CN104645351A - hsa-miR-487a在制备治疗或术后预防肝癌的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种hsa-miR-487a在制备治疗或术后预防肝癌的药物中的用途。本发明通过研究首次证实名为hsa-miR-487a的miRNA在肝癌中存在高表达，利用该RNA的这一特性，采用hsa-miR-487a探针预测患者术后预后，便于后期个体治疗的采用。

Description

hsa-miR-487a在制备治疗或术后预防肝癌的药物中的用途

技术领域

本发明涉及一种内源性的非编码小miRNAs、包含其的药物组合物，以及其用于治疗或术后预防肝癌的新用途，特别地，涉及一种hsa-miR-487a用于治疗或术后预防肝癌药物中的用途。

背景技术

众所周知，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC，简称肝癌)是全球男性第五大常见肿瘤，具有预后恶劣、死亡率高等特点，严重威胁我国人民的生命与健康。如2008年世界新增肝癌病例为7483万人，而同年肝癌死亡病例高达到6959万人，其发病率与死亡率几近1:1。尽管近年来随着影像诊断与手术技术的不断进步以及以索拉非尼为代表的肝癌靶向治疗药物的面世，为肝癌的早期诊断与治疗提供了可能与更多且更有效的治疗选择，使肝癌的治疗水平得到了一定的提高。

然而，综观目前肝癌临床治疗现状，肝癌术后复发转移率仍高居不下，术后5年生存率仍徘徊在30％上下，严重的制约了肝癌总体治疗水平的提高，无法使之得到根本性的改善。究其原因就是尚未完全弄清楚肝癌发生、发展与侵袭转移的确切机制。这严重制约了对肝癌进展过程的理解和对新的治疗肝癌药物的研发。因此，如何深入研究探讨HCC发生、发展与侵袭转移的机制已成为现今HCC研究领域中的一个十分重要科学问题。

微小RNA(microRNAs，简称miRNAs)是一类长度约为20～24nt，有显著生物学意义的内源性非编码蛋白质的单链小RNA分子。miRNA于基因转录后阶段发挥相应的调控作用。据已有文献估计，miRNA能够对体内约1/3的蛋白合成起到调控作用，miRNAs可广泛参与不同生理及病理过程的调节，如发育、凋亡、分化、增殖、代谢、应激等。

鉴于miRNA常常定位于染色体易于丢失、重排、扩增的脆点，致使miRNA定位的染色体脆点部分易于出现缺失、重排、扩增，进而导致miRNA表达出现异常，并直接导致细胞增殖、分化、转移、凋亡等功能也随之发生异常改变，诱使肿瘤细胞的出现。miRNA强大的功能及特殊的生成、调控方式已经吸引了众多学者的关注，目前大量研究已证明miRNA在肿瘤的发生、增殖、分化、侵袭、转移、凋亡方面均发挥重要的作用，在肿瘤的诊断、预后评估、治疗等领域开始崭露头角。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明人通过研究发现了与肝癌侵袭转移和肝癌增殖过程密切相关的分子机制，并利用在该分子机制中起关键作用的小分子RNA——hsa-miR-487a的表达量的变化和作用通路，提供了用于治疗肝癌的药物组合物。

根据本发明的一个方面，提供了一种药物组合物，其包含小分子核酸hsa-miR-487a。

进一步地，小分子核酸hsa-miR-487a与递送载体相连接后用于药物组合物中。

进步一地，递送载体为吗啉代核酸。

根据本发明的另一方面，还提供了一种小分子核酸hsa-miR-487a在制备治疗或术后预防肝癌的药物中的应用。

进步一地，应用包括将小分子核酸hsa-miR-487a与递送载体连接后用于药物中。

进步一地，递送载体为吗啉代核酸。

进步一地，药物为用于肝癌的生长期或肝癌转移期的药物。

进步一地，含有小分子核酸hsa-miR-487a的肝癌诊断试剂盒。

根据本发明的另一方面，还提供了一种用于检测肝癌的试剂盒，试剂盒包括小分子核酸hsa-miR-487a。

本发明具有以下有益效果：

1.本发明通过研究首次证实hsa-miR-487a的作用通路，及其具有可促进肝癌细胞的侵袭转移与增殖的作用的特性。利用该特性，将具有该结构的miRNA与现有的药物载体相结合，给药后，该药物能有效抑制动物体内该基因的表达，从而抑制肝癌细胞的增殖和转移，从而达到提高肝癌患者预后的目的。

2.本发明提供的hsa-miR-487a的应用包括了对于肝癌的治疗或术后预防。

3.本发明通过研究首次证实名为hsa-miR-487a的miRNA在肝癌中存在高表达，利用该RNA的这一特性，可以用于制备检测潜在肝癌患者的试剂盒。

除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出肝细胞癌芯片结果示意图；

图2示入选550例患者的纳入排除及分组过程的流程示意图；

图3示hsa-miR-487a在肝细胞癌中的表达水平，其中图A与图B分别示训练队列和验证队列中肝癌hsa-miR-487a的表达水平，红线示癌组织中hsa-miR-487a高于癌旁组织2倍水平，在两个队列中分别有85/132与43/66例样本中癌组织hsa-miR-487a表达水平高于癌旁组织两 倍以上；图C示在两个队列中，统计显示癌组织中hsa-miR-487a表达水平均显著高于癌旁组织；图D示在两个队列肝细胞癌的三种亚型中，hsa-miR-487a在高转移潜能的亚型NHCC中表达显著高于低转移潜能的SHCC与SLHCC组；

图4示肝癌组织与癌旁组织中hsa-miR-487a表达水平。采用原位杂交技术检测肝癌组织石蜡固定切片中hsa-miR-487a表达水平。图A示阴性对照原位杂交探针Scramble结果图，图B示作为内参及阳性对照的原位杂交探针U6结果图，图C示采用hsa-miR-487a探针检测检测样本中hsa-miR-487a表达水平。图片中蓝色为原位杂交探针阳性颗粒，红色为核固红非特异性核染料。图中可见hsa-miR-487a在肝癌组织中表达显著高于癌旁组织，两者之间可看到显著的分界线；

图5示正常肝细胞系与肝癌细胞系中hsa-miR-487a表达水平。采用realtime-PCR检测原代肝细胞系(PHH)，正常肝细胞系(L02)与肝癌细胞系(HepG2，PLC，Bel7402，MHCC97-L，SMMC7721，Huh7，Hep3B，MHCC97-H，HCCLM3)细胞系中hsa-miR-487a的表达水平。hsa-miR-487a在肝癌细胞系中表达均高于正常肝细胞系；

图6示肝癌组织中高表达hsa-miR-487a的患者往往具有相对差的总体生存率与无病生存率。图A与图B分别示意训练队列与验证队列中hsa-miR-487a高低表达组中总体生存率和无病生存率。hsa-miR-487a低表达组中患者具有较好的术后总体生存率与无病生存率；

图7示采用慢病毒感染肝癌细胞系感染效率。亮视野(Brightfield)示光镜下所见，绿色荧光(GFP)示同视野下成功被感染慢病毒的细胞。叠加图(Merge)则是将亮视野与绿色荧光图叠加后所获得的图片，可清晰看出镜下已成功感染病毒与未感染病毒的细胞；

图8示采用慢病毒感染肝癌细胞系后其中hsa-miR-487a的表达水平。图A示空白的HCCLM3细胞系(untreated)和HCCLM3细胞系感染hsa-miR-487a干预病毒(Anti-hsa-miR-487a)或阴性对照病毒(Negative control，NC)后其中hsa-miR-487a表达水平。图B示空白的HepG2细胞系(untreated)和HepG2细胞系感染hsa-miR-487a过表达病毒(hsa-miR-487a)或阴性对照病毒(Negative control，NC)后其中hsa-miR-487a表达水平；

图9示hsa-miR-487a具有促进肝癌细胞的增殖的作用。图A示7天细胞增殖曲线，可见干预hsa-miR-487a表达后(Anti-hsa-miR-487a)可抑制肝癌细胞系HCCLM3的增殖能力，而过表达hsa-miR-487a后可促进肝癌细胞系HepG2的增殖能力。图B左图示克隆形成试验结果，右图示克隆数目统计，干预hsa-miR-487a表达后细胞克隆形成能力下降，过表达hsa-miR-487a表达后细胞克隆形成能力增强。图C左图示细胞周期结果图，右图示结果统计图，统计结果示hsa-miR-487a能够促进细胞由G0/G1期进入G2/M期；

图10示采用Edu染料标记增殖细胞证实hsa-miR-487a促进肝癌细胞的增殖。图AHoechest33342为细胞核染料，标记所有细胞细胞核为蓝色。Edu为胸腺嘧啶类似物，标记处于增殖周期的细胞系为红色。Overlay示将Hoechest33342与Edu图叠加，红色细胞为处于增殖期细胞，蓝色为处于静息期的细胞。图B为图A中各组中处于增殖期的细胞占细胞总数的比例；

图11示hsa-miR-487a具有促进肝癌细胞的转移与迁移能力的作用。图A示hsa-miR-487a促进肝癌细胞的转移能力。左图示Transwell结果，右图示统计结果。图B示hsa-miR-487a促进肝癌细胞的迁移能力。左图示划痕愈合结果，右图示统计结果；

图12示体内抑制hsa-miR-487a可减少体内抑制肿瘤的生长与肺部转移。图A左侧示将各肝癌细胞系注射到不同裸鼠皮下，一个月后处死切取同等大小瘤块种植在另一只裸鼠肝脏中，再一月后处死取样本照片。右侧示各组肿瘤大小统计。可见抑制hsa-miR-487a可减少肝癌瘤块的生长速度，而过表达hsa-miR-487a则加速其生长速度。图B示裸鼠肺组织石蜡固定切片后进行苏木精-伊红染色法染色代表图。图中可见hsa-miR-487a相对高表达组肺组织中出现了更多的转移结节。图C示各组中出现肝内转移的裸鼠比例。图D示各组中出现肺内转移的裸鼠比例；

图13示组织中hsa-miR-487a与ki67表达有关。采用免疫组织化学检测裸鼠肿瘤中细胞增殖能力标志物Ki67的表达水平。图A，B示裸鼠HCCLM3组与HepG2组肝癌组织中ki67的表达水平。图B示人的高表达hsa-miR-487a与低表达hsa-miR-487a的肝癌组织中ki67表达水平。

图14示Vivo-Morpholino分子结构示意图。Morpholino分子交由Gene Tool公司合成(该公司官网为：http://www.gene-tools.com/)图中分子结构示意图为Vivo-Morpholino结构，其中决定Morpholino功能的为图中B标记的碱基序列；

图15示Morpholino-Anti-hsa-miR-487a抑制肝内肿瘤增殖与肺转移。采用Luciferase标记的HCC建立原位成瘤模型，在裸鼠原位成瘤模型建立以后，Morpholino-Anti-hsa-miR-487a与其对照Morpholino-Control经过尾静脉注射每周两次，每周进行活体荧光检测一次，6周后处死收取样本。图A示6周时各组活体荧光检测结果。图中可见Morpholino-Control组中荧光显著强于Morpholino-Anti-hsa-miR-487a组。图B示各组每周活体荧光检测肿块光子流量(Total Flux)，其值高低代表肿块的大小。图C左图示图A中裸鼠肝脏组织与肿瘤组织，图C右图示肿瘤体积统计图。图中可见Morpholino-Control组中肿块大小明显大于Morpholino-Anti-hsa-miR-487a组。图D左图示图A中裸鼠肺组织活体荧光成像结果图，右图为各组肺中出现转移的裸鼠数统计图。图中可见Morpholino-Control组中肺转移数目明显多于Morpholino-Anti-hsa-miR-487a组。图E示各组裸鼠肺组织石蜡固定后切片，采用苏木精-伊红染色法染色结果图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。

本文中吗啉代核酸为Vivo-Morpholino递送载体。本文中hsa-miR-487a为人源性的。

概述

在下面具体的实施例中，首先在实施例1中通过对从中南大学湘雅医院纳入30例在湘雅 医院行肝细胞癌手术切除的肝癌组织通过Exiqon公司的芯片分析三种参见癌组织中及癌旁组织中的miRNAs表达谱。从该表达谱中如图1所示，挑选出在3种肝癌亚型(SHCC，SLHCC，NHCC)中均为高表达的hsa-miR-487a进行后续的研究。在实施例2中，对从中南大学湘雅医院纳入的多例行肝切除肿块的患者的对新鲜的肝癌组织及相应的邻近非瘤肝组织，分别对该肝组织进行突光实时定量PCR检测和原位杂交实验，所得结果列于图3～5中。可发现在实施例1中所得分析结果与对病患肝癌组织统计结果相同。均证实了hsa-miR-487a在各型肝癌细胞和患者组织中均为高表达。

实施例3通过对肝癌患者术后各项指标进行统计，发现患者术后组织中hsa-miR-487a高表达者的预后较差，而hsa-miR-487a低表达者则预后各项指标较好。充分说明了hsa-miR-487a能反映出肝癌患者预后康复效果，是否存在癌细胞转移或再生的可能。所得结果列于图6和表格1～7中。实施例4对hsa-miR-487a进行各项体外实验，以进一步证实其所具有的对肝癌的增殖抑制和转移抑制作用。结果列于图7～11中。在以上实验结果的支持下，对hsa-miR-487a进行体内实验。实验过程及所得结果如实施例5所示。实施例5中通过将hsa-miR-487a结合至vivo-Morpholino上，结合后的结构如图14所示。图14中hsa-miR-487a中的n＝23。通过动物实验发现，以此方式给药后，能有效的抑制癌细胞在肝脏内再次增殖或转移至其他组织中，能用于肝癌早、中和晚期的各项治疗中，尤其能起到抑制肝癌细胞的生长和转移。提高术后的康复，防止肝癌复发。同时通过实施例6，采用常规方法将hsa-miR-487a制成试剂盒，可以将其用于检测术后病人或潜在肝癌患者是否存在该基因的高表达，以检测出病人是否已患肝癌。也可用于检测术后病人是否肝癌复发和/或肝癌转移。

本发明的一方面提供了一种药物组合物，其中含有小分子核酸hsa-miR-487a。通过上述实施例中的各项实验可知，小分子核酸hsa-miR-487a具有抑制肝癌细胞增殖和转移的作用。当将hsa-miR-487a与适当的载体相结合后，即可作用于动物体，进而发挥对肝癌的治疗效果。显然hsa-miR-487a也可加入其他具有治疗肝癌作用的药物中，起到增加其疗效或协同其发挥疗效的作用。hsa-miR-487a的给药方式以能使其发挥抑制肝癌细胞增殖和转移的效果即可。hsa-miR-487a可以与任何常用的基因给药载体相结合，从而对患者体内肝癌细胞的生长此时抑制作用。

小分子核酸hsa-miR-487a具有SEQ ID NO:1所示的序列。

优选的递送载体为吗啉代核酸。以该载体进行给药在实施例5中已经证明对动物体具有抑制转移和增殖的作用。

本发明的另一方面还提供了一种小分子核酸hsa-miR-487a在制备治疗肝癌的药物中的应用。在上述实施例中可知hsa-miR-487a会在肝癌患者组织或肝癌细胞中存在高表达。这种高表达，可以用于制备具有检测作用的试剂盒。该试剂盒可以通过对人体组织进行检测，通过PCR扩增该组织，以获取其中hsa-miR-487a的表达量，从而确定提供该受试样品的人体是否存在肝癌。从而提高肝癌早期的筛查，以利于病患能尽早得到治疗，以免延误病情。当然该应用也包含含hsa-miR-487a基团或其部分基团的药物，给药后，达到抑制肝癌细胞增殖或转移的作用，从而达到治疗肝癌的作用的应用。

优选的小分子核酸hsa-miR-487a具有SEQ ID NO:1所示的序列。该序列的核酸，检测效果较准确。

更优选的小分子核酸hsa-miR-487a被制成与递送载体相连接的药物。通过载体给药为核酸给药的常规方法，该给药方式可以为病毒载体、胆固醇、壳聚糖或脂质体。优选为纳米粒子级的给药载体。更优选为吗啉代核酸。此时给药后疗效稳定。

小分子核酸hsa-miR-487a在治疗药物中的应用中所得的药物，可以用于治疗以下病例：肝癌的生长期或肝癌转移期。此处的肝癌生长期包括肝癌发病的早期、中期和晚期。肝癌转移期指肝癌发生转移的时期，该期包括肝癌在生长期中的任何一期中发生的转移。

hsa-miR-487a还可用于预防术后肝癌复发和转移的预防中。通过人体给药，可以有效的抑制试验动物体内hsa-miR-487a的表达，从而达到抑制肝癌复发和转移的作用。可参见实施例5。

实施例

以下各实施例中所用试剂的配方可参看miRCURY-LNA-microRNA-ISH-Optimization-Kit-manual.pdf第14-15页Table2和Table3。

以下各实施例中，患者纳入均照此进行。从中南大学湘雅医院2003年1月至2013年12月的550例行肝肿块切除的患者被纳入，其中32例患者术后病检证实为胆管癌排除，54例证实为血管瘤被排除，剩余444例肝细胞癌患者根据其手术时间在2008年1月前与2008年1与月后分为两组数据，预期采用200例患者进行研究，根据2:1比例抽取样本进入训练队列(Training cohort)与验证队列(Validation cohort).其中训练队列最终女入患者132例，验证队列纳入患者66例。

Edu细胞增殖试验通过采用Edu试剂盒中所附说明书中的具体操作步骤进行。

Vivo-Morpholino合成和Vivo-Morpholino设计与合成过程可参考参考文献部分的相关文献中所公开的内容。

本发明中所采用的hsa-miR-487a并抑制其作用的Morpholino序列为：Morpholino-Anti-hsa-miR-487a:GATGTCCCTGTATGATTCGTCAT。

hsa-miR-487a单独序列如SEQ ID NO.1所示。hsa-miR-487a错配对照序列为：Morpholino-Control:GtTcTCCgTGTATcATTCcTCAT如SEQ ID NO.2所示(为便于区分将错配碱基以小写字母示出，实为大写字母)。通过对比SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2可发现，仅改变几个碱基序列后，所得miR就不具有本发明提供的各种作用和性能。

以下研究中以hsa-miR-487a错配RNA(SEQ ID NO.2)为训练队列，以便通过近似的碱基序列说明hsa-miR-487a(SEQ ID NO.1)具有的效果。Morpholino-Anti-hsa-miR-487a分子量为9580OD:467.82。

实施例1

芯片筛选

首先采用Exiqon公司的miRCURYTM Array microarray kit V8.0芯片对30例在湘雅医院行肝细胞癌手术切除的肝癌组织进行分析，分别检测孤立性大肝癌(SLHCC)、小肝癌(SHCC)和结节性肝癌(NHCC)的癌组织与癌旁组织中的miRNAs表达谱。通过对比不同肝癌亚型的miRNA表达谱，发现了大量在癌与癌旁及在不同亚型肝癌和癌旁中差异表达的miRNAs谱。其中hsa-miR-487a在肝癌组织中表达较癌旁组织高，且其表达水平在高侵袭转移亚型NHCC中高表达，而转移能力较弱的SLHCC与SHCC，结果参见图1。采用miRNA芯片技术筛选发现hsa-miR-487a在3种肝癌亚型(SHCC，SLHCC，NHCC)中均为高表达，在转移性较强的肝癌亚型NHCC中表达明显较其他两组高。SHCC，小肝癌(肿瘤大小<5cm)。SLHCC，孤立性大肝癌(肿瘤大小≥5cm，单个肿瘤结节)NHCC，结节性肝癌(肿瘤结节数≥2)。

实施例2

对新鲜的肝癌组织及相应的邻近非瘤肝组织(Adjacent nontuinorous liver tissue，ANLT，距肿块边缘1.0cm)用于miRNA表达水平的突光实时定量PCR检测。在这120例新鲜肝癌标本中包括40例小肝癌，40例结节性肝癌和40例孤立性大肝癌。所定义的孤立性大肝癌具有的特征性表现为单个肿块，有包膜形成，体积较大(肿瘤直径>5.0cm)但却相对较少发生静脉侵犯，手术切除后复发与转移率较低，手术效果与预后结局均较好，具有独特的临床与分子病理特征与相对较好的肿瘤生物学行为。肿瘤直径S5.0cm则为小肝癌，肿块结节个数^2者为结节性肝癌[4]。收集标本时特别注意要避开出血坏死组织，标本离体后即切取相关部分组织标本并分装于灭菌EP管中然后迅速置于液氮中，随后保存于-80℃超低温冰箱中备用。超低温冰箱型号为Forma 702，购自美国Thermo Scientific。

原位杂交实验方法及其所用仪器：双地高辛标记的hsa-miR-487a，scramble，U6探针从丹麦Exiqon公司购买，所使用的试剂盒为Exiqon公司的miRCURY LNA^TM microRNA ISH Optimization Kit(FFPE)#90000。石蜡固定切片采用二甲苯、99.9％、96％、70％酒精多次浸泡脱蜡。加15μg/mL的蛋白酶K 37℃孵育10分钟，洗净后再次采用70％，96％，99.9％的酒精梯度浸泡脱水。加入经过90℃4分钟变性处理的探针，U6探针浓度1nM，其他探针浓度20nM，50-60℃孵育1小时，在50℃的5x，1x，0.2xSSC缓冲液中逐级浸泡，每次5分钟。与含有羊血清的封闭液(Antibody blocking solution)孵育15分钟。采用抗地高辛抗体(Sheep-anti-DIG-AP)1：800浓度常温孵育60分钟，磷酸盐吐温缓冲液(PBS-T)清洗后加入AP底物30℃孵育2小时。采用孵育终止液KTBT孵育终止反应，并使用水清洗2次各1min。之后，采用核固红染料染细胞核1分钟，在自来水下流水冲洗10分钟。重复之前提及的脱水步骤，采用封固剂固定，全程杂交步骤中避免风干。固定后可采用显微镜观察拍照。

hsa-miR-487a在HCC组织中呈高表达分析

为了进一步验证hsa-miR-487a在肝癌中的表达水平，根据试验方法中所述随机抽取444对2003年至2013年在中南大学湘雅医院进行肝细胞癌切除的患者的样本根据其手术时间分为训练队列与验证队列两个独立队列，过程如图2所示。研究中采用训练队列(Training cohort)以及验证队列(Validtion cohort)两个独立队列来证实hsa-miR-487a在肝细胞癌组织中的表达水 平及预后显著性。

采用realtime-PCR技术检测各组肝癌组织与癌盘组织中的表达水平，hsa-miR-487a表达水平采用log2(癌组织表达水平/癌旁组织表达水平)表示，图3A中可见hsa-miR-487a在训练队列中85/132(65.39％)，验证队列中43/66(65.15％)肝癌组织中表达高于癌旁组织两倍以上。统计显示两个队列中肝癌组织中hsa-miR-487a表达水平均显著高于癌旁组织(P<0.01)。为了验证microRNA芯片结果，将各队列中小肝癌(SHCC)，孤立性大肝癌(SLHCC)，结节性肝癌(NHCC)中hsa-miR-487a表达水平进行了统计，图3D中显示的统计显示与芯片结果一致，hsa-miR-487a在结节性肝癌中的表达水平显著高于小肝癌与孤立性大肝癌组，而hsa-miR-487a在小肝癌与孤立性大肝癌中的表达水平并没有显著的差异。为了能够更为直观的了解hsa-miR-487a在肝癌组织中的表达水平，采用了原位杂交技术对肝癌组织石蜡固定切片进行了检测，图4中结果可见肝癌组织中hsa-miR-487a表达显著高于癌旁组织，肝癌组织与癌旁组织间有明显的表达差异。同样，还选取了9株肝癌细胞系(HepG2，PLC，Bel7402，MHCC97-L，SMMC7721，Huh7，Hep3B，MHCC97-H，HCCLM3)与2株正常肝细胞系(PHH，L02)采用relatime-PCR检测其中hsa-miR-487a的表达水平，结果如图5所示，同样发现肝癌细胞中hsa-miR-487a表达水平均远高于正常肝细胞系水平，与患者组织中发现一致。

实施例3

高表达hsa-miR-487a与肝癌的不良预后有关

为了了解hsa-miR-487a是否与肝癌患者术后的预后有关，根据各队列中hsa-miR-487a表达水平是否高于癌旁组织两倍分为高表达组与低表达组，结合本发明己构建的肝癌患者术后随访数据对两组患者病理情况与预后情况进行了分析。首先，对两个队列的基本临床资料进行了比较，以确保两个队列中纳入的患者具有可比性，比对结果列于表1中。

表1 训练队列与验证队列中各临床病例特征比较

为了了解hsa-miR-487a表达水平与各临床病例特征之间的关系，进行了相关分析，分析结果显示两个队列中hsa-miR-487a的表达水平与肿瘤大小、肿瘤结节数目，有无包膜，微血管侵犯，TNM分期有关，训练队列中hsa-miR-487a与临床病例特征相关性列于表2中。验证队列中hsa-miR-487a与临床病例特征相关性的情况列于表3中。

表2.训练队列中hsa-miR-487a与临床病例特征相关性

表3.验证队列中hsa-miR-487a与临床病例特征相关性

而这几个临床病例特征已知与肝癌术后的转移与复发密切相关。因此，由此可知，hsa-miR-487a表达水平可能与肝癌术后的转移复发有关。

为了探索各临床病理特征与hsa-miR-487a的表达水平对肝癌术后总体生存率、无病生存率影响的相对危险度(RR)，了解hsa-miR-487a是否是肝癌术后生存或预后的独立危险因素。采用COX回归模型来对两个队列中各变量进行了单多因素统计分析。统计结果显示：训练队列中肝硬化、肿瘤结节数目、微血管侵犯及hsa-miR-487a高表达为肝癌术后总体生存的独立危险因素，而肝硬化、肿瘤结节数目、微血管侵犯及hsa-miR-487a高表达同样也被发现为肝癌术后无病生存的独立危险因素。前述结果分别列于表4和表5中。

表4.单因素与多因素分析训练队列中肝癌总体生存率的危险因素

表5 单因素与多因素分析训练队列中肝癌无病生存率的危险因素

为了证实这一研究发现，同样在具有更长随访时间的验证队列中再次进行了分析统计，结果显示在验证队列中、肿瘤结节数目、微血管侵犯及hsa-miR-487a高表达为肝癌术后总体生存的独立危险因素。参见表6。而肝硬化、微血管侵犯及hsa-miR-487a高表达为肝癌术后无病生存的独立危险因素。参见表7。

表6.单因素与多因素分析验证队列中肝癌总体生存率的危险因素

表7 单因素与多因素分析验证队列中肝癌无病生存率的危险因素

从表6和7中所列结果可得知，hsa-miR-487a的高表达通常与肝癌的总体生存率与无病生存率息息相关，hsa-miR-487a高表达为肝癌低总体生存率与低无病生存率重要的独立危险因素之一。

为了更为直观的观察hsa-miR-487a高表达与hsa-miR-487a低表达患者的术后远期预后，采用Kaplan-meier曲线对两个队列中hsa-miR-487a高表达组与低表达组的患者进行了分析比较，统计曲线如图6A显示，训练队列中hsa-miR-487a低表达组总体生存率率与无病生存率均显著优于hsa-miR-487a高表达组。同样，如图6B显示，也在具有更长随访时间的验证队列中证实了这一发现。

由此肝癌组织中高表达hsa-miR-487a的患者往往有着一个相对较差的远期生存预后。

实施例4

对hsa-miR-487a分别进行以下体外实验，以进一步证实其对肝癌的作用。

1.构建细胞系用于体外细胞试验

在明确高表达hsa-miR-487a与肝癌的不良预后有关这一情况以后，希望进一步了解hsa-miR-487a导致患者不良预后的原因。如图5所示，hsa-miR-487a表达最高的肝癌细胞系HCCLM3与表达最低的肝癌细胞系HepG2进行后续研究。采用慢病毒载体对细胞中hsa-miR-487a分进行干预与过表达，建立稳定表达hsa-miR-487a的肝癌细胞系HepG2hsa-miR-487a与稳定抑制hsa-miR-487a的肝癌细胞系HCCLM3Anti-hsa-miR-487a细胞系。细胞感染慢病毒后，采用光镜与绿色荧光(GFP)结合的方法确定感染效率，如图7中所示，可见HCCLM3与HepG2各组细胞感染效率达到90％以上。同时，采用realtime-PCR检测构建的稳定细胞株中hsa-miR-487a的表达水平，结果如图8所示，图中可见，Anti-hsa-miR-487a慢病毒有效干预了肝癌细胞系HCCLM3中hsa-miR-487a表达水平，hsa-miR-487a慢病毒有效的提高了肝癌细胞系HepG2中hsa-miR-487a表达水平。在HCCLM3Anti-hsa-miR-487a中hsa-miR-487a的表达效率明显被抑制，而在HepG2hsa-miR-487a细胞系中，hsa-miR-487a表达明显增高。

2.hsa-miR-487a可促进肝癌细胞的体外增殖能力

肝癌细胞的增殖能力往往与肝癌的生长有密切的联系，为了了解hsa-miR-487a是否与肝癌的增殖能力有关，采用了多个试验对这一情况进行证实。细胞生长曲线如图9A显示，敲出hsa-miR-487a后肝癌细胞HCCLM3的增殖能力显著降低，过表达hsa-miR-487a后肝癌细胞HepG2的增殖能力显著提高。如图9B显示，细胞克隆试验显示敲出hsa-miR-487a后肝癌细胞HCCLM3的克隆形成数显著降低，过表达hsa-miR-487a后肝癌细胞HepG2的克隆数显著提高。这两个试验均证实hsa-miR-487a与肝癌的增殖能力有明显关系。为了了解hsa-miR-487a究竟通过影响细胞周期中哪个阶段从而影响肝癌细胞的增殖能力，采用流式细胞仪对细胞周期进行检测，如图9C中显示，结果显示干预hsa-miR-487a后，肝癌细胞G1期细胞数增多，过表达hsa-miR-487a后，肝癌细胞G1其细胞数减少。结果显示，hsa-miR-487a能够促进肝癌细胞从G1期进入S期或G2/M期从而最终促进细胞的增殖能力。同时，还采用胸腺嘧啶类似物Edu来标记处于增殖周期的细胞，而采用非特异性细胞核染料Hoechst33342来标记所有的细胞核，以求比较直观的观察处于增殖期的细胞占总细胞数的比例，结果示于图10中，图中可见干预hsa-miR-487a表达后处于增殖期的细胞数减少，过表达hsa-miR-487a表达后处于增殖期的细胞数增加。显示干预hsa-miR-487a后处于增殖期的HCCLM3细胞数显著减少，而过表达hsa-miR-487a后处于增殖期的HepG2细胞数显著增加。

以上结果均证实，hsa-miR-487a能够发挥促进肝癌细胞体外增殖能力的作用。

3.hsa-miR-487a促进肝癌细胞的体外侵袭与转移能力

肝癌的侵袭转移能力与肝癌的术后复发与转移密切相关，为了明确hsa-miR-487a是否与肝癌的复发转移能力相关，采用了Transwell试验与划痕愈合试验来进行检测。Transwell试验结果显示与11A中，干预hsa-miR-487a后Transwell膜下细胞数较对照组减少而过表达hsa-miR-487a后细胞数较对照组增加，提示hsa-miR-487a可促进肝癌细胞的侵袭转移能力。划痕愈合结果显示，干预hsa-miR-487a后，24h细胞划痕愈合能力较对照组明显下降，而过表达hsa-miR-487a组24h细胞划痕愈合能力则较对照组明显提升，提示hsa-miR-487a与肝癌细胞的迁徙能力有关。这两个试验结果均可证实，miR-487可促进肝癌细胞的体外侵袭与转移能力(图11B)。图11中结果显示干预hsa-miR-487a表达后细胞转移与迁移能力下降，过表达hsa-miR-487a表达后转移与迁移能力增强。

实施例5

携带有miR-487的Vivo-Morpholino动物给药方法：采用尾静脉注射给药，注射前先将裸鼠固定于小鼠固定注射器中，将尾部露于仪器外，采用75％酒精反复擦拭裸鼠尾部，起到消毒与扩张血管的作用，待裸鼠尾部两侧尾静脉怒张后采用1ml注射器吸取适量15ug/ul Vivo-Morpholino后进行注射，给药总量按12mg/kg计算。

动物给药及处死方式：每周给药两次。每日定期观察裸鼠生存状态，是否出现并发症，每周定期采用活体荧光观察肿瘤生长状况，6周后处死取组织。

活体荧光细胞系构建：采用Luciferase(萤火虫荧光素酶)标记HCCLM3肝癌细胞。细胞构建交由上海Berthold公司构建，具体构建过程可参看该公司提供的LM3-GFP/mCherry-luc人肝癌细胞说明书进行。

活体荧光成像：Luciferase荧光底物由上海Berthold公司提供。采用DPBS(杜式PBS)稀释荧光底物至15mg/ml，通过0.2μm滤网过滤除菌。试验前首先采用2％的戊巴比妥钠100ul腹腔注射麻醉裸鼠，采用1ml注射器吸取荧光底物进行腹腔注射，给药总量为150mg/kg。7-8分钟后利用湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室IVIS lumina II检测系统进行检测。每周检测一次，术后苏醒继续养殖。第6周检测后将裸鼠深麻醉处死，迅速取出肺组织再次采用IVIS lumina II检测系统拍照观察肺部转移灶。

1.hsa-miR-487a促进肝癌细胞的体内生长与转移能力

为了能够更好的模拟人体内的肝癌生长状况，采用上述的稳定转染hsa-miR-487a干预或过表达的肝癌细胞系构建了裸鼠原位成瘤模型，每组各6只裸鼠，1个月后，将小鼠处死，取肝与肺组织观察，图12A示1个月后，hsa-miR-487a干预组肝癌肿块显著小于其对照组，其肿块体积仅有对照组的1/4左右，而hsa-miR-487a过表达肝癌肿块明显较对照组增大，其肿块体积是对照组5倍以上。同时，取其肺组织经石蜡固定并切片后采用HE染色镜下观察，示意图12B显示HCCLM3对照组中裸鼠肺组织中出现了大量的转移结节，干预hsa-miR-487a后肺中极少有转移灶出现。经过统计显示，hsa-miR-487a干预组肝内转移与肺内转移灶均较对照数减少，而图12C，D显示hsa-miR-487a过表达组肝内转移与肺内转移灶均明显增多。以上结果显示，hsa-miR-487a可促进肝癌细胞在体内的生长与转移能力。而且hsa-miR-487a相对高 表达组中均有更多的裸鼠出现了肝内与肺内转移结节。

2.肝癌组织中hsa-miR-487a表达水平与其增殖能力密切相关。

为了在组织中证实hsa-miR-487a表达水平与肝癌增殖能力的关系，首先采用动物进行实验，选取了高表达hsa-miR-487a的裸鼠肿块组织与低表达hsa-miR-487a的裸鼠肿块组织石蜡固定切片后进行增殖能力标志物Ki67免疫组织化学检测，代表性图片如图13A，B显示相对低表达hsa-miR-487a的裸鼠肝癌组织中Ki67表达水平较相对高表达hsa-miR-487a的裸鼠肝癌组织中Ki67表达水平明显减少，提示高表达hsa-miR-487a的肝癌组织中细胞增殖能力较hsa-miR-487a低表达肝癌组织强。同时显示高表达hsa-miR-487a的肝癌组织中细胞增殖能力较标志物Ki67的表达水平增高。

同样，在人体试验中，根据realtime-PCR的结果如图3A，B显示，与原位杂交(图4)结果选取高表达hsa-miR-487a的人肝癌样本与低表达hsa-miR-487a的人肝癌样本进行增殖能力标志物Ki67的免疫组织化学检测，结果同样显示，在高表达hsa-miR-487a的人肝癌组织中Ki67的表达水平要高于低表达hsa-miR-487a的人肝癌组织。结果提示，高表达hsa-miR-487a的肝癌组织增殖较低表达组强。

3.用于靶向干预体内hsa-miR-487a表达的Vivo-Morpholino构建

前期研究结果已显示高表达hsa-miR-487a与肝癌患者术后不良预后有关，hsa-miR-487a在体内外均能够显著的促进肝癌细胞的增殖与转移能力，而对其进行干预可显著的抑制肝癌细胞的增殖与侵袭转移能力，这一作用的发现提示hsa-miR-487a可能能够作为一个潜在的药物靶点成为一种于肝癌的治疗或改善患者术后预后的高度有效的药物。鉴于Morpholino载体药物目前已用于埃博拉病毒、马尔堡病毒、杜氏肌萎缩病药物治疗，是一种体内安全有效的体内干预技术，Vivo-Morpholino是一种经过修饰的Morpholino载体，它能够有效的经过血管内注射或腹腔内注射将起作用的Morpholino药物转入活体细胞内，是一种有极强运用前景的Morpholino载体。因此，委托Gene-tool公司构建了靶向干预体内hsa-miR-487a表达的Vivo-Morpholino(Morpholino-Anti-hsa-miR-487a)与其错配的对照Vivo-Morpholino(Morpholino-Control)，Vivo-Morpholino结构示意图及其特异性的碱基序列如图14所示。为了验证Morpholino-Anti-hsa-miR-487a在活体内对肝癌的治疗效果，再次采用萤火虫荧光素酶(Luciferase)标记的肝癌细胞HCCLM3构建了12只裸鼠原位成瘤模型，随机分配为两组，每周两次经尾静脉分别给予Morpholino-Anti-hsa-miR-487a与Morpholino-Control注射，药物总量按照12mg/kg计算，给药浓度为15ug/ul。每周定期采用活体荧光检测系统对裸鼠体内肿瘤生长状况进行检测。检测结果示于图15A，图15B中，显示Morpholino-Anti-hsa-miR-487a给药后，裸鼠体内肿瘤生长减慢，图15C显示，6周后Morpholino-Anti-hsa-miR-487a注射组明显较对照组减小，尤为明显的是图15D，E中显示Morpholino-Anti-hsa-miR-487a注射组肺中转移灶数目及大小均较对照组显著减少。研究结果显示，Morpholino-Anti-hsa-miR-487a应用后可有效抑制裸鼠体内肿瘤的生长速度，减少其肺部转移灶，是一种有效的肝癌治疗药物。

图15中可见Morpholino-Control组中出现了较多的肺转移灶而 Morpholino-Anti-hsa-miR-487a组则没有出现明显肺转移灶。

实施例6

按CN200810143294.8中公开的方法将其中所用EG FL7基因替换为本发明中的hsa-miR-487a即可制得含hsa-miR-487a的用于检测肝癌检测试剂盒。

所得结果可以按CN200810143294.8中公开的方法对所得含hsa-miR-487a的试剂盒进行检测。所得结果证实hsa-miR-487a可用于检出hsa-miR-487a高表达的肝癌患者。

人肝癌细胞来源可以为LM3-GFP/mCherry-luc人肝癌细胞。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

以上实验方法和背景技术部分可以参考以下文献相关内容：

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Claims (9)

1.一种药物组合物，其特征在于，其包含小分子核酸hsa-miR-487a。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述小分子核酸hsa-miR-487a与递送载体相连接后用于所述药物组合物中。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述递送载体为吗啉代核酸。

4.小分子核酸hsa-miR-487a在制备治疗或术后预防肝癌的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用包括将所述小分子核酸hsa-miR-487a与递送载体连接后用于所述药物中。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述递送载体为吗啉代核酸。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物为用于肝癌的生长期或肝癌转移期的药物。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，含有所述小分子核酸hsa-miR-487a的肝癌诊断试剂盒。

9.一种用于检测肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括小分子核酸hsa-miR-487a。