MX2010011998A

MX2010011998A - Metodos y composiciones de pericitos para regular la angiogenesis y composicion de pericapilar.

Info

Publication number: MX2010011998A
Application number: MX2010011998A
Authority: MX
Inventors: John Knopf; Jasbir Seehra; Asya Grinberg; Ravindra Kumar; Robert Scott Pearsall; Kristian Pietras
Original assignee: Acceleron Pharma Inc
Priority date: 2008-05-02
Filing date: 2009-05-01
Publication date: 2011-04-11
Also published as: US8158584B2; KR20180029111A; KR20110031908A; AU2009241755A1; KR20210113446A; EP2283040A2; TW200950806A; US20210388104A1; CA2723449C; BRPI0911853A2; US20130039910A1; AU2018200237B2; JP2011520793A; US20180179293A1; CN105963695A; KR20170012595A; KR20190037355A; JP5719766B2; TWI586364B; CN102099374B

Abstract

En ciertos aspectos, la presente descripción se refiere al discernimiento de que un polipéptido que comprende una porción de unión a ligando del dominio extracelular del polipéptido de cinasa 1 tipo activina (ALK1) puede ser utilizado para inhibir angiogénesis in vivo, particularmente, en mamíferos que padecen de trastornos relacionados con angiogénesis. Además, la descripción demuestra que los inhibidores de ALK1 pueden ser utilizados para incrementar la cobertura dI pericito en tejidos vascularizados, incluyendo tumores y la retina. La descripción también identifica ligandos para ALK1 y demuestra que dichos ligandos tienen actividad pro-angiogénica, y describe anticuerpos que inhiben la interacción de receptor-ligando.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES DE PER1CITOS PARA REGULAR LA ANGIOGÉNESIS Y COMPOSICIÓN PERICAPILAR Solicitudes Relacionadas La presente solicitud reclama el beneficio de la fecha de presentación de acuerdo con el Título 35 § 119 del Código de los Estados Unidos de América sobre la Solicitud Provisional de Patente Norteamericana No. 61/050,168 presentada en Mayo 2, 2008, y la Solicitud Provisional No. 61/144,131 presentada en Enero 12, 2009, cuyos contenidos de ambas están incorporados a la presente descripción como referencia.

Antecedentes de la Invención La angiogénesis, el proceso de formación de nuevos vasos sanguíneos, es crítica en muchas condiciones fisiológicas normales y anormales. Bajo las condiciones fisiológicas normales, los humanos y animales pasan por angiogénesis en situaciones específicas y restringidas. Por ejemplo, se observa generalmente la angiogénesis en la curación de heridas, el desarrollo fetal y embrionario y la formación del cuerpo lúteo, el endometrio y la placenta.

La angiogénesis regulada de manera indeseable o inapropiada ocurre en muchas enfermedades, en las cuales el crecimiento anormal del endotelio puede ocasionar o participar en el proceso patológico. Por ejemplo, la angiogénesis participa en el crecimiento de muchos tumores. La angiogénesis des- regulada ha estado implicada en procesos patológicos tales como la artritis reumatoide, las retinopatías, hemangiomas, y psoriasis. Las condiciones de enfermedad patológica diversas en las cuales está presente la angiogénesis no regulada han sido categorizadas como enfermedades asociadas con la angiogénesis.

Ambas la angiogénesis controlada y la angiogénesis no controlada se considera que proceden de una manera similar. Los vasos sanguíneos capilares están compuestos principalmente de células del endotelio y pericitos, rodeadas por una membrana de basamento. La angiogénesis comienza con la erosión de la membrana de basamento por las enzimas liberadas por las células del endotelio y los leucocitos. Las células del endotelio, las cuales recubren el lumen de los vasos sanguíneos, entonces sobresalen a través de la membrana de basamento. Los factores angiogénicos inducen a las células del endotelio a migrar a través de la membrana de basamento erosionadas. Las células migrantes forman un "brote" que sobresale del bazo sanguíneo de origen, en donde las células del endotelio pasan por la mitosis y proliferan. Los brotes del endotelio se fusionan entre ellos para formar los circuitos capilares, creando los nuevos vasos sanguíneos.

Los agentes que inhiben la angiogénesis han probado ser efectivos en el tratamiento de una variedad de enfermedades. El Avastin™ (bevacizumab), un anticuerpo monoclonal que se enlaza al Factor de Crecimiento Vascular del Endotelio (VEGF), ha probado ser efectivo en el tratamiento de una variedad de cánceres. El Macugen™, un aptámero que se enlaza al VEGF ha probado ser efectivo en el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad neovascular (húmeda). Los antagonistas de la trayectoria de señalización SDF/CXCR4 inhibe la neovascularización del tumor y son efectivos contra el cáncer en los modelos de ratón (Guleng y asociados, Cáncer Res. 2005 Jul 1;65(13): páginas 5864 a 5871). La isocumarina de ácido 2-(8-hidroxi-6-metoxi-1 -oxo-1 H-2-benzopiran-3-il)propiónico (NM-3) ha completado la fase I de la evaluación clínica como un inhibidor oralmente biodisponible de la angiogénesis. El NM-3 extermina directamente tanto las células del endotelio como las del tumor in vitro y es efectivo en el tratamiento de diversos xenoinjertos del tumor humano en los ratones (Agata y asociados, Cáncer Chemother Pharmacol. 2005 Dic; 56(6): páginas 610 a 614). La talidomida y los compuestos relacionados han mostrado efectos benéficos en el tratamiento del cáncer, y aunque el mecanismo de acción molecular no es claro, la inhibición de la angiogénesis parece ser un componente importante del efecto anti-tumor (ver por ejemplo, la publicación de Dredge y asociados, en Microvasc Res. 2005 Ene; 69(?-2): páginas 56 a 63). El éxito de los antagonistas de TNF-alfa en el tratamiento de la artritis reumatoide es atribuido parcialmente a los efectos anti-angiogénicos en los tejidos de las articulaciones inflamadas (Feldmann y asociados, Annu Rev Immunol. 2001; 19: páginas 163 a 196). Se espera ampliamente que las terapias anti-angiogénicas tengan efectos benéficos en otras enfermedades inflamatorias, particularmente la psoriasis. Aunque muchos agentes anti-angiogénicos tienen un efecto de angiogénesis independientemente del tejido que es afectado, otros agentes angiogénicos pueden tender a tener un efecto selectivo de tejidos.

Los pericitos son uno de los componentes de los tipos de célula de la vasculatura, junto con las células del endotelio y las células del músculo liso. La proporción de pericitos a células del endotelio es mayor en el sistema nervioso central, y los pericitos se considera que juegan un rol importante en la barrera de sangre-cerebro. La retinopatía diabética es marcada por una pérdida de pericitos en la microvasculatura de la retina, y esta pérdida de pericitos se considera que tiene un efecto patofisiológico importante en el progreso de la enfermedad.

Es deseable tener composiciones y métodos adicionales para inhibir la angiogénesis y para aumentar la cobertura de pericitos en los tejidos vascularizados. Estos incluyen métodos y composiciones que pueden inhibir el crecimiento no deseado de los vasos sanguíneos, ya sea generalmente o en ciertos tejidos y/o condiciones de enfermedad.

Breve Descripción de la Invención En parte, la presente descripción presenta una caracterización de un sistema regulatorio portado por la activina similar a cinasa I (ALK1) y el rol de este sistema en la angiogénesis y la regulación de la cobertura de pericitos en tejidos vascularizados in vivo. En ciertos aspectos, la descripción proporciona antagonistas de ligandos ALK-1 y el uso de dichos antagonistas como agentes anti-angiogénicos o para aumentar la cobertura de pericitos. Adicionalmente, la descripción proporciona los antagonistas de ALK-1 mismos, y el uso de dichos antagonistas como agentes anti-angiogénicos. Como se describe en el presente documento, el ALK1 es un receptor para el grupo de ligandos GDF5, el cual incluye GDF6 y GDF7, y también para el grupo de ligandos BMP9, el cual incluye BMP10. La presente invención demuestra que la señalización portada por ALK1 y los ligandos descritos anteriormente están comprendidos en la angiogénesis in vivo, y que la inhibición de este sistema regulatorio tiene un efecto anti-angiogénico potente. Adicionalmente, la presente invención demuestra que la inhibición del sistema regulatorio ALK1 ocasiona una cobertura aumentada de pericitos en los tejidos vascularizados. Por lo tanto, en ciertos aspectos, la presente invención proporciona antagonistas del sistema regulatorio ALK1, incluyendo los antagonistas del receptor y uno o más de los ligandos, para utilizarse en la inhibición de la angiogénesis. En ciertos aspectos, la descripción proporciona antagonistas de los ligandos ALK1 para el tratamiento de cánceres, particularmente el mieloma múltiple, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer pancreático (particularmente tumores del tejido pancreático endocrino), cáncer de mama (por ejemplo, cáncer de mama primario o cáncer de mama metastático; receptor de estrógenos positivo (ER+) o receptor de estrógenos negativo (ER-)), artritis reumatoide, enfermedades asociadas con la angiogénesis patológica en los ojos y enfermedades asociadas con la pérdida de pericitos en tejidos vascularizados, tales como la retinopatía diabética.

En ciertos aspectos, la presente invención proporciona polipéptidos que comprenden una porción de enlace del ligando del dominio extracelular de los polipéptidos ALK1 ("polipéptidos ALK1 ECD") para utilizarse en la inhibición de la angiogénesis. Aunque no deseamos estar comprometidos con mecanismo de acción particular alguno, se espera que dichos polipéptidos actúen mediante el enlace a los ligandos de ALK1 e inhibiendo la capacidad de estos ligandos para ¡nteractuar con ALK1 así como otros receptores. En ciertas modalidades, un polipéptido ALK1 ECD comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos del 22 al 118 de la secuencia de ALK1 humana de la SEQ ID NO: 1. Un polipéptido ALK1 ECD puede ser utilizado como una proteína monomérica menor o en una forma dimerizada (por ejemplo, expresada como una proteína de fusión), particularmente para la administración local en los tejidos tales como el ojo. Un ALK1 ECD también puede ser fusionado a una segunda porción del polipéptido para producir propiedades mejoradas, tales como una vida media aumentada o una facilidad mayor de producción o purificación. Las fusiones a una porción Fe de una inmunoglobulina o enlace a una porción de polioxietileno (por ejemplo, polietilénglicol) pueden ser particularmente útiles para aumentar la vida media en el suero del polipéptido ALK1 ECD en la administración sistémica (por ejemplo, por medio de administración intravenosa, intra-arterial o intraperitoneal). Como se ha demostrado aquí, un polipéptido ALKI-Fc administrado sistémicamente tiene un efecto anti-angiogénico potente en los ojos y también proporciona efectos positivos en modelos múridos de artritis reumatoide y varios tumores. En ciertas modalidades, una proteína de fusión ALKI-Fc comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos del 22 al 118 de la SEQ ID NO: 1, cuyo polipéptido está fusionado, ya sea con o sin la intervención de un enlazador, a una porción Fe de una inmunoglobulina, y en donde la proteína de fusión ALK1-Fc se enlaza a los ligandos GDF5, GDF7 y BMP9 con un KD menor de 1 x 1 O"7 M y se enlaza al TGF -1 con un KD mayor de 1 x 10"6. Una porción Fe puede ser seleccionada como para que sea apropiada para el organismo.

Opcionalmente, la porción Fe es una porción Fe de una l g G 1 humana. En una modalidad preferida, la proteína de fusión ALK1-Fc comprende los aminoácidos del 22 al 118 de la SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, la proteína de fusión ALK1-Fc comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. Opcionalmente, la proteína de fusión ALK1-Fc es la proteína producida por la expresión del ácido nucleico de la SEQ ID NO: 4 en una línea de células de mamíferos, particularmente una línea de células de Ovario de Hámster Chino (CHO). Los polipéptidos ALK1-ECD pueden ser formulados en la forma de una preparación farmacéutica que es substancialmente libre de pirógenos. La preparación farmacéutica puede ser preparada para administración sistémica (por ejemplo, la administración intravenosa, intra-arterial o subcutánea) o administración local (por ejemplo, al ojo).

En ciertos aspectos, la presente invención identifica dificultades en el desarrollo de preparaciones relativamente homogéneas de las proteínas de fusión ALK1-Fc para utilizarse en un establecimiento terapéutico. Como aquí se describe, la proteína de fusión ALK1-Fc tiende a agregarse dentro de los multímeros del orden más alto. La presente invención proporciona soluciones a estas dificultades y por lo tanto proporciona preparaciones farmacéuticas que comprenden las proteínas de fusión ALK1-Fc en donde dichas preparaciones son por lo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% compuestas de proteínas de fusión ALK1-Fc diméricas. Por lo tanto, en ciertos aspectos, la presente invención proporciona preparaciones farmacéuticas que comprenden proteínas de fusión ALK1- Fe que comprenden: un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 97% idéntica a la secuencia de aminoácidos del 22 al 118 de la SEQ ID NO: 1, cuyo polipéptido está fusionado a una porción Fe de una inmunoglobulina, y en donde la proteína de fusión ALK1- Fe se enlaza a los ligandos GDF5, GDF7 y BMP9 con un KD menor de 1 x 1 O"7 M y se enlaza al TGF -1 con un KD mayor de 1 x 1 O"6 y en donde por lo menos está presente el 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de la proteína de fusión ALK1 -Fe en una forma dimérica. La porción Fe de la proteína de fusión ALK1-Fc puede ser una porción Fe de una lgG1 humana. La proteína de fusión ALKl-Fc puede comprender la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. La proteína de fusión ALK1-Fc puede ser producida mediante la expresión del ácido nucleico de la SEQ ID NO: 4 en una línea de células de mamífero, particularmente en la línea de células de Ovario de Hámster Chino (CHO). Dichas preparaciones farmacéuticas pueden ser formuladas como para ser apropiadas para la administración al ojo, particularmente por medio de inyección. Las preparaciones farmacéuticas descritas pueden ser utilizadas para una variedad de propósitos terapéuticos aquí descritos, incluyendo la inhibición de la angiogénesis, el tratamiento de tumores, el tratamiento de artritis reumatoide, el tratamiento de enfermedades oculares asociadas con la angiogénesis y el tratamiento de enfermedades asociadas con la pérdida de cobertura de pericitos en un tejido vascular, tal como la retinopatía diabética. Las preparaciones farmacéuticas de ALK1-Fc pueden ser utilizadas en conjunto con un segundo agente que inhibe la angiogénesis, tal como un antagonista de VEGF (por ejemplo, Avastina, sorafenib, y trampas del receptor VEGF).

La presente descripción demuestra que los antagonistas de la trayectoria de señalización de ALK1 aumentan la cobertura de pericitos en los tejidos vascularizados. Por lo tanto, la presente descripción proporciona métodos para promover un aumento en la cobertura de pericitos en un tejido vascularizado de un mamífero. Dichos antagonistas pueden ser cualquiera de los antagonistas aquí descritos, incluyendo las proteínas ALK1 ECD (por ejemplo, ALK1-Fc), proteínas DAN, y anticuerpos dirigidos al ALK1 y cualquiera de sus ligandos, incluyendo los ligandos BMP9, BMP10, GDF5, GDF6 y GDF7. En ciertos aspectos, la presente invención proporciona métodos para la promoción de un aumento en la cobertura de pericitos en un tejido vascularizado de un mamífero que lo necesita, comprendiendo el método la administración al mamífero de una cantidad efectiva de una proteína ALK1 ECD. La proteína ALK1 ECD puede ser una proteína de fusión ALK1-Fc, y la proteína de fusión ALKl-Fc puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos del 22 al 118 de la SEQ ID NO: 1, cuyo polipéptido es fusionado a una porción Fe de una inmunoglobulina, y en donde la proteína de fusión ALK1-Fc se enlaza al TGFp-1 con un KD mayor de 1 x 10"6. La proteína ALK1 ECD se puede enlazar a uno o más ligandos ALK1 seleccionados del grupo consistente de los ligandos: GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 y BMP10. El polipéptido ALK1 ECD puede comprender una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos del 34 al 95 de la SEQ ID NO: 1. La proteína ALK1 ECD puede comprender una secuencia de aminoácidos codificados por un ácido nucleico que híbrida bajo condiciones de hibridación severas a los nucleótidos del 100 al 285 de la SEQ ID NO: 2 o una variante de los nucleótidos del 100 al 285 de la SEQ ID NO: 2 que codifican la misma secuencia de aminoácidos. La proteína de fusión ALK1-Fc puede tener la secuencia de la SEQ ID NO: 3. La proteína de fusión ALK1 ECD puede ser administrada de manera intravenosa, o local al ojo. En ciertos aspectos, la presente invención proporciona métodos para promover un aumento en la cobertura de pericitos en un tejido vascularizado de un mamífero que lo necesita, comprendiendo el método la administración al mamífero de una cantidad efectiva de un anticuerpo que se enlaza a un polipéptido ALK1 que consiste de los aminoácidos del 22 al 118 de la SEQ ID NO: 1 e inhibe el enlace de al menos un ligando ALK1 seleccionado del grupo consistente de los ligandos: GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 y BMP10. El anticuerpo se puede enlazar al polipéptido ALK1 con un KD menor de 5 x 10"8 M, menor de 1 x 10"9 M o menor de 1 x 10"10 M. El anticuerpo puede inhibir el enlace del ALK1 a un ligando de ALK1, en donde el ligando de ALK1 es seleccionado del grupo consistente de los ligandos: BMP9 y BMP10. El anticuerpo puede ser administrado de manera intravenosa o intraocular. Los anticuerpos descritos en el documento WO 2007/040912 pueden ser útiles en dichos métodos. Los antagonistas de señalización de ALK1 pueden ser administrados con un segundo agente que inhibe la angiogénesis, tal como un antagonista de VEGF. El mamífero que va a ser tratado puede tener retinopatía diabética u otra enfermedad de la retina caracterizada por la pérdida de cobertura de pericitos en la vasculatura de la retina, o un tumor seleccionado del grupo consistente de: melanoma, tumor de pulmón, mieloma múltiple, tumor pancreático, tal como un tumor del tejido pancreático endocrino, y cáncer de mama (por ejemplo, cáncer de mama primario o cáncer de mama metastático; receptor de estrógenos positivo (ER + ) o receptor de estrógenos negativo (ER-)).

En ciertos aspectos, la presente invención proporciona métodos para inhibir la angiogénesis en un mamífero por medio de la administración de cualquiera de los polipéptidos ALK1 ECD descritos generalmente o específicamente en este documento. En una modalidad, un método comprende la administración al mamífero de una cantidad efectiva de una proteína de fusión ALK1-Fc, en donde la proteína de fusión ALK1 Fe comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos del 22 al 118 de la SEQ ID NO: 1, cuyo polipéptido es fusionado a una porción Fe de una inmunoglobulina, y en donde la proteína de fusión ALK1-Fc se enlaza al TGFp-1 con un KD mayor de 1 x 10"6. Opcionalmente, la proteína de fusión ALK1-Fc se enlaza a uno o más de los ligandos de ALK1 seleccionados del grupo consistente de los ligandos: GDF5, GDF6, GDF7, B P9 y BMP10. Opcionalmente, la proteína de fusión ALK1-Fc tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 3. El polipéptido ALK1 ECD puede ser administrado localmente (por ejemplo, al ojo) o sistémicamente (por ejemplo, por medio de inyección intravenosa, intra-arterial o subcutánea). En una modalidad particular, la presente invención proporciona un método para inhibir la angiogénesis en el ojo de un mamífero administrando una proteína ALK1-Fc al mamífero en una ubicación distante al ojo, por ejemplo, por medio de la administración sistémica.

En ciertos aspectos, la presente invención proporciona anticuerpos que se enlazan al ALK1, particularmente un epítope situado en un dominio extracelular, los aminoácidos del 22 al 118 de la SEQ ID NO: 1, e inhiben el enlace del ALK1 a por lo menos un ligando ALK1 seleccionado del grupo consistente de los ligandos: GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 y BMP10. Basados en la afinidad de estos ligandos por el ALK1, un anticuerpo se puede enlazar con un KD menor de 5 x 10"8 M, y opcionalmente entre 5 x 10"8 y 1 x 10"10. Un anticuerpo con afinidad dentro de este rango se esperaría que inhibiera la señalización de uno o más de los ligandos GDF5, 6 y 7 mientras que tiene menos efecto en la señalización del B P9 y el 10. Dicho anticuerpo preferentemente inhibe la angiogénesls estimulada por al menos un ligando de ALK1 seleccionado del grupo consistente de los ligandos: GDF5, GDF6 y GDF7. Aunque no deseamos estar comprometidos con un mecanismo particular, se espera que dichos anticuerpos actuarán mediante la inhibición directamente de la actividad de ALK1, la cual debe de ser contrastada con la actividad de una proteína de fusión ALK1-Fc, la cual se espera que inhiba la actividad de los ligandos ALK1. El anticuerpo anti-ALK1 no se espera que interfiera con la capacidad de los ligandos GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 o B P10 para emitir señales a través de los sistemas receptores alternativos, tales como los complejos BMPRIa, BMPR b y BMPRII. Sin embargo, un anticuerpo anti-ALK1 se espera que interfiera con la capacidad de los ligandos de baja afinidad para ALK1 (por ejemplo, TGF-ß, el cual se reconoce generalmente como el detonador de los eventos importantes de señalización a través del ALK- aunque el enlace es relativamente débil) para la señal a través del ALK1, aunque puede no enlazarse al ALK1 ECD o inhibir dichos ligandos de baja afinidad. Un anticuerpo que se enlaza al polipéptido ALK1 con un KD menor de 1 x 10" 10 . Un anticuerpo con una afinidad dentro de este rango se esperaría que inhibiera la señalización del BMP9 o el 10. Dicho anticuerpo preferentemente inhibe la señalización del BMP9 y el BMP10 para el ALK1. De manera notable, basados en los datos aquí descritos, un anticuerpo que se enlaza de una manera relativamente deficiente al ALK1 puede inhibir el enlace del TGF al ALK1 mientras que falla para inhibir los ligandos de enlace más fuertes tales como GDF5 o B P9. Los anticuerpos aquí descritos preferentemente son anticuerpos recombinantes, significando que un anticuerpo expresado de un ácido nucleico que ha sido construido de manera que se utilizan técnicas de biología molecular, tal como un anticuerpo humanizado o un anticuerpo completamente humano, son desarrollados de un anticuerpo de una sola cadena. Los anticuerpos Fv, Fab y de una sola cadena también están incluidos dentro del término "anticuerpo recombinante". Los anticuerpos también pueden ser policlonales o anticuerpos monoclonales no recombinantes (incluyendo las formas humana o múrida, así como anticuerpos humanos obtenidos de ratones transgénicos). Los anticuerpos y los polipéptidos ALK1-ECD pueden ser formulados como una preparación farmacéutica que está substancialmente libre de pirógenos. La preparación farmacéutica puede ser preparada para la administración sistémica (por ejemplo, administración intravenosa, intra-arterial o subcutánea) o administración local (por ejemplo, al ojo). Los anticuerpos descritos en el documento WO 2007/040912 pueden ser útiles en varios métodos aquí mencionados.

En ciertos aspectos, la presente invención proporciona métodos para inhibir la angiogénesis en un mamífero administrando al mamífero una cantidad efectiva de un anticuerpo que se enlaza a un polipéptido ALK1, aquí descrito ya sea generalmente o específicamente. Un anticuerpo útil para este propósito puede enlazarse al dominio extracelular del ALK1 (por ejemplo, enlazarse a un polipéptido que consiste de los aminoácidos del 22 al 118 de la SEQ ID NO: 1) u otra porción del ALK1. El anticuerpo se puede enlazar a un polipéptido consistente de los aminoácidos del 22 al 118 de la SEQ ID NO: 1 e inhibe el enlace de por lo menos un ligando de ALK1 seleccionado del grupo consistente de los ligandos: GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 y BMP10. El anticuerpo se puede enlazar al polipéptido ALK1 con un KD menor de 5 x 10"8 M, y opcionalmente entre 5 x 10"8 y 1 x 10"10. El anticuerpo puede inhibir la angiogénesis estimulada por al menos un ligando de ALK1 seleccionado del grupo consistente de los ligandos: GDF5, GDF6 y GDF7. Un anticuerpo que inhibe selectivamente la señalización portada por los ligandos GDF5, 6 ó 7 relativo a la señalización de los ligandos BMP9 ó 10 puede ser utilizado como un inhibidor selectivo de angiogenesis que ocurre en tejidos en donde los ligandos GDF5, 6 ó 7 están localizados: principalmente en los huesos o articulaciones. El anticuerpo se puede enlazar al polipéptido ALK1 con un KD menor de 1 x 10" 10 M. El anticuerpo puede inhibir el enlace del ALK1 a un ligando ALK1, en donde el ligando ALK1 es seleccionado del grupo consistente de los ligandos: B P9 y BMP10. El anticuerpo anti-ALK1 puede ser administrado localmente (por ejemplo, al ojo) o sistémicamente (por ejemplo, mediante inyección intravenosa, ¡ntra-arterial o subcutánea). En una modalidad particular, la presente invención proporciona un método para inhibir la angiogénesis en el ojo de un mamífero administrando un anticuerpo anti-ALK1. En otra modalidad particular, la presente invención proporciona un método para el tratamiento de pacientes con mieloma múltiple. En una modalidad particular, la presente invención proporciona un método para inhibir la angiogénesis en enfermedades que están asociadas con la angiogénesis patológica como una consecuencia de factores pro-angiogénicos múltiples, tales como VEGF, PDGF y/o FGF.

En ciertos aspectos, la presente invención proporciona anticuerpos que se enlazan a un ligando ALK1 aquí descrito e inhiben el enlace del ligando ALK1 al ALK1. Aunque no deseamos estar comprometidos con mecanismo particular alguno, se espera que los anticuerpos que se enlazan a los ligandos ALK1 tendrán efectos que son de naturaleza similar a los polipéptidos ALK1 ECD, debido a que ambos tipos de agentes se enlazan a los ligandos en vez de al receptor mismo. En ciertas modalidades, el anticuerpo se enlaza a un ligando seleccionado del grupo consistente de los ligandos GDF5, GDF6 y GDF7. El anticuerpo se puede enlazar al ligando ALK1 con un KD menor de 5 x 10"8 M. El anticuerpo puede ser seleccionado para la inhibición de la angiogénesis estimulada por el ligando ALK1. Un ensayo CAM es un sistema de ensayo apropiado para la selección de anticuerpos deseables. Dichos anticuerpos son preferentemente anticuerpos recombinantes, y pueden ser formulados como una preparación farmacéutica que está substancialmente libre de pirógenos. La preparación farmacéutica puede ser preparada para la administración sistémica (por ejemplo, la administración intravenosa, intra-arterial o subcutánea) o la administración local (por ejemplo, al ojo).

En ciertos aspectos, la presente invención proporciona anticuerpos que se enlazan a un ligando ALK1 e inhiben el enlace del ligando ALK1 al ALK1, en donde el ligando ALK1 es seleccionado del grupo consistente de los ligandos BMP9 y BMP10. El anticuerpo se puede enlazar al ligando ALK1 con un KD menor de 1 x 10~10 M. Dichos anticuerpos son preferentemente anticuerpos recombinantes, y pueden ser formulados como una preparación farmacéutica que está substancialmente libre de pirógenos. La preparación farmacéutica puede ser preparada para la administración sistémica (por ejemplo, para la administración intravenosa, intra-arterial o subcutánea) o la administración local (por ejemplo, al ojo).

En ciertos aspectos, la presente invención proporciona métodos para inhibir la angiogénesis en un mamífero, comprendiendo el método, la administración al mamífero de una cantidad efectiva de un anticuerpo que se enlaza a un ligando ALK1 e inhibe el enlace del ligando ALK1 al ALK1, en donde el ligando AL 1 es seleccionado del grupo consistente de los ligandos GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 y BMP10. El anticuerpo puede inhibir la angiogénesis estimulada por al menos un ligando de ALK1 seleccionado del grupo consistente de los ligandos: GDF5, GDF6 y GDF7.

Los miembros de la familia BMP/GDF, incluyendo los ligandos BMP9, BMP10, GDF5, GDF6 y GDF7 se enlazan a un receptor tipo I y un receptor tipo II con el objeto de formar un complejo de señalización funcional. Los sitios de enlace para estos receptores son diferentes. Por consiguiente, en ciertas modalidades, un anticuerpo que se enlaza a un ligando de ALK1 e inhibe el ligando para ALK1 es un anticuerpo que se enlaza en o cerca del sitio de enlace del receptor de tipo I del ligando.

En ciertos aspectos, la presente invención proporciona métodos para inhibir la angiogénesis en un mamífero administrando otros inhibidores del sistema de señalización ALK1 aquí descritos. Dichos inhibidores pueden incluir ácidos nucleicos (por ejemplo, antisentido o construcciones de ARNi) que disminuyen la producción de los ligandos ALK1, GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 o BMP10). Una variedad de reactivos de enlace de afinidad también pueden ser utilizados, tales como aptámeros, péptidos aleatorios, plataformas de proteínas que pueden ser modificadas para permitir el enlace al objetivo seleccionado (los ejemplos de dichas plataformas incluyen anticalinos y dominios FNIII); y en cada caso, un reactivo de enlace de afinidad sería seleccionado por su capacidad para interrumpir el sistema regulatorio de ALK1 aquí descrito, ya sea interrumpiendo la interacción del ligando ALK1 o inhibiendo la señalización que ocurre después del enlace.

En una modalidad adicional, la presente invención describe el rol de la proteína DAN como un regulador del sistema regulatorio de ALK1. Como aquí se muestra, la proteína DAN se enlaza al grupo GDF5 de ligandos pero falla en enlazarse al grupo B P9 de ligandos. Por lo tanto, se espera que la proteína DAN inhiba la angiogénesis portada por los ligandos GDF5, GDF6 o GDF7 pero no la angiogénesis portada por los ligandos BMP9 o BMP10. La proteína DAN por lo tanto puede ser utilizada como un agente selectivo para inhibir la angiogénesis en el hueso o las articulaciones, en donde el grupo de proteínas GDF5 es expresado principalmente. Por lo tanto, en ciertas modalidades, la presente invención proporciona las proteínas DAN para utilizarse como agentes anti-angiogénicos en el contexto de la angiogénesis de huesos o articulaciones, incluyendo la artritis reumatoide y los cánceres que comprenden el hueso o las articulaciones (por ejemplo, el mieloma múltiple y las metástasis del hueso). Una proteína DAN generalmente se enlazará a uno o más ügandos de ALK1 seleccionados del grupo consistente de ügandos: GDF5, GDF6 y GDF7, aunque tienen un enlace relativamente pobre para los ügandos BMP9 o BMP10. Una proteína DAN puede comprender una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos del 17 al 180 de la SEQ ID NO: 10 (proteína DAN humana madura) o los aminoácidos del 21 al 125 de la SEQ ID NO: 10 (dominio de nudo de cisteína conservado de la proteína DAN). Una proteína DAN puede también ser codificada por un ácido nucleico que comprende una secuencia de complemento la cual se híbrida bajo condiciones de hibridación severas a los nucleótidos del 153 al 467 de la SEQ ID NO: 11 o una variante de los nucleótidos del 153 al 467 de la SEQ ID NO: 11 que tiene la misma secuencia de codificación (una variante "silenciosa", tal como una variante que contiene una o más alteraciones en una posición de bamboleo en el código del triplete), o a los nucleótidos del 93 al 635 de la SEQ ID NO: 11 o una variante silenciosa del mismo. En ciertos aspectos, la proteína DAN es una proteína de fusión, tal como una proteína de fusión Fe. Aunque la proteína DAN se espera que sea particularmente útil para la inhibición de la angiogénesis en el hueso y las articulaciones (incluyendo los tumores localizados en el hueso o las articulaciones, tales como mielomas múltiples y metástasis del hueso), también puede ser útil en otros contextos, tales como en los tumores localizados en alguna otra parte, o en el ojo.

En ciertos aspectos, la presente invención proporciona métodos para el tratamiento de la artritis reumatoide en un mamífero, comprendiendo el método, la administración al mamífero que tiene la artritis reumatoide de una cantidad efectiva de un agente seleccionado del grupo consistente de: una proteína ALK1 ECD; un anticuerpo que se enlaza a un ligando ALK1 e inhibe el enlace del ligando ALK1 al ALK1, en donde el ligando ALK1 es seleccionado del grupo consistente de los ligandos GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 y BMP10; un anticuerpo que se enlaza a un polipéptido ALK1 que consiste de los aminoácidos del 22 al 118 de la SEQ ID NO: 1 e inhibe el enlace de por lo menos un ligando ALK1 seleccionado del grupo consistente de los ligandos: GDF5, GDF6, GDF7, B P9 y B P10; y un polipéptido DAN.

En ciertos aspectos, la presente invención proporciona métodos para el tratamiento de un tumor en un mamífero. Dicho método puede comprender la administración al mamífero que tiene un tumor de una cantidad efectiva de un agente seleccionado del grupo consistente de: una proteína ALK1 ECD (por ejemplo, ALK1-Fc); un anticuerpo que se enlaza a un ligando ALK1 e inhibe el enlace del ligando ALK1 al ALK1, en donde el ligando ALK1 es seleccionado del grupo consistente de los ligandos GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 y BMP10; un anticuerpo que se enlaza a un polipéptido ALK1 consistente de los aminoácidos del 22 al 118 de la SEQ ID NO: 1 e inhibe el enlace de por lo menos un ligando ALK1 seleccionado del grupo consistente de los ligandos: GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 y BMP10; y un polipéptido DAN. Un método puede comprender la administración adicional de un segundo agente que inhibe la angiogénesis. Un tumor puede ser un tumor que está asociado con el hueso, tal como una leucemia, un tumor de médula ósea, un mieloma múltiple o metástasis de los huesos, tal como aquellos comúnmente asociados con el cáncer de mama o próstata. Un tumor puede ser un melanoma, un tumor de cáncer de pulmón, un tumor pancreático (por ejemplo, un tumor del tejido pancreático endocrino), o un tumor de mama (por ejemplo, un cáncer de mama primario o un cáncer de mama metastático). El cáncer de mama puede ser receptor de estrógeno positivo (ER + ) o receptor de estrógeno negativo (ER- ). También un tumor puede ser uno que utiliza factores pro-angiogénicos múltiples, tales como un tumor que es resistente a la terapia anti-VEGF.

En ciertos aspectos, la presente invención proporciona formulaciones oftálmicas. Dichas formulaciones pueden comprender un agente seleccionado del grupo consistente de: una proteína ALK1 ECD, un anticuerpo que se enlaza a un ligando ALK1 e inhibe el enlace del ligando ALK1 al ALK1, en donde el ligando ALK1 es seleccionado del grupo consistente de los ligandos GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 y BMP10; un anticuerpo que se enlaza a un polipéptido ALK1 consistente de los aminoácidos del 22 al 118 de la SEQ ID NO: 1 e inhibe el enlace de por lo menos un ligando ALK1 seleccionado del grupo consistente de los ligandos: GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 y BMP10; y un polipéptido DAN.

En ciertos aspectos, la presente invención proporciona métodos para el tratamiento de una angiogénesis relacionada con la enfermedad del ojo. Dichos métodos pueden comprender la administración sistémica a dicho ojo de una formulación farmacéutica que comprende: una cantidad efectiva de un agente seleccionado del grupo consistente de: una proteína ALK1 ECD; un anticuerpo que se enlaza a un ligando ALK1 e inhibe el enlace del ligando ALK1 al ALK1, en donde el ligando ALK1 es seleccionado del grupo consistente de los ligandos GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 y BMP10; un anticuerpo que se enlaza a un polipéptido ALK1 consistente de los aminoácidos del 22 al 118 de la SEQ ID NO:1 e inhibe el enlace de por lo menos un ligando ALK1 seleccionado del grupo consistente de los ligandos: GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 y BMP 10; y un polipéptido DAN.

En cada caso, un agente aquí descrito puede ser administrado en conjunto con un segundo agente que inhibe la angiogénesis. En donde es deseable Inhibir la anglogénesis de un tumor, el agente puede ser administrado en conjunto con un segundo agente que tiene un efecto anti-cáncer, tal como un agente quimioterapéutico o un agente biológico anti-cáncer.

La presente invención también proporciona una formulación farmacéutica oftálmica que comprende una proteína de fusión ALK1-Fc que tiene la secuencia de aminoácidos que es por lo menos 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos del 22 al 118 de la SEQ ID NO: 1, cuyo polipéptido es fusionado a la porción Fe de una inmunoglobulina, y en donde la proteína de fusión ALK1-Fc se enlaza a los ligandos GDF5, GDF7 y BMP9 con un KD menor de 1 x 10~7 M y se enlaza al TGFp-1 con un KD mayor de 1 x 10"6. En una modalidad, la proteína de fusión tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3. En una modalidad, la porción Fe es de la lgG1 humana. En una modalidad, la proteína de fusión es producida mediante la expresión del ácido nucleico de la SEQ ID NO: 4 en una línea de células de mamífero. En una modalidad, la línea de células es la Línea de células de Ovario de Hámster Chino. La formulación puede comprender además uno o más de los siguientes medicamentos: pegaptanib, ranibizumab, o un glucocorticoide. En una modalidad, la formulación está substancialmente libre de pirógenos.

La presente descripción también proporciona una formulación farmacéutica oftálmica que comprende un anticuerpo que se enlaza a un polipéptido ALK1 consistente de los aminoácidos del 22 al 118 de la SEQ ID NO: 1 e inhibe el enlace de por lo menos un ligando ALK1 seleccionado del grupo consistente de los ligandos: GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 y BMP10. En una modalidad, el anticuerpo inhibe la angiogénesis estimulada por al menos un ligando ALK1 seleccionado del grupo consistente de los ligandos: GDF5, GDF6 y GDF7. En una modalidad, el anticuerpo se enlaza a un polipéptido ALK1 con un KD menor de 5 x 1 O"8 M. En otra modalidad, el anticuerpo se enlaza a un polipéptido ALK1 con un KD menor de 1 x 10"10 M. En una modalidad, el anticuerpo inhibe la angiogénesis estimulada por los ligandos GDF5, GDF6, GDF7, BMP9, o BMP10. La formulación puede comprender además uno o más de los siguientes medicamentos: pegaptanib, ranibizumab, o un glucocorticoide. En una modalidad, la formulación está substancialmente libre de pirógenos.

En ciertos aspectos, la presente invención proporciona una formulación farmacéutica oftálmica que comprende un anticuerpo que se enlaza a un ligando ALK1 aquí descrito e inhibe el enlace del ligando ALK1 al ALK1. En ciertas modalidades, el anticuerpo se enlaza a un ligando seleccionado del grupo consistente de los ligandos GDF5, GDF6 y GDF7. El anticuerpo puede enlazarse al ligando ALK1 con un KD menor de 5 x 10"8 M. El anticuerpo puede ser seleccionado para la inhibición de la angiogénesis estimulada por el ligando ALK1. Un ensayo CA es un sistema de ensayo apropiado para la selección de los anticuerpos deseables. Dichos anticuerpos preferentemente son anticuerpos recombinantes. La formulación puede comprender además uno o más de los siguientes medicamentos: pegaptanib, ranibizumab, o un glucocorticoide. En una modalidad, la formulación está substancialmente libre de pirógenos.

La presente solicitud también proporciona métodos de tratamiento de una enfermedad relacionada con la angiogénesis del ojo que comprende la administración a dicho ojo de una formulación farmacéutica oftálmica que comprende la proteína de fusión ALK1-Fc que comprende: un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos del 22 al 118 de la SEQ ID NO: 1, cuyo polipéptido está fusionado a una porción Fe de una inmunoglobulina, y en donde la proteína de fusión ALKI-Fc se enlaza a los ligandos GDF5, GDF7 y B P9 con un KD menor de 1 x 10"7 M y se enlaza al TGF -1 con un Kp mayor de 1 x 10" 6. En una modalidad, la proteína de fusión tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3. En una modalidad, la porción Fe es de la inmunoglobulina lgG1 humana. En una modalidad, la proteína de fusión es producida mediante la expresión del ácido nucleico de la SEQ ID NO: 4 en una línea de células de mamífero. En una modalidad, la línea de células es la línea de células de Ovario de Hámster Chino. La formulación puede comprender además uno o más de los siguientes medicamentos: pegaptanib, ranibizumab, o un glucocorticoide. En una modalidad, la formulación está substancialmente libre de pirógenos.

La presente invención también proporciona métodos de tratamiento de una enfermedad del ojo relacionada con la angiogénesis que comprende la administración a dicho ojo de una formulación farmacéutica oftálmica que comprende un anticuerpo que se enlaza a un polipéptido ALK1 que consiste de los aminoácidos del 22 al 118 de la SEQ ID NO: 1 e inhibe el enlace de por lo menos un ligando ALK1 seleccionado del grupo consistente de los ligandos: GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 y BMP10. En una modalidad, el anticuerpo inhibe la angiogénesis estimulada por al menos un ligando ALK1 seleccionado del grupo consistente de los ligandos: GDF5, GDF6 y GDF7. En una modalidad, el anticuerpo se enlaza al polipéptido ALK1 con un KD menor de 5 x 10"8 M. En otra modalidad, el anticuerpo se enlaza al polipéptido ALK1 con un KD menor de 1 x 1010 M. En una modalidad, el anticuerpo inhibe la angiogénesis estimulada por los ligandos GDF5, GDF6, GDF7, BMP9, o BMP 10. La formulación puede comprender además uno o más de los siguientes medicamentos: pegaptanib, ranibizumab, o un glucocorticoide. En una modalidad, la formulación está substancialmente libre de pirógenos.

En una modalidad de los métodos descritos, la enfermedad asociada con la angiogénesis es seleccionada del grupo consistente de un tumor, un tumor que es resistente a la terapia anti-VEGF, un tumor de mieloma múltiple, un tumor que ha formado metástasis en los huesos, articulaciones o inflamación del hueso, artritis reumatoide, retinopatía diabética, retinopatía por premadurez, degeneración macular, rechazo de injerto de la córnea, glaucoma neovascular, y fibroplasias retrolentales.

Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos para la Activina Similar a la Cinasa 1 humana, ALK1 (SEQ ID NO: 1). Un solo subrayado muestra el dominio extracelular pronosticado. El subrayado doble muestra el dominio intracelular. El péptido de señal y el dominio transmembrana no están subrayados.

La figura 2 muestra la secuencia de ácido nucleico del cADN de ALK1 humano (SEQ ID NO: 2). La secuencia de codificación está subrayada. La porción que codifica el dominio extracelular tiene subrayado doble.

La figura 3 muestra un ejemplo de una fusión del dominio extraceiular de la ALK1 humana al dominio Fe (SEQ ID NO: 3). La proteína hALK1-Fc incluye los aminoácidos del 22 al 120 de la proteína ALK1 humana, fusionada en la termlnal-C a un enlazador (subrayado) y una región Fe de la lgG1.

La figura 4 muestra la secuencia de ácido nucleico para la expresión del polipéptido hALK1-Fc de la SEQ ID NO: 3. La secuencia de aminoácidos codificada también es mostrada. La secuencia líder es disociada de modo que el Asp 22 se encuentra en el aminoácido de la terminal-N de la proteína secretada.

La figura 5 muestra el efecto anti-angiogénico de la ALK1-Fc múrida ("RAP") y la ALK1 -Fe humana ("ACE") en un ensayo de formación de tubo de células del endotelio. Todas las concentraciones de RAP y ACE redujeron el nivel de la formación del tubo en respuesta al Suplemento de Crecimiento de la Célula del Endotelio (ECGF) en un grado mayor que el control positivo, Endostatina.

La figura 6 muestra el efecto angiogénico del ligando GDF7 en un ensayo de la membrana corioalantoica de pollo (CAM). El efecto del ligando GDF7 es comparable con del VEGF.

La figura 7 muestra el efecto anti-angiogénico de la proteína de fusión ALK1-Fc humana en el ensayo CAM. La proteína hALK1-Fc inhibe la angiogénesis estimulada por los factores VEGF, FGF y GDF7.

La figura 8 muestra efectos anti-angiogénicos comparativos de ALK1-Fc múrida (mALK1-Fc), hALK1-Fc, un anticuerpo monoclonal anti-ALK1 que se consigue comercialmente (Anti-ALK1 mAb) y el anticuerpo monoclonal anti-VEGF neutralizante, que se consigue comercialmente. El efecto anti-angiogénico de las construcciones de ALK1-Fc es comparable con los efectos del anticuerpo anti-VEGF.

La figura 9 muestra los efectos anti-angiogénicos de la proteína hALK1-Fc y el anticuerpo anti-VEGF in vivo. La hALK1-Fe y el anti-VEGF tuvieron efectos comparables en la angiogénesis del ojo medidos por el ensayo de microbolsa de la córnea de ratón.

La figura 10 muestra los efectos de la proteína mALK1-Fc en el modelo de artritis reumatoide (CIA) de artritis inducida por colágeno múrido. La gráfica muestra las calificaciones promedio del grupo artrítico determinado durante un período de observación de 42 días en los ratones artríticos DBA/1 machos inducidos por colágeno. RAP-041 es la proteína mALK1-Fc. Avastin™ es el anticuerpo anti-VEGF bevacizumab.

La figura 11 muestra la resolución de hALK1-Fc (SEQ ID NO: 3) y una proteína de fusión hALK1-Fc proveniente de R&D Systems (Minneapolis, MN) mediante la columna de Exclusión de Tamaño Superóse 12 10/300 GL (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). El material de R&D Systems contiene aproximadamente 13% de proteína agregada, como lo muestran los picos del lado izquierdo de la gráfica, así como algunas especies de peso molecular inferior. El material de la SEQ ID NO: 3 tiene más de 99% de dímeros de tamaño molecular apropiado.

La figura 12 muestra la señal fluorescente de las células de cáncer de pulmón (LL/2-luc) de Lewis que expresa la luciferasa en ratones tratados con PBS (círculos) y mALK1-Fc (triángulos). Las células del tumor fueron inyectadas en la vena de la cola y el tratamiento (PBS o 10 mg/kg de mALK1-Fc IP, dos veces a la semana) fue iniciado en el día de la administración de las células. Los ratones tratados con PBS fueron sacrificados en el día 22 como que estaban moribundos. Los grupos de tratamiento y los grupos en general consistieron cada uno de siete animales (n = 7).

La figura 13 muestra los niveles de expresión de ALK1 y BMP9 en las diferentes etapas del desarrollo del tumor en el modelo de ratón RIPI-Tag2 de tumores pancreáticos endocrinos. Los picos de expresión de ALK1 durante el período de actividad angiogénica máxima, mientras que la expresión del BMP9 aumenta en todo el desarrollo del tumor.

La figura 14 muestra los efectos de un tratamiento con proteína mALK1-Fc en el crecimiento del tumor de los ratones RIPI-Tag2. Los ratones fueron tratados ya sea con la proteína mALK1-Fc o el Fe del control (en cada caso 300 microgramos por ratón, dos veces . a la semana) por un período de dos semanas comenzando en cualquiera de los ratones de 10 semanas de edad o 12 semanas de edad. El tratamiento con la proteína mALK1-Fc detuvo completamente el crecimiento del tumor.

La figura 15 muestra la densidad vascular (células CD31+) de los tumores de los ratones RIPl-Tag2 que fueron tratados con la proteína mALK1-Fc o el Fe de control. El tratamiento con la proteína mALK1-Fc redujo la densidad vascular de los tumores en aproximadamente un 50%.

La figura 16 muestra la cobertura de pericitos (proporción de células NG2+ a células CD31+) en recipientes de tumores de ratones RIPI-Tag2 que fueron tratados con la proteína mALK1-Fc o el Fe de control. El tratamiento con la proteína mALK1-Fc aumentó la cobertura de pericitos en aproximadamente un 100%.

La figura 17 muestra los efectos de la proteína mALK1-Fc en un modelo de xenoinjerto ortotópico utilizando la línea de células M DA-M B-23 , una línea de células derivada de las células ER- de cáncer de mama. En una dosis de 30 mg/kg, la proteína mALK1-Fc tiene efectos importantes de demora de crecimiento en el tumor de xenoinjerto.

La figura 18 muestra los efectos de la proteína hALK1-Fc en un modelo de xenoinjerto ortotópico utilizando la línea de células MCF7, una línea de células derivada de las células ER+ la de cáncer de mama. En una dosis de 10 ó 30 mg/kg, la proteína hALK1-Fc tiene efectos importantes de demora de crecimiento en el tumor del xenoinjerto.

Descripción Detallada de la Invención 1. Revisión El ALK1 es un receptor de superficie de células tipo para la superfamilia TGF-ß de ligandos y también es conocido como ACVRL1 y ACVRLK1. El ALK1 ha estado implicado como un receptor para las familias TGF-ß?, TGF^3 y BMP-9 (Marchuk y asociados, Hum Mol Genet. 2003; Brown y asociados,, J Biol Chem. 2005 Jul 1; 280(26): páginas 25111 a 25118).

En los ratones, las mutaciones de pérdida de función en el receptor ALK1 conduce a una variedad de anormalidades en el desarrollo de la vasculatura (Oh y asociados, Proc. Nati Acad. Sci. EUA 2000, 97, páginas 2626 a 2631; Urness y asociados, Nat. Genet. 2000, 26, páginas 328 a 331).

En los humanos, las mutaciones de pérdida de función en el receptor ALK1 están asociadas con la telangiectasia hemorrágica hereditaria (HHT, o el síndrome de Osler-Rendu-Weber), en el cual los pacientes desarrollan malformaciones arteriovenosas que crean el flujo directo (comunicación) de una arteria a una vena (desviación arteriovenosa), sin que intervenga un lecho capilar. Los síntomas típicos de los pacientes con HHT incluyen epistaxis recurrente, hemorragia gastrointestinal, telangietasias cutánea y mucocutánea, y malformaciones arteriovenosas (AVM) en la vasculatura pulmonar, cerebral, o hepática.

Las publicaciones recientes de David y asociados, en (Blood. 2007 Mar 1; 109(5): páginas 1953 a 1961) y Scharpfenecker y asociados, en (J Cell Sci. 2007 Mar 15; 120(Pt 6): páginas 964 a 972) concluyen que los ligandos BMP9 y BMP10 activan el receptor ALK1 en las células del endotelio, y que la consecuencia de esta activación es inhibir la proliferación y migración de células del endotelio. Estos efectos son directamente opuestos a los de los factores pro-angiogénicos tales como el VEGF. Por lo tanto, estas publicaciones concluyen que los ligandos BMP9 y BMP10 por ellos mismos son factores anti-angiogénicos, y además, que la activación del receptor ALK1 tiene un efecto anti-angiogénico. En contraste, la presente invención demuestra que los antagonistas, más que los agonistas de los ligandos BMP9 y BMP10 tienen efectos anti-angiogénicos.

La presente invención se refiere al descubrimiento de que los polipéptidos que comprenden una porción del dominio extracelular del receptor ALK1 ("polipéptidos ALK1 ECD") pueden ser utilizados para inhibir la angiogénesis in vivo, incluyendo la angiogénesis independiente de VEGF y la angiogénesis que es portada por factores angiogénicos múltiples, incluyendo los factores VEGF, FGF y PDGF. En parte, la presente invención proporciona la identidad de ligandos de alta afinidad fisiológica para el receptor ALK1 y demuestra que los polipéptidos ALK1 ECD inhiben la angiogénesis. Los datos demuestran que un polipéptido ALK1 ECD puede ejercer un efecto anti-angiogénico aún en el caso en donde el polipéptido ALK1 ECD no exhibe un enlace importante con la familia TGF-ß1. Además, los polipéptidos ALK1 ECD inhiben la angiogénesis que es estimulada por muchos factores pro-angiogénicos diferentes, incluyendo los factores VEGF, FGF, y GDF7. Por lo tanto, la presente invención proporciona una descripción del sistema regulatorio del receptor ALK1, en el cual el ALK1 es un receptor para el grupo de ligandos GDF5, el cual incluye los ligandos GDF6 y GDF7, y también para el grupo de ligandos BMP9, el cual incluye el BMP10, con diferentes afinidades para los dos grupos de ligandos. Además, la presente invención demuestra que la señalización portada por ALK1 y los ligandos descritos anteriormente es pro-angiogénica in vivo, y que la inhibición del sistema regulatorio tiene un efecto anti-angiogénico potente in vivo. Por lo tanto, en ciertos aspectos, la presente invención proporciona antagonistas del sistema regulatorio de ALK1, incluyendo antagonistas del receptor o uno o más de los ligandos, utilizada para inhibir la angiogénesis, incluyendo ambas la angiogénesis dependiente de VEGF y la angiogénesis independiente de VEGF.

Además, deberá observarse que se espera que los anticuerpos dirigidos al receptor ALK1 mismo tengan efectos diferentes de los del polipéptido ALK1 ECD. Un anticuerpo pan- neutralizante contra el receptor ALK1 (uno que inhibe el enlace de todos los ligandos fuertes y débiles) se esperaría que inhibiera la señalización de dichos ligandos a través del receptor ALK1 pero no se esperaría que inhibieran la capacidad de dichos ligandos para emitir señales a través de otros receptores (por ejemplo, BMPR1 a, BMPR1 b, BMPRII en el caso de los ligandos GDF5-7 y BMP9-10 y TBRI y TBRII en el caso de la familia TGF ). Por otra parte, un polipéptido ALK1 ECD se esperaría que inhibiera todos los ligandos que se enlazan de manera estrecha, e incluyen una construcción tal como la mostrada en los Ejemplos GDF5-7 y BMP9-10, pero no afectaría los ligandos que se enlazan de manera débil, tales como el TGF-ß. De este modo, aunque el anticuerpo pan-neutralizante contra el receptor ALK1 bloquearía la señalización de los ligandos BMP9 y TGF-ß a través del ALK1 no bloquearía la señalización de los ligandos BMP9 y TGF-ß a través de otro receptor, y aunque el polipéptido ALK1 ECD puede inhibir la señalización del BMP9 a través de todos los receptores (todavía receptores diferentes al ALK1) no se esperaría que inhibiera la señalización de TGF-ß a través de cualquier receptor, incluyendo el ALK1.

Las proteínas aquí descritas, son formas humanas, a menos que se especifique lo contrario. Las referencias del Genbank para las proteínas son las siguientes: GDF5 humano, CAA56874; GDF6 humano, AAH43222; GDF7 humano, NP_878248; BMP9 humano, Q9UK05; BMP10 humano, 095393; DAN humana, BAA92265. Todas las secuencias de ALK1 están establecidas en las figuras de la 1 a la 5.

Secuencias de aminoácidos de proteína DAN humana (SEQ ID NO: 10) (Genbank BAA92265): MLRVLVGAVL PAMLLAAPPP INKLALFPDK SAWCEAKN IT QIVGHSGCEA KSIQNRACLG QCFSYSVPNT FPQSTESLVH CDSCMPAQS WEIVTLECPG HEEVPRVDKL VEKILHCSCQ ACGKEPSHEG LSVYVQGEDG PGSQPGTHPH PHPHPHPGGQ TPEPEDPPGA PHTEEEGAED Se espera que la proteína DAN madura corresponda a los aminoácidos del 17 al 180. El dominio del nudo de cisteína conservado de la proteína DAN corresponde a los aminoácidos del 21 al 125 (subrayados).

Secuencia de cADN de la proteína DAN humana (SEQ ID NO: 11) (Genbank BCO12037): gccgagcctc ctggggcgcc cgggcccgcg acccccgcac ccagctccgc aggaccggcg ggcgcgcgcg ggctctggag gccacgggca tgatgcttcg ggtcctggtg ggggctgtcc tccctgccat gctactggct gccccaccac ccatcaacaa gctggcactg ttcccagata agagtgcctg gtgcgaagcc aagaacatca cccagatcgt gggccacagc ggctgtgagg ccaagtccat ccagaacagg gcgtgcctag gacagtgctt cagctacagc gtccccaaca ccttcccaca gtccacagag tccctggttc actgtgactc ctgcatgcca gcccagtcca tgtgggagat tgtgacgctg gagtgcccgg gccacgagga ggtgcccagg gtggacaagc tggtggagaa gatcctgcac tgtagctgcc aggcctgcgg caaggagcct agtcacgagg gsrctgagcgt ctatgtgcag ggcgaggacg ggccgggatc ccagcccggc acccaccctc acccccatcc ccacccccat cctggcgggc agacccctga gcccgaggac ccccctgggg ccccccacac agaggaagag ggggctgagg actgaggccc ccccaactct tcctcccctc tcatccccct gtggaatgtt gggtctcact ctctggggaa gtcaggggag aagctgaagc ccccctttgg cactggatgg acttggcttc agactcggac ttgaatgctg cccggttgcc atggagatct gaaggggcgg ggttagagcc aagctgcaca atttaatata ttcaagagtg gggggaggaa gcagaggtct tcagggctct ttttttgggg ggggggtggt ctcttcctgt ctggcttcta gagatgtgcc tgtgggaggg ggaggaagtt ggctgagcca ttgagtgctg ggggaggcca tccaagatgg catgaatcgg gctaaggtcc ctgggggtgc agatggtact gctgaggtcc cgggcttagt gtgagcatct tgccagcctc aggcttgagg gagggctggg ctagaaagac cactggcaga aacaggaggc tccggcccca caggtttccc caaggcctct caccccactt cccatctcca gggaagcgtc gccccagtgg cactgaagtg gccctccctc agcggagggg tttgggagtc aggcctgggc aggaccctgc tgactcgtgg cgcgggagct gggagccagg ctctccgggc ctttctctgg cttccttggc ttgcctggtg ggggaagggg aggaggggaa gaaggaaagg gaagagtctt ccaaggccag aaggaggggg acaacccccc aagaccatcc ctgaagacga gcatccccct cctctccctg ttagaaatgt tagtgccccg cactgtgccc caagttctag gccccccaga aagotgtcag agccggccgc cttctcccct ctcccaggga tgctctttgt aaatatcgga tgggtgtggg agtgaggggt tacctccctc gccccaaggt tccagaggcc ctaggcggga tgggctcgct gaacctcgag gaactccagg acgaggagga catgggactt gcgtggacag tcagggttca cttgggctct ctctagctcc ccaattctgc ctgcctcctc cctcccagct gcactttaac cctagaaggt ggggacctgg 9999a999ac agggcaggcg ggcccatgaa gaaagcccct cgttgcccag cactgtctgc gtctgctctt ctgtgcccag ggtggctgcc agcccactgc ctcctgcctg gggtggcctg gccctcctgg ctgttgcgac gcgggcttct ggagcttgtc accattggac agtctccctg atggaccctc agtcttctca tgaataaatt ccttcaacgc caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa La secuencia de codificación para el precursor de la proteína DAN corresponde a los ácidos nucleicos del 93 al 635. La secuencia de codificación para la proteína DAN madura corresponde a los ácidos nucleicos del 141 al 632. La secuencia de codificación para la porción del nudo de cisteína conservado de la proteína DAN corresponde a los ácidos nucleicos del 153 al 467.

Los términos utilizados en esta descripción generalmente tienen sus significados normales en la técnica, dentro del contexto de la presente descripción y en el contexto específico en donde cada término es utilizado. Ciertos términos son explicados en la presente descripción, para proporcionar una guía adicional al practicante para describir las composiciones y métodos aquí descritos y la forma de hacerlos o utilizarlos. El alcance o significado de cualquier uso de un término se podrá apreciar a partir del concepto específico en el cual es utilizado el término. 2. Polipéptidos ALK1 Solubles Las proteínas ALK1 que ocurren de manera natural son proteínas transmembrana, con una porción de la proteína colocada fuera de la célula (la porción extracelular) y una porción de la proteína colocada dentro de la célula (la porción ¡ntracelular). Los aspectos de la presente invención comprenden polipéptidos que comprenden una porción del dominio extracelular de las proteínas ALK 1.

En ciertas modalidades, la presente invención proporciona "polipéptidos ALK1 ECD". El término "polipéptido ALK1 ECD" pretende referirse a un polipéptido que consiste o comprende una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de un polipéptido ALK1, que ocurre de manera natural ya sea que incluye o excluye cualquier secuencia de señal y la secuencia de la terminal-N para la secuencia de señal, o una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 33% idéntica a un dominio extracelular de un polipéptido ALK1 que ocurre de manera natural, y opcionalmente por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% idéntica a la secuencia de un dominio extracelular de un polipéptido ALK1 que ocurre de manera natural, como lo ejemplifica la región del nudo de cisteína de los aminoácidos del 34 al 95 de la SEQ ID NO: 1 o el nudo de cisteína más los aminoácidos adicionales en las terminales N- y C- del dominio extracelular, tales como los aminoácidos del 22 al 118 de la SEQ ID NO: 1. De un modo similar, el polipéptido ALK1 puede comprender un polipéptido que es codificado por los nucleótidos del 100 al 285 de la SEQ ID NO: 2, y las variantes silenciosas del mismo o ácidos nucleicos que hibridan para complemento del mismo bajo condiciones de hibridación severas (generalmente, dichas condiciones son conocidas en la técnica pero pueden, por ejemplo, comprender la hibridación de formamida al 50% v/v, 5x SSC, agente de bloqueo p/v al 2%, N-lauroilsarcosina al 0.1%, SDS al 0.3% a una temperatura de 65°C durante la noche y lavado, por ejemplo, en 5xSSC a una temperatura de aproximadamente 65°C). Adicionalmente, un polipéptido ALK1 ECD puede comprender un polipéptido que es codificado por los nucleótidos del 64 al 384 de la SEQ ID NO: 2, o las variantes silenciosas del mismo o ácidos nucleicos que hibridan para el complemento del mismo bajo condiciones de hibridación severas (generalmente, dichas condiciones son conocidas en la técnica pero pueden, por ejemplo, comprender la hibridación de formamida al 50% v/v, 5x SSC, agente de bloqueo p/v al 2%, N-lauroilsarcosina al 0.1%, SDS al 0.3% a una temperatura de 65°C durante la noche y lavado en, por ejemplo, 5xSSC a una temperatura de aproximadamente 65°C). El término "polipéptido ALK1 ECD" por consiguiente comprende las porciones extracelulares aisladas de los polipéptidos ALK1, variantes de los mismos (por ejemplo, incluyendo las variantes que comprenden, no más de 2, 3, 4, 5 ó 10 substituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos en la secuencia correspondiente a los aminoácidos del 22 al 118 de la SEQ ID NO: 1 y que incluyen variantes que comprenden no más de 2, 3, 4, 5, ó 10 substituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos en la secuencia correspondiente a los aminoácidos del 34 al 95 de la SEQ ID NO: 1), fragmentos de las mismas y proteínas de fusión que comprenden cualquiera de los anteriores, pero en cada caso preferentemente cualquiera de los polipéptidos ALK1 ECD siguientes retendrán afinidad substancial para uno o más de los ligandos GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 o B P10. El término "polipéptido ALK1 ECD" pretende explícitamente excluir cualquier polipéptido de ALK1 que ocurre de manera natural de longitud completa. Generalmente, un polipéptido ALK1 ECD será diseñado para ser soluble en soluciones acuosas en temperaturas biológicamente importantes, niveles de pH y osmolaridad.

Como se describió anteriormente, la presente invención proporciona los polipéptidos ALK1 ECD que comparten un grado especificado de identidad o similitud de secuencia con un polipéptido ALK1 que ocurre de manera natural. Para determinar el porcentaje de identidad de las dos secuencias de aminoácidos, las secuencias son alineadas para propósitos de comparación óptima (por ejemplo, las aperturas pueden ser introducidas en una o ambas de una primera o segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para la alineación óptima y las secuencias no homologas pueden ser descartadas para propósitos de comparación). Los residuos de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos correspondientes son comparados entonces. Cuando una posición es la primera secuencia de la primera secuencia es ocupada por el mismo residuo de aminoácidos que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se usa en la presente descripción, la "identidad" de aminoácidos es equivalente a "homología" de aminoácidos). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartida por las secuencias, tomando en cuenta el número de aperturas, y la longitud de cada apertura, las cuales necesitan ser introducidas para la alineación óptima de las dos secuencias.

La comparación y determinación del porcentaje de identidad y similitud de las secuencias entre las dos secuencias se puede realizar utilizando el algoritmo matemático. ("Biología Molecular por Computación" (Computational Molecular Biology), Lesk, A. M., editores, Oxford University Press, New York, 1988; "Biocomputación: Informática y Proyectos del Genoma" (Biocomputing: Informatics and Genome Projects), Smith, D. W., editores, Academic Press, New York, 1993; "Análisis de Datos de Secuencia por Computadora" (Computer Analysis of Sequence Data), Parte 1, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., editores, Humana Press, New Jersey, 1994; "Análisis de Secuencia en Biología Molecular" (Sequence Analysis in Molecular Biology), von Heinje, G., Academic Press, 1987; y "Cebador de Análisis de Secuencia" (Sequence Analysis Primer), Gribskov, M. y Devereux, J., editores, M Stockton Press, New York, 1991).

En una modalidad, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos es determinado utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J Mol. Biol. (48): páginas 444 a 453 (1970)) el cual ha sido incorporado en el programa GAP del paquete de software GCG (que se consigue en http://www.gcg.com). En una modalidad específica, los siguientes parámetros son utilizados en el programa GAP: ya sea una matriz Blosum 62 o una matriz PAM250, y un peso de la apertura de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, ó 6. Todavía en otra modalidad, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos es determinado utilizando el programa GAP del paquete de software GCG (Devereux, J., y asociados, Nucleic Acids Res. 12(1): página 387 (1984)) (que se consigue en http://www.gcg.com). Los parámetros de ejemplo incluyen el uso de la matriz NWSgapdna.CMP y el peso de apertura de 40, 50, 60, 70, ó 80 y/o un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, ó 6. A menos que se especifique io contrario, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos va a ser determinado utilizando el programa GAP y utilizando una matriz Blosum 62, un peso de GAP de 10 y un peso de longitud de 3, y si dicho algoritmo no puede calcular el porcentaje de identidad deseado, deberá ser seleccionada una alternativa adecuada aquí descrita.

En otra modalidad, el porcentaje de identidad entre las dos secuencias de aminoácidos es determinado utilizando el algoritmo de E. Myers y W. Miller (CABIOS, 4: páginas 11 a 17 (1989)), el cual ha sido incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), utilizando1 la tabla de residuo de peso PAM 120, una penalidad de longitud de la apertura de 12 y una penalidad de apertura de 4.

Otra modalidad para determinar la mejor alineación general entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el programa de computadora FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag y asociados (Comp. App. Biosci, 6: páginas 237 a 245 (1990)). En una alineación de secuencia las solicitudes y las secuencias del sujeto son ambas secuencias de aminoácidos. El resultado de dicha alineación global de la secuencia se presenta en términos del porcentaje de identidad. En una modalidad, la identidad de la secuencia de aminoácidos es realizada utilizando el programa de computadora FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag y asociados (Comp. App. Biosci., 6: páginas 237 a 245 (1990)).

En una modalidad específica, los parámetros empleados para el cálculo del porcentaje de identidad y similitud de la alineación de aminoácidos comprende: Matriz=PAM 150, k-tuple = 2, Mal Acoplamiento de Penalidad=1, Unión de Penalidad = 20, Longitud del Grupo de Aleatoriedad = 0, Calificación de Corte = 1, Penalidad de Apertura = 5 y Penalidad por Tamaño de Apertura=0.05.

En ciertas modalidades, los polipéptidos ALK1 ECD comprende una porción extracelular de una proteína ALK1 que ocurre de manera natural tal como una secuencia de la SEQ ID NO: 1, y preferentemente una porción de enlace del ligando del dominio ALK1 extracelular. En ciertas modalidades, un polipéptido ALK1 soluble comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos del 22 al 118 de la SEQ ID NO: 1. En ciertas modalidades, el polipéptido ALK1 extracelular truncado comprende por lo menos 30, 40 ó 50 aminoácidos consecutivos de una secuencia de aminoácidos de una porción extracelular de la SEQ ID NO: 1.

En modalidades preferidas, un polipéptido ALK1 ECD se enlaza a uno o más de los ligandos GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 y BMP10. Opcionalmente, el polipéptido ALK1 no muestra un enlace substancial a TGF-ß o TGF- 3. El enlace puede ser evaluado utilizando proteínas purificadas en solución o en un sistema de resonancia de plasmón de superficie, tal como el sistema Biacore™. Los polipéptidos ALK1 solubles preferidos exhibirán una actividad anti-angiogénica. Los bio-ensayos para la actividad inhibitoria de la angiogénesis incluyen el ensayo de membrana corioalantoica de pollo (CA ), el ensayo de microbolsa de la córnea de ratón, un ensayo para la medición del efecto de la administración de proteínas aisladas o sintetizadas en tumores implantados. El ensayo CAM lo describe O'Reilly, y asociados, en el libro "Regulación Angiogénica de Crecimiento Metastático" (Angiogenic Regulátion of Metastatic Growth) Cell, vol. 79 (2), Oct. 1, 1994, páginas 315 a 328. Brevemente, los embriones de pollo de 3 días con yemas intactas se separan del huevo y son colocados en un plato de petri. Después de 3 días de incubación, un disco de metilcelulosa que contiene la proteína que va a ser probada es aplicado al CAM en dos embriones individuales. Después de 48 horas de incubación, los embriones y los CAMs son observados para determinar si el crecimiento del endotelio ha sido inhibido. El ensayo de microbolsa de la córnea de ratón comprende implantar un gránulo que contienen el factor de crecimiento, junto con otro gránulo que contiene el inhibidor de crecimiento sospechado del endotelio, en la córnea de un ratón y observar el patrón de capilaridades que son elaboradas en la córnea. Otros ensayos se describen en los Ejemplos.

Los polipéptidos ALK1 ECD pueden ser producidos removiendo la cola citoplásmica y la región de la membrana de un polipéptido ALK1. Alternativamente, el dominio transmembrana puede ser desactivado por eliminación o por substitución de los residuos de aminoácidos normalmente hidrofóbicos que comprenden un dominio transmembrana con los hidrofóbicos. En cualquier caso, un perfil de hidropatía substancialmente hidrofílica es creado el cual reducirá la afinidad de lípidos y mejorará la solubilidad acuosa. La eliminación de un dominio transmembrana es preferida sobre la substitución con residuos de aminoácidos hidrofílicos debido a que evita la introducción de epítopes potencialmente inmunogénicos.

Los polipéptidos ALK1 ECD pueden incluir adicionalmente cualquiera de las diferentes secuencias líder en la terminal-N. Dicha secuencia permitiría que los polipéptidos fueran expresados y se tomaran como objetivos para la trayectoria de secreción en el sistema eucariótico. Ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,082,783 (1992) otorgada a Ernst y asociados. Alternativamente, una secuencia de señal de ALK1 natural puede ser utilizada para efectuar la extrusión de la célula. Las secuencias líder posibles incluyen tPa natural, y líderes de melitina de miel de abeja (SEQ ID NOs. de la 7 a la 9, respectivamente). El procesamiento de péptidos de señal puede variar dependiendo de la secuencia líder seleccionada, el tipo de célula utilizado y las condiciones del cultivo, entre otras variables, y por lo tanto los sitios de inicio reales de la terminal-N para los polipéptidos ALK1 ECD maduros, incluyendo el de la SEQ ID NO: 5, pueden cambiar por de 1 a 5 aminoácidos en cualquiera de la dirección de la terminal-N o la terminal-C. En ciertas modalidades, la presente descripción contempla mutaciones específicas de los polipéptidos ALK1 como para alterar la glucosilación del polipéptido. Dichas mutaciones pueden ser seleccionadas como para introducir o eliminar uno o más sitios de glucosilación, tales como los sitios de glucosilación enlazados a O- o enlazados a N-. Los sitios de reconocimiento de glucosilación enlazados a asparagina generalmente comprenden una secuencia de tripéptidos, asparagina-X-treonina (o asparagina-X-serina) (en donde "X" es cualquier aminoácido) el cual es reconocido específicamente por las enzimas de glucosilación celular apropiadas. La alteración se puede hacer mediante la adición, o substitución de uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del polipéptido ALK1 de tipo natural (para los sitios de glucosilación enlazados a O-). Una variedad de substituciones o cancelaciones de aminoácidos en uno o ambos de la primera y tercera posiciones de aminoácidos de un sitio de reconocimiento de glucosilación (y/o eliminación de aminoácidos en la segunda posición) da como resultado la no glucosilación en la secuencia del tripéptido modificado. Otros medios para aumentar el número de porciones de carbohidratos en un polipéptido ALK1 es por medio del acoplamiento químico o enzimático de los glucósidos al polipéptido ALK1. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, los azúcares pueden ser enlazados a (a) arginina e histidina; (b) grupos carboxilo libres; (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cisteína; (d) grupos hidroxilo libres tales como aquellos de serina, treonina, o hidroxiprolina; (e) residuos aromáticos tales como aquellos de fenilalanina, tirosina, o triptofano; o (f) los grupos amida de glutamina. Estos métodos se describen en el documento WO 87/05330 publicado en Septiembre 11, 1987, y en el artículo de Aplin y Wriston (1981) en CRC Crit. Rev. Biochem., páginas 259 a 306, incorporado a la presente descripción como referencia. La remoción de una o más porciones de carbohidratos presentes en el polipéptido ALK1 puede ser lograda química y/o enzimáticamente. La desglucosilación química puede comprender, por ejemplo, la exposición del polipéptido ALK1 al compuesto de ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento tiene como resultado la disociación de la mayor parte o todos los azúcares excepto el azúcar de enlace (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras que deja intacta la secuencia de aminoácidos. La desglucosilación química se describe además en el artículo de Hakimuddin y asociados (1987) en Arch. Biochem. Biophys. 259: página 52 y en el de Edge y asociados (1981) en Anal. Biochem. 118: página 131. La disociación enzimática de las porciones de carbohidratos en los polipéptidos ALK1 se puede lograr mediante el uso de una variación de endo- y exo-glucosidasas como las describen Thotakura y asociados (1987) en Meth. Enzymol. 138: página 350. La secuencia de un polipéptido ALK1 puede ser ajustada, según sea apropiado, dependiendo del tipo del sistema de expresión utilizado, como las células de mamífero, levadura, insectos y plantas pueden todas introducir patrones de glucosilación diferentes que pueden afectar la secuencia de aminoácidos del péptido. En general, las proteínas ALK1 para utilizarse en los humanos serán expresadas en una línea de células de mamífero que proporciona la glucosilación apropiada, tales como las líneas de células HEK293 o CHO, aunque otras líneas de células de expresión de mamífero, líneas de células de levadura con enzimas de glucosilación diseñadas y células de insectos se espera que sean útiles también.

La presente invención contempla además un método para generar mutantes, particularmente conjuntos de mutantes de combinación de un polipéptido ALK1, así como mutantes de truncación; los conjuntos de mutantes de combinación son especialmente útiles para identificar las secuencias variantes funcionales. El propósito para seleccionar dichas librerías de combinación puede ser generar, por ejemplo, variantes del polipéptido ALK1 las cuales pueden actuar como cualquier agonista o antagonista, o alternativamente, los que poseen actividades novedosas juntas. Una variedad de ensayos de selección se proporciona a continuación, y dichos ensayos pueden ser utilizados para evaluar las variantes. Por ejemplo, la variante del polipéptido ALK1 puede ser seleccionada por su capacidad para enlazar un ligando ALK1, para prevenir el enlace de un ligando ALK1 a un polipéptido ALK1 o para interferir con la señalización ocasionada por un ligando ALK1. La actividad de un polipéptido ALK1 o sus variantes también puede ser probada en un ensayo basado en células o ¡n vivo, particularmente cualquiera de los ensayos descritos en los Ejemplos.

Pueden ser generadas las variantes derivadas de combinaciones que tengan una potencia aumentada generalmente o selectiva en relación con el polipéptido ALK1 ECD que comprende un dominio extracelular de un polipéptido ALK1 que ocurre de manera natural. De un modo similar, la mutagénesis puede originar las variantes las cuales tengan vidas medias en el suero dramáticamente diferentes a las correspondientes al polipéptido ALK1 ECD de tipo natural. Por ejemplo, la proteína alterada se puede hacer ya sea más estable o menos estable a la degradación proteolítica y otros procesos que resultan en la destrucción de, o de otra manera la eliminación o desactivación de un polipéptido ALK1 ECD natural. Dichas variantes y los genes que las codifican, pueden ser utilizadas para alterar el polipéptido ALK1 ECD en sus niveles mediante la modulación en la vida media de los polipéptidos de ALK1. Por ejemplo, una vida media corta puede originar efectos biológicos más transitorios y puede permitir un control más estrecho de los niveles del polipéptido ALK1 ECD recombinante dentro del paciente. En una proteína de fusión Fe, se pueden hacer mutaciones en el enlazador (si lo hay) y/o la porción Fe para alterar la vida media de la proteína.

La librería de combinación puede ser producida por medio de una librería degenerada de genes que codifican una librería de polipéptidos que incluyen cada uno por lo menos una porción de secuencias potenciales del polipéptido ALK1. Por ejemplo, se puede ligar enzimáticamente una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias del gen de modo que el conjunto de generación de la secuencia de nucleótidos del polipéptido ALK1 potencial se puede expresar como polipéptidos individuales, o alternativamente, como un conjunto de proteínas de fusión más grandes (por ejemplo, una pantalla de fagos).

Existen muchos medios por los cuales las librerías de las variantes de ALK1 ECD potenciales pueden ser generadas de una secuencia de oligonucleótidos degenerada. La síntesis química de la secuencia genética degenerada se puede llevar a cabo en un sintetizador automático de ADN, y los genes sintéticos pueden ser ligados en un vector apropiado para la expresión. La síntesis de los oligonucleótidos degenerados es bien conocida en la técnica (ver por ejemplo, las publicaciones de Narang, SA (1983) en Tetrahedron 39: página 3; Itakura y asociados (1981) en "ADN Recombinante, Actas del 3er Simposio de Macromoléculas de Clevely", (Recombinant DNA, Proc. 3rd Clevely Sympos. Macromolecules), editores. AG Walton, Amsterdam: Elsevier, páginas 273 a 289; Itakura y asociados (1984) en Annu. Rev. Biochem. 53: página 323; Itakura y asociados (1984) en Science 198: página 1056; Ike y asociados (1983) en Nucleic Acid Res. 11: página 477). Dichas técnicas han sido empleadas en la evolución directa de otras proteínas (ver, por ejemplo, las publicaciones de Scott y asociados (1990) en Science 249: páginas 386 a 390; Roberts y asociados (1992) en PNAS EUA 89: páginas 2429 a 2433; Devlin y asociados (1990) en Science 249: páginas 404 a 406; Cwirla y asociados (1990) en PNAS EUA 87: páginas 6378 a 6382; así como las Patentes Norteamericanas Nos: 5,223,409, 5,198,346, y 5,096,815).

Alternativamente, se pueden utilizar otras formas de mutagénesis para generar las librerías de combinación. Por ejemplo, se pueden generar variantes de polipéptidos ALK1 y aislados de una librería mediante la selección utilizando, por ejemplo, la mutagénesis de exploración de alanina y similares (Ruf y asociados (1994) Bíochemistry 33: páginas 1565 a 1572; Wang y asociados (1994) J. Biol. Chem. 269: páginas 3095 a 3099; Balint y asociados (1993) Gene 137: páginas 109 a 118; Grodberg y asociados (1993) Eur. J. Biochem. 218: páginas 597 a 601; Nagashima y asociados (1993) J. Biol. Chem. 268: páginas 2888 a 2892; Lowman y asociados (1991) Biochemistry 30: páginas 10832 a 10838; y Cunningham y asociados (1989) Science 244: páginas 1081 a 1085), por medio de mutagénesis de exploración del enlazador (Gustin y asociados (1993) Virology 193: páginas 653 a 660; Brown y asociados (1992) Mol. Cell Biol. 12: páginas 2644 a 2652; McKnight y asociados (1982) Science 232: página 316); mediante mutagénesis de saturación (Meyers y asociados (1986) Science 232: página 613); mediante mutagénesis PCR (Leung y asociados (1989) Method Cell Mol Biol 1: páginas 11 a 19); o mediante mutagénesis aleatoria, incluyendo mutagénesis química, etc. (Miller y asociados (1992) "Un Curso Corto Sobre Genética Bacterial" (A Short Course in Bacterial Genetics), CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; y Greener y asociados (1994) Strategies en Mol Biol 7: páginas 32 a 34). La mutagénesis de exploración del enlazador, particularmente en un establecimiento de combinación es un método atractivo para identificar las formas truncadas (bioactivas) de los polipéptidos ALK1.

Un amplio rango de técnicas son conocidas en el arte para la selección de los productos genéticos de las librerías de combinación hechas mediante mutaciones y truncaciones del punto, y para este asunto, para la selección de librerías de cADN para productos genéticos que tienen cierta propiedad. Dichas técnicas serán generalmente adaptables para la selección rápida de las librerías genéticas generadas por la mutagénesis de combinación de los polipéptidos ALK1. Las técnicas más ampliamente utilizadas para la selección de librerías grandes de genes generalmente comprenden la clonación de la librería del gen en vectores de expresión que se pueden duplicar, la transformación de las células apropiadas con la librería de vectores resultante, y la expresión de los genes de combinación bajo condiciones en las cuales la detección de las instalaciones de actividad deseada del aislamiento relativamente fácil del vector que codifica el gen cuyo producto fue detectado. Los ensayos preferidos incluyen ensayos del enlace del ligando ALK1 y ensayos de señalización de la célula portada por el ligando.

En ciertas modalidades, los polipéptidos ALK1 ECD de la presente invención pueden comprender además modificaciones posteriores a la traducción además de cualquiera de las que están naturalmente presentes en los polipéptidos ALK1. Dichas modificaciones incluyen, pero no están limitadas a, acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación y acilación. Como resultado, los polipéptidos ALK1 ECD modificados pueden contener elementos que no son de aminoácidos, tales como polietilénglicoles, lípidos, poli- o mono-sacáridos, y fosfatos. Los efectos de dichos elementos que no son aminoácidos en la funcionalidad de un polipéptido ALK1 ECD pueden ser probados como aquí se describe para otras variantes del polipéptido ALK1 ECD. Cuando es producido un polipéptido ALK1 ECD en las células mediante la disociación de una forma naciente del polipéptido ALK1 , el procesamiento posterior a la traducción puede también ser importante para la duplicación correcta y/o la función de la proteína. Las células diferentes (tales como CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 o HEK293) tienen una maquinaria celular específica y mecanismos característicos para dichas actividades posteriores a la traducción y pueden ser seleccionados para asegurar la modificación y procesamiento correcto de los polipéptidos ALK1.

En ciertos aspectos, las variantes funcionales o las formas modificadas de los polipéptidos ALK1 ECD incluyen proteínas de fusión que tienen por lo menos una porción de los polipéptidos ALK1 ECD o uno o más dominios de fusión. Los ejemplos bien conocidos de dichos dominios de fusión incluyen, pero no están limitados a, polihistidina, Glu-Glu, glutationa S transferasa (GST), tioredoxina, proteína A, proteína G, región constante de cadena pesada de inmunoglobulina (Fe), proteína de enlace de maltosa (MBP), o albúmina de suero humano. Un dominio de fusión puede ser seleccionado como para conferir una propiedad deseada. Por ejemplo, algunos dominios de fusión son particularmente útiles para el aislamiento de las proteínas de fusión por cromatografía de afinidad. Para propósitos de la purificación por afinidad, se pueden utilizar matrices importantes para cromatografía de afinidad, tales como glutationa-, amilasa-, y resinas conjugadas de níquel- o cobalto-. Muchas de dichas matrices están disponibles en forma de "equipos", tales como el sistema de purificación de Pharmacia GST y el sistema Q I Aexpress™ (Qiagen) útiles en los asociados de fusión (HIS6). Como otro ejemplo, un dominio de fusión puede ser seleccionado como para facilitar la detección de los polipéptidos ALK1 ECD. Los ejemplos de dichos dominios de detección incluyen las diferentes proteínas fluorescentes (por ejemplo, GFP) así como "etiquetas de epítope", las cuales son generalmente secuencias cortas de péptidos para las cuales están disponibles los anticuerpos específicos. Las etiquetas de epítope bien conocidas para las cuales están fácilmente disponibles los anticuerpos monoclonales específicos incluyen FLAG, la hemaglutinina del virus de influenza (HA), y las etiquetas c-myc. En algunos casos, los dominios de fusión tienen un sitio de disociación de proteasa, tales como el Factor Xa o Trombina, los cuales permiten que la proteasa relevante digiera parcialmente las proteínas de fusión y por lo tanto libere de las mismas las proteínas recombinantes. Las proteínas liberadas entonces pueden ser aisladas del dominio de fusión mediante separación cromatográfica posterior. En ciertas modalidades preferidas, un polipéptido ALK1 ECD es fusionado con un dominio que estabiliza los polipéptidos ALK1 ¡n vivo (un dominio "estabilizador"). "Estabilización" significa cualquier cosa que aumente la vida media en el suero, independientemente de si se debe a la destrucción disminuida, la disociación disminuida por parte del riñon, u otro efecto farmacocinético. Las fusiones con la porción Fe de una ¡nmunoglobulina es conocido que confieren propiedades farmacocinéticas deseables en un amplio rango de proteínas. De un modo similar, las fusiones a la albúmina de suero humano pueden conferir propiedades deseables. Otros tipos de proteínas de fusión que pueden ser seleccionados incluyen la multimerización (por ejemplo, dimerización, tetramerización) de dominios y dominios funcionales.

Como un ejemplo específico, la presente invención proporciona una proteína de fusión que comprende un dominio extracelular soluble de ALK1 fusionado a un dominio Fe (por ejemplo, SEQ ID NO: 6).

THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP DTL ISRTPEVTCV D (A) VSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQY STYRWSVLTVLHQDWLNGKEY CK (A) VSNKAL PVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPEN YKTTPPVLDSDGPFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVNHEALH (A) HYT QKSLSLSPGK* Opcionalmente, el dominio Fe tiene una o más mutaciones en los residuos tales como Asp-265, Usina 322, y Asn-434. En ciertos casos, el dominio Fe muíante que tiene una o más de estas substituciones (por ejemplo, la mutación Asp-265) tiene una capacidad reducida de enlace al receptor Fcy en relación con el dominio Fe de tipo natural. En otros casos, el dominio Fe muíante tiene una o más de estas mutaciones (por ejemplo, la mutación Asn-434) tiene una capacidad aumentada de enlace al receptor Fe relacionado con el MHC de clase I (FcRN) en relación con el dominio Fe de tipo natural.

Deberá quedar entendido que se pueden acomodar de cualquier manera los diferentes elementos de las proteínas de fusión que sean consistentes con la funcionalidad deseada. Por ejemplo, un polipéptido ALK1 ECD puede ser colocado en la terminal-C para un dominio heterologo, o alternativamente, un dominio heterologo puede ser colocado en la terminal-C para un polipéptido ALK1 ECD. El dominio del polipéptido ALK1 ECD y el dominio heterologo no necesitan estar adyacentes en una proteína de fusión, y pueden ser incluidos dominios adicionales o secuencias de aminoácidos en la terminal-C o la terminal-N en cualquier dominio o entre los dominios.

Como se usan en la presente descripción, los términos, "región Fe de inmunoglobulina" o simplemente "Fe" se entiende que significan una porción de la terminal carboxilo de una región constante de cadena de inmunoglobulina, preferentemente una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, o una porción de la misma. Por ejemplo, una región Fe de inmunoglobulina puede comprender 1) un dominio CH1, un dominio CH2, y un dominio CH3, 2) un dominio CH1 y un dominio CH2, 3) un dominio CH1 y un dominio CH3, 4) un dominio CH2 y un dominio CH3, ó 5) una combinación de dos o más dominios y una región de articulación de inmunoglobulina. En una modalidad preferida, la región Fe de inmunoglobulina comprende por lo menos una región de articulación de inmunoglobulina, un dominio CH2 y un dominio CH3, y preferentemente carece del dominio CH1.

En una modalidad, la clase de inmunoglobulina de la cual es derivada la región constante de cadena pesada es la región IgG ( I gy) (subclases ? 1, 2, 3, ó 4). Se pueden utilizar otras clases de inmunoglobulina, IgA (Iga), IgD (Ig5), IgE (Igs) e IgM ( I g µ) . La elección de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina apropiada se explica en detalle en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,541,087, y 5,726,044. La selección de las secuencias de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina particulares de ciertas clases y subclases de inmunoglobulina para lograr un resultado particular se considera que se encuentra dentro del nivel de un experto en la técnica. La porción de la construcción de ADN que codifica la región Fe de inmunoglobulina preferentemente comprende por lo menos una porción de un dominio de articulación, y preferentemente por lo menos una porción de un dominio CH3 de Fe ? o los dominios homólogos en cualquiera de las inmunoglobulinas IgA, IgD, IgE, o IgM.

Además, está contemplado que la substitución o eliminación de aminoácidos dentro de las regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina pueden ser útiles en la práctica de los métodos y composiciones aquí descritos. Un ejemplo sería introducir substituciones de aminoácidos en la región CH2 superior para crear una variante Fe con una afinidad reducida para los receptores Fe (Colé y asociados (1997) J. Immunol. 159: página 3613).

En ciertas modalidades, la presente descripción pone a disposición las formas aisladas y/o purificadas de los polipéptidos ALK1 ECD, las cuales son formas aisladas, o substancialmente libres de otra manera de (por ejemplo, por lo menos 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% libres de), otras proteínas y/u otras especies de polipéptidos ALK1 ECD. Los polipéptidos ALK1 generalmente serán producidos mediante la expresión de ácidos nucleicos recombinantes.

En ciertas modalidades, la descripción incluye ácidos nucleicos que codifican polipéptidos ALK1 solubles que comprenden la secuencia de codificación para una porción extracelular de una proteína ALK1. En modalidades adicionales, esta descripción también pertenece a una célula huésped que comprende dichos ácidos nucleicos. La célula huésped puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, un polipéptido de la presente invención puede ser expresado en células bacteriales tales como E. coli, células de insectos (por ejemplo, utilizando un sistema de expresión de baculovirus), levadura, o células de mamífero. Otras células huésped adecuadas son conocidas para los expertos en la técnica. Por consiguiente, algunas modalidades de la presente invención pertenecen adicionalmente a métodos de producción de polipéptidos ALK1 ECD. Se ha establecido que una proteína de fusión ALKI-Fc establecida en la SEQ ID NO: 3 y expresada en las células CHO tiene una actividad anti-angiogénica potente.

Los polipéptidos DAN, incluyendo las variantes del DAN de tipo natural, y las proteínas de fusión que contienen las proteínas DAN pueden ser generados y caracterizados como se describió anteriormente con respecto a las proteínas ALK1 ECD. 3. Ácidos Nucleicos que Codifican Polipéptidos ALK1 En ciertos aspectos, la presente invención proporciona ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que codifican cualquiera de los polipéptidos ALK1 (por ejemplo, polipéptidos ALK1 ECD), incluyendo fragmentos, variantes funcionales y las proteínas de fusión aquí descritas. Por ejemplo, la SEQ ID NO: 2 codifica el polipéptido precursor ALK1 humano que ocurre de manera natural, mientras la SEQ ID NO: 4 codifica el precursor de un dominio extracelular de ALK1 fusionado a un dominio Fe de lgG1. Los ácidos nucleicos de asunto material pueden ser de un solo hilo o de hilo doble. Dichos ácidos nucleicos pueden ser moléculas de ADN o ARN. Estos ácidos nucleicos pueden ser utilizados, por ejemplo, en métodos para elaborar polipéptidos ALK1 o como agentes terapéuticos directos (por ejemplo, en un método de terapia genética o de ARNi antisentido).

En ciertos aspectos, los ácidos nucleicos asunto material que codifican los polipéptidos ALK1 son entendidos que además incluyen ácidos nucleicos que son variantes de las SEQ ID NO: 2 ó 4. Las variantes de las secuencias de nucleótidos incluyen secuencias que difieren por una o más substituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótidos, tales como variantes alélicas.

En ciertas modalidades, la presente invención proporciona las secuencias recombinantes o aisladas de ácido nucleico que son por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idénticas a las SEQ ID NO: 2 ó 4. Un experto en la técnica apreciará que las secuencias de ácido nucleico complementarias a las SEQ ID NO: 2 ó 4, y las variantes de las SEQ ID NO: 2 ó 4 también se encuentran dentro del alcance de la presente invención. En modalidades adicionales, las secuencias de ácido nucleico de la presente invención pueden ser aisladas, recombinantes, y/o fusionadas con una secuencia de nucleótidos heteróloga, o en una librería de ADN.

En otras modalidades, los ácidos nucleicos de la presente descripción también incluyen secuencias de nucleótidos que hibridan bajo condiciones altamente severas para las secuencias de nucleótidos designadas en las SEQ ID NO: 2 ó 4, las secuencias de complemento de las SEQ ID NO: 2 ó 4, o fragmentos de las mismas. Como se explicó anteriormente, un experto en la técnica entenderá fácilmente que se pueden variar las condiciones de severidad apropiadas las cuales promueven la hibridación del ADN. Un experto en la técnica entenderá fácilmente que las condiciones de severidad apropiadas que promoverán la hibridación del ADN pueden ser variadas. Por ejemplo, se podría realizar la hibridación en 6.0 x de cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a una temperatura de aproximadamente 45°C, seguido por un lavado de 2.0 x SSC a una temperatura de 50°C. Por ejemplo, la concentración de sal en el paso de lavado puede ser seleccionada de una severidad baja de aproximadamente 2.0 x SSC a una temperatura de 50°C a una severidad alta de aproximadamente 0.2 x SSC a una temperatura de 50°C. Además, la temperatura del paso de lavado puede ser aumentada de condiciones de baja severidad a temperatura ambiente, de aproximadamente 22°C, a condiciones de alta severidad a una temperatura de aproximadamente 65°C. Ambas la temperatura y la sal pueden ser variadas, o la temperatura o la concentración de sal se pueden mantener constantes mientras que la otra variable es cambiante. En una modalidad, la presente invención proporciona ácidos nucleicos que hibridan bajo condiciones de baja severidad de 6 x SSC a temperatura ambiente, seguidas por un lavado de 2 x SSC a temperatura ambiente.

Los ácidos nucleicos aislados que difieren de los ácidos nucleicos establecidos en las SEQ ID NOs: 2 ó 4 debido a la degeneración del código genético también se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, un número de aminoácidos son designados por más de un triplete. Los codones que especifican el mismo aminoácido, o sinónimos (por ejemplo, CAU y CAC son sinónimos de histidina) pueden resultar en mutaciones "silenciosas" las cuales no afectan la secuencia de aminoácidos de la proteína. Sin embargo, se espera que el polimorfismo de la secuencia de ADN que conduce a los cambios en las secuencias de aminoácidos de las proteínas asunto materia existirán entre las células de mamíferos. Un experto en la técnica apreciará que estas variaciones en uno o más nucleótidos (hasta aproximadamente del 3% al 5% de los nucleótidos) de los ácidos nucleicos que codifican una proteína particular pueden existir entre los individuos de una especie determinada debido a la variación alélica natural. Cualquiera de dichas variaciones de nucleótidos y los polimorfismos resultantes de aminoácidos se encuentran dentro del alcance de la presente invención.

En ciertas modalidades, los ácidos nucleicos recombinantes de la presente invención pueden ser enlazados de manera operable a una o más de las secuencias de nucleótidos regulatorias en una construcción de expresión. Las secuencias de nucleótidos regulatorias generalmente serán apropiadas para la célula huésped utilizada para la expresión. Numerosos tipos de vectores de expresión apropiados y secuencias regulatorias adecuadas son conocidos en la técnica para una variedad de células huésped. Generalmente, dichas una o más secuencias de nucleótidos regulatorias pueden incluir, pero no están limitadas a, secuencias promotoras, secuencias líder o de señal, sitios de enlace de ribosomas, inicio de transcripción y secuencias de terminación, inicio de traducción y secuencias de terminación, y secuencias mejoradoras o activadores. Los promotores constitutivos o inducibles son conocidos en la técnica y están contemplados por la presente descripción. Los promotores pueden ser ya sea promotores que ocurren de manera natural, o promotores híbridos que combinan elementos de más de un promotor. Una construcción de expresión puede estar presente en una célula en un episoma, tal como un plásmido, o la construcción de expresión puede ser insertada en un cromosoma. En una modalidad preferida, el vector de expresión contiene un gen marcador que se puede seleccionar para permitir la selección de las células huésped transformadas. Los genes marcadores que se pueden seleccionar son bien conocidos en la técnica y variarán con la célula huésped utilizada.

En ciertos aspectos aquí descritos, el ácido nucleico asunto material se proporciona en un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido ALK1 y que está enlazado de manera operable a por lo menos una secuencia regulatoria. Las secuencias regulatorias son reconocidas en la técnica y son seleccionadas para dirigir la expresión del polipéptido ALK1. Por consiguiente, los términos "secuencia regulatoria" incluyen promotores, mejoradores, y otros elementos de control de expresión. Las secuencias regulatorias de ejemplo se describen en el libro de Goeddel; "Tecnología de Expresión Genética: Métodos en Enzimología" (Gene Expression Technology: Methods in Enzymology), Academic Press, San Diego, CA (1990). Por ejemplo, cualquiera de una amplia variedad de secuencias de control de expresión que controlan la expresión de la secuencia de ADN cuando son enlazadas de manera operativa puede ser utilizada en estos vectores para expresar las secuencias de ADN que codifican un polipéptido ALK1. Dichas secuencias de control de expresión útiles, incluyen, por ejemplo, los promotores tempranos o tardíos de SV40, el promotor tet, el promotor temprano inmediato de adenovirus o citomegalovirus, promotores de RSV, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC o TRC, el promotor T7 cuya expresión es dirigida por la polimerasa del ARN T7, el operador principal y las regiones promotoras del fago lambda, las regiones de control de la proteína de recubrimiento fd, el promotor para la cinasa de 3-fosfoglicerato u otras enzimas glucolíticas, los promotores de fosfatasa ácida, por ejemplo, Pho5, los promotores de los factores de a-acoplamiento de levadura, el promotor de polihedros en el sistema de baculovirus y secuencias conocidas como los genes de expresión de células procarióticas o eucarióticas o sus virus, y varias combinaciones de los mismos. Deberá entenderse que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la selección de la célula huésped que va a ser transformada y/o el tipo de proteína que se desea que sea expresada. Además, el número de copias del vector, la capacidad para controlar ese número de copias y la expresión de cualquier proteína codificada por el vector, tales como marcadores de antibióticos, también deberán ser considerados.

Un ácido nucleico recombinante incluido en la presente descripción puede ser producido mediante la ligación del gen clonado, o una porción del mismo, en un vector adecuado para la expresión en cualquiera de las células procarióticas, células eucarióticas (células de levadura, aves, insectos o mamíferos), o ambos. Los vehículos de expresión para la producción de un polipéptido ALK1 recombinante incluyen plásmidos y otros vectores. Por ejemplo, los vectores adecuados incluyen plásmidos de los tipos de: plásmidos derivados de pBR322, plásmidos derivados de pEMBL, plásmidos derivados de pEX, plásmidos derivados de pBTac, y plásmidos derivados de pUC para la expresión en las células procarióticas, tales como E. coli.

Algunos vectores de expresión de mamíferos contienen ambas secuencias procarióticas para facilitar la propagación del vector en las bacterias, y una o más transcripciones eucarióticas en unidades que son expresadas en células eucarióticas. Los vectores derivados de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo y pHyg son ejemplos de vectores de expresión de mamíferos adecuados para la transfección de células eucarióticas. Algunos de estos vectores son modificados con las secuencias de plásmidos bacteriales, tales como pBR322, para facilitar la duplicación y la selección de resistencia al fármaco tanto en las células procarióticas como ecucarióticas. Alternativamente, los derivados de los virus tales como el virus de papiloma bovino (BPV-1), o el virus Epstein-Barr (pHEBo, derivado de pREP- y p205) pueden ser utilizados para la expresión transitoria de proteínas en las células eucarióticas. Los ejemplos de otros sistemas de expresión viral (incluyendo retrovirales) se pueden encontrar debajo en la descripción de los sistemas de administración de la terapia genética. Varios métodos empleados en la preparación de los plásmidos y en la transformación de los organismos huésped son bien conocidos en la técnica. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para las células procarióticas como eucarióticas, así como los procedimientos recombinantes generales, consultar el libro "Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio" (Molecular Cloning A Laboratory Manual), 3a Edición, editado por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). En algunos casos, puede ser deseable expresar los polipéptidos recombinantes mediante el uso de un sistema de expresión de baculovirus. Los ejemplos de dichos sistemas de expresión de baculovirus incluyen vectores derivados de pVL (tales como pVL1392, pVL1393 y pVL941), vectores derivados de pAcUW (tales como pAcUWI), y vectores derivados de pBlueBac (tales como el ß-gal que contiene pBlueBac III).

En una modalidad preferida, se diseñará un vector para la producción de los polipéptidos ALK1 asunto materia en células CHO, tales como el vector Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, Cal if . ) , los vectores pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) y los vectores pCI-neo (Promega, Madison, Wise). Como lo podrán apreciar, las construcciones del gen asunto material pueden ser utilizadas para ocasionar la expresión de los polipéptidos ALK1 asunto materia en las células propagadas en el cultivo, por ejemplo, para producir proteínas, incluyendo proteínas de fusión ó proteínas variantes, para la purificación.

La presente invención también pertenece a una célula huésped transfectada con un gen recombinante que incluye una secuencia de codificación (por ejemplo, las SEQ ID NO: 2 ó 4) para uno o más de los polipéptidos ALK1 asunto materia. La célula huésped puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, un polipéptido ALK1 aquí descrito se puede expresar en células bacteriales tales como E. coli, células de insectos (por ejemplo, utilizando el sistema de expresión de baculovirus), células de levadura o de mamífero. Otras células huésped adecuadas son conocidas para los expertos en la técnica.

Por consiguiente, la presente invención pertenece además a métodos de producción de los polipéptidos ALK1 asunto materia, incluyendo los polipéptidos ALK1 ECD. Por ejemplo, una célula huésped transfectada con un vector de expresión que codifica un polipéptido ALK1 puede ser cultivada bajo condiciones apropiadas para permitir que ocurra la expresión del polipéptido ALK1. El polipéptido ALK1 puede ser secretado y aislado de una mezcla de células y medios que contienen el polipéptido ALK1. Alternativamente, el polipéptido ALK1 puede ser retenido citoplásmicamente o en una fracción de membrana y células recolectadas, Usadas y con las proteínas aisladas. Un cultivo de células incluye células huésped, medios y otros derivados. Los medios adecuados para el cultivo de células son bien conocidos en la técnica. Los polipéptidos ALK1 asunto materia pueden ser aislados del medio de cultivo, las células huésped, o ambos, utilizando las técnicas conocidas en el arte para la purificación de proteínas, incluyendo la cromatografía de intercambio , de iones, cromatografía de filtración de gel, ultrafiltración, electroforesis, purificación de inmuno-afinidad con anticuerpos específicos para epítopes particulares de los polipéptidos ALK1 y purificación de afinidad con un agente que se enlaza a un dominio fusionado al polipéptido ALK1 (por ejemplo, se puede utilizar la columna de la proteína A para purificar una fusión ALK1-Fc). En una modalidad preferida, el polipéptido ALK1 es una proteína de fusión que contiene un dominio que facilita su purificación. En una modalidad preferida, la purificación es lograda por una serie de pasos de cromatografía de columna, incluyendo, por ejemplo, tres o más de los siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía de sefarosa Q, cromatografía de fenilsefarosa, cromatografía de exclusión por tamaño, y cromatografía de intercambio de cationes. La purificación podría ser contemplada con la filtración viral y el intercambio de regulador.

En otra modalidad, un gen de fusión que codifica una secuencia de purificación líder, tal como una secuencia del sitio de disociación poli-(His)/enterocinasa en la terminal-N de la porción deseada del polipéptido ALK1 recombinante, puede permitir la purificación de la proteína de fusión expresada mediante cromatografía de afinidad utilizando una resina de metal Ni2+. La secuencia líder de purificación entonces puede ser removida posteriormente mediante el tratamiento con enterocinasa para producir el polipéptido ALK1 purificado (por ejemplo, consultar las publicaciones de Hochuli y asociados (1987) en J. Chromatography 411: página 177; y Janknecht y asociados, en PNAS EUA 88: página 8972).

Las técnicas para la elaboración de los genes de fusión son bien conocidas. Esencialmente, la unión de varios fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias de polipéptidos se lleva a cabo de acuerdo con técnicas convencionales, empleando las terminales de extremos romos o extremos escalonados para la ligación, la digestión de la restricción de enzima para producir las terminales apropiadas, el llenado de los extremos cohesivos según sea apropiado, el tratamiento de fosfatasa alcalina para evitar la unión no deseable, y la ligación enzimática. En otra modalidad, el gen de fusión puede ser sintetizado mediante técnicas convencionales que incluyen sintetizadores automáticos de ADN. Alternativamente, la amplificación PCR de los fragmentos del gen pueden llevarse a cabo utilizando cebadores ancla los cuales originan los salientes complementarios entre dos fragmentos del gen consecutivos los cuales pueden ser posteriormente recocidos para generar una secuencia del gen quimérica (ver, por ejemplo, el libro "Protocolos Actuales en Biología Molecular" (Current Protocols in Molecular Biology), eds. Ausubel y asociados, John Wiley & Sons: 1992).

Los ejemplos de las categorías de los compuestos de ácido nucleico que son antagonistas de ALK1, BMP9, BMP10, GDF5, GDF6 o GDF7 incluyen los ácidos nucleicos antisentido, las construcciones de ARNi, y las construcciones de ácido nucleico catalítico. Un compuesto de ácido nucleico puede ser de un solo hilo o de hilo doble. Un compuesto de hilo doble puede incluir también regiones de salientes o de no complementaridad, en donde uno o el otro de los hilos es un solo hilo. Un compuesto de un solo hilo puede Incluir regiones de auto-complementaridad , significando que el compuesto forma la denominada "horquilla" o estructura de "circuito de origen", con una región de estructura helicoidal doble. Un compuesto de ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una región que consiste de más de 1000, no más de 500, no más de 250, no más de 100 o no más de 50, 35, 30, 25, 22, 20 ó 18 nucleótidos de la secuencia de ácido nucleico ALK1 de longitud completa o la secuencia de ácido nucleico del., ligando. La región de complementaridad preferentemente será de por lo menos 8 nucleótidos, y opcionalmente por lo menos 10 o por lo menos 15 nucleótidos, y opcionalmente entre 15 y 25 nucleótidos. Una región de complementaridad puede encontrase dentro de un intrón, una secuencia de codificación o una secuencia que no es de codificación del transcrito objetivo, tal como la porción de secuencia de codificación. Generalmente, un compuesto de ácido nucleico tendrá una longitud de aproximadamente 8 hasta aproximadamente 500 nucleótidos o pares básicos de longitud, y opcionalmente la longitud será de aproximadamente 14 hasta aproximadamente 50 nucleótidos. Un ácido nucleico puede ser un ADN (particularmente para utilizarse como un antisentido), un ARN o híbrido de ARN:ADN. Cualquiera de uno de los hilos puede incluir una mezcla de ADN y ARN, así como las formas modificadas que no pueden ser clasificadas fácilmente como cualquiera de ADN o ARN. De un modo similar, un compuesto de doble hilo puede ser de ADN:ADN, ADN :ARN o ARN : AR , y cualquiera de un hilo puede también incluir una mezcla de ADN y ARN, así como formas modificadas que no pueden ser clasificadas fácilmente como cualquiera de ADN o ARN. Un compuesto de ácido nucleico puede incluir cualquiera de una variedad de modificaciones, incluyendo una o más modificaciones a las estructuras (la porción de azúcar-fosfato en un ácido nucleico natural, que incluye los enlaces de internucleótido) o la porción de base (la porción de purina o pirimidina de un ácido nucleico natural). Un compuesto de ácido nucleico antisentido preferentemente tendrá una longitud de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30 nucleótidos y con frecuencia contendrá una o más modificaciones para mejorar las características tales como la estabilidad en el suero, en una célula o en un lugar en donde el compuesto es probable que sea administrado, tal como el estómago en el caso de los compuestos administrados oralmente o el pulmón para los compuestos inhalados. En el caso de una construcción de ARNi, el hilo complementario al transcrito objetivo generalmente será ARN o modificaciones de los mismos. El otro hilo puede ser ARN, ADN o cualquier variación. La porción dúplex de la construcción de ARNi de "horquilla" de un solo hilo o de hilo doble preferentemente tendrá de 18 a 40 nucleótidos de longitud y opcionalmente de aproximadamente 21 a 23 nucleótidos de longitud, siempre que sirva como un substrato Dicer. Los ácidos nucleicos catalíticos o enzimáticos pueden ser ribozimas o enzimas de ADN y también pueden contener formas modificadas. Los compuestos de ácido nucleico pueden inhibir la expresión del objetivo hasta aproximadamente 50%, 75%, 90% o más cuando se ponen en contacto con células bajo condiciones fisiológicas o en una concentración en donde el control sin sentido o sentido tiene poco o ningún efecto. Las concentraciones preferidas para la prueba del efecto de los compuestos de ácido nucleico son de 1, 5 y 10 micromolares. Los compuestos de ácido nucleico pueden también ser probados por sus efectos en, por ejemplo, la angiogénesis.

Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos DAN, incluyen variantes de DAN de tipo natural, y aquellos que codifican las proteínas de fusión que contienen proteínas DAN que pueden ser generadas y caracterizadas como se describió anteriormente con respecto a los ácidos nucleicos que codifican las proteínas ALK1 ECD. 4. Anticuerpos Otro aspecto de la presente invención pertenece a un anticuerpo reactivo con una porción extracelular de un polipéptido ALK1, preferentemente anticuerpos que son específicamente reactivos con el polipéptido ALK1. En una modalidad preferida, dicho anticuerpo puede interferir con el enlace de ALK1 a un ligando tal como GDF5, GDF6, GDF7 BMP-9 o BMP-10 - quedará entendido que un anticuerpo contra un ligando de ALK1 debe enlazarse a la forma procesada madura de la proteína relevante. La descripción también proporciona anticuerpos que se enlazan a los GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 y/o BMP10 e inhiben el enlace ALK1 a dichos ligandos. Los anticuerpos preferidos exhibirán una actividad anti-angiogénica en un bio-ensayo, tal como un ensayo CAM o un ensayo de microbolsa de la córnea (ver párrafos anteriores).

El término "anticuerpo" como se usa en la presente descripción pretende incluir anticuerpos completos, por ejemplo, de cualquier isotipo (IgG, IgA, IgM, IgE, etc.), e incluye fragmentos o dominios de inmunoglobulinas las cuales son reactivas con el antígeno seleccionado. Los anticuerpos pueden ser fragmentados utilizando técnicas convencionales y los fragmentos seleccionados por utilidad y/o interacción con un epítope de interés específico. Por lo tanto, el término incluye segmentos de porciones preparadas de manera recombinante o disociadas proteolíticamente de una molécula de anticuerpo que tiene la capacidad de reaccionar selectivamente con cierta proteína. Los ejemplos no limitativos de dichos fragmentos proteolíticos y/o recombinantes incluyen Fab, F(ab')2, Fab', Fv, y anticuerpos de una sola cadena (scFv) que contienen un dominio V[L] y/o V[H] unido a un enlazador péptido. El fragmento scFv's puede ser enlazado covalente o no covalentemente para formar anticuerpos que tienen dos o más sitios de enlace. El término anticuerpo también incluye anticuerpos policlonales, monoclonales, u otras preparaciones purificadas de preparaciones de anticuerpos y anticuerpos recombinantes. Los términos "anticuerpo recombinante", significa un anticuerpo, o dominio de enlace del antígeno de una inmunoglobulina, expresada de un ácido nucleico que ha sido construido utilizando las técnicas de biología molecular, tales como un anticuerpo humanizado o un anticuerpo completamente humano desarrollado de un anticuerpo de una sola cadena. Los anticuerpos de un solo dominio y una sola cadena también están incluidos dentro de los términos "anticuerpo recombinante".

Los anticuerpos pueden ser generados por cualquiera de los diferentes métodos conocidos en la técnica, incluyendo la administración del antígeno a un animal, la administración del antígeno a un animal que es el portador de los genes de inmunoglobulina humana, o la selección con un antígeno contra una librería de anticuerpos (con frecuencia anticuerpos de una sola cadena o dominios de anticuerpo). Una vez que es detectada la actividad del enlace del antígeno, las porciones relevantes de la proteína pueden ser injertadas en otras estructuras del anticuerpo, incluyendo las estructuras IgG de longitud completa. Por ejemplo, utilizando los inmunógenos derivados de un polipéptido ALK1 o un ligando ALK1, se pueden hacer anticuerpos antisuero o monoclonales anti-péptidos/anti-proteína mediante protocolos estándar (Ver, por ejemplo, "Anticuerpos: Un Manual de Laboratorio" (Antibodies: A Laboratory Manual) editado por Harlow y Lañe (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Un mamífero, tal como un ratón, un hámster o un conejo pueden ser inmunizados con una forma inmunogénica del péptido (por ejemplo, un polipéptido ALK1 o un fragmento antigénico el cual tiene la capacidad de promover una respuesta del anticuerpo, o una proteína de fusión). Las técnicas para conferir la ¡nmunogenicidad en una proteína o péptido incluyen la conjugación a los portadores y otras técnicas bien conocidas en el arte. Una porción inmunogénica (preferentemente una porción extracelular) del polipéptido ALK1 puede ser administrada en la presencia del adyuvante. El progreso de la inmunización puede ser monitoreado mediante la detección de los títulos de anticuerpo en el plasma o suero. Una prueba de ELISA estándar u otros inmunoensayos se pueden utilizar con los inmunógenos como antígenos para evaluar los niveles de anticuerpos.

Después de la inmunización de un animal con una preparación antigénica de un polipéptido ALK1, el antisuero anti-ALK1 puede ser obtenido, y si se desea, los anticuerpos anti-ALK1 policlonales pueden ser aislados del suero. Para producir anticuerpos monoclonales, las células que producen anticuerpos (linfocitos) pueden ser recolectadas de un animal inmunizado, y fusionadas mediante procedimientos estándar de fusión de células somáticas con células de inmortalización tales como células de mieloma para producir las células de hibridoma. Dichas técnicas son bien conocidas en el arte, e incluyen, por ejemplo, la técnica de hibridoma (originalmente desarrollada por Kohler y Milstein (1975) Nature, 256: páginas 495 a 497), la técnica de hibridoma de célula humana B (Kozbar y asociados (1983) Immunology Today, 4: página 72), y la técnica de hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Colé y asociados (1985) Monoclonal Antibodies y Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., páginas 77 a 96). Las células de hibridoma pueden ser seleccionadas inmunoquímicamente para la producción de anticuerpos específicamente reactivos con un polipéptido ALK1 de mamífero de la presente descripción y anticuerpos monoclonales aislado de un cultivo que comprende dichas células de hibridoma.

El término anticuerpo como se usa en la presente descripción pretende incluir fragmentos de los mismos los cuales también son reactivos específicamente con uno de los polipéptidos ALK1 asunto materia. Los anticuerpos pueden ser fragmentados utilizando técnicas convencionales y los fragmentos seleccionados por su utilidad de la misma manera que se describió anteriormente para los anticuerpos completos. Por ejemplo, los fragmentos F(ab)2 pueden ser generados tratando el anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab)2 resultante puede ser tratado para reducir los puentes de disulfuro para producir los fragmentos Fab. El anticuerpo de la presente descripción pretende además incluir moléculas bi-específicas, de una sola cadena, quiméricas y humanizadas que tienen afinidad para un polipéptido ALK1 conferido por al menos una región CDR del anticuerpo. En modalidades preferidas, el anticuerpo comprende además una etiqueta adherida al mismo y puede ser detectado (por ejemplo, la etiqueta puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, enzima o un co-factor de enzima).

En ciertas modalidades preferidas, un anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo recombinante, particularmente un anticuerpo monoclonal o humanizado o un anticuerpo recombinante completamente humano.

Los términos "específicamente reactivos con" como se utiliza haciendo referencia a un anticuerpo pretende significar, como generalmente se entiende en la técnica, que el anticuerpo es suficientemente selectivo entre el antígeno de interés (por ejemplo, un polipéptido ALK1 o un ligando ALK1) y otros antígenos que no son de interés que el anticuerpo es útil para, cuando menos, detectar la presencia del antígeno de interés en un tipo particular de muestra biológica. En ciertos métodos, el empleo del anticuerpo, pudiera ser deseable un grado más alto de especificidad en el enlace. Por ejemplo, un anticuerpo para utilizarse para detectar una proteína de interés de poca abundancia en la presencia de una o más proteínas de alta abundancia que no son de interés se puede realizar mejor si tiene un grado más alto de selectividad entre el antígeno de interés y otros reactivos cruzados. Los anticuerpos monoclonales generalmente tienen una tendencia mayor (comparada con los anticuerpos policlonales) para discriminar efectivamente entre los antígenos deseados y los polipéptidos de reacción cruzada. Además, un anticuerpo que es efectivo para identificar selectivamente un antígeno de interés en un tipo de muestra biológica (por ejemplo, una muestra de materias fecales) puede no ser tan efectivo para identificar selectivamente el mismo antígeno en un tipo diferente de muestra biológica (por ejemplo, una muestra de sangre). De un modo similar, un anticuerpo que es efectivo para identificar un antígeno de interés en una preparación de proteína purificada que está desprovista de otros contaminantes biológicos puede no ser tan efectivo para identificar un antígeno de interés en una muestra biológica cruda, tal como una muestra de sangre u orina. Por consiguiente, en las modalidades preferidas, la presente solicitud proporciona anticuerpos que han demostrado la especificidad para un antígeno de interés en un tipo de muestra que probablemente sea un tipo de muestra de elección para utilizarse del anticuerpo.

Una característica que influye en la especificidad de la interacción de un anticuerpo:antígeno es la afinidad del anticuerpo para el antígeno. Aunque la especificidad deseada puede ser alcanzada con un rango de diferentes afinidades, los anticuerpos generalmente preferidos tendrán una afinidad (una constante de disociación) de aproximadamente 10~6, 10~7, 10"8, 10"9 o menor. Debido a la afinidad de enlace aparentemente baja del TGF para el ALK1, se espera que muchos anticuerpos anti-ALK1 exhibirán el enlace al ???ß. Sin embargo, el grupo de ligandos GDF5,6,7 se enlazan con un KD de aproximadamente 5 x 10"8 M y los ligandos BMP9.10 se enlazan con un KD de aproximadamente 1 x 10"10 M. Por lo tanto los anticuerpos de afinidad apropiada pueden ser seleccionados para interferir con las actividades de señalización de estos ligandos.

Además, las técnicas utilizadas para seleccionar anticuerpos con el objeto de identificar un anticuerpo deseado pueden influir en las propiedades de los anticuerpos obtenidos. Por ejemplo, un anticuerpo que va a ser utilizado para determinados propósitos terapéuticos, preferentemente podrá tener como objetivo un tipo de célula particular. Por consiguiente, para obtener anticuerpos de este tipo, sería deseable seleccionar anticuerpos que se enlazan a las células que expresan el antígeno de interés (por ejemplo, mediante la clasificación de células de fluorescencia activada). De un modo similar, si un anticuerpo va a ser utilizado para el enlace de un antígeno en solución, puede ser deseable probar el enlace de la solución. Una variedad de técnicas diferentes están disponibles para probar las interacciones de anticuerpo:antígeno para identificar particularmente los anticuerpos deseables. Dichas técnicas incluyen los ensayos de ELISA, los ensayos de enlace de resonancia de plasmón de superficie (por ejemplo, el ensayo de enlace Biacore, Bia-core AB, Uppsala, Suecia), los ensayos de emparedado (por ejemplo, el sistema de cuentas paramagnéticas de IGEN International, Inc., Gaithersburg, Maryland), los western blots, ensayos de inmunoprecipitación e inmunohistoquímica. 5. Alteraciones en anticuerpos y proteínas de fusión Fe La presente solicitud proporciona además anticuerpos, proteínas de fusión ALK1-Fc y proteínas de fusión DAN-Fc con regiones diseñadas y variantes Fe. Dichos anticuerpos y proteínas de fusión Fe pueden ser útiles, por ejemplo, para regular las funciones efectuadoras, tales como citotoxicidad dependiente del antígeno (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Adicionalmente, el ensayo de las modificaciones mejora la estabilidad de los anticuerpos y las proteínas de fusión Fe. Las variantes de la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos y proteínas de fusión Fe son preparadas introduciendo los cambios de nucleótidos adecuados en el ADN, o mediante la síntesis de péptidos. Dichas variantes incluyen, por ejemplo, las eliminaciones de, y/o inserciones en y/o substituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos y las proteínas de fusión Fe aquí descritas. Cualquier combinación de cancelación, inserción, y substitución se hace para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos posteriores a la traducción de los anticuerpos y las proteínas de fusión Fe, tales como el cambio del número o posición de sitios de glucosilación.

Los anticuerpos y las proteínas de fusión Fe con función reducida del efectuador pueden ser producidas introduciendo cambios en la secuencia de aminoácidos, incluyendo, pero sin limitarse a, la mutación Ala-Ala descrita por Bluestone y asociados (consultar los documentos WO 94/28027 y WO 98/47531; y también consultar la publicación de Xu y asociados, 2000 en Cell Immunol 200; páginas 16 a 26). Por lo tanto en ciertas modalidades, los anticuerpos y las proteínas de fusión Fe de la presente descripción con mutaciones dentro de la región constante que incluyen la mutación Ala-Ala pueden ser utilizados para reducir o abulir la función efectuadora. De acuerdo con estas modalidades, los anticuerpos y las proteínas de fusión Fe pueden comprender una mutación a una alanina en la posición 234 o una mutación a una alanina en la posición a 235, o una combinación de las mismas. En una modalidad, el anticuerpo o la proteína de fusión Fe comprende una estructura lgG4, en donde la mutación Ala-Ala describiría una mutación de fenilalanina a alanina en la posición 234 y/o una mutación de leucina a alanina en la posición 235. En otra modalidad, el anticuerpo o la proteína de fusión Fe comprenden una estructura lgG1, en donde la mutación Ala-Ala describiría una mutación de leucina a alanina en la posición 234 y/o una mutación de leucina a alanina en la posición 235. El anticuerpo o la proteína de fusión Fe puede alternativamente o adicionalmente llevar otras mutaciones, incluyendo la mutación de punto K322A en el dominio CH2 (Hezareh y asociados, 2001. J Virol. 75: páginas 12161 a 12168).

En modalidades particulares, los anticuerpos o proteínas de fusión Fe pueden ser modificados ya sea para mejorar o inhibir la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). La actividad modulada de CDC puede ser lograda introduciendo una o más substituciones, inserciones, o eliminaciones de aminoácidos en una región Fe (ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 6,194,551). Alternativamente, o adicionalmente, el residuo de cisteína puede ser introducido en la región Fe, permitiendo de esta manera la formación del enlace disulfuro intercadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico de esta manera generado puede tener una capacidad de internalización mejorada o reducida y/o un exterminio de células portado por el complemento aumentado o disminuido. Ver las publicaciones de Carón y asociados, en J.

Exp Med. 176: páginas 1191 a 1195 (1992) y Shopes, en B. J. Immunoi. 148: páginas 2918 a 2922 (1992), el documento WO 99/51642, la publicación de Duncan & Winter en Nature 322: páginas 738 a 740 (1988); la Patente Norteamericana No. 5,648,260; la Patente Norteamericana No. 5,624,821; y el documento WO 94/29351. 6. Métodos y composiciones para regular la anqioqénesis, la cobertura de pericitos y ciertas enfermedades La presente invención proporciona métodos para inhibir la angiogénesis y/o aumentar la cobertura de pericitos en un mamífero administrando a un sujeto una cantidad efectiva de un polipéptido ALK1 ECD, tal como una proteína de fusión ALK1-Fc, una proteína DAN, tal como una proteína de fusión DAN-Fc, o un anticuerpo aquí descrito, tal como el anticuerpo contra los ligandos GDF5, GDF6, GDF7, BMP9, BMP10, o el ECD de ALK1, o antagonistas de ácido nucleico (por ejemplo, antisentido o siARN) si los hay de los siguientes a los que nos referimos colectivamente como "agentes terapéuticos". Los datos presentados indican específicamente que los agentes terapéuticos anti-angiogénicos aquí descritos pueden ser utilizados para inhibir la angiogénesis en el ojo de un mamífero. Se espera que estos agentes terapéuticos también serán útiles para inhibir la angiogénesis en los huesos y articulaciones, y en tumores, particularmente los tumores asociados con los huesos y articulaciones.

Las enfermedades asociadas con la angiogénesis incluyen, pero no están limitadas a, cáncer dependiente de la angiogénesis, incluyendo, por ejemplo, tumores sólidos, tumores nacidos en la sangre tales como leucemias, y tumores de metástasis; tumores benignos, por ejemplo, hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas, y granulomas piogénicos; artritis reumatoide; psoriasis; rubeosis; el Síndrome de Osier-Webber; angiogénesis del miocardio; neovascularización de placas; telangiectasia; articulaciones hemofílicas; y angiofibroma. En particular, los agentes terapéuticos de polipéptidos de la presente invención son útiles para el tratamiento o prevención del cáncer (tumor), y particularmente los cánceres tales como los conocidos que dependen de los procesos angiogénicos para soportar el crecimiento. A diferencia de la mayor parte de los agentes anti-angiogénicos, los polipéptidos ALK1 ECD afectan la angiogénesis que es estimulada por factores múltiples. Esto es altamente importante en los cánceres, en donde un cáncer frecuentemente adquirirá factores múltiples que soportan la angiogénesis del tumor. Por lo tanto, los agentes terapéuticos aquí descritos serán particularmente efectivos en tratamientos de tumores que son resistentes al tratamiento con un fármaco que tiene como objetivo un solo factor angiogénico (por ejemplo, bevacizumab, el cual tiene como objetivo el VEGF). Como aquí se demostró, una proteína de fusión ALK1-Fc es efectiva para reducir los efectos patológicos de melanomas, cáncer de pulmón, cáncer pancreático (por ejemplo, tumores del tejido endocrino pancreático), mieloma múltiple y cáncer de mama (por ejemplo, cáncer de mama primario y cáncer de mama metastático; receptor de estrógenos positivo (ER+) o receptor de estrógenos negativo (ER-)).

El mieloma múltiple es ampliamente reconocido como un cáncer que incluye un componente angiogénico importante. Por consiguiente, se espera que las proteínas de fusión ALK1-Fc y otros agentes terapéuticos aquí descritos serán útiles para el tratamiento de mieloma múltiple y otros tumores asociados con los huesos. Como aquí se demuestra, los agentes terapéuticos aquí descritos pueden ser utilizados para aliviar el daño a los huesos asociado con el mieloma múltiple, y por lo tanto pueden ser usados para aliviar el daño a los huesos asociados con las metástasis en los huesos de otros tumores, tales como tumores de mama o próstata. Como aquí se ha observado, los ligandos GDF del 5 al 7 son altamente expresados en los huesos, y aunque no deseamos estar limitados por mecanismo alguno particular, la interferencia con estos ligandos puede interrumpir los procesos que son requeridos para el desarrollo del tumor en el hueso.

En ciertas modalidades de dichos métodos, uno o más agentes terapéuticos de polipéptidos pueden ser administrados, juntos (simultáneamente) o en tiempos diferentes (consecutivamente). Además, los agentes terapéuticos de polipéptidos pueden ser administrados con otro tipo de compuestos para el tratamiento del cáncer o para la inhibición de la angiogénesis.

En ciertas modalidades, los métodos asunto materia de la presente descripción pueden ser utilizados solos. Alternativamente, estos métodos pueden se utilizados en combinación con otros métodos terapéuticos anti-cáncer dirigidos al tratamiento o prevención de enfermedades proliferativas (por ejemplo, tumores). Por ejemplo, dichos métodos pueden ser usados en la prevención profiláctica del cáncer, prevención de la recurrencia del cáncer y metástasis después de cirugía, y como un adyuvante de otra terapia de cáncer convencional. La presente invención reconoce que la efectividad de las terapias convencionales del cáncer (por ejemplo, quimioterapia, terapia de radiación, fototerapia, inmunoterapia, y cirugía) pueden ser mejoradas a través del uso del agente terapéutico de polipéptidos asunto materia de la presente invención.

Una amplia adaptación de compuestos convencionales han mostrado que tienen actividades anti-neoplásticas. Estos compuestos han sido utilizados como agentes farmacéuticos en quimioterapia para reducir los tumores sólidos, prevenir metástasis y el crecimiento adicional o disminuir el número de células malignas en enfermedades de leucemia o médula ósea.

Aunque la quimioterapia ha sido efectiva en el tratamiento de varios tipos de malignidades, muchos 'compuestos antineoplásticos inducen efectos laterales no deseables. Se ha mostrado que cuando dos o más tratamientos diferentes son combinados, los tratamientos pueden funcionar sinérgicamente y permitir la reducción de la dosificación de cada uno de los tratamientos, reduciendo de este modo los efectos laterales perjudiciales ejercidos por cada compuesto en dosis más altas. En otros casos, las malignidades que son refractarias al tratamiento pueden responder a una terapia de combinación de dos o más tratamientos diferentes.

Cuando un agente terapéutico de polipéptidos aquí descrito es administrado en combinación con otro agente antineoplástico convencional, ya sea de manera consecutiva o concomitantemente, dichos agentes terapéuticos pueden mejorar el efecto terapéutico del agente anti-neoplástico o superar la resistencia celular a dicho agente anti-neoplástico. Esto permite disminuir la dosificación del agente antineoplástico, reduciendo de este modo los efectos laterales no deseables, y se restaura la efectividad de un agente antineoplástico en las células resistentes.

De acuerdo con la presente invención, los agentes anti-angiogénicos aquí descritos pueden ser utilizados en combinación con otras composiciones y procedimientos para el tratamiento de enfermedades. Por ejemplo, un tumor puede ser tratado convencionalmente con cirugía, radiación o quimioterapia combinados con ei ALK1 o el antagonista del ligando ALK1 y luego el antagonista puede ser posteriormente administrado al paciente para extender la inactividad de las micrometástasis y para estabilizar cualquier tumor primario residual.

Los agentes inhibidores de la angiogénesis también pueden ser administrados profilácticamente a individuos que se conoce que están en un alto riesgo de desarrollar un cáncer nuevo o recurrente. Por consiguiente, un aspecto de la presente invención comprende los métodos para la prevención profiláctica del cáncer en un sujeto, comprendiendo el método la administración al sujeto de una cantidad efectiva de un ALK1 o un antagonista del ligando ALK1 y/o un derivado del mismo, u otro agente inhibidor de angiogénesis de la presente descripción.

Como aquí se ha demostrado, la proteína ALK1-Fc es efectiva para disminuir el fenotipo del modelo múrido de artritis reumatoide. Por consiguiente, los agentes terapéuticos aquí descritos pueden ser utilizados para el tratamiento de la artritis reumatoide y otros tipos de inflamación del hueso o la articulación.

Ciertos procesos fisiológicos normales también están asociados con la angiogénesis, por ejemplo, la ovulación, menstruación, y placentación. Las proteínas que inhiben la angiogénesis de la presente invención son útiles en el tratamiento de la enfermedad de un estímulo excesivo o anormal de las células del endotelio. Estas enfermedades incluyen, pero no están limitadas a, adherencias intestinales, aterosclerosis, escleroderma, y cicatrices hipertróficas, por ejemplo, queloides. También son útiles en el tratamiento de enfermedades que tienen la angiogénesis como una consecuencia patológica tales como la enfermedad de rasguño de gato (Róchele minalia quintosa) y úlceras (Helicobacter pylori).

Las proteínas generales que inhiben la angiogénesis pueden ser utilizadas como un agente de control de la natalidad reduciendo o previniendo la vascularización uterina requerida para la implantación de los embriones. Por lo tanto, la presente invención proporciona un método de control de la natalidad efectivo cuando una cantidad de proteína inhibitoria es suficiente para evitar el implante del embrión que es administrada a una hembra. En un aspecto del método de control de la natalidad, una cantidad de la proteína de inhibición suficiente para bloquear la implantación del embrión es administrada antes o después de la relación sexual y que ha ocurrido la fertilización, proporcionando de esta manera un método efectivo de control de la natalidad, posiblemente un método de "la mañana después". Aunque no queremos estar comprometidos por esta declaración, se considera que la inhibición de la vascularización del endometrio uterino interfiere con el implante de los blastocistos. Una inhibición similar de la vascularización de la mucosa del tubo uterino interfiere con la implantación del blastocisto, evitando la ocurrencia del embarazo tubario. Los métodos de administración pueden incluir, pero no están limitados a, pildoras, inyecciones (intravenosas, subcutáneas, intramusculares), supositorios, esponjas vaginales, tampones vaginales, y aparatos intrauterinos. También se ha considerado que la administración de agentes de inhibición de angiogénesis de la presente invención interferirán con la vascularización aumentada normal de la placenta, y también con el desarrollo de vasos dentro del blastocisto implantado exitosamente y el desarrollo de los embriones y el feto.

En los ojos, la angiogénesis está asociada con, por ejemplo, la retinopatía diabética, retinopatía de premadurez, degeneración macular, rechazo de injerto de córnea, glaucoma neovascular, y fibroplasias retrolentales. Los agentes terapéuticos aquí descritos pueden ser administrados intra-ocularmente o por otro tipo de administración local al ojo. Además, como se muestra en los Ejemplos, la proteína ALK1-Fc puede ser administrada sistémicamente y todavía tiene el efecto deseado en la angiogénesis ocular.

Otras enfermedades asociadas con la angiogénesis en los ojos incluyen, pero no están limitadas a, keratoconjuntivitis epidémica, deficiencia de Vitamina A, sobre-uso de lentes de contacto, keratitis atópica, keratitis límbica superior, keratitis del pterigion sicca, sjogrens, acné rosáceo, filectenulosis, sífilis, infecciones por Micobacterias, degeneración de lípidos, quemaduras químicas, úlceras bacteriales, úlceras micóticas, infecciones de Herpes simplex, infecciones de Herpes zoster, infecciones protozoarias, sarcoma de Kaposi, úlcera de Mooren, degeneración marginal de Terrien, keratolisis marginal, artritis reumatoide, lupus sistémico, poliarteritis, trauma, sarcoidosis de Wegeners, Escleritis, la enfermedad de Steven Johnson, keratotomía radial perifigoide, y rechazo de injerto de córnea, anemia de células inactivas, sarcoides, pseudoxantoma elástico, enfermedad de Paget, oclusión de venas, oclusión de arterias, enfermedad obstructiva de la carótida, uveitis/vitritis crónica, infecciones micobacteriales, enfermedad de Lyme, lupus eritematoso sistémico, retinopatía de premadurez, enfermedad de Eales, enfermedad de Bechet, infecciones que ocasionan la retinitis o coroiditis, histoplasmosis ocular presumida, enfermedad de Best, miopía, fosas ópticas, enfermedad de Stargarts, pars planitis, desprendimiento crónico de la retina, síndrome de hiperviscosidad, toxoplasmosis, traumas y complicaciones posteriores al láser. Otras enfermedades incluyen, pero no están limitadas a, las enfermedades asociadas con la rubeosis (neovascularización del ángulo) y enfermedades ocasionadas por la proliferación anormal del tejido fibrovascuiar o fibroso incluyendo todas las formas de vitreo-retinopatía proliferativa.

Los padecimientos del ojo pueden ser tratados o prevenidos por medio de, por ejemplo, la administración sistémica, tópica, la inyección intra-ocular de un agente terapéutico, o por la inserción de un aparato de liberación sostenida que libera un agente terapéutico. Un agente terapéutico puede ser administrado en un vehículo oftálmico farmacéuticamente aceptable, de modo que el compuesto sea mantenido en contacto con la superficie ocular por un período de tiempo suficiente para permitir que el compuesto penetre en la córnea y la región interna del ojo, como por ejemplo, la cámara interior, la cámara posterior, el cuerpo vitreo, el tumor acuoso, el humo vitreo, la córnea, iris/ciliar, lentes, coroide/retina y esclera. Los vehículos oftálmicos farmacéuticamente aceptables pueden, por ejemplo, ser un ungüento, aceite vegetal o un material de encapsulación. Alternativamente, los agentes terapéuticos de la presente invención pueden ser inyectados directamente en el humor vitreo y acuoso. En una alternativa adicional, los compuestos pueden ser administrados sistémicamente, tal como por medio de una infusión intravenosa o inyección, para el tratamiento del ojo.

Se pueden administrar uno o más agentes terapéuticos. Los métodos de la presente invención también incluyen la co- administración con otros medicamentos que son utilizados para tratar padecimientos del ojo. Cuando se administra más de un agente o una combinación de agentes y medicamentos, la administración puede ocurrir simultáneamente o consecutivamente en el tiempo. Los agentes terapéuticos y/o medicamentos pueden ser administrados por diferentes rutas de administración o con la misma ruta de administración. En una modalidad, el agente terapéutico y el medicamento son administrados juntos en una formulación farmacéutica oftálmica.

En una modalidad, el agente terapéutico es utilizado para tratar una enfermedad asociada con la angiogénesis en el ojo mediante la administración concurrente con otros medicamentos que actúan para bloquear la angiogénesis por medio de mecanismos farmacológicos. Los medicamentos que pueden ser administrados concurrentemente con un agente terapéutico de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, pegaptanib ( acugen™ ), ranibizumab (Lucentis™), Iactato de escualamina (Evizon™), heparinasa, y glucocorticoides (por ejemplo, Triamcinolona). En una modalidad, se proporciona un método para tratar una enfermedad asociada con la angiogénesis que es tratada administrando una formulación farmacéutica oftálmica que contiene por lo menos un agente terapéutico aquí descrito y por lo menos uno de los siguientes medicamentos: pegaptanib (Macugen™), ranibizumab (Lucentis™), Iactato de escualamina (Evizon™), heparinasa, y glucocorticoides (por ejemplo, Triamcinolona). 7. Formulación y Dosis Efectiva Los agentes terapéuticos aquí descritos pueden ser formulados en composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas para utilizarse de acuerdo con la presente descripción pueden ser formuladas de la manera convencional utilizando uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables. Dichas formulaciones generalmente estarán substancialmente libres de pirógenos, en cumplimiento con la mayor parte de los requerimientos regulatorios.

En ciertas modalidades, el método terapéutico de la presente invención incluye la administración sistémica de la composición, o localmente como un implante o aparato. Cuando es administrada, la composición terapéutica para utilizarse en esta invención se encuentra en una forma libre de pirógenos, y una forma fisiológicamente aceptable. Los agentes terapéuticamente útiles que no son los antagonistas de señalización ALK1 que también pueden ser incluidos opcionalmente en la composición como se describió anteriormente, pueden ser administrados simultáneamente o consecutivamente con los compuestos asunto materia (por ejemplo, polipéptidos ALK1 ECD o cualquiera de los anticuerpos aquí descritos) en los métodos aquí descritos.

Generalmente, los agentes terapéuticos de proteínas aquí descritos serán administrados parenteralmente, y particularmente de manera intravenosa o subcutánea. Las composiciones farmacéuticas para la administración parenteral pueden comprender uno o más polipéptidos ALK1 ECD u otros anticuerpos en combinación con una o más soluciones acuosas o no acuosas ¡sotónicas estériles farmacéuticamente aceptables, dispersiones, suspensiones o emulsiones, o polvos estériles los cuales pueden ser reconstituidos en soluciones acuosas o dispersiones estériles inyectables justamente antes de utilizarse, las cuales pueden entonces contener antioxidantes, reguladores, bacterioestatos, solubles los cuales hacen isotónica la formulación con la sangre del receptor pretendido o agentes de suspensión o espesantes. Los ejemplos de los vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden ser empleados en las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilénglicol, polietilénglicol, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez correcta puede ser mantenida, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos.

En una modalidad, los anticuerpos y las proteínas ALK1 ECD aquí descritos son administrados en una formulación farmacéutica oftálmica. En algunas modalidades, la formulación farmacéutica oftálmica es una solución acuosa estéril, preferentemente de una concentración adecuada para inyección, o una pomada o ungüento. Dichas pomadas o ungüentos generalmente comprenden uno o más anticuerpos o proteínas ALK1 ECD aquí descritas disueltas o suspendidas en una base de pomada o ungüento estéril farmacéuticamente aceptable, tal como base de petrolato blanco-aceite mineral. En las composiciones de pomada o ungüento, también se puede incluir lanolina anhidra en la formulación. Preferentemente se les agrega también a dichas composiciones de ungüento timerosal o clorobutanol como agentes antimicrobiales. En una modalidad, la solución acuosa estéril es como se describe en la Patente Norteamericana No. 6,071,958.

La presente invención proporciona formulaciones que pueden ser variadas para incluir ácidos y bases para ajusfar el pH; y agentes de regulación para mantener el pH dentro de un rango estrecho. Se pueden agregar medicamentos adicionales a la formulación. Estos incluyen, pero no están limitados a, pegaptanib, heparinasa, ranibizumab, o glucocorticoides. La formulación farmacéutica oftálmica de acuerdo con la presente invención es preparada mediante manipulación aséptica, o la esterilización es realizada en una etapa de preparación adecuada.

Las composiciones y formulaciones pueden, si se desea, pueden ser presentadas en un paquete o aparato abastecedor el cual puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contienen el ingrediente activo. El paquete puede comprender, por ejemplo, lámina de metal o plástico, tales como burbujas blister. El paquete o aparato abastecedor puede estar acompañado por instrucciones para la administración.

EJEMPLOS: Ejemplo 1: Expresión de proteínas de fusión ALK1-Fc Los solicitantes construyeron una proteína de fusión ALK1 soluble que tiene el dominio extraceluiar de la ALK1 humana fusionada a un Fe humano o ALK1 de ratón fusionado a un dominio Fe múrido con un enlazador mínimo entre ellos. A las construcciones nos referimos como hALK1-Fc y mALK1-Fc, respectivamente.

La proteína hALK1-Fc se muestra como líneas de células CHO purificadas en la figura 3 (SEQ ID NO: 3). De manera notable, aunque la terminal-C convencional del dominio extraceluiar de la proteína ALK1 humana es el aminoácido 118 de la SEQ ID NO: 1, hemos determinado que es deseable evitar tener un dominio que termina en un residuo de glutamina. Por consiguiente, la porción de la SEQ ID NO: 3 que deriva de la ALK1 humana incorpora dos residuos de la term¡nal-C a la Q118, una leucina y una alanina. Por lo tanto la presente invención proporciona polipéptidos ALK1 ECD (que incluyen proteínas de fusión Fe) que tienen una terminal-C de la secuencia derivada de ALK1 que se encuentra en cualquier parte arriba de los aminoácidos del 1 al 5 (del 113 al 117 en relación con la SEQ ID NO: 1) o abajo (del 119 al 123) de la Q118.

Las proteínas hALK1-Fc y mALK1-Fc fueron expresadas en las líneas de células CHO. Se consideraron tres secuencias líder diferentes: (i) Melitina de miel de abeja (HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (SEQ ID NO: 7) (ii) Activador de Plasminógenos de Tejidos (TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQ ID NO: 8) (iii) Natural: MTLGSPRKGLLMLLMALVTQG (SEQ ID NO: 9).

La forma seleccionada emplea un líder TPA y tiene la secuencia de aminoácidos sin procesar mostrada en la figura (SEQ ID NO: 5).

Este polipéptido es codificado por la secuencia de ácido nucleico mostrada en la figura 4 (SEQ ID NO: 4).

La purificación se puede lograr mediante una serie de pasos de cromatografía de columna, incluyendo, por ejemplo, tres o más de los siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía de sefarosa Q, cromatografía de fenilsefarosa, cromatografía de exclusión por tamaño, y cromatografía de intercambio de cationes. La purificación puede ser completada con filtración viral e intercambio de regulador. La proteína hALK1-Fc fue purificada a una pureza de >98% determinada por cromatografía de exclusión por tamaño y >95% determinada por SDS PAGE.

En el curso de la producción y purificación de la proteína, observamos que la proteína hALK1-Fc tiende a ser expresada en una mezcla de dimeros y agregados de un orden superior los cuales, aunque parecen puros bajo la desnaturalización, reduciendo las condiciones (por ejemplo, reduciendo el SDS-PAGE), son problemáticas para la administración a un paciente. Los agregados pueden ser inmunogénicos o biodisponibles de manera deficiente, y debido a su heterogeneidad, estos agregados pueden dificultar caracterizar la preparación farmacéutica en un nivel que sea deseable para el desarrollo de un fármaco. Por lo tanto, se probaron varios métodos para reducir la cantidad del agregado en las preparaciones finales.

En un método, se probaron un número de medios de cultivo de células diferentes. IS CHO-CD (Cat. No. 91119, Irvine Scientific, Santa Ana, CA) mostró una reducción notable en la producción de productos agregados mientras mantiene un alto nivel de producción de la proteína hALK1-Fc. Adicionalmente, la elución del material a partir de la columna de interacción hidrofóbica (por ejemplo, fenilsefarosa) en un pH de 8.0 dio como resultado la resolución adicional del producto agregado. El material resultante comprende más del 99% de dimeros. Una comparación con una proteína de fusión ALK1-Fc comercializada por R&D Systems (cat. no. 370-AL, Minneapolis, MN) muestra que esta proteína, producida en células NSO, tiene el 84% de dímeros, apareciendo la proteína restante como especies de alto peso molecular por la cromatografía de exclusión por tamaño. Una comparación del perfil de la columna de dimensionamiento para la preparación se muestra en la figura 11. Habiendo identificado la formación de agregados como un problema importante en la producción de la proteína ALKI-Fc, se esperaba que se pudieran desarrollar otros métodos, incluyendo métodos que comprendan pasos adicionales de purificación (aunque dichos métodos pueden tener como resultado un rendimiento inferior de la proteína purificada).

Ejemplo 2: Identificación de los ligandos ALK1-Fc ALK1 es uno de los receptores del tipo 1 para miembros de la familia ?T?ß. Una variedad de miembros de la familia TGFp fueron probados por el enlace a una proteína de fusión humana ALK1-Fc, utilizando el sistema Biacore™. El receptor TGFp mismo, y los ligandos GDF8, GDF11, BMP2 y BMP4 todos fallaron en mostrar un enlace substancial a la proteína hALK1-Fe. Los ligandos BMP2 y BMP4 mostraron un enlace limitado. Los ligandos GDF5, GDF7 y BMP9 mostraron un enlace con valores KD de aproximadamente 5 x 10"8 M, 5 x 10~8 M y 1 x 0" 0 M, respectivamente. Basados en la similitud de los ligandos GDF5 y GDF7 al GDF6, se esperaba que el GDF6 se enlazaría con una afinidad similar. El BMP10 está estrechamente relacionado con el BMP9 y también se esperaba que se enlazara con una afinidad similar.

Ejemplo 3: Caracterización de la Proteína ALK1-Fc y Efectos del Anticuerpo anti-ALK1 en las Células del Endotelio Utilizando una construcción reportadora de luciferasa bajo el control de cuatro sitios de consenso SBE consecutivos (SBE4-luc), los cuales responden a la señalización portada por Smadl/5/8, medimos la actividad portada por el B P-9 en presencia o ausencia del fármaco hALK1-Fc o el anticuerpo monoclonal de neutralización específico de ALK1 en las células H VEC. Las células HMVEC fueron estimuladas con rhBMP-9 (50 ng/ml), el cual indujo una activación de transcripción portada por Smadl/5/8, aquí evidenciada por el aumento en la activación de transcripción regulada SBE4-Iuc. Cuando se agregó, el compuesto ALK1-Fc (10 gg/ml) o el anticuerpo (10 g/ml) se disminuyó esta respuesta de transcripción, cada uno cerca del 60%, indicando que la presencia de la proteína ALK1-Fc reduce de manera significativa la señalización del ligando BMP9, y además, que la señalización del ligando BMP9 está relacionada con la actividad de la ALK1.

La activación de la fosforilación SMAD es generalmente utilizada para la activación de los ensayos de receptores de activina ascendente. La ALK1 es conocido que regula la fosforilación de las proteínas SMAD de 1.5 y 8 al momento de la activación por su ligando. En este caso, agregamos rhBMP-9 (50 ng/ml) para iniciar la fosforilación SMAD en las células HUVEC, una línea de células humanas del endotelio que de manera innata expresa el receptor ALK1, en un curso de tiempo de 30 minutos. La fosforilación de SMAD 1/5/8 se dió 5 minutos después del tratamiento de las células con el ligandos y la fosforilación fue mantenida por un período total de 30 minutos, en la presencia de concentraciones relativamente bajas de hALK1 -Fe (250 ng/ml), se redujo la fosforilación de SMAD 1/5/8, confirmando que este agente inhibe la activación de Smad 1/5/8 en las células del endotelio.

Con el fin de evaluar el efecto angiogénico de la proteína ALK1-Fc en un sistema in vitro, ensayamos la efectividad del compuesto para reducir la formación del tubo en las células del endotelio en un substrato de Matrigel. Esta técnica es generalmente utilizada para evaluar la neovascularización, dando resultados tanto rápidos como altamente reproducibles. El Suplemento de Crecimiento de Células del Endotelio (ECGS) es utilizado para inducir la formación de microvasos de las células del endotelio en Matrigel, y la eficacia de los compuestos anti-angiogénicos es entonces registrada como una reducción de la formación del vínculo en la presencia tanto del fármaco como de ECGS en un curso de tiempo de 18 horas. Como se esperaba, la adición de ECGS (200 ng/ml) indujo una formación importante del vínculo, comparada con el control negativo (sin tratamiento agregado), el cual indica los niveles básales de la formación del vínculo de las células del endotelio producidas en el substrato de Matrigel (figura 5). Al momento de la adición de cualquiera de hALK1-Fc (100 ng/ml) o mALK1-Fc (100 ng/ml), la formación del vínculo fue reducida de manera visible. La cuantif icación final de la longitud del vaso en todas las muestras reveló que cada concentración de hALK1-Fc o mALK1-Fc redujo la neovascularlzación a niveles básales. Adicionalmente, hALK1-Fc y mALK1-Fc en la presencia del factor ECGS fuertemente pro-angiogénico se mantuvo una inhibición fuerte de la neovascularlzación demostrando todavía una actividad anti-angiogénica más potente que la endostatina de control negativo (100 ng/ml).

Ejemplo 4: Ensayos CAM Los factores VEGF y FGF es bien conocido que estimulan la angiogénesis. El sistema de ensayo CAM (membrana corioalantoica de pollo) fue utilizado para evaluar los efectos angiogénicos del ligando GDF7. Como se muestra en la figura 6, el ligando GDF7 estimula la angiogénesis con una potencia que es similar a la del factor VEGF. Se observaron resultados similares con los ligandos GDF5 y GDF6.

Las fusiones de ALK1-Fc fueron probadas por su actividad anti-angiogénica en el ensayo CAM. Estas proteínas de fusión mostraron un efecto anti-angiogénico potente en la angiogénesis estimulada por los factores VEGF, FGF y GDF7. Ver figura 7. El BMP9 y el PDGF mostró una capacidad relativamente pobre para inducir la angiogénesis en este ensayo, pero dicho efecto angiogénico de estos factores fue no obstante inhibido por el ALK1.

Las proteínas de fusión ALK1-Fc y el anticuerpo monoclonal anti-angiogénico anti-VEGF que se consiguen comercialmente fueron comparados en el ensayo CAM. Las proteínas de fusión ALK1-Fc tuvieron una potencia similar comparada con el anticuerpo anti-VEGF. El anticuerpo anti-VEGF bevacizumab es actualmente utilizado en el tratamiento del cáncer y la degeneración macular en los humanos. Ver figura 8.

De manera interesante, el anticuerpo anti-ALK1 (R&D Systems) falló para inhibir de manera importante la angiogénesis en este sistema de ensayo. Esperamos que esto pueda reflejar la diferencia en la secuencia de ALK1 en diferentes especies.

Ejemplo 5: ensayo de icrobolsa de Córnea de Ratón El ensayo de microbolsa de córnea de ratón fue utilizado para evaluar los efectos de la proteína ALK1-Fc en la angiogénesis del ojo del ratón. La proteína hALK1-Fc, fue administrada intraperitonealmente, e inhibió de manera importante la angiogénesis ocular. Como se muestra en la figura 9, la proteína hALK1-Fc inhibió la angiogénesis ocular hasta el mismo grado que el anticuerpo anti-VEGF. Los factores hALK1-Fc y anti-VEGF fueron utilizados en dosis de peso/peso idénticas. Se obtuvieron datos similares cuando el tapón de Matrigel impregnado con VEGF fue implantado en un lugar no ocular.

Estos datos demuestran que los ligandos de alta afinidad para el ALK1 promueve la angiogénesis, y que una proteína de fusión ALK1-Fc tiene una actividad anti-angiogénica potente. Los ligandos para ALK1 se encuentran en dos categorías, teniendo el grupo de GDF5, 6, 7 una afinidad intermedia para el receptor ALK1 y teniendo el grupo de BMP9, 10 una afinidad alta para el receptor ALK1.

Los ligandos GDF5, 6 y 7 son localizados principalmente en el hueso y las articulaciones, mientras que el ligando BMP9 es circulado en la sangre. Por lo tanto, parece ser un sistema pro-angiogénico de los huesos y articulaciones que incluye los ligandos ALK1, GDF5, 6 y 7 y un sistema angiogénico sistémico que incluye los ligandos ALK1 y BMP9 (y posiblemente el BMP 10).

Ejemplo 6: Modelo Múrido de Artritis Reumatoide El modelo de artritis inducida por colágeno múrido es un modelo bien aceptable de la artritis reumatoide. En este estudio, se trataron grupos de 10 ratones con vehículo, anti-VEGF (el bevacizumab - como control negativo, debido a que bevacizumab no inhibe el VEGF múrido), o dosis de mALK1 -Fe ("RAP-041") en cantidades de 1 mg/kg, 10 mg/kg o 25 mg/kg. Después del refuerzo de colágeno se tomaron calificaciones artríticas en el día 21 (ver figura 10) y la hinchazón de la pata de manera estable aumentó en todos los grupos, teniendo el pico alrededor del día 38. Los ratones tratados con mALK1-Fc ("RAP-041") mostraron calificaciones reducidas para ambas características, particularmente en la dosis más alta (25 mg/kg), aunque la reducción no logró una importancia estadística. No obstante, es aparente una tendencia relacionada con la dosis.

Para la terminación del estudio en el día 42 la incidencia de la artritis había alcanzado 10/10 en los ratones tratados con el control de vehículo, 9/10 en los ratones tratados con bevacizumab, 8/10 en el grupo tratado con 1 mg/kg de la proteína mALK1-Fc y 9/10 en el grupo tratado con 10 mg/kg de la proteína mALK1-Fc. En el grupo tratado con 25 mg/kg de la proteína mALK1-Fc, la incidencia de la enfermedad fue menor en 6/10.

Ejemplo 7: Características de Enlace del Ligando de la Proteína DAN La proteína DAN es un miembro de una familia de proteínas de nudo de cisteína secretada que inhibe la actividad del BMP. La proteína DAN es sabido que se enlaza a y antagoniza con el ligando GDF5. Nosotros determinamos que la proteína DAN también se enlaza de manera estrecha con el ligando GDF7, pero no con el ligando BMP9. Por lo tanto, concluimos que la proteína DAN inhibe el alojamiento en el hueso y la articulación localizado en los ligandos para ALK1, y las proteínas DAN y se espera que sea un antagonista potente de la angiogénesis relacionada con el hueso y la articulación. Por lo tanto la proteína DAN puede ser útil en el tratamiento de cánceres del hueso, por ejemplo, mieloma múltiple y metástasis de huesos, así como artritis reumatoide y osteoartritis.

Tomados juntos, los descubrimientos aquí descritos en estos Ejemplos proporcionan numerosos reactivos, aquí descritos, para inhibir la angiogénesis ¡n vivo, y particularmente la angiogénesis ocular. Estos descubrimientos indican también que los agentes que tienen por objetivo los ligandos GDF5, 6 y 7 pueden ser utilizados para inhibir selectivamente la angiogénesis del hueso y la articulación. Estos descubrimientos indican además que dichos agentes pueden ser utilizados para tratar cánceres y la artritis reumatoide.

Ejemplo 8: La Proteína ALK -Fc Reduce la Angiogénesis del Tumor en un Ensayo CAM Los tumores, igual que con cualquier tejido, tienen un requerimiento básico de nutrientes y oxígeno. Aunque los tumores pequeños tienen la capacidad de adquirir cantidades adecuadas por medio de la difusión de los vasos sanguíneos vecinos, conforme crece el tamaño del tumor, debe asegurar los nutrientes reclutando y manteniendo los capilares existentes. Con el objeto de probar la capacidad de la proteína ALK1-Fc para limitar el crecimiento del tumor a través de la inhibición del vaso, probamos concentraciones variables de la proteína mALK1-Fc en un ensayo CAM de explante de melanoma. Igual que con los ensayos CAM que se describieron anteriormente, se hicieron pequeñas ventanas en la superficie de cada huevo a través de los cuales fueron implantadas las células del melanoma 5 x 105 B16. Entonces los huevos fueron tratados diariamente con 0.02 mg/ml de mALK1-Fc, 0.2 mg/ml de mALK1-Fc, o dejados sin tratar por un período de una semana. Al final del experimento, los tumores fueron removidos cuidadosamente, pesados y se capturaron imágenes digitales. Los tumores que se originaron de los CAMs tratados con la proteína mALK1-Fc mostraron una disminución de tamaño importante comparados con los tumores CAM sin tratar. La cuantificación del peso del tumor demostró que el peso de los tumores tratados diariamente ya sea con 0.02 mg/ml o 0.2 mg/ml de mALK1 -Fe mostraron una reducción del 65% y 85% comparados con los ratones CAMs sin tratar (figura 6E). En conclusión, la neovascularización y el crecimiento del tumor fue suprimido de manera importante al momento de la adición de la proteína ALK1-Fc de una manera de respuesta a la dosis, indicando que la proteína ALK1-Fc es un agente anti-angiogénico poderoso.

Ejemplo 9: Modelo Experimental del Cáncer de Pulmón Para confirmar adicionalmente los efectos de la proteína ALK1-Fc en el progreso del tumor, se probó el modelo de ratón de cáncer de pulmón. Las células de cáncer de pulmón Lewis múridas marcadas fluorescentemente (LL/2-luc) fueron administradas a 6 ratones Negros a través de la vena de la cola. En el mismo día, comenzó el tratamiento de los ratones ya sea con control PBS (n = 7) o 10 mg/kg de mALK1 -Fe (n = 7) administrado intraperitonealmente. La elaboración de imagen fluorescente en vivo mostró un desarrollo substancial del tumor localizado en los pulmones en los ratones de control, hasta el punto de que los ratones llegaron a quedar moribundos y tuvieron que ser sacrificados en el día 22 posterior al implante. En contraste, los ratones tratados con la proteína ALK1-Fc mostraron un crecimiento reducido substancialmente de los tumores del pulmón y exhibieron una sobrevivencia del 100% para el día 22. Ver figura 12.

Estos datos demuestran que la proteína ALK1-Fc tenía un efecto substancial en el crecimiento del tumor en el modelo del ratón de cáncer de pulmón y proporciona el beneficio de la sobrevivencia.

Ejemplo 10. Efectos de la Proteína ALK1-Fc en un Modelo de Tumor Pancreático En antígeno SV40 grande T es un antígeno que puede ser expresado en una variedad de tejidos diferentes en ratones para estimular la formación de tumores espontáneos, ortotópicos en los ratones. Estos tumores pueden portar un parecido mayor a los tumores que ocurren de manera natural que para los generalmente utilizados en los modelos de xenoinjerto. En los ratones RIPI-Tag2, los ratones son modificados genéticamente para expresar el antígeno T bajo control de un promotor de insulina, de modo que el ratón desarrolla tumores específicamente en el tejido endocrino de páncreas. Probamos los efectos de la proteína ALK1-Fc en los tumores de ratones RIPI-Tag2.

Observamos que el tejido pancreático de los ratones RIPI-Tag2 va a través de una serie de etapas, comenzando con el tejido normal, y luego el cual desarrolla después una apariencia hiperplástica, pasa por la angiogénesis para desarrollar un sistema de nuevos vasos sanguíneos substanciales y finalmente se convierte en un tumor completamente formado. La expresión de los ligandos ALK-1 y BMP9 fue monitoreada en los tejidos en estas diferentes etapas. Los resultados se muestran en la figura 13. La expresión del ligando ALK1 mostró su pico durante la etapa angiogénica de desarrollo, mientras que la expresión del BMP9 aumentó en todo el desarrollo del tumor.

Los ratones RIPI-Tag2 fueron tratados con la proteína mALK1-Fc o Fe de control (300 microgramos por ratón, o simplemente 12 mg/kg, dos veces a la semana durante dos semanas) comenzando en la semana 10 (desarrollo temprano del tumor) o la semana 12 del (desarrollo del tumor maduro). En cualquier caso, el tratamiento con la proteína mALK1-Fc interrumpió de manera esencial el crecimiento del tumor. Ver figura 14. Observar que el volumen del tumor de los ratones tratados a las 10 semanas de edad fallaron para aumentar de 10 semanas a 12 semanas, mientras que los ratones tratados con una proteína de control Fe mostraron un triplicado del volumen del tumor durante el mismo período de tiempo. De un modo similar, el volumen del tumor de los ratones tratados a las 12 semanas de edad falló en aumentar de 12 semanas a 14 semanas, aunque el grupo de control mostró un 30% de aumento adicional en el volumen del tumor.

La tinción fluorescente de los tumores tratados y de control mostró una disminución en la vascularización ocasionada por el tratamiento con la proteína mALK1-Fc, medida por la tinción para CD31, un marcador de las células del endotelio. Figura 15. De manera notable, el tratamiento con la proteína mALK1-Fc ocasionó un aumento en la cobertura de pericitos de la vasculatura del tumor, medido por la proporción de las células NG2 positivas (pericitos) a las células CD31 positivas. Figura 16. Los pericitos son células que forman parte de los vasos sanguíneos y juegan un rol en la regulación de la estabilidad y permeabilidad de los vasos. Los aumentos similares en la cobertura de pericitos fueron observados en respuesta al tratamiento con la proteína ALK1-Fc de los modelos de tumor de xenoinjerto con la línea celular de cáncer del pulmón de célula no pequeña CaLu6.

Colectivamente, estos datos muestran que la proteína ALK -Fc es un inhibidor potente del crecimiento del tumor en los tumores espontáneos, pancreáticos ortotópicos formados en los ratones RIPI-Tag2, y que la inhibición del tumor está correlacionada con una disminución marcada en la vascularización del tumor y un aumento marcado en la cobertura de pericitos de la vasculatura del tumor. La importancia de este último con respecto a la biología del tumor permanece siendo determinada. Sin embargo, deberá observarse que la patología de la retinopatía diabética es ampliamente atribuida a la pérdida de pericitos y a una filtración de fluido de los vasos de la retina diabética. Por lo tanto, estos datos demuestran que la proteína ALK1-Fc puede ser utilizada como un agente anti-tumor/anti-angiogénico, y además, que este agente puede ser utilizado para promover la formación de pericitos en los tejidos vascularizados.

Ejemplo 11. Efectos de la Proteína de Fusión ALK1-Fc en Modelos de Tumor de Cáncer de Mama Las proteínas mALK1-Fc fueron efectivas para demorar el crecimiento de las líneas de células de tumor de cáncer de mama derivadas del receptor de estrogenos positivo (ER+) y las células del tumor del receptor de estrogenos negativo (ER-).

La línea de células de cáncer de mama MDA-MB-231 (derivadas de las células ER-) fue transfectada de manera estable con el gen de luciferasa para permitir la detección ¡n vivo del crecimiento del tumor y las metástasis potenciales. En este estudio, se implantaron 1 x 106 M DA-M B-231 -Luc células ortotópicamente en la grasa mamaria de los ratones rasurados atímicos (Harían). El progreso del tumor fue seguido mediante la detección de la bioluminiscencia utilizando un sistema de elaboración de imagen de Espectro I VI S (Caliper Life Sciences). Un aumento en la luminiscencia (número de fotones detectados) corresponde a un aumento en la carga del tumor.

Treinta ratones hembra rasurados fueron inyectados con 1 x 106 células de tumor en la almohadilla de grasa mamaria. Tres días después del implante del tumor los ratones fueron tratados con ya sea vehículo de control o proteína mALK1-Fc (30 mg/kg) dos veces por semana mediante una inyección subcutánea (SC). El tratamiento continuó y el progreso del tumor fue monitoreado mediante la elaboración de imagen bioluminiscente por 10 semanas. El tratamiento con la proteína mALK1-Fc en una cantidad de 30 mg/kg disminuyó el progreso del tumor determinado por la detección bioluminiscente cuando es comparado con los controles tratados con vehículo (figura 17). El tratamiento con la proteína mALK1-Fc demoró, pero no revirtió el crecimiento del tumor en este modelo. Esto puede ser esperado de un compuesto anti-angiogénico en que los tumores pueden sobrevivir a un cierto tamaño antes de requerir la nueva formación de vasos sanguíneos para soportar el crecimiento continuado. En un experimento similar, la proteína hALK1-Fc produjo efectos similares, pero ligeramente menores en niveles de dosis tan bajas como de 3 mg/kg.

El receptor de estrógenos positivo (ER+), la línea celular que expresa la luciferasa, el MCF-7, fue probado también en un modelo de implante ortotópico. En este modelo, los ratones rasurados hembra son implantados subcutáneamente con un gránulo de liberación lenta de 60 días de 17p-estradiol . Dos días después del implante del gránulo, se implantaron 5 x 106 células de tumor MCF-7 en la almohadilla de grasa mamaria. Los ratones fueron tratados dos veces por semana con la proteína hALK1-Fc en una cantidad de 3, 10 y 30 mg/kg, o vehículo de control, mediante la ruta IP. El progreso del tumor fue seguido mediante la elaboración de imagen bioluminiscente en una base semanal con un elaborador de imagen de Espectro IVIS (Caliper Life Sciences). Los tumores de ratones tratados con vehículo progresaron rápidamente hasta el día 26 del estudio (figura 18). Después del día 26 existieron fluctuaciones en la luminiscencia del tumor hasta la conclusión del estudio en el día 60 (cuando fueron agotados los gránulos de estradiol). Estas fluctuaciones son debidas a una característica común de este modelo en que el crecimiento rápido del tumor puede exceder la respuesta angiogénica de los animales huésped conduciendo a la necrosis del tumor y una caída concomitante en la señal luminiscente. Las células restantes continúan creciendo conduciendo a una señal aumentada. Los ratones tratados con 10 ó 30 mg/kg de la proteína hALK1-Fc pudieron mantener el tamaño del tumor en un nivel constante durante el estudio, comparado con los controles tratados con vehículo, indicando un efecto potente de esta molécula en el crecimiento del tumor.

INCORPORACIÓN COMO REFERENCIA Todas las publicaciones y patentes aquí mencionadas están incorporadas a la presente descripción como referencia en su totalidad como si cada publicación individual o patente fuera indicada específica e individualmente para ser incorporada como referencia, en caso de conflicto, controlará la presente solicitud, incluyendo cualesquiera definiciones en la misma.

EQUIVALENTES Aunque las modalidades específicas de las invenciones del asunto materia aquí descritas explícitamente, la especificación anterior es ilustrativa y no restrictiva. Podrán apreciar los expertos en la técnica muchas variaciones a las invenciones al momento de revisar esta descripción y las reivindicaciones siguientes. El alcance completo de la presente invención deberá ser determinado haciendo referencia a las reivindicaciones, junto con su alcance completo de equivalentes y la descripción, junto con dichas variaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una preparación farmacéutica que comprende una proteína de fusión ALK1-Fc que comprende: un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 97% idéntica a la secuencia de aminoácidos del 22 al 118 de la SEQ ID NO: 1, cuyo polipéptido es fusionado a una porción Fe de una inmunoglobulina, y en donde la proteína de fusión ALK1-Fc se enlaza a los ligandos GDF5, GDF7 y BMP9 con un KD menor de 1 x 10"7 M y se enlaza al receptor TGFp-1 con un KD mayor de 1 x 10"6, y en donde por lo menos el 90% de la proteína de fusión ALKI-Fc está presente en una forma dimérica.

2. La preparación farmacéutica tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la porción Fe de la proteína de fusión ALK1-Fc es una porción FC de una lgG1 humana.

3. La preparación farmacéutica tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína de fusión ALKI-Fc comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.

4. La preparación farmacéutica tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína de fusión ALKI-Fc es producida mediante la expresión del ácido nucleico de la SEQ ID NO: 4 en una línea de células de mamífero.

5. La preparación farmacéutica tal y como se describe en la reivindicación 4, caracterizada porque la proteína de fusión ALKI-Fc es producida mediante la expresión del ácido nucleico de la SEQ ID NO: 4 en una línea de células de Ovario de Hámster Chino (CHO).

6. La preparación farmacéutica tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la preparación farmacéutica es una preparación farmacéutica que es adecuada para la administración al ojo.

7. La preparación farmacéutica tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6, caracterizada porque por lo menos el 95% de la proteína de fusión ALK1-Fc está presente en una forma dimérica.

8. La preparación farmacéutica tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6, caracterizada porque por lo menos el 99% de la proteína de fusión ALK1-Fc está presente en una forma dimérica.

9. Un método para inhibir la angiogénesis en un mamífero que lo necesita, comprendiendo el método la administración al mamífero de una cantidad efectiva de una preparación farmacéutica tal y como se describe en la reivindicación 1. 10. Un método para el tratamiento de un tumor en un mamífero que lo necesita, comprendiendo el método la administración al mamífero de una cantidad efectiva de una preparación farmacéutica tal y como se describe en la reivindicación 1. 11. Un método para el tratamiento de una enfermedad ocular asociada con la angiogénesis en un mamífero que lo necesita, comprendiendo el método la administración al mamífero de una cantidad efectiva de una preparación farmacéutica tal y como se describe en la reivindicación 1. 12. Un método de tratamiento de la artritis reumatoide en un mamífero que lo necesita, comprendiendo el método, la administración al mamífero de una cantidad efectiva de la preparación farmacéutica tal y como se describe en la reivindicación 1. 13. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 9 a la 12, caracterizado porque el método comprende además la administración de un segundo agente que inhibe la angiogénesis. 14. Un método para promover un aumento en la cobertura de pericitos en un tejido vascularizado de un mamífero que lo necesita, comprendiendo el método la administración al mamífero de una cantidad efectiva de una proteína ALK1 ECD. 15. El método tal y como se describe en la reivindicación 14, caracterizado porque la proteína ALK1 ECD es una proteína de fusión ALK1 -Fe. 16. El método tal y como se describe en la reivindicación 15, caracterizado porque la proteína de fusión ALK1-Fc comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos del 22 al 118 de la SEQ ID NO: 1, cuyo polipéptido es y es fusionada a una porción Fe de una inmunoglobulina, y en donde la proteína de fusión ALK1-Fc se enlaza al receptor TGF -1 con un KD mayor de 1 x 10"6. 17. El método tal y como se describe en la reivindicación 14, caracterizado porque la proteína ALK1 ECD se enlaza a uno o más ligandos de ALK1 seleccionados del grupo consistente de ligandos: GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 y BMP10. 18. El método tal y como se describe en la reivindicación 14, caracterizado porque el polipéptido ALK1 ECD comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos del 34 al 95 de la SEQ ID NO:1. 19. El método tal y como se describe en la reivindicación 14, caracterizado porque el polipéptido ALK1 ECD comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que híbrida bajo condiciones de hibridación severas a los nucleótidos del 100 al 285 de la SEQ ID NO:2 o una variante de los nucleótidos del 100 al 285 de la SEQ ID NO:2 que codifica la misma secuencia de aminoácidos. 20. El método tal y como se describe en la reivindicación 15, caracterizado porque la proteína de fusión ALK1-Fc tiene una secuencia de la SEQ ID NO:3. 21. El método tal y como se describe en la reivindicación 15, caracterizado porque la proteína de fusión ALK1-Fc es administrada en una preparación farmacéutica en donde por lo menos el 90% de la proteína de fusión ALK1-Fc se encuentra en una forma dimérica. 22. El método tal y como se describe en la reivindicación 14, caracterizado porque la proteína de fusión ALK1 ECD es administrada de manera intravenosa o localmente al ojo. 23. El método tal y como se describe en la reivindicación 14, caracterizado porque el método comprende además administrar un segundo agente que inhibe la angiogénesis. 24. El método tal y como se describe en la reivindicación 14, caracterizado porque el tejido vascularizado es seleccionado del grupo consistente de: el ojo de un mamífero, un tumor, un hueso, y una articulación. 25. El método tal y como se describe en la reivindicación 14, caracterizado porque el mamífero tiene retinopatía diabética u otra enfermedad de la retina caracterizada por la pérdida de cobertura de pericitos en la vasculatura retinal. 26. El método tal y como se describe en la reivindicación 14, caracterizado porque el mamífero tiene un tumor seleccionado del grupo consistente de: melanoma, tumor de pulmón, mieloma múltiple y cáncer de mama. 27. El método tal y como se describe en la reivindicación 14, caracterizado porque el mamífero tiene un tumor pancreático. 28. El método tal y como se describe en la reivindicación 27, caracterizado porque el mamífero tiene un tumor del tejido pancreático endocrino. 29. Un método para promover un aumento en la cobertura de pericitos en un tejido vascularizado de un mamífero que lo necesita, comprendiendo el método la administración al mamífero de una cantidad efectiva de un anticuerpo que se enlaza a un polipéptido ALK1 que consiste de los aminoácidos del 22 al 118 de la SEQ ID NO:1 e inhibe el enlace de por lo menos un ligando ALK1 seleccionado del grupo consistente de ligandos: GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 y BMP10. 30. El método tal y como se describe en la reivindicación 29, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza al polipéptido ALK1 con un KD menor de 5 x 1 O"8 M. 31. El método tal y como se describe en la reivindicación 29, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza al polipéptido ALK1 con un KD menor de 1 x 10~10 M. 32. El método tal y como se describe en la reivindicación 29, caracterizado porque el anticuerpo inhibe el enlace del ALK1 al ligando ALK1 , en donde el ligando ALK1 es seleccionado del grupo consistente de ligandos: BMP9 y BMP10. 33. El método tal y como se describe en la reivindicación 29, caracterizado porque el anticuerpo es administrado de manera intravenosa. 34. El método tal y como se describe en la reivindicación 29, caracterizado porque el método comprende además la administración de un segundo agente que inhibe la angiogénesis. 35. El método tal y como se describe en la reivindicación 29, caracterizado porque el tejido vascularizado es seleccionado del grupo consistente de: el ojo del mamífero, un tumor, un hueso y una articulación. 36. El método tal y como se describe en la reivindicación 29, caracterizado porque el mamífero tiene retinopatía diabética u otra enfermedad de la retina caracterizada por la pérdida de la cobertura de pericito en la vasculatura de la retina. 37. El método tal y como se describe en la reivindicación 29, caracterizado porque el mamífero tiene un tumor seleccionado del grupo consistente de: melanoma, un tumor de pulmón, mieloma múltiple, y cáncer de mama. 38. El método tal y como se describe en la reivindicación 29, caracterizado porque el mamífero tiene un tumor pancreático. 39. El método tal y como se describe en la reivindicación 38, caracterizado porque el mamífero tiene un tumor del tejido pancreático endocrino. 40. Un método para el tratamiento de un tumor en un mamífero, comprendiendo el método, la administración al mamífero que tiene un tumor de una cantidad efectiva de un agente seleccionado del grupo consistente de: (a) una proteína ALK1 ECD; (b) un anticuerpo que se enlaza a un ligando ALK1 e inhibe el enlace del ligando ALK1 al ALK1, y en donde el ligando ALK1 es seleccionado del grupo consistente de ligandos: GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 y BMP10; (c) un anticuerpo que se enlaza a un polipéptido ALK1 que consiste de los aminoácidos del 22 al 118 de la SEQ ID NO:1 e inhibe el enlace de por lo menos un ligando ALK1 seleccionado del grupo consistente de ligandos: GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 y BMP10; y (d) un polipéptido DAN, caracterizado porque el tumor es seleccionado del grupo consistente de: melanoma, mieloma múltiple, un tumor asociado con los huesos, un tumor que ha formado metástasis en los huesos, un tumor de pulmón, un tumor pancreático y un tumor de mama. 41. El método tal y como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque la proteína ALK-1 ECD es una proteína de fusión ALK1-Fc. 42. El método tal y como se describe en la reivindicación 41, caracterizado porque la proteína de fusión ALK1-Fc comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a la secuencia de los aminoácidos del 22 al 118 de la SEQ ID NO:1, cuyo polipéptido es fusionado a una porción Fe de una inmunoglobulina, y en donde la proteína de fusión ALK1-Fc se enlaza al receptor ?GFß-^ con un KD mayor de 1 x 10"6. 43. El método tal y como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque la proteína ALK1 ECD se enlaza a uno o más ligandos ALK1 seleccionado del grupo consistente de ligandos: GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 y BMP10. 44. El método tal y como se describe en la reivindicación 41, caracterizado porque la proteína de fusión ALK1-Fc tiene una secuencia de la SEQ ID NO:3. 45. El método tal y como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque el polipéptido ALK1 ECD comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos del 34 al 95 de la SEQ ID NO:1. 46. El método tal y como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque el polipéptido ALK1 ECD comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que híbrida bajo condiciones de hibridación severas a los nucleótidos del 100 al 285 de la SEQ ID NO:2 o una variante de los nucleótidos del 100 al 285 de la SEQ ID NO:2 que tiene la misma secuencia de codificación. 47. El método tal y como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque el anticuerpo de (b) se enlaza al polipéptido ALK1 con un KD menor de 5 x 1 O"8 M. 48. El método tal y como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque el anticuerpo de (b) se enlaza al polipéptido ALK1 con un KD menor de 1 x 10"10 . 49. El método tal y como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque el anticuerpo de (b) inhibe la angiogénesis estimulada por al menos un ligando de ALK1 seleccionado del grupo consistente del ligando: GDF5, GDF6 y GDF7. 50. El método tal y como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque el anticuerpo de (b) inhibe el enlace de la ALK1 a un ligando ALK1, caracterizado porque el ligando ALK1 es seleccionado del grupo consistente de ligandos: BMP9 y BMP10. 51. El método tal y como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque el anticuerpo de (c) inhibe la angiogénesis estimulada por al menos un ligando de ALK1 seleccionado del grupo consistente de ligandos GDF5, GDF6 y GDF7. 52. El método tal y como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque el anticuerpo de (c) inhibe la angiogénesis estimulada por al menos un ligando ALK1 seleccionado del grupo consistente de ligandos BMP9 y BMP10. 53. El método tal y como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque la proteína DAN es una proteína de fusión DAN-Fc. 54. El método tal y como se describe en la reivindicación 53, caracterizado porque la proteína de fusión DAN-Fc comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que es por lo menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos del 21 al 125 de la SEQ ID NO:10, cuyo polipéptido es fusionado a una porción Fe de una inmunoglobulina, y en donde la proteína de fusión ALK1-Fc se enlaza al receptor TGFP- con un KD menor de 1 x 10~6. 55. El método tal y como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque la proteína DAN se enlaza a uno o más ligandos ALK1 seleccionado del grupo consistente de Iigandos: GDF5, GDF6 y GDF7. 56. El método tal y como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque la proteína DAN comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos del 17 al 180 de la SEQ ID NO:10. 57. El método tal y como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque la proteína DAN comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que híbrida bajo condiciones de hibridación severas a los nucleótidos 153 a 467 de la SEQ ID NO:11 o una variante de los nucleótidos del 153 a 467 de la SEQ ID NO:11 que tiene la misma secuencia de codificación. 58. El método tal y como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque el agente es administrado por ruta intravenosa. 59. El método tal y como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque el método comprende además la 5 administración de un segundo agente que inhibe la angiogénesis. 60. El método tal y como se describe en la reivindicación 10, caracterizado porque el tumor es seleccionado del grupo consistente de: melanoma, tumor de pulmón, mieloma múltiple,

10. tumor pancreático, y cáncer de mama.