DE69619416T2 - Verfahren und Reagenzien zum immunologischen Nachweis von Cortisol im Urin - Google Patents

Verfahren und Reagenzien zum immunologischen Nachweis von Cortisol im Urin

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Cortisol ohne Extraktion und ohne Chromatographie, welches auf den überraschenden Eigenschaften von bestimmten gegen Cortisol gerichteten Antikörpern basiert.
  • Die Erfindung umfasst insbesondere die Antikörper selbst, ein Verfahren zur Herstellung derselben, Verfahren zur Bestimmung von Cortisol, basierend auf diesen Antikörpern, und Reagens-Sets zur Durchführung dieser Verfahren.
  • Cortisol, eines der wichtigsten Glucocorticoid-Hormone, wird in den faszikulären und retikularen Zonen der Nebennierenrinde synthetisiert. Es entsteht über Cholosterin unter der Wirkung mehrerer Enzyme. Sein Ausscheidungsgrad hängt von der Hypothalamus-Hypophysen- Regulation ab. Der CRF (Corticotropin Releasing Factor) aktiviert den Hypophysenvorderlappen, der ACTH produziert, dieses wiederum stimuliert die Nebennierenrinde, die Corticoide und davon 90% Cortisol synthetisiert. Im Plasma zirkuliert der Großteil von Cortisol in an Plasmaproteine gebundener Form, u.zw. in erster Linie an das Corticosteroid Binding Globulin CBG, an Albumin und an das Testosteron Estradiol Binding Globulin TEBG; eine ganz geringe Menge kommt in freier Form vor.
  • Die Funktionsüberwachung der Hypothalamus-Hypophysen-Achse der Nebennierenrinde beruht weitgehend auf der Bestimmung von Cortisol. Dessen Messung im Serum wird im Wesentlichen im Zuge von dynamischen Versuchen verwendet. Im Harn vorkommendes freies Cortisol zeigt schließlich eine gute Korrelation mit dem Hormonbildungsgrad und ist nach wie vor der beste hormonelle Indikator im Fall von Hyperkortizismus.
  • Die direkte Bestimmung von Cortisol im Serum wird durch den im Allgemeinen erhöhten Gehalt desselben gegenüber allen anderen Steroiden, mit Ausnahme von Dehydroepiandrosteron-(DHEA)-Sulfat, das zur Familie der Androgene mit einer ganz anderen Struktur gehört und von Anti-Cortisol-Antikörpern kaum erkannt wird, erleichtert. Sämtliche handelsübliche Sets vom radioimmunologischen oder immunenzymologischen Typ schlagen direkte Methoden zur Messung von Cortisol im Serum vor. Sie entsprechen häufig der gewünschter Qualität (siehe nachstehende Tabelle 1).
  • Hingegen stellt die direkte Bestimmung von Cortisol im Harn im Wesentlichen aufgrund der Ansammlung von Metaboliten sowie der nach wie vor wenig bekannten Struktur und Konzentration eine viel größere Schwierigkeit dar. Bisher umfassen die zuverlässigsten Verfahren zur Bestimmung von Cortisol in diesem biologischen Milieu einen Schritt der Extraktion mit Dichlormethan, gefolgt von einer Chromatographie zur Gewährleistung der Spezifität. Diese Schritte sind heikel, langwierig und kostspielig.
  • Es wurden zahlreiche Versuche zur Erzeugung von monoklonalen und polyklonalen Anti-Cortisol-Antikörpern unternommen, insbesondere ausgehend von einem Cortisol-21-Halbsuccinat-Derivat und vor allem von einem Cortisol-3-CMO-Derivat, ohne dass in letzterem Fall spezielle Eigenschaften beschrieben wurden, die mit der geometrischen syn/anti-Isomerie der CMO-Gruppe in Verbindung stehen. Derartige Antikörper gestatten keine korrekte Bestimmung von Cortisol im Harn: sie liefern erhöhte Konzentrationswerte von Cortisol im Harn im Vergleich zu Ergebnissen, die durch Bestimmung nach einer Chromatographie erhalten werden.
  • Drei Produzenten, nämlich Kodak, Orion und DSL, schlagen die direkte Bestimmung von Cortisol im Harn vor. Allein, diese Verfahren liefern ganz andere Resultate als sie durch die Bestimmung nach einer Extraktion und Chromatographie der Probe erhalten werden, wie die nachstehende Tabelle 2 zeigt.
  • Darüber hinaus beschreibt das Dokument US-A-4 339 390 einen Antikörper, der durch Immunisierung mit dem an bovines Serumalbumin (BSA) mit einem Kopplungsgrad von 22 gebundenem Hapten Cortisol-21-acetat-3-carboxymethyloxim erhalten wird. Das Verhältnis der Affinität dieses Antikörpers zu den syn- und anti-Isomeren eines Cortisol-Derivats, nämlich Cortisol-21-acetat-3-iminoxyacetyltyrosinmethylester, ist größer als 1 zugunsten des syn-Isomers. Der in diesem Dokument beschriebene Antikörper erkennt jedoch die syn- und anti-Isomere eines anderen Cortisolderivats, nämlich von Cortisol-3-carboxymethyloximhistamin, in Harnmilieu nicht mit einem Affinitätsverhältnis, das gleich oder größer als 1 zugunsten des syn- Isomers ist. Außerdem wurde dieser Antikörper durch Immunisierung mit dem Hapten Cortisol- 21-acetat-3-carboxymethyloxim und nicht mit an BSA gekoppeltem Cortisol-3-carboxymethyloxim erhalten.
  • Es wäre daher wünschenswert, ein Verfahren zur direkten und raschen Messung von Cortisol im Harn zur Verfügung zu haben, welches ein Ergebnis liefert, das nahe an jenes herankommt, das mittels Chromatographie, einer für Routinemessungen zu aufwendigen Methode, erzielt wird.
  • Die Anmelderin hat also bestimmte Antikörper hergestellt und entdeckt, dass diese, egal ob polyklonal oder monoklonal, eine besondere Spezifität aufweisen, mit welcher eine direkte Bestimmung nicht nur von Cortisol in Serum und anderen biologischen Flüssigkeiten (Speichel, Kopf-Rückenmark-Flüssigkeit, Kulturüberständen), sondern auch von Cortisol im Harn möglich ist.
  • Diese erfindungsgemäßen Antikörper können vor allem von Tieren erhalten werden, die mit einem neuen Immunogen bestehend aus dem im Wesentlichen reinen Hapten Cortisol-3- carboxymethyloxim (syn-Isomer), das insbesondere über seine Carboxylfunktion an ein Makromolekül gekoppelt ist, immunisiert werden.
  • Daher betrifft die vorliegende Erfindung einen neuen polyklonalen oder monoklonalen Antikörper, der Cortisol in Harnmilieu spezifisch erkennt und bei dem das Affinitätsverhältnis (CI50) des Antikörpers für die Derivate Cortisol-3-carboxymethyloxim-(syn)-histamin und Cortisol-3-carboxymethyloxim-(anti)-histamin größer oder gleich 1, vorzugsweise größer als 1,5 zugunsten des syn-Isomers ist, wie es unter Verwendung eines Immunogens umfassend im Wesentlichen reines Cortisol-3-carboxymethyloxim (syn-Isomer) als Hapten erhalten wird. Cortisol-3-carboxymethyloxim wird an manchen Stellen im Folgenden Cortisol-3-CMO genannt.
  • Unter "Makromolekül" wird insbesondere ein Protein oder ein Polysaccharid mit einem Molekulargewicht verstanden, das ausreicht, um die Bildung von Antikörpern bei Tieren zu induzieren, vorzugsweise Rinder- oder bovines Serumalbumin (BSA). Die meisten Autoren erachten ein Molekulargewicht von 5000 als ausreichend.
  • Unter "gekoppelt" versteht man, dass Cortisol-3-CMO (syn) insbesondere durch eine kovalente Bindung, beispielsweise eine Ester- oder Amidbindung, vorzugsweise eine Amidbindung, an den Lysinen eines Proteins an das Makromolekül gebunden ist.
  • Eine besondere Ausführungsform der Erfindung besteht darin, dass Cortisol-3-carboxymethyloxim (syn) mit einem molaren Kopplungsverhältnis von größer oder gleich 1, vorzugsweise zwischen 15 und 31, an Rinderserumalbumin (BSA) gekoppelt ist. Man erzeugt so bei der Maus polyklonale Antikörper mit einer großen Affinität und einer bemerkenswerten Spezifität, die eine direkte Bestimmung von Cortisol im Harn von Patienten ohne Extraktion und ohne Chromatographie innerhalb einer Stunde gestatten.
  • Es wurden auch Mäuse-Myelomzellen mit Mäuse-Lymphozyten verschmelzt, die mit dem Immunogen Cortisol-3-carboxymethyloxim-(syn)-BSA immunisiert wurden, um monoklonale Antikörper zu produzieren, deren Spezifität quasi identisch mit jener der entsprechenden polyklonalen Antikörper ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft also insbesondere derartige monoklonale Antikörper, vor allem einen monoklonalen Antikörper, der vom Hybridom IMMU-473, das am 9. Februar 1995 unter der Nr. 11532 bei der Collection Nationale des Cultures de Microorganismes in Paris hinterlegt wurde, sezerniert wird.
  • Die oben beschriebenen und in den nachstehenden Verfahren und Sets verwendeten Antikörper sind vorzugsweise monoklonale Antikörper.
  • Das oben beschriebene Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßen Antikörpern ist nicht einschränkend zu verstehen. Es ist insbesondere möglich, erfindungsgemäße Antikörper mit Immunogenen zu erhalten, die mit nicht makromolekularen Trägern vermischt sind, u.zw. durch Immunisation in vitro oder sogar ohne Immunisation (Griffiths A.D. et al.; EMBO Journal, 13, 3245-3260, 1994).
  • Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Bestimmung von Cortisol, basierend auf den oben beschriebenen polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, bei verschiedenen Bestimmungsmethoden unter Verwendung von Markersubstanzen radioaktiver (beispielsweise Tritium oder radioaktives Iod), enzymatischer, lumineszierender oder fluoreszierender Natur in fester Phase oder in flüssiger Phase. Solche Markersubstanzen können entweder an ein Cortisol-Derivat oder an einen erfindungsgemäßen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper gekoppelt sein, um den entsprechenden Tracer zu bilden. Tritiummarkiertes Cortisol oder ein tritiummarkiertes Derivat von Cortisol können ebenfalls einen geeigneten Tracer darstellen.
  • Aus diesem Grund betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Cortisol, dadurch gekennzeichnet, dass ein Antikörper wie oben definiert verwendet wird, dass die Bestimmung eine kompetitive Bestimmung unter Verwendung eines Tracers ist und dass der Tracer aus dem Hapten Cortisol-3-carboxymethyloxim (syn) oder Cortisol-3-carboxymethyloxim (anti) besteht, das über seine Carboxylfunktion an eine Markersubstanz in Form eines iodierbaren Moleküls gebunden ist.
  • Die Kopplung kann direkt sein oder über einen im Stand der Technik gut bekannten Zweig erfolgen.
  • Unter "iodierbarem Molekül" wird ein dem Fachmann gut bekanntes iodierbares Molekül, beispielsweise Histamin, Histidin, Tyramin, Tyrosin oder ein einen iodierbaren Rest wie einen Phenolkern oder Imidazol enthaltendes Peptid verstanden.
  • Eine spezielle Ausführungsform der Erfindung besteht darin, dass ein oben beschriebener Antikörper, fixiert an eine feste Phase, verwendet wird, der in Anwesenheit des zu bestimmenden Cortisols und eines radioaktiven iodierten Tracers inkubiert wird, welcher durch Markierung eines mittels Transplantation von Cortisol-3-carboxymethyloxim (syn) oder Cortisol-3-carboxymethyloxim (anti) auf ein obiges iodierbares Molekül erhaltenen Vorläufers mit Iod 125 hergestellt wird.
  • Unter anderen bevorzugten Bedingungen zur Durchführung der Erfindung ist das obige Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass Cortisol-3-carboxymethyloxim (syn) oder Cortisol-3- carboxymethyloxim (anti) als Tracer an radioaktives iodiertes Histamin gebunden ist.
  • Unter bevorzugten Durchführungsbedingungen ist das oben beschriebene Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass der radioaktive Tracer mit Iod 125 iodiert ist.
  • Gemäß anderen immunologischen Bestimmungsmethoden wird das zu bestimmende Cortisol in Konkurrenz mit einem Tracer in Form eines Konjugats gestellt, das aus Cortisol-3- carboxymethyloxim (syn) oder Cortisol-3-carboxymethyloxim (anti), gekoppelt an ein Enzym oder ein lumineszierendes oder fluoreszierendes Molekül, besteht.
  • Bevorzugt werden die polyklonalen oder monoklonalen Antikörper gemäß der Erfindung auf einer festen Phase, Röhrchen, Titrierplatten oder Kugeln fixiert.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Cortisol, bei dem ein an eine feste Phase gebundenes Cortisol-Derivat, insbesondere Cortisol-3- carboxymethyloxim (syn) oder (anti), und ein wie oben definierter Anti-Cortisol-Antikörper wie oben definiert verwendet werden, der mit einem radioaktiven, enzymatischen, lumineszierenden oder fluoreszierenden Molekül markiert ist.
  • Bei letzterem Verfahren wird das zu bestimmende Cortisol in Anwesenheit eines obigen immobilisierten Cortisol-Derivats und eines markierten erfindungsgemäßen Antikörpers inkubiert.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Sets zur Bestimmung von Cortisol in biologischen Flüssigkeiten unter Verwendung eines Antikörpers wie oben definiert.
  • Eine erste Art von Set zur direkten Bestimmung von Cortisol enthält eine feste Phase, die mit erfindungsgemäßen gegen Cortisol-3-carboxymethyloxim-(syn)-BSA gerichteten Antikörpern beschichtet ist.
  • Ein derartiges Set enthält vorzugsweise außerdem einen Tracer "Cortisol-3-carboxymethyloxim (anti)" oder "Cortisol-3-carboxymethyloxim (syn)", der über seine Carboxylfunktion entweder an ein Enzym oder an ein fluoreszierendes oder ein lumineszierendes Molekül oder an ein Histamin oder an ein Peptid oder ein Aminosäure-Derivat umfassend einen Phenolring oder einen Imidazolring, iodiert mit einem radioaktiven Iodatom, gekoppelt ist. Ein Set, das noch vollständiger ist, umfasst darüber hinaus vorteilhaft einen oder vorzugsweise zwei Cortisol- Standards, nämlich einen zur Bestimmung von Cortisol im Harn und den anderen zur Bestimmung von Cortisol in Serum.
  • Eine zweite Art von Set zur direkten Bestimmung von Cortisol enthält einen erfindungsgemäßen "Anti-Cortisol-Antikörper"-Tracer, der entweder mit radioaktivem Iod oder mit einem lumineszierenden oder fluoreszierenden Molekül oder aber mit einem Enzym markiert ist. Ein derartiges Set enthält vorzugsweise außerdem eine mit einem Cortisol-Antigen beschichtete feste Phase und darüber hinaus vorteilhaft eine oder vorzugsweise zwei Cortisol-Standards, nämlich einen zur Bestimmung von Cortisol im Harn und den anderen zur Bestimmung von Cortisol in Serum.
  • Die Erfindung betrifft auch Cortisol-3-carboxymethyloxim-(syn)-histamin sowie Cortisol-3-carboxymethyloxim-(anti)-histamin in im Wesentlichen reiner Form, die zur Charakterisierung der Antikörper und als Vorläufer von radioaktiven iodierten Derivaten verwendet werden können.
  • Die Erfindung betrifft weiters Cortisol-3-carboxymethyloxim (syn) in im Wesentlichen reiner Form, Cortisol-3-carboxymethyloxim (anti) in im Wesentlichen reiner Form, insbesondere Cortisol-3-carboxymethyloxim (syn), das mit dem Mehrheitsisomer in einer Menge von mindestens 96% angereichert sein kann, insbesondere im Wesentlichen frei von Cortisol-3,20-di- carboxymethyloxim, d. h. enthaltend weniger als 1%, und vorzugsweise weniger als 1% Umwandlungsprodukte der Funktionen in Position 11 und an der Dihydroxyketon-Seitenkette in Position 17 (mittels Hochleistungsflüssigchromatographie geschätzte Prozentwerte) enthält, und ganz besonders Cortisol-3-carboxymethyloxim (anti), das mit dem Mehrheitsisomer in einer Menge von mindestens 99% angereichert ist, insbesondere im Wesentlichen frei von Cortisol- 3,20-dicarboxymethyloxim, d. h. enthaltend weniger als 1%, und weniger als 1% Umwandlungsprodukte der Funktionen in Position 11 und an der Dihydroxyketon-Seitenkette in Position 17 (mittels Hochleistungsflüssigchromatographie geschätzte Prozentwerte) enthält.
  • Die Erfindung betrifft schließlich im Wesentlichen reines Cortisol-3-carboxymethyloxim (syn), gekoppelt an ein Makromolekül, vor allem ein Protein, insbesondere Rinderserumalbumin.
  • Im Folgenden werden Bedingungen beschrieben, unter denen die erfindungsgemäße monoklonale Antikörper sezernierenden Hybridome isoliert wurden.
  • Nachstehend finden sich auch Beispiele, die die direkte Bestimmung von Cortisol in Serum und im Harn nach der Art von Radiokompetition mit Hilfe dieser monoklonalen Antikörper veranschaulichen. Diese Beispiele beziehen sich auf:
  • 1. Die Synthese des Haptens Cortisol-3-CMO und die Auftrennung in syn- und anti-Isomere.
  • 2. Die Herstellung des Immunogens Cortisol-3-CMO-(syn)-Rinderserumalbumin.
  • 3. Die Herstellung des Immunogens Cortisol-3-CMO-(anti)-Rinderserumalbumin.
  • 4. Die Herstellung des Markierungsvorläufers Cortisol-3-CMO-(syn)-histamin und des entsprechenden radioaktiven iodierten Tracers.
  • 5. Die Herstellung des Markierungsvorläufers Cortisol-3-CMO-(anti)-histamin und des entsprechenden radioaktiven iodierten Tracers.
  • 6. Antikörper, die gegen Cortisol-3-CMO-(syn)-BSA gerichtet sind.
  • 7. Ein Set zur direkten Bestimmung von Cortisol in Serum oder Plasma.
  • 8. Ein Set zur direkten Bestimmung von Cortisol im Harn.
    • BEISPIEL 1: Synthese von Cortisol-3-CMO und Auftrennung in die beiden Isomere syn und anti. Stufe A: 21-Acetoxycortisol (2)
  • Cortisol (1) (10,0 g; 27,6 mmol) wird in 300 ml einer Mischung von Pyridin-Essigsäureanhydrid 5 : 1 gelöst. Die Reaktionsmischung wird 75 min lang auf 70ºC gehalten und dann unter reduziertem Druck eingedampft. Die letzten Spuren von Essigsäureanhydrid werden durch Zugabe von Ethanol und durch azeotrope Toluol-Destillation unter reduziertem Druck entfernt. Man erhält das Acetat (2) in Form eines weißen Feststoffs (11,1 g; 27,4 mmol).
  • Rf = 0,35 (Chloroform-Ethylacetat 1 : 1)
  • Fp. = 220-224ºC (nach Umkristallisation aus einer Chloroform-Methanol-Mischung)
  • ¹H-NMR (C&sub5;D&sub5;N) δ 1,41 (3H, s, 18-CH&sub3;); 1,62 (3H, s, 19-CH&sub3;); 2,12 (3H, s, 21-COCH&sub3;); 4,7 (1H, m, 11α-H); 5,3-5,6 (4H, q: J = 17,5 Hz, 21-CH&sub2;O); 5,8 (1H, s, 4-H).
    • Stufe B: 21-Acetoxycortisol-3-CMO (Mischung aus syn + anti (3))
  • In Stufe A erhaltenes 21-Acetoxycortisol (2) (4,0; 9,9 mmol) wird in 150 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Zu dieser Lösung wird tropfenweise eine Lösung von O-Carboxymethylhydroxylamin-semihydrochlorid (1,3 g; 5,9 mmol) in 150 ml Pyridin gegeben. Das Reaktionsmedium wird unter Stickstoffatmosphäre 16 Stunden lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Das Ende der Reaktion wird mittels Dünnschichtchromatographie kontrolliert, dann wird das Pyridin durch Abdampfen unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wird in einer mit Natriumhydrogencarbonat gesättigten wässrigen Lösung aufgenommen, die anschließend zur Entfernung der nicht sauren Verunreinigungen mit Chloroform extrahiert wird. Die wässrige Phase wird durch Zugabe von Salzsäure auf pH 4 angesäuert und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase, die das Steroid enthält, wird eingedampft und dann durch azeotrope Toluol- Destillation unter reduziertem Druck eingedampft.
  • Man erhält 21-Acetoxycortisol-3-CMO (3) (4,3 g; 9,0 mmol), das eine Mischung von syn- und anti-Isomeren (40% bzw. 60%, Prozentwerte mittels NMR ermittelt) enthält.
  • Rf = 0,40 (syn) und 0,50 (anti) (Chloroform-Aceton-Essigsäure 7 : 2 : 1)
  • ¹H-NMR (C&sub5;D&sub5;N) δ 1,38 (3H, s, 18-CH&sub3;); 1,53 (3H, s, 19-CH&sub3;); 2,11 (3H, s, 21-COCH&sub3;); 4,6 (1H, m, 11α-H); 5,1 (2H, s, NOCH&sub2;CO); 5,3-5,6 (4H, q: J = 17,5 Hz, 21-CH&sub2;O); 6,0-6,7 (1H, s, 4-H anti und syn).
    • Stufe C: Cortisol-3-CMO (Mischung aus syn + anti (4))
  • Die in Stufe B erhaltene Mischung aus syn- und anti-Isomeren von 21-Acetoxycortisol- 3-CMO (3) (2,0 g; 4,2 mmol) wird in 320 ml Methanol gelöst, dann werden 20 ml einer wässrigen 10%igen Kaliumhydrogencarbonatlösung zugegeben. Die Reaktionsmischung wird 16 Stunden lang unter Stickstoffatmosphäre bei Umgebungstemperatur gerührt, dann unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in 100 ml Wasser aufgenommen und die Lösung durch Zugabe von Salzsäure auf pH 4 angesäuert, dann mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase, die das Steroid enthält, wird eingedampft und dann durch azeotrope Toluol- Destillation unter reduziertem Druck eingedampft.
  • Man erhält Cortisol-3-CMO (4) (1,6 g; 3,7 mmol), das eine Mischung von syn- und anti-Isomeren (40% bzw. 60%, Prozentwerte mittels NMR ermittelt) enthält.
  • Rf = 0,19 (syn) und 0,27 (anti) (Chloroform-Aceton-Essigsäure 7 : 2 : 1)
    • Stufe D: syn-Isomer (5) und anti-Isomer (4) von Cortisol-3-CMO
  • Die beiden Isomere, syn und anti, des in Stufe C erhaltenen Derivats Cortisol-3-CMO (0,48 g; 1,1 mmol) werden mittels Chromatographie auf Silicaplatten, die mit einer Mischung aus Chloroform-Aceton-Essigsäure 7 : 2 : 1 entwickelt werden, getrennt. Man erhält 0,17 g (0,39 mmol) syn-Isomer (5) und 0,21 g (0,48 mmol) anti-Isomer (4), die jeweils zwischen 5 und 10% des anderen Isomers enthalten. Jedes Isomer wird danach mittels Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) auf einer Waters-C18- Säule; Elutionsmittel: Methanol-Wasser-Essigsäure 600 : 400 : 1; Durchsatz 8 ml/min. in reinem Zustand erhalten; tr (anti) = 23 min, tr (syn) = 26 min. Das Lösungsmittel wird dann unter reduziertem Druck abgedampft.
  • Isomer (syn) von Cortisol-3-CMO (5)
  • Rf = 0,19 (Chloroform-Aceton-Essigsäure 7 : 2 : 1)
  • Fp. = 133-136ºC (Rohprodukt, getrennt mittels HPLC)
  • UV: λmax = 256 nm; ε = 15000 M&supmin;¹cm&supmin;¹
  • ¹H-NMR (CD&sub3;OD) δ 0,86 (3H, s, 18-CH&sub3;); 1,37 (3H, s, 19-CH&sub3;); 4,2-4,7 (4H, q: J = 19 Hz, 21-CH&sub2;O); 4,4 (1H, m, 11α-H); 4,5 (2H, s, NOCH&sub2;CO); 6,4 (1H, s, 4-H).
  • Isomer (anti) von Cortisol-3-CMO (6)
  • Rf = 0,27 (Chloroform-Aceton-Essigsäure 7 : 2 : 1)
  • Fp. = 223-227ºC (Rohprodukt, getrennt mittels HPLC)
  • UV: λmax = 250 nm; ε = 23000 M&supmin;¹cm&supmin;¹
  • ¹H-NMR (CD&sub3;OD) δ 0,86 (3H, s, 18-CH&sub3;); 1,34 (3H, S, 19-CH&sub3;); 4,2-4,7 (4H, q: J = 19 Hz, 21-CH&sub2;O); 4,4 (1H, m, 11α-H); 4,5 (2H, s, NOCH&sub2;CO); 5,6 (1H, s, 4-H).
    • BEISPIEL 2: Immunogen Cortisol-3-CMO, syn-Isomer, gekoppelt an Rinderserumalbumin, (11) Stufe A: Cortisol-3-CMO, syn-Isomer, aktiviert in Form des N-Hydroxysuccinimidesters (7)
  • Das in Stufe D des Beispiels 1 erhaltene syn-Isomer von Cortisol-3-CMO (5) (0,1 g; 0,23 mmol) wird in 20 rnl wasserfreiem THF in Anwesenheit von N-Hydroxysuccinimid (0,11 g; 0,95 mmol) und Dicyclohexylcarbodiimid (0,21 g; 1,02 mmol) gelöst. Die Reaktionsmischung wird 4 Stunden lang bei Umgebungstemperatur unter Stickstoffatmosphäre und im Dunkeln gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wird unter einem Stickstoffstrom ohne Erhitzen zur Trockne eingedampft, um zum rohen aktivierten Ester (2) zu führen, der in weiterer Folge des Verfahrens im Allgemeinen als solches verwendet werden kann.
  • Rf = 0,54 (Ethylacetat)
    • Stufe B: Immunogen Cortisol-3-CMO, syn-Isomer, gekoppelt an Rinderserumalbumin (11)
  • Rinderserumalbumin (200 mg; etwa 3 umol) wird in 8 ml einer wässrigen 10 mM Natriumhydrogencarbonatlösung gelöst, zu der 3 ml THF tropfenweise zugegeben werden. Das Isomer (syn) von in Form des N-Hydroxysuccinimidesters aktiviertem Cortisol-3-CMO (2) (0,06 g; 113 umol), erhalten in Stufe A, wird in 3 ml THF gelöst. Diese Lösung wird anschließend tropfenweise zur Rinderserumalbuminlösung gegeben. Die Reaktionsmischung wird 16 Stunden lang bei Umgebungstemperatur gerührt und dann bei +4ºC gegen eine wässrige 10 mM Natriumhydrogencarbonatlösung dialysiert. Das Dialysat wird auf einer Sepharose-CL-4B-Säule (Pharmacia), die mit einer wässrigen 10 mM Natriumhydrogencarbonatlösung equilibriert wird, chromatographiert (Nachweis durch UV-Absorption bei 280 nm). Die Fraktionen, die das Immunogen enthalten, werden vereinigt, gegen deionisiertes Wasser, das durch Zugabe von Ammoniumhydrogencarbonat auf pH 7 eingestellt wird, dialysiert und lyophilisiert.
  • Man erhält etwa 250 g des Immunogens Cortisol-3-CMO, syn-Isomer, gekoppelt an Rinderserumalbumin, (11), dessen Kopplungsgrad zwischen 27 und 31 liegt. Der Name der Verbindung wird mit Cortisol-3-CMO-(syn)-BSA abgekürzt.
    • BEISPIEL 3: Immunogen Cortisol-3-CMO, anti-Isomer, gekoppelt an Rinderserumalbumin, (12) Stufe A: Cortisol-3-CMO, and-Isomer, aktiviert in Form des N-Hydroxysuccinimidesters, (8)
  • Das in Stufe D des Beispiels 1 erhaltene anti-Isomer von Cortisol-3-CMO (6) wird behandelt wie in Stufe A des Beispiels 2 ausgeführt, um zum rohen aktivierten Ester (8) zu führen.
  • Rf = 0,61 (Ethylacetat)
    • Stufe B: Immunogen Cortisol-3-CMO, anti-Isomer, gekoppelt an Rinderserumalbumin, (12)
  • Das in Stufe A erhaltene anti-Isomer von Cortisol-3-CMO, aktiviert in Form des N- Hydroxysuccinimidesters (8), wird auf die gleiche Weise behandelt wie in Stufe B des Beispiels 2 ausgeführt, um zum erwarteten Immunogen zu führen: Cortisol-3-CMO-(anti)-BSA (12), dessen Kopplungsgrad zwischen 27 und 31 liegt.
    • BEISPIEL 4: Markierungsvorläufer Cortisol-3-CMO, syn-Isomer, gekoppelt an Histamin, (9) und entsprechender radioaktiver iodierter Tracer Stufe A: Cortisol-3-CMO, syn-Isomer, gekoppelt an Histamin, (9)
  • Die Histaminbase (0,05 g; 0,45 mmol) wird in 1 ml einer wässrigen 10 mM Natriumhydrogencarbonatlösung gelöst, dann wird 1 ml THF zugegeben. Das in Stufe A des Beispiels 2 erhaltene Cortisol-3-CMO, syn-Isomer, aktiviert in Form des N-Hydroxysuccinimidesters, (7) (0,03 g; 0,056 mmol) wird in 1,5 ml THF gelöst. Diese Lösung wird tropfenweise zur Histaminlösung gegeben. Die Reaktionsmischung wird 1 Stunde lang unter Stickstoffatmosphäre bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Lösung wird durch Zugabe von Salzsäure auf pH 7 eingestellt und dann unter reduziertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird anschließend mittels Chromatographie auf Silicaplatten, die in einer Mischung aus Chloroform- Methanol-Ammoniak 60 : 10 : 2 entwickelt werden, und dann mittels HPLC (Shandon-Säule Ultrabase 5 u, uBondapak C18; Elutionsmittel: Methanol-Wasser-Ammoniak 500 : 500 : 1; Durchsatz 1 ml/min) gereinigt; tr (syn) = 25,3 min.
  • Man erhält 0,02 g (0,038 mmol) des an Histamin gekoppelten Produkts (9). Der Name dieses Produkt wird mit Cortisol-3-CMO-(syn)-histamin abgekürzt.
  • Rf = 0,25 (Chloroform-Methanol-Ammoniak 60 : 10 : 2)
  • Fp. = 126-131ºC (Rohprodukt, getrennt mittels HPLC)
  • UV: λmax = 253 nm; ε = 15000 M&supmin;¹cm&supmin;¹
  • ¹H-NMR (CD&sub3;OD) δ 0,87 (3H, s, 18-CH&sub3;); 1,38 (3H, s, 19-CH&sub3;); 2,8, 3,5 (2H jeweils, t: J = 7 Hz jeweils, CH&sub2;-CH&sub2;-Histamin); 4,2-4,7 (4H, q: J = 19 Hz, 21-CH&sub2;O); 4,4 (1H, m, 11 α-H); 4,4 (2H, s, NOCH&sub2;CO); 6,4 (1H, s, 4-H); 6,8, 7,6 (1H jeweils, s jeweils, CH-Imidazol).
    • Stufe B: Tracer Cortisol-3-CMO-(syn)-[¹²&sup5;I]-Iodhistamin
  • Bei der Markierung mit Iod 125, die in flüssigem Medium erfolgt, kommen Chloramin T als Oxidationsmittel und Natriummetabisulfit zum Stoppen der Oxidationsreaktion zum Einsatz. Das Iodierungsprotokoll ist wie folgt: Der in der obigen Stufe A erhaltene Markierungsvorläufer (9), etwa 2 Nanomol, verdünnt in 60 ul 0,2 M Natriumphosphatpuffer, pH 8,0, wird mit 20 ul radioaktiver Natriumiodidlösung (1 nmol Na¹²&sup5;I) in Anwesenheit von 20 ul einer Chloramin-T- Lösung zu 5 mg/ml in 0,2 M Natriumphosphatpuffer, pH 8,0, behandelt.
  • Man lässt bei Umgebungstemperatur 2 min lang inkubieren, dann stoppt man die Reaktion durch Zugabe von 100 ul wässriger Natriummetabisulfitlösung zu 1 mg/ml. Die Reaktionsmischung wird in 700 ul Wasser verdünnt und dann unter folgenden Elutionsbedingungen auf einer C18-Säule uBondak (Umkehrphase) chromatographiert:
  • Unter diesen Elutionsbedingungen ist der Tracer Cortisol-3-CMO-(syn)-[¹²&sup5;I]-Iodhistamin in 49 min eluiert (37% Acetonitril).
    • BEISPIEL 5: Markierungsvorläufer Cortisol-3-CMO, anti-Isomer, gekoppelt an Histamin, (10) und entsprechender radioaktiver iodierter Tracer Stufe A: Cortisol-3-CMO, anti-Isomer, gekoppelt an Histamin, (10)
  • Das in Stufe A des Beispiels 3 erhaltene Cortisol-3-CMO, anti-Isomer, aktiviert in Form des N-Hydroxysuccinimidesters, (8) wird behandelt wie oben für den Fall des syn-Isomers beschrieben, um zur erwarteten Verbindung zu führen: Cortisol-3-CMO-(anti)-histamin (10).
  • tr (anti) = 23,6 min (obige HPLC-Bedingungen)
  • Rf = 0,25 (Chloroform-Methanol-Ammoniak 60 : 10 : 2)
  • Fp. = 134-138ºC (Rohprodukt, getrennt mittels HPLC)
  • UV: λmax = 247 nm; ε = 23000 M&supmin;¹cm&supmin;¹
  • ¹H-NMR (CD&sub3;OD) δ 0,87 (3H, s, 18-CH&sub3;); 1,35 (3H, s, 19-CH&sub3;); 2,8, 3,5 (2H jeweils, t: J = 7 Hz jeweils, CH&sub2;-CH&sub2;-Histamin); 4,2-4,7 (4H, q: J = 19 Hz, 21-CH&sub2;O); 4,4 (1H, m, 11 α-H); 4,4 (2H, s, NOCH&sub2;CO); 5,6 (1H, s, 4-H); 6,8, 7,6 (1H jeweils, s jeweils, CH-Imidazol).
    • Stufe B: Tracer Cortisol-3-CMO-(anti)-[¹²&sup5;I]-Iodhistamin
  • Es wird gearbeitet wie in Stufe B des Beispiels 4 ausgeführt. Der Tracer Cortisol-3- CMO-(anti)-[¹²&sup5;I]-Iodhistamin ist in 46 min eluiert (35,6% Acetonitril).
    • BEISPIEL 6: Antikörper induziert durch das Immunogen Cortisol-3-CMO-(syn)-BSA Stufe A - Immunisierung von Mäusen
  • Männliche Balb/c-Mäuse im Alter von 6 Wochen werden nach dem folgenden Programm immunisiert:
  • - Tag 0: Intraperitoneale Injektion von 50 ug Cortisol-3-CMO-(syn)-BSA in einer 50/50-Emulsion (100 ul NaCl/100 ul komplettes Freundsches Adjuvans).
  • - Tag 21: Wiederholung auf intraperitonealem Weg mit 50 ug Cortisol-3-CMO-(syn)- BSA in einer 50/50-Emulsion (100 ul NaCl/100 ul inkomplettes Freundsches Adjuvans).
  • - Tag 42: Wiederholung auf intraperitonealem Weg mit 50 ug Cortisol-3-CMO-(syn)- BSA in einer 50/50-Emulsion (100 ul NaCl/100 ul inkomplettes Freundsches Adjuvans).
  • - Tag 63: Wiederholung auf intraperitonealem Weg mit 50 ug Cortisol-3-CMO-(syn)- BSA in einer 50/50-Emulsion (100 ul NaCl/100 ul inkomplettes Freundsches Adjuvans).
  • - Tag 84: Wiederholung auf intraperitonealem Weg mit 50 ug Cortisol-3-CMO-(syn)- BSA in einer 50/50-Emulsion (100 ul NaCl/100 ul inkomplettes Freundsches Adjuvans).
  • - Tag 244: Intravenöse Injektion von 100 ug Cortisol-3-CMO-(syn)-BSA in 100 ul NaCl und, eine Stunde später, Wiederholung auf intraperitonealem Weg mit 300 ug dieses Immunogens in 300 ul NaCl.
  • - Tag 247: Zellfusion.
    • Stufe B: Zellfusion nach dem Protokoll von Köhler und Milstein
  • a) Am Tag 247 wird eine ausgewählte Maus getötet und ihre Milz entnommen und in Stücke geschnitten. Die Milzzellen werden in RPMI-1640-Medium gewaschen. Die Myelomzellen P3.X63.Ag8 653, die zuvor in RPMI, 20% fötalem Kälberserum (FKS), 1% Glutamin, 1% nichtessentielle Aminosäuren und 1% Natriumpyruvat kultiviert wurden, werden ebenso im selben Medium gewaschen.
  • Parallel dazu werden peritoneale Makrophagen durch Waschen des Peritoneums von nicht mit RPMI immunisierten Balb/c-Mäusen erhalten.
  • Zur Erzielung der Bildung von Hybridomen werden die Splenozyten und die Myelomzellen in einer Menge von 5 Milzzellen pro Myelomzelle in einem Röhrchen vermischt. Nach dem Zentrifugieren wird der Zellrückstand in 800 ul 50% Polyethylenglykol 1500 in 75 mM Hepes-Puffer, pH 7,5, in Suspension gebracht. Nach einem einminütigen Kontakt bei 37ºC werden nochmals 20 ml RPMI-1640-Medium langsam zu den verschmolzenen Zellen gegeben.
  • b) Die Ausgangskultur wird auf Mikrokulturplatten mit 96 Vertiefungen in Anwesenheit von RPMI-Medium realisiert, das 20% fötales Kälberserum (FKS) und die folgenden Zusatzstoffe enthält: Hypoxanthin 5 · 10&supmin;³ M, Aminopterin 2 · 10&supmin;&sup5; M und Thymidin 8 · 10&supmin;&sup4; M. In jede Vertiefung werden 5 · 10&supmin;³ M peritoneale Makrophagen und dann 10&sup5; fusionierte Zellen gegeben.
    • Stufe C -Klonierungen und Subklonierungen
  • Jedes Hybridom, das gemäß der in der nachstehenden Stufe D genannten Methode selektioniert wird, resultiert aus einer Klonierung mittels einer Grenzverdünnungsmethode, bei der 10, 5, 2, 1 und 0,5 Zellen statistisch in Mikrovertiefungen verteilt werden, die peritoneale Makrophagen enthalten. So werden zwei Subklonierungen ausgeführt, wobei jeder Klon und Subklon repliziert und dann in 90% FKS und 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) fest wurde. Die Subklone der letzten Generation werden schließlich zur Gewinnung einer Ascitesflüssigkeit in Balb/c- Mäusen einer Expansion in vivo unterzogen, gefolgt von einer Reinigung der Immunglobuline am Protein A.
    • Stufe D -Methode zur Selektion von Hybridzellen
  • Die Selektion erfolgt mittels einer radioimmunologischen Methode in flüssiger Phase aus einem Kulturüberstand. Die gegebenenfalls Anti-Cortisol-Antikörper enthaltenden Überstände werden mit einer radioaktiven Cortisol-Lösung (tritiummarkiertes Cortisol oder mit radioaktivem Iod markiertes Cortisol-Derivat: Cortisol-3-CMO-(anti)-[¹²&sup5;I]-Iodhistamin) inkubiert. Falls Anti-Cortisol-Antikörper vorhanden sind, binden diese das radioaktive Steroid. Nach Inkubieren mit Kohle-Dextran und Zentrifugieren zur Entfernung der freien Radioaktivität und sämtlicher an die Antikörper nicht fixierter kleiner Moleküle wird der Überstand (gebundene Fraktion) entnommen und gezählt. Selektionsprotokoll
  • ¹ Mäuse-Immunserum, induziert durch das Immunogen Cortisol-3-CMO-(syn)-BSA, 4000-fach verdünnt in einem Puffer aus 0,1 M Natriumphosphat, 0,1% Gelatine, 10 mM Natriumnitrid, pH 7,2.
  • ² Tracer [1,2,6,7-³H]-Cortisol (50-80 Ci/mmol), 10.000 cpm/100 ul Puffer aus 0,1 M Natriumphosphat, 0,1% Gelatine, 10 mM Natriumnitrid, pH 7,2.
  • ² Tracer Cortisol-3-CMO-(anti)-[¹²&sup5;I]-Iodhistamin, 35.000 cpm/100 ul 0,1 M Natriumphosphatpuffer, 0,1% Gelatine, 10 mM Natriumnitrid, pH 7,2.
  • ³ Puffer = 0,1 M Natriumphosphat, 0,1% Gelatine, 10 mM Natriumnitrid, pH 7,2.
  • ³ Kohle-Dextran-Suspension, 0,3 g-0,03 g/100 ml Puffer aus 0,1 M Natriumphosphat, 0,1% Gelatine, 10 mM Natriumnitrid, pH 7,2.
  • Bei jeder Klonierung wurden nur jene Zellen zurückbehalten, die Anti-Cortisol-Antikörper sezernieren, welche gleichzeitig den tritiummarkierten Cortisol-Tracer und den Cortisol- 3-CMO-(anti)-[¹²&sup5;I]-Iodhistamin-Tracer erkennen, wobei die Nachweisschwelle fünfmal höher liegt als bei der Negativkontrolle.
  • Die Messung der Affinität der monoklonalen Antikörper erfolgt durch Verschiebung des Cortisol-3-CMO-(anti)-[¹²&sup5;I]-Iodhistamin-Tracers mit den beiden Markierungsvorläufern: Cortisol-3-CMO-(anti)-histamin und Cortisol-3-CMO-(syn)-histamin. Die Affinität wird entsprechend der Konzentration (als CI&sub5;&sub0;-Wert) ermittelt, die die Hälfte des Tracers verschieben kann, weil dieser gegenüber den anderen Bestandteilen in geringer Menge vorhanden ist.
  • Die nachstehende Tabelle zeigt die CI&sub5;&sub0;-Werte von zwei monoklonalen Antikörpern, die gegen das Immunogen Cortisol-3-CMO-(syn)-BSA erhalten wurden, wobei eine größere Verschiebung des Cortisol-3-CMO-(anti)-[¹²&sup5;I]-Iodhistamin-Tracers durch das syn-Isomer als durch das anti-Isomer beobachtet wird.
  • Daher wurde der Antikörper IMMU-473 selektioniert, der am 9. Februar 1995 bei der Collection Nationale des Cultures de Microorganismes unter der Nummer I-1532 hinterlegt wurde.
    • BEISPIEL 7: Set zur direkten Bestimmung von Cortisol in Serum oder Plasma
  • Das genannte Verfahren ist eine radioimmunologische Bestimmung durch Kompetition, das auf folgendem Prinzip beruht: die zu bestimmenden Seren oder Plasmen bzw. die Standards werden in Röhrchen, die mit erfindungsgemäßen monoklonalen Anti-Cortisol-Antikörpem beschichtet sind, entweder mit dem einen oder mit dem anderen der beiden Tracer Cortisol-3- CMO-(syn)-[¹²&sup5;I]-Iodhistamin bzw. Cortisol-3-CMO-(anti)-[¹²&sup5;I]-Iodhistamin inkubiert. Nach der Inkubation bei 22ºC wird der Inhalt der Röhrchen durch Ansaugen entleert. Die gebundene Radioaktivität wird in einem Gamma-Zähler gemessen. Es wird eine Eichkurve erstellt. Die unbekannten Werte der Seren oder Plasmen werden durch Interpolation mit Hilfe dieser Kurve bestimmt.
  • Die Reagenzien und das Protokoll, die zur direkten Bestimmung von Cortisol in Seren oder Plasmen verwendet werden, sind wie folgt:
    • Reagenzien:
  • Standard-Cortisol in steroidfreiem Humanserum und 20 mM Natriumnitrid, pH 7,2, hergestellt für sechs Konzentrationen: 0; 20; 70; 200; 700 und 2000 nM (0; 7,25; 25, 37; 72,5; 253,75 und 725 ng/ml).
  • Tracer Cortisol-3-CMO-(syn)-[¹²&sup5;I]-Iodhistamin oder Cortisol-3-CMO-(anti)-[¹²&sup5;I]- Iodhistamin der Beispiele 4 und 5, eingestellt auf 150 000 cpm/ml Puffer aus 0,1 M Natriumphosphat, 0,1% Gelatine, 10 mM Natriumnitrid und 3,56 uM Danazol, pH 7,2.
  • Röhrchen beschichtet mit erfindungsgemäßen monoklonalen Anti-Cortisol-Antikörpern IMMU-473. Die Transplantationstechnik dieser Antikörper auf die feste Phase entspricht der in der FR-A-2 543 972 beschriebenen.
    • Analysen von 87 Patientenseren
  • Protokoll: In mit erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern beschichtete Röhrchen werden 25 ul Standard-Cortisol in steroidfreiem Humanserum oder 25 ul zu bestimmende biologische Probe und 0,5 ml radiomarkierter Cortisol-Tracer gegeben. Nach einer Stunde Inkubation bei 22ºC unter Rühren (400 rpm) wird der Inhalt der Röhrchen entleert und die gebundene Radioaktivität, die im Röhrchen immobilisiert ist, mit einem Gammazähler gemessen.
  • Diese direkten Bestimmungen von Cortisol gemäß der Erfindung werden mit Bestimmungen verglichen, die nach einer Chromatographie derselben Seren auf SEP-PAK-Patronen (Waters) durchgeführt wurden. Fig. 1 zeigt die Korrelation zwischen den beiden oben genannten Bestimmungsmethoden. An der Abszisse sind die durch Bestimmung nach einer Chromatographie erhaltenen Werte und an der Ordinate die durch direkte Bestimmung erzielten Werte angegeben, wobei beide in ng/ml ausgedrückt sind. Die Ergebnisse zeigen eine perfekte Korrelation zwischen diesen direkten Bestimmungen und den nach einer Chromatographie durchgeführten (Anzahl der getesteten Seren = 87).
  • Die Korrelation lautet wie folgt:
  • Y(direkt) = 0,98 X(Chromatographie) + 11,39
  • r = 0,92
  • worin Y den durch direkte Bestimmung erzielten Wert darstellt, X den durch Bestimmung nach der Chromatographie erzielten Wert darstellt und r der Korrelationskoeffizient ist.
    • BEISPIEL 8 - Set zur direkten Bestimmung von Cortisol im Harn
  • Auch hier handelt es sich um eine radioimmunologische Bestimmungsmethode durch Kompetition, deren Prinzip bereits in Beispiel 7 beschrieben wurde. Bei diesem Verfahren wurden die gleichen mit monoklonalen Anti-Cortisol-Antikörpern IMMU-473 beschichteten Röhrchen und der gleiche Tracer, u.zw. ohne Unterschied CMO-(syn)-[¹²&sup5;I]-Iodhistamin oder Cortisol-3-CMO-(anti)-[¹²&sup5;I]-Iodhistamin, wie beim Protokoll zur direkten Bestimmung von Seren verwendet. Es unterscheidet sich nur der Standard: dieser ist ein Puffer mit einer geringen Menge von Rinderserumalbumin (siehe unten).
  • Die Reagenzien und das Protokoll, die bei der direkten Bestimmung herangezogen wurden, sind wie folgt:
    • Reagenzien:
  • Standard-Cortisol in einem Puffer aus 0,1 M Natriumphosphat, 3 g/l SAB, 20 mM Natriumnitrid, pH 7,2, hergestellt für sechs Konzentrationen: 0; 20; 70; 200; 700 und 2000 nM (0; 7,25; 25, 37; 72,5; 253,75 und 725 ng/ml).
  • Tracer Cortisol-3-CMO-(syn)-[¹²&sup5;I]-Iodhistamin oder Cortisol-3-CMO-(anti)-[¹²&sup5;I]- Iodhistamin, eingestellt auf 150 000 cpm/ml Puffer aus 0,1 M Natriumphosphat, 0,1% Gelatine, 3,56 uM Danazol, 10 mM Natriumnitrid, pH 7,2.
  • Röhrchen beschichtet mit dem erfindungsgemäßen monoklonalen Anti-Cortisol-Antikörper IMMU-473.
    • Analysen von 165 Harnproben von Patienten
  • Protokoll: In mit dem monoklonalen Antikörper IMMU-473 beschichteten Röhrchen werden 25 ul Standard-Cortisol in Pufferlösung oder 50 ul zu bestimmende Harnflüssigkeit mit 0,5 ml Tracer Cortisol-3-CMO-(syn)-[¹²&sup5;I]-Iodhistamin oder Cortisol-3-CMO-(anti)-[¹²&sup5;I]- Iodhistamin gegeben. Nach einer Stunde Inkubation bei 22ºC unter Rühren (400 rpm) wird der Inhalt der Röhrchen entleert und die gebundene Radioaktivität, die im Röhrchen immobilisiert ist, in einem Gammazähler, bestimmt.
  • Diese direkten Bestimmungen wurden mit Bestimmungen verglichen, die nach der Chromatographie der Harnproben auf SEP-PAK-Patronen (Waters) durchgeführt wurden.
  • Fig. 2 zeigt die Korrelation zwischen den beiden oben genannten Bestimmungsmethoden für die 165 Harnproben. An der Abszisse sind die durch Bestimmung nach einer Chromatographie erhaltenen Werte und an der Ordinate die durch direkte Bestimmung erzielten Werte angegeben, wobei beide in ng/ml ausgedrückt sind. Die Korrelation ist sehr gut:
  • Die Korrelation lautet wie folgt:
  • Y(direkt) = 1,09 X(Chromatographie) + 5,3
  • r = 0,95
  • worin Y den durch direkte Bestimmung erzielten Wert darstellt, X den durch Bestimmung nach der Chromatographie erzielten Wert darstellt und r der Korrelationskoeffizient ist.
  • Die nachstehende Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse, die unter Verwendung zweier Verfahren zur direkten Bestimmung von Cortisol im Harn gemäß dem Stand der Technik im Vergleich zum erfindungsgemäßen Verfahren und zum Referenzverfahren nach einer Chromatographie erhalten wurden. Nur das erfindungsgemäße Verfahren liefert exakte Ergebnisse; die beiden anderen Verfahren liefern um durchschnittlich einen Faktor 2 erhöhte Werte für die Konzentrationen der Harnproben. TABELLE I Verschiedene handelsübliche Sets zur Bestimmung von Cortisol TABELLE 2
  • Diese Resultate zeigen die bei jedem untersuchten Harn erhaltene gute Korrelation zwischen dem erfindungsgemäßen Verfahren und der Referenzmethode (Chromatographie).

Claims (17)

1. Polyklonaler oder monoklonaler Antikörper, der Cortisol in Harnmilieu spezifisch erkennt und bei dem das Affinitätsverhältnis (CI50) des Antikörpers für die Derivate Cortisol-3-carboxymethyloxim-(syn)-histamin und Cortisol-3-carboxymethyloxim-(anti)-histamin größer oder gleich 1 zugunsten des syn-Isomers ist, wie es unter Verwendung eines Immunogens umfassend im Wesentlichen reines Cortisol-3-carboxymethyloxim (syn-Isomer) als Hapten erhalten wird.
2. Polyklonaler oder monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Affinitätsverhältnis (CI50) des Antikörpers für die Derivate Cortisol-3-carboxymethyloxim-(syn)-histamin und Cortisol-3-carboxymethyloxim-(anti)-histamin größer oder gleich 1,5 zugunsten des syn-Isomers ist.
3. Polyklonaler oder monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass er durch die Immunisierung von Tieren gegen eine immunogene Verbindung bestehend aus dem im Wesentlichen reinen Hapten Cortisol-3-carboxymethyloxim (syn-Isomer), das über seine Carboxylfunktion an ein Makromolekül gekoppelt ist, erzeugt wird.
4. Polyklonaler oder monoklonaler Antikörper nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Immunogen aus dem Hapten 3-Cortisol-carboxymethyloxim (syn) besteht, gekoppelt an Rinderserumalbumin mit einem Kopplungsgrad von 1 oder mehr.
5. Polyklonaler oder monoklonaler Antikörper nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Kopplungsgrad zwischen 15 und 31 beträgt.
6. Polyklonaler oder monoklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass er die iodierten Verbindungen Cortisol-3-carboxymethyloxim-(syn)-histamin und Cortisol-3-carboxymethyloxim-(anti)-histamin mit derselben Affinität erkennt.
7. Antikörper, produziert durch das Hybridom IMMU-473, das am 9. Februar 1995 bei der Collection Nationale des Cultures de Microorganismes unter der Nummer I-1532 hinterlegt wurde.
8. Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Cortisol, dadurch gekennzeichnet, dass ein Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 7 verwendet wird, dass die Bestimmung eine kompetitive Bestimmung unter Verwendung eines Tracers ist und dass der Tracer aus dem Hapten Cortisol-3-carboxymethyloxim (syn) oder Cortisol-3-carboxymethyloxim (anti), das über seine Carboxylfunktion an eine Markersubstanz in Form eines iodierbaren Moleküls gebunden ist, besteht, oder aber der Tracer tritiummarkiertes Cortisol oder ein tritiummarkiertes Derivat von Cortisol ist.
9. Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Cortisol nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass Cortisol-3-carboxymethyloxim (syn) oder Cortisol-3-carboxymethyloxim (anti) als Tracer an radioaktives iodiertes Histamin gebunden ist.
10. Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Cortisol nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Tracer mit Iod 125 iodiert ist.
11. Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Cortisol, dadurch gekennzeichnet, dass ein Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 7 verwendet wird und dass das zu bestimmende Cortisol in Konkurrenz mit einem Tracer in Form eines Konjugats gestellt wird, das aus Cortisol- 3-carboxymethyloxim (syn) oder Cortisol-3-carboxymethyloxim (anti), gekoppelt an ein Enzym oder ein lumineszierendes oder fluoreszierendes Molekül, besteht.
12. Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Cortisol, bei dem an feste Phase gebundenes Cortisol-3-carboxymethyloxim (syn) oder Cortisol-3-carboxymethyloxim (anti) und ein Anti-Cortisol-Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 7 verwendet werden, der mit einem radioaktiven, enzymatischen, lumineszierenden oder fluoreszierenden Molekül markiert ist.
13. Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Cortisol nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
14. Set zur Bestimmung von Cortisol in biologischen Flüssigkeiten unter Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
15. Cortisol-3-carboxymethyloxim (syn) in im Wesentlichen reiner Form.
16. Cortisol-3-carboxymethyloxim-(syn)-histamin in im Wesentlichen reiner Form.
17. Cortisol-3-carboxymethyloxim (syn), gekoppelt an ein Makromolekül, in im Wesentlichen reiner Form.
DE69619416T 1995-03-24 1996-03-22 Verfahren und Reagenzien zum immunologischen Nachweis von Cortisol im Urin Expired - Lifetime DE69619416T2 (de)

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