ES2377122T3 - Ensayo para detectar feromonas peptídicas natriuréticas auriculares y cerebrales - Google Patents
Ensayo para detectar feromonas peptídicas natriuréticas auriculares y cerebrales Download PDFInfo
- Publication number
- ES2377122T3 ES2377122T3 ES04740371T ES04740371T ES2377122T3 ES 2377122 T3 ES2377122 T3 ES 2377122T3 ES 04740371 T ES04740371 T ES 04740371T ES 04740371 T ES04740371 T ES 04740371T ES 2377122 T3 ES2377122 T3 ES 2377122T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- seq
- antibody
- agent
- sequence
- fragment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 230000001746 atrial effect Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 108020001621 Natriuretic Peptide Proteins 0.000 title claims description 35
- 102000004571 Natriuretic peptide Human genes 0.000 title claims description 35
- 239000000692 natriuretic peptide Substances 0.000 title claims description 35
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 title claims description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title description 15
- 239000003016 pheromone Substances 0.000 title description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 125
- 101800000407 Brain natriuretic peptide 32 Proteins 0.000 claims abstract description 93
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 80
- 102400000667 Brain natriuretic peptide 32 Human genes 0.000 claims abstract description 79
- 101800002247 Brain natriuretic peptide 45 Proteins 0.000 claims abstract description 79
- 101800001288 Atrial natriuretic factor Proteins 0.000 claims abstract description 71
- 101800001890 Atrial natriuretic peptide Proteins 0.000 claims abstract description 71
- NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N carperitide Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N 0.000 claims abstract description 71
- 101710187800 Natriuretic peptides A Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 102100034296 Natriuretic peptides A Human genes 0.000 claims abstract description 54
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 21
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims abstract description 18
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 102100036836 Natriuretic peptides B Human genes 0.000 claims abstract 2
- 101710187802 Natriuretic peptides B Proteins 0.000 claims abstract 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 196
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 142
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 141
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 136
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 127
- 102400001282 Atrial natriuretic peptide Human genes 0.000 claims description 68
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 63
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 53
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 claims description 48
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 48
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 48
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 48
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 42
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 41
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 37
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 36
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 24
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 20
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 18
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 15
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 13
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 13
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 13
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 13
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 9
- 239000002934 diuretic Substances 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 230000001452 natriuretic effect Effects 0.000 claims description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 7
- 108010008064 pro-brain natriuretic peptide (1-76) Proteins 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 4
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 claims description 2
- 102400001263 NT-proBNP Human genes 0.000 claims 5
- 108010080071 Pro-BNP1-108 Proteins 0.000 claims 2
- HPNRHPKXQZSDFX-OAQDCNSJSA-N nesiritide Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CO)C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(O)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 HPNRHPKXQZSDFX-OAQDCNSJSA-N 0.000 abstract description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 2
- 102000002723 Atrial Natriuretic Factor Human genes 0.000 abstract 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 54
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 45
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 34
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 20
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 18
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 18
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 17
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 17
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 16
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 14
- 102100039339 Atrial natriuretic peptide receptor 1 Human genes 0.000 description 13
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 12
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 12
- 101710102163 Atrial natriuretic peptide receptor 1 Proteins 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 11
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 9
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 9
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 9
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 6
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 6
- 102100039341 Atrial natriuretic peptide receptor 2 Human genes 0.000 description 5
- 101710102159 Atrial natriuretic peptide receptor 2 Proteins 0.000 description 5
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- -1 NT-proBNP Chemical compound 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 101500027325 Homo sapiens Atrial natriuretic peptide Proteins 0.000 description 4
- 101000961044 Homo sapiens Atrial natriuretic peptide receptor 1 Proteins 0.000 description 4
- 101500026735 Homo sapiens Brain natriuretic peptide 32 Proteins 0.000 description 4
- 101000780028 Homo sapiens Natriuretic peptides A Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 4
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000928278 Homo sapiens Natriuretic peptides B Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002592 echocardiography Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 3
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 3
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 2
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 2
- 108010001687 Enterotoxin Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000000820 Enterotoxin Receptors Human genes 0.000 description 2
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101500026734 Homo sapiens NT-proBNP Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 206010002906 aortic stenosis Diseases 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 239000007767 bonding agent Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 2
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 238000013198 immunometric assay Methods 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000012716 precipitator Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- YQAXFVHNHSPUPO-RNJOBUHISA-N 2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s,4r)-1-[(2s)-1-(2-aminoacetyl)pyrrolidine-2-carbonyl]-4-hydroxypyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]amino]propanoyl]amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1C[C@@H](O)CN1C(=O)[C@H]1N(C(=O)CN)CCC1 YQAXFVHNHSPUPO-RNJOBUHISA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004476 Acute Coronary Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 108010006835 Atrial Natriuretic Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 101000800130 Bos taurus Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 206010007558 Cardiac failure chronic Diseases 0.000 description 1
- 208000031229 Cardiomyopathies Diseases 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 101100240657 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) swoF gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010013990 Guanylate Cyclase-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000017178 Guanylate Cyclase-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100022662 Guanylyl cyclase C Human genes 0.000 description 1
- 101710198293 Guanylyl cyclase C Proteins 0.000 description 1
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 1
- 206010049694 Left Ventricular Dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 101100536883 Legionella pneumophila subsp. pneumophila (strain Philadelphia 1 / ATCC 33152 / DSM 7513) thi5 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101100240662 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) gtt-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150043338 Nmt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 206010030124 Oedema peripheral Diseases 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- WDVSHHCDHLJJJR-UHFFFAOYSA-N Proflavine Chemical group C1=CC(N)=CC2=NC3=CC(N)=CC=C3C=C21 WDVSHHCDHLJJJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 206010037423 Pulmonary oedema Diseases 0.000 description 1
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N Ser-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 208000001871 Tachycardia Diseases 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 108010082685 antiarrhythmic peptide Proteins 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 1
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005189 cardiac health Effects 0.000 description 1
- 210000004903 cardiac system Anatomy 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- XJMAWYQWPVPKGV-AUOSTSAQSA-N chembl266828 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 XJMAWYQWPVPKGV-AUOSTSAQSA-N 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011976 chest X-ray Methods 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035850 clinical syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 238000002967 competitive immunoassay Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000035487 diastolic blood pressure Effects 0.000 description 1
- 230000003205 diastolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000002565 electrocardiography Methods 0.000 description 1
- 238000011984 electrochemiluminescence immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002602 lanthanoids Chemical class 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- JSOQIZDOEIKRLY-UHFFFAOYSA-N n-propylnitrous amide Chemical compound CCCNN=O JSOQIZDOEIKRLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 238000011422 pharmacological therapy Methods 0.000 description 1
- RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N phenyl 10-methylacridin-10-ium-9-carboxylate Chemical compound C12=CC=CC=C2[N+](C)=C2C=CC=CC2=C1C(=O)OC1=CC=CC=C1 RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940093429 polyethylene glycol 6000 Drugs 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000036316 preload Effects 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 208000005333 pulmonary edema Diseases 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 1
- 208000013220 shortness of breath Diseases 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019980 sodium acid phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010897 surface acoustic wave method Methods 0.000 description 1
- 208000019270 symptomatic heart failure Diseases 0.000 description 1
- 230000006794 tachycardia Effects 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 229960001479 tosylchloramide sodium Drugs 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silicon Chemical compound CC(C)[Si](C(C)C)C(C)C ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/575—Hormones
- G01N2333/58—Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Brain natriuretic peptide [BNP, proBNP]; Cardionatrin; Cardiodilatin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/32—Cardiovascular disorders
- G01N2800/325—Heart failure or cardiac arrest, e.g. cardiomyopathy, congestive heart failure
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Un método in vitro para determinar la activación o inactivación del sistema hormonal del péptido natriurético atrial (ANP) y del péptido natriurético cerebral (BNP), comprendiendo el método detectar en forma simultánea en una sola lectura o resultado la presencia o la cantidad de prohormonas del péptido natriurético atrial y cerebral (proANP y proBNP) o fragmentos de las mismas en una muestra, dicho método comprendiendo: (I) poner en contacto la muestra con una primera sustancia de enlazamiento bi u oligo-específica que es capaz de enlazarse tanto con: (a) (i) proANP (SEQ ID NO: 1) , ANP (SEQ ID NO: 2) o NT-proANP (SEQ ID NO: 3) : (ii) una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i) ; o (iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; y (b) (i) pro-BNP (SEQ ID NO: 4) , BNP (SEQ ID NO: 5) o NT-proBNP (SEQ ID NO: 6); (ii) una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i);o (iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; o (II) poner en contacto la muestra con -un agente que contiene: (a) (i) proANP (SEQ ID NO: 1) , ANP (SEQ ID NO: 2) o NT-proANP (SEQ ID NO: 3) ; (ii) una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i) ; o (iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; y (b) (i) pro-BNP (SEQ ID NO: 4) , BNP (SEQ ID NO: 5) o NT-proBNP (SEQ ID NO: 6) ; (ii) una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i) ;o (iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; y -una primera sustancia de enlazamiento que es capaz de enlazarse con: (a) (i) proANP (SEQ ID NO: 1) , ANP (SEQ ID NO: 2) o NT-proANP (SEQ ID NO: 3) ; (ii) una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i) ; o (iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; y (b) (i) pro-BNP (SEQ ID NO: 4) , BNP (SEQ ID NO. 5) o NT-proBNP (SEQ ID NO: 6) ; (ii) una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i) ; o (iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; y (c) el agente.
Description
Ensayo para detectar feromonas peptídicas natriuréticas auriculares y cerebrales
Campo de técnico de la invención
La invención se relaciona con métodos de ensayo útiles para el diagnóstico y/o el monitoreo del tratamiento de condiciones cardíacas tales como insuficiencia cardíaca y con sustancias para uso en los métodos
Antecedentes de la invención
La insuficiencia cardíaca congestiva (CHF) es un síndrome clínico provocado por una enfermedad cardíaca, caracterizada por falta de aliento y retención anormal de agua y sodio, y que trae como consecuencia edema. Esto se presenta cuando el corazón es incapaz de generar un gasto cardíaco suficiente para satisfacer las demandas del cuerpo sin un marcado incremento de la presión diastólica. Es una consecuencia de una enfermedad cardíaca que perjudica la función sistólica o diastólica ventricular, o ambas. No es una única enfermedad sino la etapa final de muchas formas diferentes de enfermedades del corazón, las más comunes de las cuales son las enfermedades de las arterias coronarias, hipertensión y diabetes (Kannel et al. 1994). La insuficiencia cardíaca se manifiesta por síntomas de pobre perfusión tisular (por ejemplo, fatiga, pobre tolerancia al ejercicio) o congestión de los cauces vasculares (por ejemplo, disnea, edema pulmonar, edema periférico) o ambos. El tratamiento de la insuficiencia cardíaca se dirige en general hacia sus causas subyacentes.
La prevalencia de insuficiencia cardíaca sintomática en la población en general en Europa se estima que es aproximadamente del 0,4 -2%. Como la prevalencia se eleva rápidamente con la edad, se espera que el incremento en las expectativas de vida tenga un mayor impacto sobre la incidencia de la insuficiencia cardíaca en el futuro próximo. La forma asintomática de la disfunción sistólica ventricular izquierda se estima que es tan común como insuficiencia cardíaca congestiva sintomática (McDonagh et al. 1997).
Se ha encontrado que los parámetros actuales de la rutina clínica e investigativa utilizados para el diagnóstico de insuficiencia cardíaca (examen clínico, electrocardiografía, rayos X de tórax) son inadecuados debido a que el diagnóstico causa resultados que son falsos positivos (Remes et al. 1991). La ecocardiografía proporciona información específica sobre el diagnóstico y pronóstico, pero no es particularmente adecuada para selección o para diagnósticos rápidos en el punto de atención. Por lo tanto, existe la necesidad por nuevas pruebas de diagnóstico para fallo cardíaco.
Una cantidad de estudios han demostrado la utilidad de la medición de los péptidos individuales derivados de la prohormona del péptido natriurético atrial (proANP) y la prohormona del péptido natriurético cerebral (proBNP) en el diagnóstico de insuficiencia cardíaca (Talwar et al 2000; De Lemos et al 2001; Daly et al 2002). El fallo cardíaco está asociado con niveles circulantes elevados de péptido natriurético atrial (ANP), péptido natriurético cerebral (BNP), un fragmento del terminal N de proANP (NTproANP) y un fragmento del terminal N de proBNP (NT-proBNP) (Sagnella 1998). Altas concentraciones en plasma están correlacionados con un pronóstico pobre después de infarto de miocardio e insuficiencia cardíaca (Omland et al 2002). Además, el monitoreo de los niveles en plasma de NTproBNP parece ofrecer una orientación más poderosa en la terapia de insuficiencia cardíaca que el seguido por parámetros clínicos convencionales (Troughton et al 2000).
Sin embargo los métodos de diagnóstico del estado del arte, tal como aquellos divulgados en WO 87/06938, WO 00/35951, WO 91/00292, US 5.786.163, EP 648 228 B1, WO 00/45176, WO 00/19207, US 6.124.430, EP 542 255 B1) o aquellos comercialmente disponibles, únicamente pretenden medir, y únicamente son capaces de medir, un solo péptido (ANP, BNP, NT-proANP o NT-proBNP) a la vez. Por ejemplo, el estado del arte divulga el uso del receptor del receptor del ANP o el receptor de NPRA (GC-A) en ensayos para determinar péptidos natriuréticos, pero no divulga ninguna determinación simultánea de péptidos natriuréticos. La patente de los Estados Unidos Número 5.747.274 divulga la detección simultánea de al menos tres marcadores cardíacos utilizando al menos tres pares diferentes de anticuerpos monoclonales o policlonales, cada uno específico para un marcador diferente. Por consiguiente, estos ensayos producen múltiples resultados. Por lo tanto, subsiste en el estado del arte la necesidad por un medio confiable y sensible pero relativamente económico y sencillo para detectar o diagnosticar fallo cardíaco tal como insuficiencia cardíaca.
US-A-6117644 describe un método para diagnosticar rechazo de un trasplante cardíaco en un paciente que comprende determinar el nivel de BNP o un fragmento del mismo en una muestra de fluido corporal del paciente.
Nishikimi et al (JACC 1995; 26: 1424 -31) describe la medición de los niveles en plasma de adrenomedulina en pacientes con insuficiencia cardíaca para investigar el papel de la adrenomedulina en la fisiopatología de la insuficiencia cardíaca.
Qi et al (American Heart Journal 2001; 142: 725 -732) describe un estudio que evalúa el BNP y el ANP circulante y la parte del terminal N de sus pro-péptidos como marcadores de hipotrofia ventricular izquierda y el incremento de presión atrial en pacientes con estenosis aórtica.
Ruskoaho (Endocrine Reviews 2003; 24(3): 341 -356) revisa hormonas cardiacas como herramientas de diagnóstico en insuficiencia cardíaca.
Por lo tanto la presente invención proporciona un método de análisis que detecta la activación o inactivación de los sistemas hormonales del ANP o del BNP mediante el análisis tanto para péptidos derivados de proANP como de proBNP en forma simultánea. Tanto los péptidos derivados de proANP como de proBNP pueden ser analizados en la misma muestra, al mismo tiempo. El método produce un solo resultado y se realiza de manera similar que los métodos del estado del arte. Además los presentes métodos de análisis muestran mayor sensibilidad que los métodos del estado del arte. Aún más, la presente prueba tiene una gran capacidad para producir un resultado confiable del análisis ya sea que el paciente esté en una fase temprana o en una fase tardía de insuficiencia cardíaca. La fórmula única del ensayo de la presente invención, llevada a cabo de por sí en forma simultánea, ofrece una alternativa más económica y rentable para los análisis disponibles permitiendo así una mediación confiable de activación o inactivación tanto de los sistemas hormonales del ANP y del BNP.
Resumen de la invención
Por lo tanto la presente invención proporciona un método in vitro para determinar la activación o inactivación del sistema hormonal del péptido natriurético atrial (ANP) y del péptido natriurético cerebral (BNP), comprendiendo el método detectar en forma simultánea en una sola lectura o resultado la presencia o la cantidad de prohormonas del péptido natriurético atrial y cerebral (proANP y proBNP) o fragmentos de las mismas en una muestra.
La invención también provee:
- -
- un agente que comprende:
- (a)
- (i)
- proANP (SEQ ID NO. 1), ANP (SEQ ID NO. 2) o NT-proANP (SEQ ID NO. 3);
- (ii)
- una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i); o
(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud;
y
- (b)
- (i)
- pro-BNP (SEQ ID NO. 4), BNP. (SEQ ID NO. 5), NT-proBNP (SEQ ID NO. 6);
- (ii)
- una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i); o
(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud;
-un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica al agente, o secuencia complementaria:
-un vector de expresión y una célula huésped que incluyen al polinucleótido;
-un proceso para producir al agente polipeptídico que comprende:
- (a)
- cultivar la célula huésped bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido; y opcionalmente
- (b)
- recuperar al polipéptido expresado; -un método para identificar una sustancia que se enlaza específicamente con
- (a)
- (i)
- proANP (SEQ ID NO. 1), ANP (SEQ ID NO. 2) o NT-proANP (SEQ ID NO. 3);
- (ii)
- una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i); o
(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud y
- (b)
- (i)
- pro-BNP (SEQ ID NO. 4), BNP (SEQ ID NO. 5), NT-proBNP (SEQ ID NO. 6);
- (ii)
- una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i); o
(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud cuyo método comprende:
- (A)
- poner en contacto una sustancia candidata con (a) y (b) bajo condiciones que permitan el enlazamiento específico; y
- (B)
- determinar si la sustancia candidata se enlaza con (a) y (b); -un anticuerpo, fragmento o derivado del mismo que es capaz de enlazarse con ambos:
- (a)
- (i)
- proANP (SEQ ID NO. 1), ANP (SEQ ID NO. 2) o NT-proANP (SEQ ID NO. 3);
- (ii)
- una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i); o
(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; y
- (b)
- (i)
- pro-BNP (SEQ ID NO. 4), BNP (SEQ ID NO. 5) o NT-proBNP (SEQ ID NO. 6);
- (ii)
- una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i); o
(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud
-un proceso para elaboración del anticuerpo;
-un soporte sólido que contiene al anticuerpo.
La invención provee además métodos para diagnosticar insuficiencia cardíaca y/o monitorear el tratamiento de
insuficiencia cardíaca y un kit de diagnóstico para uso en tales métodos.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Purificación por medio de HPLC en fase reversa de una nueva proteína o agente peptídico de la invención.
Figura 2a: Una curva de enlazamiento competitivo para el inmunoensayo de NT-proXNP.
Figura 2b: Desarrollo de títulos de anticuerpo en inmunización de una cabra utilizando una proteína de fusión de
GST de NT-proXNP2 como inmunógeno.
Figura 3: Niveles en suero de NT-proANP, NT-proBNP y NT-proXNP en pacientes con trastornos cardíacos.
Figura 4: Niveles en suero de NT-proANP, NT-proBNP y NT-proXNP en pacientes cardíacos.
Figura 5: Response de NT-proANP, NT-proBNP y NT-proXNP en plasma y rendimiento cardíaco (CO) en pacientes
de insuficiencia cardíaca a la terapia. Breve descripción de las secuencias SEQ ID NO: 1 secuencia de aminoácidos de proANP humano SEQ ID NO: 2 secuencia de aminoácidos de ANP humano SEQ ID NO: 3 secuencia de aminoácidos de NT-proANP humano SEQ ID NO: 4 secuencia de aminoácidos de proBNP humano SEQ ID NO: 5 secuencia de aminoácidos de BNP humano SEQ ID NO: 6 secuencia de aminoácidos de NT-proBNP humano SEQ ID NO: 7 secuencia de nucleótidos que codifica proANP humano SEQ ID NO: 8 secuencia de nucleótidos que codifica ANP humano SEQ ID NO: 9 secuencia de nucleótidos que codifica NT-proANP humano SEQ ID NO: 10 secuencia de nucleótidos que codifica proBNP humano SEQ ID NO: 11 secuencia de nucleótidos que codifica BNP humano SEQ ID NO: 12 secuencia de nucleótidos que codifica NT-proBNP humano SEQ ID NO: 13 secuencia de aminoácidos de un agente de acuerdo con la invención NT-proXNP1 SEQ ID NO: 14 secuencia de aminoácidos de un agente de acuerdo con la invención NT-proXNP2 SEQ ID NO: 15 secuencia de aminoácidos de un agente de acuerdo con la invención NT-proXNP3 SEQ ID NO: 16 secuencia espaciadora de aminoácidos SEQ ID NO: 17 secuencia de aminoácidos de un agente de acuerdo con la invención NT-proXNP4 SEQ ID NO: 18 secuencia de aminoácidos de un agente de acuerdo con la invención NT-proXNP5 SEQ ID NO: 19 secuencia de aminoácidos de un agente de acuerdo con la invención proXNP6 SEQ ID NO: 20: secuencia de aminoácidos de un agente de acuerdo con la invención XNP7 SEQ ID NO: 21 secuencia de nucleótidos que codifica NT-proXNP1 SEQ ID NO: 22 secuencia de nucleótidos que codifica NT-proXNP2 SEQ ID NO: 23 secuencia de nucleótidos que codifica NT-proXNP3 SEQ ID NO: 24 secuencia de nucleótidos que codifica NT-proXNP4 SEQ ID NO: 25 secuencia de nucleótidos que codifica NT-proXNP5 SEQ ID NO: 26 secuencia de nucleótidos que codifica proXNP6 SEQ ID NO: 27 secuencia de nucleótidos que codifica XNP7 SEQ ID NO: 28 secuencia del iniciador SEQ ID NO: 29 secuencia del iniciador SEQ ID NO: 30 secuencia del iniciador SEQ ID NO: 31 secuencia del iniciador SEQ ID NO: 32 secuencia del iniciador SEQ ID NO: 33 secuencia de aminoácidos del receptor de GC-A humano SEQ ID NO: 34 secuencia de aminoácidos del dominio extracelular del receptor de GC-A humano SEQ ID NO: 35 secuencia de aminoácidos del receptor de GC-B SEQ ID NO: 36 secuencia de aminoácidos del receptor de GC-C Descripción detallada de la invención La presente invención se relaciona con un nuevo método de ensayo que es útil para diagnosticar y/o monitorear el
tratamiento de una enfermedad cardíaca, en particular insuficiencia cardíaca y con componentes y kits para uso en
el método. El método permite la detección de la activación o inactivación del sistema hormonal del péptido
natriurético atrial (ANP) y el péptido natriurético cerebral (BNP) en un individuo en forma simultánea. Se utiliza un
método único de análisis. En general el método analiza en forma simultánea la presencia y/o la cantidad de péptidos
derivados de prohormonas de péptidos natriuréticos de tipo A y B en una muestra biológica adecuada.
Términos y abreviaturas
proANP es una prohormona de péptido natriurético atrial;
proANP se procesa por medio de la escisión del fragmento del terminal N dentro del péptido natriurético atrial
maduro (ANP). proANP humano tiene 126 aminoácidos (proANP1-126) SEQ ID NO: 1 NPMYNAVSNA DLMDFKNLLD HLEEKMPLED EVVPPQVLSE PNEEAGAALS PLPEVPPWTG EVSPAQRDGG
ALGRGPWDSS DRSALLKSKL RALLTAPRSL RRSSCFGGRM DRIGAQSGLG CNSFRY ANP es un péptido natriurético atrial ANP humano está formado por los aminoácidos 99 a 126 de la prohormona (proANP99-126) SEQ ID NO: 2 SLRRSSCFGG RMDRIGAQSG LGCNSFRY NT-proANP es el fragmento del terminal N de proANP El fragmento del terminal N de proANP humano está formado por los aminoácidos 1 a 98 (proANP1-98) SEQ ID NO: 3 NPMYNAVSNA DLMDFKNLLD HLEEKMPLED EVVPPQVLSE PNEEAGAALS PLPEVPPWTG EVSPAQRDGG
ALGRGPWDSS DRSALLKSKL RALLTAPR proBNP es la prohormona del péptido natriurético cerebral, proBNP se procesa por medio de la escisión del fragmento del terminal N dentro del péptido natriurético cerebral
maduro (BNP). proBNP humano tiene 108 aminoácidos (proBNP1-108) SEQ ID NO: 4 HPLGSPGSAS DLETSGLQEQ RNHLQGKLSE LQVEQTSLEP LQESPRPTGV WKSREVATEG IRGHRKMVLY
TLRAPRSPKM VQGSGCFGRK MDRISSSSGL GCKVLRRH BNP es un péptido natriurético cerebral BNP humano está formado por los aminoácidos 77 a 108 de la prohormona (proBNP77-108) SEQ ID NO: 5 SPKMVQGSGC FGRKMDRISS SSGLGCKVLR RH NT-proBNP es el fragmento del terminal N de proBNP El fragmento del terminal N de proBNP humano está formado por los aminoácidos 1 a 76 (proBNP1-76) SEQ ID NO: 6 HPLGSPGSAS DLETSGLQEQ RNHLQGKLSE LQVEQTSLEP LQESPRPTGV WKSREVATEG IRGHRICMVLY
TLRAPR
proXNP es un agente de la invención que comprende la secuencia de aminoácidos derivada u originada a partir tanto de proANP como de proBNP XNP es un agente de la invención que comprende la secuencia de aminoácidos derivada u originada a partir tanto
de ANP como de BNP
NT-proXNP es un agente de la invención que comprende la secuencia de aminoácidos derivada u originada a partir
tanto de NT-proANP como de NT-proBNP
NT-proXNP1 es un agente de la invención formado a partir de proBNP15-24 y proANP82-96
NT-proXNP2 es un agente de la invención formado a partir de proBNP1-37 y proANP29-98
NT-proXNP3 es un agente de la invención formado a partir de proBNP10-29 y proANP20-80
NT-proXNP4 es un agente de la invención formado a partir de proBNP1-76 y proANP1-98
NT-proXNP5 es un agente de la invención formado a partir de proBNP10-29 y proANP60-80
proXNP6 es un agente de la invención formado a partir de proBNP1-108 o una subsecuencia del mismo y proANP1
126 o una subsecuencia del mismo XNP7 es un agente de la invención formado a partir de proBNP77-92 o una subsecuencia del mismo y proANP112-126
o una subsecuencia del mismo.
Variantes de polipéptidos
Se hace referencia aquí a variantes de polipéptidos. Por ejemplo, se hace referencia a variantes de proANP, ANP, NT-proANP, proBNP, BNP y NT-proBNP, en la descripción de sustancias y agentes de enlazamiento de la invención. Se hace referencia también a variantes de los polipéptidos receptores de GC-A, GC-B y GC-C.
El término "variante" se refiere a un polipéptido que tiene el mismo carácter esencial o una funcionalidad biológica básica que el polipéptido relevante. De este modo una variante es típicamente capaz de complementar una o más actividades de ese polipéptido. Típicamente una variante incluye una secuencia de aminoácidos que es homóloga a toda o a una parte de la secuencia del polipéptido. En general una variante (homóloga) tiene una secuencia de
5 aminoácidos con más del 70% de identidad, preferiblemente al menos 75% u 80% o al menos 90% y particularmente preferiblemente al menos 95%, al menos 97% o al menos 99% de identidad con la secuencia dada, por ejemplo sobre una región de al menos 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90,100, 200, 300, 400 o más aminoácidos contiguos. Las variantes pueden incluir variantes alélicas, especies homólogas y la supresión, modificación o adición de aminoácidos individuales o grupos de aminoácidos dentro de la secuencia de la proteína, siempre que el péptido mantenga una funcionalidad biológica básica del polipéptido objetivo.
Una variante alélica será una variante que se presentará en forma natural, por ejemplo, en un humano, y que funcionará en una forma sustancialmente similar a la del polipéptido relevante. En forma similar, un homólogo de la especie de una proteína será la proteína equivalente que se presenta naturalmente en otra especie y que retiene una función biológica básica del polipéptido dado. Por lo tanto, por ejemplo, una variante de un polipéptido nativo o
15 de origen natural, tal como aquellos que pueden ser detectados en una muestra biológica, puede ser una variante alélica o un homólogo de la especie de otro polipéptido conocido.
Las variantes alélicas y los homólogos de la especie pueden ser obtenidos, por ejemplo, por medio del sondeo de una biblioteca elaborada a partir de células de la especie apropiada utilizando una sonda adecuada, para obtener clones que codifican las variantes alélicas o de la especie. Los clones pueden ser manipulados por medio de técnicas convencionales para generar un polipéptido que puede ser producido por medio de técnicas sintéticas o recombinantes ya conocidas.
Las variantes pueden incluir polipéptidos que sean de mayor longitud que el polipéptido relevante. Una variante puede incluir o consistir de al menos 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, aminoácidos hasta por ejemplo 500, 1000 o 2000 aminoácidos.
25 Una variante puede ser una proteína de fusión.
Las variantes pueden incluir sustituciones de aminoácidos, por ejemplo de 1, 2 ó 3 hasta 10, 20 ó 30 (ó 10, 20, 30 ó 40 hasta 50, 60 ó 70) sustituciones. El polipéptido modificado generalmente retiene la habilidad para complementar una o más de las actividades de y/o la actividad antigénica del polipéptido objetivo. Pueden hacerse sustituciones conservadoras, por ejemplo de acuerdo con la siguiente tabla. Los aminoácidos en el mismo bloque de la segunda columna y preferiblemente en la misma línea en la tercera columna pueden ser sustituidos entre sí.
- ALIF�?TICO
- No polar GAP
- ILV
- Polar no cargado
- CSTM
- NQ
- Polar cargado
- DE
- KR
- AROM�?TICO
- HFWY
Las secuencias más cortas de polipéptidos o fragmentos están dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, un péptido de al menos 6, 10, 12, 15, 17, 20, 25 aminoácidos o hasta 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 200, 300, 400 ó 500 aminoácidos de longitud (dependiendo del tamaño del polipéptido objetivo) se considera que cae dentro del alcance
35 de la invención siempre que demuestre una funcionalidad biológica básica del polipéptido objetivo. En particular, pero no exclusivamente, este aspecto de la invención abarca la situación en la cual cuando la proteína es un fragmento de la secuencia completa de la proteína y puede representar un sitio de enlazamiento por otra molécula o entidad, tal como una región de enlazamiento del péptido, o un epítopo. Tales fragmentos pueden o no retener otras funciones del polipéptido objetivo.
Las variantes de polipéptidos como las mencionadas aquí generalmente retienen una funcionalidad biológica básica del polipéptido relevante. La variante puede retener una o más de las actividades biológicas nativas o funciones del polipéptido objetivo.
En particular, una variante como la mencionada aquí generalmente retiene una o más de las características de enlazamiento del polipéptido relevante. Alternativa o adicionalmente, la variante puede retener una actividad
45 antigénica del polipéptido.
En una modalidad una variante exhibe al menos una de las propiedades de enlazamiento o de reconocimiento del polipéptido objetivo. En particular una variante puede ser capaz de enlazarse con un producto que puede enlazarse con el polipéptido por ejemplo un ligando, un receptor o un anticuerpo. De este modo, por ejemplo, una variante de ANP o BNP puede ser capaz de enlazarse con el receptor de GC-A. En forma similar, una variante del receptor de GC-A o GC-B puede enlazar ANP o BNP. Típicamente una variante enlaza al producto con una afinidad que es al menos del 60%, tal como al menos 70, 80 ó 90%, por ejemplo 95, 97 ó 99% de la afinidad con lo cual el polipéptido relevante se enlaza con el producto. Los ensayos adecuados de enlazamiento son conocidos en el arte.
Las variantes que tienen una actividad particular o característica de enlazamiento del polipéptido dado pueden ser identificadas con base en tales actividades o características, por ejemplo a partir de una biblioteca de polipéptidos.
En una modalidad adicional una variante de polipéptido puede retener las propiedades antigénicas del polipéptido objetivo. Tal variante puede, por ejemplo, ser capaz de generar una respuesta inmune en un individuo. La respuesta inmune puede ser mediada por un anticuerpo y/o célula, tal como mediada por una célula T. De este modo una variante puede ser capaz de elevar los anticuerpos que sean específicos para y enlazarse con el polipéptido objetivo. Un péptido para generar una respuesta inmune puede ser identificado por medio de estudios de inmunización, típicamente en un modelo animal. Por ejemplo, un péptido candidato puede ser administrado a un animal y después se puede determinar la respuesta del anticuerpo o célula T generada que es específica para el péptido. El antisuero generado después de la administración de un péptido a un animal puede ser evaluado por la capacidad para enlazar al péptido o para enlazar al polipéptido objetivo.
Una variante que tiene al menos una de las características de enlazamiento de un polipéptido dado puede incluir al menos una región de enlazamiento del polipéptido. Tal región de enlazamiento media en general el enlazamiento del polipéptido con otro producto tal como un receptor o un anticuerpo. La región de enlazamiento puede ser externa o interna al polipéptido dado. Por lo tanto una variante puede incluir un sitio de enlazamiento, epítopo o fragmento antigénico del polipéptido relevante. Preferiblemente la región de enlazamiento en la variante retiene la conformación que tiene en el polipéptido relevante. En un aspecto las variantes son fragmentos. Por ejemplo los fragmentos pueden ser de al menos 6 aminoácidos de longitud, preferiblemente al menos 10, tal como al menos 12 ó 15 o hasta 20, 30 ó 40 aminoácidos. Se pueden utilizar también fragmentos mayores tal como hasta de 60, 90, 100 ó 200 aminoácidos. Tales fragmentos pueden de otra manera no demostrar una función o actividad celular del polipéptido objetivo.
ANP y BNP
Los péptidos natriuréticos cardíacos ANP y BNP y los fragmentos del terminal N (NT-proANP y NT-proBNP) de prohormonas del péptido natriurético tipo A y tipo B (proANP y proBNP) son liberados a la circulación cuando el corazón es sometido a sobrecarga de presión o de volumen. Su función es disminuir la carga y proteger el corazón. A pesar del hecho de que el corazón produce dos distintos péptidos natriuréticos biológicamente activos (ANP y BNP), cada uno derivado de su propio gen y regulado en forma diferente, sus efectos biológicos son mediados por las células objetivo por medio de un solo receptor, GC-A (NPRA) (Drewett et al. 1994). La activación de ambos sistemas hormonales ANP y BNP se refiere al favorecimiento de la expresión tanto de los genes de ANP como de BNP o la producción o incremento en concentraciones en plasma, mientras que la inactivación de ambos sistemas de ANP y BNP se refiere a la reducción de la expresión de los genes tanto para ANP como para BNP o la producción o disminuye en la concentración en plasma.
En la sobrecarga del volumen y la presión cardíaca, la expresión del gen para el ANP y los niveles circulantes de ANP y NT-proANP son principalmente inducidos por la precarga incrementada del corazón, mientras que la expresión del gen para BNP y los niveles circulantes de BNP y NT-proBNP son principalmente sensibles a un incremento de la poscarga (Yoshimura et al. 1993; Yasue et al. 1994). Además, los genes para ANP y BNP son regulados en forma diferencial en las diferentes cámaras del corazón (Dzimiri et al. 2002). Los niveles elevados en plasma de ANP o NT-proANP están asociados con sobrecarga atrial por ejemplo taquicardia, mientras que BNP y NT-proBNP son mejores marcadores de sobrecarga ventricular por ejemplo estenosis aórtica. Los niveles circulantes marcadamente elevados tanto de ANP como de BNP (y NT-proANP y NT-proBNP) sugieren una sobrecarga atrial y ventricular combinada, como en cardiomiopatía combinada. De este modo, en situaciones fisiológicas y fisiopatológicas la información mediada por ANP y BNP converge en la membrana celular objetivo para provocar una cascada de señalización intracelular común. Como ya se mencionó, los análisis existentes miden uno de los analitos a la vez (ANP, BNP, NT-proANP o NT-proBNP). Debido a que una mayor intensidad de los péptidos natriuréticos en el diagnóstico de enfermedades cardíacas recae en el alto valor predictivo negativo, el ensayo de combinación de ANP y BNP (o NT-proANP y NT-proBNP) en la presente invención añadirá valor sobre aquel suministrado mediante el análisis de cualquiera de los analitos solos. El análisis secuencial de ANP y BNP (o NT-proANP y NT-proBNP) sería innecesariamente complejo, incluido un doble esfuerzo para el control de calidad, y no es rentable.
La presente invención provee nuevos métodos de diagnóstico y uso de los mismos que, por imitación del sistema regulador fisiológico que actúa en el organismo, puede combinar la información obtenida a partir de la activación o inactivación, respectivamente, de los sistemas hormonales del ANP y del BNP por un medio simple de medición simultánea de una concentración proporcionalmente acumulativa de péptidos derivados tanto de prohormonas del péptido natriurético tipo A como del tipo B.
Métodos de análisis
La invención provee un método nuevo y sensible adecuado para diagnosticar y evaluar condiciones cardíacas tales como insuficiencia cardíaca, que determina la activación o inactivación de los sistemas hormonales ANP y BNP. El método de la invención se enfoca en la detección o el monitoreo de los niveles combinados de proANP, proBNP y fragmentos de los mismos en una muestra biológica adecuada. De acuerdo con el método, los péptidos derivados de u originados a partir tanto de proANP como de proBNP se analizan al mismo tiempo en una muestra dada. En una modalidad se puede utilizar el método ya sea para propósitos de diagnóstico o para monitoreo del tratamiento.
Los péptidos derivados de proANP y proBNP incluyen NT-proANP, ANP, NT-proBNP, BNP así como proANP y proBNP. La muestra puede contener otros péptidos derivados también de las prohormonas por ejemplo por proteólisis. Por ejemplo, otros péptidos pueden incluir proANP1-30, proANP31-67 o proANP79-98. Por lo tanto, en una modalidad, cualquier combinación de proANP, NT-proANP, ANP, proBNP, NT-proBNP y BNP, y opcionalmente otros péptidos derivados, puede ser analizada en el método. En una modalidad la muestra puede contener péptidos derivados de proANP sin péptidos derivados de proBNP o vice versa.
Ya que los péptidos se detectan simultáneamente, únicamente se requiere una sola lectura o resultado. El método es adecuado para evaluar el riesgo y detectar fallo cardíaco tal como insuficiencia cardíaca, y para evaluar tratamientos para insuficiencia cardíaca. Como tal es más sensible, económico y simple de llevar a cabo que los métodos del estado del arte.
Los péptidos analizados en la invención están presentes en niveles normales de referencia en la población general. La activación de los sistemas ANP y BNP se puede considerar que se presenta cuando el nivel combinado de péptidos es mayor que su nivel de referencia normal. Por lo tanto, en cualquier formato particular de análisis, si el resultado indica un nivel cualitativamente o cuantitativamente superior de péptidos que el nivel de referencia, está implícita la activación del sistema. Por ejemplo, se puede calibrar un análisis por ejemplo utilizando un agente de la invención, de modo que se sabe que una lectura particular en el análisis representa el nivel normal de péptidos. O el análisis puede ser de tal manera que un nivel normal o de referencia del péptido producirá un resultado despreciable
o insignificante.
La inactivación de los sistemas ANP y BNP, por ejemplo después de insuficiencia cardíaca quizás en respuesta a un tratamiento médico, se presenta cuando el nivel combinado de péptidos cae del nivel elevado asociado con el incidente cardíaco anterior. Por medio de la realización de análisis seriales será posible detectar una disminución cualitativa o cuantitativa en los niveles de péptidos. Será posible determinar también la tasa de disminución y para evaluar la efectividad de un tratamiento dado.
Los métodos presentes son capaces de detectar simultáneamente tanto los péptidos derivados de proANP como de proBNP. El cambio real en el nivel individual de péptidos puede ser por ejemplo A+ y B+, A+ y B-, A-y B+, o A-y B(donde A representa los niveles de péptidos derivados de proANP y B representa los niveles de péptidos derivados de proBNP).
Los presentes métodos de análisis pueden ser cualitativos o cuantitativos. Por ejemplo, un análisis cuantitativo es posible cuando se utiliza un agente de la invención como antígeno que compite en un ensayo de competición.
En general, el método presente comprende poner en contacto una muestra con una primera sustancia de enlazamiento que es capaz de enlazar tanto péptidos derivados de proANP como de proBNP bajo condiciones que permitan que ocurra tal enlazamiento. Se detectan luego cualquiera de los complejos de enlazamiento formados entre la primera sustancia de enlazamiento y tales péptidos. Los medios de detección adecuados son conocidos en el arte y se describen con más detalle más adelante.
Los péptidos que van a ser detectados son como los descritos anteriormente. En un aspecto son péptidos de origen natural. Los péptidos proporcionan un indicador de activación o inactivación de los sistemas ANP y BNP. La primera sustancia de enlazamiento es como se define aquí.
En una modalidad la primera sustancia de enlazamiento es una sustancia de enlazamiento bi u oligo-específica como se define aquí. Tal sustancia de enlazamiento es capaz de enlazarse tanto con péptidos derivados de proANP como de proBNP. En una modalidad se utiliza esta primera sustancia de enlazamiento en el análisis cuando no se utiliza un agente de la invención en el análisis, por ejemplo como un antígeno que compite en un análisis de enlazamiento competitivo. Los complejos de enlazamiento entre la primera sustancia de enlazamiento y los péptidos en la muestra pueden ser detectados y se puede determinar la activación o inactivación como anteriormente.
En un aspecto, el presente método adicionalmente comprende poner en contacto una muestra con un agente de la invención como se describe aquí (XNP, proXNP, o NT-proXNP). El agente comprende péptidos derivados de o que se originan a partir tanto de proANP como de proBNP y es capaz de enlazarse con la primera sustancia de enlazamiento. Tal agente puede ser utilizado como un estándar para calibrar los presentes análisis. El agente puede ser utilizado como un antígeno que compite en un ensayo de competición. Los niveles de péptido en una muestra dada pueden ser expresados por lo tanto en términos de concentración del agente. Los formatos adecuados de análisis, los medios de detección y de cuantificación son conocidos en el arte y se describen con más detalle más adelante.
Los métodos de la invención se aplican generalmente a una muestra, típicamente una muestra biológica. Típicamente la muestra es una que es conocida o que se sospecha que es una muestra corporal de un individuo, tal como un humano. Una muestra puede ser una tomada de un individuo o paciente. La muestra puede incluir un fluido corporal, por ejemplo sangre, suero, plasma, fluido cerebroespinal, orina, saliva u otro fluido biológico en el cual los péptidos derivados de prohormonas e péptidos natriuréticos de tipo A y B pueden estar presentes. La muestra puede ser una muestra humana. La muestra puede ser obtenida de un individuo o paciente utilizando un procedimiento estándar o de rutina. La muestra puede ser por lo tanto de tal manera que se puede utilizar el análisis para selección diagnóstica o monitoreo terapéutico o evaluación. La muestra puede ser obtenida de un individuo o sujeto vivo.
Una muestra puede ser procesada antes de ser utilizada en el método. Por ejemplo, puede ser diluida, típicamente en agua, solución salina o solución salina que contenga un amortiguador (cualquiera de estos diluyentes puede contener adicionalmente detergente).
Generalmente, el presente método se lleva a cabo en solución acuosa. Sin embargo, en modalidades particulares (algunas de las cuales son discutías más adelante), la primera sustancia de enlazamiento, o el agente pueden ser inmovilizados en un soporte sólido. Típicamente tal soporte es la superficie del contenedor en el cual se lleva a cabo el método, tal como la superficie de un pozo de una placa de microtitulación. En otras modalidades el soporte puede ser una lámina (por ejemplo una lámina de nitrocelulosa o de nylon) o un lecho (por ejemplo de Sefarosa o de látex).
En una modalidad el soporte sólido es una partícula, barra o placa de microtitulación. Se puede utilizar una placa para ELISA.
La primera sustancia de enlazamiento o el agente pueden ser marcados con una etiqueta detectable. Los ejemplos de etiquetas detectables han sido descritos aquí.
En principio, se puede emplear cualquier técnica adecuada de análisis en la presente invención. Por ejemplo, los métodos adecuados incluyen métodos de inmunoensayo, tanto competitivos como no competitivos, métodos de enlazamiento de anticuerpo que emplean ya sea antígenos marcados como no marcados o sus análogos (inmunoensayos), o sustancias de enlazamiento marcadas o no marcadas que reconocen sus antígenos o análogos (ensayos inmunométricos y ensayos de enlazamiento del receptor), respectivamente. Se pueden utilizar ensayos tipo sándwich.
Los métodos de métodos de inmunoensayo que pueden ser utilizados incluyen inmunoensayos de fluorescencia de europio (FIA), ensayos por inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA), radioinmunoensayos (RIA), ensayos inmunoradiométricos, inmunoensayos con enzimas, ensayos inmunoenzimométricos, fluoroinmunoensayos resueltos en el tiempo, ensayos inmunofluorométricos, inmunoensayos de quimioluminiscencia (CLIA), inmunoensayos de electroquimioluminiscencia anódicos o catódicos, diferentes ensayos de tiras reactivas de química seca, inmunoensayos con base en partículas, inmunoensayos directos sin marcadores, tal como los ensayos con base en resonancia de plasmones superficiales, ondas acústicas superficiales y espectroscopía Raman mejorada de superficie, inmunoensayos homogéneos tales como ensayos de proximidad con dos etiquetas diferentes, tecnología de chips, tecnología de arreglos, inmunoensayos mejorados de partículas y otros inmunoensayos de partículas, tanto de partículas marcadas como no marcadas de tamaño individual como dual. El látex y el oro, en diferentes formas, pueden ser mencionados como ejemplos de partículas que son utilizadas. Las determinaciones turbidométricas y nefelométricas son también formatos de ensayo posibles.
La tecnología de membrana cromatográfica también puede ser utilizada como formato para implementar la presente invención. El análisis por membrana cromatográfica incluye tanto un análisis lateral como de flujo a través suyo. Los reactivos utilizados son inmovilizados ya sea en forma permanente como no permanente sobre la membrana donde ellos tienen un papel muy distinto en las diferentes zonas del análisis es decir una o múltiples zona(s) para reactivo(s), análisis, control(es) etc. Los reactivos inmovilizados pueden ser sustancias de enlazamiento, el agente de la invención, anticuerpo de la sustancia de anti-enlazamiento, anticuerpo anti-analito, anticuerpo anti-agente o una etiqueta.
Los complejos de enlazamiento de la primera sustancia de enlazamiento con péptidos en la muestra o con el agente pueden ser detectados utilizando una segunda sustancia de enlazamiento. Por ejemplo, la segunda sustancia de enlazamiento puede ser un anticuerpo que por sí mismo cuenta con una etiqueta detectable tal como aquellas enlistadas más arriba. La segunda sustancia de enlazamiento puede ser una sustancia que cause precipitación o bien inmovilice y separe los complejos de la primara sustancia de enlazamiento.
Se describirán ahora modalidades particulares del presente método en forma más detallada:
- (a)
- Una modalidad utiliza un agente proXNP marcado como antígeno, junto con anticuerpo como primera sustancia de enlazamiento que reconoce tanto péptidos derivados de prohormonas de péptido natriurético tanto de tipo A como B como al agente. En tales métodos se añade una cantidad constante conocida de agente marcado a la muestra que contiene una cantidad desconocida de antígeno no marcado, es decir analito peptídico que va a ser medido. Tanto el antígeno marcado como el no marcado se enlazan con la primera sustancia de enlazamiento, por ejemplo en una forma competitiva y la medición de la cantidad del agente marcado enlazado, cuando se compara con la cantidad conocida añadida de agente, puede ser utilizada para determinar cuánto antígeno no marcado está presente en la muestra reflejando así la activación o la inactivación de ambos sistemas el ANP y el BNP como una
medición proporcionalmente acumulativa de péptidos derivados tanto de prohormonas del péptido natriurético de tipo A como de tipo B.
- (b)
- Otro tipo preferido de método utiliza una primera sustancia marcada de enlazamiento. En tales métodos, se analiza el complejo de la primera sustancia marcada de enlazamiento y los péptidos derivados tanto de prohormonas del péptido natriurético de tipo A como de tipo B dando una medición proporcionalmente acumulativa de la cantidad de péptidos derivados tanto de prohormonas del péptido natriurético de tipo A como de tipo B en la muestra. Un caso específico es aquel en donde la primera sustancia de enlazamiento puede ser el receptor natriurético GC-A o un fragmento o extensión del mismo, un anticuerpo bi, oligoespecífico o bifuncional que reconoce péptidos derivados tanto de prohormonas del péptido natriurético de tipo A como de tipo B como del agente.
- (c)
- Un tipo adicional de método se basa en el uso de un anticuerpo marcado con sustancia de enlazamiento, cuyo anticuerpo puede ser producido en una especia animal diferente que el anticuerpo primario o secundario utilizado en el caso de la sustancia de enlazamiento que contiene un anticuerpo.
- (d)
- Un método adicional comprende (i) poner en contacto la muestra con un agente y una primera sustancia de enlazamiento, que contiene la primera sustancia de enlazamiento marcada o que contiene agente marcado; y (ii) detectar y /o determinar cuantitativamente el enlazamiento de la primera sustancia marcada de enlazamiento con el agente no marcado o el agente marcado con la sustancia de enlazamiento que reconoce péptidos derivados tanto de prohormonas del péptido natriurético de tipo A como de tipo B y al agente.
- (e)
- Un método comprende poner en contacto una muestra, la cual se sabe o se sospecha que contiene péptidos derivados tanto de prohormonas del péptido natriurético de tipo A como de tipo B con (en cualquier orden): (i) una primera sustancia de enlazamiento que reconoce ambos péptidos derivados tanto de prohormonas del péptido natriurético de tipo A como de tipo B y un agente de la invención; y (ii) una cantidad conocida del agente marcado, que actúa como un antígeno, de tal manera que la etiqueta se enlaza con la sustancia de enlazamiento en una cantidad que depende de la cantidad de péptidos no marcados derivados tanto de prohormonas del péptido natriurético de tipo A como de tipo B presentes en la muestra; y analizar la cantidad de marcador enlazado y/o no enlazado como una medida proporcionalmente acumulativa del nivel no marcado de péptidos derivados tanto de prohormonas del péptido natriurético de tipo A como de tipo B en la muestra.
- (f)
- Un método de inmunoensayo convencional (por ejemplo radioinmunoensayo) puede comprender:
- (i)
- la inmovilización sobre un soporte sólido de una primera sustancia de enlazamiento no marcada que reconoce y enlaza péptidos derivados tanto de prohormonas del péptido natriurético de tipo A como de tipo B y un agente de la invención;
- (ii)
- la adición de una muestra que contiene o que se sospecha que contiene los péptidos nativos objetivo derivados tanto de prohormonas del péptido natriurético de tipo A como de tipo B junto con una cantidad fija de agente marcado, de tal manera que los péptidos derivados tanto de prohormonas del péptido natriurético de tipo A como de tipo B y el agente marcado están libres para competir por el enlazamiento con la sustancia inmovilizada de enlazamiento;
(iii) la separación del material inmovilizado (enlazado) del material no inmovilizado (no enlazado);
- (iv)
- la determinación de la cantidad de agente marcado enlazado a la sustancia de enlazamiento; y
- (v)
- la comparación de las cantidades de agente marcado enlazado o no enlazado en mezclas de análisis de muestras de prueba con la señal obtenida utilizando calibradores con una concentración conocida de agente con el propósito de determinar la concentración proporcionalmente acumulativa de péptidos derivados tanto de prohormonas del péptido natriurético de tipo A como de tipo B en la muestra que está siendo analizada.
- (g)
- Alternativamente, el método (f) puede ser llevado a cabo en solución, donde, se puede utilizar una segunda sustancia de enlazamiento ya sea para precipitar o bien inmovilizar y separar los complejos primera sustancia de enlazamiento-antígeno. Un ejemplo típico de esto comprende:
- (i)
- poner en contacto una muestra que contiene o que se sospecha que contiene los péptidos derivados de prohormonas del péptido natriurético de tipo A y B que van a ser detectados con una primera sustancia de enlazamiento que reconoce péptidos derivados tanto de prohormonas del péptido natriurético de tipo A y de tipo B o el enlazamiento de los mismos de acuerdo con la invención en presencia de una cantidad fija de un agente marcado de la invención;
- (ii)
- poner en contacto la mezcla resultante con una sustancia de enlazamiento secundaria inmovilizada que se enlaza con la primera sustancia de enlazamiento;
(iii) separar el material inmovilizado del material no inmovilizado; y
- (iv)
- comparar las cantidades del agente marcado en el material inmovilizado o no inmovilizado con las cantidades obtenidas utilizando calibradores con concentración conocida del agente nuevo para determinar la concentración proporcionalmente acumulativa de péptidos derivados tanto de prohormonas del péptido natriurético de tipo A como de tipo B en la muestra que está siendo analizada.
- (h)
- También se prevé un análisis inmunométrico que emplea el uso de un agente no marcado inmovilizado, un ejemplo típico del cual comprende:
- (i)
- la inmovilización sobre un soporte sólido de un agente no marcado de la invención;
- (ii)
- la adición de una muestra que contiene o que se sospecha que contiene los péptidos objetivo derivados de prohormonas del péptido natriurético tipo A y tipo B junto con una cantidad fija de sustancia de enlazamiento marcada que reconoce péptidos derivados tanto de prohormonas del péptido natriurético de tipo A como de tipo B de acuerdo con la invención, de tal manera que los péptidos derivados tanto de prohormonas del péptido natriurético de tipo A como de tipo B en la muestra están libres para competir con el agente inmovilizado de la invención por la sustancia de enlazamiento marcada.
(iii) la separación de la sustancia de enlazamiento marcada que reconoce péptidos derivados tanto de prohormonas del péptido natriurético de tipo A como de tipo B que no está enlazada al agente inmovilizado de la invención;
- (iv)
- la determinación de la cantidad de sustancia de enlazamiento marcada enlazada al agente inmovilizado de la invención; y
- (v)
- la comparación de las cantidades de sustancia de enlazamiento marcada inmovilizada o no inmovilizada en las mezclas de ensayo de muestras de prueba con la actividad obtenida utilizando calibradores con concentración conocida del agente de la invención, con el propósito de determinar la concentración proporcionalmente acumulativa de péptidos derivados tanto de prohormonas del péptido natriurético de tipo A como de tipo B en la muestra que está siendo analizada.
Por lo tanto la invención provee métodos para la determinación de la concentración proporcionalmente acumulativa de péptidos derivados tanto de prohormonas del péptido natriurético de tipo A como de tipo B en una muestra, mostrando ya sea una activación o una inactivación tanto de los sistemas ANP como BNP.
La primera sustancia de enlazamiento
De acuerdo con el presente método, se analizan al mismo tiempo péptidos derivados tanto de proANP como de proBNP al mismo tiempo en una muestra dada. Como anteriormente los péptidos derivados de proANP y proBNP incluyen NT-proANP, ANP, NT-proBNP, BNP así como proANP y proBNP. Una muestra puede contener otros péptidos derivados también de las prohormonas por ejemplo por medio de proteólisis. Por ejemplo, otros péptidos pueden incluir proANP1-30, proANP31-67 o proANP79-98. Por lo tanto en una modalidad, cualquier combinación de proANP, NT-proANP, ANP, proBNP, NT-proBNP y BNP, y opcionalmente otros péptidos derivados, pueden ser analizados en el método.
Los presentes análisis utilizan una primera sustancia de enlazamiento que reconoce o se enlaza con péptidos derivados tanto de prohormonas del péptido natriurético de tipo A como de tipo B, tal como aquellos péptidos descritos anteriormente. De este modo la sustancia es capaz de enlazarse tanto con proANP como con proBNP o con variantes, incluidos fragmentos de ambas prohormonas. La primera sustancia de enlazamiento puede no enlazar ambos juegos de péptidos con igual afinidad. La sustancia de enlazamiento se enlaza con proANP, ANP o NT-proANP de origen natural y con proBNP, BNP, o NT-proBNP de origen natural. Por ejemplo puede enlazarse con las SEQ ID Nos 1, 2 ó 3 y las SEQ ID Nos 4, 5 ó 6, o con variantes alélicas o especies homólogas de las mismas. Alternativamente o adicionalmente, la sustancia puede enlazarse con uno o más fragmentos de cualquiera de las anteriores secuencias, por ejemplo fragmentos que incluyen un epítopo, fragmento antigénico, o un sitio de enlazamiento. Tales fragmentos son discutidos más detalladamente aquí.
La primera sustancia de enlazamiento es capaz de enlazarse tanto con:
- (a)
- (i)
- proANP (SEQ ID NO. 1), ANP (SEQ ID NO. 2) o NT-proANP (SEQ ID NO. 3);
- (ii)
- una variante homóloga de (i); o
(iii) un fragmento de (i) o (ii);
como con
- (b)
- (i)
- pro-BNP (SEQ ID NO. 4), BNP (SEQ ID NO. 5) o NT-proBNP (SEQ ID NO. 6);
- (ii)
- una variante homóloga de (i); o
(iii) un fragmento de (i) o (ii).
Las variantes y los fragmentos son como los definidos aquí.
La variante homóloga (ii) tiene al menos 70% de identidad con (i), y/o el fragmento (iii) es de al menos 6 aminoácidos de longitud. En un aspecto la variante homóloga (ii) es una especie homóloga o una variante alélica de (i).
En una modalidad una sustancia de enlazamiento de acuerdo con la invención es capaz de enlazarse con un péptido que contiene o que consiste de los aminoácidos 7 a 23 del ANP y/o los aminoácidos 10 a 26 de BNP o variantes de los mismos. Estas regiones del péptido forman una estructura conservada del anillo en las moléculas nativas.
Una sustancia de enlazamiento puede enlazarse con un epítopo de proANP y/o proBNP. Por ejemplo, los epítopos adecuados incluyen los aminoácidos 5-13, 1-10, 15-25 y 27-32 de BNP y los aminoácidos 65-76 y 1-13 de NTproBNP o variantes de los mismos.
En una modalidad, una sustancia de enlazamiento es capaz de enlazarse con uno o más péptidos seleccionados de proBNP1-37, proBNP15-24, proBNP10-29, proBNP77-92, proBNP1-108, ProANP29-98, proANP82-96, proANP20-80, proANP6080, proANP1-126 y proANP112-126 o Variantes de los mismos. Por ejemplo, una sustancia de enlazamiento puede ser capaz de enlazarse tanto con proBNP15-24 como con proANP82-96, tanto con proBNP1-37 como con proANP29-98, tanto con proBNP10-29 como con proANP20-80, tanto con proBNP10-29 como con proANP60-80, tanto con proBNP 1-108 como con proANP1-126 o tanto con proBNP77-92 como con proANP112-126. Por ejemplo, una sustancia de enlazamiento de acuerdo con la invención puede enlazarse con NT-proXNP1 (SEQ ID NO: 13), NT-proXNP2 (SEQ ID NO: 14), NTproXNP3 (SEQ ID NO: 15) NT-proXNP4 (SEQ ID NO: 17), NT-proXNP5 (SEQ ID NO: 18), proXNP6 (SEQ ID NO: 19) o XNP7 (SEQ ID NO: 20).
En aquellas modalidades de la presente invención que utilizan un agente de enlazamiento de la invención, la primera sustancia de enlazamiento es también capaz de enlazarse con el agente de enlazamiento.
Los ensayos adecuados de enlazamiento para determinar el enlazamiento son conocidos en el arte. En general una primera sustancia de enlazamiento es capaz de enlazar un péptido dado en una medida que puede ser utilizada en un ensayo de enlazamiento y detección tal como aquellos descritos aquí. Por ejemplo, una sustancia de enlazamiento adecuada puede enlazarse con al menos 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 100% de la afinidad de enlazamiento de un anticuerpo específico con el péptido, o del receptor natriurético GC-A con el péptido, por ejemplo del receptor GC-A con ANP o BNP.
La primera sustancia de enlazamiento como se la utiliza aquí puede ser una sola sustancia o una mezcla de sustancias. Una sustancia de enlazamiento adecuada puede ser por ejemplo, un receptor o un anticuerpo, o fragmentos o derivados de los mismos, con propiedades bi u oligoespecíficas, o una mezcla de las mismas.
En un aspecto se utiliza una mezcla de sustancias de enlazamiento como una primera sustancia de enlazamiento en modalidades donde se utiliza también un agente de la invención. Una mezcla puede incluir sustancias de enlazamiento monoespecíficas, biespecíficas y/o oligoespecíficas. Cualquier composición adecuada de sustancias de enlazamiento puede ser utilizada que permita la detección de péptidos derivados de proANP y proBNP de acuerdo con los métodos presentes. Las sustancias de enlazamiento específicas del péptido derivado de pro-ANP y las sustancias de enlazamiento específicas del péptido derivado de proBNP pueden estar presentes en cualquier proporción adecuada. Por ejemplo pueden estar presentes en iguales cantidades o capacidades de enlazamiento. Alternativamente, cada una puede estar presente, por ejemplo, en 2, 3, 4, 5 hasta 10 veces la cantidad o capacidad de enlazamiento de la otra. En una modalidad, se puede utilizar en un análisis una mezcla 1:1 de sustancia de enlazamiento específica del péptido derivado de proANP por ejemplo anticuerpo y de sustancia de enlazamiento específica del péptido derivado de proBNP por ejemplo anticuerpo.
En modalidades donde el análisis no incluye agente de la invención se prefiere que la primera sustancia de enlazamiento sea una sola sustancia de enlazamiento bi u oligoespecífica. Por lo tanto una primera sustancia de enlazamiento para uso en tales modalidades puede ser una sola sustancia que sea de enlazamiento bi u oligofuncional. Esa sola sustancia tiene la especificidad de enlazamiento de la primera sustancia de enlazamiento como se expuso anteriormente. Puede por ejemplo, tener dos o más sitios de enlazamiento para el ligando, o dos o más ligandos pueden enlazarse con un sitio en la sustancia con la misma o con diferentes afinidades. Por ejemplo tal sustancia puede incluir un receptor o anticuerpo o fragmentos de cualquiera de ellos.
(a) Receptores
Un ejemplo de un receptor adecuado es el receptor natriurético GC-A. Una secuencia de GC-A humana puede ser encontrada bajo el número de acceso P 16066 (SEQ ID NO: 33). El receptor o un fragmento, extensión o derivado del mismo puede ser producido por medio de métodos conocidos por aquellos capacitados en el arte (Misono et al.,
1999). En resumen, el domino de enlazamiento del ligando extracelular del receptor (SEQ ID NO: 34) puede ser producido por clonación de la secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos requerida para el enlazamiento tanto de ANP como de BNP humano, dentro de un vector de expresión procariota o eucariota adecuado, transfectando el vector dentro de una célula huésped apropiada, cultivando la célula huésped en un medio de cultivo adecuado, y recolectando la proteína recombinante. La secuencia derivada del receptor puede ser liberada por medio de digestión con la enzima, purificada con cromatografía de afinidad y HPLC en fase reversa e identificada por medio del mapeo y secuenciación del péptido.
El receptor de GC-B (número de acceso P20594, SEQ ID NO: 35) o ANPrecC o el receptor de despeje (número de acceso P17342, SEQ ID NO: 36) pueden actuar también como una sustancia de enlazamiento.
Por lo tanto en una modalidad la primera sustancia de enlazamiento puede incluir:
- (a)
- un receptor natriurético GC-A (SEQ ID NO: 33), GC-B (SEQ ID NO: 35) o GC-C (SEQ ID NO: 36);
- (b)
- una variante homóloga de (a); o
- (c)
- un fragmento de (a) o (b).
En un aspecto la primera sustancia de enlazamiento incluye un dominio de enlazamiento extracelular del receptor natriurético GC-A (SEQ ID NO: 34) o una variante homóloga de un fragmento del mismo.
Se puede utilizar una extensión o derivado de cualquiera de las sustancias de enlazamiento anteriores. De este modo, se puede modificar la estructura de la molécula, por ejemplo por medio de la adición de un asa para facilitar la unión a un soporte sólido, manteniendo al mismo tiempo la capacidad de enlazamiento o las propiedades de la molécula.
(b) Anticuerpos
La primera sustancia de enlazamiento puede incluir un anticuerpo o un fragmento o derivado de un anticuerpo. Por lo tanto, en un aspecto la presente invención se relaciona con un anticuerpo con la especificidad de enlazamiento expuesta anteriormente.
Los anticuerpos pueden elevarse contra epítopos específicos de las secuencias dadas de péptidos. Un anticuerpo, u otro compuesto, "se enlaza específicamente" con un polipéptido cuando este se enlaza con afinidad preferencial o alta afinidad con la proteína o proteínas por lo cual es específico pero no se enlaza específicamente únicamente con baja afinidad con otros polipéptidos. Se conocen bien en el arte una variedad de protocolos para enlazamiento competitivo o ensayos inmunométricos para determinar la capacidad específica de enlazamiento de un anticuerpo (ver por ejemplo Maddox et al, J. Exp. Med. 158, 1211 -1226, 1993). Tales inmunoensayos involucran típicamente la formación de complejos entre proteína específica y anticuerpo y la medición de la formación de complejo.
Un anticuerpo de acuerdo con la invención puede incluir ya sea un anticuerpo completo o un fragmento del mismo y tiene la especificidad de enlazamiento expuesta anteriormente. Los fragmentos incluyen a los fragmentos Fv, F(ab’) y F(ab’)2, así como anticuerpos de cadena sencilla. Un anticuerpo completo es típicamente un anticuerpo que es producido por cualquiera de los métodos para la producción de un anticuerpo que se discuten aquí. Típicamente el anticuerpo es un anticuerpo de mamífero, tal como un anticuerpo de primate, humano, roedor (por ejemplo ratón o rata), conejo, ovino, porcino, equino, cabra o camello. El anticuerpo puede ser cualquier clase o isotipo de anticuerpo, por ejemplo IgM, pero preferiblemente es IgG.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo biespecífico que sea capaz de enlazarse con dos antígenos diferentes, o un anticuerpo oligoespecífico que se capaz de enlazarse con más de dos antígenos diferentes. El anticuerpo puede incluir un anticuerpo policlonal, monoclonal, oligoclonal, bifuncional o policlonal de reacción cruzada como se explicó anteriormente.
Un fragmento de anticuerpo completo que puede ser utilizado en el método incluye un sitio para enlazamiento del antígeno, por ejemplo los fragmentos F(ab’) o F(ab)2. Tales fragmentos o anticuerpos pueden ser utilizados para formar derivados de anticuerpo. Por ejemplo el anticuerpo completo o fragmento puede estar asociado con otras fracciones, tales como enlazadores que pueden ser utilizados para unir dos o más fragmentos o anticuerpos. Tales enlazadores pueden ser enlazadores químicos o pueden estar presentes en la forma de una proteína de fusión con el fragmento o anticuerpo completo. Los enlazadores pueden ser utilizados por lo tanto para unir anticuerpos completos o fragmentos que tengan las mismas o diferentes especificidades de enlazamiento, por ejemplo que puedan enlazar los mismos o diferentes polimorfismos. El anticuerpo puede ser un "anticuerpo biespecífico" formado por medio de la unión de dos dominios variables espalda con espalda. En una modalidad el anticuerpo es un anticuerpo quimérico que contiene la secuencia de diferentes anticuerpo naturales, por ejemplo un anticuerpo humanizado. Los anticuerpos bifuncionales pueden ser elaborados por medio de combinación química de fragmentos con las características deseadas.
Los anticuerpos de la invención pueden ser producidos por medio de cualquier método adecuado. Por ejemplo, anticuerpos, fragmentos o derivados de los mismos pueden ser producidos por selección de inmunógenos para aumentar los anticuerpos, los anticuerpos que se acoplan químicamente o fragmentos de anticuerpos, fusión somática de hibridomas/esplenocitos monoclonales o técnicas recombinantes. Se pueden utilizar técnicas de despliegue en fagos en la producción de anticuerpos.
Los medios para preparar y caracterizar anticuerpos son bien conocidos en el arte, ver por ejemplo Harlow y Lane (1988) "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Por ejemplo, se puede producir un anticuerpo elevando los anticuerpos en un animal huésped contra el polipéptido completo o un fragmento del mismo, por ejemplo un epítopo antigénico del mismo, o "inmunógeno". El fragmento puede ser cualquiera de los fragmentos mencionados aquí (típicamente al menos 6 o al menos 10 ó 15 aminoácidos de longitud). Se puede utilizar un agente de la invención para elevar los anticuerpos utilizando técnicas conocidas.
Un método para producir un anticuerpo policlonal comprende la inmunización de un animal huésped adecuado, por ejemplo un animal experimental, con el inmunógeno y aislamiento de inmunoglobulinas del suero del animal. El animal puede ser por lo tanto inoculado con el inmunógeno, se puede remover posteriormente sangre del animal y purificar la fracción de IgG.
Se producen anticuerpos monoclonales y policlonales por medio de la inmunización de un animal huésped adecuado (por ejemplo un conejo, oveja, cabra, cerdo, pollo, conejillo de Indias, rata o ratón) con un inmunógeno. Por ejemplo, el inmunógeno puede incluir un agente de acuerdo con la presente invención. En una modalidad se administran uno
o más refuerzos de inmunógeno al animal. Por ejemplo, se pueden utilizar 1, 2, 3, 4 o más refuerzos. Los métodos de producción de anticuerpos monoclonales o policlonales son bien conocidos por aquellos capacitados en el arte y se puede utilizar cualquiera de estos métodos para preparar anticuerpos. Si se desea, se puede administrar el inmunógeno como un conjugado, en el cual se acopla el inmunógeno, por ejemplo a través de una cadena lateral de los residuos de aminoácido con un portador adecuado. La molécula portadora es típicamente un portador fisiológicamente aceptable.
Después de que el animal experimental ha producido anticuerpos policlonales se puede utilizar el suero diluido o se pueden aislar las inmunoglobulinas deseadas del suero. En una modalidad el suero puede ser diluido antes de usarlo. Las diluciones adecuadas pueden incluir por ejemplo, de 1:1000 a 1:500.000, por ejemplo de 1:20.000 a 1:80.000, 1:10.000 a 1:15.000 o de 1:50.000 a 1:60.000. En una modalidad la concentración del anticuerpo utilizado en un ensayo de la invención es la misma que la concentración de anticuerpo en tal dilución de suero. El anticuerpo obtenido puede ser aislado y, si se desea, purificado, por ejemplo hasta una pureza del 70% -100%. Típicamente el animal se inocula con inmunógeno, se remueve la sangre y se purifica la fracción de IgG.
Los métodos para producir anticuerpos monoclonales son también bien conocidos por aquellos capacitados en el arte (Köhler & Millstein 1975 Nature 256, 495 -497). Tales métodos generalmente comprenden la inmortalización de células lo que produce al anticuerpo reivindicado. Las células de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales, se producen por fusión de células de bazo de un animal inmunizado con células tumorales. Las células de hibridoma resultantes se inmortalizan y las células producen al anticuerpo deseado. La célula inmortalizada que produce el anticuerpo deseado puede ser seleccionada por medio de un procedimiento convencional. Los hibridomas pueden ser cultivados en medio de cultivo o inyectados en forma intraperitoneal, por formación de fluido de ascitis, o dentro del torrente sanguíneo de un huésped alogénico o inmunocomprometido.
Se pueden producir anticuerpos humanos por medio de inmunización in vitro de linfocitos humanos, seguido por transformación de los linfocitos con el virus de Epstein-Barr. Los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos también por medio de tecnología de ADN recombinante como lo describen Skerra y Plückthun (1988). También es posible utilizar cualquiera de los derivados, como por ejemplo los fragmentos F(ab’), y F(ab’)2 tanto de anticuerpos monoclonales y policlonales preparados por reacción proteolítica de papaína y pepsina, respectivamente, sobre anticuerpos sustancialmente intactos por métodos bien conocidos para una persona capacitada en el arte.
De este modo, se pueden elaborar los anticuerpos suministrados por la invención (y aquellos son utilizados en el método de la invención) cultivando una célula que expresa al anticuerpo y opcionalmente purificando el anticuerpo de la célula.
La célula utilizada en el proceso puede ser una que se obtiene por medio de la administración de un péptido que comprende cualquiera de los péptidos antigénicos relevantes a un mamífero, extrayendo células B del mamífero y selección de una célula de estas con base en la capacidad para expresar un anticuerpo que enlaza los antígenos. Opcionalmente las células B se inmortalizan después de la extracción o selección, por ejemplo fusionándolas con una célula inmortal (para formar un hibridoma) o por medio de infección con el virus EBV.
Las células que expresan el anticuerpo incluyen un polinucleótido que es capaz de expresar al anticuerpo, un polinucleótido que codifica al anticuerpo.
Otro tipo de célula que puede ser utilizada para elaborar al anticuerpo es uno que es recombinante para un polinucleótido que expresa al anticuerpo. Tal célula puede ser procariota o eucariota (por ejemplo de cualquiera de los mamíferos mencionados aquí).
El anticuerpo puede ser inmovilizado sobre un soporte sólido. Típicamente el soporte sólido es la superficie del contenedor en la cual se lleva a cabo el método, por ejemplo la superficie de una placa de microtitulación. En otras modalidades el soporte puede ser una partícula, una lámina (por ejemplo una lámina de nitrocelulosa o de nylon) o una perla (por ejemplo de Sefarosa o de látex). El anticuerpo puede estar presente sobre una placa de ELISA o en una barra.
Los anticuerpos de la invención son por ejemplo útiles en métodos de purificación, aislamiento o selección que involucran técnicas de inmunoprecipitación.
Se puede utilizar una barra para llevar a cabo el método de la invención. La barra incluye un material poroso capaz de transportar cromatográficamente un líquido y uno o más de los anticuerpos mencionados aquí. Cuando se pone en contacto la barra con la muestra retira el líquido desde la muestra hacia una región de detección sobre la barra. Los péptidos en la muestra que se derivan de proANP o proBNP se detectan por su enlazamiento con la región de detección.
El líquido se retira a través de una región en la barra que contiene los anticuerpos de la invención. Estos anticuerpos se enlazan con los péptidos relevantes formando un complejo anticuerpo/péptido. Este complejo se esparce hacia la región de detección que contiene un agente (inmovilizado sobre la barra) que enlaza y por lo tanto inmoviliza al complejo en la región de detección. Este agente es típicamente un agente de enlazamiento específico (por ejemplo un anticuerpo) que enlaza ya sea al anticuerpo o al péptido del complejo. El complejo anticuerpo/péptido es típicamente detectado en la región de detección por medio del uso de una etiqueta que se une al anticuerpo específico.
La proteína en la muestra puede ser marcada antes de ser retirada de la barra. La proteína marcada es luego retirada de la barra (que ha sido puesta en contacto con la muestra) y se detecta por medio del enlazamiento del anticuerpo específico del polimorfismo (que está enlazado a la región de detección).
Típicamente la etiqueta utilizada en los sistemas de barra descritos anteriormente es una etiqueta visualmente detectable que puede ser detectada en forma visible (es decir que puede ser observada con a simple vista) cuando se inmoviliza suficiente complejo anticuerpo/proteína en la región de detección. Una etiqueta adecuada es una partícula de oro (u otro metal coloidal) o un fluoróforo (por ejemplo fluoresceína).
La barra puede contener un agente desnaturalizante que provoca desnaturalización de la proteína que es retirada de la barra. En una modalidad se expone la muestra a condicione de desnaturalización (por ejemplo en contacto con un agente desnaturalizante) antes de ponerla en contacto con la barra.
Agentes de la invención (proXNP, NT-proXNP, XNP)
(a) Agentes peptídicos
En una modalidad el presente método de análisis utiliza un agente (proXNP, XNP o NT-proXNP) que contiene una secuencia de aminoácidos derivada o que se origina a partir tanto de proANP como de proBNP. El agente imita péptidos derivados de proANP y de proBNP en la muestra que va ser analizada, en particular péptidos de origen natural. El agente para uso en el presente método es reconocido también o enlazado por la primera sustancia de enlazamiento que es utilizada en el método. De este modo el agente puede competir con los péptidos en una muestra por el enlazamiento con la sustancia de enlazamiento en los análisis de la invención. Un agente puede ser utilizado también como un calibrador o estándar en un análisis. Por lo tanto, los agentes son particularmente útiles para cuantificar péptidos derivados de proANP y proBNP en una muestra. Por ejemplo, en los presentes métodos de análisis, la medición de péptidos en una muestra se puede expresar como una concentración de agente. Además el agente puede ser utilizado como un inmunógeno para producir anticuerpo adecuado para uso como una primera sustancia de enlazamiento, de acuerdo con los métodos expuestos anteriormente.
El agente es un polipéptido. Por ejemplo, un agente puede contener o consistir de una proteína de fusión. Un agente de acuerdo con la invención generalmente contiene una secuencia característica de proANP y una secuencia característica de proBNP. Por lo tanto, un agente típicamente incluye al menos una secuencia del péptido derivada de proANP y al menos una secuencia del péptido derivada de proBNP.
El agente incluye tanto:
- (a)
- (i)
- las SEQ ID Nos 1, 2 ó 3;
- (ii)
- una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i); o
(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud;
como
- (b)
- (i)
- las SEQ ID Nos 4, 5 ó 6;
- (ii)
- una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i); o
(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud.
En un aspecto un agente incluye los aminoácidos 7 a 23 de ANP y/o los aminoácidos 10 a 26 de BNP, o variantes de los mismos. Estos péptidos forman una estructura anular conservada en ANP y BNP natural, que puede estar conservado en el agente. En una modalidad, un agente incluye un epítopo de proANP y/o de proBNP. Por ejemplo, los epítopos adecuados incluyen los aminoácidos 5 a 13, 1 a 10, 15 a 25 ó 27 a 32 de BNP y los aminoácidos 65 a 76 ó1a13deNT-proBNP. En una modalidad un agente incluye la secuencia de péptidos derivada tanto de (de acuerdo con lo anterior) NT-proANP como de NT-proBNP (tal agente es denominado NT-proXNP), o tanto de ANP como de BNP (siendo denominado el agente como XNP).
En una modalidad el agente puede contener la secuencia de péptidos seleccionada de uno o más entre proBNP1-37, proBNP15-24, proBNP10-29, proBNP77-92, proBNP1-108, proANP29-98, proANP82-96, proANP20-80, proANP60-80, proANP112126 o variantes de las mismas. En un aspecto un agente incluye al menos una secuencia de proBNP y al menos una de proANP selecciona de esta lista. Las combinaciones adecuadas son proBNP15-24 y proANP82-96, proBNP1-37y proANP29-98, proBNP10-29 y proANP20-80, proBNP10-29 y proANP60-80, proBNP1-108 y proANP1-126 o proBNP77-92 y proANP112-126. De este modo, un agente de acuerdo con la invención puede incluir o consistir de NT-proXNP1 (SEQ ID NO: 13), NTproXNP2 (SEQ ID NO: 14), NT-proXNP3 (SEQ ID NO: 15), NT-proXNP4 (SEQ ID NO: 17), NTproXNP5 (SEQ ID NO: 18), proXNP6 (SEQ ID NO: 19) o XNP7 (SEQ ID NO: 20).
Además de las secuencias de los péptidos derivadas de proANP y proBNP el agente puede incluir una secuencia lineal, conectora o aducto de aminoácidos de longitud o composición variable. Se conocen enlazadores adecuados en el estado del arte. La estructura del enlazador puede ser por ejemplo para permitir la unión de una o más etiquetas (por ejemplo grupos fluorescentes o enzimas) con el enlazador. Por ejemplo, los espaciadores y aductos adecuados incluyen Gly-Lys-Tyr-Gly (GKYG) (SEQ ID NO: 16), Ser-Arg, Gly-Ser o un solo aminoácido por ejemplo Tyr o Cys. El residuo de Tyr permite yodación radioactiva y el residuo de Lys o Cys permite la unión de etiquetas que requieren un grupo amino o un grupo sulfhidrilo.
Un agente puede ser inmovilizado sobre un soporte sólido, por ejemplo aquellos descritos para los anticuerpos.
Un agente de la invención puede incluir una secuencia químicamente modificada de aminoácidos, por ejemplo modificados después de la traducción. Por ejemplo, puede ser glicosilada o incluir residuos modificados de aminoácidos. Puede ser modificado por medio de la adición de residuos de histidina para ayudar a la purificación. Puede ser deseable producir un péptido o proteína en una forma adecuada para unión a un soporte sólido. La proteína o el péptido pueden ser por lo tanto modificados para mejorar su enlazamiento a un soporte sólido por ejemplo por medio de la adición de un residuo de cisteína.
(b) Agentes que codifican polinucleótidos
La invención también se relaciona con polinucleótidos que codifican un agente de acuerdo con la invención. Tales polinucleótidos incluyen una secuencia que codifica los polipéptidos del agente como se definió anteriormente y/o una secuencia que es complementaria a la secuencia de codificación.
En particular un polinucleótido de la invención puede incluir tanto:
- (a)
- (i)
- las SEQ ID Nos 7, 8 ó 9;
- (ii)
- una secuencia complementaria a (i);
(iii) una secuencia que hibrida bajo condiciones rigurosas a (i) o (ii);
- (iv)
- una secuencia que se degenerada como resultado del código genético a (i), (ii) o (iii);
- (v)
- una secuencia que tiene al menos 70% de identidad con cualquiera de las secuencias en (i) hasta (iv); o
- (vi)
- un fragmento hasta de 40 nucleótidos de longitud de cualquiera de las secuencias en (i) hasta (v); y
- (b)
- (i)
- las SEQ ID Nos 10, 11 ó 12;
- (ii)
- una secuencia complementaria a (i);
(iii) una secuencia que hibrida bajo condiciones rigurosas a (i) o (ii);
- (iv)
- una secuencia que se degenerada como resultado del código genético a (i), (ii) o (iii);
- (v)
- una secuencia que tiene al menos 70% de identidad con cualquiera de las secuencia en (i) hasta (iv); o
- (vi)
- un fragmento hasta de 40 nucleótidos de longitud de cualquiera de las secuencias en (i) hasta (v).
Un polinucleótido puede incluir también una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos del enlazador o del espaciador en el agente. Un polinucleótido de la invención típicamente incluye 1000 pares de bases
- o menos, por ejemplo 500 pares de bases o menos. Un polinucleótido puede incluir hasta 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o 900 pares de bases. Por ejemplo, un polinucleótido puede incluir hasta 50, 100, 150 o 175 nucleótidos.
Típicamente el polinucleótido es ADN. Sin embargo, la invención puede incluir polinucleótidos de ARN. Los polinucleótidos pueden ser mono o bicatenarios, y pueden incluir nucleótidos sintéticos o modificados.
Un polinucleótido de la invención puede hibridar a la secuencia de codificación o el complemento de la secuencia de codificación de la secuencia especificada (cualquiera de las SEQ ID Nos: 7 -12) en un nivel significativamente por encima del nivel de fondo. La hibridación e fondo puede presentarse, por ejemplo, debido a los otros ADN presentes en una biblioteca de ADN. El nivel de la señal generado por la interacción entre un polinucleótido de la invención y la secuencia de codificación o el complemento de la secuencia de codificación de la secuencia específica es típicamente al menos 10 veces, preferiblemente al menos 100 veces, tan intensa como las interacciones entre otros polinucleótidos y la secuencia de codificación de la secuencia específica. La intensidad de la interacción puede ser medida, por ejemplo, por medio de marcación radioactiva de la sonda, por ejemplo con 32P. La hibridación selectiva típicamente se puede lograr utilizando condiciones de rigurosidad media a alta. Sin embargo, tal hibridación puede ser llevada a cabo bajo cualquiera de las condiciones adecuadas conocidas en el arte (ver Sambrook et al, 1989) Por ejemplo, si se requiere alta rigurosidad las condiciones adecuadas incluyen de 0,1 a 0,2 x SSC a 60 °C hasta 65 °C. Si se requiere baja rigurosidad las condiciones adecuadas incluyen 2 x SSC a 60 °C.
La secuencia de codificación de cualquiera de las SEQ ID Nos: 7 -12 puede ser modificada por medio de sustituciones de nucleótidos, por ejemplo de 1, 2 ó 3 hasta 10, 25 ó 50 sustituciones. El polinucleótido de cualquiera de las SEQ ID Nos: 7 -12 puede ser modificado alternativa o adicionalmente por una o más inserciones y/o supresiones y/o por medio de una extensión en uno cualquiera o en ambos extremos. También se pueden incluir secuencias adicionales por ejemplo secuencias de señalización. Pueden hacerse sustituciones degeneradas y/o pueden hacerse sustituciones que darían como resultado una sustitución conservadora de aminoácidos cuando se traduce la secuencia modificada, por ejemplo como se muestra en la Tabla incluida en la sección de Variantes más arriba.
Una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridar selectivamente con el complemento de la secuencia de codificación de ADN de cualquiera de las SEQ ID Nos: 7 -12 tendrá generalmente al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia específica de codificación sobre una región de al menos 20, por ejemplo al menos 30, por ejemplo al menos 40, al menos 60, 80, 100 por ejemplo 100 ó 200 o más nucleótidos o lo más preferible sobre la longitud completa de la secuencia específica de codificación.
Por ejemplo el Paquete UWGCG provee el programa BESTFIT que puede sr utilizado para calcular la homología (por ejemplo utilizado sobre sus ajustes predeterminados) (Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, páginas 387 -395). Se pueden utilizar los algoritmos PILEUP y BLAST para calcular homología o alineación de secuencias (típicamente sobre sus ajustes predeterminados), por ejemplo como se describe en Altschul (1993) J. Mol. Evol. 36: 290 -300; Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 -10.
El programa para llevar a cabo análisis por BLAST se encuentra públicamente disponible a través del National Centre for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo involucra primero la identificación de pares de secuencias de alta puntuación (HSP) por medio de la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta que o bien coincide o satisface alguna puntuación de umbral de valor positivo T cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una base de datos de secuencia. T se conoce como el umbral de puntuación por palabra de los alrededores (Altschul et al, 1990). Estos aciertos iniciales por palabra de los alrededores actúan como semillas para iniciar las búsquedas para hallar los HSP que los contienen. Los aciertos de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia para poder incrementar la puntuación acumulativa por alineación. Las extensiones para los aciertos de palabra en cada dirección se interrumpen cuando: la puntuación acumulativa por alineación cae en una cantidad X desde su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulativa baja hasta cero o por debajo de cero, debido a la acumulación de uno o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el final de la secuencia. Los parámetros del algoritmo de BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLAST utiliza como predeterminadas una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación de BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 89: 10915 -10919) alineaciones (B) de 50, expectativas (E) de 10, M = 5, N = 4, y una comparación de ambas cadenas.
El algoritmo de BLAST realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias; ver por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873 -5877. Una medición de la similitud suministrada por el algoritmo de BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por medio de la cual ocurriría una coincidencia entre dos nucleótidos o secuencias de aminoácidos por casualidad. Por ejemplo, se considera que una secuencia es similar a otra secuencia si la probabilidad de suma más pequeña en la comparación de la primera secuencia con la segunda secuencia es aproximadamente menor a 1, preferiblemente aproximadamente menor a 0,1, más preferiblemente aproximadamente menor a 0,01, y lo más preferible aproximadamente menor a 0,001.
Cualquier combinación de los grados de identidad de secuencia anteriormente mencionados y tamaños mínimos pueden ser utilizados para definir polinucleótidos de la invención, siendo preferidas las combinaciones más rigurosas (es decir mayor identidad de secuencia sobre longitudes mayores). De este modo, por ejemplo un polinucleótido que tiene al menos 90% de identidad de secuencia sobre 25, preferiblemente sobre 30 nucleótidos forma un aspecto de la invención, al igual que un polinucleótido que tenga al menos 95% de identidad de secuencia sobre 40 nucleótidos.
Los fragmentos de polinucleótidos son hasta de 40, y pueden ser, por ejemplo, hasta de 30 nucleótidos de longitud. Preferiblemente la longitud es hasta de 5, 10, 15, 20 ó 25 nucleótidos.
En una modalidad, un polinucleótido que codifica un agente de la invención puede incluir cualquiera de las SEQ ID NOS: 21 a 27. Por lo tanto un polinucleótido puede codificar NT-proXNP1, NT-proXNP2, NT-proXNP3, NT-proXNP4, NT-proXNP5, proXNP6 o XNP7. Un polinucleótido puede incluir:
- (a)
- las SEQ ID NO 21, 22, 23, 24, 25, 26 ó 27;
- (b)
- una secuencia complementaria a (a);
- (c)
- una secuencia que hibrida bajo condiciones rigurosas a (a) o (b);
- (d)
- una secuencia que se degenera como resultado del código genético a (a), (b) o (c);
- (e)
- una secuencia que tiene al menos 70% de identidad con cualquiera de las secuencias en (a) hasta (d); o
- (f)
- un fragmento de cualquiera de las secuencia en (a) hasta (e).
Los polinucleótidos de acuerdo con la invención pueden ser producidos en forma recombinante, sintética, o por medio de cualquier medio disponible para aquellos capacitados en el arte. También pueden ser clonados por medio de técnicas estándar. Los polinucleótidos son típicamente suministrados en forma aislada y/o purificada.
En general, los iniciadores serán producidos por medios sintéticos, lo que involucra una fabricación por etapas de la secuencia deseada de ácido nucleico, un nucleótido a la vez. Las técnicas para lograr esto utilizando técnicas automatizadas se encuentran fácilmente disponibles en el estado del arte.
Aunque en general las técnicas mencionadas aquí son bien conocidas en el arte, puede hacerse referencia en forma particular a Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
Los polinucleótidos de acuerdo con la invención tiene utilidad en la producción de los agentes polipeptídicos de acuerdo con la invención, que puede tener lugar in vitro, in vivo o ex vivo. Los polinucleótidos pueden ser utilizados en la síntesis de proteínas recombinantes. Los métodos de expresión de proteína recombinante son bien conocidos en el arte y se discuten adicionalmente más adelante.
Los polinucleótidos o iniciadores de la invención pueden portar una etiqueta de revelado. Las etiquetas adecuadas incluyen radioisótopos por ejemplo 125I, 32Po 35S, etiquetas enzimáticas, u otras etiquetas de proteína por ejemplo biotina. Tales etiquetas pueden ser añadidas a polinucleótidos o iniciadores de la invención y pueden ser detectadas utilizando técnicas ya conocidas.
(c) Vectores, células huésped y Expresión de agentes peptídicos
Los polinucleótidos de la invención pueden ser incorporados en un vector recombinante replicable. El vector puede ser utilizado para replicar al ácido nucleico en una célula huésped compatible. Por lo tanto, los polinucleótidos de la invención pueden ser elaborados por medio de la introducción de un polinucleótido de la invención en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula huésped compatible y cultivando la célula huésped bajo condiciones que producen la replicación del vector.
En un aspecto el vector es un vector de expresión que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica un agente polipeptídico de la invención. Tales vectores de expresión se construyen rutinariamente en el arte de la bilogía molecular y pueden, por ejemplo, involucrar el uso de ADN plasmídico e iniciadores apropiados, promotores, reforzadores y otros elementos, que pueden ser necesariamente, y que se posicionan en la orientación correcta, con el propósito de permitir la expresión de proteína. Otros vectores adecuados serían evidentes para las personas capacitadas en el arte. A modo de ejemplo adicional en este sentido se hace referencia a Sambrook et al. 1989.
En una modalidad, un polinucleótido de la invención o para uso en la invención en un vector está operativamente enlazado a una secuencia de control que es capaz de proveer la expresión de la secuencia de codificación por la célula huésped, es decir el vector es un vector de expresión. El término "operativamente enlazado" se refiere a una yuxtaposición donde los componentes descritos están en una relación que les permite actuar en su forma prevista. Una secuencia reguladora, por ejemplo un promotor, "operativamente enlazado" a una secuencia de codificación está ubicada de tal manera que la expresión de la secuencia de codificación se logra bajo condiciones compatibles con la secuencia reguladora.
Los vectores pueden ser por ejemplo, vectores plásmidos, virus o fagos provistos con un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión de dicho polinucleótido y opcionalmente un regulador del promotor. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables, por ejemplo un gen de resistencia a la ampicilina en el caso de un plásmido bacteriano o un gen de resistencia para un vector de hongos.
Los promotores y otras señales de regulación de la expresión pueden ser seleccionados para que sean compatibles con la célula huésped para la cual se diseña la expresión. Por ejemplo, los promotores de levadura incluyen S. cerevisiae GAL4 y promotores ADH, S. pombe nmt1 y el promotor adh. Los promotores de mamífero incluyen al promotor de metalotioneína que puede ser inducido en respuesta a metales pesados por ejemplo cadmio. También se pueden utilizar promotores virales por ejemplo el promotor de antígeno T grande del SV40 o promotores adenovirus. Todos estos promotores se encuentran disponibles en el arte.
Se pueden utilizar promotores de mamífero, por ejemplo promotores de �-actina. Se pueden utilizar promotores específicos del tejido. También se pueden utilizar promotores virales, por ejemplo la repetición del terminal largo del virus e la leucemia de múrido de Moloney (MMLV LTR), el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV), el promotor del SV40, el promotor IE de citomegalovirus humano (CMV), adenovirus, promotores del HSV (por ejemplo los promotores IE del HSV), o promotores del HPV, particularmente la región reguladora secuencia arriba del HPV (URR). Los promotores virales se encuentran disponibles en el arte.
Los vectores pueden ser utilizados in vitro, por ejemplo para la producción de ADN o ARN o utilizados para transfectar o transformar una célula huésped, por ejemplo, una célula huésped de mamífero.
Los vectores de expresión pueden ser transformados en una célula huésped adecuada para permitir la expresión de un agente polipeptídico de la invención o un componente peptídico del agente de acuerdo con la invención. La célula huésped, transformada o transfectada con un vector de expresión como se describió anteriormente, se cultiva bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido o fragmento, y se recupera el producto de la expresión. El polipéptido puede ser aislado y purificado utilizando métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, se pueden utilizar técnicas de despliegue en fagos. Las células huésped se escogen para ser compatibles con el vector y serán preferiblemente bacterianas. Las células huésped pueden ser también células de un animal no humano, o una planta transformada con un polinucleótido de la invención.
General
Cualquiera de los agentes, polipéptidos, polinucleótidos, vectores, células o anticuerpos de la invención pueden estar presentes en forma sustancialmente aislada. Pueden ser mezclados con portadores o diluyentes que no interferirán con su uso pretendido y aún ser considerados como sustancialmente aislados. También pueden estar en forma sustancialmente purificada, en cuyo caso generalmente incluirán al menos 90%, por ejemplo al menos 95%, 98% o 99% de las proteínas, polinucleótidos, células o masa seca de la preparación.
Cualquiera de los agentes, o anticuerpos de la invención pueden ser marcados, generalmente con una etiqueta detectable adecuada. Por ejemplo, las etiquetas adecuadas incluyen etiquetas radioactivas, etiquetas de enzimas (por ejemplo fosfatasa alcalina y peroxidasa por ejemplo HRP), etiquetas químicas por ejemplo biotina (que puede ser detectada por avidina o estreptavidina conjugada con peroxidasa), lantánidos por ejemplo europio y etiquetas fluorescentes (por ejemplo fluoresceína y rodamina), y etiquetas luminiscentes o quimioluminiscentes (por ejemplo éster de acridinio, luminol), oro (u otro metal coloidal), un colorante o una partícula. Las etiquetas de enzimas pueden ser detectadas utilizando un sistema con base en quimioluminiscencia o cromogénico.
Tratamiento de diagnóstico y monitoreo
Los presentes métodos son útiles para evaluar la salud cardíaca en un individuo. En particular, se pueden utilizar los métodos para detectar y evaluar insuficiencia cardíaca. Un ejemplo particular de una enfermedad cardíaca que puede ser manejada utilizando los presentes métodos es la insuficiencia cardíaca congestiva.
La insuficiencia cardíaca es una condición clínica caracterizada por la inhabilidad del corazón para generar un gasto cardiaco suficiente para satisfacer las demandas del organismo lo cual resulta en una activación de los sistemas hormonales ANP y BNP. La activación del sistema ANP está inicialmente asociada principalmente con una sobrecarga atrial mientras que la activación del sistema BNP es ante todo sugerente de sobrecarga ventricular. La inactivación de los sistemas es un resultado de cualquiera de los sistemas reguladores propios del paciente o el uso de fármacos terapéuticos para el tratamiento de insuficiencia cardíaca.
Como anteriormente, los presentes métodos, pueden ser utilizados por medio de la determinación de los niveles combinados de los péptidos derivados de proANP y proBNP en una muestra con relación a un nivel de un péptido de referencia, para determinar la activación o inactivación tanto del sistema hormonal ANP como del BNP en un individuo. Por lo tanto, los presentes métodos pueden ser utilizados para evaluar el funcionamiento de los sistemas cardíacos. Los métodos de la invención son útiles para seleccionar y descartar, evaluar la severidad, evaluar el pronóstico, hacer seguimiento al tratamiento y dirigir el tratamiento de una enfermedad cardíaca por ejemplo insuficiencia cardíaca en pacientes con sobrecarga de volumen o de presión cardíaca.
Por ejemplo, los métodos pueden ser utilizados para diagnóstico de una enfermedad cardíaca. Los métodos pueden ser utilizados para seleccionar individuos, para evaluar la severidad de una condición cardíaca, para evaluar el pronóstico o para estimar la susceptibilidad, por ejemplo a un fallo cardíaco. Los presentes métodos pueden ser empleados también como un seguimiento al tratamiento para una enfermedad cardíaca y para evaluar, monitorear y dirigir el tratamiento de una enfermedad cardíaca. Por medio del monitoreo de la activación o inactivación de los sistemas ANP y BNP de acuerdo con los presentes métodos, es posible evaluar los efectos del tratamiento en pacientes que padecen una enfermedad cardíaca, por ejemplo terapia farmacológica. Por lo tanto los presentes métodos pueden ser utilizados para evaluar la sensibilidad del paciente a una terapia particular y para mejorar el tratamiento que se administra.
Los presentes métodos pueden ser utilizados para evaluar la susceptibilidad a una enfermedad cardíaca. Los individuos pueden ser entonces aconsejados sobre cambios en el estilo de vida que pueden ser requeridos para disminuir la probabilidad de desarrollar o disminuir la severidad de los síntomas asociados con una enfermedad cardíaca por ejemplo insuficiencia cardíaca. Los individuos pueden ser tratados profilácticamente para el mismo propósito.
Kits de diagnóstico
La invención también provee un kit de diagnóstico de acuerdo a la reivindicación 35. El kit es adecuado para uso en los presentes métodos y es en general útil para el diagnóstico y evaluación de la condición cardíaca como se describió anteriormente.
Los contenidos del kit serán adecuados para el formato de análisis para el cual está diseñado el kit. Típicamente el kit incluye una primera sustancia de enlazamiento como se define en la reivindicación 1 (I), y opcionalmente medios para detectar complejos de enlazamiento formados por la primera sustancia de enlazamiento, también como se describe aquí. Un kit puede incluir adicionalmente un agente de acuerdo con la invención, siendo el agente capaz de enlazarse con la primera sustancia de enlazamiento en el kit como se define en la reivindicación 1 (II). La primera sustancia de enlazamiento y/o el agente pueden estar marcados.
En general un kit puede incluir otros reactivos o componentes para uso en el ensayo particular, por ejemplo amortiguadores, precipitadores, medios de etiquetado y/o de detección. El kit puede incluir instrucciones, por ejemplo un inserto dentro del empaque que instruye al usuario del kit sobre el contenido del mismo y el formato de análisis.
Por lo tanto, un kit para un ensayo competitivo puede incluir:
- (a)
- una primera sustancia de enlazamiento;
- (b)
- un agente etiquetado (NT-proXNP, proANP o XNP);
- (c)
- un estándar (NT-proXNP, proXNP o XNP); y
- (d)
- otros materiales usuales de acuerdo con el sistema de detección, por ejemplo precipitadores, amortiguadores etc.
Un kit para un ensayo tipo sándwich puede contener:
- (a)
- una primera sustancia de enlazamiento;
- (b)
- una segunda sustancia de enlazamiento marcada;
- (c)
- un estándar (NT-proXNP, proXNP, XNP);
- (c)
- otros materiales usuales de acuerdo con el sistema de detección.
Los siguientes Ejemplos ilustran la invención. A menos que se indique otra cosa, los métodos utilizados son técnicas estándar de bioquímica y de biología molecular. Los ejemplos de libros de texto adecuados de metodología general incluyen Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) y Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology (1995) John Wiley y Sons Inc.
Ejemplo I
Expresión y purificación de NT-proXNP recombinante
Los nucleótidos que codifican los aminoácidos 1 -37 de NT-proBNP humano y aquellos que codifican los aminoácidos 29 -98 de NT-proANP humano se amplifican por medio de PCR de transcripción inversa de ARN atrial humano utilizando iniciadores oligonucleótidos. El iniciador 5’ para amplificación de NT-proBNP contiene el sitio de escisión para la enzima de restricción BamHI (5’-GCGGATCCCACCCGCTGGGCAGCCCCG-3’ SEQ ID NO: 28) y el iniciador 3’ para XbaI (5’-GCTCTAGAGGATGTCTGCTCCACC-3’ SEQ ID NO: 29). El iniciador 5’ para amplificación de NT-proANP tiene enlazador XbaI (5’-GCTCTAGAGAAGATGAGGTCGTGC-3’ SEQ ID NO: 30) y el iniciador 3’ tiene al enlazador EcoRI (5’-GCGAATTCTCACCGAGGGGCAGTGAGC-3’ SEQ ID NO: 31). Además, el amplicón de NT-proANP contiene un codón de terminación en el marco (TGA) en su extremo 3’ precediendo al sitio de escisión de EcoRI. La otra versión del amplicón de NT-proBNP contiene un codón en el marco para Tyr en su terminal 5’ después de la secuencia enlazadora de BamHI (5’-GCGGATCCTACCACCCGCTGGGCAG-3’ SEQ ID NO: 32). Los productos de la RT-PCR se purifican por medio de electroforesis en agarosa, se escinden con XbaIy BamHI o EcoRI y se subclonan de extremo a extremo (NT-proBNP -> NT-proANP) en el sitio BamHI/EcoRI del vector pGEX4T-1 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). Las secuencias de nucleótidos y los marcos de lectura de las construcciones se confirman por medio de secuenciación.
La expresión y purificación por afinidad de las proteínas de GST se lleva a cabo de acuerdo con el siguiente procedimiento. Un cultivo durante la noche de E. coli, transformado con un plásmido recombinante, se diluye 1:100 en 2xYTA y se cultiva a 37°C hasta que la OD a 660 nm alcanza 0,6. Se añade isopropil-1-tio-D-galactopiranósido (IPTG) hasta una concentración final de 0,1 mM y se incuba adicionalmente el cultivo durante 1 -2 h. Las células bacterianas se recolectan por medio de centrifugación (7000 g durante 10 min a +4°C), se resuspende en PBS (50 µl/ml del cultivo) y se sonica. El lisado celular se clarifica a 7000 g durante 15 min. Se aplica el sobrenadante a una columna de agarosa glutationa (Sigma, Saint Louis, MO, EUA) y se lava tres veces con PBS. La proteína de fusión se eluye con glutationa 10 mM en Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 y se almacena en alícuotas a 20°C. Las muestras se separan por SDS-PAGE (acrilamida al 12%). Se pueden utilizar tanto vectores de expresión procariotas como eucariotas. Por lo tanto, se puede producir el péptido completo o al menos una porción de dicho péptido o proteína en células procariotas o eucariotas.
Los péptidos recombinantes se liberan del compañero de fusión por medio de tratamiento con trombina (Amersham Pharmacia Biotech) a temperatura ambiente durante 1 h (1U /100 µg de proteína). Se purifican los péptidos por medio de HPLC en fase reversa utilizando una columna C4 Vydac de 4,6 x 150 mm. Se eluye la columna con un gradiente lineal de 20 -48 % de acetonitrilo durante 40 min en ácido trifluoroacético acuoso. La tasa de elución es de 1 ml/min y se mide la absorbancia a 200 -280 nm durante la HPLC para monitorear la pureza de los productos.
Un ejemplo del perfil de HPLC del producto purificado que consiste de (desde el terminal NH2 hasta el terminal CO2H) proBNP1-37 humano, un espaciador corto, serina y arginina, y proANP29-98 humano, se presenta en la Figura
1. Dos aminoácidos adicionales, glicina y serina, originados a partir de GST se dejen en el terminal N del péptido como un aducto.
Síntesis química de NT-proXNP
Se ensambló la combinación epítopo NT-proXNP5 que incluye las secuencias (desde el terminal NH2 hasta el terminal CO2H) proBNP10-29 humanas, espaciador Cys y proANP60-80 humana con un Sintetizador de Péptidos utilizando química Fmoc. Alternativamente se ensambló la combinación epítopo péptido NT-proXNP1 que incluye (desde el terminal NH2 hasta el terminal CO2H) las secuencias proBNP15-24 humana, espaciador Gly-Lys-Tyr-Gly y proANP82-96 humana. Se escindió el producto a partir de la resina HMP con 95 % de ácido trifluoroacético/2,5 % de H2O, 2,5 % de tri-isopropilsilano, precipitado con dietil éter, se seca y desaliniza sobre Sefadex G-15 en ácido acético al 30 %. Se purificó el péptido por medio de HPLC en fase reversa en un preparado. Un cartucho C18 RCM NovaPak (2,5 x 10 cm) con un gradiente lineal de acetonitrilo en ácido trifluoroacético acuoso al 0,1 %. Se determinó la pureza por medio de HPLC en fase reversa en condiciones de elución con diferente selectividad. Se confirmó la identidad del péptido por medio del análisis de aminoácidos o espectrometría de masas MALDI-TOF y mapeo de péptidos.
Inmunoensayo de NT-proXNP
Se preparó la sustancia de enlazamiento a partir de anticuerpos de cabra obtenidos utilizando como inmunógeno proteína de fusión purificada por afinidad de GST/NT-proANP20-80 y NT-proBNP10-29-TBG o proteína de fusión GST de NT-pro-BNP1-37 y NTproANP29-98. El último de los antígenos peptídicos fue preparado con los métodos descritos en el Ejemplo 1 y contiene proBNP1-37 humano, espaciador Ser-Arg, proANP29-98 humano y aducto Gly-Ser. Alternativamente, se preparó otro antígeno peptídico con los métodos descritos en el Ejemplo 2 que contiene (desde el terminal NH2 hasta el terminal CO2H) las secuencias de proBNP10-29 humano, espaciador de cisteína a partir del cual fue acoplado a la tiroglobulina bovina (TBG) antes de la inmunización y proANP60-80 humano. Las cabras fueron inyectadas en múltiples sitios en el lomo con 1 -1,5 mg de inmunógeno en 1 ml de NaCl al 0,9 % emulsionado en un volumen igual de adyuvante completo de Freund. Se suministraron refuerzos de 0,5 mg en adyuvante incompleto de Freund 2 -4 veces en intervalos de 2 -3 semanas y se retira sangre 14 días después de las últimas inyecciones. Se escogieron los antisueros de acuerdo con el título del enlazamiento del péptido o agente proteico marcado con yodo radiactivo de la invención (ver más adelante), así como la sensibilidad y especificidad con relación a péptidos relacionados y al péptido o agente proteico de la invención. Cualquier modificación del péptido o agente proteico de la invención o cualquier fragmento o derivado del mismo puede ser utilizado también con propósitos de inmunización para producir ya sea anticuerpos monoclonales o policlonales.
NT-proBNP1-37/NT-proANP29-98 recombinante (1,5 µg), producido como se describe en el Ejemplo 1, fue marcado con yodo radioactivo utilizando 0,5 mCi de Na125I en presencia de 10 µg de cloramina-T en amortiguador de fosfato 0,5 M, pH 7,5 durante 60 s, seguido por la adición de 10 µg de disulfito de sodio. La mezcla fue desalinizada por medio de filtración en gel de Sefadex G-25 y purificada por HPLC en fase reversa en una columna C18 Symmetry y un gradiente lineal de 20 % a 50 % de acetonitrilo durante 30 min en ácido trifluoroacético acuoso con una velocidad de flujo de 1 ml/min. Se recolectaron fracciones de 1 ml y se monitoreó la radioactividad en un contador Multi-Gamma (Wallac, Turku, Finlandia).
NT-proBNP1-37/NT-proANP29-98 recombinante, producido como se describe en el Ejemplo 1, fue utilizado también como el calibrador del ensayo en el inmunoensayo de NT-proXNP. El amortiguador del ensayo utilizado para todas las diluciones consiste de fosfato ácido de sodio 0,04 M, fosfato dihidrógeno de sodio 0,01 M, NaCl 0,1 M, gelatina al 0,1 %, Triton X-100 al 0,05 %, pH 7,4). Se incubaron muestras de suero o plasma en duplicados de 25 µl con 100 µl de antisuero y 100 µl de solución trazadora (que contiene aproximadamente 8 000 cpm de péptido yodado) durante 16 -24 h a +4°C. Se realizó la calibración por medio de incubación de los calibradores (0,08 -8 nmol l-1) con la misma cantidad y concentración de antisuero, trazador y anti-antisuero durante el mismo período de tiempo anterior. Se determinó la cantidad de antisuero analizada para enlazar 40 -50% del trazador cuando no había competidor presente, con el propósito de garantizar suficiente competición en el enlazamiento.
La Figura 2b muestra el desarrollo de títulos de anticuerpo en la inmunización de una cabra utilizando la proteína de fusión GST de NTproBNP1-37/NT-proANP29-98 (que contiene la SEQ ID NO: 14) como inmunógeno, títulos después del 1er, 3ero y 4to refuerzo en RIA de NT-proANP1-98 y NT-proBNP1-76. La Figura 2b muestra que, por ejemplo, una sustancia de enlazamiento preparada en una cabra, obtenida por medio del uso de proteína de fusión GSTde NT-proBNP1-37/NT-proANP29-48 (que contiene la SEQ ID NO: 14) como inmunógeno, típicamente en dilución de 1:50.000-1:60.000 fue adecuado para 40 -50% del enlazamiento y enlazamiento simultáneo de NT-proANP (SEQ ID NO: 3) y NT-proBNP (SEQ ID NO: 6) demostrado también en radioinmunoensayos separados de NT-proANP1-98 y NTproBNP1-76. Se produjo una sustancia similar de enlazamiento en la inmunización de una cabra utilizando conjugado de TBG de NTproBNP10-29/NT-proANP60-80, (que contiene la SEQ ID NO: 18) como inmunógeno. Una dilución típica en un ensayo competitivo de NT-proXNP estaba en el rango de 1:10.000 a 1:15.000.
Se separó NT-proXNP enlazado y libre por medio de precipitación con IgG anticabra de asno en 0,5 ml de polietilén glicol 6000 al 8%, que contenía como portador suero normal de cabra (1 µl). Después de centrifugación, se midió la radioactividad del precipitado. Un ejemplo de una curva de referencia obtenida por medio de este tipo de análisis se presenta en la Figura 2a.
La Figura 2a muestra una curva de enlazamiento competitivo para un inmunoensayo de NT-proXNP. El ensayo utiliza NT-proBNP1-37/NT-proANP29-98 recombinante como calibrador y trazador y sustancia de enlazamiento con base en anticuerpo policlonal de cabra para reconocer NT-proXNP, NT-proANP y NT-proBNP simultáneamente. El eje X describe la cantidad de calibrador añadida y el eje Y Enlazado/Enlazado sin calibrador añadido.
El inmunoensayo de NT-proXNP descrito en el Ejemplo 3 fue utilizado para determinar los niveles en suero de NTproXNP en 700 pacientes con trastornos cardíacos. Los resultados se muestran en la Figure 3. Los niveles de NTproXNP se correlacionan de manera altamente significativa con los niveles de NT-proANP y NT-proBNP medidos a partir de las mismas muestras por medio de radioinmunoensayos internos separados de NT-proANP1-98 yNT-proBNP1-76.
Los métodos del Ejemplo 3 fueron utilizados para el análisis de los niveles en suero de NT-proXNP, en 500 pacientes cardíacos clasificados de acuerdo con la escala de la New York Heart Association (NYHA). Los resultados se muestran en la Figura 4. Los niveles en suero de NT-proANP y NT-proBNP medidos por medio de radioinmunoensayos internos separados a partir de las mismas muestras se muestran como referencia como una medida de activación de los sistemas ANP y BNP.
Los métodos del Ejemplo 3 fueron utilizados para analizar los niveles en plasma de NT-proXNP en pacientes que
5 sufren de insuficiencia cardíaca y estos fueron correlacionados con efecto positivo de terapia farmacológica en los pacientes. Los resultados se muestran en la Figura 5. Los niveles en suero de NT-proANP y NT-proBNP medidos a partir de las mismas muestras por medio de radioinmunoensayos internos separados se muestran como referencia. Pacientes (n = 11) que sufren de insuficiencia cardíaca (clase II-III estable de la NYHA) fueron tratados por medio de infusión intravenosa de un inodilatador durante 24 horas. Se midió el gasto cardíaco (CO) como ml/min con
10 ecocardiografía. Los niveles de NT-proANP, NT-proBNP y NT-proXNP fueron analizados antes y a las 24 horas del inicio de la administración del fármaco. La sensibilidad relativa para detectar la respuesta al tratamiento se determinó en los niveles límite de un incremento del 10 % en CO, como se determinó con ecocardiografía y disminuyó un 20 % en NT-ProANP y NT-ProBNP y NT-proXNP como una medición de la inactivación de sistemas ANP y BNP. NTproXNP excedió el límite en todos los 11 casos, mientras que NT-proANP y NT-proBNP y CO excluyeron el límite en
15 9 de 11 casos.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> ORION DIAGNOSTICA OY
<120> ASSAY
<130> N88837A JHS
<141> 2004-06-28
<150> GB 0315291.5
<151> 2003-06-30
<160> 36 10 <170> PatentIn versión 3.0
<210> 1
<211> 126
<212> PRT
<213> Homo sapiens
15 <400> 1
<210> 2
<211> 28
<212> PRT 20 <213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
<210> 4
<211> 108
10 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
<210> 5
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
<210> 6
<211> 76
<212> PRT 10 <213> Homo sapiens
<400> 6
<210> 7
15 <211> 378
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 7
20 <210> 8 <211> 84
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 8
<210> 9
<211> 294
<212> ADN
<213> Homo sapiens
10 <400> 9
<210> 10
<211> 324
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 10
<210> 11
20 <211> 96
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 11
<210> 12
<211> 228
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 12
<210> 13
<211> 25
<212> PRT 10 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia de aminoácidos de un agente de acuerdo con la invención NT-proXNP1
<400> 13
15 <210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> secuencia de aminoácidos de un agente de acuerdo con la invención NT-proXNP2
<400> 14 <210> 15
<211> 81
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia de aminoácidos de un agente de acuerdo con la invención NT-proXNP3
<400> 15
10 <210> 16
<211> 4
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> secuencia de aminoácidos del espaciador
<400> 16
<210> 17 <211> 174
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia de aminoácidos de un agente de acuerdo con la invención NT-proXNP4
<400> 17
<210> 18
10 <211> 41
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia de aminoácidos de un agente de acuerdo con la invención NT-proXNP5
15 <400> 18 <210> 19
<211> 234
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia de aminoácidos de un agente de acuerdo con la invención NT-proXNP6
<400> 19
<210> 20 <211> 31
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia de aminoácidos de un agente de acuerdo con la invención NT-proXNP7
<400> 20
<210> 21
<211> 75
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia de nucleótidos que codifica NT-proXNP1
<400> 21
<210> 22
<211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia de nucleótidos que codifica NT-proXNP2
<400> 22
<210> 23
<211> 241 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia de nucleótidos que codifica NT-proXNP3
<400> 23
<210> 24
<211> 522
<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia de nucleótidos que codifica NT-proXNP4
<400> 24
15 <210> 25
<211> 123
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> secuencia de nucleótidos que codifica NT-proNXP5
<400> 25
<210> 26 <211> 702
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia de nucleótidos que codifica proXNP6
<400> 26
<210> 27
<211> 93
10 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia de nucleótidos que codifica XNP7
<400> 27
<210> 28
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> secuencia del iniciador
<400> 28 gcggatccca cccgctgggc agccccg 27
<210> 29
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia del iniciador
<400> 29 gctctagagg atgtctgctc cacc
<210> 30
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia del iniciador
<400> 30 gctctagaga agatgaggtc gtgc
<210> 31
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia del iniciador
<400> 31 gcgaattctc accgaggggc agtgagc
<210> 32
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia del iniciador
<400> 32 gcggatccta ccacccgctg ggcag
25 <210> 33
<211> 1061
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
<210> 34
<211> 430
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
<210> 35
<211> 1047
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
<210> 36
<211> 541
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 36
REFERENCIAS
Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215: 403 -410 Altschul et al., J. Mol. Evol. (1993) 36: 290 -300 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995) John Wiley & Sons Inc Daly C et al.: Natriuretic peptides in the diagnosis of heart disease -First amongst equals? In J Cardiol 2002; 84: 107
- -
- 13.
De Lemos J. A. et al.: The prognostic value of B-type natriuretic peptide in patients with acute coronary syndromes. N Engl J Med 2001; 345: 1014 -21. Devereux et al., Nucleic Acids Research (1984) 12: 387 -395 Drewett J. G., Garbers D. L.: The family of guanylyl cyclase receptors and their ligands. Endocrine Rev 1994; 15: 135
- -
- 62.
Dzimiri N, Moorji A, Afrane B, Al-Halees Z. Differential regulation of atrial and brain natruiretic peptides and its implications for the management of left ventricular volume overload. Eur J Clin Invest 2002; 32: 563 -9. Harlow and Lane "Antibidies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY
(1988) Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 10915 -10919 Kannel W. B. et al.: Changing epidemiological features of heart failure. Br Heart J 1994; 72: S3 -S9 Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 5873 -5877 Köhler G, Milstein C: Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975;
256: 495 -7.
McDonagh T. A. et al.: Symptomatic and asymptomatic left-ventricular systolic dysfunction in an urban population. Lancet 1997; 350: 829 -33.
Maddox et al., J. Exp. Med. (1993) 158: 1211 -1226
Misono K, Sivasubramanian N, Berkner K, Xhang X. Expression and purification of the extracellular ligand-binding domain of the atrial natriuretic peptide (ANP) receptor: monovalent binding with ANP induces 2:2 complexes. Biochemistry 1999; 38: 516 -23
Omland T et al.: N-terminal pro-B-type natriuretic peptide and long-term mortality in acute in coronary syndromes. Circulation 2002; 106: 2913 -8.
Remes M, Miettinen H, Reunanen A, Pyörälä K. Validity of clinical diagnosis of heat failure in primary health care. Eur Heart J 1991; 12: 315 -21.
Sagnella G. A.: Measurement and significance of circulating natriuretic peptides incardiovascular diseases. Clin Sci 1998; 95: 519 -29.
Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989)
Skerra A, Plückthun A: Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli. Science 1988; 240: 1038 -41.
Talwar S et al.: Towards a blood test for heart failure: the potential use of circulating natriuretic peptides. J Clin Pharmacol 2000; 50: 15 -20.
Task Force for the Diagnosis and Treatment of Chronic Heart Failure, European Society of Troughton RW et al.: Treatment of heart failure guided by plasma aminoterminal brain natriuretic peptide (N-BNP) concentrations. Lancet 2000; 355: 1126 -30.
Yasue H et al.: Localization and mechanism of secretion of B-type natriuretic peptide in comparison with those of Atype natriuretic peptide in normal subjects and patients with heart failure. Circulation 1994; 90: 195 -203.
Yoshimura M et al.: Different secretion patterns of atrial natriuretic peptide and brain natriuretic peptide in patients with congestive heart failure. Circulation 1993; 87: 464 -469.
Claims (39)
- REIVINDICACIONES1. Un método in vitro para determinar la activación o inactivación del sistema hormonal del péptido natriurético atrial (ANP) y del péptido natriurético cerebral (BNP), comprendiendo el método detectar en forma simultánea en una sola lectura o resultado la presencia o la cantidad de prohormonas del péptido natriurético atrial y cerebral (proANP y proBNP) o fragmentos de las mismas en una muestra, dicho método comprendiendo:
- (I)
- poner en contacto la muestra con una primera sustancia de enlazamiento bi u oligo-específica que es capaz de enlazarse tanto con:
- (a)
- (i)
- proANP (SEQ ID NO: 1), ANP (SEQ ID NO: 2) o NT-proANP (SEQ ID NO: 3);
- (ii)
- una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i); o
(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; y- (b)
- (i)
- pro-BNP (SEQ ID NO: 4), BNP (SEQ ID NO: 5) o NT-proBNP (SEQ ID NO: 6);
- (ii)
- una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i); o
(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; o- (II)
- poner en contacto la muestra con -un agente que contiene:
- (a)
- (i)
- proANP (SEQ ID NO: 1), ANP (SEQ ID NO: 2) o NT-proANP (SEQ ID NO: 3);
- (ii)
- una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i); o
(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; y- (b)
- (i)
- pro-BNP (SEQ ID NO: 4), BNP (SEQ ID NO: 5) o NT-proBNP (SEQ ID NO: 6);
- (ii)
- una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i); o
(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; y -una primera sustancia de enlazamiento que es capaz de enlazarse con:- (a)
- (i)
- proANP (SEQ ID NO: 1), ANP (SEQ ID NO: 2) o NT-proANP (SEQ ID NO: 3);
- (ii)
- una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i); o
(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; y- (b)
- (i)
- pro-BNP (SEQ ID NO: 4), BNP (SEQ ID NO. 5) o NT-proBNP (SEQ ID NO: 6);
- (ii)
- una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i); o
(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; y(c) el agente. - 2. Un método de acuerdo con la reivindicación1 (II) donde la primera sustancia de enlazamiento comprende:
- (a)
- una sustancia de enlazamiento bi u oligo-específica; o
- (b)
- una mezcla de sustancias de enlazamiento mono-específicas.
- 3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 donde la primera sustancia de enlazamiento comprende:
- (a)
- receptor natriurético GC-A (SEQ ID NO: 33);
- (b)
- secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (a); o
- (c)
- un fragmento de (a) o (b) que tiene al menos 400 aminoácidos de longitud.
-
- 4.
- Un método de acuerdo con la reivindicación 3 donde la primera sustancia de enlazamiento comprende un dominio de enlazamiento extracelular del receptor natriurético GC-A (SEQ ID NO: 34).
-
- 5.
- Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 donde la primera sustancia de enlazamiento comprende un anticuerpo o un fragmento o derivado del mismo.
-
- 6.
- Un método de acuerdo con la reivindicación 5 donde el anticuerpo comprende un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo oligoclonal, un anticuerpo bifuncional o un anticuerpo policlonal de reacción cruzada.
-
- 7.
- Un método de acuerdo con la reivindicación 1(II) o cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6 que depende de la reivindicación 1(II) donde en el agente, (a)(i) es la SEQ ID NO: 3 y (b)(i) es la SEQ ID NO: 6 o (a)(i) es la SEQ ID NO: 2 y (b)(i) es la SEQ ID NO: 5.
-
- 8.
- Un método de acuerdo con la reivindicación 1(II) o cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6 que depende de la reivindicación 1(II) donde el agente comprende o consiste de:
- (a)
- proBNP15-24 y proANP82-96;
- (b)
- proBNP1-37 y proANP29-98;
- (c)
- proBNP10-29 y proANP20-80;
- (d)
- proBNP1-76 y proANP1-98;
- (e)
- proBNP10-29 y proANP60-80;
- (f)
- proBNP1-108 y proANP1-126;o
- (g)
- proBNP77-92 y proANP112-126.
-
- 9.
- Un método de acuerdo con la reivindicación 1(II) o cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8 que depende de la reivindicación 1(II) donde el agente es un polipéptido.
-
- 10.
- A método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la primera sustancia de enlazamiento y/o el agente están:
- (a)
- marcados con una etiqueta detectable; y/o
- (b)
- inmovilizados.
-
- 11.
- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que adicionalmente comprende poner en contacto la muestra con una segunda sustancia de enlazamiento que es capaz de enlazarse con la primera sustancia de enlazamiento.
-
- 12.
- Un método de acuerdo con la reivindicación 11 donde la segunda sustancia de enlazamiento está:
- (a)
- marcada con una etiqueta detectable; y/o
- (b)
- inmovilizada.
-
- 13.
- Un método de acuerdo con la reivindicación 11 donde la segunda sustancia de enlazamiento provoca la precipitación de la primera sustancia de enlazamiento y de cualquier péptido que esté enlazado a ella.
-
- 14.
- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende un inmunoensayo.
-
- 15.
- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que permite diagnosticar insuficiencia cardíaca o monitorear el tratamiento de una condición cardíaca.
-
- 16.
- Un agente que es un polipéptido que comprende:
- (a)
- (i)
- proANP (SEQ ID NO: 1), ANP (SEQ ID NO: 2) o NT-proANP (SEQ ID NO: 3);
- (ii)
- una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i); o
(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; y- (b)
- (i)
- pro-BNP (SEQ ID NO: 4), BNP (SEQ ID NO: 5), NT-proBNP (SEQ ID NO: 6);
- (ii)
- una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i); o
(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud. - 17. Un agente de acuerdo con la reivindicación 16 que comprende o consiste de:
- (a)
- proBNP15-24 y proANP82-96;
- (b)
- proBNP1-37 y proANP29-98;
- (c)
- proBNP10-29 y proANP20-80;
- (d)
- proBNP1-76 y proANP1-98;
- (e)
- proBNP10-29 y proANP60-80;
- (f)
- proBNP1-108 y proANP1-126;o
- (g)
- proBNP77-92 y proANP112-126.
-
- 18.
- Un agente de acuerdo con reivindicación 17 que comprende cualquiera de las SEQ ID Nos: 13, 14, 15, 17, 18, 19 ó 20.
-
- 19.
- Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 que está marcado con una etiqueta detectable.
-
- 20.
- A polinucleótido que comprende la secuencia que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19 o una secuencia que es complementaria a la secuencia de codificación.
-
- 21.
- Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 20 que comprende:
- (a)
- (i)
- las SEQ ID Nos 7, 8 ó 9;
- (ii)
- una secuencia complementaria a (i);
(iii) una secuencia que hibrida bajo condiciones rigurosas a (i) o (ii);- (iv)
- una secuencia que se degenerada como resultado del código genético a (i), (ii) o (iii);
- (v)
- una secuencia que tiene al menos 70% de identidad con cualquiera de las secuencias en (i) hasta (iv); o
- (vi)
- un fragmento hasta de 40 nucleótidos de longitud de cualquiera de las secuencias en (i) hasta (v); y
- (b)
- (i)
- las SEQ ID Nos 10, 11 ó 12;
- (ii)
- una secuencia complementaria a (i);
(iii) una secuencia que hibrida bajo condiciones rigurosas a (i) o (ii);- (iv)
- una secuencia que se degenerada como resultado del código genético a (i), (ii) o (iii);
- (v)
- una secuencia que tiene al menos 70% de identidad con cualquiera de las secuencia en (i) hasta (iv); o
- (vi)
- un fragmento hasta de 40 nucleótidos de longitud de cualquiera de las secuencias en (i) hasta (v).
-
- 22.
- Un vector de expresión que contiene un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 20 ó 21.
-
- 23.
- Una célula huésped que comprende un polinucleótido de acuerdo con reivindicación 20 ó 21 o un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 22.
-
- 24.
- Un proceso para producir un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19 cuyo proceso comprende:
- (a)
- cultivar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 23 bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido; y opcionalmente
- (b)
- recuperar el polipéptido expresado.
-
- 25.
- Un proceso para producir un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19 que comprende síntesis química.
-
- 26.
- Un anticuerpo bi u oligo-específico, fragmento o derivado del mismo que es capaz de enlazarse tanto con:
- (a)
- (i)
- proANP SEQ ID NO: 1), ANP (SEQ ID NO: 2) o NT-proANP (SEQ ID NO: 3);
- (ii)
- una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i); o
(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; como con- (b)
- (i)
- pro-BNP (SEQ ID NO: 4), BNP (SEQ ID NO: 5) o NT-proBNP (SEQ ID NO: 6);
- (ii)
- una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i); o
(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud. -
- 27.
- Un anticuerpo, fragmento o derivado de acuerdo con la reivindicación 26 que está marcado con una etiqueta detectable.
-
- 28.
- Un proceso para elaborar un anticuerpo como se define en la reivindicación 26 ó 27 que comprende el cultivo de una célula que expresa al anticuerpo y opcionalmente purificar el anticuerpo de la célula.
-
- 29.
- Un proceso de acuerdo con la reivindicación 28 en el cual la célula es una que puede ser obtenida por medio de la administración de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19 a un mamífero, la extracción de células B del mamífero y seleccionar una célula de estas con base en la habilidad para expresar un anticuerpo con la especificidad del anticuerpo de la reivindicación 26.
-
- 30.
- Un proceso de acuerdo con la reivindicación 28 en el cual la célula es recombinante para un polinucleótido que expresa al anticuerpo.
-
- 31.
- Un soporte sólido que comprende un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 26 ó 27 o un agente de acuerdo con la reivindicación 16 ó 17.
-
- 32.
- Un soporte sólido de acuerdo con la reivindicación 31, que es una partícula, barra, lámina o placa de microtitulación.
-
- 33.
- Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 20 ó 21 o un anticuerpo, fragmento o derivado del mismo de acuerdo con la reivindicación 26 ó 27 para uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal por medio del diagnóstico de insuficiencia cardíaca o el monitoreo del tratamiento de insuficiencia cardíaca.
-
- 34.
- El uso de una primera sustancia de enlazamiento como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 20 ó 21 o un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 26 ó 27 para la fabricación de un reactivo para el diagnóstico de insuficiencia cardíaca y/o el monitoreo del tratamiento de insuficiencia cardíaca.
5 35. un kit de diagnóstico que comprende:- (a)
- una primera sustancia de enlazamiento como se define en la reivindicación 1 (I); o
- (b)
- una primera sustancia de enlazamiento y un agente como se define en la reivindicación 1(II);
donde opcionalmente la sustancia de enlazamiento y/o el agente está etiquetado. - 36. Un kit de acuerdo con la reivindicación 35 donde la primera sustancia de enlazamiento es como se define en10 cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, y/o está presente sobre un soporte sólido de acuerdo con la reivindicación 31 ó 32.
- 37. Un kit de acuerdo con la reivindicación 35 ó 36 donde el agente es como se define en las reivindicaciones 16 a
- 19.
- 38. El uso de una primera sustancia de enlazamiento como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un15 agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 20 ó 21, un anticuerpo, fragmento o derivado de acuerdo con la reivindicación 26 ó 27, un soporte sólido de acuerdo con la reivindicación 31 ó 32 o un kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37 en un método in vitro para el diagnóstico de insuficiencia cardíaca y/o el monitoreo del tratamiento de insuficiencia cardíaca.
- 39. El uso de acuerdo con la reivindicación 38 que comprende un método como se define en cualquiera de las 20 reivindicaciones 1 a 15.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB0315291A GB2403533A (en) | 2003-06-30 | 2003-06-30 | Atrial natriuretic peptide and brain natriuretic peptide and assays and uses thereof |
| GB0315291 | 2003-06-30 | ||
| PCT/EP2004/006971 WO2005003764A2 (en) | 2003-06-30 | 2004-06-28 | Assay for detecting atrial and brain natriuretic peptide prohormones |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2377122T3 true ES2377122T3 (es) | 2012-03-22 |
Family
ID=27676371
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES04740371T Expired - Lifetime ES2377122T3 (es) | 2003-06-30 | 2004-06-28 | Ensayo para detectar feromonas peptídicas natriuréticas auriculares y cerebrales |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US8283123B2 (es) |
| EP (1) | EP1664769B1 (es) |
| JP (1) | JP4741485B2 (es) |
| AT (1) | ATE538389T1 (es) |
| AU (1) | AU2004254028B2 (es) |
| CA (1) | CA2530623C (es) |
| DK (1) | DK1664769T3 (es) |
| ES (1) | ES2377122T3 (es) |
| GB (1) | GB2403533A (es) |
| NO (1) | NO339026B1 (es) |
| PL (1) | PL1664769T3 (es) |
| PT (1) | PT1664769E (es) |
| SI (1) | SI1664769T1 (es) |
| WO (1) | WO2005003764A2 (es) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1731910A1 (en) * | 2005-06-07 | 2006-12-13 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Use of NT-proANP and NT-proBNP for diagnosing cardiac diseases |
| WO2007003594A1 (en) * | 2005-07-01 | 2007-01-11 | Solvay Pharmaceuticals Gmbh | Screening methods for inhibitors of the metalloprotease meprin |
| BRPI0715126B8 (pt) * | 2006-08-04 | 2021-07-27 | Medizinische Hochschule Hannover | métodos para avaliação do risco de intervenções cardíacas e usos à base de gdf-15 |
| ATE449966T1 (de) | 2006-09-15 | 2009-12-15 | Hoffmann La Roche | Biochemische marker für akute lungenembolie |
| EP2180322A1 (en) * | 2008-10-22 | 2010-04-28 | BRAHMS Aktiengesellschaft | Prognostic biomarkers for the progression of primary chronic kidney disease |
| CA2745288A1 (en) | 2008-12-03 | 2010-06-10 | Alisa Kabcenell | Antibodies for guanylyl cyclase receptors |
| JP5753159B2 (ja) * | 2009-05-05 | 2015-07-22 | ベー．エル．アー．ハー．エム．エス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 内皮性機能／機能不全に関連した疾患に罹患している患者の血管作動性ホルモンに基づいた層化 |
| JP5362487B2 (ja) * | 2009-08-27 | 2013-12-11 | 塩野義製薬株式会社 | ｐｒｏＢＮＰ−１０８の新規用途 |
| WO2012019237A1 (en) | 2010-08-12 | 2012-02-16 | Madeleine Pharmaceuticals Pty Ltd | Therapeutic method for treating congestive heart failure |
| HUE035584T2 (en) * | 2011-01-21 | 2018-05-28 | Igisu Co Ltd | A therapeutic agent for the treatment of allopathy |
| WO2014138796A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Madeleine Pharmaceuticals Pty Ltd | Dosage regimen for therapeutic method |
| WO2015135024A1 (en) | 2014-03-14 | 2015-09-17 | Madeleine Pharmaceuticals Pty Ltd | Adjuvant therapy to standard of care (soc) diuretic treatment |
| WO2017161327A1 (en) * | 2016-03-17 | 2017-09-21 | Diazyme Laboratories, Inc. | Use of fusion proteins to improve the availability of antigenic peptide epitopes in immunoassays |
| US12001939B2 (en) | 2018-12-11 | 2024-06-04 | Eko.Ai Pte. Ltd. | Artificial intelligence (AI)-based guidance for an ultrasound device to improve capture of echo image views |
| US11446009B2 (en) | 2018-12-11 | 2022-09-20 | Eko.Ai Pte. Ltd. | Clinical workflow to diagnose heart disease based on cardiac biomarker measurements and AI recognition of 2D and doppler modality echocardiogram images |
| US11931207B2 (en) | 2018-12-11 | 2024-03-19 | Eko.Ai Pte. Ltd. | Artificial intelligence (AI) recognition of echocardiogram images to enhance a mobile ultrasound device |
| CA3138080A1 (en) * | 2019-05-19 | 2020-11-26 | Jean-Francois TAMBY | Treatment of systolic dysfunction and heart failure with reduced ejection fraction with the compound(r)-4-(1-((3-(difluoromethyl)-1-methyl-1h-pyrazol-4-yl)sulfonyl)-1-fluoroethyl) n-(isoxazol-3-yl)piperidine-1-carboxamid |
| GB2621544A (en) * | 2022-07-07 | 2024-02-21 | Biohabit Ltd | Methods of detecting a disease or condition |
| CN117285624B (zh) * | 2023-09-28 | 2024-04-26 | 北京达成生物科技有限公司 | 抗犬NT-proBNP双特异性抗体及试剂盒 |
Family Cites Families (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5212286A (en) * | 1984-04-19 | 1993-05-18 | Scios Nova Inc. | Atrial natriuretic/vasodilator peptide compounds |
| EP0267272A4 (en) | 1986-05-09 | 1990-03-12 | Biotechnology Res Associates J | ATRIAL NATURAL PEPTIDE RECEPTOR PROTEIN AND ITS DNA CODING. |
| JPS6461500A (en) * | 1987-09-01 | 1989-03-08 | Shionogi & Co | Alpha-hanp recognizing monoclonal antibody and immunologically measuring reagent for alpha-hanp |
| JPH0667319B2 (ja) | 1989-04-19 | 1994-08-31 | 塩野義製薬株式会社 | Ａｎｐのｃ端側を認識するモノクローナル抗体 |
| ATE170192T1 (de) | 1989-06-23 | 1998-09-15 | Genentech Inc | Zusammensetzungen und methoden zur synthese des b-rezeptors für das natriuretische protein und verwendungsmethoden |
| US5604105B1 (en) * | 1990-10-12 | 1999-08-24 | Spectral Diagnostics Inc | Method and device for diagnosingand distinguishing chest pain in early onset thereof |
| JP2665850B2 (ja) * | 1991-11-14 | 1997-10-22 | 塩野義製薬株式会社 | ｈＢＮＰのＣ端を認識するモノクロ−ナル抗体 |
| GB9211686D0 (en) * | 1992-06-03 | 1992-07-15 | Medisinsk Innovation A S | Chemical compounds |
| CA2188143A1 (en) | 1992-12-09 | 1995-11-02 | Wolf-Georg Forssmann | Use of brain natriuretic peptides (bnp), phosphorylated urodilatine, phosphorylated cdd/anp and combinations thereof |
| DK2292662T3 (da) * | 1996-03-04 | 2014-05-05 | Scios Inc | ASSAY OG REAGENSER TIL KVANTIFICERING AF hBNP |
| US6117644A (en) * | 1998-06-04 | 2000-09-12 | Ottawa Heart Institute Research Corporation | Predicting and detecting cardiac allograft rejection |
| WO2000018422A1 (fr) | 1998-09-28 | 2000-04-06 | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | Promoteurs de secretion lacrymale ou gouttes ophtalmologiques contenant des peptides natriuretiques comme principes actifs pour traiter la keratoconjonctivite |
| AT407674B (de) | 1998-09-29 | 2001-05-25 | Biomedica Gmbh | Verfahren zur bestimmung von atrialem natriuretischem peptid (anp) |
| GB9827348D0 (en) | 1998-12-12 | 1999-02-03 | Univ Leicester | Natriuretic peptide |
| CN101046478B (zh) | 1999-01-29 | 2013-04-03 | 罗赫诊断器材股份有限公司 | 鉴定样品中的n-末端前bnp的方法 |
| CA2364471A1 (en) * | 1999-03-01 | 2000-09-08 | Human Genome Sciences, Inc. | Human serpin proteins |
| WO2000071576A2 (en) * | 1999-05-24 | 2000-11-30 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Adenovirus vectors encoding brain natriuretic peptide |
| US6407211B1 (en) * | 1999-12-17 | 2002-06-18 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Chimeric natriuretic peptides |
| CA2342683A1 (en) * | 2000-04-03 | 2001-10-03 | Unilever Plc | Test methods and devices |
| WO2001079231A2 (en) * | 2000-04-14 | 2001-10-25 | Genaissance Pharmaceuticals, Inc. | Haplotypes of the npr1 gene |
| IL142118A0 (en) | 2001-03-20 | 2002-03-10 | Prochon Biotech Ltd | Method and composition for treatment of skeletal dysplasias |
| US6461828B1 (en) * | 2001-09-04 | 2002-10-08 | Syn X Pharma | Conjunctive analysis of biological marker expression for diagnosing organ failure |
| AU2002333526B2 (en) * | 2001-09-10 | 2008-01-17 | Meso Scale Technologies, Llc. | Methods and apparatus for conducting multiple measurements on a sample |
| JP2005510696A (ja) * | 2001-11-27 | 2005-04-21 | ダイアジェニクス インターナショナル コーポレーション | 患者サンプル中の生化学的標識の迅速同時検出のための免疫分析法および免疫分析キット |
| EP1318403B1 (de) * | 2001-12-04 | 2004-07-28 | B.R.A.H.M.S Aktiengesellschaft | Verfahren zur Diagnose von Sepsis unter Bestimmung von S100B |
| US7648962B2 (en) * | 2002-11-26 | 2010-01-19 | Biocon Limited | Natriuretic compounds, conjugates, and uses thereof |
| CA2522709A1 (en) * | 2003-04-17 | 2004-11-04 | Ciphergen Biosystems, Inc. | Polypeptides related to natriuretic peptides and methods of their identification and use |
-
2003
- 2003-06-30 GB GB0315291A patent/GB2403533A/en not_active Withdrawn
-
2004
- 2004-06-28 PL PL04740371T patent/PL1664769T3/pl unknown
- 2004-06-28 US US10/562,081 patent/US8283123B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-06-28 WO PCT/EP2004/006971 patent/WO2005003764A2/en active Application Filing
- 2004-06-28 EP EP04740371A patent/EP1664769B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-06-28 SI SI200431834T patent/SI1664769T1/sl unknown
- 2004-06-28 AU AU2004254028A patent/AU2004254028B2/en not_active Ceased
- 2004-06-28 ES ES04740371T patent/ES2377122T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-06-28 JP JP2006518044A patent/JP4741485B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-06-28 PT PT04740371T patent/PT1664769E/pt unknown
- 2004-06-28 AT AT04740371T patent/ATE538389T1/de active
- 2004-06-28 CA CA2530623A patent/CA2530623C/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-06-28 DK DK04740371.2T patent/DK1664769T3/da active
-
2006
- 2006-01-30 NO NO20060481A patent/NO339026B1/no not_active IP Right Cessation
-
2012
- 2012-10-03 US US13/633,992 patent/US9151766B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2015
- 2015-09-01 US US14/841,863 patent/US20160084852A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1664769B1 (en) | 2011-12-21 |
| WO2005003764A2 (en) | 2005-01-13 |
| AU2004254028A1 (en) | 2005-01-13 |
| NO339026B1 (no) | 2016-11-07 |
| US20130157311A1 (en) | 2013-06-20 |
| US8283123B2 (en) | 2012-10-09 |
| ATE538389T1 (de) | 2012-01-15 |
| US20160084852A1 (en) | 2016-03-24 |
| JP2007526988A (ja) | 2007-09-20 |
| SI1664769T1 (sl) | 2012-04-30 |
| GB2403533A (en) | 2005-01-05 |
| PL1664769T3 (pl) | 2012-06-29 |
| DK1664769T3 (da) | 2012-03-19 |
| AU2004254028B2 (en) | 2010-10-14 |
| US20070141634A1 (en) | 2007-06-21 |
| EP1664769A2 (en) | 2006-06-07 |
| CA2530623A1 (en) | 2005-01-13 |
| CA2530623C (en) | 2014-09-16 |
| NO20060481L (no) | 2006-01-30 |
| GB0315291D0 (en) | 2003-08-06 |
| JP4741485B2 (ja) | 2011-08-03 |
| US9151766B2 (en) | 2015-10-06 |
| PT1664769E (pt) | 2012-03-09 |
| WO2005003764A3 (en) | 2006-12-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9151766B2 (en) | Methods of determination of activation or inactivation of atrial natriuretic peptide (ANP) and brain natriuretic peptide (BNP) hormonal systems | |
| ES2250959T3 (es) | Determinacion en un liquido biologico de un peptido parcial de proadrenomedulina de la region media con fines diagnosticos e imnunoensayos para la realizacion de una determinacion de este tipo. | |
| KR100572542B1 (ko) | Ｎ-말단 ｐｒｏＢＮＰ 확인 방법 | |
| JP4638350B2 (ja) | ヒトまたは動物の組織、血液もしくは体液中のヘプシジンの存在または量を検出する方法 | |
| WO2013132347A2 (en) | Improved elisa immunoassay for calprotectin | |
| ES2688545T3 (es) | Ensayo ELISA policlonal-monoclonal para detectar proBNP N-Terminal | |
| ES2271674T3 (es) | Inmunoensayo tipo sandwich para la determinacion de peptidos parciales proanp. | |
| US20220268761A1 (en) | Therapy monitoring under treatment with an anti-adrenomedullin (adm) binder | |
| WO2013035799A1 (ja) | ペリオスチンの特定領域に結合する抗体及びこれを用いたペリオスチンの測定方法 | |
| ES2948446T3 (es) | Adrenomedulina para la valoración de la congestión en un sujeto con insuficiencia cardiaca aguda | |
| US20190100576A1 (en) | Signal biomarkers | |
| EA034364B1 (ru) | Иммуноанализ для обнаружения хромогранина а | |
| Class et al. | Patent application title: METHODS OF DETERMINATION OF ACTIVATION OR INACTIVATION OF ATRIAL NATRIURETIC PEPTIDE (ANP) AND BRAIN NATRIURETIC PEPTIDE (BNP) HORMONAL SYSTEMS Inventors: Olli Vuolteenaho (Oulu, FI) Minna Ala-Kopsala (Oulu, FI) Heikki Ruskoaho (Tyrnava, FI) Juhani Leppäluoto (Oulu, FI) Jouko Haapalahti (Kempele, FI) | |
| JP5626681B2 (ja) | 癌の検出方法 | |
| US20090081714A1 (en) | Assays | |
| WO2023154780A1 (en) | Anti-her2/neu antibodies and methods of use | |
| CN115746134A (zh) | 半乳糖凝集素-3的免疫测定 | |
| Komoriya et al. | Development of an ultrasensitive CRP latex agglutination reagent by using amino acid spacers | |
| DK161098B (da) | Antistoffer mod modificeret beta2-mikroglobulin, fremgangsmaader til detektering af modificeret beta2-mikroglobulin samt farmaceutiske praeparater indeholdende saadanne antistoffer |