CN102451474A - 一种miRNA的抗肿瘤作用、实施方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种miRNA的抗肿瘤作用、实施方法及用途，属于生物医学材料技术领域。具体涉及miR-99a在抑制肝癌生长中的用途和应用方法。本发明的miR-99a在肝癌中表达显著低于正常肝组织；此外，本发明的miR-99a在体外、体内均能够抑制肝癌细胞的生长。可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。尤其用于制备预防或治疗肝癌的药物。

Description

一种miRNA的抗肿瘤作用、实施方法及用途

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及一种RNA小分子——miR-99a的抗肿瘤作用、实施方法及用途。

背景技术

微小RNA(micro RNA，简称miRNA)是一类短序列、非编码、具有调控功能的单链小分子RNA，长约18～24nt。关于miRNA的最早报道是1993年Lee等报道的在秀丽线虫(C.elegants)体内发现的一种呈时间特异性表达的小分子RNA，即可调节线虫发育的lin-4【Lee，R.C.等，The C.elegans heterochronic genelin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.Cell.1993，75：843-854】。2000年，Reinhart等【Reinhart，B.J.等，The 21-nucleotide let-7 RNAregulates developmental timing in Caenorhabditis elegans.Nature.2000，403：901-906】又发现不同时期表达的let-7。到目前，公用miRNA数据库中已收录了数百种人类miRNA序列，其中三分之二已被实验证实。

微小RNA来源于长度约为1000bp的长链RNA初始转录产物(Pri-miRNA)，Pri-miRNA分子在细胞核中经Drosha酶剪切形成长度约60～80nt的具有茎环结构的miRNA前体(Pre-miRNA)。miRNA前体转运至胞质后，被进一步加工成miRNA。

微小RNA在动植物细胞中通过对目标mRNA的切割和转录抑制发挥重要作用，参与细胞生长、组织分化和肿瘤形成等多种过程。miRNA在物种间具有高度的保守性、时续性和组织特异性。目前认为miRNA在细胞凋亡、增殖、分化、血管生成及肿瘤形成等方面均具有重要的调节作用，参与人体大约30％的基因调节，与肿瘤、心血管疾病、肝病、免疫紊乱及代谢紊乱等多种发病有关。

在上述疾病中，miRNA与肿瘤的关系是很多研究的重点。已经发现若干miRNA通过负调控基因的表达与慢性淋巴细胞性白血病、肺癌、乳腺癌、结肠癌高度相关。miRNA的正调控靶基因现象是最近的发现，具体机制还不明确。

有学者提出了“癌microRNA”(OncomiRs)”的观点【Esquela-Kerscher，A.等，Oncomirs-microRNAs with a role in cancer.Nat Rev Cancer.2006，6：259-269；Hammond，SM.等，MicroRNAs as oncogenes.Curr Opin Genet.2006，16：4-9】，即认为某些miRNA的异常表达在肿瘤的发生发展过程中充当了类似癌基因的角色。

miRNA的表达主要由miRNA基因首先表达为miRNA前体(pri-miRNA)，pri-miRNA经转运出核后，由Dicer酶剪切成为pre-miRNA，pre-miRNA表现为典型的茎环结构，茎部序列不完全互补配对。其茎部序列经剪切后成为成熟体miRNA从而发挥生物学功能。

miR-99a位于人基因组的21q21位。根据已有文献报道，miR-99a在舌鳞状细胞癌【Wong TS等，Mature miR-184 as potential oncogenic microRNA ofsquamous cell carcinoma of tongue.Clinical Cancer Research.2008，14：2588-2592.】，儿童肾上腺皮质瘤【Doghman M等，Regulation of Insulin-likeGrowth Factor-Mammalian Target of Rapamycin Signaling by MicroRNA inChildhood Adrenocortical Tumors.Cancer Research.2010，70：4666-4675.】、暴露于香烟烟雾的大鼠肺中【Izzotti A等，Downregulation of microRNAexpression in the lungs of rats exposed to cigarette smoke.Faseb Journal.2009，23：806-812.】下降。miR-99a在HCMV感染MRC-5(人胎肺细胞)后下降并抑制HCMV的增殖。【Wang FZ等，Human cytomegalovirus infection alters the expression ofcellular microRNA species that affect its replication.J Virol.2008，82(18)：9065-74.】。另有报道表明miR-99a/let-7c/miR-125b基因簇在肺癌中易丢失【George Adrian Calin等，Human microRNA genes are frequently located atfragile sites and genomic regions involved in cancers.PNAS.2004，101(9)：2999-3004.】，说明miR-99a可能参与了肿瘤的发生发展。然而，本领域中尚无关于miR-99a在肝癌中的作用的报道。

肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一，其造成了诸多患者和家庭的痛苦，也给医疗卫生系统带来了极大的压力。目前虽然已开发和应用了多种肿瘤治疗的药物和方法，但本领域仍然迫切需要开发出可有效地治疗和预防肿瘤的新型药物。

以原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)为例，其是我国常见的恶性肿瘤，患者死亡率在所有恶性肿瘤中居第三位。根据世界卫生组织的统计，全球每年新增约60万HCC患者，而每年死于肝癌的人数也约为60万。HCC的发生是一个多步骤渐进的过程，和慢性肝炎及肝硬化紧密相关。我国约有1.2亿乙肝病毒携带者，占全球感染人数的1/3。因此，如何有效的干预HCC的发生并治疗HCC患者是一个紧迫的重要问题。目前，HCC患者在手术或药物治疗后的转移复发比例依然很高，5年存活率仅约为50％。因此，探求HCC的发病机制并寻求有效的治疗靶点十分重要。

近年来，随着miRNA功能研究的不断深入，miRNA在肝癌发生发展过程中的作用也逐渐为研究者所关注。自2006年Murakami等【Murakami，Y.等，Comprehensive analysis of microRNA expression patterns in hepatocellularcarcinoma and non-tumorous tissues.Oncogene.2006，25：2537-45】首次报道miRNA在正常肝脏和HCC中的表达差异以来，已有多篇文献报道了HCC中异常表达的miRNA。

例如，对HCC组织miRNA表达谱进行基因芯片研究发现，肝癌组织中miR-222、miR-221和miR-31上调，miR-223、miR-126和miR-122a下调【Wong，QW.等，MicroRNA-223 is commonly repressed in hepatocellular carcinoma andpotentiates expression of Stathminl.Gastroenterology.2008；135：257-269】。对52例肝癌前和HCC患者进行研究发现，miR-122、miR-10和miR-10a在肝癌中表达上调，miR-145下降【Varnholt，H.等，MicroRNA gene expression profile ofhepatitis C virus associated hepatocellular carcinoma.Hepatology.2008；47：1223-1232】。

对肝硬化患者的肝组织miRNA情况也开展了研究，发现肝硬化发病与miRNA表达异常有关，而且是发生肝癌的重要参考指标，研究者还对人肝癌标本进行了研究，发现miR-21和miR-301在肝癌中表达明显，且与预后有关【Jiang，J.等，Association of MicroRNA expressionin hepatocellular carcinomas withhepatitis infection，cirrhosis，and patient survival.Clin Cancer Res.2008；14：419-427】。

基于上述研究，有学者认为miRNA是肝癌诊断和治疗研究的重要靶点【Ji，J.等，New kids on the block：diagnostic and prognostic microRNAs inhepatocellular carcinoma.Cancer Br.2009；8：1686-1693】。

总体来说，与HCC癌旁组织相比，在HCC中表达上调的miRNA有：miR-1、miR-21、miR-221、miR-222、miR-224和miR-301等，在HCC中表达下调的miRNA有：let-7a、miR-101、miR-122、miR-125a、miR-139a、miR-143、miR-195、miR-26和miR-29等。

然而，本领域中已知的miRNA种类繁多，功能各异，要从中筛选出与肿瘤相关的miRNA存在较大的难度。目前尚无miR-99a在肝癌中作用的研究报道。

综上所述，本领域中迫切需要开发出可有效针对肝癌诊断和治疗的抗肿瘤天然免疫剂。

发明内容

本发明正是从数百种已知的miRNA中筛选出了肿瘤(尤其是肝癌)表达相关性及其对肝癌生长的具有调控作用的miRNA--miR-99a，由此本发明提供了miR-99a有效抗肿瘤的新用途。

在本发明的第一方面中，提供了微小RNA miR-99a或其前体在制备预防或治疗肝癌的组合物中的应用。

在本发明的一个实施方式中，所述miR-99a的序列如SEQ ID NO：1所示。

在本发明的另一个实施方式中，所述miR-99a的前体在对象体内经加工转化为miR-99a。

在本发明的另一个实施方式中，所述miR-99a或其前体来自：人、大鼠、小鼠、犬、马、牛、兔或猴。

在一个优选例中，所述肝癌选自：原发性肝癌、肝细胞癌、胆管细胞癌、转移性肝癌、或继发性肝癌，优选原发性肝癌，更优选原发性肝细胞癌。

在本发明的另一个实施方式中，所述组合物是药物组合物或疫苗组合物。

在本发明的第二方面中，提供了一种组合物，所述组合物包含：(a)有效量的微小RNA miR-99a或其前体；和(b)药学上或免疫学上可接受的载体。

在一个优选例中，组分(a)的含量占组合物总重量的0.001～99.9wt％，优选1～95wt％，更优选5～90wt％。

在本发明的一个实施方式中，所述组合物还包含治疗或预防肿瘤(优选肝癌)的其它活性成分。

在一个优选例中，所述治疗或预防肿瘤(优选肝癌)的其它活性成分包括：化疗剂或放疗剂。

在一个优选例中，所述其它活性成分选自：烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、植物类抗癌药、激素、或免疫制剂，优选：细胞有丝分裂抑制剂、喜树碱、高三尖杉酯碱、丙卡巴肼、门冬酰胺酶、顺铂、卡铂、米托蒽醌、他莫昔芬、环磷酰胺、盐酸氮芥、洛莫司汀、司莫司汀、塞替派、白消安、氮甲、苯丁酸氮芥、氟尿嘧啶、喃氟啶、优氟啶、卡莫氟、巯嘌呤、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、环胞苷、巯鸟嘌呤、六甲蜜胺、羟基脲、丝裂霉素、阿霉素、表柔比星、博莱霉素、培莱霉素、阿伐司汀、赫赛汀、格列卫、吉西他滨、托泊替康和/或亮丙瑞林。

在另一个优选例中，所述细胞有丝分裂抑制剂选自：长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、秋水仙胺、秋水仙碱、秋水仙酰胺、鬼臼毒素、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇或多西他赛。

在本发明的另一个实施方式中，所述组合物的形式适于：直接裸RNA注射法、脂质体包裹RNA直接注射法、金包被RNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒RNA法或复制缺陷腺病毒携带目的RNA法。

在本发明的另一方面中，提供了一种预防和/或治疗肿瘤的方法，所述方法包括：给予需要预防和/或治疗的对象有效量的微小RNA miR-99a或其前体。

在一个优选例中，所述微小RNA miR-99a或其前体是通过如下方法给予对象的：直接裸DNA注射法、脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法或复制缺陷腺病毒携带目的DNA法。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1：HCC中miR-99a表达水平与患者生存时间之间的关系。其中，图1A为无瘤生存时间的Kaplan-Meier生存曲线；图1B为总体生存时间的Kaplan-Meier生存曲线(P值使用SPSS 17.0中的log-rank test计算)。

图2：miR-99a对HCC细胞系HepG2、SMMC-7721、Huh7增殖的影响。其中，图2A和图2B为EdU检测结果，图2C为MTT检测结果(结果显示为平均值±标准差(n＝4)；*，P＜0.05；**，P＜0.01)。

图3：miR-99a对HCC细胞系HepG2、SMMC-7721、Huh7细胞周期(G1期)的阻滞作用。其中，图3A为各细胞系在所示时间点的细胞周期分析图，同步化后的释放时间点记为0h；图3B为细胞同步化释放后3h(HepG2和SMMC7721)或9小时(Huh7)时，各细胞系不同处理的G1期细胞比例的统计(结果显示为平均值±标准差(n＝4)；*，P＜0.05；**，P＜0.01)。

图4：miR-99a对HCC细胞系HepG2、SMMC-7721、Huh7克隆形成能力的降低作用。

图5：瘤内注射miR-99a后，miR-99a在SMMC-LTNM肿瘤中的表达情况的qRT-PCR检测(**，P＜0.01)。

图6：瘤内注射miR-99a后对肿瘤生长的影响。其中，图6A为剥离的肿瘤图片；图6B为肿瘤生长曲线；图6C为血清AFP含量(结果显示平均值±标准差(n＝8)；*，P＜0.05；**，P＜0.01)。

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究发现：HCC患者的肿瘤组织中微小RNAmiR-99a的表达会显著下调，且下调的幅度与患者的生存时间存在相关性，其低表达与患者的预后差显著相关，从而证实了miR-99a在肿瘤进展和患者预后中起重要作用。发明人在此基础上进行进一步的研究发现：miR-99a可在体、内外有效抑制肿瘤细胞的繁殖和生长，从而发挥抗肿瘤的作用。由此，发明人发现了miR-99a在抗肿瘤中的新用途，从而在此基础上完成了本发明。

如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，“分离的”或“分离纯化的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

本发明提到的特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

miR-99a及其前体

如本文所用，术语“miR-99a”或“微小RNA miR-99a”可互换使用，是指包含SEQ ID NO：1所示序列或其同源序列的微小RNA。本领域中已知各种来源的miR-99a，例如人、黑猩猩、马、鸡等，这些同源序列均包含在本发明的术语“miR-99a”中。本发明的术语中还包含上述天然存在的miR-99a序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，或经过生物学化学修饰，且仍然具有抗肿瘤活性的衍生RNA。

如本文所用，术语“miR-99a前体”是指在被施予对象的细胞内或体内可被加工成为miR-99a的miRNA前体。本领域普通技术人员知晓获得天然存在的miR-99a前体的方法和手段，也可基于分子和遗传学理论和手段构建所述前体，例如【Doghman M等，Regulation of Insulin-like Growth Factor-MammalianTarget of Rapamycin Signaling by MicroRNA in Childhood AdrenocorticalTumors.Cancer Research.2010，70：4666-4675】。

本领域中已知miR-99a编码基因的初始转录产物经过一系列的加工成熟之后，形成成熟的miR-99a。miR-99a前体只有在加工成成熟的miR-99a后才具有相应的生物学功能，因此，本领域普通技术人员可合理预期利用miR-99a的成熟序列及能够产生或加工成为miR-99a的各种其它形式的核酸物质(即本发明所述的“miR-99a前体”)均可获得本发明所需获得的效果，即起到抗肿瘤的效果，从而均可用于制备治疗或预防肿瘤的组合物。

本发明还包括一种载体，它含有携带所述miRNA或其前体的构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的构建物或表达载体。这些方法包括但不限于：基因重组技术、体外合成技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

组合物

本发明还提供了一种组合物(尤其是药物组合物或疫苗组合物)，所述的组合物可用于预防和/或治疗肿瘤、及由其引起的相关症状和疾病。所述组合物含有有效量的本发明的miR-99a以及药学上或免疫学上可接受的载体。

所述“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

所述“药学上/免疫学上可接受的载体”指用于治疗剂或疫苗给药的载体，包括各种赋形剂、稀释剂和佐剂。该术语指这样一些药剂或疫苗载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。

这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物/疫苗制剂应与给药方式相匹配，例如，本发明的组合物可以用生理盐水或含有葡萄糖和其它辅剂的水溶液通过常规方法进行制备，以制得针剂形式。所述组合物宜在无菌条件下制造。本发明的制剂还可制成缓释制剂。

本发明的miR-99a的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：miR-99a的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。

当本发明的miR-99a或其前体以适当剂量给予对象时可获得令人满意的效果。例如，当本发明的miR-99a或其前体，每天以约2.5-25nmol/20g(优选的为20nmol/20g)动物(如小鼠)体重的剂量给予动物时，可获得令人满意的抗肿瘤效果。

给药方式

本发明的组合物，可以为固态(如颗粒剂、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌下含片)或液态(如口服液)或其它合适的形状。

给药途径可采用例如(但不限于)：(1)直接裸RNA注射法；(2)脂质体包裹RNA直接注射法；(3)金包被RNA基因枪轰击法；(4)繁殖缺陷细菌携带质粒RNA法；(5)复制缺陷腺病毒携带目的RNA法；(6)电打孔法，等等。

此外，本发明的组合物中还可含有用于改善和/或治疗肿瘤的其它活性物质，所述的其它活性物质选自下组(包括但不限于)：临床常用抗肿瘤药物(包括但不限于)：化疗剂或放疗剂，优选烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、植物类抗癌药、激素、或免疫制剂，更优选细胞有丝分裂抑制剂、喜树碱、高三尖杉酯碱、丙卡巴肼、门冬酰胺酶、顺铂、卡铂、米托蒽醌、他莫昔芬、环磷酰胺、盐酸氮芥、洛莫司汀、司莫司汀、塞替派、白消安、氮甲、苯丁酸氮芥、氟尿嘧啶、喃氟啶、优氟啶、卡莫氟、巯嘌呤、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、环胞苷、巯鸟嘌呤、六甲蜜胺、羟基脲、丝裂霉素、阿霉素、表柔比星、博莱霉素、培莱霉素、阿伐司汀、赫赛汀、格列卫、吉西他滨、托泊替康和/或亮丙瑞林。

本发明的miR-99a还可以与其它药物和治疗手段(例如手术疗法)联合，用于肿瘤的预防和治疗。

本发明的优点

本发明的优点主要在于：

(a)本发明揭示了miR-99a在预防和/或治疗肝癌中的新用途，为miR-99a、乃至miRNA的研究和开发利用提供了新的思路和途径；

(b)本发明的miR-99a或其前体可有效用于抗肝癌，从而为本领域提供了一种新颖的肝癌发生诊断剂和/或治疗剂，具有一定的临床应用前景。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1：miR-99a表达量与HCC的关系

采用实时定量反转录PCR(qRT-PCR)方法对2002至2006年收集的共142例HCC患者的HCC组织与癌旁组织(来自东方肝胆医院标本库)中miR-99a的表达进行了分析。

采用TRIzol(Invitrogen公司)抽提组织总RNA。qRT-PCR使用SYBR RT-PCR试剂盒(Takara公司)，在LightCycler1.5(Roche公司)实时定量PCR仪上完成。

miR-99a反转录引物为：

5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAG-3′(SEQ ID NO：2)；

定量PCR引物：

5′-GCAACCCGTAGATCCGAT-3′(上游，SEQ ID NO：3)和

5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′(下游，SEQ ID NO：4)；

内参U6小核RNA的反转录反应引物与其定量PCR的下游引物相同，序列为：

5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’(SEQ ID NO：5)；

定量PCR引物：

5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’(上游，SEQ ID NO：6)；和

5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’(下游，同上SEQ ID NO：5)。

miRNA的相对定量使用2^-ΔΔCt法计算(U6为内参)【Livak，KJ.等，Analysisof relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCtmethod.Methods.2001；25：402-408】。

qRT-PCR结果显示，miR-99a在约87％的HCC癌旁组织中有所下降(结果未显示)。对miR-99a的低表达与患者生存时间的性关性进行分析，P值使用SPSS17.0中的log-rank test计算，结果分别如图1A和图1B所示。

通过试验结果发现：miR-99a的低表达与患者更短的无瘤生存时间和总体生存时间显著相关。

对影响HCC预后的危险因素进行Cox回归分析，危害比(95％可信区间)和P值使用SPSS 17.0中的单因素和多因素Cox回归分析计算。

结果如表1所示。

表1影响HCC患者预后危险因素的单因素和多因素Cox回归分析

通过单因素和多因素分析发现，miR-99a的低表达是一个显著独立的预测HCC患者较低无瘤生存时间的危险因素。

实施例2：miR-99a体外抑制HCC细胞的生长

分别采用如下序列(由上海吉玛公司合成)在人HCC细胞系Hep3B细胞中使得miR-99a高表达：

miR-99a：AACCCGUAGAUCCGAUCUUGUG(SEQ ID NO：1)

对照RNA：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT(SEQ ID NO：7，3′端加TT突出是小RNA序列合成中常用的修饰方法，对其功能没有影响，主要是起到稳定核苷酸的作用【Wilda，M.等，Killing of leukemic cells with a BCR/ABL fusion geneby RNA interference(RNAi).Oncogene.2002；21：5176-5124】)。

人HCC细胞系HepG2、SMMC7721、Huh7细胞购自上海生化细胞所。使用INTERFERin转染试剂(Polyplus公司)转染小RNA，miR-99a转染终浓度为50nM，对照RNA转染浓度为50nM，步骤按说明书标准步骤操作。

EdU检测：将2×10⁴个细胞分别铺入24孔板并培养过夜，次日转染对照RNA或miR-99a，并于转染后72小时检测。首先，弃去培养上清，换入500μl含EdU50uM(RiboBio公司)的新鲜培养基；然后37℃孵育2小时，流式细胞仪检测。

细胞增殖检测：细胞的体外增殖使用MTT法检测。5×10³个细胞分别铺入96孔板并培养过夜，次日转染对照RNA或miR-99a，并于转染后0、24、48、72小时检测。首先，弃去培养上清，换入100μl含MTT 0.5mg/ml(Sigma公司)的新鲜培养基；然后37℃孵育4小时；最后换入100μl DMSO(Sigma公司)并振荡10分钟。最终吸光度使用570nm波长检测。

细胞周期检测：使用流式细胞术检测细胞周期。上述各细胞转染72小时后，收取细胞并PB S洗涤一遍，随后使用75％的乙醇4℃固定1小时。固定后的细胞使用PBS洗三遍，并加入1ml含40μg碘化丙啶(Sigma公司)和100μg RNA酶A(Sigma公司)的PBS。最后使用FACS Calibur流式细胞仪检测细胞周期。

软琼脂克隆形成：上述各细胞转染24小时后，收取细胞，各取1×10⁴个用0.3％低熔点软琼脂(Lonza公司)重悬，铺入预铺0.6％低熔点软琼脂的六孔板。10天后检测克隆形成数。

转染miR-99a后影响HCC细胞增殖的结果如图2所示，影响HCC细胞周期的结果如图3所示，影响HCC细胞克隆形成的结果如图4所示。

结果显示：在HCC细胞系中，高表达miR-99a能够抑制细胞增殖、抑制细胞周期和克隆形成。

实施例3：miR-99a在裸鼠人肝癌荷瘤模型SMMC-LTNM中表达降低

按照文献方法构建人原代HCC组织皮下荷瘤裸鼠模型SMMC-LTNM【Tao，WZ.等，The tumor invasion and metastasis in the transplantation of transplantedhuman hepatocellular carcinoma into nude mice abdominal cavity and orthotopichepatic tissue.Dier Junyi Daxue Xuebao.1998；19：54-56】。根据文献报道，与常规使用的HCC细胞系构建的裸鼠荷瘤模型相比，SMMC-LTNM与人HCC的临床进展更为相似，它能够发生局部侵袭和其它器官的转移，此外还能大量分泌甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)。

利用实施例1所述qRT-PCR方法对人正常肝脏组织(来自东方肝胆医院标本库)和SMMC-LTNM肿瘤中miR-99a的表达情况进行检测，结果显示miR-99a在SMMC-LTNM肿瘤中表达量显著降低(结果未示出)。

实施例4：miR-99a抑制HCC细胞在体内的生长

利用人原代HCC组织皮下荷瘤裸鼠模型SMMC-LTNM观察miR-99a的体内抑瘤效果。

胆固醇偶联的miR-99a及胆固醇偶联的对照RNA(即SEQ ID NO：7所示的RNA)均由广州锐博公司合成(胆固醇偶联后可的miRNA可自主通过细胞膜进入细胞内，转染效率较高【Wolfrum，C.等，Mechanisms and optimization of in vivodelivery of lipophilic siRNAs.Nat Biotechnol.2007；25：1149-1157.】)。体内转染RNA时，将10nmol(0.1ml)胆固醇偶联的miR-99a(或胆固醇偶联的对照RNA)直接瘤内注射，每三天注射一次，持续注射两周。

利用实施例1所述qRT-PCR方法对人正常肝脏组织和SMMC-LTNM肿瘤中miR-99a的表达情况进行检测。肿瘤体积的计算按文献操作【Qi，R.等，Notch1signaling inhibits growth of human hepatocellular carcinoma through induction ofcell cycle arrest and apoptosis.Cancer Res.2003；63：8323-8329】。血清AFP的测定使用AFP ELISA试剂盒(购自Autobio公司)。

miR-99a瘤内注射后SMMC-LTNM肿瘤中miR-99a的表达情况如图5所示。结果显示：通过瘤内注射胆固醇偶联的miR-99a后，miR-99a在SMMC-LTNM肿瘤中的表达显著增高。

miR-99a体内对肿瘤细胞生长和血清AFP含量作用试验结果如图6所示。结果显示：瘤内注射胆固醇偶联的miR-99a显著抑制了肿瘤的生长和血清AFP的含量。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.微小RNA miR-99a或其前体在制备预防或治疗肝癌的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miR-99a的序列如SEQ IDNO：1所示。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miR-99a的前体在对象体内经加工转化为miR-99a。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miR-99a或其前体来自：人、大鼠、小鼠、犬、马、牛、兔或猴。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肝癌选自：原发性肝癌、肝细胞癌、胆管细胞癌、转移性肝癌、或继发性肝癌。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物是药物组合物或疫苗组合物。

7.一种组合物，所述组合物包含：(a)有效量的微小RNA miR-99a或其前体；和(b)药学上或免疫学上可接受的载体。

8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含治疗或预防肿瘤的其它活性成分。

9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述治疗或预防肿瘤的其它活性成分包括：化疗剂或放疗剂。

10.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述组合物的形式适于：直接裸RNA注射法、脂质体包裹RNA直接注射法、金包被RNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒RNA法或复制缺陷腺病毒携带目的RNA法。

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