MX2007009935A - Anticuerpos monoclonales que carecen de residuos fucosilo contra antigeno membranal especifico de prostata (psma). - Google Patents

Abstract

La invencion concierne a anticuerpos anti-PSMA que carecen de residuos fucosilo. Los anticuerpos de la invencion exhiben actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) incrementada en comparacion con la forma fucosilada de los anticuerpos. La invencion tambien proporciona celulas huesped que expresan los anticuerpos anti-PSMA que carecen de residuos fucosilo, en donde las celulas huesped son deficientes para una fucosil transferasa. Tambien se proporcionan metodos para utilizar los anticuerpos para inhibir el crecimiento de celulas PSMA+, tales como celulas tumorales.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES QUE CARECEN DE RESIDUOS FUCOSILO CONTRA ANTÍGENO MEMBRANAL ESPECÍFICO DE PRÓSTATA (PSMA) ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cáncer de próstata es una causa principal de morbilidad y mortalidad entre varones. Los tratamientos para el cáncer de próstata incluyen cirugía, hormonas, radiación y quimioterapia. Existen tratamientos poco efectivos para la enfermedad metastásica de próstata. Por lo tanto, la identificación de genes y/o productos génicos que representen marcadores de diagnóstico y de pronóstico, así como también objetivos para terapia, es crítica. El antígeno específico de próstata (PSA) es un marcador de cáncer que es útil en el diagnóstico clínico e identificación de etapas del cáncer de próstata. Sin embargo, el PSA no puede diferenciar la hiperplasia prostática benigna (BPH) de la prostatitis o cáncer de próstata en el intervalo de 4-10 ng/ml, de esta manera, se necesita una valoración citológica y/o histológica para confirmar el diagnóstico apropiado (Barren, R.J. et al. (1998) Prostate 36:181-188). El antígeno membranal específico de próstata (PSMA) es una glicoproteína transmembranal tipo II de 750 aminoácidos de aproximadamente 110 kD que tiene 54% de homología con el receptor de transferrina. El PSMA tiene 3 dominios estructurales, que incluyen un dominio intracelular de 19 aminoácidos, un dominio transmembranal de 24 aminoácidos, y un dominio extracelular de 707 aminoácidos. La proteína PSMA muestra actividad de neurocarboxipeptidasa y folato hidrolasa y se reporta involucrada en la relación neuroendócrina del crecimiento y diferenciación de la próstata (Heston, W.D. (1996) Urologe-Ausgabe A. 35:400-407). El PSM' es una forma empalmada de manera alternativa del PSMA que se localiza en el citoplasma. El PSMA se expresa predominantemente por células epiteliales prostáticas. La expresión de PSMA se incrementa en el cáncer de próstata, especialmente en carcinomas deficientemente diferenciados, metastásicos y refractarios a hormonas (Gregorakis, A.K. et al. (1998) Seminars in Orologic Oncology 16:2-12; Silver, D.A. (1997) Clinical Cáncer Research 3:81-85). ün bajo nivel de expresión de PSMA se observa en tejidos extraprostáticos tales como el intestino delgado, glándulas salivales, mucosa duodenal, túbulos renales proximales, y cerebro (Silver, D.A. (1997) Clinical Cáncer Research 3:81-85). El PSMA se expresa también en células endoteliales de vasos capilares y áreas peritumorales y endotumorales de ciertas neoplasias malignas, incluyendo carcinoma de células renales, y carcinomas de colón, pero no en vasos sanguíneos de tejidos normales. Además, el PSMA se reporta relacionado con la angiogénesis tumoral (Silver, D.A. (1997) Clinical Cáncer Research 3:81-85).

Se han descrito anticuerpos contra el dominio extracelular del PSMA (véase por ejemplo, Liu, H. et al. (1997) Cáncer Res. 57:3629-3634; Murphi, G.P. et al. (1998) J. Urol. 160:2396-2401; Wang, S. et al. (2001) Ent. J. Cáncer 92:871-876; Kato, K. et al. (2003) Ent. J. Urol. 10:439-444; Patente Norteamericana No. 6,150,508 y Patente Norteamericana No. 6,107,090). Más recientemente, anticuerpos humanos y humanizados que se unen al PSMA se han descrito (véase por ejemplo, Bander, N.H. et al. (2003) Semin. Oncol. 30:667-676; Publicación de PCT WO 02/098897; Publicación de PCT WO 01/09192; Publicación de PCT WO 03/064606; Publicación de PCT WO 03/034903; y Solicitud Norteamericana No. 2004/0033229) . Tales anticuerpos se han utilizado para adquirir imágenes de células cancerosas de próstata (véase por ejemplo, Yao, D. et al. (2002) Semin. Urol. Oncol. 20:211-218; Bander, N.H. et al. (2003) J. Urol. 170:1717-1721). Los anticuerpos anti-PSMA se han utilizado también para la intervención terapéutica en el tratamiento de cáncer de próstata, típicamente como un conjugado con un agente quimioterapéutico o isótopo radiactivo (véase por ejemplo, Nanus, D.M. et al. (2003) J. Urol. 170:S84-89; Milowsky, M.I. et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22:2522-2531; Henry, M.D. et al. (2004) Cáncer Res. 64:7995-8001) . Se desean anticuerpos terapéuticos mejorados contra PSMA que sean efectivos para tratar y/o prevenir enfermedades que involucran la expresión de PSMA, en particular anticuerpos que tengan efectos citotóxicos sin la necesidad de conjugarse a un agente quimioterapéutico o isótopo radiactivo.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona anticuerpos desfucosilados aislados (es decir, anticuerpos que carecen de residuos de fucosa) que se unen a PSMA humano y exhiben eliminación citotóxica celular dirigida por anticuerpos (ADCC) intensificada de células que expresan PSMA, en comparación con la forma no desfucosilada del anticuerpo (es decir, anticuerpos que contienen residuos de fucosa) . También se proporcionan métodos para tratar una diversidad de enfermedades que involucran la expresión de PSMA utilizando los anticuerpos y composiciones de la invención. Los anticuerpos desfucosilados de la presente invención se unen a PSMA e inhiben el crecimiento de células que expresan PSMA al intensificar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) en la presencia de células efectoras humanas (por ejemplo, monocitos o células mononucleares), en comparación con la forma fucosilada del anticuerpo. En consecuencia, los anticuerpos de la presente invención proporcionan un medio mejorado para tratar trastornos caracterizados por la expresión de PSMA. En consecuencia, en un aspecto, la invención concierne a un anticuerpo anti-antígeno membranal específico de próstata (PSMA) aislado, que carece de residuos de fucosa. Preferiblemente, el anticuerpo intensifica la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos de las células que expresan PSMA en superficie celular, en comparación con una forma del anticuerpo que contiene residuos de fucosa. En modalidades preferidas, el anticuerpo que carece de residuos de fucosa tiene una EC5o de actividad ADCC contra células cancerosas de próstata LNCaP de 0.05 µg/ml o menos, o 0.04 µg/ml o menos, o 0.03 µg/ml o menos, o 0.02 µg/ml o de aproximadamente 0.018 µg/ml o menos. En otras modalidades preferidas, el anticuerpo que carece residuos de fucosa tiene una EC50 de actividad ADCC contra células cancerosas de próstata LNCaP que es por lo menos 3 veces menor (o por lo menos 4 veces menor, o por lo menos 5 veces menor o por lo menos 6 veces menor) que la EC50 de la actividad ADCC contra células cancerosas de próstata LNCaP de la forma del anticuerpo que contiene residuos de fucosa. Preferiblemente, el anticuerpo desfucosilado de la invención es un anticuerpo monoclonal. En un aspecto, la invención concierne a un anticuerpo monoclonal humanizado o quimérico. Preferiblemente, el anticuerpo humanizado o quimérico se prepara a partir de un anticuerpo anti-PSMA de ratón seleccionado del grupo que consiste de: 3F5.4G6, 3D7.1.1, 4E10-1.14, 3E11, 4D8, 3E6, 3C9, 2C7, 1G3, 3C4, 3C6, 4D4, 1G9, 5C8B9, 3G6, 4C8B9, E99, J415, J533 y J591. En otro aspecto, la invención concierne a un anticuerpo monoclonal humano. En una modalidad preferida, el anticuerpo monoclonal humano comprende una región variable de cadena pesada humana y una región variable de cadena ligera humana, en donde: (a) la región variable de cadena pesada humana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 1-9; y (b) la región variable de cadena ligera humana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 10-18. En diversas modalidades, las siguientes combinaciones de cadena pesada y ligera se prefieren: la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 1 y la región variable de cadena ligera humana comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 10; la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 2 y la región variable de cadena ligera humana comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 11; la región variable de cadena pesada humana ' comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 3 y la región variable de cadena ligera humana comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 12; la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 4 y la región variable de cadena ligera humana comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 13; la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 5 y la región variable de cadena ligera humana comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 14; la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 6 y la región variable de cadena ligera humana comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 15; la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 7 y la región variable de cadena ligera humana comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 16; la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 8 y la región variable de cadena ligera humana comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 17; la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 9 y la región variable de cadena ligera humana comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 18. En otra modalidad, un anticuerpo monoclonal de la invención comprende: (a) una región variable de cadena pesada humana CDRl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 19-27; (b) una región variable de cadena pesada humana CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 28-36; (c) una región variable de cadena pesada humana CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 37-45; (d) una región variable de cadena ligera humana CDRl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 46-54; (e) una región variable de cadena ligera humana CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 55-63; y (f) una región variable de cadena ligera humana CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 64-72. En diversas modalidades, las siguientes combinaciones CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y cadena ligera se prefieren: (a) una región variable de cadena pesada humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 19; (b) una región variable de cadena pesada humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 28; (c) una región variable de cadena pesada humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 37; (d) una región variable de cadena ligera humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 46; (e) una región variable de cadena ligera humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 55; y (f) una región variable de cadena ligera humana CDR3 que comprende SEC. DE I DENT. NO: 64; o (a) una región variable de cadena pesada humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 20; (b) una región variable de cadena pesada humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 29; (c) una región variable de cadena pesada humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 38; (d) una región variable de cadena ligera humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 47; (e) una región variable de cadena ligera humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 56; y (f) una región variable de cadena ligera humana CDR3 que comprende SEC. DE I DENT. NO: 65; o (a) una región variable de cadena pesada humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 21; (b) una región variable de cadena pesada humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 30; (c) una región variable de cadena pesada humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 39; (d) una región variable de cadena ligera humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 48; (e) una región variable de cadena ligera humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 57; y (f) una región variable de cadena ligera humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 66; o (a) una región variable de cadena pesada humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 22; (b) una región variable de cadena pesada humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 31; (c) una región variable de cadena pesada humana CDR3 que comprende SEC. DE I DENT. NO: 40; (d) una región variable de cadena ligera humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 49; (e) una región variable de cadena ligera humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 58; y (f) una región variable de cadena ligera humana CDR3 que comprende SEC. DE I DENT. NO: 67; o (a) una región variable de cadena pesada humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 23; (b) una región variable de cadena pesada humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 32; (c) una región variable de cadena pesada humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 41; (d) una región variable de cadena ligera humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 50; (e) una región variable de cadena ligera humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 59; y (f) una región variable de cadena ligera humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 68; o (a) una región variable de cadena pesada humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 24; (b) una región variable de cadena pesada humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 33; (c) una región variable de cadena pesada humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 42; (d) una región variable de cadena ligera humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 51; (e) una región variable de cadena ligera humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 60; y (f) una región variable de cadena ligera humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 69; o (a) una región variable de cadena pesada humana CDRl que comprende SEC. DE I DENT. NO: 25; (b) una región variable de cadena pesada humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 34; (c) una región variable de cadena pesada humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 43; (d) una región variable de cadena ligera humana CDRl que comprende SEC. DE I DENT. NO: 52; (e) una región variable de cadena ligera humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 61; y (f) una región variable de cadena ligera humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 70; o (a) una región variable de cadena pesada humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 26; (b) una región variable de cadena pesada humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 35; (c) una región variable de cadena pesada humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 44; (d) una región variable de cadena ligera humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 53; (e) una región variable de cadena ligera humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 62; y (f) una región variable de cadena ligera humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 71; o (a) una región variable de cadena pesada humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 27; (b) una región variable de cadena pesada humana CDR2 que comprende SEC. DE I DENT. NO: 36; (c) una región variable de cadena pesada humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 45; (d) una región variable de cadena ligera humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 54; (e) una región variable de cadena ligera humana CDR2 que comprende SEC. DE I DENT. NO: 63; y (f) una región variable de cadena ligera humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 72. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-PSMA humano desfucosilado que comprende una región variable de cadena pesada que es un producto de o se deriva a partir de un gen VH 5-51 o VH 3-30.3 humano. La invención también proporciona un anticuerpo anti-PSMA humano desfucosilado que comprende una región variable de cadena ligera que es un producto de o se deriva a partir de un gen Vk L6, 04/014 o L18 humano. La invención aún además proporciona un anticuerpo anti-PSMA humano desfucosilado que comprende una región variable de cadena pesada que es un producto de o se deriva a partir de un gen VH 5-51 o VH 3-30.3 humano y una región variable de cadena ligera que es un producto de o se deriva a partir de un gen Vk L6, 04/014 o L18 humano. En otro aspecto, la invención concierne a una gallina quimérica que comprende genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina que codifican un anticuerpo anti-PSMA de manera que el anticuerpo anti-PSMA se expresa en los huevos de la gallina quimérica, en donde el anticuerpo anti-PSMA expresado en los huevos de la gallina quimérica carece de residuos de fucosa. Preferiblemente, los genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina son genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana. En otro aspecto, la invención concierne a una célula huésped que comprende genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina que codifican un anticuerpo anti-PSMA, en donde la célula huésped carece de una fucosiltransferasa de manera que el anticuerpo anti-PSMA expresado por la célula huésped carece de residuos de fucosa. Preferiblemente, los genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina son genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana. Preferiblemente, la fucosiltransferasa es FUT8. Preferiblemente, la célula huésped es una célula CHO. En otro aspecto, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de células PSMA+. El método involucra contactar las células con un anticuerpo anti-PSMA desfucosilado bajo condiciones suficientes para inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) de las células. Las células pueden ser, por ejemplo, células tumorales. Preferiblemente, el anticuerpo anti-PSMA es un anticuerpo humano. La invención también proporciona un método para inhibir el crecimiento de células tumorales en un sujeto, en donde las células tumorales o células endoteliales vasculares próximas a las células tumorales expresan PSMA. El método involucra administrar al sujeto un anticuerpo anti-PSMA desfucosilado en una cantidad efectiva para inhibir el crecimiento de las células tumorales en el sujeto. Preferiblemente, el anticuerpo anti-PSMA es un anticuerpo humano. En modalidades preferidas, las células tumorales son células tumorales de carcinoma prostático. Otras características y ventajas de la presente invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada y ejemplos que no deben interpretarse como limitantes. Los contenidos de todas las referencias, entradas de Genbank, patentes y solicitudes de patente publicadas citadas en toda esta solicitud se incorporan expresamente en la presente para referencia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 4A3, 7F12, 8C12, 8A11 y 16F9 (SEC. DE IDENT. NOS: 1-5, respectivamente) con la secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO: 73) de VH 5-51 de línea germinal humana.

La Figura 2 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 4A3, 7F12 y 8C12 (SEC. DE IDENT. NOS: 10-12, respectivamente) con la secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO: 74) de Vk L6 de línea germinal. La Figura 3 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 8A11 y 16F9 (SEC. DE IDENT. NOS: 13 y 14, respectivamente) con la secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO: 75) de Vk 04/014 de línea germinal humana. La Figura 4A muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO: 78) y secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO: 9) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 1C3. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. NO: 27), CDR2 (SEC. DE IDENT. NO: 36) y CDR3 (SEC. DE IDENT. NO: 45) se delinean y las derivaciones de línea germinal V, D y J se indican. La Figura 4B muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO: 82) y secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO: 18) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 1C3. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. NO: 54), CDR2 (SEC. DE IDENT. NO: 63) y CDR3 (SEC. DE IDENT. NO: 72) se delinean y las derivaciones de línea germinal V y J se indican. La Figura 5A muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO: 79) y secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO: 6) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 2A10. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. NO: 24), CDR2 (SEC. DE IDENT. NO: 33) y CDR3 (SEC. DE IDENT. NO: 42) se delinean y las derivaciones de línea germinal V y J se indican. La Figura 5B muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO: 83) y secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO: 15) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 2A10. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. NO: 51), CDR2 (SEC. DE IDENT. NO: 60) y CDR3 (SEC. DE IDENT. NO: 69) se delinean y las derivaciones de línea germinal V y J se indican. La Figura 6A muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO: 80) y secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO: 7) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 2C6. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. NO: 25), CDR2 (SEC. DE IDENT. NO: 34) y CDR3 (SEC. DE IDENT. NO: 43) se delinean y las derivaciones de línea germinal V, D, y J se indican. La Figura 6B muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO: 84) y secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO: 16) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 2C6. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. NO: 52), CDR2 (SEC. DE IDENT. NO: 61) y CDR3 (SEC. DE IDENT. NO: 70) se delinean y las derivaciones de línea germinal V y J se indican. La Figura 7A muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO: 81) y secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO: 8) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 2F5. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. NO:26), CDR2 (SEC. DE IDENT. NO: 35) y CDR3 (SEC. DE IDENT. NO: 44) se delinean y las derivaciones de línea germinal V, D, y J se indican. La Figura 7B muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO: 85) y secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO: 17) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 2F5. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. NO: 53), CDR2 (SEC. DE IDENT. NO: 62) y CDR3 (SEC. DE IDENT. NO: 71) se delinean y las derivaciones de línea germinal V y J se indican. La Figura 8 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 2A10, 2C6 y 2F5 (SEC. DE IDENT. NOS: 6-8, respectivamente) con la secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO: 73) de VH 5-51 de línea germinal humana. La Figura 9 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 1C3 (SEC. DE IDENT. NO: 9) con la secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO: 76) de VH 3-30.3 de línea germinal humana y la línea germinal JH6b (SEC. DE IDENT. NO: 86) . La Figura 10 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 2C6 (SEC. DE IDENT. NO: 16) con la secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO: 74) de Vk L6 de línea germinal humana y la línea germinal JK3 (SEC. DE IDENT. NO: 87) . La Figura 11 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 1C3, 2A10 y 2F5 (SEC. DE IDENT. NOS: 18, 15 y 17, respectivamente) con la secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO: 77) de Vk L18 de línea germinal humana y la línea germinal JK4 (SEC. DE IDENT. NO: 88). La Figura 12 es un diagrama de los vector s de expresión Ov7.5 y Ovl5. Las posiciones de las secuencias reguladoras 5' y 3' de Ov se indican. Se incluye en el extremo 3' del vector un cásete con EGFP y puromicina (Puro) dirigidos por un promotor (Cx) que funciona en todos los tipos celulares para facilitar el aislamiento de líneas transfectadas estables de células cES y la identificación de la contribución de la célula cES a las quimeras. Detalles del cásete MAb se ilustran en la parte inferior del diagrama. La línea negra delgada representa secuencias de intrones o secuencias no traducidas derivadas de las cadenas L y H humanas (aunque las secuencias de intrones no se presentan en la construcción Ovl5Mab7F12) . SiGvL: secuencia para péptido señal de la cadena L, VL: secuencia para gen V de la cadena L, Cíe: secuencia para región constante de la cadena Kappa L, IRES: secuencia de entrada ribosomal interna, SÍGVH: secuencia para péptido señal de la cadena H, VH : secuencia para gen V de la cadena H, CH?, H, CH2 y CH3: secuencias codificantes de los dominios CH?, bisagra, CH2 y CH3 de la cadena H gamma 1. Las Figuras 13A-13B son resúmenes de las estructuras de oligosacáridos del anticuerpo anti-PSMA 7F12 expresado en huevos de gallina, según se determina por espectrometría de masas MALDI TOF. Los círculos oscuros representan mañosa; los círculos opacos representan hexosa (mañosa o galactosa) y los cuadrados oscuros representan N-acetil glucosamina. La línea vertical indica que la última hexosa puede conectarse a cualquiera de los residuos de mañosa o N-acetil glucosalina a lo largo de la línea. Las Figuras 14A-14B son gráficas que muestran los resultados del ensayo de ADCC con 7F12 expresado en célula CHO ("7F12") y TF12 expresado en pollo, en comparación con un control de isotipo. Los resultados se expresan como % de lisis. La Figura 14A muestra resultados utilizando células efectoras estimuladas con IL-2. La Figura 14B muestra resultados utilizando células efectoras de sangre periférica humana frescas. La Figura 15 es una gráfica de barras que muestran los resultados de experimentos en los que la actividad ADCC de 7F12 expresado en célula CHO ("7F12") y 7F12 expresado en pollo, en comparación con un control de isotipo, se bloqueo con anticuerpo anti-CD16. Las Figuras 16A-16C son gráficas que muestran los resultados de ensayos ADCC mAb 2A10 desfucosilado ("defucosa") en comparación mAb 2A10 fucosilado ("progenitor") y un control de isotipo. Las Figuras 16A y 16B representan dos experimentos independientes utilizando células objetivo LNCaP-C42b y células efectoras estimuladas con IL-2. La Figura 16C representa un experimento utilizando células objetivo LNCaP-C42b y células efectoras de sangre periférica humana frescas. La Figura 17 es una gráfica de barras de resultados del ensayo de ADCC 2A10 mAb desfucosilado ("defucosa") en comparación con 2A10 mAb fucosilado ("progenitor") y un control de isotipo o sin control de anticuerpo, en que la actividad ADCC se bloqueo con un anticuerpo anti-CD16.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona composiciones de anticuerpos y terapias mejoradas basadas en anticuerpo para tratar y diagnosticar una serie de trastornos asociados con la expresión de PSMA y/o células que expresan PSMA. Los anticuerpos de la invención carecen de residuos fucosilo en las cadenas de carbohidratos del anticuerpo. Adicionalmente, los anticuerpos exhiben eliminación citotóxica celular dirigida por anticuerpos (ADCC) intensificada de células PSMA+ . En modalidades particulares, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos humanizados o completamente humanos y en particular son útiles para el tratamiento terapéutico en humanos de trastornos asociados con células que expresan PSMA. Métodos para utilizar anticuerpos anti-PSMA que carecen de residuos fucosilo para tratamiento terapéutico (por ejemplo, para tratar y/o prevenir enfermedades asociadas con la expresión de PSMA) también se contemplan por la invención. A fin de que la presente invención pueda entenderse más fácilmente, ciertos términos se definirán como sigue. Definiciones adicionales se establecen a lo largo de la descripción detallada. Los términos "antígeno membranal específico de próstata" y "PSMA" se utilizan de manera intercambiable en la presente e incluyen cualesquiera variantes, isoformas y especies homologas de PSMA humano que se expresan de manera natural por las células y que retienen unión a los anticuerpos 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9, 2A10, 2C6, 2F5 y 1C3 descritos en la presente. La secuencia de aminoácidos completa de la proteína PSMA humana tiene el número de acceso de Genbank NP_004467. La secuencia de ADNc completa que codifica la proteína PSMA humana tiene el número de acceso de Genbank NM_004476. Como se utilizan en la presente, los términos "anticuerpo que carecen de residuos de fucosa" y "anticuerpo desfucosilado" se utilizan de manera intercambiable y pretenden referirse a un anticuerpo en el que la porción de carbohidratos del anticuerpo no contiene un residuo fucosilo o en el cual el residuo fucosilo se ha eliminado. Un anticuerpo que carece residuos de fucosa puede generarse, por ejemplo, por expresión del anticuerpo en una célula o sistema de expresión que minimiza o no une residuos fucosilo a la cadena de carbohidratos del anticuerpo, o por modificación química del anticuerpo para eliminar residuos fucosilo de la cadena de carbohidratos (por ejemplo, tratamiento del anticuerpo con una fucosidasa) . Como tales, los términos "carecen de residuos de fucosa" y "desfucosilado" no pretenden limitarse por el mecanismo por el cual el anticuerpo con estructura alterada de carbohidratos se prepara . Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo que expresa residuos de fucosa" y "anticuerpo fucosilado" se utilizan de manera intercambiable y pretenden referirse a un anticuerpo en el que la porción de carbohidratos del anticuerpo contiene fucosa. El término "respuesta inmune" se refiere a la acción de, por ejemplo, linfocitos, células presentadoras de antígeno, células fagocitarias, granulocitos, y macromoléculas solubles producidas por las células anteriores o el hígado (incluyendo anticuerpos, citocinas, y complementos) que resulta en daño selectivo a, destrucción de, o eliminación del cuerpo humano de patógenos invasores, células o tejidos infectados con tejidos, células cancerosas, o en casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales. Como se utiliza en la presente, el término "célula efectora" se refiere a una célula inmune que se involucra en la fase efectora de una respuesta inmune, en oposición a las fases cognitiva y de activación de una respuesta inmune. Las células inmunes ejemplares incluyen una célula de un origen mieloide o linfoide, por ejemplo, linfocitos (por ejemplo, células B y células T incluyendo células T citolíticas (CTLs)), células asesinas, células asesinas naturales, macrófagos, monocitos, eosinofilos, neutrofilos, células polimorfonucleares, granulocitos, mastocitos y basofilos. Algunas células efectoras expresan receptores Fc específicos y llevan a cabo funciones inmunes específicas. En modalidades preferidas, una célula efectora es capaz de inducir citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) , por ejemplo, un neutrófilo capaz de inducir ADCC. Por ejemplo, los monocitos y macrófagos, los cuales expresan FcR se involucran en eliminación específica de células objetivo y presentación de antígenos a otros componentes del sistema inmune, o unión a células que presentan antígenos. En otras modalidades, una célula efectora puede fagocitar un antígeno objetivo o célula objetivo. La expresión de un FcR particular en una célula efectora puede regularse por factores humorales tales como citocinas. Por ejemplo, la expresión de FcaRI se ha encontrado sobre regulada por G-CSF o GM-CSF. Esta función intensificada incrementa la función efectora de las células que llevan FcaRl contra objetivos. Una célula efectora puede fagocitar o lisar un antígeno objetivo o una célula objetivo. "Célula objetivo" se refiere a cualquier célula o patógeno cuya eliminación puede ser benéfica en un sujeto (por ejemplo, un humano o animal) y a la que puede dirigirse una composición (por ejemplo, anticuerpo) de la invención. Por ejemplo, la célula objetivo puede ser una célula que expresa o sobre-expresa PSMA. El término "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo" o "ADCC" se refiere a una reacción citotóxica mediada por células en la que una célula objetivo PSMA+ con anticuerpo anti-PSMA unido se reconoce por una célula efectora que lleva receptores Fc y se lisa subsecuentemente sin requerir la intervención del complemento. Como se utiliza en la presente, el término "intensifica la ADCC" (por ejemplo, en referencia a las células) pretende incluir cualquier incremento medible en lisis celular cuando se contactan con un anticuerpo anti-PSMA que carecen de residuos fucosilo en comparación con la eliminación celular de la misma célula en contacto con un anticuerpo anti-PSMA fucosilado en la presencia de células efectoras (por ejemplo, en una proporción de células objetivo: células efectoras de 1:50), por ejemplo, un incremento en lisis celular en por lo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, o 325%. El término "anticuerpo" según se refiere en la presente incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, "porción de unión a antígeno") o cadenas sencillas de los mismos. Un "anticuerpo" se refiere a una glicoproteína que comprende por lo menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, o una porción de unión a antígeno de las mismas. Cada cadena pesada se comprende de una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada se comprende de tres dominios CH?, CH2 y CH3.

Cada cadena ligera se comprende de una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera se comprende de un dominio, CL. Las regiones VH y V pueden además subdividirse en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones de determinación de complementariedad (CDR) , intercaladas con regiones que se encuentran más conservadas, llamadas regiones de armazón (FR) . Cada VH y VL se componen de tres CDRs y cuatro FRs, dispuestas del extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del huésped, incluyendo diversas células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Ciq) del sistema de complemento clásico. El término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo") , como se utiliza en la presente, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retiene la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, PSMA) . Se ha mostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de unión contemplados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH?; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región de la bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH?; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste de un dominio VH; y (vi) una región de determinación de complementariedad (CDR) aislada. Adicionalmente, aunque los dos dominios del fragmento Fv, V y VH, se codifican por genes separados, pueden unirse, utilizando métodos recombinantes, por un enlazador sintético que les permite elaborarse como una sola cadena de proteína en la que las regiones V y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como cadena Fv sencilla (scFv) ; véase por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tales anticuerpos de cadena sencilla también pretenden contemplarse dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas para aquellos con experiencia en la técnica, y los fragmentos se tamizan por utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos. El término "anticuerpo humano recombinante", como se utiliza en la presente, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aislan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado del mismo (descrito además en lo siguiente) , (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo humano, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatorios recombinantes, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que involucre, empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en las que las regiones de armazón y CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En ciertas modalidades, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes pueden sujetarse a mutagénesis in vi tro (o, cuando un animal transgénico para secuencias de Ig humana se utiliza, mutagénesis somática in vivo) y de esta manera las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque se derivan de y se relacionan con las secuencias VH y VL de línea germinal humana, pueden no existir de manera natural dentro del repertorio de línea germinal de anticuerpos humanos in vivo . Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpos monoclonales" como se utiliza en la presente se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpos de composición molecular sencilla. Una composición de anticuerpos monoclonales muestra una sola especificidad de unión y afinidad por un epítopo en particular . El término "anticuerpo humano", como se utiliza en la presente, pretende referirse un anticuerpos que tienen regiones variables en las que las regiones de armazón y CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Adicionalmente, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se deriva de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis in vi tro aleatoria o dirigida o por mutación somática in vivo) . El término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que muestran una sola especificidad de unión que tienen regiones variables en las que las regiones de armazón y CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales humanos se producen por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada humana y un transgen de cadena ligera fusionados a una célula inmortalizada. El término "anticuerpo monoclonal humano", como se utiliza en la presente, también incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aislan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humanas o un hibridoma preparado del mismo (descrito además en lo siguiente) , (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo humano, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una librería de anticuerpos humanos combinatoria, recombinantes, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que involucre empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en las que las regiones de armazón y CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En ciertas modalidades, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes pueden sujetarse a mutagénesis in vi tro (o, cuando un animal transgénico para secuencias de Ig humana se utiliza, mutagénesis somática in vivo) y de esta manera las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y V de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque se derivan de y se relacionan con secuencias VH y VL de línea germinal humana, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de línea germinal de anticuerpos humanos in vivo . Un "anticuerpo aislado", como se utiliza en la presente, pretende referirse a un anticuerpo que es sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a PSMA es sustancialmente libre de anticuerpos que unen específicamente antígenos diferentes al PSMA) . Un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo, isoforma o variante de PSMA humano puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo, de otra especie (por ejemplo, homólogos de especie de PSMA) . Más aún, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o químicos. En una modalidad de la invención, una combinación de anticuerpos monoclonales "aislados" que tienen diferentes especificidades se combinan en una composición bien definida . El término "anticuerpo humanizado" pretende referirse a anticuerpos en los que las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias de armazón humanas. Modificaciones adicionales a la región de armazón pueden hacerse dentro de las secuencias de armazón humanas. El término "anticuerpo quimérico" pretende referirse un anticuerpos en los que las secuencias de región variable se derivan de una especie y las secuencias de región constante se derivan de otra especie, tal como un anticuerpo en el que las secuencias de región variable se derivan de un anticuerpo de ratón y las secuencias de región constante se derivan de un anticuerpo humano. El término "epítopo" significa un determinante de proteína capaz de unión específica a, o unión específica por, un anticuerpo. Los epítopos usualmente consisten de agrupaciones de superficie químicamente activa de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y usualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como también características de carga específica. Epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen en que la unión a los primeros, pero no a los últimos, se pierde en la presencia de solventes desnaturalizantes. Como se utiliza en la presente, "unión específica" se refiere a unión del anticuerpo a un antígeno predeterminado. Típicamente, el anticuerpo se con una constante de disociación (KD) de 10"7 M o menos, y se, une al antígeno predeterminado con una KD que es por lo menos dos veces menor que su KD para la unión a un antígeno inespecífico (por ejemplo, BSA, caseína) diferente al antígeno predeterminado o un antígeno estrechamente relacionado. Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se utilizan de manera intercambiable en la presente con el término "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno". Como se utiliza en la presente, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgGI) que se codifica por genes de región constante de cadena pesada . El término "vector", como se utiliza en la presente, pretender referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha enlazado. Un tipo de vector es una "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN de doble hebra circular en el que segmentos de ADN adicionales pueden ligarse. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde segmentos de ADN adicionales pueden ligarse en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episomales) . Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episomales) pueden integrarse en el genoma de una célula huésped en la introducción en la célula huésped, y en consecuencia se replican junto con genoma huésped. Más aún, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales se enlazan operativamente. Tales vectores son referidos en la presente como "vectores de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores de expresión") . En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están con frecuencia en la forma de plásmidos. En la especificación presente, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse de manera intercambiable ya que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectuosos en replicación, adenovirus y virus adenoasociados), que desempeñan funciones equivalentes. El término "célula huésped recombinante" (o simplemente "célula huésped"), como se utiliza en la presente, pretende referirse a una célula en la que un vector de expresión recombinante se ha introducido. Debe entenderse que tales términos pretenden referirse no solo a la célula sujeto en particular sino a la progenie de tales células. Ya que ciertas modificaciones pueden presentarse en generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, tal progenie, de hecho, puede no ser idéntica a la célula progenitora, pero aún se incluye dentro del alcance del término "célula huésped" como se utiliza en la presente. Células huésped recombinantes incluyen, por ejemplo, célula CHOs, transfectomas, y células linfocíticas. Como se utiliza en la presente, el término "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. El término "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, anfibios, reptiles, etc. Los términos "animal no humano transgénico" se refieren a un animal no humano que tiene un genoma que comprende uno o más transgenes o transcromosomas de cadena pesada y/o ligera humana (ya sea integrado o no integrado en el ADN genómico natural del animal) y que es capaz de expresar anticuerpo completamente humanos. Por ejemplo, un ratón transgénico puede tener un transgen de cadena ligera humana y ya sea un transgen de cadena pesada humana o transcromosoma de cadena pesada humana, de manera que el ratón produce anticuerpos anti-PSMA humanos cuando se inmuniza con antígeno PSMA y/o células que expresan PSMA. El transgen de cadena pesada humana puede integrarse en el ADN cromosómico del ratón, como en el caso de, por ejemplo, ratones HuMAb transgénicos, o el transgen de cadena pesada humana puede mantenerse de manera extracromosomal, como en el caso de ratones transcromosómicos (por ejemplo, KM) según se describe en WO 02/43478. Tales ratones transgénicos y transcromosómicos son capaces de producir isotipos múltiples de anticuerpos monoclonales humanos para PSMA (por ejemplo, IgG, IgA y/o IgE) al experimentar recombinación V-D-J y conmutación de isotipo. Diversos aspectos de la invención se describen en detalle adicional en las siguientes subsecciones.

Anticuerpos Anti-PSMA que Carecen de Residuos de Fucosa y que Tienen Actividad ADCC Intensificada La presente invención se relaciona con un anticuerpo anti-PSMA desfucosilado con citotoxicidad celular dirigida por anticuerpo (ADCC) intensificada contra células que expresan PSMA en comparación con la forma fucosilada del anticuerpo. En una modalidad preferida, un anticuerpo desfucosilado de la invención intensifica la ADCC de células de carcinoma prostático LnCaP (ATCC CRL-1740) in vi tro comparado con la forma fucosilada del anticuerpo, por ejemplo bajo condiciones de una concentración de anticuerpos de 0.1 µg/ml y una proporción célula objetivo a célula efectora de 1:100. Preferiblemente, las células efectoras utilizadas son células efectoras estimuladas con IL-2 de sangre periférica humana (por ejemplo, 1 x 106 células mononucleares de sangre periférica humana se incuban con lOU/ml de IL-2 humana durante la noche a 37°C) . La forma desfucosilada del anticuerpo de preferencia se compara con una forma fucosilada que se obtiene de la expresión en célula huésped de mamífero, tales como células CHO. En modalidades preferidas, la forma desfucosilada del anticuerpo tiene una EC50 para actividad ADCC de 0.05 µig/ml o menos, de más preferencia 0.04 µg/ml o menos, incluso de más preferencia 0.03 µg/ml o menos, incluso más preferiblemente 0.02 µg/ml o menos, e incluso de más preferencia una EC50 de aproximadamente 0.018 µg/ml. En otras modalidades preferidas, la forma desfucosilada del anticuerpo tiene una EC50 para actividad ADCC de 0.01 µg/ml o menos, más preferiblemente 0.009 µg/ml o menos, incluso más preferiblemente 0.008 µg/ml o menos, incluso más preferiblemente 0.007 µg/ml o menos, incluso más preferiblemente 0.005 µg/ml o menos e incluso más preferiblemente una EC50 de aproximadamente 0.002 µg/ml. Preferiblemente, la EC50 para actividad ADCC se determina utilizando el ensayo descrito en el Ejemplo 4 y utilizando células efectoras estimuladas con IL-2 o utilizando el ensayo descrito en el Ejemplo 4 y utilizando células efectoras de sangre periférica humana fresca. En otras modalidades preferidas, la forma desfucosilada del anticuerpo tiene una EC50 para actividad ADCC que es por lo menos 3 veces menor que la EC50 ya que la forma fucosilada del anticuerpo (por ejemplo, una forma del anticuerpo expresada en célula) , más preferiblemente por lo menos 4 veces menor que la EC50 de la forma fucosilada del anticuerpo, incluso más preferiblemente por lo menos 5 veces menor que la EC50 de la forma fucosilada del anticuerpo, incluso más preferiblemente por lo menos 6 veces menor que la EC50 de la forma fucosilada del anticuerpo, incluso más preferiblemente por lo menos 7 veces menor que la EC50 de la forma fucosilada del anticuerpo, incluso más preferiblemente por lo menos 8 veces menor que la EC50 de la forma fucosilada del anticuerpo, incluso más preferiblemente por lo menos 9 veces menor que la EC50 de la forma fucosilada del anticuerpo y incluso más preferiblemente por lo menos 10 veces menor que la EC50 de la forma fucosilada del anticuerpo. Otra vez, de preferencia, la ECso para actividad ADCC se determina utilizando el ensayo descrito en el Ejemplo 4 y utilizando células efectoras estimuladas con IL-2 o utilizando el ensayo descrito en Ejemplo 4 y utilizando células efectoras de sangre periférica humana fresca. Típicamente, la proporción de EC50 (fucosilado) : EC50 (desfucosilado) se encontró mayor utilizando las células efectoras de sangre periférica humana fresca, aunque el porcentaje de lisis máximo se encontró menor utilizando las células efectoras de sangre periférica fresca . La actividad ADCC incrementada de un anticuerpo desfucosilado de la invención puede cuantificarse, por ejemplo, como un incremento en porcentaje de lisis celular, en comparación con la forma fucosilada del anticuerpo, cuando la actividad ADCC se mide bajo las mismas condiciones para las forma desfucosilada y fucosilada (por ejemplo, mismas concentraciones de anticuerpo y mismas proporciones de célula objetivo a efectora) . Adicional o alternativamente, la actividad ADCC incrementada de un anticuerpo desfucosilado de la invención puede cuantificarse, por ejemplo, como una potencia incrementada al medirse por una disminución en el valor de EC50 para la forma desfucosilada, en comparación con la forma fucosilada. Esto puede cuantificarse por la proporción de la EC50 para la forma fucosilada a la forma desfucosilada. Ejemplos de líneas celulares PSMA+ que pueden utilizarse en los ensayos de ADCC de la invención y contra las que un anticuerpo desfucosilado de la invención exhibe actividad ADCC intensificada, en comparación con la forma fucosilada del anticuerpo, incluyen células LnCaP, células 22Rvl y/o células PCa2b. La ADCC intensificada efectuada por anticuerpos anti-PSMA desfucosilados puede resultar en actividad ADCC sobre células PSMA+ en concentraciones de anticuerpo donde la ADCC puede no observarse con la forma fucosilada del anticuerpo.

Desfucosilación de Anticuerpos Anti-PSMA Los anticuerpos anti-PSMA (por ejemplo, anticuerpos murinos, quiméricos, humanizados y humanos) se conocen en la técnica, y pueden utilizarse en la presente invención. El anticuerpo anti-PSMA de la presente invenciones modifica de manera que el anticuerpo carecen de residuos fucosilo. Un anticuerpo puede elaborarse de manera que carezca de residuos fucosilo por uno de una diversidad de métodos. Por ejemplo, el anticuerpo puede expresarse utilizando tecnología de ADN recombinante, en una célula con un mecanismo de glucosilación alterado de manera que la adición de residuos fucosilo a cadenas de carbohidratos se inhiba. Adicional o alternativamente, un anticuerpo puede desfucosilarse a través de eliminación química del residuo fucosilo. Además aún, en una modalidad preferida, el anticuerpo puede expresarse en un sistema de expresión de gallina quimérica, de manera que el anticuerpo se produzca en los huevos de la gallina quimérica. La preparación de gallinas quiméricas que expresan un anticuerpo anti-PSMA en los huevos de la gallina se describe en detalle en Ejemplo 1 y la carencia de residuos de fucosa tales anticuerpos anti-PSMA expresados en huevo de gallina se demuestra en el Ejemplo 3. Gallinas quiméricas adecuadas para utilizarse en la expresión de proteínas en los huevos de la gallina se describen en Publicación de PCT WO 2004/015123. En consecuencia, en otro aspecto, la invención concierne a una gallina quimérica que comprende genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina que codifican un anticuerpo anti-PSMA de manera que el anticuerpo anti-PSMA se expresa en los huevos de la gallina quimérica, en donde el anticuerpo anti-PSMA expresado en los huevos de la gallina quimérica carece de residuos de fucosa. Preferiblemente, los genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina son genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana. En otra modalidad, el anticuerpo se expresa en una célula que carece de una enzima fucosiltransferasa de manera que la línea celular produce proteínas que carecen de fucosa en sus carbohidratos (véase Ejemplos 5 y 6) . Por ejemplo, las líneas celulares Ms704, Ms705, y Ms709 carecen del gen de fucosiltransferasa, FUT8 (alfa (1,6) fucosiltransferasa), de manera que los anticuerpos expresados en las líneas celulares Ms704, Ms705, y Ms709 carecen de fucosa en sus carbohidratos. Las líneas celulares FUT8~ _ Ms704, Ms705, y Ms709 se crearon por la interrupción dirigida del gen FUT8 en células CHO/DG44 utilizando dos vectores de reemplazo (véase la Publicación de Patente Norteamericana No. 20040110704 por Yamane et al. y Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22). Como otro ejemplo, EP 1,176,195 por Hanai et al. describe una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente interrumpido, que codifica una fucosil transferasa, de manera que los anticuerpos expresados en tal línea celular exhiben hipofucosilación al reducir o eliminar la enzima relacionada con el enlace alfa 1,6. Hanai et al. también describe líneas celulares que también tienen de manera natural una baja actividad enzimática para agregar mucosa a la N-acetilglucosamina que se une a la región Fc del anticuerpo o no tiene la actividad enzimática, por ejemplo la línea celular YB2/0 de mieloma de rata (ATCC CRL 1662) . La Publicación de PCT WO 03/035835 por Presta describe una variante de la línea celular CHO, células Lecl3, con capacidad reducida para unir fucosa a carbohidratos enlazados a Asn(297), lo que resulta también en hipofucosilación de anticuerpos expresados en esa célula huésped (véase también Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). La Publicación de PCT WO 99/54342 por Umana et al. describe líneas celulares diseñadas para expresar glicosil transferasas de modificación de glicoproteínas (por ejemplo, beta(l,4)-N- acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII) ) de manera que los anticuerpos expresados en las líneas celulares diseñadas exhiben estructuras GlcNac divididas incrementadas que resultan en actividad ADCC incrementada de los anticuerpos (véase también Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176- 180) . En otra modalidad, un anticuerpo anti-PSMA se expresa y el o los residuos fucosilo se escinden utilizando una enzima fucosidasa. Por ejemplo, la fucosidasa alfa-L-fucosidasa elimina residuos fucosilo de los anticuerpos (Tarentino, A.L. et al. (1975) Biochem. 14:5516-23). Adicionalmente, en otras modalidades, otras formas de glucosilación de un anticuerpo se modifican también. Por ejemplo, un anticuerpo glucosilado puede elaborarse (es decir, el anticuerpo carece de glucosilación) . Tales modificaciones de carbohidratos pueden lograrse, por ejemplo, al alterar uno o más sitios de glucosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, una o más sustituciones de aminoácidos puede hacerse que resulten en eliminación de uno o más sitios de glucosilación de armazón de región variable para eliminar en consecuencia la glucosilación en ese sitio. Tal aglucosilación puede incrementar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Tal estrategia se describe en mayor detalle en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,714,350 y 6,350,861 por Co et al.

Caracterización de la Ausencia de Residuos fucosilo en Anticuerpos Anti-PSMA Los anticuerpos de la invención carecen de residuos fucosilo, por ejemplo en la cadena de carbohidratos de la porción Fc . Los anticuerpos pueden probarse por la ausencia de residuos fucosilo utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica, tal como fluorescencia inducida por láser en electroforesis capilar con APTS. Brevemente, los oligosacáridos enlazados a N del anticuerpo anti-PSMA purificado pueden liberarse al agregar el péptido N-glicanasa (Prozyme) e incubar durante la noche. Los carbohidratos se resuspenden y se derivan con 8-aminopiren-l, 3, 6-trisulfonato (APTS) bajo condiciones suaves de aminación reductiva en las que la desialilación y pérdida de residuos fucosilo se minimiza. Los aductos de la reacción se analizan por electroforesis capilar con un detector de fluorescencia inducida por láser (Beckman Coulter) . Una ausencia de fucosa puede observarse por un cambio en la electroforesis en comparación con el mismo anticuerpo que contienen fucosa. Otra técnica para probar la ausencia de fucosa en anticuerpos anti-PSMA es un análisis de monosacáridos utilizando HPLC. Otras técnicas para analizar el contenido y estructura de carbohidratos para el anticuerpo incluye perfil de MS carbohidratos expresados (glucómica) , análisis MALDI-TOF directo de glucanos intactos liberados (para proporcionar la masa de clases de carbohidratos), espectro CID MSMS bajo (para proporcionar composición estructural de los glucanos) , espectro CID MSMS alto y espectro MSn (para proporcionar información acerca de la conectividad de los glucanos) y digestión con exoglucosidasa secuencial (para proporcionar información de conectividad de estructura de los glucanos) . Las metodologías para examinar el contenido de carbohidratos de los anticuerpos se describe en detalle en el Ejemplo 3.

Caracterización de Eliminación Celular Dependiente de Anticuerpos de Células PSMA+ Los anticuerpos anti-PSMA desfucosilados pueden probarse por su capacidad para mediar fagocitosis y eliminación de células que expresan PSMA. En una modalidad, un anticuerpo anti-PSMA desfucosilado intensifica la eliminación de células que expresan PSMA en comparación con el mismo anticuerpo que contiene fucosa cuando se compara en la misma concentración. En otra modalidad, un anticuerpo anti-PSMA desfucosilado induce eliminación de células que expresan PSMA donde el mismo anticuerpo que contienen fucosa no induce eliminación celular en la misma concentración. La actividad ADCC de un anticuerpo monoclonal puede probarse en ensayos in vi tro establecidos. Como un ejemplo, un ensayo de ADCC de liberación de cromo puede utilizarse. Brevemente, células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), u otras células efectoras, de donadores sanos pueden purificarse por centrifugación por densidad de Ficoll Hypaque, seguida por lisis de eritrocitos contaminantes. Las PBMCs lavadas puede suspenderse en RPMI suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado con calor y mezclarse con células que expresan PSMA etiquetadas con 51Cr, en diversas concentraciones de células efectoras a células tumorales (células efectoras : células tumorales). El anticuerpo anti-PSMA puede entonces agregarse en varias concentraciones. Un anticuerpo correlacionado con isotipo puede utilizarse como un control negativo. Los ensayos pueden llevarse a cabo durante 4-18 horas a 37°C. Las muestras pueden ensayarse para citólisis al medir el 51Cr liberado en el sobrenadante de cultivo. El anti-PSMA monoclonal puede también probarse en combinaciones entre sí para determinar si la citólisis se intensifica con múltiples anticuerpos monoclonales. Un ensayo alternativo que puede utilizarse para la capacidad del anticuerpo anti-PSMA para mediar fagocitosis y muerte de células que expresan PSMA es un ensayo de fluorometría resuelta en tiempo. Brevemente, células que expresan PSMA se cargan con un acetoximetil éster de ligando de intensificación de fluorescencia (BATDA) , que penetra las membranas celulares. Dentro de la célula, los enlaces éster se hidrolizan y el compuesto no puede pasar más la membrana celular. El anticuerpo anti-PSMA puede entonces agregarse en diversas concentraciones. Después de la citólisis, una solución de europeo (Perkin Elmer) se agrega y cualquier ligando libre se une al europeo para formar un quelato altamente fluorescente y estable (EuTDA) que puede leerse en un lector de microplacas (Perkin Elmer) . La señal medida se correlaciona con la cantidad de células lisadas. Los ensayos de ADCC preferidos para examinar la actividad ADCC de los anticuerpos anti-PSMA de la invención se describen en detalle en el Ejemplo 4. Los anticuerpos anti-PSMA también pueden probare en un modelo in vivo (por ejemplo, en ratones) para determinar su eficacia en mediar la fagocitosis y muerte de células que expresan PSMA, por ejemplo, células tumorales. Estos anticuerpos pueden seleccionarse, por ejemplo, con base en los siguientes criterios, que no pretenden ser exclusivos : 1) unión a células vivas que expresan PSMA; 2) alta afinidad de unión a PSMA; 3) unión a un epítopo único en el PSMA (para eliminar la posibilidad de que anticuerpos monoclonales con actividades complementarias cuando se utilizan en combinación pudieran competir por la unión al mismo epítopo) ; 4) internación por células que expresan PSMA; 5) mediación de inhibición de crecimiento, fagocitosis y/o eliminación in vi tro de células que expresan PSMA en la presencia de células efectoras humanas. Los anticuerpos monoclonales preferidos de la invención reúnen uno o más de estos criterios. En una modalidad particular, los anticuerpos monoclonales se utilizan en combinación, por ejemplo, como una composición farmacéutica que comprende dos o más anticuerpos monoclonales anti-PSMA o fragmentos de los mismos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales anti-PSMA que tienen diferentes actividades, pero complementarias, pueden combinarse en una sola terapia para lograr un efecto terapéutico o de diagnostico deseado. Una ilustración de esto puede ser una composición que contienen un anticuerpo monoclonal anti-PSMA que media la eliminación altamente efectiva de células objetivos en la presencia de células efectoras, combinado con otro anticuerpo monoclonal anti- PSMA que inhibe el crecimiento de células que expresan PSMA. Caracterización de la Unión a PSMA Los anticuerpos de la invención pueden probarse por su unión a PSMA por, por ejemplo, ensayos estándar conocidos en la técnica, tales como ELISA, análisis de FACS y/o análisis Biacore. En un ensayo de ELISA típico, brevemente, placas de microvaloración se recubren con PSMA purificado a 0.25 µg/ml en PBS, y entonces se bloquean con 5% albúmina sérica bovina en PBS. Diluciones de anticuerpo se agregan a cada pozo y se incuban durante 1-2 horas a 37°C. Las placas se lavan con PBS/Tween y se incuban entonces con reactivo secundario (por ejemplo, para anticuerpo humanos o un reactivo policlonal específico de Fc anti-IgG humana de cabra) conjugado a fosfatasa alcalina durante 1 hora a 37°C. Después de lavar, las placas se revelan con sustrato pNPP (1 mg/ml) , y se analizan a una OD de 405-650. A fin de mostrar la unión de los anticuerpos monoclonales a células vivas que expresan el PSMA, puede utilizarse citometría de flujo. En un ejemplo típico (pero no limitante) de un protocolo de citometría de flujo, líneas celulares que expresan PSMA (cultivadas bajo condiciones de crecimiento estándar) se mezclan con diversas concentraciones de anticuerpos monoclonales en PBS que contienen 0.1% de BSA y 20% de suero de ratón, y se incuba a 37°C durante 1 hora.

Después de lavar, las células se hacer reaccionar con anticuerpo secundario etiquetado con Fluoresceína (por ejemplo, anticuerpo anti-IgG humana) bajo las mismas condiciones que la tinción de anticuerpo primaria. Las muestras pueden analizarse por un instrumento FACScan utilizando luz y propiedades de dispersión lateral para sincronizarse sobre células sencillas. Un ensayo alternativo que utiliza microscopía de fluorescencia puede utilizarse (además de o en lugar de) el ensayo de citometría de flujo.

Las células pueden teñirse exactamente como se describe en lo anterior y examinarse por microscopía de fluorescencia. Este método permite la visualización de células individuales, pero puede tener sensibilidad disminuida lo que depende de la densidad del antígeno. Los anticuerpos anti-PSMA pueden además probarse por reactividad con antígeno PSMA por transferencia Western. Por ejemplo, extractos celulares de células que expresan PSMA pueden prepararse y sujetarse a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS) . Después de la electroforesis, los antígenos separados se transfieren a membranas de nitrocelulosa, se bloquean con 20% suero de ratón, y se sondean con los anticuerpos monoclonales que se probarán. La unión del anticuerpo puede probarse utilizando un anticuerpo secundario específico anti-especie enlazado a fosfatasa alcalina y revelado con tabletas de sustrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) . Otras técnicas para evaluar la capacidad de unión de los anticuerpos hacia PSMA se conocen en la técnica, incluyendo análisis RIAs y Biacore. Ensayos adecuados para determinar la unión a PSMA se describen en detalle en el Ejemplo 4.

Anticuerpos Anti-PSMA Quiméricos o Humanizados En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-PSMA desfucosilado de la invención es un anticuerpo quimérico humanizado. Tales anticuerpos pueden prepararse utilizando anticuerpos anti-PSMA de ratón que se encuentran disponibles en la técnica y procedimientos establecidos para convertir un anticuerpo de ratón a un anticuerpo quimérico o humanizado. Ejemplos no limitantes de tales anticuerpos anti-PSMA de ratón incluyen los anticuerpos monoclonales 3F5.4G6, 3D7.1.1, 4E10-1.14, 3E11, 4D8, 3E6, 3C9, 2C7, 1G3, 3C4, 3C6, 4D4, 1G9, 5C8B9, 3G6, 4C8B9, E9.9, J415, J533 y J591. Hibridomas que secretan 3F5.4G6, 3D7.1.1, 4E10-1.14, 3E11, 4D8, 3E6, 3C9, 2C7, 1G3, 3C4, 3C6, 4D4, 1G9, 5C8B9, 3G6 o 4C8B9 se han depositado públicamente y se describen en la Patente Norteamericana No. 6,159,508. Hibridomas que secretan E99, J415, J533 o J591 se han depositado públicamente y se describen en la Patente Norteamericana No. 6,107,090. Más aún, anticuerpos anti-PSMA humanizados, incluyendo una versión humanizada de J591, se describen en mayor detalle en la Publicación de PCT WO 02/098897. Adicionalmente, otros anticuerpos anti-PSMA humano de ratón se han descrito en la técnica, tales como mAb 107-1A4 (Wang, S. et al. (2001) Ent. J. Cáncer 92:871-876) y mA.b 2C9 (Kato, K. et al. (2003) Ent. J. Urol. 10:439-444) .

Anticuerpos Anti-PSMA Monoclonales Humanos Los anticuerpos preferidos de la invención incluyen anticuerpos monoclonales anti-PSMA humanos. Ejemplos de anticuerpos monoclonales anti-PSMA humanos incluyen los anticuerpos 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9, 2A10, 2C6, 2F5 y 1C3, aislados y estructuralmente caracterizados según se describe originalmente en las Solicitudes PCTs WO 01/09192 y WO 03/064606 y en la Solicitud Provisional Norteamericana No. Serie 60/654,125, titulada "Anticuerpos Monoclonales Humanos para Antígeno Membranal Específico de Próstata (PSMA)", presentada el 18 de febrero de 2005, cuyo contenido de cada una se incorpora expresamente en la presente para referencia. Las secuencias de aminoácidos de VH de 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9, 2A10, 2C6, 2F5 y 1C3 se muestran en las SEC. DE IDENT. NOS: 1-9, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de VL de 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9, 2A10, 2C6, 2F5 y 1C3 se muestran en SEC. DE IDENT. NOS: 10-18, respectivamente. Otros anticuerpos anti-PSMA humanos que pueden utilizarse en la invención incluyen los anticuerpos descritos en la Publicación de PCT WO 03/034903 y Solicitud Norteamericana No. 2004/0033229. Dado que cada uno de estos anticuerpos puede unirse a PSMA, las secuencias VH y VL pueden "mezclarse y correlacionarse" para crear otras moléculas de unión anti-PSMA de la invención. La unión a PSMA de tales anticuerpos "mezclados y correlacionados" puede probarse utilizando los ensayos de unión bien conocidos en la técnica, tales como análisis de FACS y ensayos de ELISA. Preferiblemente, cuando las cadenas VH y VL se mezclan y correlacionan, una secuencia VH de un par VH/VL particular se reemplaza con una secuencia VH estructuralmente similar. Asimismo, de preferencia una secuencia VL de un par VH/VL particular se reemplaza con una secuencia VL estructuralmente similar. Por ejemplo, las secuencias de VH de 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9, 2A10, 2C6 y 2F5 son particularmente accesibles para mezclar y correlacionar, ya que estos anticuerpos utilizan secuencias de VH derivadas de la misma secuencia de línea germinal (VH 5-51) y de esta manera exhiben similitud estructural. Asimismo, las secuencias VL de 4A3, 7F12, 8C12, y 2C6 son particularmente accesibles para mezclar y correlacionarse, ya que estos anticuerpos utilizan secuencias VL derivadas de la misma secuencia de línea germinal (VL L6) y de esta manera exhiben similitud estructural. Asimismo, las secuencias VL de 8A11 y 16F9 son particularmente accesibles para mezclar y correlacionarse, ya que estos anticuerpos utilizan secuencias VL derivadas de la misma secuencia de línea germinal (VL 04/014) y de esta manera exhiben similitud estructural. Asimismo, las secuencias VL de 1C3, 2A10 y 2F5 son particularmente accesibles para mezclar y correlacionar, ya que estos anticuerpos utilizan secuencias VL derivadas de la misma secuencia de línea germinal (VL L18) y de esta manera exhiben similitud estructural. En modalidades particulares, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal desfucosilado, o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 1-9; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NO: 10-18; en donde el anticuerpo une específicamente PSMA humano . Combinaciones de cadena pesada y ligera preferidas incluyen: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 1; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 10; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 2; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 11; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 3; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 12. (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 4; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 13; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 5; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 14; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 6; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 15; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 7; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 16; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 8; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 17; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 9; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 18.

En otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos desfucosilados que comprenden las CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y cadena ligera de 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9, 2A10, 2C6, 2F5 y 1C3, o combinaciones de las mismas. Las secuencias de aminoácidos de las CDRl de VH de 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9, 2A10, 2C6, 2F5 y 1C3 se muestran en SEC. DE IDENT. NOS: 19-27, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las VH CDR2 de VH 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9, 2A10, 2C6, 2F5 y 1C3 se muestran en SEC. DE IDENT. NOS: 28-36, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3 de VH 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9, 2A10, 2C6, 2F5 y 1C3 se muestran en SEC. DE IDENT. NOS: 37-45, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de la CDRl de V? 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9, 2A10, 2C6, 2F5 y 1C3 se muestran en SEC. DE IDENT. NOS: 46-54, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de la CDR2 de V? de 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9, 2A10, 2C6, 2F5 y 1C3 se muestran en SEC. DE IDENT. NOS: 55-63, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de la CDR3 de V? de 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9, 2A10, 2C6, 2F5 y 1C3 se muestran en SEC. DE IDENT. NOS: 64-72, respectivamente. Las regiones CDR se delinean utilizando el sistema Kabat (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department de Health y Human Services, NIH Publication No. 91-3242) .

Dado que cada uno de estos anticuerpos puede unirse a PSMA y que la especificidad de unión a antígeno se proporciona de manera primera por las regiones CDRl, 2 y 3, las secuencias de CDRl, 2 y 3 de VH y secuencias CDRl, 2 y 3 de Vk pueden "mezclarse y correlacionarse" (es decir, las CDRs de diferentes anticuerpos pueden mezclarse y correlacionarse, aunque cada anticuerpo debe contener una CDRl, 2 y 3 de VH y una CDRl, 2 y 3 de Vk) para crear otras moléculas de unión anti-PSMA de la invención. La unión a PSMA de tales anticuerpos "mezclados y correlacionados" puede probarse utilizando ensayos de unión conocidos en la técnica, por ejemplo, análisis de FACS y ensayos de ELISA. Preferiblemente, cuando las secuencias CDR de VH se mezclan y correlacionan, la secuencia CDRl, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia de VH particular se reemplaza con una o unas secuencias CDR estructuralmente similares. Asimismo, cuando las secuencias CDR de Vk se mezclan y correlacionan, la secuencia CDRl, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia Vk particular de preferencia se reemplaza con una o unas secuencias CDR estructuralmente similares. Será fácilmente aparente para el técnico con experiencia ordinaria que secuencias de VH y VL novedosas pueden crearse al sustituir una o más secuencias de región CDR de VH y/o VL CDR con secuencias estructuralmente similares de las secuencias CDR descritas en la presente para anticuerpos monoclonales 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9, 2A10, 2C6, 2F5 y 1C3. En consecuencia, en otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal desfucosilado, o porción de unión a antígeno del mismo que comprende: (a) una región variable de cadena pesada CDRl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 19-27; (b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 28-36; (c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 37-45; (d) una región variable de cadena ligera CDRl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 46-54; (e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 55-63; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 64-72; en donde el anticuerpo une específicamente PSMA. En una modalidad preferida, el anticuerpo comprende: (a) una región variable de cadena pesada humana CDRl que comprende SEC. DE I DENT. NO: 19; (b) una región variable de cadena pesada humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 28; (c) una región variable de cadena pesada humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 37; (d) una región variable de cadena ligera humana CDRl que comprende SEC. DE I DENT. NO: 46; (e) una región variable de cadena ligera humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 55; y (f) una región variable de cadena ligera humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 64. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende : (a) una región variable de cadena pesada humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 20; (b) una región variable de cadena pesada humana CDR2 que comprende SEC. DE I DENT. NO: 29; (c) una región variable de cadena pesada humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 38; (d) una región variable de cadena ligera humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 47; (e) una región variable de cadena ligera humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 56; y (f) una región variable de cadena ligera humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 65. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende : (a) una región variable de cadena pesada humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 21; (b) una región variable de cadena pesada humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 30; (c) una región variable de cadena pesada humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 39; (d) una región variable de cadena ligera humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 48; (e) una región variable de cadena ligera humana CDR2 que comprende SEC. DE I DENT. NO: 57; y (f) una región variable de cadena ligera humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 66. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende : (a) una región variable de cadena pesada humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 22; (b) una región variable de cadena pesada humana CDR2 que comprende SEC. DE I DENT. NO: 31; (c) una región variable de cadena pesada humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 40; (d) una región variable de cadena ligera humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 49; (e) una región variable de cadena ligera humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 58; y (f) una región variable de cadena ligera humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 67. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende : (a) una región variable de cadena pesada humana CDRl que comprende SEC. DE I DENT. NO: 23; (b) una región variable de cadena pesada humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 32; (c) una región variable de cadena pesada humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 41; (d) una región variable de cadena ligera humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 50; (e) una región variable de cadena ligera humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 59; y (f) una región variable de cadena ligera humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 68. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende: (a) una región variable de cadena pesada humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 24; (b) una región variable de cadena pesada humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 33; (c) una región variable de cadena pesada humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 42; (d) una región variable de cadena ligera humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 51; (e) una región variable de cadena ligera humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 60; y (f) una región variable de cadena ligera humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 69. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende : (a) una región variable de cadena pesada humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 25; (b) una región variable de cadena pesada humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 34; (c) una región variable de cadena pesada humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 43; (d) una región variable de cadena ligera humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 52; (e) una región variable de cadena ligera humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 61; (f) una región variable de cadena ligera humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 70. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende: (a) una región variable de cadena pesada humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 26; (b) una región variable de cadena pesada humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 35; (c) una región variable de cadena pesada humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 44; (d) una región variable de cadena ligera humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 53; (e) una región variable de cadena ligera humana CDR2 que comprende SEC. DE I DENT. NO: 62; y (f) una región variable de cadena ligera humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 71. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende : (a) una región variable de cadena pesada humana CDRl que comprende SEC. DE I DENT. NO: 27; (b) una región variable de cadena pesada humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 36; (c) una región variable de cadena pesada humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 45; (d) una región variable de cadena ligera humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 54; (e) una región variable de cadena ligera humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 63; y (f) una región variable de cadena ligera humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 72.

Anticuerpos que Tienen Secuencias de Línea Germinal Particulares En ciertas modalidades, un anticuerpo desfucosilado de la invención comprende una región variable de cadena pesada de un particular gen de inmunoglobulina de cadena pesada de línea germinal particular y/o una región variable de cadena ligera de un gen de inmunoglobulina de cadena ligera de línea germinal particular. Por ejemplo, en una modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal desfucosilado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o se deriva a partir de un gen VH 5-51 humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a PSMA humano. En otra modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal desfucosilado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o se deriva a partir de un gen VH 3-30.3 humano, en donde el anticuerpo une específicamente PSMA. En otra modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal desfucosilado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o se deriva a partir de un gen Vk L6 humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a PSMA humano. En otra modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal desfucosilado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o se deriva a partir de un gen Vk 04/014 humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a PSMA humano. En otra modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal desfucosilado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o se deriva a partir de un gen Vk L18 humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a PSMA humano. En aún otra modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal desfucosilado, o una porción de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo: (a) comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o se deriva a partir de un gen VH 5-51 o 3-30.3 humano (que codifica la secuencia de aminoácidos establecida en SEC. DE IDENT. NOS: 73 y 76, respectivamente); (b) comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o se deriva a partir de un gen Vk L6, 04/014, o L18 humano (que codifica las secuencias de aminoácidos establecidas en SEC. DE IDENT. NOS: 74, 75 y 77, respectivamente) ; y (c) se une específicamente a PSMA humano.

Una combinación preferida de línea germinal VH y Vk es VH 5-51 y Vk L6. Ejemplos de anticuerpos que tienen VH y V? de VH 5-51 y Vk L6, respectivamente, son los anticuerpos 4A3, 7F12, 8C12 y 2C6. Otra combinación preferida de línea germinal VH y Vk es VH 5-51 y Vk 04/014. Ejemplos de anticuerpos que tienen VH y Vk de VH 5-51 y Vk.04/014, respectivamente, son los anticuerpos 8A11 y 16F9. Otra combinación preferida de línea germinal VH y Vk es VH 5-51 y Vk L18. Ejemplos de anticuerpos que tienen VH y Vk de VH 5-51 y Vk L18, respectivamente, son los anticuerpos 2A10 y 2F5. Otra combinación preferida de línea germinal VH y Vk es VH 3-30.3 y Vk L18. Un ejemplo de un anticuerpo tiene VH y Vk de VH 3-30.3 y Vk L18, respectivamente, es el anticuerpo 1C3. Como se utiliza en la presente, un anticuerpo humano comprende regiones variables de cadena pesada o ligera que es "el producto de" o "derivado de" una secuencia de línea germinal particular si las regiones variables del anticuerpo se obtienen de un sistema que utilice genes de inmunoglobulina de línea germinal humana. Tales sistemas incluyen inmunizar un ratón transgénico que lleva genes de inmunoglobulina humana con el antígeno de interés o tamizar una genoteca de inmunoglobulina humana desplegada en el fago con el antígeno de interés. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "derivado de" secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana puede identificarse como tal al comparar las secuencias de aminoácidos del anticuerpo humano con las secuencias de aminoácidos inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, utilizando la base de datos Vbase) y seleccionar la secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana que es más cercana en secuencia (es decir, mayor % de identidad) con la secuencia del anticuerpo humano. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "derivado de" una secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana particular puede contener diferencias en aminoácidos en comparación con la secuencia de línea germinal, debido a, por ejemplo, mutaciones somáticas que se presentan de manera natural o introducción intencionada de mutación dirigida. Sin embargo, un anticuerpo humano seleccionado típicamente es por lo menos 90% idéntico en secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de línea germinal humana y contiene residuos de aminoácidos que identifican el anticuerpo humano como humano cuando se compara con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina de línea germinal de otra especies (por ejemplo, secuencias de línea germinal murina) . En ciertos casos, un anticuerpo humano puede ser por lo menos 95%, o incluso por lo menos 96%, 97%, 98%, o 99% idéntico en secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal. Típicamente, un anticuerpo humano derivado de una secuencia de línea germinal humana particular mostrará no más de 10 diferencias en aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal humana. En ciertos casos, el anticuerpo humano puede mostrar no más de 5, o incluso no más de 4, 3, 2, o 1 diferencia en aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal.

Anticuerpos Homólogos En aún otra modalidad, un anticuerpo desfucosilado de la invención comprende regiones variables de cadena pesada y ligera que comprenden secuencias de aminoácidos que son homologas a las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos preferidos descritos en la presente, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-PSMA de la invención. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal desfucosilado, o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde: (a) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80% homologa a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 1-9; (b) la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80% homologa a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 10-18; y (c) el anticuerpo se une específicamente a PSMA humano. En otras modalidades, las secuencias de aminoácidos de VH y/o VL pueden ser 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% homologa con las secuencias establecidas en lo anterior. Un anticuerpo que tiene regiones VH y VL que tienen alta homología (es decir, 80% o mayor) con las regiones VH y VL de las secuencias establecidas en lo anterior, puede obtenerse por mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida o mediada por PCR) de una o más moléculas de ácidos nucleicos que codifican las secuencias SEC. DE IDENT. NOS: 1-18, seguido por la prueba por función retenida del anticuerpo alterado codificado (es decir, unión a PSMA) utilizando los ensayos de unión descritos en la presente. Moléculas de ácidos nucleicos que codifican SEC. DE IDENT. NOS: 6-9 y 15-18 pueden encontrarse en SEC. DE IDENT. NOS: 78-85. Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican SEC. DE IDENT. NOS: 1-5 y 10-14 pueden encontrarse en la Publicación de PCT WO 03/064606, Figuras 17A y 17B. Como se utiliza en la presente, el porcentaje de homología entre dos secuencia de aminoácidos es equivalente al porcentaje de identidad entre las dos secuencias. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de homología = # de posiciones idénticas/# total de posiciones x 100) , tomando en cuenta el número de espacios, y la longitud de cada espacio, que necesita introducirse para alineamiento óptimo de las dos secuencias. La comparación de secuencias y determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede lograrse utilizando un algoritmo matemático, como se describe en los ejemplos no limitantes en lo siguiente. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede determinarse utilizando un programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando una matriz NWSgapdna . CMP y un peso de espacio de 40, 50, 60, 70, u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos puede también determinarse utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos en peso PAM120, una penalización de longitud de espacio de 12 y una penalización de espacio de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de. software GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando ya sea una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y un peso de longitud de l, 2, 3, 4, 5, o 6. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos en peso PAM120, una penalización de longitud de espacio de 12 y una penalización de espacio de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970) ) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando ya sea una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. Adicional o alternativamente, las secuencias de proteína de la presente invención pueden además utilizarse como una "secuencia de consultas" para realizar una búsqueda contra bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Tales búsquedas pueden realizarse utilizando el programa XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, calificación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homologas a las moléculas de anticuerpo de la invención. Para obtener alineamientos espaciales para propósitos de comparación, Gapped BLAST puede utilizarse como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 ( 17 ): 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, los parámetros predeterminados de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST) pueden utilizarse. Véase http: //www. ncbi . nlm. nih . gov.

Anticuerpos con Modificaciones Conservadoras En ciertas modalidades, un anticuerpo desfucosilado de la invención comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencias CDRl, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias CDRl, CDR2 y CDR3, en donde una o más de estas secuencias de CDR comprenden secuencias de aminoácidos específicas con base en los anticuerpos preferidos descritos en la presente (por ejemplo, 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9, 2A10, 2C6, 2F5 y 1C3) , o modificaciones conservadoras de los mismos, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-PSMA de la invención. En consecuencia, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal desfucosilado, o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencias CDRl, CDR2, y CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias CDRl, CDR2, y CDR3, en donde: (a) la secuencia CDR3 de la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 37-45, y modificaciones conservadoras de la misma ; (b) la secuencia CDR3 de región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 64-72, y modificaciones conservadoras de la misma; y (c) el anticuerpo se une específicamente a PSMA humano. En una modalidad preferida, la secuencia CDR2 de región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 28-36, y modificaciones conservadoras de la misma; y la secuencia CDR2 de región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 55-63, y modificaciones conservadoras de la misma. En otra modalidad preferida, la secuencia CDRl de región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 19-27, y modificaciones conservadoras de la misma; y la secuencia CDRl de región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 46-54, y modificaciones conservadoras de la misma. Como se utiliza en la presente, el término "modificaciones conservadoras de secuencia" pretende referirse a modificaciones en aminoácidos que no afectan o alteran de manera significativa las características de unión del anticuerpo que contienen la secuencia de aminoácidos. Tales modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y eliminaciones de aminoácidos. Pueden introducirse modificaciones en un anticuerpo de la invención por técnicas estándar conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos son una en que el residuo de aminoácidos se reemplaza con un residuo de aminoácidos que tiene una cadena latera similar. Familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han identificado en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales acidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales ramificadas beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina) . De esta manera, uno o más residuos de aminoácidos dentro de las regiones CDR de un anticuerpo de la invención puede reemplazarse con otros residuos de aminoácidos de la misma familia de cadena lateral y el anticuerpo alterado puede probarse por función retenida (es decir, las funciones establecidas en (i) y hasta (iv) en lo anterior) utilizando los ensayos funcionales descritos en la presente. Alternativamente, en otra modalidad, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de una secuencia codificante de anticuerpo anti-PSMA, tal como por mutagénesis por saturación, y los anticuerpos anti-PSMA modificados resultantes pueden tamizarse para actividad de unión.

Anticuerpos que se Unen al Mismo Epítopo como los Anticuerpos Anti-PSMA de la Invención En otra modalidad, la invención proporciona anticuerpos desfucosilados que se unen al mismo epítopo como lo hacen los diversos anticuerpos anti-PSMA de la invención proporcionados en la presente, tales como otros anticuerpos humanos que se unen al mismo epítopo que los anticuerpos 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9, 2A10, 2C6, 2F5 y 1C3 descritos en la presente. Tales anticuerpos adicionales pueden identificarse con base en su capacidad de competencia cruzada (por ejemplo, para inhibir competitivamente la unión de, de una manera estadísticamente significativa) con otros anticuerpos de la invención, tales como 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9, 2A10, 2C6, 2F5 o 1 C3, en ensayos de unión a PSMA a estándar. La capacidad de un anticuerpo de prueba para inhibir la unión de, por ejemplo, 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9, 2A10, 2C6, 2F5 y 1C3, a PSMA humano demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con aquel anticuerpo para unirse a PSMA humano; de manera que un anticuerpo puede, de acuerdo con la teoría no limitante, unirse al mismo epítopo o una relacionado (por ejemplo, uno estructuralmente similar o espacialmente próximo) en PSMA humano como el anticuerpo con el cual compite. En una modalidad preferida, el anticuerpo desfucosilado que se une al mismo epítopo en PSMA humano como 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9, 2A10, 2C6, 2F5 y 1C3 es un anticuerpo monoclonal humano. Tales anticuerpos monoclonales humanos pueden prepararse y aislarse como se describe en las Publicaciones de PCT WO 01/09192 y WO 03/064606.

Anticuerpos Diseñados y Modificados Un anticuerpo desfucosilado de la invención además puede prepararse utilizando un anticuerpo que tiene una o más de las secuencias VH y/o VL descritas en la presente como material de inicio para diseñar un anticuerpo modificado, cuyo anticuerpo modificado puede tener propiedades alteradas a partir del anticuerpo de inicio. Un anticuerpo puede diseñarse al modificar uno o más residuos de aminoácidos dentro de una o ambas regiones variables (es decir, VH y/o VL) , por ejemplo dentro de una o más regiones CDR y/o dentro de una o más regiones de armazón. Adicional o alternativamente, un anticuerpo puede diseñarse al modificar residuos dentro de la o las regiones constantes, por ejemplo para alterar la o las funciones efectoras del anticuerpo. Un tipo de diseño de región variable que puede realizarse es injerto de CDR. Los anticuerpos interactúan con los antígenos objetivo predominantemente a través de residuos de aminoácidos que se localizan en las seis regiones de determinación de complementaridad (CDRs) de cadena pesada y ligera. Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDRs son más variadas entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDRs. Ya que las secuencias CDR son los responsables de la mayor parte de las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de anticuerpos específicos que se presentan de manera natural al construir vectores de expresión que incluyen secuencias CDR del anticuerpo específico que se presenta de manera natural injertadas en secuencias de armazón de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (véase, por ejemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Véase. U.S.A. 86:10029-10033; Patente Norteamericana No. 5,225,539 para Winter, y Patentes Norteamericanas Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 para Queen et al.). En consecuencia, otra modalidad de la invención concierne a un anticuerpo monoclonal desfucosilado, o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencias CDRl, CDR2, y CDR3 que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 19-27, SEC. DE IDENT. NOS: 28-36, y SEC. DE IDENT. NOS: 37-45, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 46-54, SEC. DE IDENT. NOS: 55-63 y SEC. DE IDENT. NOS: 64-72, respectivamente. De esta manera, tales anticuerpos contienen las secuencias CDR VH y VL de anticuerpos monoclonales 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9, 2A10, 2C6, 2F5 y 1C3, aún pueden contener diferentes secuencias de armazón de estos anticuerpos. Tales secuencias de armazón pueden obtenerse de base de datos de ADN públicas o referencias publicadas que incluyen secuencias génicas de anticuerpos de línea germinal. Por ejemplo, secuencias de ADN de línea germinal para genes de región variable de cadena pesada y ligera humana pueden encontrarse en la base de datos de secuencia de línea germinal humana "VBase" (disponible en Internet en www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), así como también en Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins de Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department de Health y Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire de Human Germline VH Sequences Reveáis about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; y Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory de Human Germ-line VH Segments Reveáis a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol . 24:827-836; los contenidos de cada una de las cuales se incorporan expresamente en la presente para referencia. Secuencias de armazón preferidas para utilizarse en los anticuerpos de la invención son aquellas que son estructuralmente similares a las secuencias de armazón • utilizadas por anticuerpos seleccionados de la invención, por ejemplo, similares a las secuencias VH 5-51 o 3-30.3 (SEC. DE IDENT. NOS: 73 y 76, respectivamente) y/o la secuencia de armazón Vk L6, 04/014 o L18 (SEC. DE IDENT. NOS: 74, 75 y 77, respectivamente) utilizadas por anticuerpos monoclonales preferidos de la invención. Las secuencias CDRl, 2 y 3 de VH, y las secuencias CDRl, 2 y 3 de V?, pueden injertarse en regiones de armazón que tienen la secuencia idéntica como aquella que se encuentra en el gen de inmunoglobulina de línea germinal de la que se deriva la secuencia de armazón derive, o las secuencias CDR pueden injertarse en regiones de armazón que contienen una o más mutaciones en comparación con las secuencias de línea germinal. Por ejemplo, se ha encontrado que en ciertas instancias es benéfico mutar residuos dentro de las regiones de armazón para mantener o intensificar la capacidad de unión a antígeno del anticuerpo (véase por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 para Queen et al). Otro tipo de modificación de región variable es mutar residuos de aminoácidos dentro de las regiones CDRl, CDR2 y/o CDR3 de VH y/o V? para mejorar por consecuencia una o más propiedades de unión (por ejemplo, afinidad) del anticuerpo de interés. Mutagénesis dirigida o mutagénesis mediada por PCR puede realizarse para introducir la o las mutaciones y el efecto en la unión del anticuerpo, u otra propiedad funcional de interés, puede valuarse en ensayos in vi tro o in vivo según se describe en la presente y se proporciona en los Ejemplos. Preferiblemente se introducen modificaciones conservadoras (como se discute en lo anterior) . Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos, pero de preferencia son sustituciones. Más aún, típicamente no más de uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos dentro de una región CDR alterada. En consecuencia, en otra modalidad, la invención proporciona anticuerpos monoclonales anti-PSMA desfucosilado, o porciones de unión a antígeno de los mismos, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una región variable CDRl de VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NO: 19-27, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos en comparación con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NO: 19-27; (b) una región CDR2 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NO: 28-36, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos en comparación con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NO: 28-36; (c) una región CDR3 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NO: 37-45, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos en comparación con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NO: 37-45; (d) una región CDRl de V? que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NO: 46-54, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos en comparación con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NO: 46-54; (e) una región CDR2 de V? que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NO: 55-63, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos en comparación con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NO: 55-63; y (f) una región CDR3 de V? que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NO: 64-72, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos en comparación con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NO: 64-72. Los anticuerpos diseñados de la invención incluyen aquellos que se han hecho modificaciones a los residuos de armazón dentro de VH y/o V?, por ejemplo para mejorar las propiedades del anticuerpo. Típicamente tales modificaciones de armazón se hacen para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, una estrategia es "restituir" uno o más residuos de armazón a la secuencia de línea germinal correspondiente. Más específicamente, un anticuerpo que ha experimentado mutación somática puede contener residuos de armazón que difieren de la secuencia de línea germinal de la que el anticuerpo se deriva. Tales residuos pueden identificarse a comparar las secuencias de armazón del anticuerpo con las secuencias de línea germinal de la que el anticuerpo se deriva. Por ejemplo, para 8C12 y 8A11, el residuo #13 de aminoácido (dentro de FRl) de VH es una treonina mientras que este residuo en la secuencia de línea germinal VH 5-51 correspondiente es una lisina. Para regresar la secuencia de la región de armazón a la configuración de línea germinal, las mutaciones somáticas pueden "restituirse" a la secuencia de línea germinal por, por ejemplo, mutagénesis dirigida o mutagénesis mediada por PCR (por ejemplo, el residuo 13 de FRl de la VH de 8C12 o 8A11 puede "restituirse" de treonina a lisina. Tales anticuerpos "restituidos" pretenden también contemplarse por la invención . Otro tipo de modificación de armazón involucra mutar uno o más residuos dentro de la región de armazón, o incluso dentro de una o más regiones CDR, para eliminar epítopos de célula T para reducir por consecuencia la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Esta estrategia es también referida como "desinmunización" y se describe en mayor detalle en la Publicación de Patente Norteamericana No. 20030153043 por Carr et al. Como adición o alternativa a las modificaciones hechas dentro de las regiones de armazón o CDR, los anticuerpos de la invención pueden diseñarse para incluir modificaciones dentro de la región Fc, típicamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tales como vida media sérica, fijación del complemento, unión a receptor de Fc, y/o citotoxicidad dependiente de antígeno. Adicionalmente, un anticuerpo de la invención puede modificarse químicamente (por ejemplo, una o más porciones química pueden unirse al anticuerpo) o modificarse para alterar su glucosilación, una vez más para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas modalidades se describe en mayor detalle en lo siguiente. La numeración de residuos en la región Fc es aquella del índice EU de Kabat. En una modalidad, la región de la bisagra de CHI se modifica de manera que el número de residuos de cisteína en la región de la bisagra se altera, por ejemplo, incrementándose o disminuyendo. Esta estrategia se describe además en la Patente Norteamericana No. 5,677,425 por Bodmer et al. El número de residuos de cisteína en la región de la bisagra de CHI se altera para, por ejemplo, facilitar el ensamble de las cadenas ligera y pesada o para incrementar o disminuir la estabilidad del anticuerpo. En otra modalidad, la región de la bisagra de Fc de un anticuerpo se muta para disminuir la vida media biológica del anticuerpo. Más específicamente, una o más mutaciones en aminoácidos se introducen en la región de interconexión del dominio CH2-CH3 del fragmento Fc-bisagra de manera que el anticuerpo tiene unión impedida a la proteína A estafilococcica (SpA) con relación a la unión A-SpA de dominio Fc bisagra nativo. Esta estrategia se describe en mayor detalle en la Patente Norteamericana No. 6,165,745 por Ward et al. En otra modalidad, el anticuerpo se modifica para incrementar su vida media biológica. Diversas estrategias son posibles. Por ejemplo, una o más de las siguientes mutaciones puede introducirse: T252L, T254S, T256F, como se describe en la Patente Norteamericana No. 6,277,375 para Ward. Alternativamente, para incrementar la vida media biológica, el anticuerpo puede alterarse dentro de la región CHI o CL para que contenga un epítopo de unión a receptor silvestre tomado a partir de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, como se describe en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,869,046 y 6,121,022 por Presta et al.

Aún en otras modalidades, la región Fc se altera al reemplazar por lo menos un residuo de aminoácidos con un residuo de aminoácidos diferente para alterar la o las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos de aminoácidos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 puede reemplazarse con un residuo de aminoácidos diferente de manera que el anticuerpo tenga un afinidad alterada por un ligando efector pero retenga la capacidad de unión a antígeno del anticuerpo progenitor. El ligando efector para el cual se altera la afinidad, puede ser, por ejemplo, un receptor de Fc o el componente Cl del complemento. Esta estrategia se describe en mayor detalle en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,624,821 y 5,648,260, ambas por Winter et al. En otro ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos de aminoácidos 329, 331 y 322 pueden reemplazarse con un residuo de aminoácido diferente de manera que el anticuerpo tenga unión alterada a Ciq y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) reducida o suprimida. Esta estrategia se describe en mayor detalle en la Patente Norteamericana No. 6,194,551 por Idusogie et al. En otro ejemplo, uno o más residuos de aminoácidos dentro de las posiciones de aminoácidos 231 y 239 se alteran para alterar por consecuencia la capacidad del anticuerpo para fijar complemento. Esa estrategia se describe en mayor detalle en la Publicación de PCT WO 94/29351 por Bodmer et al. Aún en otro ejemplo, la región Fc se modifica para incrementar la capacidad del anticuerpo para mediar citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o para incrementar la afinidad del anticuerpo por un receptor |Fcfj al modificar uno o más aminoácidos en las siguientes posiciones: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439. Esta estrategia se describe además en la Publicación de PCT WO 00/42072 por Presta. Más aún, los sitios de unión en IgGl humana para Fc?Rl, FcyRII, FcyRIII y FcRn se han mapeado y se han descrito por variantes con unión mejorada (véase Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Mutaciones específicas en las posiciones 256, 290, 298, 333, 334 y 339 demostraron mejorar la unión a FcyRIII. Adicionalmente, las siguientes mutantes de combinación mostraron mejorar la unión a FcyRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A y S298A/E333A/K334A. Otra modificación de los anticuerpos en la presente que se contempla por la invención es pegiiación. Un anticuerpo puede pegilarse para, por ejemplo, incrementar la vida media biológica (por ejemplo, sérica) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo, típicamente se hace reaccionar con polietilenglicol (PEG) , tal como un éster o aldehido reactivo derivado de PEG, bajo condiciones en las que uno o más grupos PEG se unen al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Preferiblemente, la pegilación se lleva a cabo mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula PEG reactiva (o un polímero análogo soluble en agua reactivo) . Como se utiliza en la presente, el término "polietilenglicol" pretende contemplar cualquiera de las formas de PEG que se han utilizado para derivar las proteínas, tales como mono alcoxi (de 1 a 10 átomos de carbono) o ariloxi-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En ciertas modalidades, el anticuerpo que se pegilará es un anticuerpo aglucosilado. Los métodos para pegilar la proteína se conocen en la técnica y pueden aplicarse a los anticuerpos de la invención. Véase por ejemplo, EP 0 154 316 por Nishimura et al. y EP 0 401 384 por Ishikawa et al.

Métodos para Diseñar Anticuerpos Como se discutió en lo anterior, los anticuerpos anti-PSMA desfucosilados que tienen secuencias de VH y V? descritas en la presente pueden utilizarse para crear nuevos anticuerpos anti-PSMA al modificar la secuencias de VH y/o V?, O la O las regiones constantes unidas a las mismas. De esta manera, en otro aspecto de la invención, las características estructuras de un anticuerpo anti-PSMA de la invención, por ejemplo 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9, 2A10, 2C6, 2F5 y 1C3, se utilizan para crear anticuerpos anti-PSMA desfucosilados estructuralmente relacionados que retienen por lo menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, tal como unión a PSMA humano. Por ejemplo, una o más regiones CDR de 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9, 2A10, 2C6, 2F5 y 1C3, o mutaciones de las mismas, pueden combinarse de manera recombinantemente con regiones de armazón conocidas y/o otras CDRs para crear anticuerpos anti-PSMA diseñados de manera recombinante adicionales de la invención, como se discute en lo anterior. Otros tipos de modificaciones incluyen aquellas descritas en la sección anterior. El material de inicio para el método de diseño es una o más de las secuencias de VH y/o V? proporcionadas en la presente, o uno o más regiones CDR de las mismas. Para crear el anticuerpo diseñado, no es necesario preparar de hecho (es decir, expresar como una proteína) un anticuerpo que tenga una o más de las secuencias de VH y/o V? proporcionadas en la presente, o una o más regiones CDR de las mismas. Antes bien, la información contenida en la o las secuencias se utiliza como el material de inicio para crear una o unas secuencias de "segunda generación" derivadas de la o las secuencias originales y entonces la o las secuencias de "segunda generación" se preparan y expresan como una proteína. En consecuencia, en otra modalidad, la invención proporciona un método para preparar un anticuerpo anti-PSMA que comprende: (a) proporcionar: (i) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesa que comprende una secuencia CDRl seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 19-27, una secuencia CDR2 seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 28-36 y/o una secuencia CDR3 seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 37-45; y/o (ii) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia CDRl seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 46-54, una secuencia CDR2 seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 55-63 y/o una secuencia CDR3 seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 64-72; (b) alterar por lo menos un residuo de aminoácido dentro de la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada y/o la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera para crear por lo menos una secuencia de anticuerpo alterada; y (c) expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína. Técnicas estándar en biología moléculas pueden utilizarse para preparar y expresar las secuencias de anticuerpo alteradas. La secuencia de anticuerpo alterada preparada así puede entonces elaborarse en forma desfucosilada utilizando los métodos descritos en la presente para obtener un anticuerpo anti-PSMA alterado desfucosilado. Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados pueden valorarse utilizando ensayos estándares disponibles en la técnica y/o descritos en la presente, tales como aquellos establecidos en los Ejemplos (por ejemplo, citometría de flujo, ensayos de unión, ensayos de ADCC) . En ciertas modalidades de los métodos para diseñar anticuerpos de la invención, las mutaciones pueden introducirse aleatoria o selectivamente a lo largo de la totalidad o en una parte de una secuencia codificante de anticuerpo anti-PSMA y los anticuerpos anti-PSMA resultantes pueden tamizarse para actividad de unión y/o otras propiedades funcionales como se describe en la presente. Método mutacionales se han descrito en la técnica. Por ejemplo, la Publicación de PCT WO 02/092780 por Short describe método para crear y tamizar mutaciones de anticuerpo utilizando mutagénesis por saturación, ensamble por ligación sintética o una combinación de las mismas. Alternativamente, la Publicación de PCT WO 03/074679 por Lazar et al. describe métodos de tamización computacionales para tamizar las propiedades fisioquímicas de los anticuerpos.

Moléculas de Ácidos Nucleicos que Codifican Anticuerpos de la Invención Otro aspecto de la invención concierne a moléculas de ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la invención. El término "molécula de ácido nucleico", como se utiliza en la presente, pretende incluir moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser de hebra sencilla o de doble hebra, pero de preferencia es ADN de doble hebra. Los ácidos nucleicos pueden presentarse en células completas, en un lisado celular, o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico se "aisla" o "se vuelve sustancialmente puro" cuando se purifica retirándose de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, por técnicas estándar, incluyendo tratamiento alcalino/SDS, gradientes CsCl, cromatografía de columna, electroforesis en gel de agarosa y otras bien conocidas en la técnica. Véase, F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols en Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Enterscience, New York. Un ácido nucleico de la invención puede ser, por ejemplo, ADN o RNA y puede o no puede contener secuencias intrónicas. En una modalidad preferida, el ácido nucleico es una molécula de ADNc. Los ácidos nucleicos de la invención pueden obtenerse utilizando técnicas en biología molecular estándar. Para anticuerpos expresados por hibridomas (por ejemplo, hibridomas preparados de ratones transgénicos que llevan genes de inmunoglobulina humanas como se describe adicionalmente en lo siguiente) , los ADNc que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo elaborado por el hibridoma pueden obtenerse por amplificación por PCR estándar o técnicas de clonación de ADNc. Para anticuerpos obtenidos a partir de una genoteca de inmunoglobulinas (por ejemplo, utilizando técnica de presentación en fago) , el ácido nucleico que codifica el anticuerpo puede recuperarse de la biblioteca. Moléculas de ácidos nucleicos preferidas de la invención son aquellas que codifican las secuencias VH y VL de los anticuerpos monoclonales 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9, 2A10, 2C6, 2F5 y 1C3. Las secuencias de ADN que codifican las secuencias de aminoácidos VH y VL de 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9 se publican en la Publicación de PCT No. WO 03/064606 (véase Figuras 17A y 17B) , los contenidos de la cual se incorporan expresamente para referencia. La secuencia de ADN que codifica la secuencia VH de 1C3 se muestra en SEC. DE IDENT. NO: 78. La secuencia de ADN que codifica la secuencia VL de 1C3 se muestra en SEC. DE IDENT. NO: 82. La secuencia de ADN que codifica la secuencia VH de 2A10 se muestra en SEC. DE IDENT. NO: 79. La secuencia de ADN que codifica la secuencia VL de 2A10 se muestra en SEC. DE IDENT. NO: 83. La secuencia de ADN que codifica la secuencia VH de 2C6 se muestra en SEC. DE IDENT. NO: 80. La secuencia de ADN que codifica la secuencia VL de 2C6 se muestra en SEC. DE IDENT. NO: 84. La secuencia de ADN que codifica la secuencia VH de 2F5 se muestra en SEC. DE IDENT. NO: 81. La secuencia de ADN que codifica la secuencia VL de 2C6 se muestra en SEC. DE IDENT. NO: 85. Una vez que los fragmentos de ADN que codifican los segmentos VH y VL se obtienen, estos fragmentos de ADN pueden además manipularse por técnicas de ADN recombinante estándar, por ejemplo para convertir los genes de la región variable a genes de cadena de anticuerpo de longitud completa, a genes de fragmento Fab o a un gen scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica VL o VH se enlaza de manera operativa a otro fragmento de ADN que codifican otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o un enlazador flexible. El término "operativamente enlazado", como se utiliza en este contexto, pretende dar a entender que los dos fragmentos de ADN se unen de manera que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en marco de lectura . El ADN aislado que codifica la región VH puede convertirse a un gen de cadena pesada de longitud completa al enlazar de manera operativa el ADN que codifica VH a otra molécula de ADN que codifica regiones constantes de cadena pesada (CHI, CH2 y CH3). Las secuencias de los genes de región constante de cadena pesada humana se conocen en la técnica (véase por ejemplo, Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) y los fragmentos de ADN que contemplan esas regiones pueden obtenerse por amplificación por PCR estándar. La región constante de cadena pesada puede ser una región constante de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero de mayor preferencia es una región constante de IgGl o IgG4. Para un gen de cadena pesada de fragmento Fab, el ADN que codifica VH puede enlazarse de manera operativa a otra molécula de ADN que codifica solo la región constante de CHl de cadena pesada. El ADN aislado que codifica la región VL puede convertirse a un gen de cadena pesada de longitud completa (así como también un gen de cadena ligera Fab) al enlazarlo operativamente al ADN que codifica VL a otra molécula de ADN que codifica región constante de cadena ligera, CL. Las secuencias de los genes de región constante de cadena ligera humana se conocen en la técnica (véase por ejemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins de Immunological Interest , Fifth Edition, U.S. Department de Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) y los fragmentos de ADN que contemplan estas regiones pueden obtenerse por amplificación por PCR estándar. La región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda, pero de mayor preferencia es una región constante kappa. Para crear un gen scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL se enlazan operativamente a otro fragmento que codifican un enlazador flexible, por ejemplo, que codifican la secuencia de aminoácidos (Gly-Ser)3 (SEC. DE IDENT. NO: 89), de manera que las secuencias VH y VL puedan expresarse como una proteína de cadena única contigua, con las regiones VL y VH unidas por el enlazador flexible (véase por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554). Las composiciones de ácido nucleico de la presente invención, aunque con frecuencia en una secuencia nativa (excepto para sitios de restricción modificados y similares) , ya sea ADNc, genómico o mezclas pueden mutarse, de los mismo de acuerdo con técnicas estándar para proporcionar secuencias génicas. Para secuencias codificantes, estas mutaciones, pueden afectar la secuencia de aminoácidos según se desee. En particular, las secuencias de ADN sustancialmente homologas o derivadas de conmutaciones constantes de V, D, J, nativas y otras secuencias tales descritas en la presente se contemplan (donde "derivada" indica que una secuencia es idéntica o modificada a partir de otra secuencia) .

Producción de Anticuerpos Monoclonales de la Invención Los anticuerpos monoclonales (mAbs) de la presente invención pueden producirse por una diversidad de técnicas, incluyendo metodología de anticuerpos monoclonales convencional por ejemplo, la técnica de hibridación celular somática estándar de Kohier y Milstein (1975) Nature 256: 495. Aunque se prefieren procedimientos de hibridación celular somática, en principio, otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales pueden emplearse por ejemplo, transformación viral u oncogénica de linfocitos B. El sistema animal preferido para preparar hibridomas es el sistema murino. La producción de hibridomas en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. Protocolos y técnicas de inmunización para aislamiento de esplenocitos inmunizador para fusión se conocen en la técnica. Progenitores de fusión (por ejemplo, células de mieloma murinas) y procedimientos de fusión se conocen también. En diversas modalidades, el anticuerpo puede ser, por ejemplo, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados o anticuerpo quiméricos. Los anticuerpo quiméricos o humanizados de la presente invención pueden prepararse con base en la secuencia de un anticuerpo monoclonal murino preparado como se describe en lo anterior. El ADN que codifica las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera puede obtenerse a partir del hibridoma murino de interés y diseñarse para contener secuencias de inmunoglobulinas no murinas (por ejemplo, humanas) utilizando técnicas en biología molecular estándar. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables murinas pueden enlazarse a regiones constantes humanas utilizando métodos conocidos en la técnica (véase por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 4,816,567 para Cabilly et al.). Para crear un anticuerpo humanizado, las regiones CDR murinas pueden insertarse en un armazón humano utilizando métodos conocidos en la técnica (véase por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,225,539 para Winter, y las Patentes Norteamericanas Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 para Queen et al.). Una diversidad de anticuerpos anti-PSMA de ratón se conocen en la técnica que pueden utilizarse para crear anticuerpos anti-PSMA quiméricos o humanizados, por ejemplo, 3F5.4G6, 3D7.1.1, 4E10-1.14, 3E11, 4D8, 3E6, 3C9, 2C7, 1G3, 3C4, 3C6, 4D4, 109, 5C8B9, 3G6, 4C8B9, E99, J415, J533 y J591. En una modalidad preferida, los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales humanos. Tales anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra PSMA pueden generarse utilizando ratones transgénicos o ratones cromosómicos que llevan partes del sistema inmune humano más que del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones referidos en la presente como ratones HuMAb y ratones KM, respectivamente, y se refieren de manera colectiva en la presente como "ratón de Ig humana". El HuMAb mouse® (Medarex, Ene.) contiene miniloci de gen de inmunoglobulina humana que codifican secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada (µ y ?) y ligera K humana sin ordenar, en conjunto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci endógenos de cadena µ y K (véase por ejemplo, Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859).

En consecuencia, los ratones exhiben expresión reducida de IgM o K de ratón, y en respuesta a la inmunización, los transgenes introducidos de cadena pesada y ligera humana experimentan conmutación de clase y mutación somática para generar IgG? monoclonal humana de alta afinidad (Lonberg, N. et al. (1994), supra; revisado en Lonberg, N. (1994).

Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Entern. Rev. Immunol . 13: 65-93, and Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546). La preparación y uso de ratones HuMab, y las modificaciones genómicas llevadas por tales ratones, se describen además en Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) Enternational Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBOJ. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) Enternational Immunology 6: 579-591; y Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851, los contenidos de todas se incorporan específicamente por la presente para referencia en su totalidad. Véase además, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; y 5,770,429; todas para Lonberg y Kay; la Patente Norteamericana No. 5,545,807 para Surani et al.; las Publicaciones de PCT Nos. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas para Lonberg y Kay; y la Publicación de PCT No. WO 01/14424 para Korman et al. En otra modalidad, los anticuerpos humanos de la invención pueden amplificarse utilizando un ratón que lleva secuencias de inmunoglobulina humana en transgenes y transcromosomas, tal como un ratón que lleva un transgen de cadena pesada humana y transcromosoma de cadena ligera humana. Tales ratones, referidos en la presente como "ratones KM", se describen en detalle en la Publicación de PCT WO 02/43478 para Ishida et al. Adicionalmente incluso, sistemas animales transgénicos que expresan genes de inmunoglobulina humana se encuentran disponibles en la técnica y pueden utilizarse para amplificar anticuerpos anti-PSMA de la invención. Por ejemplo, un sistema transgénico alternativo referido como el Xenomouse (Abgenix, Ene.) puede utilizarse; tales ratones se describen en, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6, 150,584 y 6,162,963 para Kucherlapati et al. Más aún, sistemas animales transcromosómicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana se encuentran disponibles en la técnica y pueden utilizarse para amplificar anticuerpos anti-PSMA de la invención. Por ejemplo, los ratones que llevan un transcromosoma de cadena pesada humana y un transcromosoma de cadena ligera humana, referido como "ratón TC" puede utilizarse; tales ratones se describen en Tomizuka et al. (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:722-727. Adicionalmente, vacas que llevan transcromosomas de cadena pesada y ligera humana se han descrito en la técnica (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) y pueden utilizarse para amplificar anticuerpos anti-PSMA de la invención. Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también pueden prepararse utilizando métodos de presentación en fagos para tamización de bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana. Tales métodos de presentación en fagos para aislar anticuerpos humanos se establecen en la técnica. Véase por ejemplo: las Patentes Norteamericanas Nos. 5,223,409; 5,403,484; y 5,571,698 para Ladner et al.; las Patentes Norteamericanas Nos. 5,427,908 y 5,580,717 para Dower et al.; las Patentes Norteamericanas Nos. 5,969,108 y 6,172,197 para McCafferty et al.; y las Patentes Norteamericanas Nos. 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 y 6,593,081 para Griffiths et al. Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención pueden también prepararse utilizando ratones SCID en los que células inmunes humanas se han reconstituido de manera que una respuesta de anticuerpos humanos puede generarse en la inmunización. Tales ratones se describen en, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,476,996 y 5,698,767 para Wilson et al.

Inmunización de Ratones de Ig Humana Cuando ratones de Ig humana se utilizan para amplificar anticuerpos humanos de la invención, tales ratones pueden inmunizarse con una línea celular que expresa PSMA (tales como células LnCaP, ATCC CRL-1740), con una preparación purificada o enriquecida de antígeno PSMA (tal como membranas celulares de LnCaP) y/o con PSMA recombinante, o una proteína de fusión de PSMA recombinante, como se describe en general por Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; y la Solicitud de PCT WO 98/24884 y WO 01/14424. Preferiblemente, los ratones serán de 6-16 semanas de edad en la primera infusión. Por ejemplo, una preparación membranal de células LnCaP puede utilizarse para inmunizar los ratones de Ig humana de manera intraperitoneal. Procedimientos detallados para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos para PSMA se describen en las Publicaciones PCT WO 01/09192 y WO 03/064606. Experiencia acumulada con varios antígenos ha mostrado que los ratones transgénicos responden cuando se inmunizan inicialmente de manera intraperitoneal (IP) con antígeno el adyuvante completo de Freund, seguido por inmunizaciones IP cada dos semanas (hasta un total de 6) con antígeno en adyuvante incompleto de Freund. Sin embargo, adyuvantes diferentes al de Freund también se encuentran efectivos. Además, células completas en ausencia de adyuvante se encuentran altamente inmunogénicas. La respuesta inmune puede monitorearse durante el curso de protocolo de inmunización con muestras plasmáticas obteniéndose por sangrados retroorbitales . El plasma puede tamizarse por ELISA (como se describe en lo siguiente) , y ratones con suficientes títulos de inmunoglobulina humana anti-PSMA pueden utilizarse para fusiones. Los ratones pueden reforzarse de manera intravenosa con antígeno 3 días antes del sacrificio y remoción del bazo. Se espera que 2-3 para cada inmunización se necesiten realizar. Entre 6 y 24 ratones se inmuniza típicamente para cada antígeno. Usualmente se utilizan las cepas HCo7 y HCol2. Además, los transgenes HCo7 y HCol2 pueden reproducirse juntos en un solo ratón que tiene dos transgenes de cadena pesada humana diferentes (HCo7/HCol2) .

Generación de Hibridomas que Producen Anticuerpos Monoclonales Humanos de la Invención Para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos de la invención, esplenocitos y/o células de nodulo linfático de ratones transgénicos inmunizados que llevan genes de inmunoglobulina humanas pueden aislarse y fusionarse a una línea celular inmortalizada apropiada, tal como una línea celular de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes pueden tamizarse para la producción de anticuerpos específicos de antígenos. Por ejemplo, suspensiones celulares sencillas de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados pueden fusionarse a una sexta parte del número de células de mieloma de ratón no secretoras P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) con 50% PEG. Las células se colocan en placas a aproximadamente 2 x 105 en placas de microvaloración de fondo plano, seguida por una incubación de dos semanas en medio selectivo que contiene 20% de Clone Serum fetal, 18% de medio condicionado "653", 5% de origen (IGEN), L-glutamina 4 mM, piruvato de sodio 1 mM, HEPES 5 mM, 2-mercaptoetanol 0.055 mM, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina y HAT IX (Sigma; el HAT se agrega 24 horas después de la fusión. Después de aproximadamente dos semanas, las células pueden cultivarse en medio en el que el HAT se reemplaza con HT . Pozos individuales pueden entonces tamizarse por ELISA para anticuerpos IgM y IgG monoclonales humanos. Una vez que se presenta crecimiento extensivo del hibridoma, el medio puede observarse usualmente después de 10-14 días. Los hibridomas que secretan anticuerpos pueden recolocarse en placas, tamizarse otra vez, y si aún son positivos para IgG humana, los anticuerpos monoclonales pueden subclonarse por lo menos dos veces por dilución limitante. Los subclones estables pueden entonces cultivarse in vi tro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en el medio de cultivo del tejido para caracterización. Para purificar anticuerpos monoclonales humanos, los hibridomas seleccionados pueden cultivarse en matraces para agitación de dos litros para purificación de anticuerpos monoclonal. Los sobrenadantes pueden filtrarse y concentrarse antes de cromatografía de afinidad con proteína A-sefarosa (Pharmacia, Piscataway, N.J.). La IgG eluida puede verificarse por electroforesis en gel y cromatografía líquida de alta resolución para asegurar la pureza. La solución tampón puede intercambiarse por PBS, y la concentración puede determinarse por OD280 utilizando un coeficiente de extensión de 1.43. Los anticuerpos monoclonales pueden guardarse en alícuotas y almacenarse a -80°C.

Generación de Transfectomas que Producen Anticuerpos Monoclonales de la Invención Los anticuerpos de la invención pueden también reproducirse en un transfectoma de célula huésped utilizando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfección génica bien conocidos (por ejemplo, Morrison, S. (1985) Science 229:1202). Por ejemplo, para expresar los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de los mismos, los ADNs que codifican cadenas ligeras y pesadas de longitud parcial o completa, pueden obtenerse por técnicas en biología molecular estándar (por ejemplo, amplificación por PCR o clonación de ADNc utilizando un hibridoma que expresa el anticuerpo de interés) y los ADNs pueden insertarse en vectores de expresión de manera que los genes se enlacen operativamente a secuencias de control transcripcional y transduccional. En este contexto, el término "operativamente enlazado" pretende dar a entender que un gen de anticuerpo se liga en un vector de manera que las secuencias de control transcripcional y transduccional dentro del vector desempeñan su función pretendida de regular la transcripción y traducción del gen de anticuerpo. El vector de vector de expresión y secuencias de control de expresión se eligen para que sean compatibles con la célula huésped de expresión utilizada. El gen de cadena ligera de anticuerpo y el gen de cadena pesada de anticuerpo pueden insertarse en un vector separado o, más típicamente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresión por métodos estándar (por ejemplo, ligación de sitios de restricción complementario en el fragmento del gen del anticuerpo y vector, o ligación de extremos romos si no se presentan sitios de restricción) . Las regiones variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos descritos en la presente pueden utilizarse para crear genes de anticuerpos de longitud completa de cualquier isotipo de anticuerpo al insertarlo en vectores de expresión que ya codifican regiones constantes de cadena pesada y constantes de cadena ligera del isotipo deseado de manera que el segmento VH se enlaza operativamente al o los segmentos CH dentro del vector y el segmento V? se enlaza operativamente al segmento CL dentro del vector. Adicional o alternativamente, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo a partir de una célula huésped. El gen de cadena del anticuerpo puede clonarse en el vector de manera que el péptido señal se enlaza en marco de lectura al extremo amino del gen de cadena de anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína que no es inmunoglobulina) . Además de los genes de cadena de anticuerpo, los vectores de expresión recombinante de la invención llevan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de cadena de anticuerpo en una célula huésped. El término "secuencia regulatoria" pretende incluir promotores, intensificadores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o traducción de los genes de cadena de anticuerpo. Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Se apreciará por aquellos con experiencia en la técnica que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras, puede depender de tales factores como la elección de la célula huésped que se transformará, el nivel de expresión de proteína deseada, etc. Secuencias reguladoras preferidas para expresión en célula huésped de mamífero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteínas en células de mamífero, tales como promotores y/o intensificadores derivados de citomegalovirus (CMV) , Virus 40 de Simio (SV40) , adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP) y polioma. Alternativamente, secuencias reguladoras no virales pueden utilizarse, tales como el promotor de ubiquitina o promotor de ß-globina. Incluso además, elementos reguladores compuestos de secuencias de diferentes fuentes, tal como el sistema promotor SRa, que contiene secuencias del promotor temprano SV40 y el repetido terminal largo del virus tipo 1 de la leucemia de células T humanas (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Gell. Biol. 8:466-472). Además de los genes de cadena de anticuerpo y secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinante de la invención pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en las células huésped (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores selectivos. El gen marcador selectivo facilita la selección de célula huésped en las que el vector se ha introducido (véase, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017, todas para Axel et al.). Por ejemplo, típicamente el gen marcador selectivo confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula huésped en la que el vector se ha introducido. Genes marcadores selectivos preferidos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para utilizarse en células huésped de dhfr- con selección/amplificación por metotrexato) y el gen neo (para selección con G418). Para la expresión de las cadenas ligera y pesada, el o los vectores de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera se transfectan en una célula huésped por técnicas estándar. Las diversas formas del término "transfección" pretenden contemplar una amplia variedad de técnicas comúnmente utilizadas para la introducción de ADN exógeno en una célula huésped procariótica o eucariótica, por ejemplo, electroporación, precipitación con calcio-fosfato, transfección con DEAE-dextrano y similares. Aunque es teóricamente posible expresar los anticuerpos de la invención en célula huésped procariótica o eucarióticas, la expresión de los anticuerpos en células eucarióticas, y de mayor preferencia en células huésped de mamífero, es la más preferida ya que tales células eucarióticas, y en particular las células de mamífero, tienen mayor probabilidad que las células procarióticas para ensamblar y secretar un anticuerpo apropiadamente plegado e inmunológicamente activo. La expresión procariótica de genes de anticuerpo se ha reportado inefectiva para la producción de altos rendimientos de anticuerpo activo (Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13). Células huésped preferidas para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen células que modifican la fucosilación de un anticuerpo expresado. Por ejemplo, la célula huésped puede ser una célula que carece de una enzima fucosiltransferasa de manera que la célula huésped produce proteínas que carecen de fucosa en sus carbohidratos, o una célula huésped que expresa glicosil transferasas que modifican glicoproteínas de manera que los anticuerpos expresados en la célula huésped tienen estructuras incrementadas GlcNac divididas que evitan la fucosilación. Otras células huésped de mamífero para expresar los anticuerpos recombinantes incluyen las de Ovario de Hámster Chino (células CHO) (incluyendo células CHO dhfr-, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, utilizadas con un marcador selectivo DHFR, por ejemplo, como se describe en R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NSO, células COS y células SP2. En particular, para utilizarse con células de mieloma NSO, otro sistema de expresión preferido es el sistema de expresión génica GS descrito en WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338,841. Cuando os vectores de expresión recombinante que codifican genes de anticuerpos se introducen en células huésped de mamífero, los anticuerpos se producen al cultivar las células huésped durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o, más preferiblemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se cultiva la célula huésped. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo utilizando métodos de purificación de proteínas estándar.

Inmunoconj ugados En otro aspecto, la presente invención presenta un anticuerpo anti-PSMA desfucosilado, o un fragmento del mismo, conjugado a una porción terapéutica, tal como una citotoxina, un fármaco (por ejemplo, un inmunosupresor) o una radiotoxina. Tales conjugados se refieren en la presente como "inmunoconjugados". Los inmunoconjugados que incluyen una o más citotoxinas se refieren como "inmunotoxinas . " Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que es perjudicial para (por ejemplo, mata) las células. Ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismo.

Los agentes terapéuticos también incluyen, por ejemplo, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbacina) , agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalano, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU) , ciclotosfamida, busulfano, dibromomannitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cisdiclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatina) , antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) y doxorubicina) , antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina) , bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC) ) , y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina) . Otros ejemplos preferidos de citotoxinas terapéuticas que pueden conjugarse a un anticuerpo de la invención incluyen duocarmicinas, caliqueamicinas, maitansinas y auristatinas, y derivados de las mismas. Un ejemplo de un conjugado caliqueamicina anticuerpo se encuentra comercialmente disponible (Mylotarg™; Wyeth-Ayerst) . Las citocinas pueden conjugarse a los anticuerpos de la invención utilizando tecnología de enlazador disponible en la técnica. Ejemplos de tipos de enlazador que se han utilizado para conjugar una citotoxina a un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, hidrazonas, tioéteres, esteres, disulfuros y enlazadores que contienen péptido. Un enlazador puede elegirse para que sea, por ejemplo, susceptible a la escisión por bajo pH dentro del compartimento lisosomal o susceptible a la escisión por proteasas, tales como proteasas expresadas de preferencia en tejido tumoral tales como catepsinas (por ejemplo, catepsinas B, C, D) . Para una discusión adicional de tipos de citotoxinas, enlazadores y métodos para conjugar agentes terapéuticos a anticuerpos, véase también Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cáncer Immunol . Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cáncer Cell 3:207-212; Alien, T.M. (2002) Nat. Rev. Cáncer 2:750-763; Pastan, I. y Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Envestig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, C.J. (2001) Adv. DrugDeliv. Rev. 53:247-264. Los anticuerpos de la presente invención también pueden conjugarse a un isótopo radiactivo para generar radiofarmacéuticos citotóxicos, referidos también como radioinmunocon ugados. Ejemplos de isótopos radiactivos que pueden conjugarse a anticuerpos para utilizarse de manera diagnóstica o terapéutica incluyen, pero no se limitan a, yodo131, indio111, itrio90 y lutecio177. El método para preparar radioinmunoconjugados se establece en la técnica. Ejemplos de radioinmunoconjugados se encuentran comercialmente disponibles, incluyendo Zevalin™ (IDEC Pharmaceuticals) y Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals) , y métodos similares pueden utilizarse para preparar radioinmunoconjugados utilizando los anticuerpos de la invención. Los conjugados de anticuerpos de la invención pueden utilizarse para modificar una respuesta biológica dada, y la porción del fármaco no debe interpretarse como limitada a los agentes terapéuticos típicos clásicos. Por ejemplo, la porción del fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa, o fragmento activo de la misma, tales como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, o toxina diftérica; una proteína tal como factor de necrosis tumoral o interferón-?; o, modificadores de respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfoncinas, interleucina-1 ("IL-1") , interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos ("GMCSF") , factor estimulante de colonias de granulocitos, u otros factores de crecimiento. Las técnicas para conjugar tal porción terapéutica a anticuerpos se conocen bien, véase, por ejemplo, Arnon et al . , "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy", in Monoclonal Antibodies Y Cáncer Therapy, Reisfeld et al . (eds . ) , pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al . , "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al . (eds . ) , pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies ' 84 : Biological Y Clinical Applications, Pinchera et al . (eds . ) , pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, Y Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection Y Therapy, Baldwin et al . (eds . ) , pp. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al . , "The Preparation Y Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol . Rev. , 62:119-58 (1982).

Composiciones Farmacéuticas En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que contiene uno o una combinación de anticuerpos monoclonales, o una o unas porciones de unión-antígeno de los mismos, de la presente invención, formulados junto con un portador farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones pueden incluir uno o una combinación de (por ejemplo, do o más diferentes) anticuerpos, o inmunoconjugados de la invención. Por ejemplo, una composición farmacéutica de la invención puede comprender una combinación de anticuerpos (inmunoconjugados) que se unen a diferentes epítopos en el antígeno objetivo o que tienen actividad complementaria.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden administrarse en terapia de combinación, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación pueden incluir un anticuerpo anti-PSMA desfucosilado de la presente invención combinado con por lo menos otro agente anti-neoplásico, anti-inflamatorio, o inmunosupresor. Tales agentes terapéuticos incluyen entre otros, fármacos anti-inflamatorios esteroidales y no esteroidales (NSAIDS) , por ejemplo, aspirina y otros salicilatos, tales como ibuprofeno (Motrin, Advil), naproxeno (Naprosyn) , sulindaco (Clinoril), dielofenaco (Voltaren), piroxicam (Feldene) , cetoprofeno (Orudis) , diflunisal (Dolobid) , nabumetona (Relafen) , etodolaco (Lodine) , oxaprozin (Daypro), indometacina (Indocin), y aspirina en altas dosis. Otros ejemplos de agentes terapéuticos que pueden utilizarse en terapia de combinación se describen en mayor detalle en lo siguiente, en la sección de usos de los anticuerpos de la invención. Como se utiliza en la presente, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera o todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungales, agentes de retardamiento isotónicos y de absorción, y similares que sean fisiológicamente compatibles. De preferencia, el portador es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, por inyección o infusión) . Dependiendo de la ruta de administración el compuesto activo, es decir, anticuerpo o inmunoconjugado, puede recubrirse con un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto. Los compuestos farmacéuticos de la invención pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto progenitor y no imparte ningunos efectos toxicológicos indeseados (véase por ejemplo, Berge, S.M., et al . (1977) J. Pharm . Sci . 66:1-19). Ejemplos de tales sales incluyen sales de adición acida y sales de adición básica. Las sales de adición acida incluyen aquellas derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodihídrico, fosforoso y similares, así como también de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos mono y dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos, sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos y similares. Las sales de adición básica incluyen aquellas derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como también de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N'- dibenziltilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaina, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaina y similares. Una composición farmacéutica de la invención puede también incluir un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidamente solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA) , hidroxitolueno butilado (BHT) , lecitina, propilgalato, alfa-tocoferol, y similares; y (3) agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiamino tetra-acético, (EDTA) , sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares. Ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol,, polioles (tales como glicero, propilenglicol, polietilenglicol y similares) , y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tal como aceite de oliva, y esteres orgánicos inyectables, tal como oleato de etilo. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, de uso de materiales de recubrimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y por el uso de tensioactivos.

Estas composiciones pueden también contener adyuvantes tales como conservadores, agentes humectantes, agentes emulsificantes y agentes de dispersión. La prevención de la presencia de microorganismos puede asegurarse por procedimientos de esterilización, supra , y por la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifungales, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenolsórbico, y similares. Puede también ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio, y similares de las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede producirse por la inclusión de agentes que retardan la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina. Portadores farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersión inyectable estéril. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce en la técnica. Excepto a tal lado que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, el uso de los mismos en las composiciones farmacéuticas de la invención se contemplan. Compuestos activos suplementarios pueden también incorporarse en las composiciones. Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para la alta concentración del fármaco. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, poli-alcoholes, tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada en la composición inyectable puede realizarse al incluir en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, sales monoestearato y gelatina. Soluciones inyectables estériles pueden prepararse al incorporar el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados en lo anterior, como se requiera, seguido por microfiltración de esterilización. Generalmente, las dispersiones se preparan al incorporar el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados en lo anterior. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son, secado al vacío y secado por congelación (liofilización) que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente filtrada estéril de los mismos. La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con un material portador para producir una sola forma de dosificación variará dependiendo del sujeto que se trata,, y el modo particular de administración. La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con un material portador para producir una sola forma de dosificación generalmente será aquella cantidad de la composición que produzca un efecto terapéutico. Generalmente, fuera del cien por ciento, esta cantidad variará de aproximadamente 0.01 a aproximadamente noventa y nueve por ciento de ingrediente activo, de preferencia de aproximadamente 0.1 por ciento a aproximadamente 70 por ciento, de mayor preferencia de aproximadamente 1 por ciento a aproximadamente 30 por ciento de ingrediente activo en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica) . Por ejemplo, un solo bolo puede administrarse, varias dosis divididas pueden administrarse durante el tiempo o la dosis puede reducirse o incrementarse proporcionalmente según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación para facilidad de administración, y uniformidad de dosificación. La forma de unidad de dosificación como se utiliza en la presente se refiere a unidades físicamente dispuestas, adecuadas como dosificaciones unitarias para os sujetos que se tratarán; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas de unidad de dosificación de la invención se dicta por y depende por (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se logrará, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica para combinar tal compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en los individuos . Para la administración del anticuerpo, la dosificación varía de aproximadamente 0.0001 a 100 mg/kg, y más usualmente 0.01 a 5 mg/kg, del peso corporal del hueso. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser 0.3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal ó 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg. Un régimen de tratamiento ejemplar implica la administración una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses y una vez cada tres a 6 meses. Los regímenes de dosificación preferidos para un anticuerpo anti-PSMA desfucosilado de la invención incluyen 1 mg/kg de peso corporal ó 3 mg/kg de peso corporal vía administración intravenosa, con el anticuerpo que se da utilizando uno de los siguientes calendarios de dosificación: (i) cada cuatro semanas para seis dosificaciones, después cada tres meses; (ii) cada tres semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal una vez seguido por 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas. En algunos métodos, dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión se administran de manera simultánea, en cuyo caso la dosificación de cada anticuerpo administrado cae dentro de los intervalos indicados. El anticuerpo usualmente se administra en ocasiones múltiples. Los intervalos entre dosificaciones sencillas pueden ser, por ejemplo, semanalmente, mensualmente, cada tres meses o anualmente. Los intervalos pueden ser también irregulares como se indica al medir niveles de sangre del anticuerpo para el antígeno objetivo en el paciente. En algunos métodos, la dosificación se ajusta para lograr una concentración plasmática de anticuerpo de aproximadamente 1-1000 µg /ml y en algunos métodos aproximadamente 25-300 µg /ml . Alternativamente, el anticuerpo puede administrarse como una formulación de liberación prolongada, en cuyo caso se requiere administración menos frecuente. La dosificación y frecuencia varían dependiendo de la vida media del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la vida media más larga, seguidos por los anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, y anticuerpos no humanos. La dosificación y frecuencia de administración puede variar dependiendo si el tratamiento el profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, una dosificación relativamente baja se administra a intervalos relativamente infrecuentes durante un largo periodo de tiempo. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento por el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, una dosificación relativamente alta a intervalos relativamente cortos se requiere algunas veces hasta que el progreso de la enfermedad se reduzca o se termine, y de preferencia hasta que el paciente muestre mejoría parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. En lo sucesivo, el paciente puede administrarse por un régimen profiláctico. Los niveles de dosificación actuales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse, de manera que se obtenga una cantidad de ingrediente activo que sea efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para una paciente, composición y modo de administración particular, sin que sea tóxico para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una serie de factores farmacocinéticos incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, o el éster, sal, o amida de las mismas, la ruta de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto particular que se emplea, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historia médica anterior del paciente que se trata, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Una "dosificación terapéuticamente efectiva" de un anticuerpo anti-PSMA de la invención de preferencia resulta en una disminución en la severidad de los síntomas de la enfermedad, un incremento en la frecuencia y duración de los periodos libres de síntomas de enfermedad, o una prevención del deterioro y discapacidad debidos a la aflicción de la enfermedad.. Por ejemplo, para el tratamiento de tumores cancerosos, una "dosificación terapéuticamente efectiva" de preferencia inhibe el crecimiento celular o crecimiento tumoral en por lo menos aproximadamente 20%, de más preferencia por lo menos aproximadamente 40%, aun de más preferencia por lo menos aproximadamente 60%, y aún de más preferencia por lo menos aproximadamente 80% con relación a los sujetos no tratados. La capacidad de un compuesto para inhibir el crecimiento tumoral puede evaluarse en un sistema de modelo animal predictivo de eficacia en tumores humanos. Alternativamente, esa propiedad de una composición puede evaluarse al examinar la capacidad del compuesto para inhibir, la inhibición in vi tro por ensayos conocidos para el profesional experto. Una cantidad terapéuticamente efectiva de una compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño del tumor, o de otra manera mejorar los síntomas en un sujeto. Alguien con experiencia ordinaria en la técnica debe ser capaz de determinar tales cantidades con base en factores tales como la talla del sujeto, la severidad de los síntomas del sujeto y la composición de o ruta de administración particular seleccionadas. Una composición de la presente invención puede administrarse mediante una o más rutas de administración I utilizando uno o más de una serie de métodos conocidos en la técnica. Como se apreciará por el técnico experto, la ruta y/o modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Las rutas preferidas de administración para los anticuerpos de la invención incluyen intravenosa, intramuscular, íntradérmica, intraperitoneal, subcutánea espinal u otras rutas parenterales de administración, por ejemplo, por inyección o infusión. La frase "administración parenteral" como se utiliza en la presente significa modos de administración diferentes a la administración enteral y tópica, usualmente por inyección, e incluye sin limitación inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e inyección intraesternal e infusión. Alternativamente, un anticuerpo desfucosilado de la invención puede administrarse mediante una ruta no parenteral, tal como una ruta de administración tópica, epidérmica o mucosal, por ejemplo, intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópicamente. Los compuestos activos pueden prepararse con portadores que protegerán el compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos, y sistemas de suministro microencapsulados. Polímeros biodegradables biocompatibles pueden utilizarse, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones se patentan o en general se conocen por aquellos con experiencia en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained y Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. Las composiciones terapéuticas pueden administrarse con dispositivos médicos conocidos en la técnica, por ejemplo, en una modalidad preferida, una composición terapéutica de la invención puede administrarse con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tal como los dispositivos descritos en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; ó 4,596,556. Ejemplos de implantes y modelos bien conocidos útiles en la presente incluyen: Patente Norteamericana No. 4,487,603, que describe una bomba de micro-infusión implantable para distribuir médicamente a una velocidad controlada; Patente Norteamericana No. 4,486,194, que describe un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; Patente Norteamericana No. 4,447,233, que describe una bomba de infusión de medicación para suministrar médicamente a una velocidad de infusión precisa; Patente Norteamericana No. 4,447,224, que describe un aparato de infusión implantable de flujo variable para suministro continuo de fármaco; Patente Norteamericana No. 4,439,196, que describe un sistema de suministro de fármaco osmótico que tiene compartimientos de cámara múltiple; y Patente Norteamericana No. 4,475,196, que describe un sistema de suministro de fármaco osmótico. Estas patentes se incorporan en la presente para referencia. Muchos otros implantes, sistemas de suministro y módulos se conocen por aquellos con experiencia en la técnica. En ciertas modalidades, los anticuerpos desfucosilados de la invención pueden formularse para asegurar distribución apropiada in vivo . Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrofílicos. Para asegurar que los compuestos terapéuticos de la invención crucen la BBB (si se desea), puedan formularse, por ejemplo, en liposomas. Para métodos de fabricación de liposomas, véase, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas 4,522,811; 5,374,548; y 5,399,331. Los liposomas pueden comprender una o más porciones que se transportan de manera selectiva en células u órganos específicos, de esta manera intensifican el suministro de fármaco dirigido ( véase, por ejemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin . Pharmacol . 29:685). Opciones de dirección ejemplares incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, Patente Norteamericana 5,416,016 para Low et al . ) ; manósidos (Umezawa et al . , (1988) Biochem . Biophys . Res . Commun . 153:1038); anticuerpos (P.G. Bloeman et al . (1995) FEBSLett . 357:140;. M. Owais et al . (1995) Antimicrob . Agents Chemother. 39:180); receptores de proteína A tensioactiva (Briscoe et al . (1995) Am . J. Physiol . 1233:134) ; pl20 (Schreier et al . (1994) J. Biol . Chem . 269:9090); véase también K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBSLett . 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.

Usos y Métodos de la Invención Los anticuerpos desfucosilados, composiciones de anticuerpos y métodos de la presente invención tienen numerosas utilidades diagnósticas y terapéuticas in vi tro e in vivo involucrando el diagnóstico y tratamiento de trastornos que involucran la expresión de PSMA. Por ejemplo, estas moléculas pueden administrarse a células en cultivo, por ejemplo in vi tro o ex vivo, o a sujetos humanos, por ejemplo, in vivo , para tratar, prevenir y para diagnosticar una diversidad de trastornos. Como se utiliza en la presente, el término "sujeto" pretende incluir animales humanos y no humanos. Los animales no humanos incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas, caballos, cerdos, pollos, aves, anfibios y reptiles. Los sujetos preferidos incluyen pacientes humanos que tienen trastornos asociados con la expresión de PSMA. Cuando los anticuerpos para PSMA se administran junto con otro agente, los dos pueden administrarse en orden o de manera simultánea. Rutas adecuadas para la administración de las composiciones de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpo o inmunoconj gado) de la invención in vivo e in vi tro se conocen bien en la técnica y pueden seleccionarse por aquellos con experiencia ordinaria. Por ejemplo, las composiciones de anticuerpos pueden administrarse por inyección (por ejemplo, intravenosa o subcutánea) . Dosificaciones adecuadas de las moléculas utilizadas dependerán de la edad y peso del sujeto y la concentración y/o formulación de la composición de anticuerpos. En una modalidad, los anticuerpos de la invención pueden probarse inicialmente para actividad de unión asociada con uso terapéutico o diagnóstico in vi tro . Por ejemplo, las composiciones de la invención pueden probarse utilizando ensayos de ELISA y citometría de flujo. Además, la actividad de estas moléculas en el inicio de por lo menos una actividad de célula efectora mediada por efector incluyendo la inhibición del crecimiento de y/o eliminación de células que expresan PSM pueden ensayarse. Protocolos para ensayar la ADCC mediada por célula efectora se describen en los Ejemplos a continuación.

A . Métodos de Detección En una modalidad, los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para detectar niveles de PSMA, o niveles de células que contienen PSMA en su superficie membranal, cuyos niveles pueden entonces asociarse con ciertos síntomas de enfermedad. En una modalidad particular, la invención proporciona métodos para detectar la presencia de PSMA en una muestra, o mediar la cantidad de PSMA en la superficie de células, que comprende contactar la muestra, y una muestra control, con un anticuerpo desfucosilado, o una porción de unión de antígeno del mismo que se une específicamente a PSMA, bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo o porción del mismo y PSMA. La formación de un complejo se detecta entonces, en donde una diferencia en la formación del complejo entre la muestra comparada con la muestra control es indicativo de la presencia de PSMA en a muestra. Por ejemplo, métodos de detección estándar, bien conocidos en la técnica, tales como ensayos de ELISA y citometría de flujo pueden realizarse utilizando las composiciones de la invención. Por consiguiente, en un aspecto, la invención además proporciona métodos para detectar la presencia de PSMA (por ejemplo, PSMA humano) en una muestra, o medir la cantidad de PSMA, que comprende contactar la muestra, y una muestra control, con un anticuerpo de la invención, o una porción de unión de antígeno del mismo, que se une específicamente a PSMA, bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo o porción del mismo y PSMA. La formación de un complejo entonces se detecta, en donde la diferencia en la formación del complejo entre la muestra comparada con la muestra control es indicativo de la presencia de PSMA en la muestra. Las composiciones de la invención pueden también utilizarse para dirigirse a células que expresan PSMA, por ejemplo, para etiquetar tales células. Para tal uso, el agente de unión puede enlazarse a una molécula que pueda detectarse. De esta manera, la invención proporciona métodos para localizar células que expresan PSMA ex vivo o in vi tro . La etiqueta detectable puede ser, por ejemplo, a radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático.

B . Inhibición de Crecimien to de Células PSMA+ Los anticuerpos pueden utilizarse para inhibir el crecimiento de células que expresan PSMA lo cual, a su vez, puede asociarse a la prevención o mejoría de ciertos síntomas de enfermedad asociados con la expresión de PSMA. Diferencias en la expresión de PSMA durante una condición de enfermedad en comparación con una condición de no enfermedad pueden determinarse al contactar una muestra de prueba de un sujeto que adolece de la enfermedad y una muestra control con el anticuerpo anti-PSMA bajo condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo y PSMA.

Cualesquiera complejos formados entre el anticuerpo y PSMA se detectan y comparan en la muestra y el control. Por ejemplo, los anticuerpos pueden utilizarse para obtener, in vivo o in vi tro una o más de las siguientes actividades biológicas: para inhibir el crecimiento de y/o eliminar una célula que expresa PSMA; para mediar la fagocitosis o ADCC de una célula que expresa PSMA en la presencia de células efectoras humanas; para inhibir la secreción de PSMA soluble. Como se discute en la presente,, los anticuerpos desfucosilados de la invención exhiben actividad ADCC intensificada en comparación con la forma fucosilada del anticuerpo. En consecuencia, en otro aspecto, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de células PSMA+ que comprende contactar las celdas con un anticuerpo anti-PSMA desfucosilado bajo condiciones suficientes para inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) de las células. Las células pueden ser, por ejemplo, células tumorales. En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-PSMA es un anticuerpo humano. En una modalidad, los anticuerpos, o porciones de unión de los mismos de la presente invención pueden utilizarse para modular niveles de PSMA en las células objetivo, tal como por bloqueo y eliminación de receptores en la superficie celular. Mezclas de anticuerpos anti-receptor de Fc pueden también utilizarse para este propósito. Células efectoras específicas de objetivo, por ejemplo, células efectoras enlazadas a composiciones de la invención pueden también utilizarse como agentes terapéuticos. Las células efectoras para el direccionamiento pueden ser leucocitos humanos, tales como macrófagos, neutrófilos o monocitos. Otras células incluyen eosinófilos, células asesinas naturales y otras células que llevan receptor IgG- o IgA. Si se desea, las células efectoras pueden obtenerse del sujeto que se tratará. Las células efectoras específicas de objetivo, pueden administrarse como una suspensión de células en una solución fisiológicamente aceptable. El número de células administrado puede estar en el orden de 108-109 pero variará dependiendo del propósito terapéutico. En general, la cantidad será suficiente para obtener localización en la célula objetivo, por ejemplo, una célula tumoral que expresa PSMA, y para efectuar la eliminación de la célula por, por ejemplo, fagocitosis. Las rutas de administración pueden variar también. La terapia con células efectoras específicas de objetivo puede realizarse en conjunto con otras técnicas para la remoción de células objetivo. Por ejemplo, terapia antitumoral utilizando las composiciones de la invención y/o células efectoras armadas con esas composiciones pueden utilizarse en conjunto con la quimioterapia. Adicionalmente, inmunoterapia de combinación puede utilizarse para dirigir dos poblaciones efectoras citotóxicas distintas hacia el rechazo de la célula tumoral.

C. Uso de Inmunoconj ugados y Terapia de Combinación En una modalidad, los inmunoconjugados de la invención pueden utilizarse para dirigir compuestos (por ejemplo, agentes terapéuticos, etiquetas, citotoxinas, radiotoxinas, inmunosupresores, etc.) a células que tienen moléculas de superficie celular de PSMA al enlazar tales compuestos al anticuerpo. De esta manera, la invención también proporciona métodos para localizar células que expresan PSMA ex vivo o in vi tro (por ejemplo, con una etiqueta detectable, tal como un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor enzimático) . Alternativamente, los inmunoconjugados pueden utilizarse para eliminar células que tienen receptores de superficie celular de PSMA al dirigir citotoxinas o radiotoxinas a PSMA, tal como a células tumorales que expresan PSMA para eliminar por consiguiente la célula tumoral. En otras modalidades, el sujeto puede adicionalmente tratarse con un agente que modula, por ejemplo, intensifica o inhibe, la expresión de la actividad de Fc? o receptores de Fc?, por ejemplo, al tratar al sujeto con una citocina. Citocinas preferidas para la administración durante el tratamiento incluyen del factor estimulante de colonia de granulocitos (G-CSF) , factor estimulante de colonia de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) , interferón-? (IFN-?) , y factor de necrosis tumoral. En otra modalidad, los pacientes tratados con composiciones de anticuerpos de la invención pueden adicionalmente administrarse (previo a, simultáneamente con o después de la administración de un anticuerpo de la invención) con otro agente terapéutico, tal como un agente citotóxico o radiotóxico, que intensifica o aumenta el efecto terapéutico de los anticuerpos humanos. El anticuerpo puede enlazarse al agente (como un inmunocomplejo) o puede administrarse separado del agente. En el ultimo caso (administración separada) , el anticuerpo puede administrarse antes, después o de manera concurrente con el agente o puede coadministrarse con otras terapias conocidas, por ejemplo, una terapia anti, -cáncer, por ejemplo, radiación. Tales agentes terapéuticos incluyen, entre otros, agentes antineoplásicos tales como doxorubicina, (adriamicina) , sulfato de cisplatina bleomicina, carmustina, clorambucil y ciclofosfamida hidroxiurea que, por sí mismos, sólo son efectivos a niveles que son tóxicos o subtóxicos para un paciente. La cisplatina se administra de manera intravenosa como una dosis de 100 mg/ml una vez cada cuatro semanas y la diamicina se administra de manera intravenosa como una dosis a 60-75 mg/ml una vez cada 21 días. La coadministración de los anticuerpos anti-PSMA, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención con agentes quimioterapéuticos proporcionan dos agentes anti-cancerosos que operan mediante mecanismos diferentes lo cual produce un efecto citotóxico para las células tumorales humanas. Tal coadministración puede resolver problemas debidos a desarrollo de resistencia a fármacos o a un cambio en la antigenicidad de las células tumorales que podría volverlas no reactivas con el anticuerpo.

D . Tra tamiento de Cáncer Se ha mostrado que el PSMA se expresa en células tumorales, tales como células tumorales de carcinoma prostático y también se ha mostrado que se expresa en células endoteliales vasculares próximas a las células cancerosas, tales como células cancerosas uroteliales, células cancerosas de colon, células cancerosas rectales, células cancerosas pulmonares, células cancerosas de mama y células cancerosas de adenocarcinoma metastático del hígado (véase Patente Norteamericana No .6, 136, 311) . Por consiguiente, los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para tratar cáncer al inhibir el crecimiento de células tumorales que expresan PSMA o al inhibir el crecimiento de células endoteliales vasculares próximas a las células tumorales. De esta manera, en otra modalidad, la presente invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto, en donde las células del tumor o células endoteliales vasculares próximas al tumor son PSMA+, en las cuales un anticuerpo anti-PSMA desfucosilado de la invención se administra al sujeto de manera que el crecimiento del tumor se inhibe. Para sujetos humanos, el anticuerpo de preferencia es un anticuerpo humanizado o humano. En una modalidad preferida, las células tumorales son células tumorales de próstata. En otras modalidades, las células son de cánceres tales como de colon, renal, rectal, urotelial, de mama, de vejiga, de hígado, de páncreas o melanoma. Los métodos de tratamiento de la invención involucran administrar a un sujeto una composición de anticuerpos de la presente invención en una cantidad efectiva para tratar o prevenir el trastorno. La composición de anticuerpos puede administrarse sola o junto con otro agente terapéutico, tal como un agente citotóxico o radiotóxico (conjugado a o administrado con el anticuerpo) que actúa en conjunto con o de manera sinergística con la composición de anticuerpos para tratar o prevenir la enfermedad asociada con la expresión de PSMA.

Equipos También dentro del alcance de la invención se encuentran equipos que comprenden un anticuerpo de la invención e instrucciones para uso. El equipo puede además comprender uno o más reactivos adicionales, tales como un reactivo inmunoestimulador, un agente citotóxico o un agente radiotóxico, o uno o más anticuerpos adicionales de la invención (por ejemplo, un anticuerpo que tenga una actividad complementaria que se une a un epítopo en el antígeno PSMA distinto del primer anticuerpo) . Los equipos típicamente incluyen una etiqueta que indica el uso pretendido de los contenidos del equipo. El término etiqueta incluye cualquier escritura, o material registrado suministrado en o con el equipo, o que de otra manera acompaña al equipo. La presente invención además se ilustra por los siguientes ejemplos que no deben interpretarse además como limitantes. Los contenidos de todas las figuras y todas las referencias, patentes, y solicitudes de patente publicadas en toda esta solicitud se incorporan expresamente en la presente para referencia.

Ejemplo 1 Expresión de Anticuerpo Monoclonal Anti-PSMA en Huevos de Gallinas Quiméricas En este ejemplo, la expresión del anticuerpo monoclonal humano anti-PSMA, 7F12, en los huevos de gallinas quiméricas se describe. Metodologías generales para expresar proteínas, que incluyen anticuerpos, en los huevos de gallinas quiméricas se describen en la Publicación PCT WO 2004/015123, los contenidos de la cual se incorporan expresamente en la presente para referencia. Información adicional con respecto a la expresión de anticuerpos en huevos de gallinas quiméricas se describe en la Solicitud Norteamericana No. de Serie 11/062,325, titulada "Expresión de Anticuerpos Específicos de Tejido en Gallinas, presentada el 18 de febrero de 2005, los contenidos de la cual se incorporan expresamente en la presente para referencia. En el siguiente ejemplo, un transgen que contiene una secuencia reguladora de clara de huevo endógena que comprende un promotor junto con genes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina exógena se construyen para producir expresión de anticuerpos específica de tejido en las células glandulares tubulares del oviducto. La molécula del anticuerpo expresada de esta manera se deposita entonces en la clara de huevo de una gallina transgénica. En esta modalidad, los anticuerpos codificados por cualquier gen dé inmunoglobulina reacomodados se expresan específicamente en el tejido que comprende las células glandulares tubulares de la región del magno del oviducto y pueden aislarse de las claras de los huevos. Los genes de inmunoglobulina reacomodados que codifican el anticuerpo monoclonal se expresan preferencialmente en el oviducto a la exclusión sustancial de la expresión en otros tejidos, aunque la expresión en otros tejidos puede existir por arriba de niveles detectables. Construcciones transgénicas preferidas para construcciones de anticuerpos monoclonales derivados de ovoalbúminas se muestran en la Figura 12. Estas construcciones transgénicas, designadas 0v7.5 y 0vl5, tienen aproximadamente 7.5 kb y 15 kb, respectivamente, del promotor de ovoalbúmina que flanquea la adhesión codificante de MAb en la secuencia del extremo 5' y 15 kb de la secuencia 3' del promotor de la región codificante. Las regiones codificantes comprenden las regiones variables para la cadena ligera y cadena pesada, secuencias de intrones J-C, la región constante de cadena ligera kappa, una secuencia IRES y las regiones constantes de cadena pesada y su tipo 1. El extremo 3' de la construcción comprende un gen GFP y una marcador selectivo, en este caso un gen de resistencia a puromicina dirigido por el promotor CX. Las longitudes de la secuencia del promotor de ovoalbúmina en 3' y 5' de la región codificante del anticuerpo monoclonal son ejemplos solamente y construcciones análogas pueden incluir 25-100 kb o más de la secuencia 5' así como también longitudes diversas en la secuencia 3'. Aquellos con experiencia ordinaria en la técnica apreciarán que el marcador GFP se presenta sólo para detección en especímenes fisiológicos y puede eliminarse sin apartarse de la utilidad del transgen. El marcador de resistencia a puromicina puede sustituirse con cualquier marcador que proporcione la capacidad de seleccionar células troncales embrionarias que se transformen exitosamente con el transgen. Varios tipos de marcador selectivo análogo son bien conocidos en la técnica y pueden utilizarse esencialmente de manera intercambiable con el gen de resistencia a puromicina de esta modalidad. El transgen utilizado para expresión del mAb 7F12 anti-PSMA humano se refirió como Ovl5mAb7Fl2 e incluye 15 kb de las secuencias reguladoras 5' del promotor de ovoalbúmina. Adicionalmente, el péptido señal se unió directamente a VL para evitar su remoción durante el procesamiento del ARNm. Líneas celulares cES femeninas recién derivadas (preparadas como se describe en la Publicación PCT WO 2004/015123) se utilizaron de manera que quimeras de alto grado pudieran producir huevos. El vector Ovl5MAb7F12 se transfectó en una línea celular cES femenina y los clones transfectadas estables se tamizaron por PCR. Un clon (OVH) se analizó adicionalmente por transferencia Southern blot. Se mostró que sólo una copia transgen Ovl5MAb7F12 se integró en el genoma de cES y que el transgen contenía por lo menos 10 kb de la secuencias promotoras Ov 5 ' . Las gallinas quiméricas se elaboraron a partir del clon OVH para análisis del transgen. Diez gallinas quiméricas se utilizaron para inducción temprana con estrógenos. Áreas derivadas de cES donante (GFP positiva) de diversos tejidos incluyendo la porción del magno del oviducto, músculo, cerebro, hígado e intestino se recolectaron. RT-PCR con cebadores específicos para cadenas L y H se utilizó para monitorear la expresión del transgen.. Los transcritos de cadena L y H se detectaron en el magno pero no en muestras de músculo, cerebro e hígado a partir de 3 de 4 gallinas inducidas (OV15-34, OV15-76 y OV15-83) . Sin embargo, expresión de bajo nivel se detectó también en íleo, ciego y colon. Inmunohistoquímica de secciones a partir de magnos inducidos con estrógenos confirmaron la expresión del anticuerpo monoclonal en células glandulares tubulares positivas GFP pero no en células epiteliales positivas GFP. Tomados en conjunto, estos datos demuestran que el vector Ovl5MAb7F12 dirigió la expresión del transgen en células glandulares tubulares del oviducto. La expresión ectópica de bajo nivel detectada en el intestino sugiere que 15 Kb de las secuencias reguladoras 5' de Ov pueden no ser suficientes para conferir expresión específica de tejido de posición independiente del transgen. Sesenta y nueve quimeras se generaron a partir de las células OVH cES que llevan el Ovl5MAb7F12 para evaluar la deposición del Mab completamente humano en los huevos. Treinta gallinas quiméricas se criaron hasta la madurez sexual y comenzaron a ovopositar. Los huevos de todas las gallinas contenían MAb en su clara de huevo según se indica por análisis de ELISA. La concentración y cantidad de MAb en los huevos varió entre las gallinas quiméricas, presumiblemente debido al grado variable de quimerismo en el magno. Ocho gallinas quiméricas pusieron huevos que contenían más de 1 mg de Mab por huevo y el nivel máximo entre las 30 quimeras fue 3.4 mg de Mab por huevo. Cuatro gallinas quiméricas pusieron huevos cuyo nivel medio de MAb fue de entre 1.2 y 1.6 mg por huevo. Seis gallinas quiméricas pusieron huevos cuyo nivel medio de Mab fue de entre 0.5 y 1.0 mg por huevo. La presencia de of MAb en la clara de huevo se analizó además por transferencia western con una IgG antihumana de conejo (H+L) que reconoce las cadenas H y L. La clara de huevo de una gallina White Leghorn no quimérica tipo silvestre se utilizó como control negativo. IgGl humana purificada, J (Sigma) se utilizó como el estándar de referencia. Las cadenas L y H de longitud completa se detectaron en muestras de clara de huevo de cinco gallinas quiméricas (OV15-17, OV15-29, Ovl5-71, OV16-34 y OV16-42). H2L2 completamente ensamblado se observó también, aunque pequeñas cantidades de intermediarios de ensamble estuvieron también presentes. Para determinar la variación de la concentración de MAb depositada en la clara de huevo, huevos de 5 diferentes gallinas quiméricas (OV16-34, OV16-42, OV17-29, OV17-52 y OV17-83) se monitorearon durante un periodo de 3-4 meses. En 3 gallinas, la cantidad de Mab tuvo un pico durante las primeras semanas, y entonces cayó aproximadamente dos veces y permaneció estable durante los siguientes cinco meses. En dos gallinas, el nivel de expresión permaneció relativamente estable durante el curso del tiempo. Si no todas las glándulas tubulares secretan y depositan la proteína ovoalbúmina a medida que el huevo pasa a través de la porción del magno del oviducto, la cantidad de Mab depositada en la clara de huevo puede variar a medida que cada huevo pasa a través del magno debido a la naturaleza quimérica de las glándulas tubulares en estas gallinas. Muestras sanguíneas de 26 quiméricas y una gallina Barred Plymouth Rock (BPR) (control negativo) se analizaron por ELISA para la presencia de IgG humana. Dieciocho gallinas tuvieron niveles detectables de Mab en la sangre con la concentración más alta de 39 ng/ml observado en la gallina OV17-83. El coeficiente de correlación (r) entre el nivel de MAb en la sangre y la concentración de Mab en la clara de huevo fue de 0.67. Sin embargo, esta comparación fue complicada por el hecho de que el grado de quimerismo en diferentes tejidos puede variar significativamente. Por ejemplo, la gallina OV17-122 tuvo muy poco MAb en el huevo (0.02 mg/huevo en promedio) pero tuvo la segunda concentración más alta de Mab en la sangre (36 ng/ml) . Se especula que la presencia de MAb en la sangre puede no ser una consecuencia de fuga de la expresión en el oviducto sino que refleja la expresión ectópica (por ejemplo, el intestino donde la expresión ectópica se detectó por RT-PCR en quimeras inducidas con estrógenos) .

Ejemplo 2 : Purificación y Caracterización de Proteina del Producto de Anticuerpo El MAb 7F12 se purificó a partir de clara de huevo como sigue. La clara de huevo se mezcló primero a una baja velocidad de corte durante 30 minutos a temperatura ambiente y después la ovomucina se precipitó por un método conocido en la técnica. Un volumen de suspensión homogenizada de clara de huevo se agregó a tres volúmenes de agua de osmosis inversa y se agitó durante 30 minutos. La suspensión diluida se ajustó a pH 6.0 utilizando ácido fosfórico 0.5 M y después se centrifugó durante 20 minutos a 12,100g. Aproximadamente 3% de la proteína de clara de huevo que contenía en su mayor parte ovomucina se eliminó por este método. El sobrenadante se ajustó a pH 7.4 utilizando fosfato de sodio dibásico 0.5 M y cloruro de sodio y 150 mM en concentración con sal cristalina. La IgG humana se purificó en una columna de Proteína A-Sefarosa FF (Amersham Biosciences) a una velocidad de flujo lineal de 120 cm/h. La IgG humana absorbida se lavó con cinco volúmenes de columna del tampón de carga (PBS, pH 7.4) y después de eluyó al utilizar ácido fosfórico 3 mM. La fracción de IgG humana se ajustó a pH 7.5 utilizando fosfato de sodio 60 mM (pH 7.5) conteniendo NaCl 230 mM para alcanzar una concentración final de 40 mM de fosfato de sodio y 150 mM de NaCl. La muestra se filtró entonces a través de un filtro para jeringa de 0.2 µm (Pall). La mayor parte del material purificado fue una molécula de Mab completamente ensamblada con una pureza mayor que 90% (determinada por ELISA y A280) . El MAb7F12 producido en gallinas se comparó en diversos ensayos con el MAb7F12 producido en cultivo celular CHO convencional, como sigue: 1. Análisis SEC-HPLC del anticuerpo Aproximadamente 10 µg de muestra de IgG se analizó en un Waters 2795 HPLC utilizando una columna BioSep SEC S3000 de 4.6 x 300 mm (Phenomenex) . La cromatografía se llevó a cabo en fosfato de sodio 0.1 M, NaCl 0.15 M, y sulfato de sodio 0.1 M, pH 7.2 a 0.4 ml/min de velocidad de flujo durante 20 minutos. Las separaciones se monitorearon a A280. Marcadores de peso molecular (Bio-Rad) se utilizaron para determinar el peso molecular aproximado. El análisis SEC-HPLC mostró que ambos tenían más de 90% de monómero IgG. 2. Análisis de secuencia de proteína Nano LC ESI MS/MS Preparaciones de MAb (expresadas en huevo de gallina y expresadas en célula CHO) se redujeron y alquilaron, dializaron durante la noche y digirieron con tripsina durante 4 horas a 37 °C en bicarbonato de amonio 25 mM (PH 8) . La espectrometría de masas en tándem de ambos digeridos trípticos se realizó en un sistema Nano HPLC Dionex, Sunnyvale, CA) en interacción con la operación con un espectrómetro de masas QSTAR (MDS Sciex, Concord, Ontario, Canadá) en modo de ion positivo y utilizando disociación inducida por colisión (CID) para obtener espectros en tándem. Una alícuota de 1 µl de cada muestra se inyectó y separó utilizando una columna Pepmap C18 de 75 pm de diámetro a una velocidad de flujo de 250 nl/min. La fase móvil fue solvente A (95% de agua, 5% acetonitrilo, 0.5% de ácido fórmico) y solvente B (20% de agua, 80% acetonitrilo, 0.5% de ácido fórmico) . El instrumento se operó en modo de adquisición dependiente de información con ciclos de operación 7 s, registrando un espectro completo durante 2 s y después seleccionando el ion más intenso para registrar un espectro CID durante los 5 s. Los espectros se analizaron utilizando Mascot (Matrix Science, London, UK) . El análisis de ambas preparaciones de Mab por los métodos descritos no mostró diferencias en secuencia dependiente del sistema de expresión. 3. Análisis LC-MS Muestras de IgG (50 µg) en guanidina HCl 4 M se redujeron en DTT 25 mM al incubar las muestras a 60°C durante 90 min. Las muestras se alquilaron después en ácido iodoacético 45 mM durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad y la reacción se detuvo con DTT 22 mM. Previo a LC-MS las muestras se dializaron contra con 1 L de bicarbonato de amonio 25 mM y 50 µl de cada muestra se inyectó en una columna de 2.1 x 100 mm Poros Rl/10 2.1 x 100 mm (Applied Biosystems) utilizando un Waters 2795 HPLC equipado con un espectrómetro de masas Micromass ZQ y se analizó en modo de ion positivo. La fase móvil fue (A) 0.1% de ácido fórmico y 0.01% de ácido trifluoroacético (TFA) y (B) 100% de CH3CN con 0.1% de ácido fórmico y 0.01% de TFA. La elución (0.25 ml/min) se condujo por un gradiente lineal de 10-60% de (B) en (A) desarrollado durante 100 min. El análisis de la cadena L mostró que ambas preparaciones de MAb tenían masas idénticas. (+/- 3 Da.). 4. Análisis cIEF Muestras de IgG samples (50 µg cada una a 1.0 mg/ml) se dializaron contra agua para eliminar sales antes del análisis CE. Enfoque isoeléctrico por electroforesis capilar se realizó en un sistema P/ACE MDQ CE (Beckman) con polaridad normal, utilizando un capilar neutral eCAP de 50 µm interno (Beckman) con 30 cm de longitud efectiva. La muestra se inyectó durante 60 s por inyección a presión a 1.406 kgl/cm2 (20 psi) . La separación se llevó a cabo utilizando 15 kV durante 45 min. La temperatura del capilar fue de 20°C. El anolito fue ácido fosfórico 20 mM y el catiolito fue hidróxido de sodio 40 mM. La solución de enjuague fue ácido fosfórico 10 mM y la solución movilizadora catódica fue utilizada como se proporcionó (Beckman) . Las separaciones se monitorearon a A2so- El análisis cIEF indicó que ambas tenían puntos isoeléctricos (pi) similares, aunque MAb7F12 derivado de CHO tuvo una heterogeneidad de carga incrementada. 5. Estabilidad térmica por calorimetría de barrido diferencial Las estabilidades térmicas 7F12 producidas en los sistemas de expresión en la gallina y CHO se obtuvieron utilizando calorimetría de barrido diferencial (DSC) y se compararon con sus formas correspondientes que se desglicosilaron en su dominio Fc. Mediciones de calorimetría de temperaturas de fusión (Tm) se llevaron a cabo en una plataforma de microcalorímetro de barrido diferencial VP-Capilar DSC que se combina con un automuestreador (MicroCal LLC, Northampton, MA, USA) . El volumen celular de la muestra es 0.144 mL. Datos de desnaturalización en las formas glicosilada y desglicosilada de los anticuerpos se obtuvieron al calentar las muestras, a una concentración de 2.3 µM, de 30 a 95°C a una velocidad de l°C/min. Las muestras de proteína se presentaron en solución salina tamponada de fosfatos (PBS) a pH 7.4. El mismo tampón se utilizó en la celda de referencia para obtener la capacidad térmica molar por comparación. Los termogramos observados se corrigieron con la referencia y los datos normalizados se analizaron utilizando Origin v7.0. Los perfiles sin plegar de los anticuerpos derivados de CHO y gallina, fueron bastante diferentes, mientras que los perfiles sin plegar de los anticuerpos Fc desglicosilados fueron casi idénticos. Los datos de DSC indicaron que las diferencias en las estabilidades térmicas de los Mabs derivados de CHO y gallina, se deben principalmente a los patrones de glicosilación diferentes presentes en sus respectivos dominios CH2. De los diversos puntos de transición de fusión, el primero es crítico ya que determina la estabilidad global de los anticuerpos a temperatura menor. La Tm? del anticuerpo derivado de gallina se determinó de 63.8°C, mientras que la Tmi del anticuerpo expresado en CHO se determinó de 62.7°C. Dado que la Tml del anticuerpo derivado de gallina es mayor que la Tm? del anticuerpo expresado en CHO, es probable que el anticuerpo derivado de gallina sea más termo-estable a temperatura ambiente.

Ejemplo 3: Análisis de Oligosacáridos de Anticuerpo Anti-PSMA Expresado en Gallina En este ejemplo, el patrón de glicosilación del anticuerpo 7F12 expresado en huevo de gallina se analizó utilizando una diversidad de técnicas diferentes. 1. Caracterización de Oligosacáridos por CE-LIF Los oligosacáridos se liberaron de las muestras de IgG (100 µg) por incubación durante la noche de las muestras con 12.5 mU de PNGaseF (Prozyme) a 40°C. Bajo las condiciones utilizadas, los glicanos enlazados a N de la porción Fc de HuMAbFl expresados en células CHO y gallina se liberaron. Después de precipitación con etanol para eliminar la proteína Mab, el sobrenadante que contenía los glicanos se secó por centrifugación al vacío y se resuspendió en APTS 19 mM (Beckman) en 15% de ácido acético y cianoborohidruro de sodio 1 M en THF (Sigma) . La reacción de etiquetado del glucano se dejó continuar durante la noche a 40°C seguido por dilución de 25 veces de la muestra en agua. Los glicanos etiquetas con APTS se aplicaron a electroforesis capilar fluorescencia inducida por láser en un sistema P/ACE MDQ CE (Beckman) con polaridad inversa, utilizando un capilar recubierto con N-CHO de 50 µm del diámetro interno (Beckman) con longitud efectiva de 50 cm. Las muestras se inyectaron por presión (8 sec.) y la separación se llevó a cabo a 20°C utilizando Tampón de Gel de Separación de Carbohidratos (Beckman) a 25 kV durante 20 min. Las separaciones se monitorearon utilizando un sistema de detección de fluorescencia inducida por láser (Beckman) con un láser de ion argón de 3 mW y longitud de onda de excitación de 488 nm y emisión de 520 nm. El perfil de oligosacárido de 7F12 producido en la gallina se encontró bastante diferente de aquel de 7F12 producido en las células CHO. 2. Caracterización de oligosacáridos por MALDI Q-TOF MS Anticuerpos purificados (100 µg cada uno a 1.0 mg/ml) se trataron con 4 µl de PNGaseF, una endoglucosidasa que escinde de carbohidratos unidos a N (Prozyme) . La muestras se incubaron a 37 °C durante la noche seguidas por diálisis durante la noche contra bicarbonato de amonio 50 mM. La proteína se eliminó por precipitación con etanol. Los carbohidratos liberados se desalaron en la columna de microcarbono de Glygen Corp. (Columbia, MD) siguiendo esencialmente el protocolo del vendedor, pero el volumen de elusión se redujo a 5 µl. Una alícuota de 1 µl para cada muestra del glucano se mezcló 1:1 (v:v) cn solución de matriz (ácido a-ciano-4-hidroxicinámico o ácido 2,5 dihidroxibenzoico (Applied Biosystems) , en manchas sobre una placa objetivo de MALDI y dejadas secar al aire. Análisis en tándem de MALDI-Q-TOF se utilizaron para realizar el análisis de glicoconjugados intactos. Todos los espectros de masas se registraron en un espectrómetro de masas QSTAR pulsar i equipado con una fuente 2 o-MALDI (MDS Sciex, Concord, Ontario, Canadá) , que proporciona la masa (composición) de clases de carbohidratos. Después del perfilado de glicanos de ambos MAb, se investigó el posible enlace glucosílico en cada glucano. Cada espectro de masas CID se registro en un analizador 4700 Proteomics con una óptica TOF/ToF (Applied Biosystems, Forster City, CA) . Para experimentos de alta CID MSMS, la energía de colisión se estableció a 1. Dentro de la celda de colisión, los iones de oligosacáridos seleccionados se hicieron colisionar con argón a una presión de 0.000266644 Pa (2 x 10"6 Torr) . La composición de carbohidratos y posibles enlaces glicosílicos de once glicanos principales en 7F12 derivado de gallina analizados por espectrometría de masas MALDI TOF se resumen en las Figuras 13A y 13B. Se encontró que las estructuras de oligosacáridos contenían altos glicanos N tipo mañosa, tipo complejo y tipo híbrido. Ninguna de las estructuras contenía residuos fucosilo. 3. Análisis de monosacáridos por HPLC con HPAE-DAD Muestras de IgG samples (200 µg) se sujetaron a hidrólisis acida utilizando TFA 2 N (para estimar azúcares neutrales) o HCl 6 N (para estimar aminoazúcares) a 100°C durante 4 h. Las muestras se secaron por centrifugación al vacío a temperatura ambiente y se reconstituyeron en 200 µl de agua previo al análisis por HPAE-PAD (Dionex) . Los monosacáridos se separaron utilizando una columna de 4 x 250 mm CarboPac PA 10 4 con Amino Trap y Borato Trap (Dionex) de pre-columna. Los procedimientos se siguieron de acuerdo con la Nota Técnica 53 Dionex. La identidad de pico y abundancia relativa de monosacáridos se determinaron utilizando marcadores de monosacáridos (Dionex) . El análisis de monosacáridos de 7F12 producido en gallina y en CHO se resume en la Tabla 1 en lo siguiente.

Tabla 1: Análisis de Monosacáridos de MAb 7F12 producido en gallina y en CHO.

El análisis de monosacáridos reveló una diferencia en composición de carbohidratos y mostró la presencia de residuos de N-acetil glucosamina, residuos de mañosa, y muy bajo contenido de residuos de galactosa en 7F12 producidos en gallina. No se detectaron residuos de fucosa en 7F12 producidos en gallina, en contraste con la preparación del anticuerpo expresado en CHO que contenía residuos fucosilo.

El análisis de exoglucosidasa de los glicanos por CE y espectrometría de masas para identificar los residuos de azúcar terminales confirmó la ausencia de residuos de ácido siálico y fucosa terminales en MAb7F12 producidos en células glandulares tubulares de gallina. En resumen, las diferencias más notables en los perfiles de oligosacáridos enlazados a N fueron la presencia de N-glicanos tipo mañosa, la ausencia de fucosa y el muy bajo contenido de residuos de galactosa en el anticuerpo producido en la gallina.

Ejemplo 4: Análisis Funcional de Anticuerpo Anti-PSMA Expresado en Gallina En este ejemplo, las propiedades funcionales del anticuerpo anti-PSMA 7F12 expresado en huevo de gallina se examinaron, incluyendo afinidad de unión, internación, vida media sérica in vivo y actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) . 1. Afinidad de Unión para PSMA PSMA en células LNCaP (ATCC CRL-1740) se utilizó como antígeno para el ensayo para unión a anticuerpo por citometría de flujo. Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS, HEPES 10 mM, L-glutamina 2 mM, y piruvato de sodio 1 mM. La propiedad de unión a antígeno de 7F12 producido en células glandulares tubulares de gallina se comparó con aquella de 7F12 producida en células CHO. 200,000 células/pozo se incubaron por duplicado durante 30 minutos con alícuotas de 50 µl de anticuerpo a varias concentraciones. Las células se lavaron dos veces antes de la adición de anticuerpo etiquetado con PE anti-IgG humana de cabra (Jackson ImmunoResearch) a dilución 1:200, 50 µl/pozo durante 30 minutos 4°C. Las células se lavaron dos veces en PBS con 1% de BSA y se realizó ensayo por FACS. Los valores de EC5o de la unión de MAb a PSMA en células LNCaP se determinaron a partir de curvas de unión utilizando GraphPad Prism 3.0 (GraphPad Software). Ambas preparaciones de anticuerpos produjeron curvas de unión casi idénticas a PSMA expresadas en células LNCaP con valores de EC50 similares. Los datos demostraron que mientras los anticuerpos derivados de gallina y derivados de CHO glucosidan de manera diferente, reconocen y se unen al antígeno de manera equivalente. 2. Internación de Anticuerpos La unión del 7F12 mAb a PSMA conduce a la internación del anticuerpo. En una aplicación potencial, el MAb puede conjugarse con citotoxinas a fin de dirigirse a y destruir las células tumorales que expresan PSMA. La internación del anticuerpo que se une a PSMA en células LNCaP se determinó al incubar las células con MAb y Hum-Zap (Advanced Targeting Systems) . HumZap es un anticuerpo anti- IgG humana de cabra conjugado a la proteína de inactivación de ribosoma, saporina. Las células se eliminan cuando el complejo 7F12 MAb/Hum-Zap se une a PSMA en la superficie celular y se interna mientras que el anticuerpo o Hum-Zap solo no es tóxico para las células LNCaP. Las células LNCaP (10, 000/pozo) se incubaron por triplicado durante 48 horas, a 37°C, en 150 µl de medio de cultivo que contenía 300 ng de Hum-Zap, y 300 ng de 7F12 MAb, o MAb control. La proliferación y supervivencia se determinaron celular con el Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente CellTiter-Glo (Promega). Los ensayos de internación se hicieron también al incubar diluciones de anticuerpo en medio de cultivo celular con 10,000 células LNCaP adherentes/pozo, durante 2 horas a 4°C. Las soluciones de anticuerpo se eliminaron suavemente y se reemplazaron con 150 µl de medio que contenía 200 ng de HumZap. La viabilidad celular se determinó después de 48 horas de incubación a 37 °C. Los valores de EC50 para la internación de anticuerpos se determinaron gráficamente con Prism 3.0 (GraphPad Software). Las preparaciones de anticuerpos expresados en gallina y los expresados en CHO se internaron con una eficiencia similar. Cuando se probaron con un intervalo de concentraciones de anticuerpos, los valores de EC50 para la internación de 7F12 MAb derivado de gallina y derivado de CHO fueron de 0.49 nM. 3. Vida Media In Vivo La vida media in vivo del 7F12 MAb producido en gallina se analizó en paralelo con el anticuerpo producido en CHO en ratones BALB/c por inyección intravenosa de anticuerpos radioetiquetados. Diez µg de proteína MAb se iodinaron ligeramente (menos de un I por anticuerpo) con 1251 utilizando el método Iodobead method (Pierce) . Ratones BALB/c hembras de seis semanas de edad (Taconic Farms, Germantown, NY) se administraron con 0.1 mg/ml ioduro de potasio en su agua de bebida durante una semana previa al experimento. Cuatro ratos por proteína se inyectaron de manera intravenosa en la vena caudal con aproximadamente 600,000 cpm de MAb etiquetado y la radioactividad corporal completa se midió en tiempos seleccionados utilizando un contador de gamma de cuerpo completo (detector de cristal de Nal Wm. B. Jonson con un contador de impulsos Ludlum scaler) . La vida media se calculó por análisis de regresión exponencial de la radioactividad residual. El 7F12 MAb producido por células glandulares tubulares de gallina se depuró con una vida media (tm ) de 102.4± 0.9 horas, mientras el 7F12 MAb producido por células CHO se depuró más lentamente con una vida media de 207.5+18.3 horas . . Actividad ADCC Células LNCaP-C42B se probaron en un ensayo ADCC 51Cr modificado. Células mononucleares de sangre periférica humana se purificaron a partir de sangre completa heparinizada por separación estándar de Ficoll-paque . Las células se resuspendieron (a lxlO6 células/ml) en medio RPMI1640 que contenía 10% de FBS y 10 U/ml de IL-2 humana y se incubaron durante la noche a 37 °C. Al siguiente día, las células se recolectaron y lavaron una vez en medio de cultivo y se resuspendieron a 2 x 107 células/ml. Dos millones de células LNCaP-C42b objetivo se incubaron con 200 µCi de 51Cr en 1 ml de volumen total durante 1 hora a 37 °C. Las células objetivo se lavaron una vez, se resuspendieron en 1 ml de medio, y se incubaron a 37 °C durante 30 minutos adicionales. Después de la incubación final, las células objetivo se lavaron una vez y se llevaron a un volumen final de lxlO5 células/ml. Para el ensayo de ADCC final, 100 µl de células LNCaP etiquetadas se incubaron con 50 µl de células efectoras y 50 µl de anticuerpos. Se seleccionó la proporción final objetivo a efectora de 1:100. En todos los estudios, el control de isotipo de IgGl humana se corrió y se compararó con el anticuerpo 7F12 anti-PSMA derivado de CHO. Otros controles que se incluyeron fueron: a) células objetivo y efectoras pero no anticuerpo, b) células objetivo sin células efectoras y c) células objetivo y efectoras en la presencia de 3% de Tritón X-100. Después de 4 horas de incubación a 37°C, los sobrenadantes se recolectaron y contaron en un Contador gamma (Cobra II auto-gamma de Packard Instruments) con una ventana de lectura de 240-400 keV. Los conteos por minuto se graficaron como una función de la concentración de anticuerpo y los datos se analizaron por regresión no lineal, respuesta de dosis sigmoidea (pendiente variable) utilizando el software Prism software (San Diego, CA) . El porcentaje de lisis se determinó por la siguiente ecuación: % Lisis = (CPM de Muestra - CPM Sin anticuerpo) /CPM de TritonX - CPM Sin anticuerpo) X 100 Se encontró que es importante que los valores de EC50 y de % de Lisis se monitoreen en todos los estudios. Por. ejemplo, es posible cuando se comparan dos anticuerpos tener un cambio ya sea en la EC50 o % lisis o en ambos. Los resultados de dos experimentos de ADCC diferentes se muestran en la Figura 14A (células efectoras estimuladas con IL-2) y en la Figura 14B (células efectoras de sangre periférica humana fresca) . La Figura 14A muestra que el MAb derivado de CHO induce lisis celular dependiente de dosis que alcanzó una meseta a 38% de lisis con una EC50 de 0.11 µg/ml con células efectoras estimuladas con IL-2. En contraste, el MAb derivado de huevo de gallina fue más potente y más eficaz. El % de lisis máximo del MAb derivado de huevo de gallina fue de 60% con dos preparaciones diferentes del anticuerpo. La potencia intensificada sobre el MAb derivado de CHO se demostró también, ya que la EC50 de este material fue de 0.018 µg/ml. Esto es, la EC50 para el anticuerpo expresado en gallina fue aproximadamente seis veces menor que la EC5o para el anticuerpo expresado en CHO. Finalmente, como se esperaba, el anticuerpo de control de isotipo no indujo lisis celular. La ADCC con células efectoras no estimulados (PBMC frescas) mostró una diferencia mayor en los valores de EC50, pero eliminación celular global menor (Figura 14B) . CD16 (FcyRIII) es un receptor clave que media la ADCC. La especificidad de la respuesta a ADCC se mostró al bloquear la interacción de células objetivo y efectoras utilizando un anticuerpo monoclonal dirigido contra CD16. El bloque de la ADCC con anticuerpos anti-CD16 se condujo de acuerdo con el ensayo ADCC descrito en lo anterior, con las siguientes modificaciones. Las células se incubaron ya sea con 1 µl/ml (una dosis de saturación) o 0.01 µl/ml (una dosis sub-óptima) de anticuerpos anti-PSMA 7F12 (expresados en gallina o CHO) en la ausencia o presencia de 5 anticuerpos/ml de anticuerpo 3G8 anti-CD16 o anticuerpo de control de isotipo. Los resultados se muestran en la Figura 15. Un µl/ml de anticuerpo anti-PSMA en la ausencia de anticuerpo anti-CD16, indujo aproximadamente 15% y 38% de lisis con anticuerpo derivado de CHO y derivado de gallina, respectivamente. Este % lisis se redujo a ~4% en la presencia de anticuerpo anti-CD16 mientras que el anticuerpo de control de isotipo no tuvo efecto.

Ejemplo 5: Preparación y Caracterización de Anticuerpo Anti- PSMA Desfucosilado en Células Huésped Negativas a FUT8 En este ejemplo, un anticuerpo monoclonal anti-PSMA completamente humano se expresó en una línea celular que carece de una enzima fucosil transferasa de manera que la línea celular produce proteínas que carecen de fucosa en sus carbohidratos. El anticuerpo desfucosilado se probó contra un anticuerpo anti-PSMA fucosilado (expresado en una línea celular diferente que contiene la enzima fucosil transferasa) para determinar diferencias estructurales y en características entre los anticuerpos, utilizando una diversidad de técnicas de análisis clínicos, incluyendo electroforesis capilar, comparación de secuencia de aminoácido, diferencias de masas por espectroscopia de masas y variación de carga por enfoque isoeléctrico capilar. Se utilizó el anticuerpo 2A10 monoclonal completamente humano anti-PSMA. Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de la cadena pesada de 2A10 se muestran en la Figura 5A y las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de la cadena ligera de 2A10 se muestran en la Figura 5B. La secuencias variables de cadena pesada y ligera de 2A10 se subclonaron en un vector de expresión. El ADNc de región variable kappa de 2A10, incluyendo su secuencia señal y una secuencia Kozak óptima, se subclonó en marco de lectura con la región constante kappa humana. El ADNc de región variable de cadena pesada de 2A10, incluyendo su secuencia señal y una secuencia Kozak óptima, se subclonó en marco de lectura con la región constante pesada ?l humana. Las expresiones de cadena ligera y pesada se dirigieron por el promotor SR alfa. Este vector de expresión se describe en mayor detalle en la solicitud PCT No. PCT/US2004/028954, los contenidos de la cual se incorporan expresamente en la presente para referencia . El vector de expresión se transfectó en la línea Ms704 de células huésped FUT8" _ por electoporación de ADN. La línea celular Ms704 FUT8_/" se creó por la interrupción dirigida del gen FT08 en células CHO/DG44 utilizando dos vectores de reemplazo, y se describe más completamente en la Publicación de Patente Norteamericana 20040110704 por Yamane et al . y Yamane-Ohnuki et al . (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22. Las células Ms704 se adaptaron al crecimiento en cultivo de suspensión en el medio de cultivo EX-CELL™ 325 PF CHO (JRH #14335) suplementado con hipoxantina 100 µM con timidina 16 µM (Invitrogen #11067-030) y L-glutamina 6 mM (Invitrogen #25030-081) . El ADN vector utilizado para incorporación se precipitó con etanol y se resuspendió en agua. 1.5 µg de ADN se utilizó para cada una de ocho electroporaciones. Las células Ms704 se prepararon para la transfección al lavar las células en una solución tamponada de sacarosa (SBS) y resuspender las células a 1 X 107 células/ml en solución SBS. 400 µl de célula se mezclaron con el ADN de la construcción y se electroporaron utilizando ajustes a 250 voltios, 275 microfaradays de capacitancia y 25 ohms de resistencia (electromanipulador celular BTX Molecular Delivery Systems #630) . Las células se eliminaron de las celvillas de electroporación y se agregaron 20 ml de medio de cultivo. Las células se colocaron en placas en una placa de 96 pozos utilizando 200 µl de células por pozo, aproximadamente 4 X 104 células/pozo. 2 días después de la electroporación, 150 µl de medio se eliminaron de cada pozo y se reemplazaron con 150 µl de medio de selección, medio de cultivo con 400 µg/ml de G418 (Invitrogen #10131-035) . Cada tres a siete días, 150 µl de medio de selección por pozo se reemplazaron con medio de selección fresco. Células huésped CHO DG44 (FUT 8 +/+) se electroporaron con la construcción 2A10 idéntica utilizando un procedimiento similar y las CHO DG44 transfectantes expresando anticuerpo 2A10 recombinante que contiene carbohidratos fucosilados se establecieron. Los clones Ms704 y CHO DG44 de más alta producción se expandieron y el anticuerpo 2A10 recombinante se purificó a partir de sobrenadantes de cultivo celular por cromatografía de afinidad a proteína A. Análisis comparativo de muestras de oligosacáridos enlazados a N derivados de Ms704 y el anticuerpo monoclonal anti-PSMA derivado de CHO DG44 se realizó por fluorescencia inducida por láser en electroforesis capilar (cLIF) (Chen y Evangelista (1998) Electrophoresis 15:1892). Los oligosacáridos enlazados a N del anticuerpo purificado se liberaron al agregar la péptido N-glicanasa (Prozyme) e incubaron durante la noche. La proteína se precipitó con etanol, y el sobrenadante que contenía carbohidrato se transfirió a un nuevo tubo y se secó utilizando un Speedvac. Los carbohidratos se resuspendieron y derivaron con 8-aminopiren-1, 3, 6-trisulfonato (APTS) bajo condiciones suaves de aminación reductiva en las que la desialización y pérdida de residuos de fucosa se minimizaron. Los aductos de reacción se analizaron por electroforesis capilar con un detector de fluorescencia inducida por láser (Beckman Coulter) (Ma y Nashabeh (1999) Anal . Checo . 71:5185). Diferencias en eí perfil de oligosacáridos se observaron entre el anticuerpo obtenido a partir de la línea celular Ms704 en comparación la línea celular CHO DG44, consistentes con una ausencia de residuos de fucosa en los anticuerpos anti-PSMA derivados de Ms704. El análisis de monosacáridos utilizando intercambio aniónico Dionex-HPLC con detección amperométrica en impulsos confirmó que el anticuerpo expresado en Ms704 carecía de expresión de cualesquier residuos de fucosa. Los resultados se resumen en lo siguiente en la Tabla 2.

Tabla 2: Análisis de Monosacáridos de MAb 2A10 de Células FUT8-/- y FUT8 +/+ Fuera de la diferencia en oligosacáridos mostrada por electroforesis capilar y análisis de monosacáridos, las muestras de proteína de anticuerpo anti-PSMA derivadas de Ms704 y CHO DG44 fueron esencialmente idénticas. Análisis de secuencia de proteína N terminal reveló una secuencia e aminoácidos N terminal idéntica. Espectrometría de masas de la cadena ligera de los anticuerpos anti-PSM derivados de Ms704 y CHO DG44 produjeron masas de 23,552 y 23,548, respectivamente, que estuvieron dentro del error del instrumento. Los anticuerpos se probaron también utilizando un equipo de enfoque isoeléctrico capilar estándar (Beckman Coulter) y mostraron que las dos muestras de anticuerpos tenían esencialmente puntos isoeléctricos idénticos. Estos estudios indican que el componente de proteína de las muestras de anticuerpo derivados de las células Ms704 y las CHO DG44 son esencialmente idénticas con la excepción de la desfucosilación de los anticuerpos derivados de Ms704. El análisis de carbohidratos indicó que la forma desfucosilada del anticuerpo tenía más residuos de galactosa terminales que la forma fucosilada del anticuerpo.

Ejemplo 6: Valoración de la Actividad de ADCC del Anticuerpo Anti-PSMA Desfucosilado Expresado en Células huésped FUT8 Negativas La actividad citotóxica del anticuerpo 2A10 derivado de Ms7040 (desfucosilado) contra células LNCaP-C42B (comercialmente obtenidas de ViroMed Laboratories, Minnetonka, MN) se probó en un ensayo de ADCC con 51Cr modificado. Células mononucleares de sangre humana periférica se purificaron a partir de sangre completa heparinizada por ¡ separación Ficoll estándar. Las células se resuspendieron (a lxlO6 células/ ml) en medio in RPMI1640 que contenía 10% de FBS y 10 U/ml de IL-2 humana y se incubaron durante la noche a 37°C. Al día siguiente, las células se recolectaron y lavaron una vez en medio de cultivo y se resuspendieron a 2 x 107 células/ml. Dos millones de células LNCaP-C42b objetivo se incuban con 200 µCi 51Cr en 1 ml de volumen total durante 1 hora a 37°C. Las células objetivo se lavan una vez, se resuspenden en 1 ml de medio, y se incuban a 37 °C durante 30 minutos adicionales. Después de la incubación final, las células objetivo se lavan una vez y se llevan a un volumen final de lxlO5 células/ml. Para el ensayo de ADCC final, 100 µl de células LNCaP etiquetadas se incubaron con 50 µl de células efectoras y 50 µl de anticuerpo. Se seleccionó la proporción final objetivo a efectora de 1:100. En todos los estudios, se corrió control de isotipo de IgGl humana y se comparó con anticuerpo 2A10 anti-PSMA derivado de CHO DG44 (fucosilado). Otros controles que se incluyeron fueron: a) células objetivo y efectoras pero sin anticuerpo, b) células objetivo sin células efectoras y c) células objetivo y efectoras en la presencia de 3% de Tritón X-100. Después de 4 horas de incubación a 37 °C, los sobrenadantes se recolectaron y contaron en un Contador gamma (Cobra II auto-gamma de Packard Instruments) con una ventana de lectura de 240-400 keV. Los conteos por minuto se reflejaron como una función de la concentración de anticuerpo y los datos se analizaron por regresión no lineal, respuesta de dosis sigmoidea (pendiente variable) utilizando software Prism software (San Diego, CA) . El porcentaje de lisis se determinó por la siguiente ecuación : % de Lisis = (CPM de Muestra - CPM Sin anticuerpo) /CPM DE TritonX - CPM Sin anticuerpo) X 100 Los resultados de tres experimentos de ADCC separados se muestran en las Figuras 16A, 16B (células efectoras estimuladas con IL-2) y 16C (células efectoras de sangre periférica humana fresca) . Una curva de citotoxicidad celular para la línea celular LnCaP utilizando concentraciones variables de fuc-2A10 y defuc-2A10 se determinó y los valores de EC50 y % de Lisis se determinaron. Los resultados de los tres experimentos correspondientes a las Figuras 16A, 16B y 16C respectivamente, se muestran en la Tabla 3 en lo siguiente: Tabla 3: Capacidad Citotóxica del mAb 2A10 anti-PSMA Desfucosilado La potencia intensificada del mAb 2A10 derivado de Ms704 (es decir, desfucosilado) , en comparación con el mAb 2A10 derivado de CHO DG44 (es decir, fucosildado) , es evidente por los valores de EC50 menores y los valores de % de lisis mayores para la forma desfucosilada del anticuerpo.

Por ejemplo, de EC50 para la forma desfucosilada son aproximadamente 3 veces a 18 veces menores para la forma desfucosilada. La actividad ADCC con células efectoras sin estimular (PBMC frescas) , en comparación con las células efectoras estimuladas con IL-2, mostró una diferencia mayor en los valores de EC50, pero eliminación celular global menor (Figura 16C) . CD16 (Fc?RIII) es un receptor clave que media la ADCC. La especificidad de la respuesta ADCC se mostró al bloquear la interacción de células objetivo y efectoras utilizando un anticuerpo monoclonal dirigida contra CD16. El bloqueo de la ADCC con anticuerpos anti-CD16 se condujo de acuerdo con el ensayo ADCC descrito en lo anterior con las siguientes modificaciones. Las células se incubaron ya sea con un 1 µg/ml (una dosis de saturación) ó 0.01 µg/ml (una dosis subóptima) de anticuerpos anti-PSMA 2A10 (expresado en Ms704 o CHO DG44) en la ausencia o presencia de 5 µg/ml de anticuerpo 3G8 anti-CD16 o anticuerpo de control de isotipo. Los resultados se muestran en la Figura 17. Un µg/ml de anticuerpo anti-PSM, en la ausencia de anticuerpo anti-CD16, indujo aproximadamente 12% y 37% de lisis con anticuerpo fucosilado y desfucosilado, respectivamente. Este porcentaje de lisis se redujo a menos de 5% en la presencia de anticuerpo anti-CD16 mientras que el anticuerpo de control de isotipo no tuvo esencialmente efecto.

Equivalentes Aquellos con experiencia en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar utilizando nomás que la experimentación de rutina, muchos equivalentes de las modalidades específicas de la invención descritos en la presente. Tales equivalentes pretenden contemplarse por las siguientes reivindicaciones.

SUMARIO DE LISTA DE SECUENCIA SUMARIO DE LISTA DE SECUENCIA

Claims (40)

1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo aislado anti-antígeno membranal específico de próstata (PSMA) , que carece de residuos de fucosa, en donde el anticuerpo (a) tiene una EC50 de actividad ADCC contra células cancerosas de próstata LNCaP de 0.05 µg/ml o menos, o (b) tiene una EC50 de actividad ADCC contra células cancerosas de próstata LNCaP que es por lo menos 3 veces menor que la EC50 de la actividad ADCC contra células cancerosas de próstata LNCaP de una forma del anticuerpo que contiene residuos de fucosa.
2. 2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo intensifica la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos de células que expresan PSMA en superficie celular, en comparación con la forma del anticuerpo que contiene residuos de fucosa.
3. 3. El anticuerpo de la reivindicación 1, que es un anticuerpo monoclonal.
4. 4. El anticuerpo de la reivindicación 3, que es un anticuerpo humanizado o quimérico.
5. 5. El anticuerpo de la reivindicación 4, en donde el anticuerpo humanizado o quimérico se prepara de un anticuerpo anti-PSMA de ratón seleccionado del grupo que consiste de: 3F5.4G6, 3D7.1.1, 4E10-1.14, 3E11, 4D8, 3E6, 3C9, 2C7, 1G3, 3C4, 3C6, 4D4, 1G9, 5C8B9, 3G6, 4C8B9, E99, J415, J533 y J591.
6. 6. El anticuerpo de la reivindicación 3, que es un anticuerpo humano.
7. 7. El anticuerpo de la reivindicación 6, en donde el anticuerpo humano comprende una región variable de cadena pesada humana y una región variable de cadena ligera humana, en donde: (a) la región variable de cadena pesada humana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 1-9; y (b) la región variable de cadena ligera humana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 10-18.
8. 8. El anticuerpo de la reivindicación 7, en donde la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 1 y la región variable de cadena ligera humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 10.
9. 9. El anticuerpo de la reivindicación 7, en donde la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 2 y la región variable de cadena ligera humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 11.
10. 10. El anticuerpo de la reivindicación 7, en donde la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 3 y la región variable de cadena ligera humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 12.
11. 11. El anticuerpo de la reivindicación 7, en donde la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 4 y la región variable de cadena ligera humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 13.
12. 12. El anticuerpo de la reivindicación 7, en donde la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 5 y la región variable de cadena ligera humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 14.
13. 13. El anticuerpo de la reivindicación 7, en donde la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 6 y la región variable de cadena ligera humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 15.
14. 14. El anticuerpo de la reivindicación 7, en donde la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 7 y la región variable de cadena ligera humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 16.
15. 15. El anticuerpo de la reivindicación 7, en donde la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 8 y la región variable de cadena ligera humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 17.
16. 16. El anticuerpo de la reivindicación 7, en donde la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 9 y la región variable de cadena ligera humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. NO: 18.
17. 17. El anticuerpo de la reivindicación 3, que comprende : (a) una región variable de cadena pesada humana CDRl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 19-27; (b) una región variable de cadena pesada humana CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 28-36; (c) una región variable de cadena pesada humana CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 37-45; (d) una región variable de cadena ligera humana CDRl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 46-54; (e) una región variable de cadena ligera humana CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 55-63; y (f) una región variable de cadena ligera humana CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. NOS: 64-72.
18. 18. El anticuerpo de la reivindicación 17, que comprende: (a) una región variable de cadena pesada humana CDRl que comprende SEC. DE I DENT. NO: 19; (b) una región variable de cadena pesada humana CDR2 que comprende SEC. DE I DENT. NO: 28; (c) una región variable de cadena pesada humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 37; (d) una región variable de cadena ligera humana CDRl que comprende SEC. DE I DENT. NO: 46; (e) una región variable de cadena ligera humana CDR2 que comprende SEC. DE I DENT. NO: 55; y (f) una región variable de cadena ligera humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 64.
19. 19. El anticuerpo de la reivindicación 17, que comprende : (a) una región variable de cadena pesada humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 20; (b) una región variable de cadena pesada humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 29; (c) una región variable de cadena pesada humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 38; (d) una región variable de cadena ligera humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 47; (e) una región variable de cadena ligera humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 56; y (f) una región variable de cadena ligera humana CDR3 que comprende SEC. DE I DENT. NO: 65.
20. 20. El anticuerpo de la reivindicación 17, que comprende : (a) una región variable de cadena pesada humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 21; (b) una región variable de cadena pesada humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 30; (c) una región variable de cadena pesada humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 39; (d) una región variable de cadena ligera humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 48; (e) una región variable de cadena ligera humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 57; y (f) una región variable de cadena ligera humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 66.
21. 21. El anticuerpo de la reivindicación 17, que comprende: (a) una región variable de cadena pesada humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 22; (b) una región variable de cadena pesada humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 31; (c) una región variable de cadena pesada humana CDR3 que comprende SEC. DE I DENT. NO: 40; (d) una región variable de cadena ligera humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 49; (e) una región variable de cadena ligera humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 58; y (f) una región variable de cadena ligera humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 67.
22. 22. El anticuerpo de la reivindicación 17, que comprende: (a) una región variable de cadena pesada humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 23; (b) una región variable de cadena pesada humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 32; (c) una región variable de cadena pesada humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 41; (d) una región variable de cadena ligera humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 50; (e) una región variable de cadena ligera humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 59; y (f) una región variable de cadena ligera humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 68
23. 23. El anticuerpo de la reivindicación 17, que comprende : (a) una región variable de cadena pesada humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 24; (b) una región variable de cadena pesada humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 33; (c) una región variable de cadena pesada humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 42; (d) una región variable de cadena ligera humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 51; (e) una región variable de cadena ligera humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 60; y (f) una región variable de cadena ligera humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 69.
24. 24. El anticuerpo de la reivindicación 17, que comprende : (a) una región variable de cadena pesada humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 25; (b) una región variable de cadena pesada humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 34; (c) una región variable de cadena pesada humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 43; (d) una región variable de cadena ligera humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 52; (e) una región variable de cadena ligera humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 61; y (f) una región variable de cadena ligera humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 70.
25. 25. El anticuerpo de la reivindicación 17, que comprende : (a) una región variable de cadena pesada humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 26; (b) una región variable de cadena pesada humana
26. CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 35; (c) una región variable de cadena pesada humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 44; (d) una región variable de cadena ligera humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 53; (e) una región variable de cadena ligera humana CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 62; y (f) una región variable de cadena ligera humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 71. 26. El anticuerpo de la reivindicación 17, que comprende : (a) una región variable de cadena pesada humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 27; (b) una región variable de cadena pesada humana CDR2 que comprende SEC. DE I DENT. NO: 36; (c) una región variable de cadena pesada humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 45; (d) una región variable de cadena ligera humana CDRl que comprende SEC. DE IDENT. NO: 54; (e) una región variable de cadena ligera humana
27. CDR2 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 63; y (f) una región variable de cadena ligera humana CDR3 que comprende SEC. DE IDENT. NO: 72. 27. El anticuerpo de la reivindicación 6, que comprende una región variable de cadena pesada que es un producto de o se deriva a partir de un gen VH 5-51 o VH 3-30.3 humano .
28. 28. El anticuerpo de la reivindicación 6, que comprende una región variable de cadena ligera que es un producto de o se deriva a partir de un gen Vk L6, 04/014 o L18 humano.
29. 29. El anticuerpo de la reivindicación 6, que comprende una región variable de cadena pesada que es un producto de o se deriva a partir de un gen VH 5-51 o VH 3-30.3 humano y una región variable de cadena ligera que es un producto de o se deriva a partir de un gen Vk L6, 04/014 o L18 humano.
30. 30. Una célula huésped que comprende genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina que codifican el anticuerpo anti-PSMA de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la célula huésped carece de actividad fucosiltransferasa efectiva y por lo cual el anticuerpo anti-PSMA expresado por la célula huésped carece de residuos de fucosa.
31. 31. La célula huésped de la reivindicación 30, en donde los genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina son genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana .
32. 32. La célula huésped de la reivindicación 30, en donde la fucosiltransferasa es FUT8.
33. 33. La célula huésped de la reivindicación 30, que es una célula CHO.
34. 34. Un método para inhibir el crecimiento de células PSMA+ que comprende contactar las células con el anticuerpo anti-PSMA desfucosilado de cualquiera de las reivindicaciones precedentes bajo condiciones suficientes para inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) de las células.
35. 35. El método de la reivindicación 34, en donde las células son células tumorales.
36. 36. El método de la reivindicación 34, en donde el anticuerpo anti-PSMA es un anticuerpo humano.
37. 37. Un método para inhibir el crecimiento de células tumorales en un sujeto, en donde las células tumorales o células endoteliales vasculares próximas a las células tumorales expresan PSMA, que comprende administrar al sujeto el anticuerpo anti-PSMA desfucosilado de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en una cantidad efectiva para inhibir el crecimiento de células tumorales en el sujeto.
38. 38. El método de la reivindicación 37, en donde el anticuerpo anti-PSMA es un anticuerpo humano.
39. 39. El método de la reivindicación 37, en donde las células tumorales son células tumorales de cáncer prostático.
40. 40. El método de la reivindicación 37, en donde las células tumorales son de un cáncer seleccionado del grupo que consiste de colon, renal, rectal, urotelial, de mama, vejiga, hígado, páncreas o melanoma.