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Die
Erfindung betrifft ein nicht-invasives Screeningverfahren für
Wirkstoffe und/oder Formulierungen gegen Hautalterung in vivo.
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Die
wichtigste Aufgabe von Anti-Aging-Kosmetika ist es, neben der Bereitstellung
eines ansprechenden Hautgefühls und der Grundpflege der
Haut, positiven Einfluss auf die Alterung der Haut zu nehmen. Insbesondere
soll die Hautalterung verlangsamt und der Haut eine jüngere
Erscheinung erhalten werden, als es dem biologischen Alter entspricht.
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Die
Wirkung von Anti-Aging-Kosmetik beruht auf zwei Effekten. Einerseits
wird durch Farbstoffe oder -pigmente und die über das Produkt
auf die Haut aufgebrachte Feuchtigkeit die Hautoberfläche
direkt in ihrer Erscheinung verbessert. Andererseits wirken die
beigemengten Aktivstoffe auf die Zellen der Haut ein, um in diesen
Prozesse zu induzieren, die eine biologische Verbesserung des Alterungsstatus
zu mit sich bringen. Diese zweite Wirkung ist bislang nur zeitaufwendig
und kostenintensiv nachzuweisen, da die induzierten Prozesse naturgemäß nur über
einen längeren Zeitraum bei regelmäßiger
Anwendung zu makroskopisch messbaren Effekten führen.
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Die
Prozesse, die zur Alterung der Haut führen, sind auf molekularer
Ebene in Teilen schon gut verstanden, wobei die gewonnenen Erkenntnisse
in der Regel aus der Analyse von kultivierten Zellen der Haut bzw.
durch die Untersuchung von Biopsien der Haut (also aus in vitro
Experimenten) stammen.
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Invasive,
d. h. die Dermis sowie tiefer liegende Gewebeschichten verletzende,
in vivo Methoden kommen aus ethischen Gründen nicht in
Frage. Nicht-invasive Methoden, welche Effekte von Formulierungen und/oder
Wirkstoffen gegen die Hautalterung aufzeigen könnten, erlauben
nur die Bestimmung makroskopischer Parameter, beispielsweise der
Faltentiefe.
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Es
besteht Bedarf an einer Methode, mit der sich bereits nach kurzer
Zeit die biologische Veränderung der Haut bei Produktanwendung über
die Messung relevanter molekularer Marker in vivo erfassen lässt.
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Im
Stand der Technik ist die so genannte Tape Strip (oder Tape Stripping)
Methode bekannt, bei der Zellen der Hautoberfläche mit
Hilfe von Klebeband isoliert und der molekularen Untersuchung zugänglich
gemacht werden. Diese Methode wurde bislang nur für die
medizinische Untersuchung von Entzündungsprozessen der
Haut/entzündlichen Hauterkrankungen beschrieben.
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Die
EP 1112077 beschreibt beispielsweise
ein entsprechendes Verfahren für den Nachweis von Entzündungsmarkern,
speziell Cytokinen. Der Nachweis von Entzündungsmarkern
ist im Vergleich mit anderen Markern relativ einfach und gut untersucht,
insbesondere aufgrund der hohen differentiellen Expression von Cytokinen
bei akuten Entzündungsprozessen.
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Die
Aufgabe der Erfindung ist es daher ein Verfahren bereitzustellen,
welches die Nachteile des Standes der Technik überwindet
und in vivo Untersuchungen zur Wirkung von Aktivstoffen und/oder
Formulierungen gegen die Zeichen der Hautalterung ethisch vertretbar,
kostengünstiger und in kürzerer Zeit ermöglicht.
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Die
Aufgabe wird gelöst durch ein nicht-invasives Verfahren
zum Screening von Wirkstoffen und/oder Formulierungen gegen Hautalterung
in vivo, dadurch gekennzeichnet, dass es folgenden Schritte umfasst:
- a) In Kontakt bringen eines Lebewesens, bevorzugt
eines Menschen, mit einem zu testenden Wirkstoffs und/oder einer
zu testenden Formulierung
- b) Aufbringen eines Klebebandes auf eine ausgewählte
Hautoberfläche
- c) Abreißen des Klebebandes von der Haut
- d) Gewinnung von anhaftendem biologischem Material
- e) Detektion der Anwesenheit, Menge, Expression und/oder Aktivität
mindestens eines Markers für Hautalterung ausgewählt
aus der Liste gemäß Anhang 1 oder 2.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich
um eine nicht-invasive in vivo Methode. Es bedarf bei der Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens weder eines „chirugischen” Eingriffs
noch der Anwesenheit eines Arztes oder irgendwelchen medizinischen
Fachpersonals. Die Hautalterung ist darüber hinaus ein
natürlicher, nicht krankhafter Prozess. Die Suche nach
Wirkstoffen, welche die Hautalterung beeinflussen können,
ist an sich ebenfalls kosmetisch und nicht therapeutisch.
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In
einem ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird ein zu testender Wirkstoff und/oder eine zu testende Formulierung
auf die Hautoberfläche eines Lebewesens, bevorzugt eines
Menschen, aufgebracht. Das In Kontakt bringen erfolgt bevorzugt
topisch. Es kann aber auch über orale, enterale, parenterale oder
sonst wie geartete Wirkstoffgaben erfolgen.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
wird in Schritt a) ein zu testender Wirkstoff und/oder eine zu testende
Formulierung auf die Hautoberfläche eines Lebewesens, bevorzugt eines
Menschen, aufgebracht.
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Das
In Kontakt bringen erfolgt somit topisch. Besonders bevorzugt wird
nach der Aufbringung eines zu testenden Wirkstoffs bzw. einer zu
testenden Formulierung auf die Hautoberfläche, dann in
Schritt b) ein Klebeband auf die gemäß a) behandelte
Hautoberfläche aufgebracht.
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Das
In Kontakt bringen aus Schritt a), insbesondere die Auftragung auf
die Hautoberfläche, kann entweder einmalig oder in ein
oder mehreren (bevorzugt regelmäßigen) Wiederholungen
erfolgen. Je nach Stärke des Effekts bzw. je nach Marker
ist es möglich bereits nach einem In Kontakt bringen, insbesondere
einer Auftragung eine Wirkung des zu testenden Wirkstoffs bzw. der
zu testenden Formulierung nachzuweisen.
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Es
kann bevorzugt sein, einen Wirkstoff in regelmäßigen
Abständen (z. B. morgens und abends) über ein,
zwei oder mehrere Tage oder Wochen in Kontakt zu bringen, insbesondere
aufzutragen, und dann die Wirkung des Wirkstoffs bzw. der zu testenden
Formulierung durch die weiteren Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens
zu bestimmen.
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Bevorzugt
werden für die topische Auftragung des Wirkstoffs gemäß bevorzugter
Ausführung in Schritt a) und/oder die Applikation des Klebebandes
gemäß Schritt b) solche Hautareale ausgewählt,
die nur eine geringe Behaarung aufweisen oder auf denen die Behaarung,
bevorzugt vor Aufbringung der zu testenden Formulierung bzw. des
zu testenden Wirkstoffs, spätestens aber vor Aufbringung
des Klebebandes gemäß Schritt b) entfernt wurde.
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Solche
Testungen können bei Lebewesen, insbesondere Säugetieren,
bevorzugt bei Menschen durchgeführt werden. Bevorzugt wird
das Verfahren bei Menschen durchgeführt, da die Effekte
der Hautalterung als kosmetisches Problem insbesondere bei Menschen
eine Rolle spielt und außerdem Artefakte, welche durch die Übertragung
von Erkenntnissen von anderen Spezies auf den Menschen entstehen,
ausgeschlossen werden.
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Gemäß einem
weiteren Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird in einem Schritt b) ein Klebeband auf eine ausgewählte
Hautoberfläche aufgebracht.
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Wie
bereits zu Schritt a) beschrieben, werden insbesondere Hautareale
mit geringer Behaarung ausgewählt bzw. die Haare vor Beginn
des Schritt b) entfernt.
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Besonders
bevorzugt ist es, in Schritt b) das Hautareal aus der Hautoberfläche
der Arme, der Beine, insbesondere der Schenkel, bevorzugt der Unterschenkel,
des Rückens oder der Gesichtshaut auszuwählen. Bevorzugt
wird das Klebeband in Schritt b) auf die Haut der Unterarme, insbesondere
auf deren Innenseite, oder auf die Gesichtshaut, aufgebracht.
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Erfolgt
das In Kontakt bringen mit dem Wirkstoff bzw. der Formulierung durch
topisches Aufbringen des zu testenden Wirkstoffs bzw. der zu testenden
Formulierung auf die Hautoberfläche, wird in Schritt b)
das Klebeband bevorzugt auf die gemäß a) behandelte
Hautoberfläche aufgebracht.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren ist dann gemäß einer
besonderen Ausführungsform durch die folgenden Schritte
gekennzeichnet:
- a) Auftragen eines zu testenden
Wirkstoffs und/oder einer zu testenden Formulierung auf die Hautoberfläche
eines Lebewesens, bevorzugt eines Menschen,
- b) Aufbringen eines Klebebandes auf die gemäß a)
behandelte Hautstelle
- c) Abreißen des Klebebandes von der Haut
- d) Gewinnung von anhaftendem biologischem Material
- e) Detektion der Anwesenheit, Menge, Expression und/oder Aktivität
mindestens eines Markers für Hautalterung ausgewählt
aus der Liste gemäß Anhang 1 oder 2,
- f) Auswahl eines solchen Wirkstoffs und/oder Formulierung, welche
zur Modulation mindestens eines der gemäß e) getesteten
Marker fähig ist.
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Alle
im weiteren als bevorzugt beschriebenen Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung beziehen sich insbesondere auch auf die
vorstehend genannte besondere Ausführungsform, in der in
Schritt a) das Auftragen eines zu testenden Wirkstoffs und/oder
einer zu testenden Formulierung auf die Hautoberfläche
eines Lebewesens, bevorzugt eines Menschen, durchgeführt
wird.
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Die
dafür besonders geeigneten Hautstellen wurden bereits für
den Schritt unter b) beschrieben. Besonders bevorzugt wird nach
der Aufbringung eines zu testenden Wirkstoffs bzw. einer zu testenden
Formulierung auf die Innenseite der Unterarme, dann in Schritt b)
ein Klebeband auf diese gemäß a) behandelte Hautoberfläche
(dieses Hautareal) aufgebracht
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Der
Zeitabstand zwischen der Durchführung von Schritt a) bzw.
bei Wiederholungen von Schritt a) nach der letzten Anwendung von
Schritt a) und Schritt b) des erfindungsgemäßen
Verfahrens (dem Aufbringen des Klebebandes) kann beliebig sein,
Die Schritte können beispielsweise direkt hintereinander
(beispielsweise im Abstand von einer oder mehrere Sekunden, Minuten
oder Stunden), aber auch mit längeren Pausen (beispielsweise
Tagen bzw. Wochen oder Monaten) erfolgen. Bevorzugt liegen zwischen
der letzten Durchführung von Schritt a) und Schritt b)
eine Minute bis mehrere Wochen, insbesondere 10 Wochen.
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Als
Klebeband (Klebestreifen) im Sinne der vorliegenden Erfindung wird
insbesondere ein mit einem oder mehreren verschiedenen Haftklebstoffen
beschichtetes Trägermaterial, beispielsweise Papier, Gewebe, Metallfolien
oder Kunststofffolien, verstanden.
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Weiterhin
ist darunter auch ein Klebestreifen zu verstehen, der sich erst
in situ (insbesondere nach Auftragung auf die Haut) aus einer mehr
oder minder flüssigen bzw. halbflüssigen bzw.
halbfesten Klebemasse (beispielsweise einer Acrylatklebemasse wie
auch aus handelsüblichem Sekundenkleber) bildet.
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Bevorzugt
werden einseitig beschichtete Klebebänder eingesetzt, bei
denen das Trägermaterial nur von einer Seite haftklebrig
beschichtet wird. Dies hat den Vorteil, dass das Ablösen
des Klebebandes von der Haut erleichtert wird und geringere Kontamination
durch Anhaften auf der nicht mit der Haut des Probanden in Kontakt
gekommenen Seite stattfindet.
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Ebenfalls
einsetzbare Klebebänder im Sinne der Erfindung sind Transferklebebänder.
Diese besitzen kein Trägermaterial, die Klebebänder
bestehen aus einer Haftklebstoffschicht, die durch ein vom Klebstoff
gut ablösbares Abdeckmaterial geschützt wird.
Diese Haftklebstoffschicht ist bevorzugter Weise fest. Dies hat
den Vorteil, dass die Entfernung von der Haut einfach und im wesentlichen
ohne Reste erfolgt.
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Einen
Sonderfall stellen Klebebänder dar, die mit wasseraktivierbaren
Klebstoffen (bevorzugt mit Dextrin- oder Glutinleimen) beschichtet
sind: Hier ist der Klebstoff mit Wasser aktivierbar, d. h. der Klebstoff
bildet bei Wasserzugabe klebrige Eigenschaften aus. In diesem Fall
werden das Klebeband und/oder die zu beklebende Hautoberfläche
vor Aufbringung des Klebebandes angefeuchtet und/oder mit Wasser
benetzt.
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Als
Haftklebstoffe im Sinne der vorliegenden Erfindung sind viskoelastische
Klebstoffe, deren abgebundener Film bei Raumtemperatur in trockenem
Zustand permanent klebrig und klebfähig bleibt. Dabei kann es
sich um unterschiedliche Klebstoffarten handeln kann, nämlich
insbesondere um einen Schmelzklebstoff, einen Dispersionsklebstoff,
einen lösemittelhaltigen Klebstoff oder einen als Paste
auf das Trägerband aufzutragenden Klebstoff. Basispolymere
der Haftklebstoffe sind Natur- und Synthese-Kautschuke, Polyacrylate, Polyester,
Polychloroprene, Polyisobutene, Polyvinylether und Polyurethane,
die in Kombination mit Zusätzen wie Harzen, Weichmachern und/oder
Antioxidantien eingesetzt werden. Haftklebstoffe können
als wässrige Systeme (Dispersionsklebstoffe), als Lösemittel-
und als Schmelzklebstoff-Systeme formuliert werden.
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Das
Material des Trägers bzw. des Trägerbandes kann
im Rahmen der vorliegenden Erfindung aus einer Vielzahl von polymeren
Materialien ausgewählt werden. Als Beispiele seien genannt
Polyolefine, wie Polyethylen einschließlich HDPE, Polyethylen
hoher Dichte, Polyethylen niedriger Dichte, lineares Polyethylen niedriger
Dichte und lineares Polyethylen sehr niedriger Dichte, Polypropylen
und Polybuthylen, Polyurethane, Vinyl-Copolymere, wie Poly(Vinylchlorid)
und Poly(Vinylacetat), insbesondere weichgemachtes Poly(Vinylchlorid);
olefinische Copolymere, wie Ethylen/Methacrylat-Copolymere, Ethylen/Vinylacetat-Copolymere, Acrylnitril-Butadien-Styrolcopolymere
und Ethylen/Propylen-Copolymere; acrylische Polymere und Copolymere
und Kombinationen dieser Materialien. Coextrudate, Mischungen und
Elends von Kunststoffen oder Kunststoff- und Elastomer-Materialien,
wie Polypropylen/Polyethylen, Polyurethan/Polyolefin, Polyurethan/Polycarbonat
und Polyurethan/Polyester können auch verwendet werden.
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Die
Dicke des Trägerbandes variiert entsprechend dem Anwendungsgebiet.
Für manuelle Anwendungsgebiete, d. h. für Zwecke
des täglichen Bedarfs, wird eine Dicke des Trägerbandes
von 10 bis 250 μm bevorzugt.
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Das
Trägerband weist eine lösemittelfreie oder lösemittelhaltige
Haftklebemasse auf, welche z. B. durch Coextrusion, Schmelzbeschichtung
oder Dispersionsbeschichtung erzeugt wird, wobei diese Klebemasse
vermittels einer Flamm- oder Coronavorbehandlung oder einer Haftvermittlerschicht,
welche durch Coextrusion oder Beschichtung aufgebracht wird, mit
der Oberfläche des Trägermaterials verbunden ist.
Es ist auch möglich, eine Zwischenfolie als sogenannten
Release Liner einzusetzen.
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Der
auf dem Trägerband angeordnete Haftkleber wird vorteilhaft
ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyestern, Polyurethanen,
Styrolcopolymeren und Polyolefinen. Die Klebstoffe auf Basis von Acrylaten
können nicht wasserlöslich oder wasserlöslich
sein, es kann sich z. B. um Copolymere von Isooctylacrylat und Acrylsäure
handeln. Als Synthesekautschuk kommen z. B. Polyisoprene, Polybutadien,
Styrol-Isopren-Styrol- und Styrol-Butadien-Styrol-Blockcopolymere
und andere Elastomere in Frage. Die Klebstoffe können in
Form von Dispersionen vorliegen.
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Die
Klebstoffe auf Basis von Acrylaten können aus einer wässrigen
Matrix oder aus einem Lösungsmittel beschichtet werden,
es kann sich z. B. um Copolymere von Isooctylacrylat und Acrylsäure
handeln. Als Synthesekautschuk kommen z. B. Polyisoprene, Polybutadien,
Styrol-Isopren-Styrol und Styrol-Butadien-Styrol-Blockcoplymere
und andere Elastomere in Frage. Die erfindungsgemäß eingesetzten
silikonbasierten Haftklebstoffe beinhalten z. B. Siloxane und Silanole.
Haftklebstoffe können als Feststoffe oder als Lösung
oder in Form von Dispersionen vorliegen.
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Die
Dicke der Klebstoffschicht kann im Bereich von 5 μm bis
1000 μm variieren. Vorzugsweise wird eine Schichtdicke
von 20 μm bis 250 μm verwendet.
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Vorteilhaft
ist die Klebebeschichtung mit einem Flächengewicht von
10 bis 200 g/m2, vorzugsweise von 30 bis
150 g/m2 auf das Trägerband aufgetragen.
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Die
auf mindestens einer Seite aufgebrachte Haftklebstoffbeschichtung
kann vollflächig sein. Es ist aber auch möglich,
dass nur eine partielle Beschichtung vorliegt. Beispielsweise kann
die Beschichtung mit Haftklebstoff streifenförmig oder
punktförmig aufgebracht sein. Hierdurch kann der Klebstoffverbrauch
reduziert werden. Wesentlich ist es aber, dass ein zum zuverlässigen
Fixieren des Klebebandes ausreichender Flächenanteil mit
Haftklebstoff beschichtet ist.
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Unter
Haftklebstoffen dieser Art sind insbesondere solche auf Acrylatbasis
vorteilhaft. Dieser Begriff ist weitestgehend zu verstehen. So kann
es sich um eine Polyacrylat, ein Polymethacrylat, aber auch um geeignete
Acrylat- bzw. Methacrylat-Copolymere handeln. Derartige Erzeugnisse
werden beispielsweise in Römpp Chemie-Lexikon,
Bd. 5, S. 3274 beschrieben, nämlich Polyacrylate,
ein Polymethacrylate, Copolymerisate aus Acryl- und Methacrylestern,
wie beispielsweise mit Styrol, Vinylchlorid, Vinylacetat, Acrylnitril.
Auch Copolymere auf Acrylat/Methacrylat-Basis sind geeignet. Bevorzugt
werden als Acrylat-Materialien Copolymerisate aus Methacrylsäuremethylester
mit Acrylsäurebutylester.
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Geeignete
Haftkleber sind außerdem solche auf der Basis von (Meth)-Acrylsäureestern
mit Alkylresten von C4 bis C12.
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Daneben
können aber auch geringe Anteile von (Meth)-Acrylsäureestern
mit Alkylresten von C1 bis C3 bzw.
C13 bis C18 enthalten
sein. Außerdem können geringe Anteile (etwa 0–12
Gew.-%) (Meth)-Acrylsäure und/oder andere copolymerisierbare
Säuren, wie Maleinsäure, Fumarsäure,
Itaconsäure einpolymerisiert sein. Zur Steigerung der Kohäsion
und Verbesserung der Stabilität der Dispersion können
auch Anteile von Acrylnitril oder Acrylamiden sowie Vernetzerzusätze,
z. B. N-Methylolacrylamid oder Glycidyl-methacrylat in Verbindung
mit Hydroxylgruppen tragenden (Meth)-Acrylsäureestern oder
mehrfunktionelle Acrylester, z. B. Butandiol-bis-acrylat, verwendet
werden. Schließlich kann ein Teil der (Meth)-Acrylester
durch copolymerisierbare Verbindungen, wie Vinylacetat oder Vinylpropionat
ersetzt sein.
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Zur
Erzeugung haftklebriger, mit ihrer Basis auf dem Trägerband
verankerten Kalotten sind die an sich bekannten technischen Druckverfahren
vom Typ Siebdruck oder Tiefdruck hervorragend geeignet, wobei als Haftklebemassen
Dispersionen mit hohem Feststoffgehalt, bevorzugt konzentrierte,
thixotrope, wässrige Haftklebedispersionen verwendet werden.
Wässrige Dispersionen sind bevorzugt, jedoch können
auch Dispersionen vom Typ der Organosole verwendet werden, also
solche auf Basis eines hochsiedenden organischen Nicht-Lösungsmittels,
oder auch solche vom Typ der Plastisole, wie pastenartiger Produkte
aus Weichmacher plus Kunststoff. Bevorzugt haben wässrige
Dispersionen einen Feststoffgehalt von mindestens 45 Gew.-%, vor allem
von etwa 55–69 Gew.-%.
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Bei
den Ausgangsmaterialien kann es sich um Dispersionen handeln, die
auf Kautschuk, Polyacrylaten, Polyvinylethern bzw. Polyvinylisobutylen
beruhen. Bevorzugt sind handelsübliche Materialien auf
der Basis von Polyacrylaten. Geeignete Handelsprodukte sind Ucecryl
913 und Ucecryl PC 80 (vertrieben von der Firma ucb, Drogenbos,
Belgien) sowie die Kunststoffdispersion VP 859/6 (vertrieben von
der Firma Freihoff). Vorzugsweise enthält der aufzubringende
Haftklebstoff, der zunächst in einem wäßrigen
Medium vorliegt, Netzmittel bzw. Tenside (vertrieben unter der Handelsbezeichnung
Byk W). Die Dispersionen des Haftklebstoffes zur Ausbildung der
Haftkleberschicht werden vorzugsweise in einer Menge von etwa 1
bis 5 g/m2 und ganz besonders bevorzugt
in einer Menge von etwa 2 bis 4 g/m2 auf
das Trägerband aufgetragen.
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Sofern
es sich um einen Haftschmelzklebstoff handelt, ist dieser nicht
dispergiert oder emulgiert und wird damit nicht in Form einer Dispersion,
Emulsion, eines Organosols oder eines Plastisols für die
Beschichtung verwendet. Der Schmelzkleber kann als solcher jedoch
Additive enthalten, z. B. Weichmacher, Stabilisatoren oder ähnliche
Stoffe.
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Die
erfindungsgemäß verwendbaren Schmelzkleber umfassen
beispielsweise: a) thermoplastische Rückgratpolymere; b)
ggf. Klebharze; c) ggf. Weichmacher; d) ggf. viskositätserniedrigende
Mittel; e) ggf. Stabilisatoren; f) ggf. Füllstoffe und
g) ggf. Fotoinitiatoren. Alle thermoplastischen Polymere (a) und
deren Gemische mit den Komponenten (b) bis (g) sind hier verwendbar.
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Geeignete
thermoplastische Rückgratpolymere sind z. B. natürlicher
Kautschuk; synthetischer Kautschuk wie SBS, SIS, SEBS (Styrol/Ethylen/Butadien/Styrol),
SEPS (Styrol/Ethylen/Propylen/Styrol) (Triblockcopolymere) und S-B,
S-I, S-EP (Diblockcopolymere); Polyolefine wie ataktisches PP, Ethylen-Propylen-Butadien-Copolymer;
epoxidiertes Polyolefin, Polyacrylate wie Polybutylacrylsäureester,
Poly (2-ethylhexylacrylsäureester), Polymethacrylsäureester
und deren Copolymere mit z. B. Acrylsäure, Methacrylsäure,
Vinylacetat, Maleinsäureanhydrid, Diacetonacrylamid oder
Acrylnitril; Polyvinylderivate wie Ethylen-Vinylacetat-Copolymer,
(1-Vinyl-2-pyrrolidon)-Vinylacetat-Copolymer, Vinylacetat-Vinyllaurat-Copolymer;
Polyamide wie Diethylentriaminpolyamid; Copolyamide, Polyester,
Copolyester; Copolyetherester, Polyurethane; Silicone. Diese Rückgratpolymere
können als Copolymerisate oder als Gemische untereinander,
vollständig vernetzt oder UV- oder ESH-nachvernetzbar eingesetzt
werden.
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Geeignete
Klebharze sind z. B. aliphatische, alicyclische und aromatische
Kohlenwasserstoffe; Polyterpene; Kolophoniumester wie Kolophonium-Glycerin-Ester,
hydrierter Kolophonium-Pentaerythrit-Ester, polymerisierte Kolophonium-Diethylenglykol-Ester;
polymerisiertes Kolophonium.
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Geeignete
Weichmacher sind z. B. Phthalate wie Diethylphthalat, Dioctylphthalat,
Diisodecylphthalat; Phosphate wie Tributylphosphat, Triphenylphosphat;
Dioctyladipat; Dioctylsebacat; Dibutylmaleat.
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Geeignete
viskositätsemiedrigende Additive sind z. B. aliphatische,
alicyclische und aromatische Kohlenwasserstoffe; flüssiges
Polybuten; flüssiges Polystyrol; Xylol-Formaldehyd-Harze;
Cumaron-Inden-Harze oder Reaktivverdünner wie beispielsweise
Ethoxyethoxyacrylate.
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Geeignete
Stabilisatoren sind z. B. Tetrakis[methylen-3-(3',5'-di-tert.butyl-4'-hydroxyphenyl)propionat]methan;
1,3,5-Trimethyl-2,4,6-tris(3,5-di-tert.butyl-4-hydroxybenzyl)benzol;
4,4'-Thiobis(6-tert.butyl-m-kresol); Zink-dibutyldithiocarbamat;
Dibutyl-thioharnstoff; Octylphenylsalicylat; 2-Hydroxy-4-(2-hydroxy-3-methacryloxy)propio-benzophenon;
Octa-decyl-3-(3',5'-di-tert.butyl-4'-hydroxyphenyl)propionat.
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Geeignete
Füllstoffe sind z. B. mineralische Stoffe wie Kaolin, Talk
oder Titandioxid. Bevorzugt sind Schmelzkleber mit einer Viskosität
von etwa 1000 bis 80000 mPas bei einer Verarbeitungstemperatur von
60 bis 180°C. Für den Schmelzkleber ist eine Flächenbedeckung
von 10 bis 100%, insbesondere 30 bis 60%, vorzuziehen.
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Erfindungsgemäß geeignete
Klebebänder sind die üblicherweise im Haushalt
bzw. Büro zu verwendenden Klebebänder, beispielsweise
von Scotch guard, Beiersdorf (Tesa), Henkel (Pritt) sowie medizinische Klebebänder,
bevorzugt Scanpore® tage von Actavis
Norway AS, Norgesplaster Facility, Norway.
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Das
Klebeband weist vorteilhaft auf rostfreiem Stahl nach einer Minute
eine Klebkraft von < 20
N/cm, bevorzugt < 15
N/cm, insbesondere < 10
N/cm, bevorzugt < 8
N/cm, ganz besonders bevorzugt < 6
N/cm, beispielsweise 1 bis 5 N/cm, 1,8 bis 4 N/cm, wobei die Klebkraft
der nach der Prüfmethode PSTC-1 gemessenen Schälfestigkeit
entspricht. Die Prüfmethode ist von dem Pressure Sensitive
Tape Council entwickelt worden, einem Verband amerikanischer Klebebandhersteller.
Nach den Prüfbedingungen ist die Klebkraft, die Kraft,
die erforderlich ist, um einen Klebestreifen in bestimmter Breiter
unter definierten Bedingungen (Abzugswinkel, Andruck, Geschwindigkeit)
von einer Standardprüfplatte abzuziehen. Zur Prüfung
wird ein Stück Klebeband mit einer Länger von
ca. 400 mm und einer Probenbreite von 25 mm auf eine 200 mm lange,
50 mm breite und ca. 2 mm dicke rostfreie Stahlplatte aufgebracht
und mittels einer 2 kg schweren gummibeschichteten Metallrolle gleichmäßig
angedrückt. Von der so präparierten Stahlplatte
werden ca. 25 mm Klebeband abgezogen. Die Stahlplatte wird mit einer
Mitnehmerklemme in dem Prüfgerät fixiert, und
das freie Bandende wird mit einer anderen Klemme befestigt. Mit
einer definierten Geschwindigkeit von 300 +/–30 mm pro
Minute wird das Klebeband in einem Winkel von 180° von
der Stahlplatte abgezogen, wobei das Prüfgerät
die Werte der Klebkraft anzeigt. Nach Beendigung des Tests wird
ein Mittelwert errechnet, der den Klebkraftwert auf Stahl darstellt. Ausgedrückt
wird dieser Wert mit der Kraft (N), die für den Abzug des
Klebebandes von der Stahlfläche erforderlich ist bei einer
Probenbreite von 25 mm.
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Gemäß einem
weiteren Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird das gemäß Schritt b) aufgebrachte Klebeband
in Schritt c) von der Haut abgerissen. Bei diesem nicht-invasiven
Verfahren werden die oberste bzw. die oberen und ggf. noch die mittleren
Schichten der Epidermis durch das Aufbringen und Abreißen
des Klebebandes bzw. wiederholtem Abreißen von mehreren
Klebebändern abgetragen.
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Das
Verfahren wird so angewendet, dass nur die oberen bis maximal die
mittleren Schichten der Epidermis (bevorzugt maximal bis zum Stratum
spinosum) abgetragen werden. Ein Erreichen der epidermalen/dermalen
Grenzschicht (Stratum basale) und/oder ein Abtragen der Hautschichten
bis auf die Dermis selbst durch das Abreißen der Klebestreifen
sollte unbedingt vermieden werden. Die Grenze ist für den
Fachmann klar bestimmbar. Sobald bei den Probanden ein deutlich
fühlbarer Schmerz auftritt oder die beprobte Haut eine
starke Rötung zeigt, wird die Testung gestoppt. Die behandelte
Haut darf insbesondere nicht nässen oder ein wundenartiges
Aussehen erhalten.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
werden die Schritte b) und c) wiederholt. Bevorzugt werden die Schritte
zwei bis dreißig Mal, insbesondere vier bis zwanzig Mal,
ganz besonders bevorzugt sechs bis sechzehn Mal, hintereinander
(sukzessive) durchgeführt werden. Dies hat den Vorteil,
dass mehr biologisches Material von dem Probanden gesammelt werden
kann.
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Eine
besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft ein Verfahren
nach den vorstehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet,
dass die Wiederholung der Schritte b) und c) auf der im wesentlichen
gleichen Hautstelle erfolgt.
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Dabei
ist es besonders bevorzugt, dass die Wiederholung der Schritte b)
und c) auf der im wesentlichen gleichen Hautstelle erfolgt. D. h.
das Aufkleben und Abreißen von Klebebändern wird
möglichst an der gleichen Stelle, dem gleichen Hautareal
immer wieder durchgeführt. Das hat den Vorteil, dass auch
biologisches Material aus den tieferen Schichten der Epidermis (beispielsweise
Stratum lucidum, Straum granulosum und ggf. auch Stratum spinosum)
mit analysiert werden können.
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Insbesondere
ist es bevorzugt, bei den Wiederholungen jeweils neue Klebebänder
einzusetzen. So kann sich besonders viel biologisches Material anhaften,
welches hinterher für die Analyse zur Verfügung steht.
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Eine
besondere Ausführungsform betrifft ein Verfahren nach einem
der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass zur
Gewinnung des anhaftenden biologischen Materials in Schritt d) der
oder die Klebestreifen mit einer zur Lyse von Zellen geeigneten
Lösung behandelt werden.
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In
einem weiteren Schritt d) der vorliegenden Erfindung wird das an
dem Klebeband anhaftende biologische Material vom Klebeband gewonnen.
Als Anhaftung ist hier sowohl die physikalische als auch chemische
Anhaftung von Material zu verstehen.
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Insbesondere
werden die Klebebänder in Kontakt mit einem, bevorzugter
Maßen flüssigen Medium gebracht, um das biologische
Material von dem Klebeband wieder zu entfernen. Das flüssige
Medium enthält insbesondere Lösungsmittel, bevorzugt
C1 bis C5 Alkohole (bevorzugt Ethanol, Propanol und/oder Isopropanol),
Wasser oder wässrige Systeme, beispielsweise Mischungen
von vorstehend genannten Alkoholen und Wasser. Insbesondere bevorzugt
sind wässrigen Medien, die ggf. weitere Zusätze,
beispielsweise Puffersubstanzen, enthalten.
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Insbesondere
werden Zellen bzw. Zellbestandteile, welche auf diese Weise von
der Haut gewonnen werden, von den Klebeband bzw. den Klebebändern
gewonnen.
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Beispielsweise
ist es geeignet, das biologische Material durch Abspülen
mit oder Einlegen in Wasser oder wässrige Lösungen,
insbesondere gepufferte wässrige Lösungen, welche
weitere Zusätze enthalten können, von den Klebebändern
zu gewinnen.
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Je
nach der Analysemethode, die in Schritt e) eingesetzt werden soll,
wird die gewonnene Probe ggf. weiter aufgearbeitet. Die einschlägigen
Methoden sind dem Fachmann bekannt.
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Gemäß einer
besonders bevorzugten Ausführungsform werden in Schritt
d) das oder die Klebebänder mit einer zur Lyse von Zellen
geeigneten Lösung behandelt.
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Dies
hat den Vorteil, dass gleichzeitig zur Gewinnung des anhaftenden
biologischen Materials die Zellen lysiert, d. h. geöffnet
bzw. aufgeschlossen werden, und biologisches Material, insbesondere Proteine,
RNA, DNA etc. austreten und für weitere Analysen verfügbar
sind. Geeignet sind alle dem Fachmann bekannten, für die
Durchführung des/der nachfolgenden Analyseschritte unproblematischen
bzw. vor dem nachfolgenden Analyseschritt einfach wieder zu entfernenden
lysierenden Substanzen.
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Für
die Analyse von RNA eignen sich beispielsweise Guanidinsalz-haltige
Puffer, insbesondere Guanidinthiocyanat-haltige Puffer. Für
die Gewinnung von Proteinen bzw. Enzymen eignet sich beispielsweise
Triton X.
-
In
einem weiteren Schritt e) des erfindungsgemäßen
Verfahrens wird die Anwesenheit, Menge, Expression und/oder Aktivität
mindestens eines Markers für Hautalterung ausgewählt
aus der Liste gemäß Anhang 1 oder 2 detektiert.
-
Die
Listen gemäß Anhang 1, 2 bzw. 3 (auch als Listen
1, 2 bzw. 3 bezeichnet) enthalten solche Marker, die besonders stark
differentiell exprimiert werden bzw. sich stark unterscheidend.
-
Liste
1 beschreibt die als unterschiedlich bei alten im Vergleich zu jungen
Personen aufgefundenen mRNAs (Quotient), weiterhin angegeben sind
in den Listen 1 und 2 die Genkürzel (Spalte 1) sowie die
zur Zeit der Anmeldung gebräuchlichen systematischen Namen über
die UniProttrEMBL-Accessionnumber (Spalte 2). Die Sonden des cDNA-Chips
aus Beispiel 1 (Spalte 3) wurden anhand der genannten Datenbank-Accessionnummmern
designed. In entsprechenden, dem Fachmann bekannten Datenbanken
(bspw. uniprotKB über www.uniprot.org)
und beziehen sich auf die Zuordnung gemäß Stand
der Datenbank vom 01.06.2009.
-
Die
erfindungsgemäße Lehre zu den als unterschiedlich
expremiert aufgefundenen Marker (im weiteren als Hautalterungsmarker
bezeichnet) als solche oder im erfindungsgemäßen
Verfahren betrifft neben der in der Beschreibung explizit genannten
mRNA auch die daraus für den Fachmann unmittelbar ableitbaren cDNA
und DNAs sowie die entsprechenden codierten Proteine (oder deren
Fragmente). Diese Informationen sind für den Fachmann unmittelbar über
die Accessionnummer in der entsprechenden Datenbank (uniprotKB etc.)
abrufbar.
-
Anhand
der UniProttrEMBL-Accessionnumber (Spalte 2 aus Liste 1 oder 2)
kann das Protein sowie das kodierende Gen eindeutig identifiziert
werden. Der Fachmann ist selbstverständlich in der Lage, über
die offenbarten Sequenzen/Teilsequenzen geeignete Sonden zu entwickeln,
welche eine eindeutige Zuordnung der Detektion erlauben.
-
Erfindungsgemäß ist
bei den Markern die Bezeichnung, welche in der linken Spalte der
Listen 1 und 2 angegeben ist, entscheidend. Wenn diese Bezeichnung
keine eineindeutige Zuordnung erlaubt, kann die Accession-Number
aus der Spalte links daneben (2.Spalte von links) zur Zuordnung
hinzugezogen werden.
-
Als
Marker im Sinne der vorliegenden Erfindung eignen sich sowohl die über
die Beschreibung in der Datenbank auffindbaren Nukleinsäuren
bzw. Proteine. Dabei sind darunter auch die Fragmente der Nukleinsäure-
als auch die Proteinsequenzen zu verstehen, die dem Fachmann eine
eindeutige Zuordnung ermöglichen.
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Die
Angaben in den Listen 1, 2 und 3 beziehen sich aufgrund des Testdesigns
auf den Menschen, wenn das erfindungsgemäße Verfahren
bei anderen Lebewesen, beispielsweise Säugetieren wie der
Maus eingesetzt werden soll, wählt der Fachmann als Marker
den entsprechend in den Datenbanken zugängliche murinen
Marker mit der, ggf. abweichenden, murinen Protein- bzw. Nukleinsäuresequenz
aus. Analoges gilt für andere Lebewesen, insbesondere Säugetiere,
wie z. B. Hunde oder Katzen.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform ist in Schritt e) mindestens
ein Marker für die Hautalterung ausgewählt aus
der Liste gemäß Anhang 2. Die darin beschriebenen
Marker werden in alter und junger Haut deutlich unterschiedlich
exprimiert (wie durch die Angabe der Reihenfolge der unterschiedlichen
Signifikanztests zu entnehmen ist) und können so zu einer
robusten und verlässlichen Einschätzung der Wirkung
des Aktivstoffes und/oder der zu testenden Formulierung beitragen.
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Gemäß einer
besonders bevorzugten Ausführungsform ist in Schritt e)
mindestens ein Marker für die Hautalterung ausgewählt
aus der Liste gemäß Anhang 3. Die darin beschriebenen
Marker werden in alter und junger Haut besonders deutlich unterschiedlich
exprimiert.
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Gemäß einer
ganz besonders bevorzugten Ausführungsform wird in Schritt
e) die Anwesenheit, Menge, Expression und/oder Aktivität
mindestens eines Markers für Hautalterung detektiert, der
ausgewählt ist aus CANX, KRT15, TXLN, ANXA1, CYP7A1, ENG,
VEGFD, MMP11, ADRM1 und MFAP3.
-
Die
entsprechenden Zuordnungen dieser Gennamen zu Referenzsequenzen
bzw. Genen/Genprodukten sind dem Anhang 2 (Spalten 2 bzw. 3) zu
entnehmen.
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Ganz
außerordentlich bevorzugt sind die in Schritt e) zu detektierenden
Hautalterungsmarker ausgewählt aus MMP-11, VEGFD und/oder
ADRM-1.
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MMP-11
(Stromelysin3) ist ein untypisches Mitglied der MMP-Familie, da
es als spezifisches Substrat den alphal-protease inhibitor besitzt,
hingegen Proteine der extrazellulären Matrix wie Fibronektin,
Kollagen und Laminin nur schwach proteolytisch abbauen kann. Damit
kommt MMP-11 eine im Wesentlichen andere Funktion zu als den übrigen
MMP, beispielsweise der MMP-9, die als so genannte Collagenase denaturiertes Kollagen
abbauen.
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KRT15
ist ein Typ I-Kerstin, dessen Typ II-Kerstin-Partner zur Bildung
eines Kerstin-Heterodimers noch nicht eindeutig indentifiziert ist.
KRT15 wird ähnlich wie KRT19 als Stammzellmarker beschrieben,
wobei sich die Eigenschaft als Marker auf potentielle Stammzellen
in der ”Bulge”-Region des Haarfollikels beziehen. KRT15
wird im Gegensatz zu KRT16 nicht in aktivierten Keratinozyten, wie
sie beispielsweise in psoriatischer Haut auftreten, gefunden.
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VEGFD
ist ein durch c-fos induzierbarer Wachstumsfaktor, der strukturell
dem VEGFC ähnelt und an die Rezeptoren VEGFR-2 und VEGFR-3
bindet. Es unterscheidet sich von VEGF (das synonym für
VEGFA verwendet wird) durch das Wirkspektrum. Auch die gewebespezifische
Expression im Herz- und Skelettmuskel sowie im Mesenchym von Lunge
und Haut ist unterschiedlich.
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Gemäß einer
weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Verfahrens wird in Schritt e) in der gleichen Probe die Expression
eines, zweier oder mehrerer weiterer Marker, bevorzugt ebenfalls
ausgewählt aus der Liste gemäß Anhang
1 oder 2, insbesondere der Liste gemäß Anhang
2, bevorzugt der Liste gemäß Anhang 3 bestimmt.
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Es
kann vorteilhaft sein, in Schritt e) mehrere Marker (insbesondere
solche ausgewählt aus der Liste gemäß Anhang
1) oder 2) zu untersuchen.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform ist ein erster in Schritt e)
zu untersuchender Marker ausgewählt aus der Liste gemäß Anhang
3 und ein zweiter in einem weiteren Schritt e) zu untersuchender
Marker ausgewählt aus der Liste gemäß Anhang
1) oder 2).
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Gemäß einer
besonders bevorzugten Ausführungsform wird in Schritt e)
die Anwesenheit, Menge, Expression und/oder Aktivität mindestens
eines Markers für Hautalterung detektiert, der ausgewählt
ist aus CANX, KRT15, TXLN, ANXA1, CYP7A1, ENG, VEGFD, MMP11, ADRM1
und MFAP3 sowie mindestens eines weiteren Markers ausgewählt
aus der Liste gemäß Anhang 1) oder 2).
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Besonders
bevorzugt wird in Schritt e) eine der folgenden Markerkombinationen
untersucht: MMP-11 und CANX; MMP-11 und KRT15; MMP-11 und FLG_2;
MMP-11 und SFN; MMP-11 und TXLN; MMP-11 und ANXA1; MMP-11 und CYP7A1;
MMP-11 und ENG; MMP-11 und VEGFD; MMP-11 und GJA1; MMP-11 und LAMA2;
MMP-11 und ADRM1; MMP-11 und COL9A3; MMP-11 und MFAP3; VEGFD und
CANX; VEGFD und KRT15; VEGFD und FLG_2; VEGFD und SFN; VEGFD und
TXLN; VEGFD und ANXA1; VEGFD und CYP7A1; VEGFD und ENG; VEGFD und
GJA1; VEGFD und LAMA2; VEGFD und ADRM1; VEGFD und COL9A3; VEGFD
und MFAP3; ADRM-1 und CANX; ADRM-1 und KRT15; ADRM-1 und FLG_2;
ADRM-1 und SFN; ADRM-1 und TXLN; ADRM-1 und ANXA1; ADRM-1 und CYP7A1;
ADRM-1 und ENG; ADRM-1 und GJA1; ADRM-1 und LAMA2; ADRM-1 und COL9A3;
ADRM-1 und MFAP3.
-
Diese
Kombinationen sind aufgrund der besonders ausgeprägten
Unterscheidungskraft zwischen alt und jung besonders zum Screening
von Wirkstoffen und/oder Formulierungen geeignet.
-
Aus
gleichem Grund besonders bevorzugt wird in Schritt e) mindestens
eine der folgenden Markerkombinationen untersucht: MMP-11 und DCN
(Decorin); MMP-11 und MMP13; MMP-11 und Biglycan; MMP-11 und CD44;
MMP-11 und CASP4 (Caspase 4); MMP-11 und FN1 (Fibronektin); MMP-11
und VWF (von Willebrandt-Faktor); MMP-11 und Lumican; MMP-11 und
XRCC6; VEGFD und DCN (Decorin); VEGFD und MMP13; VEGFD und Biglycan;
VEGFD und CD44; VEGFD und CASP4 (Caspase 4); VEGFD und FN1 (Fibronektin); VEGFD
und VWF (von Willebrandt-Faktor); VEGFD und Lumican; VEGFD und XRCC6;
ADRM-1 und DCN (Decorin); ADRM-1 und MMP13; ADRM-1 und Biglycan;
ADRM-1 und CD44; ADRM-1 und CASP4 (Caspase 4); ADRM-1 und FN1 (Fibronektin);
ADRM-1 und VWF (von Willebrandt-Faktor); ADRM-1 und Lumican; ADRM-1
und XRCC6;
-
Zu
diesen Kombinationen können selbstverständlich
noch ein, zwei, drei, vier bis mehrere hundert weitere Marker, insbesondere
ausgewählt aus den Listen 1 oder 2 gleichzeitig oder hintereinander
untersucht werden.
-
Besonders
bevorzugt wird in Schritt e) mindestens eine der folgenden Markerkombinationen
untersucht: VEGFD und MMP-11 und DCN (Decorin); VEGFD und MMP-11
und MMP13; VEGFD und MMP-11 und Biglycan; VEGFD und MMP-11 und CD44;
VEGFD und MMP-11 und CASP4 (Caspase 4); VEGFD und MMP-11 und FN1
(Fibronektin); VEGFD und MMP-11 und VWF (von Willebrandt-Faktor);
VEGFD und MMP-11 und Lumican; VEGFD und MMP-11 und XRCC6; ADRM-1
und MMP-11 und DCN (Decorin); ADRM-1 und MMP-11 und MMP13; ADRM-1
und MMP-11 und Biglycan; ADRM-1 und MMP-11 und CD44; ADRM-1 und MMP-11
und CASP4 (Caspase 4); ADRM-1 und MMP-11 und FN1 (Fibronektin);
ADRM-1 und MMP-11 und VWF (von Willebrandt-Faktor); ADRM-1 und MMP-11
und Lumican; ADRM-1 und MMP-11 und XRCC6; ADRM-1 und VEGFD und DCN
(Decorin); ADRM-1 und VEGFD und MMP13; ADRM-1 und VEGFD und Biglycan;
ADRM-1 und VEGFD und CD44; ADRM-1 und VEGFD und CASP4 (Caspase 4);
ADRM-1 und VEGFD und FN1 (Fibronektin); ADRM-1 und VEGFD und VWF
(von Willebrandt-Faktor); ADRM-1 und VEGFD und Lumican; ADRM-1 und
VEGFD und XRCC6;
-
Zu
diesen Kombinationen können selbstverständlich
noch ein, zwei, drei, vier bis mehrere hundert weitere Marker, insbesondere
ausgewählt aus den Listen 1 oder 2 gleichzeitig oder hintereinander
untersucht werden.
-
In
einigen Fällen reicht es aus, die bloße Anwesenheit
eines Markers zu detektieren, um eine Aussage bzgl. der Wirkung
auf die Hautalterung zu treffen.
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In
anderen Fällen ist die Bestimmung der Menge, also der Quantität,
insbesondere der Expression eines Gens und/oder Genprodukten (insbesondere
eines Proteins) bzw. von Genen und/oder Genprodukten (insbesondere
Proteinen) wichtig, um eine Aussage bzgl. der Eignung eines getesteten
Wirkstoffs und/Oder einer getesteten Formulierung zur Bekämpfung
der Hautalterung zu treffen.
-
Handelt
es sich um Enzyme, kann auch die Bestimmung der Aktivität
(bevorzugt der spezifischen Aktivität) des Enzyms bzw.
der Enzyme zu einer Aussage bzgl. der Eignung der Marker zur Bekämpfung
der Hautalterung führen.
-
Zur
Bestimmung der Expression sind alle dem Fachmann bekannten Methoden
zur Bestimmung der Expression von Genen und/oder Proteinen geeignet.
Insbesondere solche Methoden, die eine Quantifizierung dieser Expression
ermöglichen, sind erfindungsgemäß geeignet.
-
Gemäß einer
besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt in Schritt
e) die Detektion der Anwesenheit, Menge, Expression und/oder Aktivität
mittels ELISA, Proteinanalyse oder Nukleinsäureanalyse,
insbesondere auf einem Microarray.
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens wird in Schritt e) die Genexpression selbst, die Expression
eines Genprodukts und/oder die Aktivität mindestens eines
Markers für die Hautalterung (bevorzugt quantitativ) bestimmt.
-
Ggf.
kann die Bestimmung mehrerer absoluter Expressionen durch nachträgliche
Quotientenbildung zu einer noch weiter verbesserten Analysegenauigkeit
führen. Somit können inter-indivduelle Unterschiede
bei der absoluten Expression durch eine einfachere Analyse der relativen
Expression, die Auswahl eines geeigneten Wirkstoffes in einem optionalen
Schritt f) vereinfachen.
-
Weiterhin
ist es beispielsweise möglich, eine entsprechende relative
Expression auch auf Basis einer oder mehrerer nicht von Hautalterung
beeinflussten Marker (einem Referenzmarker) zu bestimmen. Diese mindestens
eine, nicht beeinflusste Marker kann dann in Schritt e) gleichzeitig mit
dem mindestens einen Hautalterungsmarker oder in einem weiteren
Schritt vor- oder nachher bestimmt werden.
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
erfolgt die Bestimmung des Markers in Schritt e) mittels einer Expressionsanalyse
auf einem Microarray.
-
Microarrays
im Sinne der Erfindung sind Nukleinsäurechips (Nukleinsäuremicroarrays)
und/oder Proteinchips (Proteinmicroarrays).
-
Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bestimmung
in Schritt e) mittels Analyse von Nukleinsäuren.
-
Zur
Bestimmung, insbesondere Quantifizierung von RNA wird insbesondere
eine der folgenden Methoden durchführt, die ausgewählt
ist unter
- i. Northern Blots,
- ii. Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT-PCR),
- iii. RNase-Schutzexperimente,
- iv. Dot-Blots,
- v. cDNA-Sequenzierung,
- vi. Klon-Hybridisierung,
- vii. Differential Display,
- viii. Subtraktive Hybridisierung,
- ix. cDNA-Fragment-Fingerprinting,
- x. Total Gene Expression Analysis (TOGA),
- xi. Serielle Analyse der Genexpression (SAGE),
- xii. Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS®)
und insbesondere
- xiii. Einsatz von Nukleinsäurechips,
oder
mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
-
Diese
erfindungsgemäß einsetzbaren Methoden sind in
den Übersichtsartikeln von Akhilesh Pandey und
Matthias Mann: „Proteomics to study genes and genomes",
Nature, Volume 405, Number 6788, 837–846 (2000),
und „Genomics, gene expression and DNA arrays",
Nature, Volume 405, Number 6788, 827–836 (2000),
und den dort angegebenen Referenzen beschrieben, worauf hiermit
in vollem Umfang Bezug genommen wird.
-
Das
TOGA-Verfahren ist in "J. Gregor Sutcliffe et al,
TOGA: An automated parsing technology for analyzing expression of
nearly all genes, Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America (PNAS), Vol. 97, No. 5, pp. 1976–1981
(2000)" beschrieben, worauf hiermit vollumfänglich
Bezug genommen wird.
-
Das
MPSS
®-Verfahren ist in der
US-A-6,013,445 beschrieben,
worauf hiermit in vollem umfang Bezug genommen wird.
-
Beispielhaft
sei im Weiteren ein CDNA Microarray beschrieben. Diese dienen dazu,
RNA-Menge zu quantifizieren und darüber Genaktivitäten
nachzuweisen. Es gibt hauptsächlich zwei verschiedene Arten
von DNA-Microarrays, einerseits solche die auf gebundener cDNA beruhen
und solche die auf synthetisch hergestellten Oligonukleotiden beruhen.
Diese dienen als Sonden, die an definierte Positionen eines Rasters
z. B. auf Glasträger aufgebracht werden. Unabhängig
von der Art der verwendeten Arrays, wird RNA zunächst aus dem
zu untersuchenden Objekt extrahiert und diese nach eventuellen Aufreinigungs-
und/oder Vermehrungsschritten der mRNA in cDNA oder cRNA umgeschrieben
und beispielsweise mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Diese werden
dann mit den Microarrays hybridisiert. Hierbei binden markierte
cDNA/cRNA Stücke an ihren komplementären Gegenpart
auf dem Array. Nach der Abwaschung der nicht gebundenen cDNA/cRNA
Stücke wird das Fluoreszenzsignal jeder Position des DNA-Microarrays
mittels eines Lasers ausgelesen. Diese reine Intensität
wird üblicherweise noch normalisiert um Abbaueffekte, verschieden
gute Extraktionen und andere Effekte mit einzurechnen. In der vorliegenden
Studie wurde der Agilent Whole Genome Oligo Microarray eingesetzt,
bei welchem ca. 40.000 Gene immobilisiert sind.
-
Wenn
in Schritt e) ein weiterer Marker für Hautalterung bestimmt
werden soll, kann diese Bestimmung gleichzeitig oder zeitlich vor
oder nach der ersten Markerbestimmung gemäß Schritt
e) erfolgen.
-
Beispielsweise
ist es ökonomisch sinnvoll, ein oder insbesondere mehrere
Hautalterungsmarker (sowie ggf. ein oder mehrere Referenzmarker)
gleichzeitig auf einem Microarray (Protein oder Nukleinsäurechip) zu
bestimmen, welcher diese und ggf. noch weitere Marker detektieren
kann.
-
Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bestimmung
in Schritt e) mittels Proteinanalyse. Als Alternative zur Bestimmung
der Genexrpession oder auch zur breiten Absicherung der Analyse
kann die Bestimmung auch über alle dem Fachmann bekannten
Methoden zur Proteinanalyse bestimmt werden. Besonders bevorzugt
sind
- i. Affinitätschromatographie
- ii. ein- oder zweidimensionaler Gelelektrophorese
- iii. Protein-Protein-Komplexierung in Lösung
- iv. Massenspektrometrie, insbesondere Matrix Assistierter Laser
Desorptions Ionisation (MALDI) und insbesondere
- v. Einsatz von Proteinchips (microarrays),
oder mittels
geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
-
Es
muss bei der angewendeten Methode gewährleistet sein, dass
der gewünschte Marker spezifisch erkannt wird. Beispielsweise
geeignet sind auch ELISA und andere fluoreszenzmarkierende Methoden,
Antikörper und sonstige Methoden.
-
Bevorzugt
sind bei mehreren Markern, die in Schritt e) zu bestimmen sind,
auch Proteinchips
-
Diese
erfindungsgemäß einsetzbaren Methoden sind in
dem Übersichtsartikel von Akhilesh Pandey und Matthias
Mann: „Proteomics to study genes and genomes",
Nature, Volume 405, Number 6788, 837–846 (2000),
und den dort angegebenen Referenzen beschrieben, worauf hiermit
in vollem Umfang Bezug genommen wird.
-
Die
2D-Gelelektrophorese, wird beispielsweise in L. D. Adams,
Two-dimensional Gel Electrophoresis using the Isodalt System oder
in L. D. Adams & S.
R. Gallagher, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the O'Farrell
System; beide in Current Protocols in Molecular Biology (1997, Eds.
F. M. Ausubel et al.), Unit 10.3.1–10.4.13; oder
in 2-D Electrophoresis-Manual; T. Berkelman, T. Senstedt;
Amersham Pharmacia Biotech, 1998 (Bestell-Nr. 80-6429-60),
beschrieben.
-
Die
massenspektrometrische Charakterisierung der Proteine oder Proteinfragmente
erfolgt in der Fachwelt bekannter Weise, beispielsweise wie in den
folgenden Literaturstellen beschrieben:
- Methods
in Molecular Biology, 1999; Vol 112; 2-D Proteome Analysis Protocols;
Editor: A. J. Link; Humana Press; Totowa; New Jersey. Darin insbesondere:
Courchesne, P. L. und Patterson, S. D.; S. 487–512.
- Carr, S. A. und Annan, R. S.; 1997; in: Current Protocols
in Molecular Biology; Editor: Ausubel, F. M. et al.; John Wiley
and Sons, Inc. 10.2.1–0.21.27.
-
CDNA
Microarrays dienen dazu, RNA-Menge zu quantifizieren und darüber
Genaktivitäten nachzuweisen. Es gibt hauptsächlich
zwei verschiedene Arten von DNA-Microarrays, einerseits solche die
auf gebundener cDNA beruhen und solche die auf synthetisch hergestellten
Oligonukleotiden beruhen. Diese dienen als Sonden, die an definierte
Positionen eines Rasters z. B. auf Glasträger aufgebracht
werden. Unabhängig von der Art der verwendeten Arrays,
wird RNA zunächst aus dem zu untersuchenden Objekt extrahiert
und diese nach eventuellen Aufreinigungs- und/oder Vermehrungsschritten
der mRNA in cDNA oder cRNA umgeschrieben und beispielsweise mit
Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Diese werden dann mit den Microarrays
hybridisiert. Hierbei binden markierte cDNA/cRNA Stücke
an ihren komplementären Gegenpart auf dem Array. Nach der
Abwaschung der nicht gebundenen cDNA/cRNA Stücke wird das
Fluoreszenzsignal jeder Position des DNA-Microarrays mittels eines
Lasers ausgelesen. Diese reine Intensität wird üblicherweise
noch normalisiert um Abbaueffekte, verschieden gute Extraktionen
und andere Effekte mit einzurechnen.
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform erfolgt in einem weiteren Schritt
f) dann die Auswahl eines solchen getesteten Wirkstoffs und/oder
einer getesteten Formulierung als zur Bekämpfung der Hautalterung
geeignet, wenn der getestete Wirkstoff bzw. die getestete Formulierung
zur Modulation mindestens eines der gemäß e) getesteten
Marker fähig ist.
-
Modulation
im Sinne der vorliegenden Erfindung ist jeder Effekt auf die Expression
oder Aktivität der Gene sowie der Genexpressionsprodukte,
jeder Effekt auf ein Gen oder dessen Aktivität auf mindestens
einen ihrer Expressionspromotoren, das Vorkommen und die Aktivität
eines Proteins bzw. Enzyms.
-
Bevorzugt
sind solche Effekt darunter zu verstehen, die eine Erhöhung
oder Verminderung der Regulation, eine Stimulation oder eine teilweise
oder vollständige Inhibition induzieren.
-
Gemäß einer
besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt in Schritt
f) die Auswahl des Wirkstoffs (insbesondere im Hinblick auf die
Bestimmung des Vorliegens einer Modulation) im Vergleich zu einer
Referenz.
-
Es
ist beispielsweise möglich, die in dem Verfahren gefundenen
Messwerte mit anderen Messwerten aus der gleichen oder anderen Testreihen
zu vergleichen, um das Vorliegen einer Modulation zu erkennen und damit
den für die Bekämpfung der Hautalterung geeigneten
Wirkstoff bzw. die Formulierung auszuwählen.
-
Bevorzugt
werden die Messwerte mit Messwerten aus der gleichen und/oder einer ähnlichen
Testreihe verglichen.
-
Gemäß einer
besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Referenz
durch die Durchführung der Schritte b) bis e) des Verfahrens
auf einer nicht mit dem zu testenden Wirkstoff bzw. der zu testenden
Formulierung in Kontakt gekommenen Hautstelle erhalten.
-
Im
Falle eines systemischen In Kontakt Bringens (orale, parenterale
oder sonst wie geartetes Aufnahme der zu testenden Formulierung
bzw. des zu testenden Wirkstoffs) gemäß Schritt
a) ist es sinnvoll, vor (oder zeitlich deutlich nach) dem In Kontakt
bringen eine entsprechende Referenz des gleichen Lebewesens, bevorzugt
des gleichen Menschen zu gewinnen.
-
Es
ist allerdings auch möglich, die Referenz vor, gleichzeitig
oder nach der Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens durch Durchführung der Schritte b) bis e) an
einem oder mehren anderen Lebewesen, insbesondere anderen Menschen
zu erhalten.
-
Bevorzugt
ist es dabei insbesondere, die Referenz vom gleichen Lebewesen,
bevorzugt vom gleichen Menschen zu erhalten.
-
Das
erfindungsgemäß besonders bevorzugte Verfahren,
bei dem in Schritt a) die zu testende Formulierung bzw. der zu testende
Wirkstoff auf eine Hautstelle topisch aufgebracht wird, wird dann
bevorzugt so durchgeführt, dass vergleichbare, nicht behandelte
Hautstellen für die Referenz bzw. für die Auftragung
eines Placebos ausgewählt werden.
-
Beispielsweise
wird dazu auf der einen Unterarminnenseite ein zu testende Formulierung
und/oder ein zu testender Wirkstoff aufgetragen und auf der anderen
Unterarminnenseite entweder die Haut unbehandelt belassen oder ein
Placebo aufgetragen. Dann wird das erfindungsgemäße
Verfahren entsprechend durchgeführt und die unbehandelte/bzw.
mit dem Placebo behandelte Probe als Referenz für die Auswahl
der Probe von der mit der zu testenden Formulierung bzw. dem zu
testenden Wirkstoff behandelten Probe benutzt.
-
Im
Stand der Technik sind bereits Marker für die Hautalterung
bekannt. Gewonnen wurden diese aus Hautbiopsien, bei welchen die
gesamte Haut (Vollhaut) einschließlich der Dermis) betrachtet
und analysiert wurde. Andere Informationen wurden aus Monolayerkulturen
der Hautzellen erhalten.
-
Überraschenderweise
konnten viele der bereits für die Hautalterung bekannten
Marker, nicht über das Tape Stripping nachgewiesen werden.
Trotzdem gelang es überraschenderweise, einige Marker in
den unterschiedlichen Altersgruppen zu identifizieren, deren Expression
zwischen Alt und Jung deutlich voneinander verschieden ist.
-
Vorteilhafterweise
erhält man durch die Messung der Hautalterungsmarker im
Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens nach kurzer
Anwendungszeit bzw. nach wenigen Anwendungen (zum Teil sogar nach
nur einer Anwendung) der zu testenden Wirkstoffe bzw. der zu testenden
Formulierungen Informationen in vivo über den Einfluss
von kosmetischen Produkten, Formulierungen, insbesondere kosmetischen
Formulierungen, oder Wirkstoffen, insbesondere kosmetischen Wirkstoffen.
-
Weiterhin
ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren
in vorteilhafter Weise die Bereitstellung neuer Parameter zur Bestimmung
der Hautalterung in vivo, die über die bisherigen makroskopischen
Eindrücke (sichtbare Hautalterung) hinausgeht.
-
Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren
zur nicht-invasiven Bestimmung des biologischen Alters der Haut
bei einem Lebewesen, bevorzugt einem Menschen, das die folgenden
Schritte umfasst:
- a) In Kontakt bringen eines
Lebewesens, bevorzugt eines Menschen, mit einem zu testenden Wirkstoffs und/oder
einer zu testenden Formulierung
- b) Aufbringen eines Klebebandes auf eine ausgewählte
Hautoberfläche
- c) Gewinnung des am Klebeband anhaftenden biologischen Materials,
- d) Detektion der Anwesenheit, Menge, Expression und/oder Aktivität
mindestens eines Markers für Hautalterung ausgewählt
aus der Liste gemäß Anhang 1 oder 2,
- e) Korrelieren der Ergebnisse aus d) mit den Ergebnissen einer
Vergleichsgruppe.
-
Insbesondere
bevorzugt umfasst dieses Verfahren die folgenden Schritte:
- a) Aufbringen eines Klebebandes auf die Hautoberfläche
- b) Abreißen eines Klebebandes von der Haut
- c) Gewinnung des am Klebeband anhaftenden biologischen Materials,
- d) Detektion der Anwesenheit, Menge, Expression und/oder Aktivität
mindestens eines Markers für Hautalterung ausgewählt
aus der Liste gemäß Anhang 1 oder 2,
- e) Korrelieren der Ergebnisse aus d) mit den Ergebnissen einer
Vergleichsgruppe.
-
Vorteilhafter
weise kann mit diesem Verfahren das biologische Alter der Haut durch
einen Vergleich der aufgefundenen Messwerte mit den Messwerten von
Vergleichsgruppen verschiedener Altersstufen bestimmt werden.
-
Bezüglich
weiterer Eigenschaften sowie bevorzugter Ausführungsformen
des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung
der Hautalterung gilt mutatis mutandis das zu den erfindungsgemäßen
Verfahren zum Screening von Wirkstoffen Gesagte.
-
Die
nachstehenden Beispiele sollen den Gegenstand der Erfindung näher
erläutern, ohne ihn zu beschränken.
-
Beispiel 1:
-
Von
einer jungen Gruppe, bestehend aus 20 Personen (beiderlei Geschlechts)
im Alter zwischen 18 und 27 Jahren, und einer gealterten Gruppe,
bestehend aus 22 Personen (beiderlei Geschlechts) zwischen 54 und
72 Jahren, wurden entweder vom rechten oder linken Arm jeweils zwei
Tape Strip-Proben genommen. Dazu wurden an geeigneter Stelle des
Unterarms 16 aufeinander folgende Abrisse mit Klebebändern
genommen und die Streifen in einer Pufferlösung gesammelt,
in der anhaftenden Zellen lysiert und die in Lösung gegangene
RNA anschließend nach Standardprotokollen aufgearbeitet
wurden.
-
Probengewinnung:
-
Vor
dem Aufkleben wird die Haut mit 100% Alkohol desinfiziert.
-
Insgesamt
wurden 16, vorher auf entsprechende Größe zugeschnittene
Patches (Scanpore tage, Actavis A/S, Norgesplaster, Vennesla, Norwegen)
auf einem Hautareal (2 × 2 cm) des Unterarms aufgeklebt,
ein Kosmetiktuch aufgelegt und dreimal mit einem 1000 g Roller darüber
gerollt. Nach einer Minute wurde das Pflaster mit einer Pinzette
abgenommen, mit einer anderen Pinzette in den Lysispuffer (RLT-Puffer
(Qiagen, enthält Guanidinthiocyanat, 2 ml) überführen,
eine Minute geschüttelt und das Pflaster dann verworfen.
Dies wurde 16 mal auf der gleichen Hautstelle durchgeführt.
Je 8 Klebebänder (Patches, abwechselnde Reihenfolge) wurden
zusammengeführt. Die Probenpuffer werden zum Schluss vereint
(~4 ml) und 4 ml Ethanol (70%) dazugegeben.
-
Die
weitere Aufarbeitung erfolgt mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen,
Hilden, Kat. Nr. 74106) mit DNase Verdau. Die Proben werden
dann in 30 μl Wasser eluiert (2 × 15 μl).
Die Lagerung der aufgearbeiteten RNA erfolgte bis zur weiteren Bearbeitung
bei –20°C.
-
Zur
weiteren Analyse wurden aus den insgesamt 84 verschiedenen RNA-Proben
10 Pools der jungen Spender und 11 Pools der älteren Spender
gemäß oben angegebener Vorgehensweise hergestellt
und das Genexpressionsprofil der jeweiligen Pools anschließend
durch die Verwendung von cDNA-Microarrays (PIQOR (TM) Skin Microarray
der Fa. Miltenyi Biotec) analysiert.
-
Die
erhaltenen Daten wurden bioinformatisch aufbereitet und auf alt-jung-diskriminierende
Gene hin analysiert. Ein Vergleich auf Basis der Medianwerte der
Genexpressionen in den verschiedenen Pools ergab die Liste diskriminerender
Gene gemäß Anhang 1.
-
Beispiel 2:
-
Um
eine möglichst robuste Auswahl an Genen zu treffen, über
deren Expressionsniveau zwischen junger und gealterter Haut unterschieden
werden kann, wurden verschiedene statistische Verfahren auf die
Daten angewendet, namentlich das Pavlidis Template Matching, Zwei-Gruppen
t-Test und die Signifikanzanalyse von Mikroarrays (SAM). Über
den Vergleich der Ergebnisse lässt sich die Auswahl besonders
robuster Diskriminatoren festlegen (angegeben ist die Rangfolge
der Gene als Diskriminator im jeweiligen statistischen Test, in
der Liste gemäß Anhang 2):
-
Beispiel 3:
-
Aus
den diskriminierenden Genen gemäß der Liste – Anhang
2 sind Gene von besonderem Interesse ausgewählt (vgl. Liste
gemäß Anhang 3). Anhang 1:
Name | UniProttrEMBL | RefSeq | fold-change
(old/young) |
KRT5 | P13647 | NM_000424 | –3,223 |
KRT15 | P19012 | NM_002275 | –3,171 |
CD59_HUMAN | P13987 | NM_000611 | –3,091 |
COL17A1 | Q9UMD9 | NM_000494 | –2,487 |
BIGLYCAN | P13247 | NM_001711 | –2,395 |
TPM4 | P07226 | NM_003290 | –2,387 |
FLG_2 | P20930 | NM_002016 | –2,382 |
ENG | Q14926 | NM_000118 | 2,381 |
COX8 | P10176 | NM_004074 | 2,367 |
KRT6 | P02538 | NM_005554 | –2,241 |
HSP90AA1 | P07900 | NM_005348 | –2,219 |
S100A6 | P06703 | NM_014624 | 2,119 |
EMP1 | P54849 | NM_001423 | –2,107 |
PFDN1 | O60925 | NM_002622 | 2,107 |
COL9A3 | Q14050 | NM_001853 | –2,084 |
CD63 | P08962 | NM_001780 | –2,069 |
DCN | P07585 | NM_001920 | –1,997 |
ADFP | Q99541 | NM_001122 | 1,970 |
SRP14 | P37108 | NM_003134 | –1,935 |
LAMA2 | Q14736 | NM_000426 | 1,925 |
ADRM1 | Q16186 | NM_007002 | –1,902 |
KRT17 | Q04695 | NM_000422 | –1,886 |
GJA1 | P17302 | NM_000165 | –1,879 |
PIG8 | O14681 | NM_004879 | 1,877 |
PTK7 | Q13308 | NM_002821 | –1,875 |
HSP90AB1_3PRIME | P08238 | NM_007355 | –1,838 |
HSPD1 | P10809 | NM_002156 | 1,836 |
MAL | P21145 | NM_002371 | –1,811 |
PSMA6 | P34062 | NM_002791 | 1,805 |
TP53BP1 | Q12888 | NM_005657 | 1,801 |
CASP4_HUMAN | P49662 | NM_001225 | –1,799 |
XRCC6 | P12956 | NM_001469 | –1,797 |
SERPINF1 | P36955 | NM_002615 | 1,795 |
TAGLN | Q01995 | NM_003186 | –1,794 |
CCT2 | P78371 | NM_006431 | 1,784 |
B2M | P61769 | NM_004048 | –1,783 |
KRT14 | P02533 | NM_000526 | –1,774 |
MAPK9 | P45984 | NM_002752 | 1,766 |
VIL2 | P23714 | NM_003379 | –1,742 |
TXN | P10599 | NM_003329 | –1,735 |
TNC | P24821 | NM_002160 | –1,704 |
THBS1 | P07996 | NM_003246 | –1,676 |
MCL1 | Q07820 | NM_021960 | 1,673 |
CD44_EX10–12_HUMAN | Q92493 | NM_000610 | –1,636 |
ALDH1A1 | P00352 | NM_000689 | –1,622 |
SPRR3 | Q9UBC9 | NM_005416 | –1,619 |
COL1A2 | P08123 | NM_000089 | –1,605 |
SFN | P31947 | NM_006142 | –1,596 |
ITGA6 | P23229 | NM_000210 | –1,592 |
MGST3 | O14880 | NM_004528 | –1,587 |
CASP1 | P29466 | NM_001223 | –1,587 |
FLK1 | O60723 | NM_002253 | 1,586 |
WSB1 | Q9Y6I7 | NM_015626 | –1,581 |
DPT | Q07507 | NM_001937 | 1,579 |
ITGB1 | P05556 | NM_002211 | –1,575 |
CDH1 | P12830 | NM_004360 | –1,560 |
CYP7A1 | P22680 | NM_000780 | –1,559 |
LUMICAN | P51884 | NM_002345 | –1,559 |
HK1 | O43443 | NM_000188 | –1,555 |
COL10A1 | Q03692 | NM_000493 | 1,555 |
GJB6 | O95452 | NM_006783 | –1,553 |
CASP2 | P42575 | NM_001224 | 1,549 |
CSN1 | Q13098 | NM_004127 | –1,542 |
RHOA | P61586 | NM_001664 | 1,541 |
THY1 | P04216 | NM_006288 | –1,541 |
FN1 | P02751 | NM_002026 | –1,540 |
IKBA | P25963 | NM_020529 | 1,537 |
HSPA5 | P11021 | NM_005347 | 1,537 |
CDM | Q13836 | NM_005745 | –1,536 |
PSMD13 | O75831 | NM_175932 | 1,524 |
VWF | P04275 | NM_000552 | 1,523 |
HPAR14 | Q9Y237 | NM_006223 | 1,521 |
HP-HPR | P00737 | NM_005143 | 1,519 |
STAT3 | P40763 | NM_003150 | –1,514 |
GPX3 | P22352 | NM_002084 | –1,509 |
ANXA1 | P04083 | NM_000700 | –1,506 |
CANX | P27824 | NM_001746 | –1,506 |
CAOP | Q15067 | NM_007292 | –1,503 |
Anhang 2:
Name | UniProttrEMBL | RefSeq | stronger expression
in | PTM | t-tes | SAM | group
median |
ADRM1 | Q16186 | NM_007002 | young | 2 | 2 | 1 | 25 |
COL9A3 | Q14050 | NM_001853 | young | 5 | 14 | 2 | 19 |
KRT15 | P19012 | NM_002275 | young | 14 | 21 | 4 | 3 |
FLG_2 | P20930 | NM_002016 | young | 11 | 38 | 8 | 10 |
SFN | P31947 | NM_006142 | young | 6 | 8 | 6 | 53 |
GJA1 | P17302 | NM_000165 | young | 13 | 36 | 10 | 27 |
CYP7A1 | P22680 | NM_000780 | young | 10 | 7 | 12 | 62 |
SRP14 | P37108 | NM_003134 | young | 21 | 39 | 14 | 23 |
EMP1 | P54849 | NM_001423 | young | 41 | 23 | 19 | 17 |
ANXA1 | P04083 | NM_000700 | young | 4 | 9 | 7 | 82 |
KRT6 | P02538 | NM_005554 | young | 28 | 50 | 15 | 13 |
CANX | P27824 | NM_001746 | young | 9 | 4 | 13 | 83 |
TAGLN | Q01995 | NM_003186 | young | 37 | 25 | 22 | 38 |
ITGA6 | P23229 | NM_000210 | young | 26 | 33 | 18 | 54 |
KRT17 | Q04695 | NM_000422 | young | 33 | 67 | 16 | 26 |
KRT14 | P02533 | NM_000526 | young | 43 | 45 | 20 | 41 |
CAOP | Q15067 | NM_007292 | young | 39 | 16 | 33 | 84 |
CDH1 | P12830 | NM_004360 | young | 44 | 56 | 23 | 61 |
MFAP3 | P55082 | NM_005927 | young | 7 | 5 | 9 | |
ENG | 014926 | NM_000118 | old | 24 | 10 | | 11 |
KRT5 | P13647 | NM_000424 | young | | 61 | 17 | 2 |
DCN | P07585 | NM_001920 | young | | 28 | 32 | 21 |
FOSL2 | P15408 | NM_005253 | young | 20 | 27 | 35 | |
LAMA3 | Q16787 | NM_000227 | young | 29 | 29 | 25 | |
LAMA2 | 014736 | NM_000426 | old | 19 | 43 | | 24 |
MCL1 | Q07820 | NM_021960 | old | 23 | 17 | | 48 |
GJA1 | Q9Y518 | NM_000165 | young | 31 | 31 | 27 | |
TPM4 | P07226 | NM_003290 | young | | 62 | 28 | 8 |
RELB | Q01201 | NM_006509 | young | 35 | 13 | 53 | |
SDCBP | O00173 | NM_005625 | young | 38 | 26 | 39 | |
COL17A1 | Q9UMD9 | NM_000494 | young | | 72 | 29 | 6 |
CASP2 | P42575 | NM_001224 | old | 32 | 11 | | 68 |
MMP13 | P45452 | NM_002427 | young | 8 | 80 | 24 | |
BIGLYCAN | P13247 | NM_001711 | young | | 89 | 34 | 7 |
FOS_1 | P01100 | NM_005252 | young | 42 | 52 | 36 | |
PSMD13 | O75831 | NM_175932 | old | 12 | 42 | | 76 |
CD63 | P08962 | NM_001780 | young | | 83 | 38 | 20 |
STAT3 | P40763 | NM_003150 | young | | 49 | 26 | 80 |
TNC | P24821 | NM_002160 | young | | 70 | 49 | 45 |
COL10A1 | Q03692 | NM_000493 | old | 30 | 81 | | 65 |
HP-HPR | P00737 | NM_005143 | old | 18 | 84 | | 79 |
CASP1 | P29466 | NM_001223 | young | | 77 | 56 | 56 |
VEGFD | O43915 | NM_004469 | old | 3 | 1 | | |
MMP11 | P24347 | NM_005940 | old | 17 | 6 | | |
CD59_HUMAN | P13987 | NM_000611 | young | | | 21 | 4 |
QSOX1 | O00391 | NM_0010041
28 | young | 25 | 15 | | |
TXLN | P40222 | NM_175852 | old | 27 | 24 | | |
PSMA6 | P34062 | NM_002791 | old | | 19 | | 33 |
CYP2A6-CYP2A7-CYP2A13-CYP2A6V2_HUMAN | P11509 | NM_000762 | young | 40 | 20 | | |
GRO1_HUMAN | P09341 | NM_001511 | young | | 18 | 45 | |
HSP90AA1 | P07900 | NM_005348 | young | | | 52 | 14 |
CYP2C9_HUMAN | P11712 | NM_000771 | old | 36 | 34 | | |
HSP90AB1_3PRIME | P08238 | NM_007355 | young | | | 40 | 30 |
XRCC6 | P12956 | NM_001469 | young | | | 37 | 36 |
HSPA9 | P31932 | NM_004134 | young | | 30 | 48 | |
CD44_EX10-12_HUMAN | Q92493 | NM_000610 | young | | | 31 | 49 |
FLK1 | O60723 | NM_002253 | old | | 37 | | 57 |
GJA7 | P36383 | NM_005497 | young | | 53 | 50 | |
ACTB | P60709 | NM_001101 | young | | 73 | 30 | |
ITGB1 | P05556 | NM_002211 | young | | | 44 | 60 |
MMP7 | P09237 | NM_002423 | young | 45 | 59 | | |
COL1A2 | P08123 | NM_000089 | young | | 55 | | 52 |
HK1 | O43443 | NM_000188 | young | | | 46 | 64 |
CASP4_HUMAN | P49662 | NM_001225 | young | | 82 | | 35 |
THBS1 | P07996 | NM_003246 | young | | 71 | | 47 |
TP53BP1 | Q12888 | NM_005657 | old | | 88 | | 34 |
TP53BP2 | Q13625 | NM_005426 | young | | 75 | 47 | |
GJB6 | O95452 | NM_006783 | young | | 60 | | 66 |
B2M | P61769 | NM_004048 | young | | 86 | | 40 |
FN1 | P02751 | NM_002026 | young | | 58 | | 72 |
FBLN1_1 | P23142 | NM_006486 | young | | 78 | 55 | |
COX8 | P10176 | NM_004074 | old | | | | 12 |
S100A6 | P06703 | NM_014624 | old | | | | 16 |
PFDN1 | O60925 | NM_002622 | old | | | | 18 |
ADFP | Q99541 | NM_001122 | old | | | | 22 |
PIG8 | O14681 | NM_004879 | old | | | | 28 |
PTK7 | Q13308 | NM_002821 | young | | | | 29 |
HSPD1 | P10809 | NM_002156 | old | | | | 31 |
FASLG | P48023 | NM_000639 | old | | 32 | | |
MAL | P21145 | NM_002371 | young | | | | 32 |
SERPINF1 | P36955 | NM_002615 | old | | | | 37 |
CCT2 | P78371 | NM_006431 | old | | | | 39 |
TNFSF9 | P41273 | NM_003811 | old | | 41 | | |
UGGT1 | Q9NYU2 | NM_020120 | young | | | 41 | |
MAPK9 | P45984 | NM_002752 | old | | | | 42 |
MT-GRPE1 | Q9HAV7 | NM_025196 | young | | | 42 | |
HSPA1A-HSPA1B | P19790 | NM_005345 | young | | | 43 | |
VIL2 | P23714 | NM_003379 | young | | | | 43 |
STIP1 | P31948 | NM_006819 | young | | 44 | | |
TXN | P10599 | NM_003329 | young | | | | 44 |
P53 | P04637 | NM_000546 | old | | 46 | | |
SLIT1 | O75093 | NM_003061 | old | | 47 | | |
MMP14 | Q92678 | NM_004995 | young | | 48 | | |
ALDH1A1 | P00352 | NM_000689 | young | | | | 50 |
AC15 | P35251 | NM_002913 | young | | 51 | | |
SPRR3 | Q9UBC9 | NM_005416 | young | | | | 51 |
GDF2 | Q9Y571 | NM_016204 | young | | | 51 | |
PARP1 | P09874 | NM_001618 | old | | 54 | | |
LDHB | P07195 | NM_002300 | young | | | 54 | |
MGST3 | O14880 | NM_004528 | young | | | | 55 |
WSB1 | Q9Y6I7 | NM_015626 | young | | | | 58 |
DPT | Q07507 | NM_001937 | old | | | | 59 |
MAPK8 | P45983 | NM_002750 | old | | 63 | | |
LUMICAN | P51884 | NM_002345 | young | | | | 63 |
DBPA | P16989 | NM_003651 | young | | 64 | | |
MMP6 | Q99547 | NM_005792 | young | | 65 | | |
IAP1 | Q13489 | NM_001165 | young | | 66 | | |
GJA5 | P36382 | NM_181703 | young | | 68 | | |
TIMP3 | P35625 | NM_000362 | young | | 69 | | |
CSN1 | Q13098 | NM_004127 | young | | | | 69 |
RHOA | P61586 | NM_001664 | old | | | | 70 |
THY1 | P04216 | NM_006288 | young | | | | 71 |
IKBA | P25963 | NM_020529 | old | | | | 73 |
HSPA5 | P11021 | NM_005347 | old | | | | 74 |
CCT3 | P49368 | NM_005998 | old | | 74 | | |
CDM | Q13836 | NM_005745 | young | | | | 75 |
ABME | P41238 | NM_001644 | young | | 76 | | |
VWF | P04275 | NM_000552 | old | | | | 77 |
HPAR14 | Q9Y237 | NM_006223 | old | | | | 78 |
OSF | Q92882 | NM_012383 | young | | 79 | | |
GPX3 | P22352 | NM_002084 | young | | | | 81 |
MOBP | Q13874 | NM_006501 | young | | 85 | | |
STAT6 | P42226 | NM_003153 | young | | 87 | | |
Anhang 3:
Name | stronger
expression in | PTM | t-test | SAM | group
median | Cluster |
CANX | young | 9 | 4 | 13 | 83 | Chaperon |
KRT15 | young | 14 | 21 | 4 | 3 | Differenzierungsmarker/Barriere |
FLG_2 | young | 11 | 38 | 8 | 10 | Differenzierungsmarker/Barriere |
SFN | young | 6 | 8 | 6 | 53 | Differenzierungsmarker/Barriere |
TXLN | old | 27 | 24 | | | Immunologie |
ANXA1 | young | 4 | 9 | 7 | 82 | Immunologie |
CYP7A1 | young | 10 | 7 | 12 | 62 | Metabolismus |
ENG | old | 24 | 10 | | 11 | Signaling |
VEGFD | old | 3 | 1 | | | Signaling |
GJA1 | young | 13 | 36 | 10 | 27 | Signaling |
LAMA2 | old | 19 | 43 | | 24 | Zell-Matrix-Interaktion |
MMP11 | old | 17 | 6 | | | Zell-Matrix-Interaktion |
ADRM1 | young | 2 | 2 | 1 | 25 | Zell-Matrix-Interaktion |
COL9A3 | young | 5 | 14 | 2 | 19 | Zell-Matrix-Interaktion |
MFAP3 | young | 7 | 5 | 9 | | Zell-Matrix-Interaktion |
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - EP 1112077 [0008]
- - US 6013445 A [0111]
-
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-
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- - Akhilesh Pandey und Matthias Mann: „Proteomics to
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- - Akhilesh Pandey und Matthias Mann: „Proteomics to
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- - L. D. Adams, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the
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Unit 10.3.1–10.4.13 [0119]
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