EP3894858A1 - Verfahren für die analyse einer blutprobe eines menschen auf eine tuberkuloseerkrankung durch detektion von tb-antigen stimulierter cd154-expression in kombination mit cd38, ki-67 oder hla-dr - Google Patents

Verfahren für die analyse einer blutprobe eines menschen auf eine tuberkuloseerkrankung durch detektion von tb-antigen stimulierter cd154-expression in kombination mit cd38, ki-67 oder hla-dr

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EP3894858A1
EP3894858A1 EP19821062.7A EP19821062A EP3894858A1 EP 3894858 A1 EP3894858 A1 EP 3894858A1 EP 19821062 A EP19821062 A EP 19821062A EP 3894858 A1 EP3894858 A1 EP 3894858A1
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EP
European Patent Office
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cells
marker
status
tuberculosis
marking
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP19821062.7A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Petra Bacher
Andrej MANTEI
Christian Meisel
Tim Meyer
Alexander Scheffold
Hans-Dieter Volk
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Charite Universitaetsmedizin Berlin
Labor Berlin Charite Vivantes Services GmbH
Original Assignee
Labor Berlin Charite Vivantes Services GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Pending legal-status Critical Current

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    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
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    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Definitions

  • the present invention relates to a method for the analysis of a human blood sample for an active tuberculosis infection (ATBI).
  • ATBI active tuberculosis infection
  • Tuberculosis is a chronic infection caused by mycobacteria from the Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC).
  • MTBC Mycobacterium tuberculosis complex
  • tuberculosis infections in humans are caused by M. tuberculosis sensu stricto and M. africanum.
  • Infection with tuberculosis bacteria only leads to tuberculosis or active tuberculosis infection in humans in approx. 10% of cases.
  • LTBI latent tuberculosis infection
  • tuberculosis bacteria remain in humans. A transition from a latent to an active tuberculosis infection and thus an illness is possible.
  • tuberculosis In order to select a tuberculosis therapy or to verify the success of the therapy, the clearest possible proof of a tuberculosis disease is necessary.
  • the detection of tuberculosis is carried out in a wide variety of ways. In principle, the detection of a tuberculosis infection is possible on the basis of blood samples. Here the reaction of the immune system to tuberculosis antigens is examined. If there is a reaction, it can be concluded that the patient in question is infected with tuberculosis bacteria. However, blood tests currently used cannot be used to determine whether the person in question is only latently infected with tuberculosis or whether there is an active tuberculosis disease.
  • a method of analyzing a human blood sample for a tuberculosis disease is based on examining an immune response against tuberculosis bacteria. Such a process has the following steps:
  • a tuberculosis infection in the blood sample of a human is to be detected and classified here too.
  • cells from a blood sample for example in the form of isolated mononuclear cells or whole blood
  • the starting material can thus be obtained minimally invasively in the form of a peripheral venipuncture. Biopsies and time-consuming cultivation of tuberculosis bacteria are eliminated.
  • a key concept of the present invention is based on the analysis of T cells (for example CD4 + T cells) which are part of the cells made available.
  • T cells for example CD4 + T cells
  • the cells made available are stimulated with tuberculosis antigens.
  • Structures which are part of bacteria of the Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC), for example ESAT-6 / CFP-10 peptides or purified protein derivative (PPD) can be used as tuberculosis antigens.
  • the T cells that respond to stimulation with tuberculosis antigens are labeled and characterized.
  • the marking is made possible by the induction of the at least one presence marker on these T cells.
  • the method can be described as a two-stage process.
  • tuberculosis-antigen-specific T cells are identified using the at least one presence marker. These cells are found in both latent and actively infected patients with tuberculosis.
  • it is examined whether the cells which carry the at least one presence marker also carry one of the status markers. This at least one status marker allows a conclusion to be drawn about the activation status of the tuberculosis-antigen-specific cells, as cells with presence markers.
  • the presence marker can be used to draw conclusions about the presence of tuberculosis bacteria and the status marker, the status, that is to say the distinction between latent and active manifestation of the tuberculosis infection.
  • the frequency of the presence markers and T cell-bearing status markers or the marking strength of the status marker on the T-cell bearing presence marker is determined and compared with a combination limit value.
  • Combination limit values can be defined as a clear limit value or as a transition range, as will be explained later. In other words, in the set of cells made available, marked cells can now be recognized and evaluated, which carry a combination of at least one presence marker and at least one status marker.
  • the number of such cells with a combined marking or the marking strength of a status marker as a measure of its frequency on the cells which also carry the at least one status marker can now be normalized to a total number of cells and compared with a combination limit. If the number of combined labeled cells exceeds the Combination limit, an active tuberculosis infection can be assumed, in particular with a certain probability.
  • a presence marker and a status marker are proteins on a subgroup of the cells made available which have specific correlations with the parameters to be analyzed.
  • the frequency of the cells that carry the presence marker after stimulation with tuberculosis antigens correlates with the frequency of tuberculosis-specific T cells in the patient's blood.
  • a presence marker must meet two conditions in particular: After in vitro stimulation, it should, if possible, only be formed by cells which specifically recognize the stimulant (here: tuberculosis antigen).
  • the duration that the presence marker can be found on the cells after stimulation should be limited, so that the method does not erroneously identify cells that were activated before in vitro stimulation.
  • tuberculosis antigens allow the analysis of tuberculosis-specific T cells in the cells made available.
  • the stimulation takes place over a defined period of 1 to 72 hours, of which in particular 1 to 48 hours, of which in particular 1 to 24 hours, of which in particular 1 to 12 hours, of which in particular 1 to 7 hours, of which in particular 4 to 6 hours.
  • the stimulation and the associated induction of the at least one presence marker therefore make it possible to recognize the cells and distinguish them from other cells which are specific for tuberculosis antigens.
  • Live bacteria, dead bacteria or, in particular, fragments or synthesized structures that resemble structures of tuberculosis bacteria e.g. lysates, protein extracts, purified proteins, protein mixtures, recombinantly produced proteins or protein fragments, peptides or nucleic acid sequences
  • tuberculosis bacteria are often closed in an encapsulated area of the body and in this state only have a limited interaction with the patient's adaptive immune system (including T cells).
  • T cells including T cells
  • the activation of the T cells by this contact leads to them starting to form activation markers, which are sometimes used as status markers.
  • the analysis of the marking of the at least one status marker in a quantitative and / or qualitative manner allows a statement to be made regarding the distinction between latent and active tuberculosis. It should also be pointed out that the status markers on the T cells already arise in the body and that no separate stimulation is necessary for this. The status markers differ from the at least one presence marker.
  • the blood sample is evaluated in a method according to the invention.
  • a comparison of a defined total cell population to the cells contained therein, which have the at least one presence marker and one or more of the status markers, is carried out in the marking result.
  • a combination limit value which indicates the relative frequency of the T cells that carry the presence marker and one of the status markers or the marking strength of one of the status markers, an active tuberculosis disease can now be assumed above the limit value.
  • the at least one presence marker specifically indicates the contact of the cells with at least one tuberculosis bacterial antigen in humans.
  • the presence markers are expressed on the T cells which are specific against tuberculosis antigens.
  • tuberculosis bacteria produce corresponding biological, chemical and / or biochemical reactions in the body. This is based in particular on a corresponding reaction of the human immune system.
  • the presence marker is stimulated specifically and without a second indication only in T cells, which in turn are specific for a tuberculosis infection. This is the case with a stimulation duration of 1 to 72 hours, of which in particular 1 to 48 hours, of which in particular 1 to 24 hours, of which in particular 1 to 12 hours, of which in particular 1 to 7 hours, of which in particular 4-6 hours.
  • the at least one status marker has at least one activity parameter for the activation status of the T cells in the blood sample.
  • the activation status of the T cells in humans they have corresponding status markers on the surface.
  • Activated T cells can be distinguished from other T cells.
  • the activation and thus the presence of a status marker is not limited to a tuberculosis infection. In combination with the at least one presence maker, however, the combination limit can be used to restrict tuberculosis infection.
  • the status marker has at least one of the following configurations:
  • the at least one status marker is changed by in vivo stimulation of the specific T cells
  • the list above is a non-exhaustive list.
  • the quantitative correlation allows an activity parameter to also provide a quantitative and thus a probability statement as to whether it is active or latent tuberculosis.
  • the activity parameter is mapped in the combination limit.
  • a stability of the activity parameter for the duration of the test can be used to provide a sample that is easier to handle and, in particular, also to provide transport between the sampling location and the analysis location. Since the status marker is not generated by the patient's own stimulation in the method, but is already in the blood sample when the blood sample is taken, this temporal stability ensures greater flexibility in the use of the method according to the invention.
  • a limit value is defined for the combination limit value, when it is exceeded an active tuberculosis disease is recognized.
  • This limit value is preferably equipped with a safety margin in order to have the corresponding safety for the subsequent treatment for a positive test result.
  • the combination limit has at least two limit values with different probabilities for the detection of an active tuberculosis disease. This means that not only can a distinction be made between a negative and a positive test result, but different probabilities can be assumed in particular in the positive result. If the test result is between the two limit values, for example, the likelihood of tuberculosis is lower than if both limit values are exceeded. At least gradually, a quantitative statement is possible regarding the probability of the test procedure.
  • a further advantage can be if, in a method according to the invention, the marking of the at least one presence marker and the at least one status marker is carried out in parallel at least in sections.
  • the marking preferably takes place simultaneously or essentially simultaneously. It is irrelevant whether a common marking mixture should be used for marking both markers or separate marking agents.
  • the design of this marking step, which is parallel at least in sections, further reduces the time required for a method according to the invention and the corresponding costs.
  • the at least one presence marker and the at least one status marker are colored with the same marker mixture. This is particularly the case in combination with the embodiment according to the preceding paragraph.
  • At least some of the cells made available from the blood sample are stimulated and / or at least some of the cells made available from the blood sample remain unstimulated.
  • the stimulation of the blood sample is in particular biological, chemical and / or biochemical. In a qualitative and / or quantitative manner, it can provide reinforcement or simplification in the analysis according to the invention.
  • Such a negative control is combined in particular with a positive control.
  • a further advantage can be achieved if, in a method according to the invention, the cells are made available from a blood sample with peripheral blood. This further reduces the invasiveness of the preliminary procedure necessary for the blood sample.
  • the blood sample can be made available quickly and easily and can serve as a starting point for a method according to the invention.
  • a further advantage can be achieved if, in a method according to the invention, the marking steps are carried out free of permeabilization on the cells made available. It is therefore not necessary to loosen or open the cell walls of the cells made available, so that the preparation effort when carrying out a method according to the invention can be reduced. The time required for the analysis can also be reduced. In this way, a further simplification and reduction of the complexity can be made available for a method according to the invention.
  • Fig. 3 shows an embodiment in the evaluation of a presence marker
  • Fig. 4 shows a further embodiment in the evaluation of an inventive
  • FIG. 1 schematically shows how cells (110) made available from a peripheral blood sample 100 are stimulated with a stimulation agent ST.
  • Markers FM either in the form of a mixture of markers or different FM markers, can be used to mark presence markers AM and status markers SM on / in the cells 110 provided.
  • this marking is evaluated in an evaluation unit 200 so that the combination limit value KG can be analyzed qualitatively and / or quantitatively.
  • FIG. 3 and 4 schematically show how the corresponding limits for the presence marker AM and the status marker SM can be designed.
  • Three blood sample analysis results can be seen in FIG. 3. While the left analysis is a combination limit value KG with a single limit value, FIG. 4 shows a combination limit value KG with two individual partial limit values. The combination of the two markers AM and SM is above the combination limit value KG in the right sample of FIG. 3, so that the presence of an active tuberculosis disease can be affirmed here. The left sample accordingly designates a negative test since the combination of the two markers AM and SM is below the combination limit value KG.
  • FIG. 2 shows a further embodiment of a method according to the invention, in which the cells 110 made available are divided. While for further processing and marking with the marking means FM there is a stimulation with the aid of a stimulation means ST, a negative sample is previously branched off from the cells 110 provided.
  • the present invention is described only by way of examples. Of course, if technically meaningful, individual features of the embodiments can be freely combined with one another without departing from the scope of the present invention.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Analyse einer Blutprobe (100) eines Menschen auf eine Tuberkuloseerkrankung basierend auf Tuberkulosebakterien, aufweisend die folgenden Schritte: - Zur Verfügung stellen von Zellen (110) aus der Blutprobe (100), - Stimulation der zur Verfügung gestellten Zellen (110) mit Tuberkulose- Antigenen zur Induktion wenigstens eines Anwesenheitsmarkers (AM) auf T- Zellen der zur Verfügung gestellten Zellen (110), - Markieren von wenigstens einem der induzierten Anwesenheitsmarker (AM) auf T-Zellen in den zur Verfügung gestellten Zellen (110), welcher spezifisch auf T-Zellen gebildet wird, die Tuberkulose-Antigen während der Stimulation erkannt haben, - Markieren von wenigstens einem Statusmarker (SM) auf T-Zellen in den zur Verfügung gestellten Zellen (110), welcher für deren Aktivierungsstatus spezifisch ist und sich von wenigstens einem Anwesenheitsmarker (AM) unterscheidet, - Auswerten des Markierergebnisses der Markierschritte mittels Analyse der Frequenz von T-Zellen der zur Verfügung gestellten Zellen (110) mit markiertem Statusmarker (SM) und markiertem Anwesenheitsmarker (AM) oder mittels Analyse der Markierungsstärke des Statusmarkers (SM) in den zur Verfügung gestellten Zellen (110) mit markiertem Anwesenheitsmarker (AM) und Abgleich mit einem Kombinationsgrenzwert (KG).

Description

VERFAHREN FÜR DIE ANALYSE EINER BLUTPROBE EINES MENSCHEN AUF EINE TUBERKULOSEERKRANKUNG DURCH DETEKTION VON TB-ANTIGEN STIMULIERTER CD154-EXPRESSION IN KOMBINATION MIT CD38, KI-67 ODER HLA-DR
B e s c h r e i b u n g
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Analyse einer Blutprobe eines Menschen auf eine aktive Tuberkuloseinfektion (ATBI).
Bei Tuberkulose handelt es sich um eine chronische Infektion, die durch Mycobakterien des Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) hervorgerufen wird. Tuberkuloseinfektionen beim Menschen werden in den allermeisten Fällen durch M. tuberculosis sensu stricto und M. africanum verursacht. Eine Infektion mit Tuberkulosebakterien führt beim Menschen nur in ca. 10% der Fälle zu einer Tuberkuloseerkrankung oder aktiven Tuberkuloseinfektion. In 90% der Fälle kommt es zu keiner Erkrankung, man spricht von einer latenten Tuberkuloseinfektion (LTBI). Auch in diesem Fall verbleiben Tuberkulosebakterien im Menschen. Ein Übergang von einer latenten zu einer aktiven Tuberkuloseinfektion und somit eine Erkrankung ist möglich. Um eine Tuberkulose-Therapie auszuwählen bzw. den Therapieerfolg zu verifizieren ist ein möglichst eindeutiger Nachweis einer Tuberkuloseerkrankung notwendig. Bei den bekannten Diagnose-Verfahren wird zur Erkennung einer Tuberkuloseerkrankung dabei in unterschiedlichster Weise vorgegangen. So ist auf der Basis von Blutproben das Erkennen einer Tuberkuloseinfektion grundsätzlich möglich. Hier wird die Reaktion des Immunsytems auf Tuberkulose-Antigene untersucht. Kommt es zu einer Reaktion lässt dies den Schluss zu, dass der entsprechende Patient mit Tuberkulosebakterien infiziert ist. Jedoch kann mittels derzeit verwendeter Bluttests nicht entschieden werden, ob die entsprechende Person lediglich latent mit Tuberkulose infiziert ist, oder ob eine aktive Tuberkulose-Erkrankung vorliegt.
Für den eindeutigen Nachweis einer aktiven Tuberkuloseerkrankung bedarf es bisher der Kultur und somit des eindeutigen Nachweises von Tuberkulose-Bakterien aus Patientenmaterial. Diese Methode hat jedoch entscheidende Nachteile. So ist sie häufig mit einem invasiven Eingriff zum Erlangen der entsprechenden Gewebeprobe verbunden. Darüberhinaus kann der Nachweis einer aktiven Tuberkuloseerkrankung mittels der Kultur von Tuberkulose-Bakterien mehrere Wochen in Anspruch nehmen und bringt so Nachteile unter anderem hinsichtlich Zeit- und Kostenaufwand sowie eines verzögerten Behandlungsbeginns mit sich. Eine Entscheidung ob eine Tuberkulosetherapie durchgeführt wird beruht daher häufig auf klinischen Erfahrungswerten bzw. der Überwachung des Patienten, oder aber es muss eine Therapie durchgeführt werden, ohne dass eine Unterscheidungsmöglichkeit gegeben ist.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die voranstehend beschriebenen Nachteile der aktuellen Tuberkulose-Diagnostik zumindest teilweise zu beheben. Insbesondere ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, in kostengünstiger und einfacher Weise eine Unterscheidung zwischen latenter und aktiver Tuberkulose bei minimaler Invasivität durch Analyse einer Blutprobe zu ermöglichen.
Die voranstehende Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren für die Analyse einer Blutprobe eines Menschen auf eine Tuberkuloseerkrankung mit den Merkmalen des Anspruchs 1. Weitere Merkmale und Details der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen. Dabei gelten Merkmale und Details, die im Zusammenhang mit dem Verfahren gemäß Anspruch 1 beschrieben sind, selbstverständlich auch im Zusammenhang mit dem Verfahren gemäß der Unteransprüche und jeweils umgekehrt, so dass bezüglich der Offenbarung zu den einzelnen Erfindungsaspekten stets wechselseitig Bezug genommen wird bzw. werden kann.
Erfindungsgemäß basiert ein Verfahren der Analyse einer Blutprobe eines Menschen auf eine Tuberkuloseerkrankung auf der Untersuchung einer Immunreaktion gegen Tuberkulosebakterien. Ein solches Verfahren weist die folgenden Schritte auf:
- zur Verfügung stellen von Zellen aus einer Blutprobe
- Stimulation der zur Verfügung gestellten Zellen mit Tuberkulose-Antigenen zur Induktion wenigstens eines Anwesenheitsmarkers auf T-Zellen in den zur Verfügung gestellten Zellen,
- Markieren von wenigstens einem der induzierten Anwesenheitsmarker, welcher für die Anwesenheit von Tuberkulosebakterien spezifisch ist, auf T-Zellen in den zur Verfügung gestellten Zellen,
- Markieren von wenigstens einem Statusmarker auf T-Zellen in den zur Verfügung gestellten Zellen, welcher für den Erkrankungsstatus des Patienten spezifisch ist und sich von wenigstens einem Anwesenheitsmarker unterscheidet,
- Auswerten des Markierergebnisses der Markierschritte mittels Analyse der Frequenz von T-Zellen in den zur Verfügung gestellten Zellen mit markiertem Statusmarker und markiertem Anwesenheitsmarker oder mittels Analyse der Markierungsstärke des Statusmarkers in den zur Verfügung gestellten Zellen mit markiertem Anwesenheitsmarker und Abgleich mit einem Kombinationsgrenzwert. Ausgehend von den bekannten Verfahren soll auch hier eine Tuberkuloseinfektion in der Blutprobe eines Menschen nachgewiesen und klassifiziert werden. Hierfür werden in einem ersten Schritt Zellen aus einer Blutprobe (z.B. in Form von isolierten mononukleären Zellen oder Vollblut) zur Verfügung gestellt. Das Ausgangsmaterial kann also minimalinvasiv in Form einer peripheren Venenpunktion erhalten werden. Biopsien und zeitaufwendiges Kultivieren von Tuberkulosebakterien entfallen.
Ein Kerngedanke der vorliegenden Erfindung beruht auf der Analyse von T-Zellen (z.B. CD4+ T-Zellen), die Bestandteil der zur Verfügung gestellten Zellen sind. Hierfür werden die zur Verfügung gestellten Zellen mit Tuberkulose-Antigenen stimuliert. Als Tuberkulose-Antigene können Strukturen verwendet werden, die Bestandteil von Bakterien des Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) sind, z.B. ESAT-6/CFP-10-Peptide oder purified protein derivative (PPD). Die T-Zellen, die auf Stimulation mit Tuberkulose-Antigenen reagieren werden markiert und charakterisiert. Die Markierung wird durch die Induktion des wenigstens einen Anwesenheitsmarkers auf diesen T-Zellen ermöglicht. Die Methode lässt sich als zweistufiges Verfahren darstellen. Im ersten Schritt werden mittels des wenigstens einen Anwesenheitsmarkers Tuberkulose-Antigen-spezifische T-Zellen identifiziert. Diese Zellen finden sich sowohl in latent als auch in aktiv mit Tuberkulose infizierten Patienten. Im zweiten Schritt wird untersucht ob die Zellen, die den wenigstens einen Anwesenheitsmarker tragen auch einen der Statusmarker tragen. Dieser wenigstens eine Statusmarker erlaubt einen Rückschluss auf den Aktivierungsstatus der Tuberkulose-Antigen-spezifischen Zellen, als Zellen mit Anwesenheitsmarker. In diesen beiden Schritten kann also mit dem Anwesenheitsmarker ein Rückschluss auf die Anwesenheit von T uberkulosebakterien und mit dem Statusmarker der Status, also die Unterscheidung zwischen latenter und aktiver Ausprägung der Tuberkuloseinfektion, erfolgen. Um in einem letzten Schritt die tatsächliche Aussage treffen zu können, ob eine aktive Tuberkuloseerkrankung vorliegt wird die Frequenz der Anwesenheitsmarker und Statusmarker tragenden T-Zellen oder die Markierungsstärke der Statusmarker auf den Anwesenheitsmarker tragenden T-Zellen bestimmt und mit einem Kombinationsgrenzwert abgeglichen. Kombinationsgrenzwerte können als eindeutiger Grenzwert oder als Übergangsbereich definiert werden, wie sie später noch erläutert sind. Mit anderen Worten sind in der Menge der zur Verfügung gestellten Zellen nun markierte Zellen erkennbar und auswertbar, welche eine Kombination aus wenigstens einem Anwesenheitsmarker und wenigstens einem Statusmarker tragen. Die Anzahl solcher Zellen mit kombinierter Markierung oder die Markierungsstärke eines Statusmarkers als Maß für dessen Häufigkeit auf den Zellen, die auch den mindestens einen Statusmarker tragen können nun auf eine Gesamtzellzahl normiert werden und mit einem Kombinationsgrenzwert verglichen werden. Übersteigt die Menge der kombiniert markierten Zellen den Kombinationsgrenzwert, so kann, insbesondere mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit, von einer aktiven Tuberkuloseinfektion ausgegangen werden.
Unter einem Anwesenheitsmarker und einem Statusmarker sind Proteine auf einer Untergruppe der zur Verfügung gestellten Zellen zu verstehen, welche spezifische Korrelationen mit den zu analysierenden Parametern aufweisen. So korreliert die Frequenz der Zellen, die nach Stimulation mit Tuberkulose-Antigenen den Anwesenheitsmarker tragen mit der Frequenz Tuberkulose-spezifischer T-Zellen im Blut der Patienten. Ein Anwesenheitsmarker muss insbesondere zwei Bedingungen erfüllen: Nach in vitro Stimulation soll er möglichst nur von Zellen gebildet werden, die das Stimulanz (hier: T uberkulose-Antigen) spezifisch erkennen. Außerdem soll die Dauer, die der Anwesenheitsmarker nach Stimulation auf den Zellen zu finden ist, begrenzt sein, damit im Rahmen der Methode nicht fälschlicherweise Zellen identifiziert werden, die bereits vor in vitro Stimulation aktiviert wurden. Die Markierung des Anwesenheitsmarkers erlaubt also bei entsprechender Stimulation mit Tuberkulose-Antigenen die Analyse von Tuberkulose-spezifischen T-Zellen in den zur Verfügung gestellten Zellen. Die Stimulation erfolgt über einen definierten Zeitraum 1 bis 72 Stunden, davon insbesondere 1 bis 48 Stunden, davon insbesondere 1 bis 24 Stunden, davon insbesondere 1 bis 12 Stunden, davon insbesondere 1 bis 7 Stunden, davon insbesondere 4 bis 6 Stunden.
Durch die Stimulation und die damit einhergehende Induktion des wenigstens einen Anwesenheitsmarkers lassen sich demnach die Zellen erkennen und von anderen Zellen unterscheiden, welche spezifisch für Tuberkulose-Antigene sind. Für die Stimulation können lebende Bakterien, tote Bakterien oder insbesondere auch Bruchstücke oder synthetisierte Strukturen, die Strukturen von Tuberkulosebakterien gleichen (z.B. Lysate, Proteinextrakte, aufgereinigte Proteine, Proteinmischungen, rekombinant hergestellte Proteine oder Proteinfragmente, Peptide oder Nukleinsäuresequenzen), verwendet werden.
Um die Unterscheidung zwischen latenter oder aktiver Tuberkuloseerkrankung treffen zu können, wird zusätzlich noch die Information benötigt, wie viele Zellen, die den Anwesenheitsmarker tragen (und hier spezifisch für Tuberkulose-Antigen sind) zusätzlich auch einen der Statusmarker tragen bzw. in welchem Ausmaß diese in den Zellen vorhanden sind. Während einer latenten Tuberkuloseinfektion sind die Tuberkulosebakterien häufig in einem verkapselten Bereich des Körpers abgeschlossen und haben in diesem Zustand nur eine begrenzte Wechselwirkung mit dem adaptiven Immunsystems (u.a. T-Zellen) des Patienten. Nach Übergang zu einer aktiven Tuberkuloseinfektion, gekennzeichnet u.a. durch intensive Replikation der Tuberkulosebakterien, kommt es zu intensivem Kontakt und Aktivierung des Immunsystems des Patienten, insbesondere der Tuberkulose-spezifischen T- Zellen. Die Aktivierung der T-Zellen durch diesen Kontakt führt dazu, dass sie beginnen Aktivierungsmarker, die z.T. als Statusmarker genutzt werden, zu bilden. Die Analyse der Markierung des wenigstens einen Statusmarkers in quantitativer und/oder qualitativer Weise erlaubt es, eine Aussage zwecks Unterscheidung von latenter und aktiver Tuberkuloseerkrankung zu treffen. Dabei ist noch darauf hinzuweisen, dass die Statusmarker auf den T-Zellen bereits im Körper entstehen und hierfür keine separate Stimulation notwendig ist. Die Statusmarker unterscheiden sich von dem wenigstens einen Anwesenheitsmarker.
In einem abschließenden Schritt erfolgt bei einem erfindungsgemäßen Verfahren die Auswertung der Blutprobe. Dabei wird im Markierergebnis ein Vergleich einer definierten Gesamtzellpopulation zu den darin enthaltenen Zellen durchgeführt, welche den mindestens einen Anwesenheitsmarker und einen oder mehrere der Statusmarker aufweisen. Durch den Vergleich mit einem Kombinationsgrenzwert, der die relative Häufigkeit der T-Zellen, die den Anwesenheits- und einen der Statusmarker tragen oder die Markierungsstärke eines der Statusmarker angibt, kann nun oberhalb des Grenzwertes von einer aktiven Tuberkuloseerkrankung ausgegangen werden.
Wie aus den voranstehenden Erläuterungen ersichtlich wird, kann nun mithilfe einer einfachen, kostengünstigen und vor allem minimalinvasiven Venenpunktion eine Methode zur Verfügung gestellt werden, welche in einem zweistufigen bzw. parallelen Prozess hinsichtlich des Status einer Tuberkuloseinfektion analysierbar ist. Unter Vermeidung eines invasiven Eingriffs wird damit eine genaue Analyse mit Unterscheidbarkeit zwischen latenter und aktiver Tuberkuloseerkrankung möglich. Dies führt zu deutlich kostengünstigeren und schnelleren Ergebnissen, welche darüber hinaus für anschließende Therapiewünsche bzw. für die Kontrolle eines Therapieerfolges eine detaillierte und aussagekräftige Informationsquelle darstellen können.
Vorteilhaft ist es, wenn bei einem erfindungsgemäßen Verfahren der wenigstens eine Anwesenheitsmarker den Kontakt der Zellen mit wenigstens einem Tuberkulosebakterien- Antigen im Menschen spezifisch anzeigt. Darunter ist insbesondere zu verstehen, dass nach in vitro Stimulation der Anwesenheitsmarker auf den T-Zellen, die gegen Tuberkulose- Antigene spezifisch sind, exprimiert wird. Wie bereits erläutert worden ist, erzeugen Tuberkulosebakterien entsprechende biologische, chemische und/oder biochemische Reaktionen im Körper. Dies beruht insbesondere auf einer entsprechenden Reaktion des Immunsystems des Menschen. Entscheidend ist bei dieser Ausführungsform, dass der Anwesenheitsmarker spezifisch und ohne zweite Indikation nur bei T-Zellen stimuliert wird, welche wiederum spezifisch für eine Tuberkuloseinfektion sind. Dies ist bei einer Stimulationsdauer von 1 bis 72 Stunden, davon insbesondere 1 bis 48 Stunden, davon insbesondere 1 bis 24 Stunden, davon insbesondere 1 bis 12 Stunden, davon insbesondere 1 bis 7 Stunden, davon insbesondere 4-6 Stunden gegeben.
Ebenfalls von Vorteil ist es, wenn bei einem erfindungsgemäßen Verfahren der wenigstens eine Statusmarker wenigstens einen Aktivitätsparameter aufweist für den Aktivierungsstatus der T-Zellen in der Blutprobe. In Abhängigkeit des Aktivierungsstatus der T-Zellen im Menschen weisen diese entsprechende Statusmarker auf der Oberfläche auf. Aktivierte T- Zellen können dabei von anderen T-Zellen unterschieden werden. Die Aktivierung und damit auch das Vorhandensein eines Statusmarkers ist dabei nicht auf eine Tuberkuloseinfektion beschränkt. In der Kombination mit dem wenigstens einen Anwesenheitsmaker kann jedoch mittels des Kombinationsgrenzwerts die Einschränkung auf eine Tuberkuloseinfektion vorgenommen werden.
Ebenfalls von Vorteil kann es sein, wenn bei einem erfindungsgemäßen Verfahren der Statusmarker wenigstens eine der folgenden Ausbildungen aufweist:
- quantitative Korrelation mit dem Aktivierungsstatus,
- der mindestens eine Statusmarker wird durch in vivo Stimulation der spezifischen T- Zellen verändert,
- die in vivo durch Infektion bewirkte Veränderung wird für die Zeitdauer des Tests und durch die Aktivierungsbedingungen in vitro nicht verändert,
- Unabhängigkeit von dem Schritt des Markierens und/oder dem Schritt des Auswertens des Markierergebnisses des Anwesenheitsmarkers.
Bei der voranstehenden Liste handelt es sich um eine nicht abschließende Aufzählung. Die quantitative Korrelation erlaubt es, dass ein Aktivitätsparameter auch eine quantitative und damit eine Wahrscheinlichkeitsaussage zur Verfügung stellen kann, ob es sich hier um eine aktive oder eine latente Tuberkulose handelt. Insbesondere wird der Aktivitätsparameter in dem Kombinationsgrenzwert abgebildet. Unter einer Stabilität des Aktivitätsparameters für die Dauer des Tests kann eine vereinfacht handhabbare Probe zur Verfügung gestellt werden und insbesondere auch ein Transport zwischen Probeentnahmeort und Analyseort zur Verfügung gestellt werden. Da der Statusmarker nicht durch eigene Stimulation im Verfahren erzeugt wird, sondern sich bei der Entnahme der Blutprobe bereits in dieser befindet, sorgt diese zeitliche Stabilität für eine größere Flexibilität in der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Darüber hinaus bringt es Vorteile mit sich, wenn bei einem erfindungsgemäßen Verfahren für den Kombinationsgrenzwert ein Grenzwert definiert ist, bei dessen Überschreitung eine aktive Tuberkuloseerkrankung erkannt wird. Mit anderen Worten ist es auf diese Weise möglich einen vorzugsweise exakten Grenzwert anzugeben, welcher bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zwischen einem positiven und einem negativen Ergebnis unterscheidet. Vorzugsweise ist dieser Grenzwert mit einem Sicherheitsaufschlag ausgestattet, um für ein positives Testergebnis die entsprechende Sicherheit für die nachfolgende Behandlung zu haben.
Auch vorteilhaft ist es, wenn bei einem erfindungsgemäßen Verfahren für den der Kombinationsgrenzwert wenigstens zwei Grenzwerte aufweist mit unterschiedlichen Wahrscheinlichkeiten für die Erkennung einer aktiven Tuberkuloseerkrankung. So kann nicht nur zwischen einem negativen und einem positiven Testergebnis unterschieden werden, sondern insbesondere im positiven Ergebnis von unterschiedlichen Wahrscheinlichkeiten ausgegangen werden. Befindet sich das Testergebnis zum Beispiel zwischen den beiden Grenzwerten so ist die Wahrscheinlichkeit einer Tuberkuloseerkrankung geringer als bei einem Überschreiten beider Grenzwerte. Zumindest stufenweise ist somit hinsichtlich der Wahrscheinlichkeit des Testverfahrens eine quantitative Aussage möglich.
Ein weiterer Vorteil kann es sein, wenn bei einem erfindungsgemäßen Verfahren das Markieren des wenigstens einen Anwesenheitsmarkers und des wenigstens einen Statusmarkers zumindest abschnittsweise zeitlich parallel erfolgt. Vorzugsweise findet das Markieren gleichzeitig oder im Wesentlichen gleichzeitig statt. Dabei ist es unerheblich, ob eine gemeinsame Markiermischung für das Markieren beider Marker oder separate Markiermittel eingesetzt werden sollen. Die zumindest abschnittsweise zeitlich parallele Ausgestaltung dieses Markierschrittes reduziert den Zeitaufwand für ein erfindungsgemäßes Verfahren und die entsprechenden Kosten weiter.
Darüber hinaus kann es von Vorteil sein, wenn bei einem erfindungsgemäßen Verfahren das Anfärben des wenigstens einen Anwesenheitsmarkers und des wenigstens einen Statusmarkers mit der gleichen Markiermischung erfolgt. Dies ist insbesondere in Kombination mit der Ausführungsform gemäß dem voranstehenden Absatz der Fall.
Vorteilhaft ist es darüber hinaus, wenn bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zumindest ein Teil der zur Verfügung gestellten Zellen aus der Blutprobe stimuliert werden und/oder zumindest ein Teil der zur Verfügung gestellten Zellen aus der Blutprobe unstimuliert bleiben. Darunter ist zu verstehen, dass insbesondere der stimulationsfreie Teil der Blutprobe als Negativkontrolle verbleibt, um entsprechend später als Analyse zur Verifikation des Testergebnisses zur Verfügung zu stehen. Die Stimulation der Blutprobe ist insbesondere biologisch, chemisch und/oder biochemisch. Sie kann in qualitativer und/oder quantitativer Weise eine Verstärkung bzw. eine Vereinfachung bei der erfindungsgemäßen Analyse zur Verfügung stellen. Eine solche Negativkontrolle ist insbesondere mit einer Positivkontrolle kombiniert.
Ein weiterer Vorteil ist erzielbar, wenn bei einem erfindungsgemäßen Verfahren die Zellen aus einer Blutprobe mit peripherem Blut zur Verfügung gestellt werden. Dies reduziert die Invasivität des notwendigen Vorverfahrens für die Erstellung der Blutprobe weiter. Insbesondere kann in schneller und einfacher Weise die Blutprobe zur Verfügung gestellt werden und als Ausgangspunkt für ein erfindungsgemäßes Verfahren dienen.
Vorteilhaft ist es darüber hinaus, wenn bei einem erfindungsgemäßen Verfahren als Anwesenheitsmarker wenigstens einer der folgenden verwendet wird:
- Oberflächenmarker, insbesondere CD154
Vorteilhaft ist es weiter, wenn bei einem erfindungsgemäßen Verfahren als Statusmarker wenigstens einer der folgenden verwendet wird:
- CD38
- HLA-DR
- Ki-67
Ein weiterer Vorteil ist erzielbar, wenn bei einem erfindungsgemäßen Verfahren die Schritte des Markierens permeabilisierungsfrei an den zur Verfügung gestellten Zellen durchgeführt werden. Damit ist kein Lösen oder Öffnen der Zellwände der zur Verfügung gestellten Zellen notwendig, so dass der Vorbereitungsaufwand bei der Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens reduzierbar ist. Auch der notwendige Zeitaufwand für die Analyse kann reduziert werden. Auf diese Weise kann also eine weitere Vereinfachung und Reduktion der Komplexität für ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Verfügung stellbar sein.
Weitere Vorteile, Merkmale und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung, in der unter Bezugnahme auf die Zeichnungen Ausführungsbeispiele der Erfindung im Einzelnen beschrieben sind. Dabei können die in den Ansprüchen und in der Beschreibung erwähnten Merkmale jeweils einzeln für sich oder in beliebiger Kombination erfindungswesentlich sein. Es zeigen schematisch: Fig. 1 eine Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens,
Fig. 2 eine weitere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens,
Fig. 3 eine Ausführungsform bei der Auswertung eines Anwesenheitsmarkers und
Fig. 4 eine weitere Ausführungsform bei der Auswertung eines erfindungsgemäßen
Statusmarkers.
In Fig. 1 ist schematisch dargestellt, wie zur Verfügung gestellte Zellen (110) aus einer peripheren Blutprobe 100 mit einem Stimulationsmittel ST stimuliert werden. Mit Markiermittel FM, entweder in Form einer Markiermittelmischung oder unterschiedlichen Markiermitteln FM kann ein Markieren von Anwesenheitsmarkern AM und Statusmarkern SM auf/in den zur Verfügung gestellten Zellen 110 erfolgen. Abschließend erfolgt in einer Auswerteeinheit 200 ein Auswerten dieser Markierung, so dass in qualitativer und/oder quantitativer Weise die Analyse des Kombinationsgrenzwertes KG erfolgen kann.
In den Fig. 3 und 4 ist schematisch dargestellt, wie die entsprechenden Grenzen für den Anwesenheitsmarker AM und den Statusmarker SM ausgebildet sein können. In der Fig. 3 sind zwei Blutprobenanalyseergebnisse zu erkennen. Während es sich bei der linken Analyse um einen Kombinationsgrenzwert KG mit einem einzigen Grenzwert handelt, zeigt die Fig. 4 einen Kombinationsgrenzwert KG mit zwei einzelnen Teilgrenzwerten. Die Kombination der beiden Marker AM und SM liegt bei der rechten Probe der Fig. 3 über dem Kombinationsgrenzwert KG, so dass hier das Vorhandensein einer aktiven Tuberkuloseerkrankung bejaht werden kann. Die linke Probe bezeichnet dementsprechend einen negativen Test, da die Kombination der beiden Marker AM und SM unterhalb des Kombinationsgrenzwertes KG liegt.
In der Fig. 4 sind nun drei Analyseergebnisse zu erkennen. So kann hier beim Vorhandensein einer Tuberkuloseerkrankung, also bei der Darstellung gemäß Fig. 3 in der rechten Probe oberhalb des Kombinationsgrenzwerts KG eine zusätzliche Information zur Verfügung gestellt werden. Ist Kombination der beiden Marker AM und SM unterhalb eines unteren Grenzwertes des Kombinationsgrenzwertes KG, kann eine latente Tuberkulose erkannt werden. Befindet sich der Wert oberhalb des oberen Grenzwertes des Kombinationsgrenzwertes KG, kann von einer aktiven Tuberkuloseerkrankung ausgegangen werden. Befindet sich der Wert für die Kombination der beiden Marker AM und SM innerhalb der genannten beiden Grenzwerte, so ist eine weitere Detailanalyse notwendig oder eine entsprechende reduzierte Wahrscheinlichkeit mit der Aussage verknüpft.
Die Fig. 2 zeigt eine weitere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens, bei welcher ein Aufteilen der zur Verfügung gestellten Zellen 110 erfolgt. Während für die weitere Verarbeitung und das Markieren mit dem Markiermittel FM hier eine Stimulation mithilfe eines Stimulationsmittels ST erfolgt, wird eine Negativprobe vorher von den zur Verfügung gestellten Zellen 110 abgezweigt. Bei der voranstehenden Erläuterung der Ausführungsformen wird die vorliegende Erfindung nur anhand von Beispielen beschrieben. Selbstverständlich können einzelne Merkmale der Ausführungsformen, sofern technisch sinnvoll, frei miteinander kombiniert werden, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
B ez u a s ze i c h e n l i s te
AM Anwesenheitsmarker
SM Statusmarker
KG Kombinationsgrenzwert
FM Markiermittel
ST Stimulationsmittel
100 Blutprobe
110 zur Verfügung gestellte Zellen
200 Auswerteinheit

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren für die Analyse einer Blutprobe (100) eines Menschen auf eine Tuberkuloseerkrankung basierend auf Tuberkulosebakterien, aufweisend die folgenden Schritte:
- Zur Verfügung stellen von Zellen (110) aus der Blutprobe (100),
- Stimulation der zur Verfügung gestellten Zellen (110) mit Tuberkulose- Antigenen zur Induktion wenigstens eines Anwesenheitsmarkers (AM) auf T- Zellen der zur Verfügung gestellten Zellen (110),
- Markieren von wenigstens einem der induzierten Anwesenheitsmarker (AM) auf T-Zellen in den zur Verfügung gestellten Zellen (110), welcher spezifisch auf T-Zellen gebildet wird, die Tuberkulose-Antigen während der Stimulation erkannt haben,
- Markieren von wenigstens einem Statusmarker (SM) auf T-Zellen in den zur Verfügung gestellten Zellen (110), welcher für deren Aktivierungsstatus spezifisch ist und sich von wenigstens einem Anwesenheitsmarker (AM) unterscheidet,
- Auswerten des Markierergebnisses der Markierschritte mittels Analyse der Frequenz von T-Zellen in den zur Verfügung gestellten Zellen (110) mit markiertem Statusmarker (SM) und markiertem Anwesenheitsmarker (AM) oder mittels Analyse der Markierungsstärke des Statusmarkers (SM) in den zur Verfügung gestellten Zellen (110) mit markiertem Anwesenheitsmarker (AM) und Abgleich mit einem Kombinationsgrenzwert (KG).
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der wenigstens eine Anwesenheitsmarker (AM) während der in-vitro Stimulation mit Tuberkulose-Antigen nur durch T-Zellen gebildet wird die während der Stimulation ihre Antigen spezifisch erkannt haben
3. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der wenigstens eine Statusmarker (SM) mit dem Aktivierungsstatus der T-Zellen als Maß für den Infektionsstatus korreliert .
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Statusmarker (SM) wenigstens eine der folgenden Ausbildungen aufweist:
- der mindestens eine Statusmarker wird durch in vivo Stimulation der spezifischen T-Zellen verändert
- 1 - - die in vivo durch Infektion bewirkte Veränderung wird für die Zeitdauer des Tests und durch die Aktivierungsbedingungen in vitro nicht verändert
- Unabhängigkeit von dem Schritt des Markierens und/oder dem Schritt des Auswertens des Markierergebnisses des Anwesenheitsmarkers (AM)
5. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass für den Kombinationsgrenzwert (KG) ein Grenzwert definiert ist, bei dessen Überschreitung eine aktive Tuberkuloseerkrankung erkannt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Kombinationsgrenzwert (KG) wenigstens zwei Grenzwerte aufweist mit unterschiedlichen Wahrscheinlichkeiten für die Erkennung einer aktiven T uberkuloseerkrankung.
7. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Markieren des wenigstens einen Anwesenheitsmarkers (AM) und des wenigstens einen Statusmarkers (SM) zumindest abschnittsweise zeitlich parallel erfolgt.
8. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Markieren des wenigstens einen Anwesenheitsmarkers (AM) und des wenigstens einen Statusmarkers (SM) mit der gleichen Markiermischung erfolgt.
9. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Teil der zur Verfügung gestellten Zellen (110) aus der Blutprobe (100) stimuliert werden und/oder zumindest ein Teil der zur Verfügung gestellten Zellen (110) aus der Blutprobe (100) unstimuliert bleiben.
10. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen (110) aus einer Blutprobe (100) mit peripherem Blut zur Verfügung gestellt werden.
11. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Anwesenheitsmarker (AM) wenigstens einer der folgenden verwendet wird:
- Oberflächenmarker, insbesondere CD154
2
12. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Statusmarker (SM) wenigstens einer der folgenden verwendet wird:
- CD38
- HLA-DR
- Ki-67
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte des Markierens permeabilisierungsfrei an den zur Verfügung gestellten Zellen (110) durchgeführt werden.
3
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