Services, NIH, 1991). Une immunoglobuline comprend trois CDRs de chaîne lourde et trois CDRs de chaîne légère. Aux fins de la présente description, les termes « CDR » et « CDRs » signifient, selon le cas, une, plusieurs ou toutes les régions contenant la plupart des résidus d'acides aminés qui sont responsables de l'aptitude d'un anticorps à se lier sélectivement à un antigène cible, c'est-à-dire à un épitope dudit antigène cible. Selon une autre définition, « CDR » ou « CDRs » signifie les régions hypervariables des chaînes lourdes et légères des immunoglobulines, tel que définies selon la numérotation IMGT. Pour mémoire, la numérotation unique EVIGT a été définie aux fins de comparer des domaines variables des immunoglobulines, indépendamment du type de récepteur à l'antigène, du type de chaîne ou de l'identité de l'espèce dont les immunoglobulines proviennent.
La présente invention est notamment relative à une molécule de liaison à l'antigène comprenant au moins un CDR ayant une séquence ayant au moins 80 % d'identité en acides aminés avec un CDR choisi parmi les CDRs de séquences SEQ ID N° 2, 3, 4, 6, 7 et 8, comme défini selon le système de numérotation EVIGT.
Ces CDRS ont été séquencés conformément au protocole décrit à l'exemple 1, à partir de l'hybridome déposé selon le Traité de Budapest à la CNCM le 25 février 2013 sous le numéro d'accès 1-4717 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur de Paris. Le "pourcentage d'identité" entre deux séquences d'acides aminés ou d'acides nucléiques, au sens de la présente invention, est déterminé en comparant les deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.
La partie de la séquence nucléotidique dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des " gaps ") par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal entre les deux séquences.
Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles un acide aminé identique (ou une base nucléique identique) est observé pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux acides aminés (ou entre les deux bases nucléiques) par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité en acides aminés (ou en nucléotides) des deux séquences entre elles.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus.
De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité de séquence est déterminé à l'aide du logiciel CLUSTAL W (version 1 .82) les paramètres étant fixés comme suit : (1 ) CPU MODE = ClustalW mp ; (2) ALIGNMENT = " full " ; (3) OUTPUT FORMAT = " aln w/numbers " ; (4) OUTPUT ORDER = " aligned " ; (5) COLOR ALIGNMENT = " no " ; (6) KTUP (word size) = " default " ; (7) WINDOW LENGTH = " default " ; (8) SCORE TYPE = " percent " ; (9) TOPDIAG = " default " ; (10) PAIRGAP = " default " ; (1 1 ) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = " none " ; (12) MATRIX = " default " ; (13) GAP OPEN = " default " ; (14) END GAPS = " default " ; (15) GAP EXTENSION = " default " ; (16) GAP DISTANCES = " default " ; (17) TREE TYPE = " cladogram " et (18) TREE GRAP DISTANCES = " hide ".
Au sens de l'invention, une séquence d'acides aminés ayant au moins 80 % d'identité en acides aminés avec une séquence d'acides aminés de référence englobe les séquences d'acides aminés ayant au moins 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou au moins 99 % d'identité en acides aminés avec ladite séquence de référence. Au sens de l'invention, une séquence nucléotidique ayant au moins 80 % d'identité en nucléotides avec une séquence nucléotidique de référence englobe les séquences nucléotidiques ayant au moins 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou au moins 99 % d'identité en nucléotides avec ladite séquence de référence.
La présente invention est relative à une molécule de liaison à l'antigène, notamment un anticorps monoclonal ou un fragment de liaison à l'antigène provenant d'un anticorps monoclonal, comprenant au moins une région variable d'une chaîne lourde comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDRs suivants :
- VH-CDR1, comprenant une séquence ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N° 2,
- VH-CDR2, comprenant une séquence ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N° 3, et
- VH-CDR3, comprenant une séquence ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N° 4.
La présente invention est relative à une molécule de liaison à l'antigène, notamment un anticorps monoclonal ou un fragment de liaison à l'antigène provenant d'un anticorps monoclonal, comprenant au moins une région variable d'une chaîne lourde comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDRs suivants :
- VH-CDR1, comprenant la séquence SEQ ID N° 2,
- VH-CDR2, comprenant la séquence SEQ ID N° 3, et
- VH-CDR3, comprenant la séquence SEQ ID N° 4.
La présente invention concerne aussi une molécule de liaison à l'antigène, notamment un anticorps monoclonal ou un fragment de liaison à l'antigène provenant d'un anticorps monoclonal, comprenant au moins une région variable d'une chaîne lourde comprenant les CDRs suivants :
- VH-CDR1, comprenant une séquence ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N° 2, - VH-CDR2, comprenant une séquence ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N° 3, et
- VH-CDR3, comprenant une séquence ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N° 4.
La présente invention concerne aussi une molécule de liaison à l'antigène, notamment un anticorps monoclonal ou un fragment de liaison à l'antigène provenant d'un anticorps monoclonal, comprenant au moins une région variable d'une chaîne lourde comprenant les CDRs suivants :
- VH-CDR1, comprenant la séquence SEQ ID N° 2,
- VH-CDR2, comprenant la séquence SEQ ID N° 3, et
- VH-CDR3, comprenant la séquence SEQ ID N° 4.
La présente invention est relative à une molécule de liaison à l'antigène, notamment un anticorps monoclonal ou un fragment de liaison à l'antigène provenant d'un anticorps monoclonal, comprenant au moins une région variable d'une chaîne légère comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDRs suivants :
- VL-CDR1, comprenant une séquence ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N° 6,
- VL-CDR2, comprenant une séquence ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N° 7, et
- VL-CDR3, comprenant une séquence ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N° 8.
La présente invention est relative à une molécule de liaison à l'antigène, notamment un anticorps monoclonal ou un fragment de liaison à l'antigène provenant d'un anticorps monoclonal, comprenant au moins une région variable d'une chaîne légère comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDRs suivants :
- VL-CDR1, comprenant la séquence SEQ ID N° 6,
- VL-CDR2, comprenant la séquence SEQ ID N° 7, et
- VL-CDR13, comprenant la séquence SEQ ID N° 8. L'invention concerne aussi une molécule de liaison à l'antigène, notamment un anticorps monoclonal ou un fragment de liaison à l'antigène provenant d'un anticorps monoclonal, comprenant au moins une région variable d'une chaîne légère comprenant les CDRs suivants :
- VL-CDR1 , comprenant une séquence ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N6,
- VL-CDR2, comprenant une séquence ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N° 7, et
- VL-CDR3, comprenant une séquence ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N° 8.
L'invention concerne aussi une molécule de liaison à l'antigène, notamment un anticorps monoclonal ou un fragment de liaison à l'antigène provenant d'un anticorps monoclonal, comprenant au moins une région variable d'une chaîne légère comprenant les CDRs suivants :
- VL-CDR1 , comprenant la séquence SEQ ID N6,
- VL-CDR2, comprenant la séquence SEQ ID N° 7, et
- VL-CDR3, comprenant la séquence SEQ ID N° 8. La présente invention a également trait à une molécule de liaison à l'antigène, notamment un anticorps monoclonal comprenant :
(a) au moins la région variable d'une chaîne lourde comprenant les trois CDRs suivants :
- VH-CDR1 , comprenant une séquence ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N° 2,
- VH-CDR2, comprenant une séquence ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N° 3, et
- VH-CDR3, comprenant une séquence ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N° 4, et
(b) au moins la région variable d'une chaîne légère comprenant les trois CDRs suivants : - VL-CDR1 , comprenant une séquence ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N° 6, - VL-CDR2, comprenant une séquence ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N° 7, et
- VL-CDR3, comprenant une séquence ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N° 8.
La présente invention concerne aussi une molécule de liaison à un antigène, notamment un anticorps monoclonal, comprenant :
(a) au moins la région variable d'une chaîne lourde comprenant les trois CDRs suivants :
- VH-CDR1, comprenant la séquence SEQ ID N° 2,
- VH-CDR2, comprenant la séquence SEQ ID N° 3, et
- VH-CDR3, comprenant la séquence SEQ ID N° 4, et
(b) au moins la région variable d'une chaîne légère comprenant les trois CDRs suivants :
- VL-CDR1, comprenant la séquence SEQ ID N° 6,
- VL-CDR2, comprenant la séquence SEQ ID N° 7, et
- VL-CDR3, comprenant la séquence SEQ ID N° 8.
Un anticorps adapté à la présente invention peut être sélectionné parmi les anticorps monoclonaux de souris, de rat, de chèvre, de lapin, de cheval, de lama, d'humain et d'autre primate.
Dans certains modes de réalisation, la molécule de liaison à l'antigène consiste en un anticorps monoclonal murin, de préférence d'isotype IgGl .
Préférentiellement, ledit anticorps monoclonal murin consiste en l'anticorps monoclonal produit par l'hybridome déposé à la CNCM le 25 février 2013 sous le numéro d'accès 1-4717, ou en un fragment fonctionnel de celui-ci.
L'invention est également relative à une molécule de liaison à l'antigène, notamment un anticorps monoclonal, comprenant au moins une chaîne lourde comprenant une région variable, ladite région variable ayant une séquence possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N° 1.
L'invention est également relative à une molécule de liaison à l'antigène, notamment un anticorps monoclonal, comprenant au moins une chaîne lourde comprenant une région variable, ladite région variable ayant une séquence comprenant la séquence SEQ ID N° 1. L'invention a aussi trait à une molécule de liaison à l'antigène, notamment un anticorps monoclonal, comprenant au moins une chaîne légère comprenant une région variable, ladite région variable ayant une séquence possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N° 5.
L'invention a aussi trait à une molécule de liaison à l'antigène, notamment un anticorps monoclonal, comprenant au moins une chaîne légère comprenant une région variable, ladite région variable ayant une séquence comprenant la séquence SEQ ID N° 5.
L'invention concerne aussi une molécule de liaison à l'antigène, ce qui englobe un anticorps monoclonal, comprenant au moins :
- au moins la région variable d'une chaîne lourde ayant une séquence comprenant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N°l, et
- au moins la région variable d'une chaîne légère ayant une séquence comprenant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N°5.
L'invention concerne aussi une molécule de liaison à l'antigène, c'est-à-dire un anticorps monoclonal, comprenant au moins :
- au moins la région variable d'une chaîne lourde comprenant la séquence SEQ ID N°l, et
- au moins la région variable d'une chaîne légère comprenant la séquence SEQ ID N°5. Dans certains modes de réalisation, la molécule de liaison à l'antigène comprend une chaîne lourde variable (VH) et une chaîne légère variable (VL) liées entre elles par un peptide de liaison. Le peptide de liaison peut comprendre de 1 à 20 acides aminés de longueur, ce qui englobe 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 acides aminés de longueur. Le peptide de liaison est préférentiellement constitué d'acides aminés Glycine et/ou Sérine. Un exemple illustratif d'un peptide de liaison est le peptide Gly4Ser. Le peptide de liaison peut être un multimère du motif monomère Gly4Ser, par exemple (Gly4Ser)2, (Gly4Ser)3 ou encore (Gly4Ser) .
Les molécules de liaison à l'antigène du type scFv peuvent être préparées par exemple comme décrit par Me Cafferty et al. (1990, Nature, Vol. 348 ; 552-554) ou encore dans la demande PCT n° WO 92/01047.
Dans certains modes de réalisation, la molécule de liaison à l'antigène comprend une structure peptidique sur laquelle est greffée au moins un CDR, ledit CDR étant greffé de manière à préserver tout ou partie des propriétés de reconnaissance de l'antigène cible par le paratope, comme dans l'anticorps parent dont provient ledit CDR.
De préférence, dans ces modes de réalisation d'une molécule de liaison à l'antigène selon l'invention, une ou plusieurs des séquences de CDRs définies dans la présente description sont présentes au sein de la structure peptidique, de manière à reconstituer un squelette peptidique favorisant un repliement des CDRs greffés permettant la conservation des propriétés de reconnaissance de l'antigène cible par le paratope, comme dans l'anticorps parent dont provient ledit CDR.
Comme structures peptidiques utiles pour le greffage de CDRs, on peut citer notamment la fibronectine, préférentiellement le domaine 10 de la fibronectine de type III, la lipocaline, l'anticaline (voir Skerra et al, 2001, J. Biotechnol, Vol. 74(4) : 257-275), la protéine Z provenant du domaine B de la protéine A de Staphylococcus aureus, la thioredoxine A ou encore des protéines comprenant des motifs répétés telle que la protéine répétée ankyrine (« ankyrin repeat » - voir Kohi et al, PNAS, 2003, Vol. 100 (4) : 1700- 1705), les séquences répétées du type « armadillo repeat » retrouvées par exemple dans la β caténine, les séquences répétées riches en leucine (« leucine-rich repeat ») retrouvées par exemple dans la tropomyosine ou la tropomoduline, ou encore les séquences répétées du type « tetratricopeptide repeat » retrouvée par exemple dans la sous-unité p67phox de la NADPH oxydase. On peut aussi citer les structures peptidiques dérivées de toxines ou encore les inhibiteurs protéiques de la « neuronal NO synthase » (PIN). Une illustration de l'utilisation de la PIN comme structure peptidique pour le greffage de CDRs est décrite par Bes et al (2006, Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 343(1) : 334-344). On peut aussi citer le greffage de CDRs sur l'une des boucles de la néocarzinostatine, comme décrit par Nicaize et al (2004, Protein Science, Vol. 13(7) : 1882-1891).
Une molécule de liaison à l'antigène selon l'invention englobe les anticorps chimériques, et le cas échéant aussi les anticorps humanisés.
Les anticorps chimériques sont des anticorps contenant une région variable naturelle (chaîne lourde et chaîne légère) provenant d'un anticorps d'une première espèce donnée, en combinaison avec les régions constantes de la chaîne légère et de la chaîne lourde provenant d'un anticorps d'une seconde espèce, distincte de la première espèce.
Les molécules de liaison à l'antigène selon l'invention, en particulier les anticorps selon l'invention, peuvent être préparées en utilisant les techniques de recombinaison génétique. Par exemple, un anticorps chimérique peut être préparé en clonant un ADN comprenant un promoteur et une séquence codant la région variable d'un anticorps monoclonal non-humain de l'invention, y compris d'un anticorps monoclonal murin de l'invention, et la séquence codant la région constante d'un autre anticorps, par exemple la région constante d'un autre anticorps murin ou bien la région constante d'un autre anticorps humain. Un tel anticorps chimérique selon l'invention peut être par exemple un anticorps chimérique souris-souris ou un anticorps chimérique souris-homme, la spécificité pour une protéine désamidée du gluten étant déterminée par la région variable dudit anticorps chimérique et l'isotype étant déterminé par la région constante dudit anticorps chimérique. Des anticorps chimériques ou humanisés peuvent être préparés selon les techniques décrites par Jones et al. (1986, Nature, Vol. 321 : 522-525) par Verhoeyen et al. (1988, Science, Vol. 239 : 1534-1536) ou encore par Riechmann et al. (1988, Nature, Vol. 322 : 323-327). Des anticorps chimériques ou humanisés peuvent aussi être préparés selon des techniques connues de l'homme du métier telles que celles décrites par Singer et al. (1992, J. Immun., Vol. 150 : 2844-2857), Mountain et al. (1992, Biotechnol. Genêt. Eng. Rev., Vol. 10 : 1- 142) ou encore Bebbington et al. (1992, Biotechnology, Vol. 10 : 169-175). D'autres techniques de préparation d'anticorps par recombinaison génétique pouvant être mises en œuvre selon l'invention, ce qui inclut des techniques de greffage de CDR, sont par exemple celles décrites par dans les documents de brevet suivants : EP 0 451 216, EP 0 682 040, EP 0 939 127, EP 0 566 647, US 5,530,101, US 6,054,297, US 5,886,152 ou encore US 5,877,293.
La présente invention concerne aussi un acide nucléique codant une molécule de liaison à l'antigène telle que définie dans la présente description, et en particulier un anticorps monoclonal tel que défini dans la présente description, ou codant un fragment fonctionnel de celui-ci.
En particulier, l'invention est relative à un acide nucléique codant un polypeptide comprenant un CDR d'une molécule de liaison à l'antigène définie dans la présente description, ledit CDR étant choisi parmi les CDRs ayant une séquence ayant au moins 80 % d'identité en acides aminés avec les CDRs séquencés conformément au protocole de l'exemple 1.
La présente invention concerne aussi un acide nucléique choisi parmi : - un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité avec le polynucléotide de séquence SEQ ID N° 10 codant le VH-CDR1 de séquence SEQ ID N° 2,
- un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité avec le polynucléotide de séquence SEQ ID N° 11 codant le VH-CDR2 de séquence SEQ ID N° 3,
- un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité avec le polynucléotide de séquence SEQ ID N° 12 codant le VH-CDR3 de séquence SEQ ID N° 4,
- un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité avec le polynucléotide de séquence SEQ ID N° 14 codant le VL-CDR1 de séquence SEQ ID N° 6,
- un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité avec le polynucléotide de séquence SEQ ID N° 15 codant le VL-CDR2 de séquence SEQ ID N° 7,
- un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité avec le polynucléotide de séquence SEQ ID N° 16 codant le VL-CDR3 de séquence SEQ ID N° 8.
La présente invention se rapporte aussi à un acide nucléique choisi parmi :
- un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité avec le polynucléotide de séquence SEQ ID N° 9 codant une chaîne lourde de séquence SEQ ID N° 1,
- un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité avec le polynucléotide de séquence SEQ ID N° 13 codant une chaîne légère de séquence SEQ ID N° 5,
La présente invention est relative à un acide nucléique choisi parmi :
- un acide nucléique comprenant le polynucléotide de séquence SEQ ID N° 10 codant le VH-CDR1 de séquence SEQ ID N° 2,
- un acide nucléique comprenant le polynucléotide de séquence SEQ ID N° 1 1 codant le VH-CDR2 de séquence SEQ ID N° 3,
- un acide nucléique comprenant le polynucléotide de séquence SEQ ID N° 12 codant le VH-CDR3 de séquence SEQ ID N° 4,
- un acide nucléique comprenant le polynucléotide de séquence SEQ ID N° 14 codant le VL-CDR1 de séquence SEQ ID N° 6,
- un acide nucléique comprenant le polynucléotide de séquence SEQ ID N° 15 codant le VL-CDR2 de séquence SEQ ID N° 7,
- un acide nucléique comprenant le polynucléotide de séquence SEQ ID N° 16 codant le VL-CDR3 de séquence SEQ ID N° 8. La présente invention se rapporte aussi à un acide nucléique choisi parmi :
- un acide nucléique comprenant le polynucléotide de séquence SEQ ID N° 9 codant la région variable d'une chaîne lourde de séquence SEQ ID N° 1,
- un acide nucléique comprenant le polynucléotide de séquence SEQ ID N° 13 codant la région variable d'une chaîne légère de séquence SEQ ID N° 5,
Au sens de l'invention, les termes « acide nucléique », « séquence nucléique », « polynucléotide » peuvent être utilisés de manière interchangeable pour désigner une séquence de nucléotides, qui peut comprendre des nucléotides modifiés, qui peut être un ADN simple brin, un ADN double brin ou un produit de transcription de ces ADNs.
L'invention concerne aussi des vecteurs comprenant un acide nucléique tel que spécifié dans la présente description.
Les vecteurs comprennent de préférence des éléments permettant l'expression des acides nucléiques de l'invention dans une cellule hôte. Les vecteurs comprennent un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la transcription ainsi que des séquences de régulation de la transcription appropriées. On peut citer par exemple les vecteurs et systèmes d'expression décrits dans le document de brevet EP 0 380 068.
L'invention a aussi trait à un procédé pour la production d'une molécule de liaison à l'antigène telle que définie dans la présente description, en particulier pour la production d'un anticorps monoclonal tel que défini dans la présente description, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
a) cultiver des cellules hôtes aptes à produire une molécule de liaison à l'antigène, b) récupérer les molécules de liaison à l'antigène produites par lesdites cellules hôtes.
Ces techniques sont bien connues de l'homme du métier. A titre illustratif, les cellules hôtes aptes à produire ladite molécule de liaison à l'antigène englobent les cellules de l'hybridome déposé selon le Traité de Budapest à la CNCM le 25 février 2013 sous le numéro d'accès 1-4717 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur de Paris.
L'invention est également relative à des vecteurs de clonage et à des vecteurs d'expression dans lesquels est inséré un acide nucléique codant une molécule de liaison à l'antigène telle que définie dans la présente description, ou un fragment fonctionnel de ladite molécule de liaison à l'antigène.
L'invention concerne aussi des cellules hôtes, par exemple des cellules d'E. coli, qui ont été transfectées avec un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus.
Procédé de préparation d'une molécule de liaison à l'antigène conforme à la présente invention
Une molécule de liaison à l'antigène selon l'invention, et en particulier un anticorps monoclonal selon l'invention peut être obtenue par immunisation d'un mammifère avec un composé immunogène comprenant un peptide approprié.
L'homme du métier connaît de nombreuses méthodes pour immuniser un mammifère en vue de la production d'anticorps dirigés à encontre d'un peptide antigénique d'intérêt.
Dans certains modes de réalisation, on immunise un mammifère non humain, par exemple un rongeur tel qu'une souris, un rat, un cobaye ou un lapin, avec une composition immunogène comprenant un composé immunogène apte à induire la production d'anticorps dirigés à l'encontre d'un peptide d'intérêt.
Dans certains modes de réalisation, le composé immunogène comprend le peptide antigénique d'intérêt qui est lié de manière covalente à une protéine porteuse telle que KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), lequel peut être préparé selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
Dans la composition immunogène, le composé immunogène peut être combiné à une ou plusieurs substance(s) immuno-adjuvante(s), telles que l'adjuvant complet de Freund, l'adjuvant incomplet de Freund, de l'hydroxyde d'aluminium, ou encore un adjuvant présenté sous forme d'une émulsion, comme le SEPPIC. Des substances immuno-adjuvantes bien connues de l'homme du métier sont décrites par exemple par Petrovsky et al. (2004, Immunology and Cell Biology, Vol. 82 : 488-496) ou F. Vogel (1995, A compendium of adjuvants and excipients, Pharm. Biotechnol, Vol. 6 : 141-228).
Dans un mode de réalisation préféré, le peptide antigénique d'intérêt comprend la séquence QPEEPFPE (SEQ ID N° 20), qui peut aussi être désignée « séquence d'épitope ».
Cet épitope est naturellement porté par la gliadine γ et par les gliadines co2, mais pas par les gliadines β et co5, ni par les gluténines de haut poids moléculaire ou de bas poids moléculaire. Dans un autre mode de réalisation préféré, un peptide antigénique d'intérêt particulièrement adapté comprend la séquence LQPEEPFPEQC (SEQ ID N° 26).
Dans un autre mode de réalisation particulièrement préféré, un peptide antigénique d'intérêt adapté pour obtenir une molécule de liaison à l'antigène selon l'invention, et en particulier un anticorps monoclonal selon l'invention, est constitué par la séquence LQPEEPFPEQC (SEQ ID N° 26).
De manière surprenante, les inventeurs ont pu obtenir une molécule de liaison à l'antigène selon l'invention, et en particulier un anticorps monoclonal apte à se lier aux protéines désamidées du gluten et ne présentant pas de réaction croisée avec les protéines non désamidées du gluten, par un protocole d'immunisation plus court que le protocole utilisé classiquement en routine. Dans le protocole classique, au moins 3 immunisations séparées de 3 semaines sont réalisées et les lymphocytes produisant les anticorps sont extraits de la rate d'une souris immunisée.
Dans un protocole particulièrement préféré, 17 jours séparent la première immunisation et la fusion cellulaire visant à immortaliser les lymphocytes sécrétant les anticorps d'intérêt.
Contrairement au protocole classique, les souris sont immunisées dans les pattes et les lymphocytes sont extraits des ganglions poplités. La brièveté du protocole d'immunisation et le fait de prélever les lymphocytes dans des ganglions lymphatiques secondaires plutôt qu'au niveau de la rate (organe lymphatique primaire), après 2 à 3 mois d'immunisation, permet d'obtenir des anticorps couvrant un éventail de réactivité plus large.
En l'occurrence, un tel protocole est tout à fait adapté à produire une molécule de liaison à l'antigène selon l'invention, et en particulier un anticorps monoclonal apte à se lier aux protéines désamidées du gluten et ne présentant pas de réaction croisée avec les protéines non désamidées du gluten.
Procédés et kits de détection
Le demandeur a montré qu'une molécule de liaison à l'antigène selon l'invention, et en particulier un anticorps monoclonal selon l'invention possédait les propriétés suivantes : - ladite molécule de liaison à l'antigène, en particulier ledit anticorps monoclonal, se lie à une protéine désamidée du gluten, et est apte à se lier aux protéines désamidées du gluten, c'est-à-dire aux gliadines a désamidées, aux gliadines β désamidées, aux gliadines γ désamidées, aux gliadines ω2 désamidées, aux gliadines co5 désamidées, aux gluténines de haut poids moléculaire désamidées, et aux gluténines de faible poids moléculaire désamidées,
- ladite molécule de liaison à l'antigène, en particulier ledit anticorps monoclonal, ne présente pas de réaction croisée, au sens de l'invention, avec une protéine non désamidée du gluten,
- ladite molécule de liaison à l'antigène, en particulier ledit anticorps monoclonal, se lie avec une haute affinité à une protéine désamidée du gluten, c'est-à-dire que des complexes entre une molécule de liaison à l'antigène selon l'invention et une protéine désamidée du gluten peuvent être détectés en utilisant une quantité réduite de ladite molécule de liaison à l'antigène, en particulier une quantité réduite d'un anticorps monoclonal de l'invention.
Les propriétés avantageuses ci-dessus d'une molécule de liaison à l'antigène selon l'invention, en particulier d'un anticorps monoclonal selon l'invention, ont permis au demandeur de concevoir des procédés de détection de la présence, dans un échantillon à tester, de gluten désamidé, ou de protéines désamidées du gluten. Plus particulièrement, les propriétés avantageuses de spécificité et d'affinité d'une molécule de liaison à l'antigène selon l'invention, y compris un anticorps monoclonal selon l'invention, ont permis au demandeur de mettre au point des procédés de détection de la présence de protéines désamidées du gluten possédant des caractéristiques de spécificité, de sensibilité et de reproductibilité qui sont compatibles avec un usage industriel, notamment à des fins de détection de protéines désamidées du gluten dans des produits commerciaux destinés à entrer en contact avec le corps humain ou animal, y compris les produits à usage alimentaire et les produits cosmétiques.
En conséquence, la présente invention concerne aussi l'utilisation d'une molécule de liaison à l'antigène telle que définie dans la présente description, notamment un anticorps monoclonal tel que défini dans la présente description, pour la détection in vitro de la présence d'une protéine désamidée du gluten dans un échantillon, plus particulièrement de protéines désamidées du gluten.
Elle est aussi relative à une molécule de liaison à l'antigène telle que définie dans la présente description, pour son utilisation dans une méthode in vitro de détection de la présence de gluten désamidé dans un échantillon, plus particulièrement de protéines désamidées du gluten.
L'invention a aussi trait à un procédé pour détecter la présence d'une protéine désamidée du gluten, en particulier des protéines désamidées du gluten, dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes :
a) fournir un échantillon à tester,
b) mettre en contact ledit échantillon avec une molécule de liaison à l'antigène telle que définie dans la présente description,
c) détecter les complexes éventuellement formés entre ledit échantillon et ladite molécule de liaison à l'antigène.
A l'étape a), on peut utiliser tout type d'échantillon pour lequel est recherchée la présence d'au moins une protéine désamidée du gluten, y compris des produits finis alimentaires ou cosmétiques ou bien les glutens utilisés comme matières premières pour la fabrication de produits finis. Dans certains modes de réalisation, l'échantillon consiste en une suspension aqueuse obtenue à partir du produit brut à analyser. Dans d'autres modes de réalisation, l'échantillon consiste en une solution aqueuse obtenue à partir du produit brut à analyser. Dans encore d'autres modes de réalisation, l'échantillon consiste en une fraction du produit brut à analyser, ladite fraction pouvant être préparée à l'aide de toute technique permettant de séparer plusieurs constituants du produit brut à analyser et ainsi enrichir l'échantillon en protéines, ou même enrichir sélectivement l'échantillon en gluten ou en certaines protéines constitutives du gluten. De telles techniques de séparation sont nombreuses et font partie des connaissances générales de l'homme du métier.
La forte sensibilité du procédé ci-dessus est permise du fait de la bonne affinité de la molécule de liaison à l'antigène pour les protéines désamidées du gluten. C'est la raison pour laquelle le procédé ci-dessus peut être réalisé en utilisant un échantillon de produit fini dans lequel la teneur en gluten est réduite.
Dans certains modes de réalisation du procédé ci-dessus, l'échantillon consiste en un échantillon de gluten qui peut être utilisé comme ingrédient dans la fabrication d'une grande variété de produits, y compris des produits alimentaires et des produits cosmétiques.
Comme cela a déjà été indiqué, une molécule de liaison à l'antigène telle que définie dans la présente description peut être avantageusement utilisée pour détecter la présence de gluten désamidé dans un échantillon, plus particulièrement de protéines désamidées du gluten, à des fins légales ou réglementaires, notamment pour répondre aux exigences actuelles et futures du Codex Alimentarius établi par l'Organisation Mondiale de la Santé.
La mise en œuvre des étapes b) et c) fait partie des connaissances générales de l'homme du métier.
L'étape c) peut être aussi définie comme une étape consistant à détecter la liaison ou la fixation de ladite molécule de liaison à l'antigène sur ledit échantillon.
La fixation de la molécule de liaison à l'antigène sur l'échantillon à tester peut être détectée selon une variété de techniques connues, ce qui inclut notamment les tests de type ELIS A ou RIA ou encore les techniques d'immuno-empreinte (aussi appelées « Western blotting »).
Dans certains modes de réalisation le procédé ci-dessus consiste en test immunologique selon la technique ELIS A bien connue de l'homme du métier.
A titre illustratif, le support sur lequel est immobilisé l'anticorps peut être un matériau insoluble dans l'eau, poreux ou non poreux. Le support peut être hydrophile ou susceptible d'être rendu hydrophile et comprend les poudres inorganiques telles que la silice, le sulfate de magnésium et l'aluminium ; les matériaux polymères naturels, en particulier les matériaux cellulosiques et les matériaux dérivés de la cellulose ; des polymères naturels ou synthétiques tels que la nitro-cellulose, l'acétate de cellulose, le poly (chlorure de vinyle), le polyacrylamide, le dextran réticulé, l'agarose, le polyacrylate, le polyéthylène, le polypropylène, le poly (4-méthylbutène), le polystyrène, le polyméthacrylate, le poly (téréphtalate d'éthylène), le Nylon, le poly (butyrate de vinyle), certains types de verre tels que le Bioglass, ou des céramiques.
La fixation d'un anticorps selon l'invention sur un support peut être réalisée par des techniques bien connues de l'homme du métier. Le support peut se présenter sous des formes diverses, y compris sous forme de bandes ou de particules telles que des billes. La surface du support peut être polyfonctionnelle ou susceptible d'être poly fonctionnalisée de manière à fixer l'anticorps via des interactions covalentes ou non covalentes qui peuvent être spécifiques ou non spécifiques.
A titre illustratif, pour l'immobilisation d'anticorps sur un support, l'homme du métier peut avantageusement se référer au brevet n° US 4, 168, 146 ou encore au brevet n° US 4,347,311. A l'étape c), la détection des complexes formés entre l'échantillon et la molécule de liaison à l'antigène, c'est-à-dire la détection de la fixation de la molécule de liaison à l'antigène sur l'échantillon, peut être réalisée par mesure d'un signal généré par une molécule détectable liée à ladite molécule de liaison à l'antigène. Comme cela est connu, la molécule détectable peut être liée directement, par exemple par liaison covalente, à la molécule de liaison à l'antigène, ou bien la molécule détectable est liée à un ligand se fixant de manière non covalente à la molécule de liaison à l'antigène. Par exemple, ledit ligand peut être du type anticorps marqué avec une molécule détectable, ledit anticorps reconnaissant une région de la molécule de liaison à l'antigène autre que la région de liaison à l'antigène. Typiquement, on utilise à l'étape c) un anticorps marqué reconnaissant une région de la molécule de liaison à l'antigène qui n'est pas impliquée dans la reconnaissance de l'antigène. Dans les modes de réalisation du procédé dans lesquels la molécule de liaison à l'antigène est un anticorps monoclonal, on utilise préférentiellement un ligand se liant sélectivement sur la partie constante dudit anticorps monoclonal. Dans ces modes de réalisation, le ligand est préférentiellement un anticorps, communément appelé « anticorps secondaire », lequel se lie à la partie constante de l'anticorps monoclonal anti-gluten désamidé.
De préférence, dans le mode de réalisation dans lequel l'un des anticorps est immobilisé sur un support, l'autre anticorps est lié de manière covalente à une molécule permettant sa détection directe, ou indirecte.
La molécule détectable peut être isotopique ou non isotopique.
A titre illustratif, mais non limitatif, la molécule détectable peut intervenir dans une réaction catalytique, telle qu'une enzyme, un fragment d'enzyme, un substrat d'enzyme, un inhibiteur d'enzyme, un co-enzyme ou un catalyseur. La molécule détectable peut être également un chromogène, tel qu'un fluorophore, un colorant, une molécule chimiluminescente.
La molécule détectable peut ainsi être une molécule fluorescente telle que les molécules décrites par Ichinose et al. (1991, Fluorometric Analysis in Biomédical Chemistry. New York : Wiley-Interscience) ou encore des dérivés d'isothiocyanate fluorescents, la phycoerithrine, l'isothiocyanate de rhodamine, le chlorure de dansyle ou encore le composé XRITC, la protéine GFP (Green Fluorescent Protein) du poisson Aequorea Victoria et ses nombreux dérivés, ou encore la protéine YFP (Yellow Fluorescent Protein) ainsi que la protéine luciférase.
Parmi les molécules détectables possédant une activité catalytique, les molécules préférées sont les enzymes suivantes, selon la Classification Internationale I. U. B. : (i) les oxydoréductases de classe 1 et (ii) les hydrolases de la classe 3. Les oxydoréductases préférées sont (i) les déhydrogénases de la classe 1.1, plus particulièrement 1.1.1, 1.1.3 et 1.1.99 et (ii) les peroxydases de la classe 1.11 et (iii) des hydrolases de la classe 3.1, et plus particulièrement de la classe 3.1.3 et de la classe 3.2, plus particulièrement 3.2.1. Les déhydrogénases préférées sont la malate déshydrogénase, la glucose-6-phosphate déhydrogénase et la lactate déhydrogénase. L'oxydase préférée est la glucose oxydase. La peroxydase préférée est la peroxydase de raifort (horse radish peroxydase). Les hydrolases préférées sont les phosphatases alcalines, la ss-glucosidase et le lyzozyme.
La molécule détectable peut être également une molécule marquée radioactivement,
3 32 125
par exemple par un isotope choisi parmi [ H], [ P] et [ I].
Dans le mode de réalisation dans lequel la molécule détectable constitue un marqueur indirect, l'un des anticorps constitutifs d'une trousse de détection selon l'invention peut être lié de manière covalente à un ligand telle que la biotine ou la streptavidine.
Dans ce mode de réalisation particulier, la molécule détectable est choisie de manière à ce qu'elle se fixe sur le ligand lié de manière covalente à l'anticorps. La molécule détectable peut par exemple être liée elle-même respectivement à la biotine ou à la streptavidine.
Selon encore un autre mode de réalisation d'une trousse de détection selon l'invention, le moyen de révélation de la formation d'un complexe entre une protéine désamidée du gluten présente dans l'échantillon testé et une molécule de liaison à l'antigène telle que définie dans la présente description, peut être un anticorps, par exemple, dans les modes de réalisation dans lesquels la molécule de liaison à l'antigène est un anticorps monoclonal, un anticorps capable de se lier spécifiquement à la partie Fc de l'anticorps monoclonal ou encore un anticorps capable de se fixer spécifiquement à l'isotype auquel appartient l'anticorps monoclonal anti-protéine désamidée du gluten.
Les molécules détectables englobent les enzymes telles que la peroxydase, la phosphatase alcaline, α D-galactosidase, la glucose oxydase, la glucose amylase, l'anhydrase carbonique, l'acétyl-choline estérase, le lysozyme, la malate déshydrogénase, ou encore la glucose-6- phosphate déshydrogénase. Les molécules détectables englobent aussi la biotine et la digoxigénine, la 5-bromodéoxyuridine. Les molécules détectables englobent aussi les molécules fluorescentes telles que la fluorescéine et ses dérivés, la protéine GFP (pour « Green Fluorescent Protein »), la protéine YFP (pour « Yellow Fluorescent Protein »), ou encore l'umbelliferone. Les molécules détectables englobent aussi les molécules chimiluminescentes telles que le luminol et le dioxetanen les molécules bioluminescentes telles que la luciférase et la luciférine. Les molécules détectables
123 125 126 133 englobent aussi les marqueurs radioactifs tels que l'iode1", l'iode1", l'iode1ZD, l'iode1", le brome77, le technétium99m, l'indium111, le gallium67, le gallium68, le rubenium95, le rubenium97, le rubenium103, le rubenium105, le mercure107, le mercure203, le rhénium99™, le rhénium101, le rhénium105, le scandium47, le fluor18 et l'iode131.
Les méthodes de marquage de composés avec des molécules détectables sont bien connues de l'homme du métier. A titre illustratif, pour le marquage de composés avec des molécules radioactives, l'homme du métier peut se référencer à l'article de Hunter et al. (1962, Nature, Vol. 194 : 495), ou encore aux documents de brevets US 4,424,200 et US 4,479,930.
De manière générale, pour la mise en œuvre de tests de détection immunologiques, l'homme du métier peut avantageusement se référer à l'ouvrage suivant : « Immunoassay », Eds Eleftherios P Diamandis et Théodore K Christopoulos, Académie Press, 1996. En particulier, pour mettre en œuvre des techniques de marquage d'anticorps, l'homme du métier peut se référer au chapitre 6 de l'ouvrage « Immunoassay » précité.
A titre illustratif, les exemples décrivent un mode de réalisation du procédé de détection ci-dessus dans lequel :
- l'étape b) est réalisée par incubation d'un anticorps monoclonal anti-gluten désamidé (molécule de liaison à l'antigène selon l'invention) dans des puits d'une plaque dans lesquels ont été préalablement immobilisées des protéines provenant de l'échantillon à tester, par exemple le gluten constitutif de l'échantillon à tester,
- l'étape c) est réalisée par incubation des puits préalablement soumis à l'étape b) avec un anticorps marqué se liant à la partie constante de la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal anti-gluten désamidé, en l'occurrence un anticorps anti-IgGl marqué à la peroxydase. Dans certains modes de réalisation du procédé de détection ci-dessus, ledit procédé consiste en un test immunologique de type « sandwich » et comprend les étapes suivantes : a) fournir un support solide sur lequel est immobilisée une molécule de liaison à l'antigène telle que définie dans la présente description, par exemple un anticorps monoclonal anti-gluten désamidé,
b) incuber ou mettre en contact ledit support solide avec un échantillon à tester, dans des conditions appropriées pour la fixation de protéines désamidées du gluten sur ladite molécule de liaison préalablement immobilisée sur ledit support,
c) incuber ou mettre en contact le support solide obtenu à la fin de l'étape b) avec une molécule de liaison à l'antigène telle que définie dans la présente description, par exemple un anticorps monoclonal anti-gluten désamidé, et
d) détecter la présence éventuelle de protéines désamidées de gluten liées à ladite molécule de liaison à l'antigène.
La présente invention concerne aussi des procédés de test immunologique dits « compétitifs » bien connus de l'homme du métier, dont le principe repose sur une compétition de liaison à l'anticorps entre (i) les molécules de protéines désamidées du gluten susceptibles d'être présentes dans l'échantillon à analyser et (ii) des molécules leurre, par exemple des peptides mimant des protéines désamidées de gluten. Dans les tests immunologiques compétitifs, la présence de protéines désamidées du gluten induit une inhibition de la liaison de l'anticorps anti-gluten désamidé aux peptides leurre, le niveau d'inhibition de la liaison de l'anticorps aux peptides leurre étant corrélée à la quantité de protéines désamidées du gluten qui est présente dans l'échantillon à tester.
Ainsi, l'invention est également relative à un procédé pour détecter la présence d'une protéine désamidée du gluten, plus particulièrement de protéines désamidées du gluten, dans un échantillon comprenant les étapes suivantes :
a) fournir un échantillon à tester,
b) incuber ledit échantillon avec une molécule de liaison à l'antigène telle que définie dans la présente description, notamment un anticorps monoclonal anti-gluten désamidé, dans des conditions permettant la formation de complexes entre ladite molécule de liaison à l'antigène et une protéine désamidée du gluten, en particulier des protéines désamidées du gluten, afin d'obtenir une solution d'incubation, c) mettre en contact la solution d'incubation obtenue à la fin de l'étape b) avec un support sur lequel est immobilisé un peptide mimant une protéine désamidée du gluten, lequel peut aussi être appelé « peptide leurre », et
d) détecter ou quantifier les complexes éventuellement formés entre (i) ledit peptide mimant une protéine désamidée du gluten qui est immobilisé sur le support et (ii) ladite molécule de liaison à l'antigène présente dans la solution d'incubation obtenue à la fin de l'étape b).
Avantageusement, à l'étape d) du procédé ci-dessus, on mesure un signal généré par la formation des complexes entre (i) ledit peptide mimant une protéine désamidée du gluten qui est immobilisé sur le support et (ii) ladite molécule de liaison à l'antigène présente dans la solution d'incubation obtenue à la fin de l'étape b). La valeur dudit signal est corrélée avec la quantité desdits complexes qui sont formés à la fin de l'étape c). Ainsi, la fixation de molécules de liaison à l'antigène sur les peptides leurre peut être quantifiée à l'étape d) du procédé. La quantité de molécules de liaison à l'antigène qui sont fixées aux peptides leurre à la fin de l'étape d) peut être exprimée en Unités arbitraires représentatives du niveau de fixation, par exemple en valeur d'absorbance de la lumière (test de type ELISA) ou en valeur de radioactivité (test RIA).
Avantageusement, le procédé ci-dessus comprend une étape additionnelle (étape e)) de comparaison de la valeur quantitative obtenue à la fin de l'étape d). La valeur de référence est préférentiellement obtenue par la mise en œuvre du procédé ci-dessus en fournissant à l'étape a) un échantillon dépourvu de protéine désamidée du gluten, ce qui englobe la mise en œuvre du procédé ci-dessus en fournissant à l'étape a) un échantillon contenant au moins une protéine non désamidée du gluten, ledit échantillon ne contenant pas de protéine désamidée du gluten.
Le rapport entre (i) la valeur de quantification mesurée à l'étape d) lorsque le procédé est réalisé avec l'échantillon à tester et (ii) la valeur de référence permet le calcul du pourcentage d'inhibition de la fixation de la molécule de liaison à l'antigène au peptide leurre. Plus la concentration de protéines désamidées du gluten dans l'échantillon à tester est grande, plus le pourcentage d'inhibition de la fixation de la molécule de liaison à l'antigène au peptide leurre est grand.
Dans certains modes de réalisation du procédé, on réalise au préalable le procédé ci- dessus successivement avec une série d'échantillons de référence contenant chacun une concentration connue de protéines désamidées du gluten, afin de générer une courbe étalon des pourcentages d'inhibition. Dans ces modes de réalisation, la quantité de protéines désamidées du gluten présente dans l'échantillon à tester est déterminée sur la courbe étalon, à partir de la valeur quantitative obtenue à la fin de l'étape d) du procédé.
Dans certains modes de réalisation du procédé de détection ci-dessus, le peptide mimant une protéine désamidée du gluten comprend une séquence en acides aminés choisie parmi :
- EPEEPFPQ (SEQ ID N° 17),
- EPQEPFPE (SEQ ID N° 18),
- EPEQPFPE (SEQ ID N° 19),
- QPEEPFPE (SEQ ID N° 20), et
- EPEEPFPE (SEQ ID N° 21).
Dans certains modes de réalisation du procédé de détection ci-dessus, le peptide mimant une protéine désamidée du gluten comprend une séquence en acides aminés LQPEEPFPEQC (SEQ ID N° 22).
L'invention a aussi trait à un kit de détection de la présence de gluten désamidé dans un échantillon, comprenant au moins une molécule de liaison à l'antigène telle que définie dans la présente description, et le cas échéant un réactif ou une pluralité de réactifs nécessaire(s) à la réalisation d'un procédé de détection tel que défini dans la présente description.
Des caractéristiques se rapportant à un kit de détection selon l'invention ont été déjà précédemment décrites en relation avec les procédés de détection de la présence de protéines désamidées du gluten.
Dans certains modes de réalisation du kit de détection, la molécule de liaison à l'antigène, qui peut être un anticorps monoclonal anti-gluten désamidé tel que défini dans la présente description, est immobilisé sur un support, par exemple est immobilisés dans des puits de plaques d'un type approprié pour réaliser des tests immunologiques, par exemple dans des puits de microplaques appropriées pour réaliser des tests immunologiques ELISA ou RIA, bien connues de l'homme du métier. La présente invention fournit donc une molécule de liaison à un antigène dédiée à détecter la présence de protéines désamidées du gluten dans un échantillon provenant d'un produit destiné à l'alimentation humaine ou vétérinaire.
La présente invention fournit aussi une molécule de liaison à un antigène dédiée à détecter la présence d'une pluralité de protéines désamidées du gluten, présentes dans un échantillon provenant d'un produit destiné à l'alimentation humaine ou vétérinaire.
La présente invention fournit aussi une molécule de liaison à un antigène dédiée à détecter la présence d'une pluralité de protéines désamidées du gluten, et susceptibles de posséder des degrés variables de désamidation, présentes dans un échantillon provenant d'un produit destiné à l'alimentation humaine ou vétérinaire.
La présente invention fournit donc une molécule de liaison à un antigène dédiée à détecter la présence d'une très faible quantité d'une pluralité de protéines désamidées du gluten, de nature différente, présentes dans un échantillon provenant d'un produit destiné à l'alimentation humaine ou vétérinaire.
La présente invention est aussi illustrée, sans y être aucunement limitée, par les exemples qui suivent.
EXEMPLES
Exemple 1 : Production d'anticorps monoclonaux selon l'invention
3 souris sont immunisées dans les pattes arrières par injection de 30μ1 d'un mélange (v/v) d'une solution de peptide de séquence SEQ ID N° 20 (QPEEPFPE) conjugué à de la KLH et d'une solution d'adjuvant de marque TitermaxGold. 17 jours après un rappel à lieu dans les mêmes conditions. Enfin, 3 jours plus tard, les souris sont mises à mort et leurs ganglions poplités sont prélevés. Les cellules présentes dans les ganglions sont extraites par perfusion et fusionnées avec des cellules de myélome (lignée NSI).
La sélection des hybridomes se fait ensuite selon les procédés classiques de production d'anticorps. Exemple 2 : Caractérisation de l'anticorps monoclonal PEE 14C7
2.1. Isotypage L'anticorps monoclonal produit par l'hybridome PEE 14C7 (hybridome déposé selon le Traité de Budapest à la CNCM le 25 février 2013 sous le numéro d'accès 1-4717 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur de Paris) a fait l'objet d'un isotypage à l'aide du kit commercialisé par la Société Pierce sous la référence n° 26178, selon les recommandations du fabricant.
Il a été déterminé que l'anticorps monoclonal produit par l'hybridome PEE 14C7 est d'isotype IgGl .
2.2. Séquençage
L'anticorps monoclonal produit par l'hybridome PEE 14C7 a fait l'objet d'un séquençage par la Société GenScript (Piscataway, Etats-Unis). En résumé, on a procédé à une étape d'extraction de l'ARN total des cellules de l'hybridome qui avaient été préalablement congelées. L'ADNc a été synthétisé par amplification des régions codant l'anticorps, et en particulier par amplification des acides nucléiques codant les régions variables des chaînes lourdes et des chaînes légères, par la technique de RT-PCR à partir de l'ARN total. Les ADNc amplifiés codant respectivement les régions variables des chaînes lourdes et des chaînes légères de l'anticorps monoclonal ont été clonés dans des vecteurs séparés. Puis, après criblage des colonies positives, l'ADN a été séquencé. Les séquences en acides aminés et en nucléotides correspondant aux chaînes lourdes et légères, ainsi que les CDRs, sont respectivement indiquées dans les Tableaux 1 et 2 ci-dessous.
Tableau 1 : Séquences en acides aminés des chaînes lourdes et légères et des CDRs correspondants.
Référence Nature de la séquence SEQ ID N°
VH Région variable de chaîne lourde 1
VH-CDR1 Chaîne lourde, CDR1 2
VH-CDR2 Chaîne lourde, CDR2 3
VH-CDR3 Chaîne lourde, CDR3 4
VL Région variable de chaîne légère 5
VL-CDR1 Chaîne légère, CDR1 6
VL-CDR2 Chaîne légère, CDR2 7
VL-CDR3 Chaîne légère, CDR3 8 Tableau 2 : Séquences en nucléotides des chaînes lourdes et légères et des CDRS
correspondants.
Figure imgf000036_0001
Exemple 3 : Spécificité d'un procédé de détection mettant en œuyre une molécule de liaison à l'antigène
3.1. Protocole de test immunologique ELISA non compétitif
Au fond d'une plaque 96 puits à fonds (NUNC, Maxisorb), ΙΟΟμΙ. de protéines à 1 μg/mL dans du tampon carbonate 50 mM pH 9,6 sont incubés toute la nuit à 4°C. Après 3 lavages au PBS-Tween 20 0,05 %, une incubation avec du PBS-lait 2 % (m/v) est effectuée. L'anticorps monoclonal PEE 14C7 (ΙΟΟμΕ de différentes dilutions d'anticorps dans du PBS-lait 0, 1 % (m/v)) est incubé lh à température ambiante. Après lavages au PBS- Tween 20 0,05 %, ΙΟΟμΙ. de l'anticorps secondaire de chèvre anti-IgG de souris couplé à la péroxydase (ref : 170-6516, Bio-Rad) dilué au 1/3000 est incubé lh à température ambiante dans les mêmes conditions que l'anticorps primaire. Après 3 lavages, le substrat OPD (O- phénylènediamine, ref : P-1526, Sigma) est incubé 30 min à l'abri de la lumière. La réaction est stoppée par ajout de 50 μΕ de H2SO4 4N. Les densités optiques sont lues en double longueur d'onde (490 nm pour la mesure de l'hydrolyse du substrat et 630 nm pour éliminer le bruit de fond) au spectromètre de plaque (Bioteck, Elx808-1). 3.2. Spéci ficité vis-à-vis des di fférentes protéines désamidées du gluten
La spécificité de l'anticorps PEE 14C7 a été contrôlé par ELIS A indirect en déposant sur la phase solides différentes protéines purifiées à partir du gluten. Ces protéines ont subi ou non une désamidation chimique (HC1 0.1 N ; 90°C ; lh). Les taux de desamidation de ces produits ont été déterminés par la méthode décrite par Khun et al. (1996) et Gourbeyre et al. (2011) : Les résultats sont présentés dans le Tableau 3 ci-dessous.
Tableau 3
Figure imgf000037_0001
Brièvement, les protéines sont solubilisées à 1 mg/mL en Ethanol à 50 % (protéines natives) ou en carbonate (0.05 M) ; 0.1 % SDS avant d'être diluées à 1 μg/mL en carbonate 0.05 M pour le dépôt en microplaque (1 nuit à 4°C). Tous les puits de la microplaque sont ensuite saturés en PBS-Lait 0.1 % (lh à température ambiante). Le surnageant de culture du clone PEE 14C7 est alors dilué en série et déposés dans les puits de la microplaque. Après lavage en PBS-Tween20 0.05 %, les anticorps monoclonaux qui se sont spécifiquement liés aux protéines déposées dans les puits sont révélés par un anticorps secondaire (Goat anti Mouse IgG ; Biorad ref 170-6516) conjugué à la péroxidase et révélé par de l'Orthophénylène Diamine et la lecture des absorbance à 490 nm.
Les résultats sont présentés sur la Figure 1. Les résultats de la Figure 1 montrent que l'anticorps monoclonal PEE 14C7 reconnaît sélectivement les protéines désamidées de gluten, respectivement la gliadine a désamidée, la gliadine γ désamidée, la gliadine co2 désamidée, la gliadine co5 désamidée et la gluténine de bas poids moléculaire désamidée.
3.3. L 'anticorps PEE 14C7 ne présente pas de réaction croisée avec le gluten non désamidé Les pourcentages de réactivité de l'anticorps vis à vis de chaque protéine sont déterminés comme décrit dans Tranquet et al. (2012). Dans le cas présent les pourcentages sont déterminées à la dilution 1/50 du surnageant de culture (i.e. la plus forte dilution permettant d'obtenir la plus forte absorbance sur la protéine la mieux reconnue - gamma gliadines désamidées). Le pourcentage de reconnaissance d'une protéine X est obtenu en faisant le rapport absorbance Protéine X / Absorbance Gamma gliadines desamidées. Les résultats sont présentés dans le Tableau 4 ci-dessous.
Tableau 4
Figure imgf000038_0001
2.4. Spécificité vis-à-vis de divers glutens désamidés commerciaux
On a testé la spécificité de l'anticorps monoclonal PEE 14C7 et du procédé de détection qui met en œuvre cet anticorps monoclonal, vis-à-vis d'une variété de glutens désamidés commerciaux. On a aussi utilisé un gluten comparatif commercial non désamidé.
Les résultats sont représentés sur la Figure 2. Les résultats de la Figure 2 montrent que l'anticorps monoclonal PEE 14C7 reconnaît sélectivement les glutens désamidés. Exemple 4 : Sensibilité d'un procédé de détection mettant en œuyre une molécule de liaison à l'antigène
Il est avantageux d'utiliser la technique de test « ELISA Compétitif ».
Ce dosage basé sur l'utilisation du peptide LQPEEPFPEQC (SEQ ID N° 22) conjugué à la BSA (100 ng/puits) et du surnageant d'anticorps PEE 14C7 dilué au 1/4000 permet de détecter spécifiquement des gliadines desamidées à une concentration comprise entre 1 et 8 ng/mL.
4.1. Protocole ELISA compétitif :
Le surnageant de culture du clone PEE 14C7 dilué au 1/4000 dans du PBS-Lait 0.1 % est préincubé (lh30 à température ambiante) avec comme compétiteur une gamme de gliadines natives ou désamidées dilués dans du PBS-Lait 0.1 % à différentes concentrations (1.6 ng/mL à 5 μg/mL) puis déposés dans une microplaque préalablement coatée avec de la B S A-LQPEEPFPEQC SEQ ID N° 22 (100 ng/puits - sur la nuit) et saturée en PBS-Lait 4 % (lh à température ambiante). Les lavages, la saturation et la détection des complexes Immuns sont réalisés avec le même protocole que l'ELISA indirect. Le pourcentage d'inhibition est calculé d'après la formule : [1 - ((DO Compétiteur - DO bruit de fond surnageant) / (DO sans Compétiteur positif - DO bruit de fond sérum)) * 100].
4.2. Résultats
Les résultats sont présentés sur la Figure 3. Les résultats de la Figure 3 montrent la haute sensibilité et la haute spécificité d'un procédé de détection de la présence de protéines désamidées de gluten qui met en œuvre l'anticorps PEE 14C7.
Tableau 5 : Séquences des peptides mimant une protéine désamidée du gluten (leurre).
Figure imgf000039_0001
Exemple 5 : Sensibilité de la détection des protéines désamidées du gluten
3 solutions échantillons de gluten désamidé à 1000, 200 et 40 ng/mL diluées dans du PBS (Phosphate Buffer Saline)- lait écrémé 0.1% et une gamme standard de gluten désamidé (1.6 ng/mL à 5 μg/mL) sont dosées en triplicate dans le protocole ELISA compétitif décrit au paragraphe 4.1. Une courbe d'étalonnage corrélant la concentration du standard et le pourcentage d'inhibition est établie et la concentration effective des échantillons préparés à 1000, 200 et 40 ng/mL en est déduite. Cette expérience est réalisée 3 fois à partir des mêmes solutions échantillons de gluten désamidé à 1000, 200 et 40 ng/mL. Tableau 6
Figure imgf000040_0001
Exemple 6 : Absence de réaction croisée avec d'autres céréales
lOOmg de farine de blé, seigle, orge, avoine, blé dur, épeautre, maïs et soja sont mis en suspension dans 1 mL de PB S (Phosphate Buffer Saline) pendant lh à température ambiante. Après centrifugation (10min ; 2500 x g) le surnageant de chaque extraction est collecté. Ces surnageants sont ensuite dilués au 1/10 (dil 10) et au 1/20 (dil 20) dans du PBS-Lait 0.1% puis dosés selon l'ELISA compétitif décrit au paragraphe 4.1.
La Figure 4 montre que pour une dilution au 1/20 d'un extrait de la farine à tester, le pourcentage d'inhibition du Test ELISA compétitif par cet extrait reste en dessous de 15%, c'est-à-dire en dessous du seuil significatif.

Claims

REVENDICATIONS
1. Molécule de liaison à un antigène choisie parmi un anticorps monoclonal et un fragment de liaison à l'antigène dudit anticorps monoclonal, apte à se lier aux protéines désamidées du gluten et ne présentant pas de réaction croisée avec une protéine non désamidée du gluten.
2. Molécule de liaison à un antigène choisie parmi un anticorps monoclonal et un fragment de liaison à l'antigène dudit anticorps monoclonal, apte à se lier à une gliadine désamidée et une gluténine désamidée et ne présentant pas de réaction croisée avec une gliadine non désamidée et une gluténine non désamidée.
3. Molécule de liaison à un antigène selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend :
(a) au moins la région variable d'une chaîne lourde comprenant les trois CDRs suivants :
- VH-CDR1, comprenant une séquence ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N° 2,
- VH-CDR2, comprenant une séquence ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N° 3, et
- VH-CDR3, comprenant une séquence ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N° 4 ; ou
(b) au moins la région variable d'une chaîne légère comprenant les trois CDRs suivants :
- VL-CDR1, comprenant une séquence ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N° 6,
- VL-CDR2, comprenant une séquence ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N° 7, et
- VL-CDR13, comprenant une séquence ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N° 8.
4. Molécule de liaison à l'antigène selon l'une des revendications 1 et 3, caractérisée en ce qu'elle comprend :
(a) au moins la région variable d'une chaîne lourde comprenant les trois CDRs suivants :
- VH-CDR1, comprenant la séquence SEQ ID N° 2,
- VH-CDR2, comprenant la séquence SEQ ID N° 3, et
- VH-CDR3, comprenant la séquence SEQ ID N° 4, et
(b) au moins la région variable d'une chaîne légère comprenant les trois CDRs suivants :
- VL-CDR1 , comprenant la séquence SEQ ID N° 6,
- VL-CDR2, comprenant la séquence SEQ ID N° 7, et
- VL-CDR3, comprenant la séquence SEQ ID N° 8.
5. Molécule de liaison à un antigène selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle se lie à une protéine désamidée du gluten choisie parmi une gliadine désamidée et une gluténine désamidée et ne présente pas de réaction croisée avec une gliadine non désamidée et une gluténine non désamidée.
6. Molécule de liaison à un antigène selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle est produite par l'hybridome déposé selon le Traité de Budapest à la CNCM le 25 février 2013 sous le numéro d'accès 1-4717 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur de Paris.
7. Un complexe formé entre une molécule de liaison à l'antigène selon l'une des revendications 1 à 6 et une protéine désamidée du gluten.
8. Molécule de liaison à l'antigène selon l'une des revendications 1 à 6, pour son utilisation dans une méthode de détection de la présence de protéines désamidées du gluten dans un échantillon.
9. Procédé pour détecter la présence de protéines désamidées du gluten dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes : a) fournir un échantillon à tester,
b) mettre en contact ledit échantillon avec une molécule de liaison à l'antigène selon l'une des revendications 1 à 6,
c) détecter les complexes éventuellement formés entre ledit échantillon et ladite molécule de liaison à l'antigène.
10. Procédé pour détecter la présence de protéines désamidées du gluten dans un échantillon comprenant les étapes suivantes :
a) fournir un échantillon à tester,
b) incuber ledit échantillon avec une molécule de liaison à l'antigène selon l'une des revendications 1 à 6, dans des conditions permettant la formation de complexes entre ladite molécule de liaison à l'antigène et les protéines désamidées du gluten, afin d'obtenir une solution d'incubation,
c) mettre en contact la solution d'incubation obtenue à la fin de l'étape b) avec un support sur lequel est immobilisé un peptide mimant une protéine désamidée du gluten, et d) détecter ou quantifier les complexes éventuellement formés entre (i) ledit peptide mimant une protéine désamidée du gluten qui est immobilisé sur le support et (ii) des molécules de liaison à l'antigène présentes dans la solution d'incubation obtenue à la fin de l'étape b).
11. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le peptide mimant une protéine désamidée du gluten comprend une séquence en acides aminés choisie parmi :
-EPEEPFPQ (SEQ ID N° 17),
-EPQEPFPE (SEQ ID N° 18),
-EPEQPFPE (SEQ ID N° 19),
-QPEEPFPE (SEQ ID N° 20), et
-EPEEPFPE (SEQ ID N° 21).
12. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le peptide mimant une protéine désamidée du gluten comprend une séquence en acides aminés LQPEEPFPEQC (SEQ ID
N° 22).
13. Un kit de détection de la présence de protéines désamidées du gluten dans un échantillon, comprenant au moins une molécule de liaison à l'antigène selon l'une des revendications 1 à 6.
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