CN105238769A

CN105238769A - 一种脂肪酶lipase7及其编码基因和应用

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Publication number: CN105238769A
Application number: CN201510713812.5A
Authority: CN
Inventors: 胡云峰; 曹莹莹; 邓盾; 孙爱君; 张云
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2015-10-27
Filing date: 2015-10-27
Publication date: 2016-01-13
Anticipated expiration: 2035-10-27
Also published as: CN105238769B

Abstract

本发明公开了一种脂肪酶LIPASE7及其编码基因和应用。本发明从海洋放线菌(Pseudonocardia？antitumoralis)SCSIO？01299中克隆得到一个新的脂肪酶基因——脂肪酶基因lipase7，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，全长为927bp，其编码的脂肪酶LIPASE7的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示，共包含308个氨基酸。通过克隆脂肪酶基因lipase7并将其连接表达载体pET-28a(+)后转化大肠杆菌BL21(DE3)，培养并诱导表达后，得到了重组表达的脂肪酶LIPASE7。脂肪酶LIPASE7作为催化剂拆分(±)-2-氯丙酸甲酯，可制备得到99％光学纯度的(R)-2-氯丙酸甲酯；脂肪酶LIPASE7作为催化剂拆分(±)-2-氯丙酸乙酯，可得到98％光学纯度的(R)-2-氯丙酸乙酯。脂肪酶LIPASE7具有稳定性高、催化效率高的优点，可用于生物医药、化妆品和精细化工等领域。

Description

一种脂肪酶LIPASE7及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物化工和生物技术领域，具体涉及一种脂肪酶LIPASE7及其编码基因和应用。

背景技术

手性化合物由于立体结构互为镜像，其在生物学和药学性质上却相差甚远。比如历史上曾出现使用反应停导致大规模新生儿畸形的事件，由于合成手性药物过程中存在两种构型的“反应停”，R型的“反应停”是孕妇用镇痛药和止痛药，而S型的“反应停”对胎儿则有致畸作。因此，得到光学纯度的手性化合物是非常重要的。

目前合成手性化合物的方法主要有：(1)化学法，即利用对映体的物理和化学性质的差异进行分离。通常有盐析法、包结法、以及组合拆分。其缺点是要求对映体之间的性质差异要大，适用的化合物不多。(2)合成法，通过设计反应来进行手性化合物的化学合成。这种方法缺点在于反应过程通常比较剧烈，耗费能量，而且反应中使用大量有毒的有机溶剂。(3)色谱拆分，这种方法是利用填料对手性对映体吸附性质的差异来实现，其缺点是设备昂贵，普及性较差。(4)酶拆分：这也是目前手性药物发展的一个朝阳方向。

脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)，又叫作三酰甘油水解酶，由其来源非常广泛(微生物、植物和动物中都有存在)，可拆分的底物多，立体选择性高，不需要辅助因子，是一种重要的手性催化剂。

光学纯的2-氯丙酸甲酯是制备光学纯的芳氧基丙酸类除草剂及一些手性药物(如左西孟旦)的重要的中间体。然而，由2-氯丙酸甲酯外消旋体为原料作为中间体进行合成医药或农药，由于其含有低效或无效或有毒副作用的对映异构体，可能以竞争性抑制剂的形式起作用，不仅会降低药效，而且会造成原料的浪费，还可能产生毒副作用等。

光学纯的2-氯丙酸乙酯作为一种重要的医药、农药手性中间体是合成光学纯芳氧丙酸类除草剂、植物生长调节剂以及一些杀菌剂的重要原料；也是α-取代丙酸系列除草剂、植物生长调解剂、非甾体类消炎解热镇痛药的重要中间体，如禾草灵，吡氟禾草灵等。

但是，目前在工业中应用的脂肪酶都是来源于进口，比如NovoNordisk公司的脂肪酶Novozym435(来自Candidaantarctica)，AmanoPharmaceutical公司的LipasePS(来自Burkholderiacepacia)，Fluka公司的LipaseA(来自Candidaantarctica)等等。这些脂肪酶价格昂贵，生产技术受到制约，因此开发具有自主产权的拆分活性好的脂肪酶十分必要。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中脂肪酶价格昂贵、生产技术受到制约的不足，提供一种新的脂肪酶LIPASE7及其编码基因和应用。

本发明从海洋放线菌(Pseudonocardiaantitumoralis)SCSIO01299中开发了一种新的脂肪酶LIPASE7及其编码基因lipase7，构建了含有脂肪酶基因lipase7的重组表达载体和基因工程菌，培养基因工程菌后获得脂肪酶LIPASE7，其可应用于制备手性(R)-2-氯丙酸甲酯和(R)-2-氯丙酸乙酯。

本发明的第一目的是提供一种脂肪酶LIPASE7，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

本发明的第二个目的是提供一种编码所述的脂肪酶LIPASE7的脂肪酶基因lipase7。

优选，所述的脂肪酶基因lipase7的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

本发明还提供一种含有所述的脂肪酶基因lipase7的重组表达载体。所述的表达载体，优选pET28a(+)载体。

本发明还提供一种含有所述的脂肪酶基因lipase7的基因工程菌。所述的基因工程菌，优选大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的第三个目的是提供所述的脂肪酶LIPASE7在制备手性(R)-2-氯丙酸甲酯或(R)-2-氯丙酸乙酯中的应用。

优选，脂肪酶LIPASE7在拆分(±)-2-氯丙酸甲酯制备得到(R)-2-氯丙酸甲酯中的应用。

进一步优选，其步骤为：取脂肪酶LIPASE7于pH为6.0-9.0的缓冲液中，再加入(±)-2-氯丙酸甲酯及其助溶剂，进行反应，得到(R)-2-氯丙酸甲酯。

优选，脂肪酶LIPASE7在拆分(±)-2-氯丙酸乙酯得到(R)-2-氯丙酸乙酯中的应用。

进一步优选，其步骤为：取脂肪酶LIPASE7于pH为6.0-9.0的缓冲液中，再加入(±)-2-氯丙酸乙酯及其助溶剂，进行反应，得到(R)-2-氯丙酸乙酯。

所述的缓冲液，优选为柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸缓冲液、Tris-HCl和甘氨酸-NaOH缓冲液中的一种。

所述的助溶剂，优选为正癸醇、正丁醇、乙醇、异丙醇、环己酮、环己烷、正己烷、正庚烷和异辛烷中的一种。

本发明的脂肪酶基因lipase7来自于海洋放线菌(Pseudonocardiaantitumoralis)SCSIO01299，保存在中国科学院南海海洋研究所实验室。本发明用生物信息学分析的方法，从基因组测序的海洋放线菌(Pseudonocardiaantitumoralis)SCSIO01299中得到脂肪酶基因lipase7，全长为927bp(从起始密码子到终止密码子)，其编码的脂肪酶LIPASE7，共包含308个氨基酸；该基因是一个全新的脂肪酶基因，与其它脂肪酶基因序列的最大相似度为42％。通过克隆脂肪酶基因lipase7并将其连接表达载体pET-28a(+)后转化大肠杆菌BL21(DE3)，培养并诱导表达后，得到了重组表达的脂肪酶LIPASE7。脂肪酶LIPASE7作为催化剂拆分(±)-2-氯丙酸甲酯，可制备得到99％光学纯度的(R)-2-氯丙酸甲酯；脂肪酶LIPASE7作为催化剂拆分(±)-2-氯丙酸乙酯，可得到98％光学纯度的(R)-2-氯丙酸乙酯。脂肪酶LIPASE7具有稳定性高、催化效率高的优点，可用于生物医药、化妆品和精细化工等领域。

本发明的海洋放线菌(Pseudonocardiaantitumoralis)SCSIO01299公开于专利号：ZL201110231994.4、发明名称为：一种假诺卡氏菌及利用其制备Deoxynyboquinone的方法的专利中，本发明的海洋放线菌(Pseudonocardiaantitumoralis)SCSIO01299即为上述专利中的假诺卡氏菌Pseudonocardiasp.SCSIO01299，其于2011年7月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCCNO：M2011255。

附图说明

图1是不同侧链长度的对硝基苯酚酯对脂肪酶LIPASE7酶活的影响。

图2是脂肪酶LIPASE7的最适pH及pH稳定性，A为最适pH曲线图，B为pH稳定性曲线图。

图3是脂肪酶LIPASE7的最适反应温度和温度稳定性，A为最适反应温度曲线图，B为温度稳定性曲线图。

图4是脂肪酶LIPASE7拆分(±)-2-氯丙酸甲酯反应GC图，A为样品(±)-2-氯丙酸甲酯气相图，B为脂肪酶LIPASE7拆分(±)-2-氯丙酸甲酯反应20min后的气相图，其中S代表(S)-2-氯丙酸甲酯，R代表(R)-2-氯丙酸甲酯；

图5是脂肪酶LIPASE7拆分(±)-2-氯丙酸乙酯反应GC图，A为样品(±)-2-氯丙酸乙酯气相图，B为脂肪酶LIPASE7拆分(±)-2-氯丙酸乙酯反应60min后的气相图，其中S代表(S)-2-氯丙酸乙酯，R代表(R)-2-氯丙酸乙酯。

图6是脂肪酶LIPASE7的蛋白表达纯化情况，M为蛋白Marker，1为未经IPTG诱导的含有pET-28a(+)-lipase7的大肠杆菌BL21(DE3)，2为经IPTG诱导的含有pET-28a(+)-lipase7的大肠杆菌BL21(DE3)，3为Ni柱纯化后得到的脂肪酶LIPASE7，4为经过脱盐柱后的脂肪酶LIPASE7。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

本发明的脂肪酶基因lipase7来自于基因组测序的海洋放线菌(Pseudonocardiaantitumoralis)SCSIO01299，该菌保存在中国科学院南海海洋研究所实验室。

实施例1：脂肪酶基因lipase7引物设计及开放阅读框边界确定

提取放线菌(Pseudonocardiaantitumoralis)SCSIO01299的基因组DNA，经测序验证无误后，利用生物信息学手段对基因组进行注释，分析其中的脂肪酶基因，确定了其中脂肪酶基因lipase7的开放阅读框，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，全长为927bp(从起始密码子到终止密码子)，其编码的脂肪酶LIPASE7的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，共308个氨基酸；该基因是一个全新的脂肪酶基因，与其它脂肪酶基因序列的最大相似度为42％。根据分析得到的脂肪酶基因lipase7序列，设计引物如下：正向引物：5′-CATGGATCCGTGAGCCGACACCTCGATCC-3′，下划线部分为BamHI酶切位点；反向引物：5′-CCGCTCGAGTCAGTGTTCCTCGGTGTCGG-3′，下划线部分为XhoI酶切位点。

实施例2：脂肪酶基因lipase7的克隆及载体构建

2.1PCR扩增

将上述设计的引物(正向引物：5′-CATGGATCCGTGAGCCGACACCTCGATCC-3′，反向引物：5′-CCGCTCGAGTCAGTGTTCCTCGGTGTCGG-3′)送至上海生物工程有限公司合成引物，合成的引物使用TE稀释到10μM，提取放线菌(Pseudonocardiaantitumoralis)SCSIO01299的总DNA作为DNA模板，建立如表1所示反应体系：

表1PCR反应体系

使用以下PCR扩增程序扩增脂肪酶基因lipase7：95℃变性10min；95℃变性1min，55～65℃退火30s，72℃延伸1min20s，进行30个循环；72℃延伸10min，冷却到18℃。

将PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶中，120V电压下电泳20min，置于凝胶成像系统中观察。回收900bp左右的条带。PCR产物按照胶回收试剂盒的方法进行回收，使用20μL无菌水洗脱，得到纯化回收的PCR产物。

2.2酶切

将纯化回收的PCR产物使用以下体系进行双酶切，酶切时间1h。酶切体系为：BamH2μL，XhoI2μL，DNA<0.3μg，灭菌的双蒸水加至30μL。酶切后纯化回收得到经过双酶切的PCR产物。

质粒pET-28a(+)的双酶切：挑取含有质粒pET-28a(+)的大肠杆菌DH5α单菌落，过夜培养。使用质粒提取试剂盒提取质粒，用BamHI和XhoI按以下体系双酶切，酶切时间1h。酶切体系为：BamHI2μL，XhoI2μL，质粒DNA<1μg，灭菌的双蒸水加至20μL。酶切后纯化回收得到经过双酶切的pET-28a(+)载体。

上述双酶切使用的限制性内切酶为Thermo公司生产的快速内切酶，酶切后的纯化回收使用核酸纯化回收试剂盒(Magen，HipureGelPureDNAMicroKit)，质粒提取试剂盒为上海捷瑞生物工程有限公司的质粒小量制备试剂盒，操作方法按其使用说明书。

2.3连接

将经过双酶切的PCR产物和pET-28a(+)载体按以下体系进行连接：双酶切的PCR产物5ul，双酶切的pET-28a(+)载体1ul，T4连接酶0.5ul；连接使用的酶量为5U/5μL连接体系，连接温度为20℃，25min；由此得到连接产物。连接使用的T4连接酶购自北京全式金生物技术有限公司。

2.4转化及筛选

取10μL连接产物于50μL大肠杆菌DH5a感受态细胞中，冰浴30min，后于42℃水浴锅热激90s，冰浴2min后加入500μLLB液体培养基，37℃200rpm转速下，孵育培养45min。取一定量的菌液涂布于含100μL/mL卡那霉素的LB平板，培养20h后挑选单菌落。单菌落于5mLLB培养基中过夜培养后提取质粒，进行双酶切验证，酶切片段与基因大小相同的即为阳性克隆。

2.5基因核苷酸序列测定

将筛选的正确阳性克隆送至上海美吉生物医药有限公司进行测序，测序结果与脂肪酶基因lipase7核苷酸序列进行比对，确认是将脂肪酶基因lipase7(其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示)插入到pET-28a(+)质粒中，结果完全正确后确认得到带有脂肪酶基因lipase7的pET-28a(+)质粒(pET-28a(+)-lipase7)，可用于进行下一步试验。

实施例3：脂肪酶基因lipase7在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效表达

3.1大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞制备

1、将少量大肠杆菌BL21(DE3)菌种接入5mLLB试管液中，37℃过夜摇培，250rpm；

2、按1％体积比的接种量将过夜摇培后的大肠杆菌BL21(DE3)菌液接种到300mlLB摇瓶中，37℃摇培3h(≥300rpm)；

3、将培养好的摇瓶在冰水中迅速冷却至0℃，分装至冰预冷的离心管(50mL)，冰置数分钟；

4、4℃，4000rpm离心10min回收细胞，去上清；

5、用冰预冷的10mL0.1M的CaCl₂重悬细胞，4℃，4000rpm离心10min回收细胞；

6、重复5，用10mL0.1M的CaCl₂重悬细胞，冰浴1h以上；

7、4℃，4000rpm离心10min回收细胞；

8、50mL原培养物用2mL含体积分数15％DMSO的0.1MCaCl₂来重悬，分装于1.5mL离心管，50μL每管，-80℃保藏。由此得到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。

3.2转化

取实施例2中得到的pET-28a(+)-lipase7质粒0.5～1μL与50μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞混合，冰浴30min，于42℃水浴锅热激45s，冰浴2min后加入500μLLB液体培养基，37℃200rpm培养45h。培养物离心后涂布50μL/mL的卡那霉素LB平板，培养过夜20h后挑选单菌。由此得到含有pET-28a(+)-lipase7的大肠杆菌BL21(DE3)。

实施例4：脂肪酶LIPASE7的表达和纯化

4.1蛋白诱导

含有pET-28a(+)-lipase7的大肠杆菌BL21(DE3)在LB培养基中37℃培养至OD600为0.85左右，加IPTG至浓度0.2mM，22℃培养16个小时。300mL菌液4000rpm，4℃离心10min，收集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体2次，4000rpm，10min收集菌体。用30mL(50mM，pH7.4)Tris-HCl缓冲液重悬菌体，超声400w，超5s，停5s，破碎10min，4℃，10000rmp离心10min，收集上清。上清于-80℃冷冻过夜，冷冻干燥制备成酶粉。

4.2脂肪酶的纯化

用镍离子亲和层析柱对步骤4.1中收集的上清进行纯化得纯化的脂肪酶LIPASE7(图6)，纯化的蛋白大小约35kD，符合理论预期。具体实施方案如下：使用20mM的咪唑洗脱5个柱体积，45mM咪唑洗脱30个柱体积，最后使用100～1000mM咪唑洗脱5个柱体积，收集中间3.5mL。用脱盐柱SephadexG25进行脱盐，具体操作方法参照GE公司的操作手册进行。

4.3脂肪酶LIPASE7酶活测定

脂肪酶LIPASE7活力测定采用对硝基苯酚酯，具体方法如下：①配制10mM的对硝基苯酚酯；②在1mL反应体系中加入940μLTris-HClbuffer(50mM，pH8.5)，20μL乙醇，10μL浓度为0.40～0.86mg/mL脂肪酶LIPASE7纯酶液；③于35℃下，3～5min后，410nm测定吸光度。

酶活单位定义：1min内水解对硝基苯酚酯，释放1μmol对硝基苯酚所需的酶量定义为一个酶活单位。

实施例5：脂肪酶LIPASE7的酶学性质

5.1水解不同长度的对硝基苯酚酯

按照4.3的测定条件，比较脂肪酶LIPASE7作用不同长度的对硝基苯酚酯，结果如图1，说明脂肪酶LIPASE7对长链对硝基苯酚酯特异性差，而对于短链对硝基苯酚酯的作用效果较好，最佳的底物是C6，即对硝基苯酚己酸酯。

5.2最适pH和pH稳定性

配制不同的缓冲溶液，这些缓冲溶液具有不同的pH，如表2所示，其浓度均为50mM：

表2不同缓冲体系的pH

将4.3中测定条件(以对硝基苯酚己酸酯作为底物)所述的缓冲液(Tris-HClbuffer)按照表2中的缓冲溶液分别进行替换，测定不同PH的缓冲溶液对脂肪酶LIPASE7的酶活力的影响，结果说明脂肪酶LIPASE7酶活在Tris-HClPH为7.5时活性最高(图2A)，PH高于8.0、小于7.0活性会急剧下降。

过夜处理置于不同的缓冲液中的脂肪酶LIPASE7，按4.3中测定条件(以对硝基苯酚己酸酯作为底物)测定脂肪酶酶活，脂肪酶LIPASE7酶活在pH为8.0缓冲液中稳定性最高(图2B)。

5.3最适温度和温度稳定性

在pH7.5，50mMTris-HCl作为缓冲溶液，按4.3中的反应混合液(以对硝基苯酚己酸酯作为底物)置于10～60℃1h后，加入等量的脂肪酶LIPASE7在各自的温度下反应3～5min，410nm测定酶活。结果说明，脂肪酶LIPASE7最适反应温度在20℃，高于20℃酶活将会大大降低(图3A)。

将脂肪酶LIPASE7置于不同温度(15～45℃)预处理1h，于20℃下，pH7.5，50mMTris-HCl的缓冲溶液中，按4.3测定方法(以对硝基苯酚己酸酯作为底物)测定脂肪酶LIPASE7酶活。结果说明，脂肪酶LIPASE7在20℃的稳定性最好，随着温度升高，稳定性逐渐降低，45℃处理1h后酶活基本为0(图3B)。

5.4金属离子抑制

以50mMpH7.0的Tris-HCl为溶剂配制不同金属离子溶液，每种金属离子浓度均为2mM，将脂肪酶LIPASE7酶液在各种金属离子溶液中37℃下处理1h；以不加金属离子的50mM、pH7.5的Tris-HCl溶液为对照(control)。再按照4.3中的测定方法(以对硝基苯酚己酸酯作为底物)测定酶活，结果见表3，Mn²⁺、Ca²⁺对脂肪酶LIPASE7酶活有促进作用，其它金属离子对脂肪酶LIPASE7活性均表现出抑制作用。

表3金属离子对lipase7酶活力的影响

5.5有机溶剂和表面活性剂对脂肪酶活性的影响

将脂肪酶LIPASE7加入到表4中的有机溶剂和表面活性剂溶液中处理12h(对照为蒸馏水，其他溶液的浓度为体积分数)，然后按照4.3的测定方法(以对硝基苯酚己酸酯作为底物)测定酶活。结果表明正庚烷对脂肪酶LIPASE7的活性有一定的促进作用，EDTA、Tween-80、Tween-20、Triton-X100能极大地促进脂肪酶LIPASE7酶活，最高达到166.54％±0.047，SDS抑制脂肪酶LIPASE7的活性。

表4有机溶剂、表面活性剂对脂肪酶活性的影响

实施例6：脂肪酶LIPASE7在拆分(±)-2-氯丙酸甲酯、(±)-2-氯丙酸乙酯中的应用

本法采用在水相中拆分(±)-2-氯丙酸甲酯、(±)-2-氯丙酸乙酯。

1)在优化的条件下，即在0.5ml900mMPH8.0的Tris-HCl缓冲溶液中，加入3uL6mg/mL的脂肪酶LIPASE7纯酶液，2％(v/v)的正癸醇，于20℃，200rpm条件下，拆分500mM的(±)-2-氯丙酸甲酯，在60min内可得到99％光学纯度的(R)-2-氯丙酸甲酯，转化率为98.28％，产物产率为99.86％(图4)。

2)在优化的条件下，即在0.5ml900mMPH8.5的Tris-HCL缓冲溶液中，加入10uL6mg/mL的脂肪酶LIPASE7纯酶液，2％(v/v)的正癸醇，于20℃，200rpm条件下，拆分500mM的(±)-2-氯丙酸乙酯，在100min内可得到98％光学纯度的(R)-2-氯丙酸乙酯，转化率为98.77％，产物产率为97.77％(图5)。

具体分析条件为：采用福立气相色谱仪，配有手性柱(30m×0.25mmCyclosilBchirlcolumn)和氢离子火焰检测器。仪器分析条件设置为：注射器温度220℃，检测器温度250℃，载气为N2，流速1.2mL/min，采用梯度升温进行分析：60℃保持1min，20℃/min，120℃保持1min，10℃/min到220℃，保持1min。

Claims

1.一种脂肪酶LIPASE7，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

2.一种编码权利要求1所述的脂肪酶LIPASE7的脂肪酶基因lipase7。

3.根据权利要求2所述的脂肪酶基因lipase7，其特征在于，所述的脂肪酶基因lipase7的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

4.权利要求1所述的脂肪酶LIPASE7在制备手性(R)-2-氯丙酸甲酯或(R)-2-氯丙酸乙酯中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，脂肪酶LIPASE7在拆分(±)-2-氯丙酸甲酯制备得到(R)-2-氯丙酸甲酯中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的应用为：取脂肪酶LIPASE7于pH为6.0-9.0的缓冲液中，再加入(±)-2-氯丙酸甲酯及其助溶剂，进行反应，得到(R)-2-氯丙酸甲酯。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，脂肪酶LIPASE7在拆分(±)-2-氯丙酸乙酯得到(R)-2-氯丙酸乙酯中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的应用为：取脂肪酶LIPASE7于pH为6.0-9.0的缓冲液中，再加入(±)-2-氯丙酸乙酯及其助溶剂，进行反应，得到(R)-2-氯丙酸乙酯。

9.根据权利要求6或8所述的应用，其特征在于，所述的缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸缓冲液、Tris-HCl和甘氨酸-NaOH缓冲液中的一种。

10.根据权利要求6或8所述的应用，其特征在于，所述的助溶剂为正癸醇、正丁醇、乙醇、异丙醇、环己酮、环己烷、正己烷、正庚烷和异辛烷中的一种。