CN100436480C - 血小板糖蛋白IB-α变体融合多肽及其用法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及血小板糖蛋白IB-α的变体，这些变体至少具有对α-凝血酶具有低亲合力，低聚合性或对水解有高抵抗力的活性。
Description
背景技术
与血管相关的疾病的负面作用，比如：中风、心脏病、动脉硬化，被认为至少部分是由血管炎症及其修复反应所引起的。血管炎症及修复反应包括血液循环中的多种类型细胞之间的交互粘附作用。此方面的例子可能出现在血小板、白细胞和血管内表面(也就是血管内皮)之间。在流体剪向冲击力较大的条件下，血小板会通过其表面的Ib-IX-V糖蛋白复合体和位于血管内皮外膜的血管性血友病因子之间的交互作用而粘附在血管的内皮上。此外，附着在血管内皮上的血小板还会在v-WF(血管性血友病因子)作用的范围内粘附血管血液中的其他血小板，从而使血小板层叠形成的血栓增厚。由GPIb-IX-V形成的GPIα链也使得α-凝血酶更容易附着到血小板的表面，从而加强了GPV和活性蛋白酶受体(PARs)的凝血酶促进分裂。
与此相对的是，白血球也可以直接粘附于活性血管内皮，或间接得通过由vWF固定的血小板附着.在这两种情况下，白血球细胞表面的粘附在选择蛋白或整联蛋白组粘合受体的分子都会促进这样的粘附过程.一般认为，白血球-血小板之间的粘合，至少部分是由于，白血球表面的整联蛋白分子MacI和血小板表面的GPIb-IX-V联合体成分的交互作用而出现的。
在血管疾病出现时，比如：动脉硬化斑破裂，或者由血管成形术、动脉狭窄、心肺替代管手术、局部缺血损伤或狭窄引起的机械损伤，发生时，白血球或血小板会在损伤部位堆积并且由于彼此可作为另一层的底层使这种堆积成倍增长。白血球和血小板的这种堆积会产生多种因子，包括：促细胞分裂原、细胞因子和趋化因子，这些因子促使血管疾病向着不理想的方向进一步发展。
包括来自于GPIα的v-WF粘合区域的用于治疗的多肽已经被公开。其中之一的多肽基于这样一个序列，该序列是包含两个氨基酸取代物(G233V，M239V)的野生型人类的GPIα氨基酸序列。一个Ig融合蛋白包含290个细胞外氨基酸，受v-WF粘合作用主导的这种变异体能够抑制冠状动脉血栓。
发明简述
本发明提供了一种糖蛋白IB-α高级变体多肽，可用于作为血管疾病的治疗药物。在不同的实施方案中，这种变体至少表现出一种下述一种性质：低聚合性、强稳定性以及对凝血酶的弱束缚作用。这种变体的作用之一是作为融合蛋白用以治疗与血管炎症、血栓、动脉硬化以及血管成形术后的再狭窄相关的血管症状。
一方面，相对于，具有人类自然的GPIα氨基酸序列(序列代码1)的多肽，或者相对上述序列包含了两个氨基酸取代物G233V和M239V的名为GPIb2V的多肽，这两者与α凝血酶的粘附而言；本发明的多肽与α凝血酶的粘附具有较低的免疫亲合力。当多肽与α凝血酶的粘附具有较低的免疫亲合力时，更多的凝血酶可用于血栓形成过程，在某一过程中可减少不希望的流血。显示出可以减少凝血酶粘附作用的多肽的例子，是那些包括一个、两个或者三个氨基酸取代物Y276F、Y278F、Y279V的代码为1和2序列，或者其保守变体。
在一些实施方案中，相对于包含代码为1和2的氨基酸序列的多肽的聚合性来说，本发明的多肽的聚合性低。在某些例子中，细胞中本多肽合成过程中也发现具有低聚合性。一个这方面的例子是，包含了C65S氨基酸取代物的多肽或其保守变体，相对于代码为1和2的氨基酸序列来说，具有低聚合性。
在一些实施方案中，本发明的多肽相对于包含代码为1和2的氨基酸序列的多肽，对蛋白质水解具有较强的耐性。一个这方面的例子是包含了K237V的氨基酸取代物的多肽或其保守变体，相对于代码为1和2的氨基酸序列，对蛋白质水解具有较强的耐性。
本发明的多肽的合适例子是那些，相对于代码为1和2的氨基酸序列，包含下述氨基酸序列取代物：Y276F，Y276FK237V，Y276FC65S，Y276FY278FY279F，Y276FY278FY279FK237V和Y276FY278FY279FC65S。
本发明的多肽可以作为融合蛋白。例如，糖蛋白Ibα融合蛋白可以包括一条包含至少糖蛋白IB-α多肽变体一部分的多肽，与第二条肽链连接。在一些例子中，这个第二条肽链形成多聚体，比如二聚体。在另一些例子中，这个第二条肽链至少包括免疫球蛋白多肽链的一部分。
本发明同样提供了糖蛋白-Ibα变体多肽的核酸编码，及载体、细胞和用糖蛋白-Ibα变体多肽编码核酸表达这种糖蛋白-Ibα变体多肽的方法。本发明同样进一步提供了，糖蛋白-Ibα变体融合多肽的的核酸编码，以及这种编码的核酸的载体，以及一种含有这种载体或核酸的细胞。
本发明也提供了一种通过连接与糖蛋白Ibα融合多肽的而抑制白血球粘合到生物组织的方法。大量的白血球被连接足以抑制白血球和生物组织的粘附。
在另一方面，本发明提供了一种治疗与血小板活化有关的血管疾病的途径。这个途径包括在某一过程中使用有效剂量的糖蛋白Ibα融合多肽。
本发明还包括了，用于治疗的，包括糖蛋白Ibα变体多肽或糖蛋白Ibα变体融合多肽的化合物。
除非另有说明，本文中所有的科学和技术术语的含义均为本发明所属领域的通用含义。尽管多种方法，和近似或等同于本文中的原料，可以用于实践或检验本发明，下面将会描述合适的实施方式。本申请中对所有出版物、专利申请文件、专利，和其他参考文献，都作为整体来参考。除非有冲突，其所用的描述包括定义，有约束力。此外，本申请中所提到的材料、方法和实施例仅是用来说明，而不用来限制。
本发明的其他特点和优点，将在以下的详细说明和权利要求中，显现出来。
附图说明
图1表示 GPIbα嵌合体对瑞斯托菌素引起的人体血小板凝集作用的抑制作用。Y轴代表野生型GPIbα(“正常”)和GPIbα-IgWT、GPIbα-290/2V-Ig，GPIbα-290/2V/FFF-Ig的嵌合体的光透过率。
图2表示GPIbα嵌合体，在冠状动脉血栓的犬牙Folts’模型下的，抗血栓形成的效能。(Y轴：LCX blood)。
图3表示在由PFA-100评估的冠状动脉血栓犬牙模型下，GPIbα-290/2V-Ig和GPIbα-290/2V/FFF-Ig对血小板功能的抑制作用。
本发明详细描述
根据本发明，糖蛋白Ibα衍生的多肽具有对α凝血酶的低粘附性、低聚合性，和/或对蛋白质水解的高抵抗力，可以作为治疗制剂用于多种情况，可以抑制由活性血小板细胞与血管细胞上的血管性血友病因子的粘附。在一些情况中，本多肽可以用作融合多肽。
本发明的蛋白质变体具有低凝血酶粘合性，可减少流血。凝血酶和血小板GPIbα受体的粘附是血液凝结所必须的。凝血酶与治疗性的可溶解GPIb的粘附，由于将凝血酶与血小板GPIbα受体隔离开来减少了凝血酶诱导的血小板凝集，增加了有机体内的出血。本发明的蛋白质变体显示出了对凝血酶的低亲合力，这就使得更多的凝血酶可参与与血小板GPIbα受体间的交互作用，从而加强了血液凝结。
合适的这样的多肽包括这样的氨基酸序列，相对于下述的，包含65-279个氨基酸的，代码1的原生GPIbα蛋白序列和代码2的氨基酸序列所代表的GPIb2V变体来说，在其间具有1到15个氨基酸被取代、缺失或插入。在一个或多个例子中，这种多肽表现出下面的一种或多种活性：(i)相对于包含代码为1和2的人体的氨基酸序列的多肽来说，对α凝血酶具有较低的粘附性；(ii)相对于包含代码为1和2的人体的氨基酸序列的多肽来说，具有低聚合性；或(iii)相对于包含代码为1和2的人体的氨基酸序列的多肽来说，具有较强的抗蛋白质水解的性能。
由于不希望囿于理论，这些性质被认为是基于，包含GPIb2V变体序列(序列代码2)的多肽在目标区域被取代的结果。在65位点(也就是，C65S)的半胱氨酸被取代为丝氨酸残基，抑制了GPIbα分子的聚合作用，尤其是在重组体产生的过程中。在276、278和279位点发现的酪氨酸残基往往被翻译并修饰为硫化酪氨酸，这样产生了与α凝血酶之间的阳离子静电交互作用。通过将他们转化为苯丙氨酸，有选择的排除这些酪氨酸残基(即，Y276F、Y278F和Y279F取代物)降低了与α凝血酶的粘合性(Marchese et al.，J.Biol Chem.270：9571-78)，并且仍能够保持与vWF的期望的粘附性。在这个位点上的赖氨酸被缬氨酸取代能够阻止重组体产生过程中的水解。
原生人体的糖蛋白Ibα链的290氨基酸序列片断如下：
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GPIb2V变体的氨基酸序列如下面代码2所述。这种变体在公开号为20030091576美国专利和它的同族专利WO 02/063003中也提及。
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在一些实施方案中，相对于序列代码1和2的氨基酸序列来说，本发明的多肽具有不超过12个的取代、缺失或插入。比如，可能只有10，8，7，6，5或者更少的取代、缺失或插入。在某些例子中，这些取代、缺失或插入发生于氨基酸65和279之间。
在一些实施方案中，本发明的多肽相对于包含代码为1和2的人体的氨基酸序列的多肽来说，对α凝血酶具有较低的亲和性。这样的多肽，相对于代码为1和2的氨基酸序列，包含了一个两个或者三个氨基酸取代物Y276F、Y278F，Y279F，或者是此多肽的保守变体。
在一些实施方案中，本发明的多肽相对于包含代码为1和2的人体的氨基酸序列的多肽来说，具有低聚合性。在一些实施方案中，在细胞内合成此多肽的过程中发现了低聚合性。显示出低聚合性的此种多肽，相对于代码为1和2的氨基酸序列，包含了氨基酸取代物C65S，或是此多肽的保守变体。
在一些实施方案中，本发明的多肽相对于包含代码为1和2的人体的氨基酸序列的多肽来说，对水解有较强的抵抗力。这样的多肽的例子，是相对于代码为1和2的氨基酸序列，包含氨基酸取代物K237V，或此多肽的保守变体。
在一些实施方案中，相对于代码为1和2氨基酸序列的1-290号氨基酸，本发明的多肽的氨基酸序列包含了1到10个氨基酸取代、缺失或插入，其中是少一个氨基酸取代物是C65S，K237V，Y276F，Y278F，Y279F，K237V。
适合的多肽的例子是那些，相对于代码为1和2氨基酸序列，包含了下述氨基酸序列取代物的多肽：Y276F，Y276FK237V，Y276FC65S，Y276FY278FY279F，Y276FY278FY279FK237V和Y276FY278FY279FC65S。
本发明也包括了那些，相对于代码为1和2氨基酸序列，来自糖蛋白IBα序列的肽链上含有一或多个，比如：2，3，5，6，8，10，15个或更多，氨基酸取代物的多肽。这些包括了，比如：GPIb302(序列代码3)，GPIb302/2A(序列代码4)，GPIb/4X(序列代码5)，GPIb290/1A(序列代码6)。
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QATEYEYLDYDFLPETEPPICEVSKVASHLEVNCDKRNLTALPPDLPKDTTILHLSENLLYTFSLATLMPYTRLTQLNLDRCELTKLQVDGTLPVLGTLDLSHNQLQSLPLLGQTLPALTVLDVSFNRLTSLPLGALRGLGELQELYLKGNELKTLPPGLLTPTPKLEKLSLANNNLTELPAGLLNGLENLDTLLLQENSLYTIPKGFFGSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQVVDVKAVTSNVASVQCDNSDKFPVYKYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVR(SEQ ID NO：7)
糖蛋白蛋白质变体可以作为融合蛋白的一部分。比如，糖蛋白IBα免疫球蛋白融合蛋白可用于抑制血小板和白血球对生物组织，例如对血管内皮，的粘附作用。本发明中的融合蛋白，或这些融合蛋白的核酸编码，可被用于用在治疗的化合物中，并且用于抑制糖蛋白IBα配体(比如，血管性血友病因子，Mac-1，P-选择蛋白或凝血酶)和位于细胞表面的糖蛋白IBα蛋白，比如血小板，之间的粘附作用。对粘附作用的抑制可以减少糖蛋白IBα蛋白促进的血小板凝集和辅助有机体内的信号转导。
糖蛋白IBα免疫球蛋白融合蛋白可被用于调节糖蛋白IBα蛋白质的同源配体的生物利用率。抑制糖蛋白IBα蛋白质配体和糖蛋白IBα蛋白质之间的交互作用可用于治疗，尤其是血管损伤和其他与血小板活性相关的血管疾病。
糖蛋白变体IBα融合蛋白多肽
在很多方面，本发明提供的融合蛋白包括，一条包含至少糖蛋白IBα多肽变体的一部分的多肽，有效地与另一条多肽连接。也就是说，糖蛋白IBα“融合蛋白”或“嵌合蛋白”，包括，至少一部分糖蛋白IBα多肽变体与另一条非糖蛋白IBα多肽的有效连接。“糖蛋白IBα多肽”或“糖蛋白IBα多肽变体”指具有至少一部分糖蛋白IBα多肽对应的氨基酸序列的多肽，与此相对，“非糖蛋白IBα多肽”具有与糖蛋白IBα蛋白实质上非同源的蛋白质对应的氨基酸序列的多肽，例如：不同于糖蛋白IBα多肽或其片断的蛋白，和来自于同样或其他有机体的蛋白质。
在一个实施方案中，糖蛋白IBα融合蛋白，包含至少糖蛋白IBα蛋白的一个生物活性的部分。在其他情况下，糖蛋白IBα融合蛋白，包含至少糖蛋白IBα蛋白的两个生物活性部分。在另外的情况下，糖蛋白IBα融合蛋白，包含至少糖蛋白IBα蛋白的三个生物活性部分。在融合蛋白中，术语“有效连接”的含义是指，第一条和第二条多肽的连接是基于保留了与糖蛋白IBα多肽相关的至少一种功能的这样一种连接方式。当用于指糖蛋白IBα融合多肽的核酸编码时，这一术语指，糖蛋白IBα多肽的核酸编码序列与非糖蛋白IBα多肽，是在骨架内的融合。非糖蛋白IBα多肽可以融合连接在糖蛋白IBα多肽的C-末端或N-末端。
在另一个实施方案中，糖蛋白IBα融合蛋白可以被连接到一个或更多的附加部分上。例如，糖蛋白IBα融合蛋白可被附加地连接到GST-融合蛋白上，此时糖蛋白IBα融合蛋白序列被融合连接到GST(即，谷胱甘肽S-转移酶)序列的C-末端。这样的融合蛋白可以加速糖蛋白IBα融合蛋白的纯化。
在另一个实施方案中，本融合蛋白包括了在N-末端的异源信号序列(即，不能被糖蛋白IBα核酸编码代表的多肽序列)。例如，本糖蛋白IBα的信号序列可以被移除并代以另一种蛋白质的信号序列。在特定的宿主细胞中(例如哺乳动物的细胞)，糖蛋白IBα的表达和分泌作用可以通过异源信号序列得到提高。典型的信号序列是MPLLLLLLLLPSPLHP(序列代码8)。另一种有代表性的信号序列是MPLQLLLLLILLGPGNSLQLWDTWADEAED ALGPLLARDRR.(序列代码9)。如果希望的话，一个或多个氨基酸可以被附加的插入，包含半GP Ibα的第一个半多肽和第二个半多肽之间。
本发明的嵌合或者融合蛋白可由标准重组DNA技术制得。制取多种GP Ibα多肽的多种变异体的GP Ibα多肽的核酸编码序列，和这些多肽的核酸序列，已经在WO02/063003中公开，本部分从整体上引用了上述专利中的内容。
比如，代表这些多肽编码的DNA片断通过常规的技术在骨架内连接，例如，以平滑或交错末端连接，限制酶切以取得合适的末端，将黏性末端以合适的方式连接，以碱性磷酸酶处理防止不希望的连接，以及酶连接。在其他的例子中，融合基因可由常规技术包括DNA自动合成器来合成。此外，基因片断的PCR扩增可通过使用锚定引物使两个连续的基因片断的突出端补足的办法实现，这两个基因片断可以在后续的退火和再扩增以形成嵌合基因序列(参见，例如，Ausubel et al.(eds)CURRENT PROTOCOL IN MOLECULAR BIOLOGY，John wiley&Sons，1992).此外，许多编码融合部分的表达片断可以在市场上获得(例如，免疫球蛋白重链的Fc区域)。糖蛋白Ibα编码的核算序列可以被克隆成这样的表达载体，这样的话融合部分就可与免疫球蛋白在骨架内连接。
糖蛋白Ibα融合多肽可以作为低聚体存在，比如二聚体或三聚体。在一些情况下，此糖蛋白Ibα融合多肽是二聚体。
在一些实施方案中，半GP Ibα多肽可以作为变体GP Ibα多肽，在自然出现的GP Ibα序列(野生型)上有一个变异，可导致GP Iβα多肽对白血球细胞表面分子的高亲和力。例如，这种变异多肽可以高亲和力与血管性血友病因子粘附。这增加了反应性，或过响反应，可以用低浓度瑞斯托霉素评估。相应地，其他合适的可测定此多肽与vWF反应性都也可被用于确定那些对vWF“高”反应性的多肽，例如比自然出现的野生型GP Ibα的反应性高。与vWF高亲和性粘合的GP Ibα变体的例子，是那些在GP Ibα多肽的铰链区包含序列改造的GP Ibα变体。铰链区是指包括220到310的残基，并且被报道是GP Ibα多肽内与vWF的主要粘合区域。在这个区域的变异包括了那些在233残基上的变异，在野生型GP Ibα中，此位置的编码为甘氨酸。合适的取代物的例子之一是233位置上的甘氨酸被缬氨酸取代(即，G233V)。这个铰链区的另一个变异位置在239，在野生型GP Ibα中此位置的编码为蛋氨酸。缬氨酸取代物是蛋氨酸239的一个有代表性的取代物，但其他氨基酸也可作为取代物。此外，在233和239位置的残基都变异的GP Ibα多肽铰链区变体，适合用于本发明中的融合多肽(参见，例如，Dong et al.JBC275：3627663-27670(2000))。因此，本发明包括在239位置上取代的融合蛋白，例如变体GP Ibα多肽的M239V取代物。本发明也包括：在233位置上取代的融合蛋白，例如G233V；和在233和239位置上都取代的变体GP Ibα多肽的融合蛋白，例如G233V和M239V取代物。
在一些实施方案中，第一条多肽包含了全长的GP Ibα多肽。或者，第一条多肽少于包含少于全长的GP Ibα多肽。例如，第一条多肽的氨基酸数目少于600，比如，少于或等于500，250，150，100，50，25。
在一些实施方案中，第二条多肽是可溶的。在一些情况下，第二条多肽加速了这条联接多肽的半衰期(比如，血清半衰期)。在一些情况下，第二条多肽包括了，一个可以加快此融合多肽与另一条GP Ibα多肽连接的，序列。在一些实施方案中，第二条多肽包括了至少免疫球蛋白多肽的一个区域。免疫球蛋白融合多肽是现有技术可知的，并在号为5516964，5225538，5428130，5514582，5714147和5455165的美国专利中有所描述。
在一些实施方案中，第二条多肽包括了免疫球蛋白多肽的全长。或者，第二条多肽包括了少于免疫球蛋白多肽的全长，比如，重链，轻链，Fab，Fab2，Fv，或Fc。例如，在一些实施方案中，第二条多肽包括了免疫球蛋白多肽的重链。在一些实施方案中，第二条多肽包括了免疫球蛋白的Fc区。
本发明的另一方面，第二条多肽效应功能低于野生型免疫球蛋白重链的Fc区。Fc效应功能包括了，比如，Fc受体粘附性，补体结合，和T细胞消耗活性(参见，例如，美国专利6136310)。测定，T细胞消耗活性，Fc效应功能，和抗体稳定性，的方法也在现有技术中有记载。在一种情况下，第二条多肽对Fc受体具有低的亲合性或没有。在另一种情况下，第二条多肽对补体蛋白C1q具有低亲和力或者没有。
典型的第二多肽序列包括了，氨基酸序列代码10。该序列包括了一个Fc区。下划线标明的氨基酸是那些与野生型免疫球蛋白序列相应位置不同的氨基酸。
HTCPPCPAPEALGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO：10)
本发明的GP Ibα多肽变体除可含指定的氨基酸取代物外，还可以含与指定氨基酸相同功能的其他替代氨基酸。在一些实施方案中，替代的氨基酸与指定的氨基酸的联系在于，作为指示氨基酸的保守取代物。“保守氨基酸取代物”的含义是，取代的氨基酸与被取代的氨基酸有相似的侧链。具有相似侧链的同族氨基酸残基已经在现有技术中定义。这些族包括了那些具有，基本侧链(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸，谷氨酸，)，不带电的极性侧链(例如，甘氨酸，天冬酰胺酸，谷酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，)，非极性侧链(例如，丙胺酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸)，β-分支的侧链(例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)，芳香族的侧链(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。
这样，在一些实施方案中，在276，278，279(Y276F，Y278F，Y279F)位置上的苏氨酸，除被苯丙氨酸代替外，苏氨酸残基也可被色氨酸或组氨酸替代。C65S变体的情况也很相似，半胱氨酸可以选择性地被甘氨酸、谷酰胺、苏氨酸或酪氨酸所替代。对于L237V取代物，赖氨酸可以选择地被丙胺酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸所替代。
本发明也包括了，那些与代码1和2的序列分别80％，85％，90％，95％，98％或99％同源的多肽，只要这些多肽包括了一个或多个氨基酸取代物C65S，K237V，Y276FY278F，Y279F，K237V。本发明的核酸或蛋白质的衍生物或类似物，不仅限于，那些包含实质上与本发明的核酸或蛋白质同源的区域的分子，在不同的情况下，至少70％，80％，85％，90％，95％，98％或甚至99％(比如，80％-99％相同)，与某一核酸或等长的氨基酸序列相同，或与现有计算机同源程序技术排列出的某一排列顺序相同，或等同于那些，能够与编码前述的蛋白质的序列的等位互补序列在严密或中等严密或低严密的情况下杂交的编码核酸。一个典型的程序是，Gap程序(Wisconsin序列分析包，第八版用于UNIX，Genetics Computer Group，University Research Park，Madison，WI)使用默认设置，该程序使用了Smith和Waterman算法。
本发明的另一部分适用于，包含了糖蛋白IBα融合多肽的编码核酸载体(包括表达载体)，或者其衍生物、片断、类似物、或其同源物。本发明的重组表达载体可被设计，使得糖蛋白IBα融合多肽可以在原核和真核细胞中表达。
在一些实施方案中，糖蛋白IBα融合多肽表达载体是酵母表达载体。在酵母Saccharomyces cerevisiae中的用以表达的载体可从现有技术中得知。
此外，糖蛋白IBα融合多肽可以在昆虫细胞中表达，通过现有技术中的方法，比如用杆状病毒表达载体。
在一些实施方案中，本发明的核酸可以用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中得到表达。
在一些实施方案中，重组哺乳动物表达载体可以指导核酸在某特定类型的细胞中表达。(组织特异性调控因素用来表达该核酸)。组织特异性调控因素记载与现有技术中。
本发明进一步提供了一种重组表达载体，包含了以反轴向方式克隆进该表达载体的本发明的DNA分子。也就是说，该DNA分子被有效的连接于一个调节序列，其连接方式允许与糖蛋白Ibα融合多肽的mRNA反向的RNA分子表达(通过对DNA分子转录)。选择调节序列有效地连接于反向克隆的核酸这种方式，可以指导反向RNA分子在不同类型细胞中的连续表达，比如病毒启动子和/或增强子，或者，调节序列可被选择用于指导反向RNA的组成性、组织特异性或细胞类型特异性表达。反向表达载体可以是以下形式：重组体质粒、质粒或弱化的病毒，其中反向核酸是在高效调节区域的控制下产生的，因此，其活性可由该载体所被引入的细胞类型决定。
宿主细胞可以是真核或原核细胞。例如，糖蛋白Ibα融合多肽可在以下细胞中得以表达：细菌细胞比如E.coli，昆虫细胞，酵母或哺乳动物细胞(比如人类细胞，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)。其他的合适的宿主细胞为本领域技术人员熟知。
载体DNA可被引入真核或原核细胞通过常规的转化或转染技术。
哺乳动物宿主细胞，比如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)，通过转录后的修饰，可被表达载体转染从而使，糖蛋白Ibα融合多肽的N-或O-连接的多糖上产生唾液Lewis抗原。对于CHO细胞来说，这一过程需要α-1，3/1，4 fucosyltranseferase(KuKowska-Latallo et al.Genes Dev.4：1288-303，1990)和Core2 β-1，6-N-acetylglucosaminytransferase酶(Kumar et al.Blood 88：3872-79，1996)的共同表达。产生在糖蛋白Ibα融合多肽的N-或O-连接的多糖上的唾液Lewis抗原，可以加强对选择蛋白的粘合性。
对于哺乳动物细胞稳定的转染来说，众所周知，基于表达载体和转染技术的使用，只有一小部分细胞可以在他们自己的基因组中被引入一个其他的DNA。为确定和选择这些部分，通常，一段编码选定标靶(例如，对抗生素有耐性的)的基因同目标一起被引入宿主细胞。不同的可选择的标靶包括，那些具有耐药性的，比如G418，潮霉素和氨甲叶酸。编码了一个可选择标靶的核酸，可与编码了糖蛋白Ibα融合多肽的核酸引入宿主细胞的同一载体上，或可被引入单独的载体上。被这些引入的核酸帮助下的稳定转染的细胞可被药物选择性确定(例如，那些引入了标靶基因的细胞可以存活下来，而其他的则会死亡)。
本发明的宿主细胞，比如真核或原核宿主细胞，可被用来产生(也就是，表达)糖蛋白Ibα融合多肽。据此，本发明进一步提供了，利用本发明中的宿主细胞产生糖蛋白Ibα融合多肽的方法。在一个具体的例子中，此方法包括在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(一个编码了糖蛋白Ibα融合多肽的重组表达载体被引入)，这样糖蛋白Ibα融合多肽就被生产出来。在另一个例子中，此方法进一步包括了将糖蛋白Ibα融合多肽从培养基或宿主细胞中分离出来。
此糖蛋白Ibα融合多肽用常规的手段被分离和纯化，例如，提取，沉淀，层析，亲和色谱法，电泳，和其他类似的方法。
多肽的化学合成使得经修饰的或天然的氨基酸，包括D-氨基酸，和其他的有机小分子的结合变得容易。在某肽链中的一个或多个L-氨基酸取代为D-氨基酸异构物，可被用来提高肽链对酶水解的抵抗力，和加强该肽链的一个或多个生物活性，也就是，受体亲合性，潜在功能，反应期。
在肽链序列中引入共价交叉结合能够加强多肽主链结构的稳定。这棵被用来此融合多肽的类似物，具有更好的潜能、选择性和稳定性。因为环链肽比直链肽的构象熵低，一个环链的结构要比非环的类似物，在熵值上有一个小小的降低，从而使得亲和自由能更得当。大环的形成来自于该肽中的N-和C-端形成氨基化合物，发生在一个侧链和N-或C-端之间〖例如，在K3fe(CN)6和ph值8.5的条件下〗，或两个氨基酸侧链之间。二硫桥也被引入线型序列中以降低它们的弹性。更进一步，将半胱氨酸残基取代为青霉胺(Pen，3-巯基(D)-缬氨酸)一直被用于提高某些阿片样受体交互作用的选择性。
包括糖蛋白Ibα融合多肽及其编码核酸的药物组合物
本发明的糖蛋白Ibα融合蛋白，或者编码了这些蛋白的核酸分子，(这里指那些“治疗的”或“活性化合物”)，及其衍生物，片断，类似物和同源物，可以被引入那些利于控制的治疗制剂。这样的组合物通常包含，本发明中的核酸分子、蛋白质、或抗体，和药物中可接受的载体。此处的“药物中可接受的载体”包含，任何和所有的可以与之配伍用药的溶剂、释放剂、涂层、抗菌或抗真菌制剂、缓释或延迟吸收的制剂、和类似化合物。合适的载体可以在最新版的Remington’s Pharmaceutically Sciencc中找到，该书是本领域的一本标准参考手册，本申请引用作为参考。这样的载体或稀释剂的例子包括，但不限于，水，盐，锌指溶液，葡萄糖溶液，和5％人体血清蛋白。脂质体和非水的介质，例如不挥发性油，也可被使用。对有药物活性的物质使用这类介质和制剂，在本领域公知。除了在常规介质和制剂范围内不能与活性化合物配伍以外，其他的使用方式都是在预期之内的。辅助的活性化合物也可引入到本组合物中。
本申请中的活性制剂也可简述为脂质体。脂质体的可由本申请中的方法制备。具备增强循环时间的脂质体在美国专利5013556中披露。
特别有用的脂质体可以，通过逆相蒸发法用包含卵磷脂、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的液体组合物，来制备。为得到预期直径的脂质体，可以通过从指定大小的孔中将脂质体挤出。
本发明的药物组合物，可以简单的适应预期的给药方式。给药方式的例子包括：注射例如：静脉，皮层给药，皮下给药，口服，经皮给药(即局部)，经黏膜给药，和直肠给药。用于注射、皮层、皮下给药的溶剂或悬浮剂可包括以下组分：消过毒的稀释液，例如注射用水、盐溶液、非挥发性油、聚乙烯乙二醇、甘油、丙稀乙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，例如苄基乙醇、甲基苯；抗氧化剂，例如维C酸、亚硫酸氢钠；螯合剂，例如EDTA，；缓冲剂，例如醋酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐；和调节张性的制剂如氯化钠、葡萄糖。PH值可由酸或碱来调节，比如盐酸和氢氧化钠。准备好的注射物，可封入由塑料或玻璃制成的，一次性的针剂、可任意使用的注射器或不同剂量的小瓶中。
适于注射的药物组合物包括，消过毒的含水溶剂(可溶于水)或分散剂，和为即用的消毒溶剂或分散剂所准备的消过毒的药粉。为静脉注射给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL(BASF，Parsippany，N.J)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在任何情况下，该组合物都必须被消毒并且被稀释到使得注射很容易进行的流动程度。它在制造和储藏过程中都应该是稳定的，并且应该在不被诸如细菌和真菌之类的微生物污染的条件下保存。载体可以是溶剂或分散介质，包括，例如，水、乙醇、多羟基化合物(如，甘油，丙稀甘油，和液态聚乙烯甘油，及其他类似物)，和其他适合的上述物质的组合物。通过使用如卵磷脂之类的涂层，通过保持分散剂颗粒为预期大小，和通过使用表面活性剂，可以保持合适的流动度。防止微生物作用，可通过多种抗菌或抗真菌的制剂实现，例如parabens？，氯丁醇，苯酚，维C酸，噻汞撒，和类似物。在许多情况下，等分剂都可被加入此混和物中，比如，糖，聚乙醇如甘露醇、山梨(糖)醇；和氯化钠。延长注射的组合物的吸收时间，可以通过在组合物中加入延迟吸收的制剂实现，例如单硬脂酸铝和凝胶。
可通过将需要量的活性化合物加入上述列举的成分之一或组合成的合适的溶剂，根据需要，随后过滤消毒，制得消过毒的注射用溶剂。通常，通过将活性化合物加入包含基本分散介质和前述中所需要的成分的消毒了的赋形剂中，制备分散剂。当从消过毒的注射试剂制备消了毒的药粉，制备方法是用真空干燥和冷冻干燥，得到药粉，由活性成分加上任何附加需要的成分，该成分来自前述消毒-过滤过的溶剂。
口服的组合物通常包括惰性稀释液或者可服用的载体。它们通常可被做成凝胶胶囊或压制成片剂。为了口腔治疗给药的目的，可以给该活性化合物加上赋形剂并做成片剂、药片或胶囊。口服组合物也可用流体载体制备作为类似漱口药使用，在流体载体中的化合物被作用于口腔，漱口并被咳出或咽下。在治疗上可以配伍的制剂，和/或辅料可作为本组合物的一部分。此种药片、胶丸、胶囊、药片和类似物可以包含任何下述成分，或相似性质的化合物：束缚剂例如微晶纤维素、黄蓍胶或凝胶；赋形剂例如淀粉、乳糖；分裂剂例如褐藻酸、Primogel、或玉米淀粉；滑润剂例如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂例如二氧化硅胶体；甜味剂例如蔗糖或糖精；或调味剂例如薄荷油、甲基水杨酸盐、桔味调味剂。
对于吸入式给药来说，本化合物以气雾的方式给药，从带有合适气体例如二氧化碳或雾化器的压力容器或分配器中送出。
身体组织给药可以通过经粘膜或者经皮的方式。此过程中需使用，针对被透过的障碍物的合适渗透剂。这样的渗透剂在本领域中熟知，包括，例如，对于局部给药，清洁剂，胆汁盐和梭链孢酸衍生物。经黏膜给药可以通过鼻腔喷雾或栓剂的方式。对于经皮给药，本活性化合物被设计成药膏、涂油膏、凝胶剂或霜剂等其他本领域常用的方式。
本化合物也可被制成栓剂(如，用常用的栓剂基质比如可可粉和其他甘油酯)或给直肠给药的缓释灌肠剂。
在一些实施方案中，本活性化合物可加入可避免其被人体迅速消除的载体，比如包括埋植剂和胶囊缓释系统的控制释放步骤。生物所能分解的、不会引起排斥的聚合体比如乙烯-醋酸乙烯共聚物、聚酸酐、聚乳酸、胶原蛋白、聚原酸酯、聚乙二醇酸可被使用。此种缓释步骤的制备方法是本领域的技术人员熟知的。原料可从Alza公司和Nova药品公司获得。脂质体悬浮剂(包括对滤过性毒菌抗原有单克隆抗体的感染细胞为标靶的脂质体)可被使用作为制药上可接受的载体。这些可用本领域技术人员熟知的方法制备。
在一些实施方案中，为便于给药和使每次剂量固定，口服或者注射组合物可做成固定剂量的单元形态。固定剂量的单元形态在这里指在物质上离散的单元匹配于药物用于需要被治疗的疾病；每一个单元包含预先分配好的，经计算确定的一定剂量的能发挥治疗效用的活性化合物，和配药需要的载体。实施本发明上述的固定剂量单元形态要受制和依赖于，该活性化合物的独特性质，和想要取得的特定治疗效果，以及合成用于人体的此种活性化合物时本领域的固有限制。
本发明的核酸分子可被插入载体中并作为基因治疗载体。基因治疗载体可被应用于如静脉注射、局部给药或定位穿刺等方面。此种基因治疗载体的药用制剂，可以包括置于一种可接受的稀释液种的基因治疗载体，也可以包括包含了该基因治疗载体的缓释基质。此外，完全基因传送载体可从重组细胞完整制得，例如，逆转录酶病毒载体，该治疗制剂可包括一个或多个产生基因传送系统的细胞。
如果需要的话，持续释放的药物也可被制备。关于持续释放制剂的合适的例子包括，包含了抗体的固体疏水聚合物半透性基质，该基质以成形颗粒存在，例如薄膜或微胶囊。持续释放的基质的例子包括，聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-异丁烯酸酯)，或聚(乙烯酯))，聚交酯，L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯共聚物，不可降解的乙烯-醋酸乙烯共聚物，可降解的聚乳酸-乙醇酸共聚物比如LUPRON DEPOT(商标)(可注射用的由聚乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的微球体)，和聚-D-(-)-3-羟丁酸。尽管有些聚合物比如乙烯-醋酸乙烯和聚乳酸-乙醇酸使得分子的释放超过100天，某些水凝胶释放蛋白质的周期比较短。
这种药物组合物可与给药指南一起被装入容器、小包或分配器中。
在生物系统中抑制粘着的方法
本发明还包括了在生物系统中抑制血液细胞对生物组织的粘附的方法。此方法包括了，在生物系统中加入足够抑制血液细胞对生物组织粘附的份量的本发明的融合多肽。
该血液细胞可以是，例如，白血球，血小板或红血球。其中，白血球可以是任何可以粘着在生物组织上的白血球。在很多方面，该白血球是，粒性白细胞(即，嗜中性粒细胞，嗜碱细胞或嗜曙红细胞)，单核细胞(即，巨噬细胞)，或淋巴细胞(例如，T-淋巴细胞，B-淋巴细胞，肿瘤浸润淋巴细胞或自然杀手细胞)。在某些情况下，该白血球表达β2整合素，例如，Mac-1。在其他情况下白血球表达选择配体。
本发明还包括，在生物系统中抑制蛋白质对生物组织的粘附的方法。此方法包括了，在生物系统中加入足够抑制蛋白质对生物组织的粘附份量的本发明的融合多肽。
此蛋白质可以是相关膜蛋白(例如，共价，非共价，或离子的)。此外，此蛋白质还可以是溶解的形态(即在溶液中)。此蛋白质是，血管性血友病因子，凝血酶，来自糖蛋白Ibα的P-选择蛋白。
这里提到的生物系统包括任何包含生物组分的系统，例如，细胞，蛋白质，糖类，脂类或核酸。此生物系统可以在活的有机体内，在活的有机体外，或在试管系统中。
“粘附”包括白血球的任何生物交互作用，例如，滚动，牢固结合，比交互作用。
对血液细胞或蛋白质对生物组织的粘附的抑制可以通过本领域的常规方法测定。例如，在此引用记载于Simon et al.，J.Exp.Med.192：193-204，2000的，定量分析测定糖蛋白Ibα对生物组织的附着。在多种情况下，GP Ibα融合多肽对生物组织的附着对血液细胞对生物组织的粘附的抑制达到至少30％，50％，75％，90％，95％，99％，或99.9％。
粘附同样可在高于或低于生理环境中流动的条件下测定，包括，静态条件和连续的静态或剪向力条件下。粘附可由例如发射光谱，荧光法，通过流式细胞分析术或用平行板流动室测定。
本发明也包括了，治疗被治疗者的与疾病相关的血小板活性，通过给该过程以具有生理活性的药用化合物(下文中的“治疗剂”)。此外，此被治疗者也需给出下列一种或多种药物：斯达汀，乙酰水杨酸(阿司匹林)，肝素类(包括普通肝素，低分子量肝素)，糖蛋白IIb/IIIa拮抗剂，保栓通Plavix；P-选择蛋白拮抗剂；凝血酶抑制剂；和溶血栓酶。
此被治疗者可以是任何哺乳动物，如，人，灵长类的动物，老鼠，啮齿目动物，狗，猫，牛，马，猪。
治疗试剂包括，例如，(i)糖蛋白Ibα多肽及其衍生物，片断，类似物和同源物，的任一或多个；(ii)指向(i)中所述的糖蛋白Ibα多肽的抗体；(iii)核酸序列编码上述(i)中的糖蛋白Ibα多肽及其衍生物，片断，类似物和同源物。
病因与血小板活性相关的任何疾病都被认为应被组织或治疗。这些疾病可以是，例如，血管炎症；动脉硬化；(心瓣手术后的)再狭窄(例如，与血管成形术相关的再狭窄)；和/或与血栓相关的情况，例如，绞痛(包括稳定性心绞痛和非稳定性心绞痛)，急性心肌梗塞，中风，动脉或静脉血栓。
具体实施例
本发明将在下列例子中进一步阐明，但并不受这些例子的限制。
例1 GPIb-Ig酪氨酸硫酸盐在凝血酶粘附中的起了重要作用，
但在vWF粘合中作用较小
GPIbα的酸性羧基末端区在对vWF和凝血酶的粘附中的作用，通过三种类型的GPIbα-lgG1Fc融合蛋白的在位置276，278，和/或279上的酪氨酸检测，这三种类型的GPIbα-lgG1Fc融合蛋白分别是：具有野生型人类GPIbα序列的融合蛋白；具有M239V(1V)取代物的融合蛋白；具有双G233VM239V(2V)取代物的融合蛋白。这些蛋白质是在中国仓鼠卵巢细胞中产生的，然后由A蛋白亲和色普和阴离子交换色普分离出。这些融合多肽的二聚体形式在被硫酸酸化0到6的条件下被分离出来。
这些不同的构型对vWF Al域(Al)和完整的vWF，以及α-凝血酶的粘附通过表面等离子体谐振(BiaCore)测定。
相对于WT多肽来说，1V和2V多肽和Al域的粘附明显具有高亲合力。相对于野生型GPIbα序列对vWF的亲合力，1V和2V多肽对vWF的亲合力也明显较强。从完全硫酸盐化到未酸化成盐的构型，2V变体的Kd范围为4到12nm，1V变体的Kd范围为119到284nm。在Kd＞1mM的条件下，野生型GPIbα对vWF的粘附未被测到。在WT中硫酸酸化程度不同的条件下，1V和2V对Al域或完整的vWF的粘附并未显出明显的变化。最后，GPIbα-Ig-vWF的交互作用显示出缓慢开始/缓慢结束的厌水交互作用的动力学模型(分别是，Ka和Kd～10-510M-1s-1和10-3～10s-1)。
对于GPIbα-Ig239V和GPIb-Ig2V分子来说，完全硫酸酸化的构型对凝血酶的亲合力是未酸化的构型的80倍(分别是，Kd0.5μM和40μM)。对于血管性血友病因子的粘附来说，完全硫酸酸化的构型的活性仅是两种变体的未酸化构型的3-4倍。酸化构型对血管性血友病因子和凝血酶的粘附之间的关系也被检测。
鼠尾出血法：使用成年雄性白化鼠(Taconic)，重250-300克。这些鼠在抵达之前就被供应商配以颈静脉血管导管。这些鼠是在室温条件下单独笼养的，在标准东动物设备中光照时间12小时每天(早六点到晚六点)，并且给其啮齿动物食品和可随意饮水。在使用前三天就使其适应新环境。
GPIbα-Ig样本给药和鼠尾静脉出血程序：在试验当天，带有三向旋塞阀的伸缩管(PE50管，20厘米长)和装满0.9生理盐水的
1毫升的注射器，连接到已存在的颈静脉血管导管上。GPIbα-Ig试验样本用0.9生理盐水稀释，并以0.2毫升/100克体重的预定剂量通过三向管的一个管口注入。该导管用0.2毫升生理盐水润洗。在注射十分钟后，这些鼠从他们的笼中取出并轻放入一个禁锢器中。尾部末梢的1-2毫米用剃刀刀刃横切并迅速浸入事先装满0.9％生理盐水的300毫升的烧杯中(温度为摄氏37度)。出血时间定义为从开始出血到出血完全终止(一次出血后30秒内没有再次出血)的这一段时间。在试验结束，这些老鼠用吸入二氧化碳的方式施以安乐死。
在此鼠尾出血试验中，在注射完200μg/kg剂量的硫化0，1，2的GPIbα变体后，出血时间为4分钟。当硫化为6时，出血时间也延长到10分钟。
这些数据表明，硫酸酸化在凝血酶的粘附中起着重要的作用，但在血管性血友病因子的粘附作用中起的作用要小的多。此外，硫酸酸化程度显著地影响了α-凝血酶的粘附。GPIbα-Ig与凝血酶的粘附的化学计量大于2α-凝血酶对GPIbα-Ig。相对于GPIbα的Cys208-Cys249环的疏水性来说，α-凝血酶-GPIbα-Ig交互作用对GPIbα-Ig的硫酸酸化程度更敏感，该环能与血管性血友病因子粘附。上述的结果暗示了GPIbα包含了两个功能不同的子域，一个与血管性血友病因子粘附，另一与凝血酶粘附。
例2.GPIbα的Cys65在凝集中的作用
晶体结构显示了Cys65位于LRR区。在普通条件下荧光探针的低标志率显示了该Cys残基难以接近。Ellman’s试验和初步天然多肽图表明在Cys65上并没有修饰。然而，即使是暴露于非常少的硫醇下也可形成分子间的二硫键并引起聚合。此残基在聚合中所起的作用被检测。
在40摄氏度下加压放置80小时，所有的蛋白质中大约25％会形成聚合体。这些聚合体是可还原的，但确具有较强的SDS稳定性。超速离心法分析显示，这些聚合体包括了从二聚体到八聚体。非还原的，烷基化Achro-K-肽图显示，包含了自由Cys的肽(K4肽)在该图上消失了，该肽可以与另一K4肽和其他包含了自由Cys的肽形成长链肽。为了确定自由Cys在聚集中的作用，该GPIbα样品被置于1摩尔的盐酸胍中并加热加压，这样导致了完全共价聚合。在1摩尔的盐酸胍存在下，似乎使该蛋白质的结构变松，使深埋其中的Cys65暴露出来，从而加速了聚合。这些数据暗示了，在上述条件下，自由Cys残基会参与聚合。
例3.GPIbα融合多肽与血管性血友病因子多肽的交互作用
GPIbα融合多肽变体与血管性血友病因子多肽间的直接交互作用的证据被测定。
被测试的GPIbα融合多肽变体包括1V，2V，3V，3V/C65S，2V/FFF，和叫做“裁剪了的2V”的变体。控制反应包括290氨基酸GPIbα蛋白质，单独的血管性血友病因子或另一个不相关的多肽(47.mFc，PSGL-1融合蛋白)。
融合多肽或控制多肽与蛋白质A琼脂糖微珠混和，后者会粘附到融合蛋白的免疫球蛋白的一部分上。粘附到蛋白质A琼脂糖微珠上的蛋白质可被洗脱并通过3％-8％的双丙稀酰胺凝胶电泳。这样，该凝胶就会具有对血管性血友病因子的多克隆抗体的免疫点，该抗体可被检测。该凝胶可在还原或非还原的条件都发挥作用。此程序进行两次。
与血管性血友病因子Al片断或完整血管性血友病因子的粘附的结果如下。血管性血友病因子对GPIBα的3V和3V/C65S变体都显示出最强的粘附在还原或非还原的试验条件下。发现对2V变体也有较强粘附，同时，检测出对1V和2V/FFF有相对较低的粘附。在上述试验中，GPIbα野生型多肽显示出对血管性血友病因子的低粘附。
| 1V | 2V | 3V | 2V/FFF | 3V/C-S | |
| 血管性血友病因子Al粘附常数(K<sub>A</sub>，M<sup>-1</sup>) | 3.6E+07 | 1.9E+08 | 1.5E+09 | 9.1E+07 | 1.5E+09 |
| 血管性血友病因子粘附常数(K<sub>A</sub>，M<sup>-1</sup>) | 7.7E+07 | 5.6E+08 | 1.7E+09 | 2.4E+08 | 1.7E+09 |
例5活有机体内对反复的冠状动脉血栓的抑制
融合Ibα蛋白质-免疫球蛋白蛋白质对活有机体内冠状动脉血栓的抑制可采用Folts at al.Circulation 54：365-70，1976中描述的方法测定。相对于序列代码1的氨基酸序列，此融和蛋白包括了带有G233V，K237V和M239V取代物的GPIbα序列。
重约20-25千克的雄性杂种狗以钠戊巴比妥麻醉(用量30毫克/公斤)，然后插入导管并以人工呼吸装置通入空气。安置静脉和动脉导管。在第五肋骨处通过胸廓切开术接近心脏。将心包膜打开，在不移动心脏的情况下置入一个支架并缝合伤口边缘。使得大约2厘米左侧卷曲的冠状动脉(LCX)隔离开来。平均的和动力的LCX流通过置于动脉最近处的血管周超声波探针进行持续监控。经过一个稳定的期间后，LCX的内皮用止血钳压迫弄伤。塑胶的收缩器被置于末梢并位于受损内皮部位的上方，使得血管收缩70％-80％。当血液流动降至0时，通过震动该收缩器驱散凝集的血小板使血流恢复。这种血流降速和恢复被称为CFRs。在给药前至少出现5个连续的CFRs。
提高血流中3V的量，导致血流速度升高。这些结果证明该融合糖蛋白在动物体内抑制血栓的模型。
例6.对活有机体的不稳定绞痛或无ST段升高心肌梗塞
(NSTEMI)的治疗。
本发明的GPIbα-Ig变体可以作为融合蛋白通过静脉快速注射给要施给患有不稳定绞痛或无ST段升高心肌梗塞(NSTEMI)的患者。以此变体治疗可改善UA和NSTEMI。瑞斯西丁素诱导的血小板凝集试验(RIPA)常用来监测GPIb-Ig活性。
例7.用保栓通Plavix和GPIbα2V或GPIbα2V/FFF变体的
出血时间的比较。
对出血时间的作用，通过比较分别施以保栓通Plavix和GPIbα2V或两种不用剂量的GPIbα2V/FFF(没有凝血酶粘附位点)的老鼠的出血时间来检测。
在保栓通Plavix给药(4.3毫克/千克，po)两小时后，GPIbα变体静脉给药。试验的GPIbα变体包括GPIbα2V/290/FFF GPIbα2V/290 GPIbα2V/290 GPIbα2V/290，GPIbα2V/290/FFF(100微克/千克)，GPIbα2V/290(50微克/千克)。RBT在GPIbα变体给药15分钟后检测。每个试验都在6或7个动物上进行。
出血时间从单独施以保栓通Plavix的老鼠的8.2分钟(N＝7)，升高到施以保栓通Plavix和50微克/千克的GPIbα2V/290(N＝6)的24分钟。出血时间从施以50微克/千克的GPIbα2V/290(N＝6)的老鼠的13.9分钟升高到施以100微克/千克的GPIbα2V/290(N＝7)的19分钟。这样，相对于施以GPIbα2V/290变体的动物，在施以两次不同剂量的GPIbα2V/290/FFF的动物上发现了较短的出血时间。
例8.硫酸化和未硫酸化的可溶性GPIbα嵌合体在冠状动脉
血栓犬状模型中的抗血栓形成效用的比较。
未硫酸化的人体GPIbα嵌合体(GPIbα-290/2V/FFF/-Ig)的配体粘附能力和抗血栓效用，与硫酸酸化的人体GPIbα嵌合体(GPIbα-290/2V-Ig)比较。
使用的可溶解的GPIbα嵌合体包括GPIbα-290/2V-Ig，该嵌合体是，由具有功能获得的233和239位置上缬氨酸取代物GPIbαN-端290氨基酸，融合到人体IgG1的Fc域。GPIbα-290/2V/FFF/-Ig是由苯基丙氨酸进一步取代三个酪氨酸残基(Tyr-276，278，279)消除硫酸化而制得的。
雄性杂种狗的血液流量的循环减少(CFRs)是由压迫性损伤左侧卷曲的冠状动脉引起的。冠状动脉血流由事先安放的血管周超声波探针进行持续监控。模板出血时间是在内部上边缘用一个自动计时器测定的。由硫酸酸化或未酸化GPIbα嵌合体的出血时间的延长，由鼠尾出血模型评估。在Folts’模型处理之前和期间的任意时间点上血小板的功能用血小板功能分析仪-100(PFA-100)测定。
在活的有机体内GPIbα-290/2V-Ig和GPIbα-290-2V/FFF-Ig对血管性血友病因子和凝血酶的粘附能力用Biacore试验测定。结果如下：
| 变体 | 血管性血友病因子粘附 | 凝血酶粘附 |
| 野生型GPIb | 266nM | 0.76uM |
| GPIb-290/2V-Ig | 5nM | 0.63uM |
| GPIb-290/2V/FFF-Ig | 15.4nm | 35.8uM |
野生型或GPIb嵌合体在瑞斯西丁素引诱的人体血小板凝集中的作用如图1A-1D所示.图示了野生型GPIbα(“正常的”)GPIbα-Ig WT，GPIbα-290/2V-Ig，和GPIbα-290-2V/FFF-Ig。
不同剂量的GPIbα-290/2V-Ig(“2v”)和GPIbα-290-2V/FFF-Ig(“FFF”)在冠状动脉血栓犬牙型Folts’模型中的反应如下。当CFRs全部被消除时，会给出4分；而当CFRs不能全部被消除但冠状动脉可以可以自然地打开时，给出3分。
| 2V微克/千克 | 反应分数 | 出血时间(分钟) | FFF微克/千克 | 反应分数 | 出血时间(分钟) |
| 50 | 4(6/6) | 2.0 | 50 | 3(3/3) | 2.4 |
| 100 | 4(6/6) | 3.7 | 100 | 4(3/3) | 2.3 |
| - | - | - | 200 | 4(3/3) | 3.1 |
| 500 | 4(2/2) | 10.25 | 500 | 4(3/3) | 5.4 |
由GPIbα-290/2V-Ig，和GPIbα-290-2V/FFF-Ig引起的鼠尾出血时间的延长同样也被检测：
| 2V微克/千克 | 出血时间(分钟) | N | FFF微克/千克 | 出血时间(分钟) | N |
| 50 | 3.1±0.6 | 8 | 100 | 3.3±0.4 | 6 |
| 100 | 4.6±0.8 | 8 | 200 | 4.9±0.2 | 7 |
| 200 | 8.9±1.1 | 7 | 500 | 8.7±0.7 | 7 |
图2显示了GPIb嵌合体在冠状动脉血栓犬牙型Folts’模型中的抗血栓效用(Y轴：LCX血)
图3显示了GPIbα-290/2V-Ig和GPIbα-290-2V/FFF-Ig在冠状动脉血栓犬牙型Folts’模型中对血小板功能的抑制，由PFA-100测定。
上述的结果证明了这六种硫酸酸化的使酪氨酸转化为苯基丙氨酸，在上述研究中降低了血管性血友病因子Al域粘附的三分之二，并几乎完全消除了凝血酶粘附。与GPIbα-290/2V-Ig相比，GPIbα-290-2V/FFF-Ig在循环血流降低中可以更多降低50％，延长的出血时间和ADP闭合时间由PFA-100测定。通过对血管性血友病因子Al域的抑制，在上述剂量的条件下，GPIb嵌合体对动脉血栓的形成有阻止作用，并且这种活性独立于凝血酶粘附。
其他情况
尽管本发明由前述相关连的细节描述概括，前面的描述意图证明而并非限制本发明的范围，本发明的范围是由权利要求书来限定的。其他方面，优点和变体都在以下的权利要求中概括。
序列表
<110>韦思公司
<120>血小板糖蛋白IB-α变体融合多肽及其用法
<130>22058-583-061
<140>Not Yet Assigned
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<151>2003-06-11
<160>10
<170>Patent In Ver.2.1
<210>1
<211>290
<212>PRT
<213>智人
<400>1
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Val Arg
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<213>智人
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65 70 75 80
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<213>人工序列
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：heterologoussignal sequence
<400>8
Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Ser Pro Leu His Pro
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：heterologoussignal sequence
<400>9
Met Pro Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Gly Pro Gly Asn
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Gly Pro Leu Leu Ala Arg Asp Arg Arg
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180 185 190
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195 200 205
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
Claims (9)
1.一种分离的多肽，在序列代码2上包括一个或一个以上取代物，所述的一个或一个以上取代物是：
Y276F；
Y276F K237V；
Y276F C65S；
Y276F Y278F Y279F；
Y276F Y278F Y279F K237V；或
Y276F Y278F Y279F K237V C65S，其中所述多肽具有至少一种选自下列组中的活性：
相对于包含序列代码2的氨基酸序列的多肽，对α-凝血酶具有低亲合力；
相对于包含序列代码2的氨基酸序列的多肽，具有低聚合性；
相对于包含序列代码2的氨基酸序列的多肽，对水解有高抵抗力。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽作为一种融合蛋白被提供。
3.包括一种免疫球蛋白区的权利要求2所述的融合蛋白。
4.根据权利要求1所述的多肽，其中所述一种或一种以上取代物是Y276F。
5.根据权利要求1所述的多肽，其中所述一种或一种以上取代物是Y276F K237V。
6.根据权利要求1所述的多肽，其中所述一种或一种以上取代物是Y276F C65S。
7.根据权利要求1所述的多肽，其中所述一种或一种以上取代物是Y276F Y278F Y279F。
8.根据权利要求1所述的多肽，其中所述一种或一种以上取代物是Y276F Y278F Y279F K237V。
9.根据权利要求1所述的多肽，其中所述一种或一种以上取代物是Y279F K237V C65S。
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