CN103417990A

CN103417990A - 人miR-148a在制备促进脂肪细胞增殖药物中的应用

Info

Publication number: CN103417990A
Application number: CN2013103631434A
Authority: CN
Inventors: 顾筱琪; 季晨博; 郭锡熔; 史春梅; 张敏; 陈玲; 蒋新液; 许鹏飞; 张悦
Original assignee: Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital
Current assignee: Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital
Priority date: 2013-08-19
Filing date: 2013-08-19
Publication date: 2013-12-04

Abstract

本发明基于基因工程领域，公开了人miR-148a在制备促进脂肪细胞增殖药物中的应用。本发明的技术方案为人miR-148a在制备促进脂肪细胞增殖药物中的应用。本发明的研究结果表明在人脂肪细胞中过表达miR-148a可以明显促进脂肪细胞的增殖速度和细胞个数，可用于制备促进脂肪细胞增殖的药物。

Description

人miR-148a在制备促进脂肪细胞增殖药物中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及人miR-148a在制备促进脂肪细胞增殖药物中的应用。

背景技术

肥胖已成为危害全球人类健康的重要问题之一，受到社会的广泛关注。随着经济发展和生活方式改变，中国的肥胖人口也急剧增长，且低龄化趋势十分突出。肥胖相关的各种并发症，如高血压、糖尿病和心脑血管疾病等，严重威胁着人类健康。《新英格兰医学杂志》一项调查显示中国糖尿病发病率已高达10%，且很大程度与肥胖有关。肥胖的科学治疗及其并发症的防治已成为临床医生面临的挑战。目前已知肥胖是机体在遗传、环境、行为因素或三者相互作用下能量代谢失衡的结果，并且随着遗传学和生物学的发展，遗传因素在肥胖发生中的重要性已倍受重视。已有研究结果指出，肥胖发生的病因中遗传因素占40-70%，开展肥胖病因的遗传学研究十分重要。

在前期研究工作中，发明人采用miRNA芯片（miRNA Array）技术筛选人脂肪细胞分化前后的差异表达miRNA，获得一条特异高表达于成熟脂肪细胞的miRNA-------人miR-148a，提示其可能与肥胖的发生发展相关。该miRNA位于人Chr7p15.2，属于基因间的miRNA。但目前没有关于人miR-148a在脂肪细胞中的功能报道。

发明内容

本发明的目的是提供人miR-148a在制备促进脂肪前体细胞增殖药物中的应用。

发明人在研究中发现人miR-148a过表达组的细胞增殖速度明显快于空载对照组细胞，细胞个数明显增加，人miR-148a过表达组的脂肪细胞中S期细胞比例显著高于空载对照组，表明染色质合成期细胞较多，细胞增殖速度加快，可见人miR-148a能够显著促进脂肪细胞增殖，因此，本发明提出了人miR-148a在制备促进脂肪细胞增殖药物中的应用的技术方案。

本发明的有益效果：

本发明检测了人miR-148a过表达对脂肪细胞增殖功能的影响，显示过表达miR-148a能促进脂肪细胞增殖（细胞个数增多且增殖速度加快），可用于制备促进脂肪细胞增殖的药物，为研究肥胖的发生发展提供了新的研究手段。

附图说明

图1：pGLV-H1-GFP/Puro载体图谱、插入位点及人miR-148a过表达慢病毒载体酶切及测序鉴定

图2：人miR-148a过表达慢病毒感染人脂肪前体细胞株的鉴定

图3：人miR-148a过表达的脂肪细胞和对照细胞生长曲线图。

其中：pGLV-H1-miR-148a-GFP/Puro：miR-148a过表达的前体脂肪细胞，pGLV-H1-GFP/Puro：空载转染对照细胞。

图4：人miR-148a的脂肪细胞和对照细胞12、24、48、72小时细胞各周期分布图。

其中：pGLV-H1-miR-148a-GFP/Puro：miR-148a过表达的前体脂肪细胞，pGLV-H1-GFP/Puro：空载转染对照细胞，G1：染色质合成前期，S：染色质合成期，G2/M：染色质合成后期及分裂期。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明

实施例1

1 材料和方法

1.1 试验材料：人前体脂肪细胞株（Human Preadipocytes-visceral，HPA-v）购自美国Sciencell公司。本实验所需的pGLV-H1-GFP/Puro质粒购自上海吉玛公司，包装质粒Pcgvp、Rev、Vsvg购自美国Allele Biotech&Pharmaceuticals公司；pGLV-H1-miR-148a-GFP/Puro慢病毒载体由本实验小组自行构建；DNA、RNA抽提试剂盒购自德国Qiagen公司，miRNA逆转录试剂盒、miRNA检测试剂盒、TanMan基因表达mixⅡ购自美国ABI公司，TaKaRa LA Taq

DNA Polymerase Hot-Start Version PCR试剂盒购自日本Takara公司，脂肪细胞专有培养基7211购自美国Sciencell公司，限制性内切酶、T4连接酶购自美国NEB公司，引物由美国Invitrogen公司合成。

1.2 实验方法：

（一）人miR-148a minigene的扩增及人miR-148a慢病毒过表达载体（pGLV-H1-miR-148a-GFP/Puro）的构建

（1）.DNA提取：按照以下步骤提取基因组DNA（德国Qiagen公司QIAamp DNAMini Kit）

1）取4ml离心管一只，加入600μl核裂解液，冰上冷却。

2）加入10-20mg解冻的人脂肪组织，匀浆机匀浆10秒。将裂解物移至1.5ml离心管中。65℃孵育30分钟。

3）待样品达到室温后，加入200μl蛋白沉淀液，涡旋震荡20秒，置于冰上冷却5分钟。

4）13,000×g离心4分钟，可见白色沉淀。将上清移至一新离心管中。

5）加入600μl异丙醇，轻轻颠倒混匀溶液，直至白色线状DNA形成。13,000×g离心1分钟，弃去上清。

6）加入600μl室温70%乙醇，轻轻颠倒离心管数次，13,000×g离心1分钟，小心弃去上清。将离心管倒置在干净的吸水纸上，自然干燥10-15分钟。

7）向离心管中加入50μl双蒸水，65℃孵育1小时，以充分溶解DNA，4℃保存。

（2）.人miR-148a minigene的扩增

（2.1）通过miRBase数据库获得人miR-148a的前体pre-miRNA-148a的序列；在NCBIblast中比对查找其所在的基因组序列，根据引物设计规则，采用Primer5软件设计扩增包括pre-miR-148a在内的序列，并在其上游和下游分别引入BamHI和EcoRI酶切位点，上游引物（含BamHI位点，下划线区域）5′-GCCGGATCCAATCTGAGGACGGGTAGGAAG-3’；下游引物（含EcoRI位点，下划线区域）5'-ACCGAATTCCAAGGGAAAGGCGCAGCGACGTG-3’，目的基因长度为443bp。（PCR试剂盒：TaKaRa LA TaqDNA Polymerase Hot-Start Version，Takara）

PCR反应条件为：预变性94℃5min；

终末延伸72℃10min

（2.2）PCR产物切胶纯化回收（Gel/PCR Extraction Kit，Biomiga）

1）按照5μl PCR产物＋1μl上样缓冲液（6×）比例混匀后，在1.0％琼脂糖凝胶上电泳，在成像仪显色下，切取443bp的目的条带于离心管中。

2）加入1倍体积的Buffer GC，至于55℃水浴中8-10分钟，至凝胶完全融化。冷却至室温。

3）转移以上混合液至一带有收集管的吸附柱中，室温下，13,000×g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。重复此步骤，直至剩余液体全部通过吸附柱。

4）加入650μl DNA Wash Buffer至吸附柱中，室温下，13,000×g离心30秒，倒掉废液，重复此步骤。

5）室温下，13,000×g开盖离心2分钟，去除残余的乙醇。

6）转移吸附柱至一新的1.5ml的离心管中，加入30-50μl在60℃预热的ddH₂O，室温放置数分钟，13,000×g离心1分钟。

（2.3）PCR产物及载体pGLV-H1-GFP/Puro双酶切

PCR产物及载体pGLV-H1-GFP/Puro分别按照下述反应体系，37℃反应1小时，得PCR产物目的片段及载体片段。

照下述反应体系，37℃反应1小时。

酶切产物，加入2倍体积Buffer GC后，瞬时离心。其余步骤按照上述切胶纯化回收步骤进行纯化。

（2.4）PCR产物及载体pGLV-H1-GFP/Puro连接反应

按照载体片段和PCR产物目的片段数目比例1:3左右加反应体系，体系中加入1μlT4DNA连接酶及1μl T4DNA Buffer，16℃过夜，得到连接产物（pGLV-H1-miR-148a-GFP/Puro）。以不加入目的片段的载体为对照。

（2.5）转化（无菌操作）

1）从-80℃冰箱取出TOP10感受态细胞，冰上融化，每200μl感受态细菌加入2-4μl连接产物，轻轻扣击管壁混匀细菌。

2）冰上30min，42℃热休克90sec，然后迅速放置冰上3min。

3）加入500μl预热到37℃的LB培养基，37℃200转/分钟培养90分钟。然后将菌液铺于含有Ampicillin抗生素（100mg/ml）的LB固体培养板。

4）37℃孵育，培养板先正置1h后倒置培养12-16小时后挑取克隆或于4℃保存。

（2.6）阳性克隆扩增和质粒抽提（质粒抽提试剂盒为德国QIAGEN公司PlasmidMini Kit）

1）取5ml无菌Ampicillin LB液体培养基（100mg/ml），加入到无菌的15ml试管中，用无菌移液器枪头在培养板上随机挑选阳性克隆，置于上述试管中，37℃200rpm振荡孵育过夜。

2）室温下，10,000rpm离心1分钟，收集菌体，并尽可能弃去上清

3）加入250μl Buffer A1，涡旋震荡混匀。

4）加入250μl Buffer B1，混匀后静置5分钟至溶液粘稠而澄清

5）加入350μl Buffer N1，立即反转多次，至溶液充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。13,000rpm离心10分钟。

6）吸取上清至带有收集管的DNA吸附柱中，13,000rpm离心1分钟，弃去收集管中的废液。

7）加入500μl Buffer KB，室温下13,000rpm离心1分钟，弃去收集管中的废液。

8）加入500μl DNA Wash Buffer，13,000rpm离心1分钟，弃去收集管中的废液。充分此步骤后，开盖离心5分钟。

9）向吸附柱中加入50-100μl ddH₂O。

（2.7）pGLV-H1-miR-148a-GFP/Pur双酶切验证、测序及保种

按照前述酶切方法（表1）进行双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳，切开双条带及条带大小与目的条带分子量相符（约400多bp）进，进行测序验证。同时取无菌1.5ml离心管并作标记，加入0.15ml无菌甘油溶液,分别吸取0.85ml阳性克隆的菌液，加入相应标记的离心管中，充分混匀，贮存于-80℃保种。构建载体及酶切、测序结果见图1。

1.2（二）慢病毒包装

在37℃、5%CO₂孵箱中，以含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养病毒包装细胞HEK-293T细胞（美国ATCC）。将HEK-293T细胞按10⁵/ml密度均匀接种于6孔板中，待细胞融合度达80%左右时，共转染慢病毒表达质粒与包装质粒，转染试剂（美国Invtrogen公司Lipofectamine^TM 2000）(μl)与表达和包装质粒总质量(μg)比例为2.5:1，慢病毒表达质粒与包装质粒Pcgvp、Rev、Vsvg比例为1.5:1.5:1:0.5（质量比）。转染12h换液，24h后使用荧光显微镜观察转染效率，于48h、72h收取细胞培养液上清（即病毒液），0.45μM滤器过滤后，分装-80℃冻存。

1.2（三）慢病毒感染人脂肪前体细胞

在37℃、5%CO₂孵箱中，以含5%胎牛血清的人脂肪细胞专用培养基（7211，Sciencell）培养人脂肪前体细胞，按10⁵/ml密度接种于6孔板中，待细胞融合度达60%左右时，将收集的病毒上清与凝聚胺（polybrene，终浓度5μg/ml）一同加入人脂肪前体细胞，24h后换液，48h-72h在荧光显微镜通过观察荧光表达情况判断感染效率，80%以上细胞可见绿色荧光，表明感染效率达到80%以上（见图2），72h时使用RNA抽提试剂盒（TRIzol法）提取细胞总RNA。

1.2（四）Real-time PCR鉴定人miR-148a在人脂肪前体细胞中过表达

分别收集miR-148a慢病毒组（miR-148a过表达组）及空载对照组的人脂肪前体细胞，使用RNA抽提试剂盒（TRIzol法）抽提总RNA，Nanodrop2.0检测RNA浓度，定量150ng总RNA用于逆转录，经特异性茎环引物（美国ABI公司，miR-148a检测试剂盒）逆转录为cDNA，进一步使用相应引物探针（美国ABI公司，miR-148a检测试剂盒）检测人miR-148a的表达。Realtime PCR反应体系为：TanMan gene expression master MixII 10μl，cDNA1μl，TanMan引物探针1μl，双蒸水8μl，共20μl，在ABI 7500运行，条件为：预变性95℃10min后，95℃15s，60℃1min，重复40个循环。用△△CT法计算人miR-148a的相对表达量。结果见图2。

1.2（五）脂肪细胞增殖的测定

A．整个增殖实验过程检测72小时细胞生长速度，在此期间应保证细胞增殖一直处于对数增长期，为了避免实验中途细胞出现生长接触抑制影响实验结果，必须先确定实验初始阶段种植于96孔板中每孔适宜的细胞数。消化呈对数增长期的人脂肪前体细胞，分别以每孔100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000个细胞数的密度将细胞种植于96孔板上。37℃孵箱培养72小时，期间根据细胞情况换液一次。倒置显微镜下观察细胞生长状态，以72小时不发生细胞生长接触抑制、实验结束时细胞密度在80％左右为最佳。本实验确定人脂肪前体细胞起始生长浓度为500个细胞/孔。

将人miR-148a过表达的脂肪细胞、空载对照细胞，接种于72孔细胞培养板，接种密度约为每孔500个细胞，以PAM培养基培养72小时，分别于第0、4、8、12、24、48、72、时取细胞进行细胞生长活力测定(CCK-8法)，连续4天后，根据CCK-8吸光度值画出生长曲线（见图3）。

B．将人miR-148a过表达的脂肪细胞、空载对照细胞，培养于细胞培养瓶，以无胎牛血清的PAM培养基培养48小时后，使细胞同步化，停留于G0期。恢复含胎牛血清的PAM培养基进行培养，并在恢复血清培养后的第0、12、24、48、72小时收取细胞，70%冰乙醇固定后经流式细胞仪检测细胞各周期分布，计算不同时间点S期细胞（染色质合成期）分布（代表细胞增殖能力）。

2．结果

通过CCK-8法实验发现在72小时内，人miR-148a过表达组的细胞增殖速度明显快于空载对照组细胞，细胞个数明显增加（见图3）；通过检测细胞周期发现，在恢复血清培养第24、48小时，人miR-148a过表达组的脂肪细胞中S期细胞比例显著高于空载对照组，表明染色质合成期细胞较多，细胞增殖速度加快（见图4）。

Claims

1.人miR-148a在制备促进脂肪细胞增殖药物中的应用。