CN101392251A

CN101392251A - 能诱导干细胞向成骨细胞分化的微小rna及其应用

Info

Publication number: CN101392251A
Application number: CNA2008102255141A
Authority: CN
Inventors: 张雅鸥; 孔祥復; 胡祥; 李国喜; 张锦芳; 谢伟东
Original assignee: Shenzhen Beike Biotechnology Co Ltd; Shenzhen Graduate School Tsinghua University
Current assignee: Shenzhen Beike Biotechnology Co Ltd; Tsinghua University; Shenzhen Research Institute Tsinghua University; Shenzhen Graduate School Tsinghua University
Priority date: 2008-11-03
Filing date: 2008-11-03
Publication date: 2009-03-25
Anticipated expiration: 2028-11-03
Also published as: CN101392251B

Abstract

本发明公开了一种能诱导干细胞向成骨细胞分化的微小RNA及其应用。本发明公开的微小RNA，是下述核糖核酸之一：是下述a1)的双链RNA或b1)的单链RNA：a1)其一条链的核苷酸序列为序列表中序列1－9，另一条链与序列表中序列1－9反向互补；b1)通过连接序列将核苷酸序列为序列表中序列1－9的单链RNA分子和核苷酸序列与序列表中序列1－9反向互补的单链RNA分子连接起来获得的重组单链RNA分子；所述连接序列为TTCAAGAGA。本发明的微小RNA可制备治疗骨科疾病的药物，该药物可治疗骨质疏松、骨折、骨裂，股骨头坏死等骨科疾病。

Description

能诱导干细胞向成骨细胞分化的微小RNA及其应用

技术领域

本发明涉及能诱导干细胞向成骨细胞分化的微小RNA及其应用。

背景技术

微小RNA(microRNA)是一类长度约为21-24个核苷酸的非编码RNA，在基因的表达调节中起重要作用。微小RNA与Ago等酶和蛋白形成复合物结合到靶基因的mRNA 3’非翻译区，阻碍mRNA的翻译或造成mRNA的降解。有证据提示微小RNA参与生命过程中一系列的重要进程，具有调节细胞增殖、分化、死亡、个体发育等生物学功能。微小RNA可被看作为一类内源性的小干扰RNA。小RNA将成为继化学药物和蛋白类药物之后的第三代药物。但是化学合成的微小RNA要进入临床应用存在如下几个问题：1)微小RNA在体液中的稳定性差；2)微小RNA要进入细胞需要体内转染试剂的介导，而目前使用的体内转染试剂存在效率差、用量大、毒性较大的问题；3)化学合成的微小RNA半衰期短、需多次用药、成本难以承受。用病毒类载体表达微小RNA可以克服化学合成的微小RNA存在的问题，但病毒载体的安全性堪忧。

干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，能分化发育成不同的组织细胞。干细胞的自我更新和多向分化过程的调控机制复杂，近期的研究发现微小RNA正是这些复杂的调控机制中非常重要的组成部分，在发育中扮演着主要角色，是干细胞命运的决定因子。尽管有大量证据显示干细胞治疗为某些传统方法难以治愈的疾病提供了新的疗法，有良好的应用前景，但临床上仍然存在质疑之声。除安全性的考虑之外，缺乏细胞替代的证据以及由此引起的疗效不持久是引起质疑的重要原因。

发明内容

本发明的目的是提供一类能诱导干细胞向成骨细胞分化的微小RNA及其应用。

本发明所提供的微小RNA，是下述核糖核酸之一：

1)是下述a1)的双链RNA或b1)的单链RNA：

a1)其一条链的核苷酸序列为序列表中序列1，另一条链与序列表中序列1反向互补；

b1)通过连接序列将核苷酸序列为序列表中序列1的单链RNA分子和核苷酸序列与序列表中序列1反向互补的单链RNA分子连接起来获得的重组单链RNA分子；所述连接序列为TTCAAGAGA；

2)是下述a2)的双链RNA或b2)的单链RNA：

a2)其一条链的核苷酸序列为序列表中序列2，另一条链与序列表中序列2反向互补；

b2)通过连接序列将核苷酸序列为序列表中序列2的单链RNA分子和核苷酸序列与序列表中序列2反向互补的单链RNA分子连接起来获得的重组单链RNA分子；所述连接序列为TTCAAGAGA；

3)是下述a3)的双链RNA或b3)的单链RNA：

a3)其一条链的核苷酸序列为序列表中序列3，另一条链与序列表中序列3反向互补；

b3)通过连接序列将核苷酸序列为序列表中序列3的单链RNA分子和核苷酸序列与序列表中序列3反向互补的单链RNA分子连接起来获得的重组单链RNA分子；所述连接序列为TTCAAGAGA；

4)是下述a4)的双链RNA或b4)的单链RNA：

a4)其一条链的核苷酸序列为序列表中序列4，另一条链与序列表中序列4反向互补；

b4)通过连接序列将核苷酸序列为序列表中序列4的单链RNA分子和核苷酸序列与序列表中序列4反向互补的单链RNA分子连接起来获得的重组单链RNA分子；所述连接序列为TTCAAGAGA；

5)是下述a5)的双链RNA或b5)的单链RNA：

a5)其一条链的核苷酸序列为序列表中序列5，另一条链与序列表中序列5反向互补；

b5)通过连接序列将核苷酸序列为序列表中序列5的单链RNA分子和核苷酸序列与序列表中序列5反向互补的单链RNA分子连接起来获得的重组单链RNA分子；所述连接序列为TTCAAGAGA；

6)是下述a6)的双链RNA或b6)的单链RNA：

a6)其一条链的核苷酸序列为序列表中序列6，另一条链与序列表中序列6反向互补；

b6)通过连接序列将核苷酸序列为序列表中序列6的单链RNA分子和核苷酸序列与序列表中序列6反向互补的单链RNA分子连接起来获得的重组单链RNA分子；所述连接序列为TTCAAGAGA；

7)是下述a7)的双链RNA或b7)的单链RNA：

a7)其一条链的核苷酸序列为序列表中序列7，另一条链与序列表中序列7反向互补；

b7)通过连接序列将核苷酸序列为序列表中序列7的单链RNA分子和核苷酸序列与序列表中序列7反向互补的单链RNA分子连接起来获得的重组单链RNA分子；所述连接序列为TTCAAGAGA；

8)是下述a8)的双链RNA或b8)的单链RNA：

a8)其一条链的核苷酸序列为序列表中序列8，另一条链与序列表中序列8反向互补；

b8)通过连接序列将核苷酸序列为序列表中序列8的单链RNA分子和核苷酸序列与序列表中序列8反向互补的单链RNA分子连接起来获得的重组单链RNA分子；所述连接序列为TTCAAGAGA；

9)是下述a9)的双链RNA或b9)的单链RNA：

a9)其一条链的核苷酸序列为序列表中序列9，另一条链与序列表中序列9反向互补；

b9)通过连接序列将核苷酸序列为序列表中序列9的单链RNA分子和核苷酸序列与序列表中序列9反向互补的单链RNA分子连接起来获得的重组单链RNA分子；所述连接序列为TTCAAGAGA。

其中，所述微小RNA也可经过2′-脱氧化学修饰。

导入本发明所述的微小RNA的细胞也属于本发明的保护范围，所述细胞为人的成体干细胞。导入微小RNA的人的成体干细胞可以用于骨科疾病治疗，或植于骨支架材料中(scafold materials)进行复合培养，用于骨缺损或股骨头坏死的治疗。

其中，所述人的成体干细胞具体可为骨髓基质干细胞、脐带血干细胞、外周血干细胞或羊膜干细胞。所述骨科疾病具体可为骨质疏松、骨折、骨裂、骨缺损或股骨头坏死等。

本发明的另一个目的是提供一种治疗骨科疾病的药物。

本发明所提供的治疗骨科疾病的药物，其活性成分为所述的微小RNA。

其中，所述骨科疾病具体可为骨质疏松、骨折、骨裂、骨缺损或股骨头坏死。

所述的微小RNA可以与脂质体、纳米颗粒、PEI、蛋白或多肽类的转染试剂混合后制成所述的治疗骨科疾病的药物。

所述治疗骨科疾病的药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

本发明所提供的治疗骨科疾病的药物，还可以是其活性成分为含有所述微小RNA的人的成体干细胞。

本发明的微小RNA可以在体外导入人的成体干细胞，所述的人的成体干细胞即可作为治疗骨科疾病的药物。也可以将导入微小RNA的人的成体干细胞种植于骨支架材料(scafold materials)中进行复合培养后，再用于骨缺损或股骨头坏死的治疗。所述人的成体干细胞具体可为骨髓基质干细胞、脐带血干细胞、外周血干细胞或羊膜干细胞。所述骨科疾病为骨质疏松、骨折、骨裂、骨缺损或股骨头坏死。

所述治疗骨科疾病的药物可经静脉注射输入体内或经局部注射进入病变的组织。

本发明的微小RNA可诱导骨髓基质干细胞(MSC)及其它成体组织干细胞向成骨细胞分化。本发明的化学合成的在体外使用还避免了微小RNA在体液中的稳定性差，体内转染试剂效率差、用量大、毒性较大的缺点；且半衰期长、无需多次用药。

附图说明

图1miR-20家族。

图2为荧光显微镜观察微小RNA转染的MSCs细胞。

图3为微小RNA转染的MSCs细胞的碱性磷酸酶活性。

图4为微小RNA转染的MSCs细胞的茜红染色。

图5为RT-PCR检测结果。

具体实施方式

实施例1、微小RNA诱导干细胞成骨分化

1)微小RNA的制备

微小RNA选自人类miR-20家族的成熟微小RNA的序列，来自miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml)，分别命名为miR-17-5p(其核苷酸序列为序列表中的序列1)、miR-18a(其核苷酸序列为序列表中的序列2)、miR-18b(其核苷酸序列为序列表中的序列3)、miR-20a(其核苷酸序列为序列表中的序列4)、miR-20b(其核苷酸序列为序列表中的序列5)、miR-93(其核苷酸序列为序列表中的序列6)、miR-106a(其核苷酸序列为序列表中的序列7)、miR-106b(其核苷酸序列为序列表中的序列8)和miR-519d(其核苷酸序列为序列表中的序列9)。上述的微小RNA为双链RNA，由上海吉玛(GenePharma)公司用化学法合成。另设随机序列为对照1，随机序列正义链的序列为序列表中的序列10。图1显示miR-20家族的微小RNA。9个微小RNA均属于的miR-20家族。它们在5’端1-8位的碱基序列极其相似，该区域被称为种子区，是与靶基因结合的保守部位。同一家族的微小RNA因种子区的序列相似，往往能与相同的靶基因结合，显示出相近的功能。

2)微小RNA诱导干细胞成骨分化的效率检测

a)细胞培养和脂质体转染：

人骨髓来源的间充质干细胞(MSCs)从健康的成年志愿者捐献的骨髓中进行分离，分离方法如下：

Ficoll-Hapague密度梯度离心收集MSC，然后在含有10g/100ml胎牛血清(FBS)和1g/100ml青霉素和链霉素的a—MEM培养基(购自GIBCOL)中，37℃、5％CO₂培养，通过连续换液和传代培养可去除里面混杂的血细胞，5代以后得到纯的MSC。

然后将MSCs细胞按5×10⁵/孔的密度接种12孔板，24小时后，按照Invitrogen公司的Lipofectamine2000的说明书，分别将9个微小RNA(其核苷酸序列为序列表中的序列1-9)及对照1(其核苷酸序列为序列表中的序列10)转染MSCs细胞，转染后的MSCs细胞继续培养24h，于荧光显微镜下观察转染效率。

图2显示一个微小RNA转染的MSC荧光显微镜观察结果。

荧光显微镜观察结果，表明微小RNA转染MSCs细胞的转染效率高达90％以上。

b)微小RNA转染的MSCs细胞的碱性磷酸酶活性

碱性磷酸酶是成骨细胞分化的早期标志，用碱性磷酸酶活性检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)对成骨细胞的碱性磷酸酶活性进行测定。

碱性磷酸酶检测方法如下：

1)9个微小RNA及对照1分别转染人的MSCs细胞，培养6天和9天后去掉上清，用PBS洗3次，加入100ul细胞裂解液(20mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl，and 1 ml/100ml Triton X-100)，冰上裂解15min。12000rpm离心10min收集蛋白；

2)按照碱性磷酸酶活性检测试剂盒的说明书进行碱性磷酸酶活性的测定，在402nm下测定OD值；

3)按照Bio—Rad标准操作测定每个样品的蛋白含量；

4)计算碱性磷酸酶的比活力，碱性磷酸酶的比活力＝测定的碱性磷酸酶活力/蛋白含量。

碱性磷酸酶比活力的测定结果如图3所示，表明微小RNA miR-17-5p，miR-18a，miR-18b，miR-20a，miR-20b，miR-93，miR-106a，miR-106和miR-519d转染的MSCs细胞培养6和9天后，其碱性磷酸酶的活力与对照相1比明显提高，尤其以miR-20a，miR-20b的效果明显，与对照1相比，3天时碱性磷酸酶活力升高分别为80％和90％；6天时碱性磷酸酶活力升高分别为100％和125％。

上述实验结果说明9个微小RNA转染的MSCs细胞，与对照1相比，向成骨细胞分化的速度加快。

图3中，“106a”代表转染微小RNA miR-106a的MSCs细胞；“106b”代表转染微小RNA miR-106b的MSCs细胞；“519d”代表转染微小RNA miR-519d的MSCs细胞；“20a”代表转染微小RNA miR-20a的MSCs细胞；“20b”代表转染微小RNAmiR-20b的MSCs细胞；“17-5p”代表转染微小RNA miR-17-5p的MSCs细胞；“18a”代表转染微小RNA miR-18a的MSCs细胞；“18b”代表转染微小RNA miR-18b的MSCs细胞；“93”代表转染微小RNA miR-93的MSCs细胞；“Control”代表未转染微小RNA的MSCs细胞；“NC”代表转染对照1的MSCs细胞。

c)微小RNA转染的MSCs细胞的细胞矿化

成骨细胞分化的最终指标是钙结节及矿化的形成。可用茜红染色(ARS)来确定最终的矿化，具体方法如下：

1)9个微小RNA转染的MSCs细胞，培养12天，去掉上清，用PBS洗3次，加入200ul4％(体积百分比)多聚甲醛固定10min；

2)用超纯水洗涤3次，然后每孔加入300ul 0.1％的茜红染液，染色10min；

3)去掉染液，用超纯水洗涤3次，显微镜下观察拍照。

茜红染色结果如图4所示，表明微小RNAmiR-17-5p，miR-18a，miR-18b，miR-20a，miR-20b，miR-93，miR-106a，miR-106和miR-519d转染的MSCs细胞呈现红色，而对照1和未转染微小RNA的MSCs细胞不未染上红色。上述实验结果说明微小RNAmiR-17、miR-18a、miR-18b、miR-20a、miR-20b、miR-93、miR-106a、miR-106和miR-519d能加快MSCs细胞向成骨细胞分化。

d)RT-PCR检测

用1ml TRIzol(GIBCOL)裂解步骤a)的微小RNA转染的MSCs细胞，并按TRIzol产品说明的操作规程提取总RNA。用DNase I 37℃消化总RNA 30分钟后，按照DNaseI产品说明提纯总RNA，然后对总RNA进行定量和质量鉴定。逆转录反应用Promega公司的M-MLV逆转录酶体系，将1ug的总RNA与0.5ug的Oligo dT混合，加热5分钟，迅速冷却至0℃，按产品说明加入缓冲液，42℃孵育1小时，逆转录反应后的cDNA，作为PCR反应的模板进行扩增反应。PCR反应的引物序列如下：

BMP2-P1：5′GTATCGCAGGCACTCAGGT3′；

BMP2-P2：5′CACTTCCACCACGAATCCATC3′。

GAPDH-P3：5′TCCATGACAACTTTGGTATCG3′；

GAPDH-P4：5′TGTAGCCAAATTCGTTGTCA3′。

PCR扩增结果如图4所示，表明细胞成骨分化的关键基因BMP2的表达上调，说明微小RNA是通过BMP2信号通路来诱导MSCs细胞成骨分化的。

图4中，“Control”代表未转染微小RNA的MSCs细胞；“NC”代表转染对照1的的MSCs细胞，“20a”代表转染微小RNA miR-20a的MSCs细胞。

实施例2、治疗骨科疾病的细胞的制备

采集患者自身的骨髓，Ficoll-Hapague密度梯度离心收集MSC，然后在含有10g/100ml胎牛血清(FBS)和1g/100ml青霉素和链霉素的a—MEM培养基(购自GIBCOL)中，37℃、5％ CO₂培养，通过连续换液和传代培养可去除里面混杂的血细胞，5代以后得到纯的MSC。然后将MSCs细胞按5×10⁵/孔的密度接种12孔板，24小时后，按照Invitrogen公司的Lipofectamine2000的说明书，分别将9个微小RNA(其核苷酸序列为序列表中的序列1-9)及对照1(其核苷酸序列为序列表中的序列10)转染MSCs细胞，转染后的MSCs细胞继续培养4-6天，可用于治疗骨科疾病，也可以将导入微小RNA的细胞注入骨组织工程支架材料中(scafoldmaterials)，在体外培养6天，成为能治疗骨科疾病的材料。

序列表

<110> 清华大学深圳研究生院深圳市北科生物科技有限公司

<120> 能诱导干细胞向成骨细胞分化的微小RNA及其应用

<130> CGGNARW81777

<160> 9

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

<210> 2

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

<210> 4

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

<210> 5

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

<210> 6

<211> 23

<212> RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 6

<210> 7

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 7

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 8

<210> 9

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 9

Claims

1、一种微小RNA，是下述核糖核酸之一：

1)是下述a1)的双链RNA或b1)的单链RNA：

2)是下述a2)的双链RNA或b2)的单链RNA：

3)是下述a3)的双链RNA或b3)的单链RNA：

4)是下述a4)的双链RNA或b4)的单链RNA：

5)是下述a5)的双链RNA或b5)的单链RNA：

6)是下述a6)的双链RNA或b6)的单链RNA：

7)是下述a7)的双链RNA或b7)的单链RNA：

8)是下述a8)的双链RNA或b8)的单链RNA：

9)是下述a9)的双链RNA或b9)的单链RNA：

2、根据权利要求1所述的微小RNA，其特征在于：所述微小RNA经过2′-脱氧化学修饰。

3、导入权利要求1或2所述微小RNA的细胞，所述细胞为人的成体干细胞。

4、根据权利要求3所述的细胞，其特征在于：所述人的成体干细胞为骨髓基质干细胞、脐带血干细胞、外周血干细胞或羊膜干细胞。

5、一种治疗骨科疾病的药物，其活性成分为权利要求1所述的微小RNA。

6、根据权利要求5所述的药物，其特征在于：所述骨科疾病为骨质疏松、骨折、骨裂、骨缺损或股骨头坏死。

7、一种治疗骨科疾病的药物，其活性成分为导入权利要求1或2所述微小RNA的人的成体干细胞。

8、根据权利要求7所述的药物，其特征在于：所述人的成体干细胞为骨髓基质干细胞、脐带血干细胞、外周血干细胞或羊膜干细胞。

9、根据权利要求7所述的药物，其特征在于：所述骨科疾病为骨质疏松、骨折、骨裂、骨缺损或股骨头坏死。

10、植入权利要求3或4所述细胞的骨组织工程支架材料。