CN102858376A - 使用了微小rna的心肌细胞的增殖方法 - Google Patents

使用了微小rna的心肌细胞的增殖方法 Download PDF

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Abstract

本发明的课题在于提供使用了促进心肌细胞的增殖的miRNA的心肌细胞的增殖方法、心脏病治疗用载体及心脏病治疗用药物组合物等。提供使用了具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的心肌细胞的增殖方法、含有该miRNA的心脏病治疗用载体及含有该载体的心脏病治疗用药物组合物等。作为miRNA，特别优选选自由作为成熟型miRNA的miR-148a、miR-148b、miR-152及miR-373以及该miRNA的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的miRNA。

Description

使用了微小RNA的心肌细胞的增殖方法
技术领域
本发明涉及使用了微小RNA的心肌细胞的增殖方法、心脏病治疗用载体及心脏病治疗用药物组合物。
背景技术
成体的心肌细胞由于已经丧失了细胞分裂能力，因而一旦因暴露于缺血或心肌炎等各种刺激下坏死或丧失，则无法补充。其结果，残存的心肌细胞通过代偿性肥厚以期保护心脏机能，但若该状态持续、超出了心肌组织的允许范围，则引起进一步的心肌细胞的疲惫、死亡，最终呈现心肌机能的降低，即心力衰竭。
以心力衰竭为首的心脏病成为日本死亡原因的第2位。另外，心脏病患者的预后非常差，5年生存率只不过50％左右。因此认为，从医疗福利以及医疗经济的观点来看，有效的心力衰竭治疗方法的开发是非常有益的。
作为迄今为止的心力衰竭治疗药，逐渐使用增加心肌收缩力的洋地黄制剂、黄嘌呤制剂等强心剂，但已知，若长时间投与这些药剂，有时反而会恶化病情。另外，最近，利用β阻断药、ACE抑制剂等减轻由交感神经系统、肾素-血管紧张素系统的亢奋所导致的过剩的心脏负荷的药剂的治疗逐渐成为主流，但这些不过是对症的治疗法，无法恢复受到伤害的心脏组织本身。
另一方面，心脏移植为对重症心力衰竭的根本的治疗法，但从脏器提供者的不足、医疗伦理、给患者的肉体带来的负担或经济的重担等问题出发，难以使用本法作为通常的治疗法。
微小RNA（以下称为“miRNA”）为存在于细胞内的长度21～25个碱基的非编码RNA。广泛保存于线虫至哺乳类，作为在生物体内的各种基因的表达调节方面担负重要作用的分子，近年来备受注目。
miRNA由存在于基因组DNA上的miRNA基因首先以数百至数千个碱基左右的miRNA初级转录产物（pri-miRNA）的形式被转录。接着，在核内由被称作Drosha的RNase III酶加工，变成约70个碱基左右的具有发卡结构的前体miRNA（pre-miRNA）。之后由Exportin-5从核运送到细胞质中，受到被称作Dicer的RNase III酶的加工，变成21～25个碱基的双链的成熟型miRNA（mature miRNA）。已知，成熟型miRNA的其中的一条链与被称作RNA诱导沉默复合体（RISC）的蛋白质形成复合体，与具有互补序列的目标基因的mRNA结合，抑制目标基因的表达（非专利文献1、2）。
推测每1个生物物种存在1000种左右的miRNA，据说它们分别调节多个目标基因的表达，控制着编码蛋白质的基因的总体的约1/3（非专利文献3）。另外，逐渐清楚了miRNA参与发生、分化、病毒感染时的生物体反应等，也暗示其与人的疾病有关。特别是关于癌与miRNA的关系，由于正常组织和癌组织中存在较多表达方式不同的miRNA，因此强烈启示miRNA参与癌变过程，报道存在促进癌变的miRNA、抑制肿瘤的miRNA两者（非专利文献4、5、6）。
另外，作为心脏病相关信息，很多研究小组报道了正常心脏和病变心脏中的miRNA的表达谱解析。其中一部分解析了具体的机能，例如报道了，心脏肥厚时miR-195的表达增加，强制表达该miRNA的转基因小鼠的心脏肥厚，引起了扩张型心肌病、心力衰竭（专利文献1、非专利文献7）；另外报道了，作为心脏肥厚时表达减少的miRNA的miR-1抑制心肌细胞的增殖（专利文献2、非专利文献8）等。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:WO2009/062169
专利文献2:WO2006/107826
非专利文献
非专利文献1:He & Hannon,Nature Reviews Genetics,5:522-531,(2004)
非专利文献2:Bartel,Cell,116:281-297,(2004)
非专利文献3:Berezikov et al.,Cell,120:21-24,(2005)
非专利文献4:Esquela-Kerscher & Slack,Nature ReviewsCancer,6:259-269,(2006)
非专利文献5:Kent & Mendell,Oncogene,25:6188-6196,(2006)
非专利文献6:Zhang et al.,Developmental Biology,302:1-12,(2007)
非专利文献7:van Rooij et al.,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America,103:18255-18260,(2006)
非专利文献8:Zhao et al.,Cell,129:303-317,(2007)
发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题在于鉴定促进心肌细胞的增殖的miRNA并提供一种使用该miRNA的心肌细胞的增殖方法、心脏病治疗用载体及心脏病治疗用药物组合物等。
用于解决问题的方案
为了解决上述课题，本发明人等着眼于作为调节心肌细胞增殖因子的微小RNA（以下称为“miRNA”）而进行研究，进行有关调节心肌细胞的增殖的miRNA的解析。并且，进行深入研究，结果，本发明人等成功地鉴定了调节心肌细胞的增殖的多个miRNA，从而完成了本发明。
作为本发明的第1方式，本发明人等提供具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA。更具体而言，本发明的miRNA包括以下的方式：
（1-1)具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA。
（1-2）根据上述（1-1）所述的miRNA，其中，miRNA为选自由成熟型miRNA及该miRNA的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的物质。
（1-3）根据上述（1-1）或（1-2）所述的miRNA，其中，miRNA为包含由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2构成的种子序列的物质。
（1-4）根据上述（1-3）所述的miRNA，其中，包含由SEQID NO:1构成的种子序列的物质为选自由miR-148a（SEQ IDNO:3）、miR-148b（SEQ ID NO:5）、miR-152（SEQ ID NO:7）及它们的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的物质。
（1-5）根据上述（1-3）所述的miRNA，其中，包含由SEQID NO:2构成的种子序列的物质为选自由miR-373（SEQ ID NO:9）及其前体、以及其突变体及类似物所组成组中的物质。
作为本发明的第2方式，本发明人等提供了具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的药物用途，所述药物用途可以记载为如下形式：（a）一种用于治疗心脏病的药物组合物，其使用了上述规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸；（b）一种心脏病的治疗方法，其特征在于，将规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸导入个体心脏的损伤部位，从而使心肌细胞在该部位增殖；（c）一种规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸在制造用于治疗心脏病的药物中的用途；或（d）一种规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸，其在心脏病的治疗中使用。本发明中“规定miRNA的核酸”是指用于使（i）成熟型miRNA及该miRNA的前体以及它们的突变体及类似物或（ii）成熟型miRNA及该miRNA的前体、以及它们的突变体及类似物在生物体内或细胞内表达的表达载体。
关于上述方式中（a）的药物组合物的发明，更具体而言，这样的药物组合物包含以下的方式：
（2-a-1）一种心脏病治疗用药物组合物，其含有规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸。
（2-a-2）根据上述（2-a-1）所述的药物组合物，其中，miRNA为选自由成熟型miRNA及该miRNA的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的物质。
（2-a-3）根据上述（2-a-1）或（2-a-2）所述的药物组合物，其中，miRNA为包含由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2构成的种子序列的物质。
（2-a-4）根据上述（2-a-3）所述的药物组合物，其中，包含由SEQ ID NO:1构成的种子序列的物质为选自由miR-148a（SEQ ID NO:3）、miR-148b（SEQ ID NO:5）、miR-152（SEQID NO:7）及它们的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的物质。
（2-a-5）根据上述（2-a-3）所述的药物组合物，其中，包含由SEQ ID NO:2构成的种子序列的物质为选自由miR-373（SEQ ID NO:9）及其前体、以及其突变体及类似物所组成组中的物质。
（2-a-6）根据上述（2-a-1）～（2-a-5）中任一项所述的药物组合物，其以用于将其导入心肌细胞内并使其表达的表达载体或脂质体形式，含有规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸。
（2-a-7）根据上述（2-a-6）所述的药物组合物，其中，载体为病毒载体或非病毒性表达载体。
（2-a-8）根据上述（2-a-7）所述的药物组合物，其中，病毒载体为选自腺病毒载体、腺伴随病毒（AAV）载体、反转录病毒载体、日本血球凝集病毒（HVJ；别名，仙台病毒）载体、慢病毒载体、牛痘病毒载体、鸡痘病毒载体（chick poxviralvectors）、乳多空病毒载体中的病毒载体。
（2-a-9）根据上述（2-a-1）～（2-a-8）中任一项所述的药物组合物，其中，miRNA为含有至少一个修饰核苷间键（modified internucleoside linkage）、至少一个修饰糖部分、至少一个修饰碱基、或它们的组合的miRNA衍生物。
（2-a-10）根据上述（2-a-1）～（2-a-9）中任一项所述的药物组合物，其中，心脏病为心肌梗塞、缺血性心脏病、充血性心力衰竭、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、心肌炎或慢性心力衰竭。
另外，关于上述方式中（b）的治疗方法的发明，更具体而言，这样的治疗方法包含以下的方式：
（2-b-1）一种心脏病的治疗方法，其特征在于，通过将规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸导入个体心脏的损伤部位，从而使心肌细胞在该部位增殖。
（2-b-2）根据上述（2-b-1）所述的治疗方法，其中，miRNA为选自由成熟型miRNA及该miRNA的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的物质。
（2-b-3）根据上述（2-b-1）或（2-b-2）所述的治疗方法，其中，miRNA为包含由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2构成的种子序列的物质。
（2-b-4）根据上述（2-b-3）所述的治疗方法，其中，包含由SEQ ID NO:1构成的种子序列的物质为选自由miR-148a（SEQ ID NO:3）、miR-148b（SEQ ID NO:5）、miR-152（SEQID NO:7）及它们的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的物质。
（2-b-5）根据上述（2-b-3）所述的治疗方法，其中，包含由SEQ ID NO:2构成的种子序列的物质为选自由miR-373（SEQID NO:9）及其前体、以及其突变体及类似物所组成组中的物质。
（2-b-6）根据上述（2-b-1）～（2-b-5）中任一项所述的治疗方法，其中，通过表达载体或脂质体将规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸导入个体心脏的损伤部位。
（2-b-7）根据上述（2-b-6）所述的治疗方法，其中，载体为病毒载体或非病毒性表达载体。
（2-b-8）根据上述（2-b-7）所述的治疗方法，其中，病毒载体为选自腺病毒载体、腺伴随病毒（AAV）载体、反转录病毒载体、日本血球凝集病毒（HVJ；别名，仙台病毒）载体、慢病毒载体、牛痘病毒载体、鸡痘病毒载体、乳多空病毒载体中的病毒载体。
（2-b-9）根据上述（2-b-1）～（2-b-8）中任一项所述的治疗方法，其中，miRNA为含有至少一个修饰核苷间键、至少一个修饰糖部分、至少一个修饰碱基、或它们的组合的miRNA衍生物。
（2-b-10）根据上述（2-b-1)～（2-b-9）中任一项所述的治疗方法，其中，心脏病为心肌梗塞、缺血性心脏病、充血性心力衰竭、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、心肌炎或慢性心力衰竭。
另外，关于上述方式中（c）的用途发明，更具体而言，这样的用途包括以下的方式：
（2-c-1）一种规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸在制造心脏病治疗用药物组合物中的用途。
（2-c-2）根据上述（2-c-1)所述的用途，其中，miRNA为选自由成熟型miRNA及该miRNA的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的物质。
（2-c-3）根据上述（2-c-1）或（2-c-2）所述的用途，其中，miRNA为包含由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2构成的种子序列的物质。
（2-c-4）根据上述（2-c-3）所述的用途，其中，包含由SEQID NO:1构成的种子序列的物质为选自由miR-148a（SEQ IDNO:3）、miR-148b（SEQ ID NO:5）、miR-152（SEQ ID NO:7）及它们的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的物质。
（2-c-5）根据上述（2-c-3）所述的用途，其中，包含由SEQID NO:2构成的种子序列的物质为选自由miR-373（SEQ ID NO:9）及其前体、以及其突变体及类似物所组成组中的物质。
（2-c-6）根据上述（2-c-1）～（2-c-5）中任一项所述的用途，其以用于将其导入心肌细胞内并使其表达的表达载体或脂质体形式，含有规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸。
（2-c-7）根据上述（2-c-6）所述的用途，其中，载体为病毒载体或非病毒性表达载体。
（2-c-8）根据上述（2-c-7）所述的用途，其中，病毒载体为选自腺病毒载体、腺伴随病毒（AAV）载体、反转录病毒载体、日本血球凝集病毒（HVJ；别名，仙台病毒）载体、慢病毒载体、牛痘病毒载体、鸡痘病毒载体、乳多空病毒载体中的病毒载体。
（2-c-9）根据上述（2-c-1）～（2-c-8）中任一项所述的用途，其中，miRNA为含有至少一个修饰核苷间键、至少一个修饰糖部分、至少一个修饰碱基、或它们的组合的miRNA衍生物。
（2-c-10）根据上述（2-c-1）～（2-c-9）中任一项所述的用途，其中，心脏病为心肌梗塞、缺血性心脏病、充血性心力衰竭、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、心肌炎或慢性心力衰竭。
进而，关于上述方式中（d）的核酸的发明，更具体而言，这样的核酸包括以下的方式：
（2-d-1）一种规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸，其在心脏病的治疗中使用。
（2-d-2）根据上述（2-d-1）所述的核酸，其中，miRNA为选自由成熟型miRNA及该miRNA的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的物质。
（2-d-3）根据上述（2-d-1）或（2-d-2）所述的核酸，其中，miRNA为包含由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2构成的种子序列的物质。
（2-d-4）根据上述（2-d-3）所述的核酸，其中，包含由SEQID NO:1构成的种子序列的物质为选自由miR-148a（SEQ IDNO:3）、miR-148b（SEQ ID NO:5）、miR-152（SEQ ID NO:7）及它们的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的物质。
（2-d-5）根据上述（2-d-3）所述的核酸，其中，包含由SEQID NO:2构成的种子序列的物质为选自由miR-373（SEQ ID NO:9）及其前体、以及其突变体及类似物所组成组中的物质。
（2-d-6）根据上述（2-d-1）～（2-d-5）中任一项所述的核酸，其以用于将其导入心肌细胞内并使其表达的表达载体或脂质体形式，含有规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸。
（2-d-7）根据上述（2-d-6）所述的核酸，其中，载体为病毒载体或非病毒性表达载体。
（2-d-8）根据上述（2-d-7）所述的核酸，其中，病毒载体为选自腺病毒载体、腺伴随病毒（AAV）载体、反转录病毒载体、日本血球凝集病毒（HVJ；别名，仙台病毒）载体、慢病毒载体、牛痘病毒载体、鸡痘病毒载体、乳多空病毒载体中的病毒载体。
（2-d-9）根据上述（2-d-1)～（2-d-8）中任一项所述的核酸，其中，miRNA为含有至少一个修饰核苷间键、至少一个修饰糖部分、至少一个修饰碱基、或它们的组合的miRNA衍生物。
（2-d-10）根据上述（2-d-1）～（2-d-9）中任一项所述的核酸，其中，心脏病为心肌梗塞、缺血性心脏病、充血性心力衰竭、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、心肌炎或慢性心力衰竭。
作为本发明的第3方式，本发明人等提供使用了上述规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸的心肌细胞的增殖方法。更具体而言，这样的心肌细胞的增殖方法包括以下的方式：
（3-1）一种心肌细胞的增殖方法，其特征在于，将规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸导入心肌细胞内并使其表达。
（3-2）根据上述（3-1)所述的方法，其中，miRNA为选自由成熟型miRNA及该miRNA的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的物质。
（3-3）根据上述（3-1）或（3-2）所述的方法，其中，miRNA为包含由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2构成的种子序列的物质。
（3-4）根据上述（3-3）所述的方法，其中，包含由SEQ IDNO:1构成的种子序列的物质为选自由miR-148a（SEQ ID NO:3）、miR-148b（SEQ ID NO:5）、miR-152（SEQ ID NO:7）及它们的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的物质。
（3-5）根据上述（3-3）所述的方法，其中，包含由SEQ IDNO:2构成的种子序列的物质为选自由miR-373（SEQ ID NO:9）及其前体、以及其突变体及类似物所组成组中的物质。
（3-6）根据上述（3-1）～（3-5）中任一项所述的方法，其包括利用表达载体或脂质体将规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸导入心肌细胞内。
（3-7）根据上述（3-6）所述的方法，其中，载体为病毒载体或非病毒性表达载体。
（3-8）根据上述（3-7）所述的方法，其中，病毒载体为选自腺病毒载体、腺伴随病毒（AAV）载体、反转录病毒载体、日本血球凝集病毒（HVJ；别名，仙台病毒）载体、慢病毒载体、牛痘病毒载体、鸡痘病毒载体、乳多空病毒载体中的病毒载体。
（3-9）根据上述（3-1）～（3-8）中任一项所述的方法，其中，miRNA为含有至少一个修饰核苷间键、至少一个修饰糖部分、至少一个修饰碱基、或它们的组合的miRNA衍生物。
发明的效果
通过使用本发明的miRNA，从而可提供心肌细胞的增殖方法、心脏病治疗用载体及心脏病治疗用药物组合物。若使用本发明的心肌细胞的增殖方法，则能够比以往方法更有效地诱导心肌细胞的细胞分裂、使细胞增殖，由该方法制作的心肌细胞可用作各种药剂的筛选用及移植治疗用的细胞。另外，通过将该方法应用于基因治疗，从而可获得由心肌细胞的坏死、缺失等引起的心脏病的再生医疗的治疗的可能性。可知，本发明的miRNA对心肌细胞显示显著的增殖活性。
附图说明
图1为显示实施例2中转染miR-148a（SEQ ID NO:3）、miR-152（SEQ ID NO:7）、miR-373（SEQ ID NO:9）而得的原代培养心肌细胞中的Ki67阳性心肌细胞率的图。Ki67为细胞核蛋白质，是作为用于检测增殖细胞的标志而使用的蛋白质。
图2为显示实施例3中感染了表达miR-148a（SEQ ID NO:3）、miR-152（SEQ ID NO:7）、miR-373（SEQ ID NO:9）的重组腺病毒的原代培养心肌细胞中的Ki67阳性心肌细胞率。None表示未处理。
图3-1为显示实施例4中转染miR-148a（SEQ ID NO:3）、miR-152（SEQ ID NO:7）、miR-373（SEQ ID NO:9）而得的原代培养心肌细胞中的磷酸化组蛋白H3（H3P）阳性心肌细胞率的图。
图3-2为显示实施例4中感染了表达miR-148a（SEQ ID NO:3）、miR-152（SEQ ID NO:7）、miR-373（SEQ ID NO:9）的重组腺病毒的原代培养心肌细胞中的H3P阳性心肌细胞率的图。None表示未处理。
图3-3为实施例4中利用抗H3P抗体、抗肌钙蛋白T抗体、以及用DAPI，对感染了表达miR-148a（SEQ ID NO:3）、miR-152（SEQ ID NO:7）、miR-373（SEQ ID NO:9）的重组腺病毒的原代培养心肌细胞进行免疫染色的细胞显微镜照片。H3P:绿、肌钙蛋白T:红、DAPI:蓝
图4为显示实施例5中使表达miR-148a（SEQ ID NO:3）、miR-152（SEQ ID NO:7）、miR-373（SEQ ID NO:9）的重组腺病毒在生物体内感染大鼠心脏而得到的心脏组织切片的Ki67阳性心肌细胞率的图。
具体实施方式
在本发明的实施中，关于分子生物学、微生物学、细胞生物学及重组DNA技术等一般的方法及现有技术，如果没有特别注释，本领域技术人员可以参照该领域的标准参考书籍。这些可以参考例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual第3版（Sambrook & Russell,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001）；Current Protocols in Molecular biology（Ausubel等编，John Wiley & Sons,1987）；Methods in Enzymology系列（Academic Press）；PCR Protocols:Methods in MolecularBiology（Bartlett & Striling编，Humana Press,2003）；Animal CellCulture:A Practical Approach  第3版（Masters编，OxfordUniversity Press,2000）；Antiboides：A Laboratory Manual（Harlow等＆ Lane编，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1987）。此外，在本说明书中，用于可参照的细胞培养、细胞生物学实验的试剂及试剂盒类已有市售，可以容易地（从Sigma公司、Aldrich公司、Invitrogen/GIBCO公司、Clontech公司、Stratagene公司等）获得。
本发明中，作为第1方式，提供具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA。
本发明中，作为第2方式，还提供：一种用于治疗心脏病的药物组合物，其使用了上述规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸；一种心脏病的治疗方法，其特征在于，通过将规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸导入个体心脏的损伤部位，从而使心肌细胞在该部位增殖；一种规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸在制造心脏病治疗用药物组合物中的用途；以及一种规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸，其在心脏病的治疗中使用。
本发明中，作为第3方式，提供使用了上述规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸的心肌细胞的增殖方法。
心肌细胞
作为使用本发明的方法进行增殖的对象的心肌细胞，通常可以包括成体心肌细胞、幼体心肌细胞、以及胎儿心肌细胞的全部发生阶段的心肌细胞。并且，本发明中，可以以哺乳动物的心脏组织内存在的心肌细胞为直接的对象，但在本发明的第1方式及第3方式中，还可以使用生物体外的培养心肌细胞等。
本发明中，作为生物体外的培养心肌细胞，无论来源于什么样的供给源的心肌细胞均可使用，例如，可以使用通过酶处理等各种方法从生物体心脏组织分离的心肌细胞，或在适当的培养条件下将其培养1～5天左右的原代培养细胞。具体的心肌细胞的培养法在很多参考文献中有记载，作为代表的方法，可以使用Chien的方法及其改进方法（Chien et al.,The Journal ofClinical Investigation,75:1770-1780,(1985)；Meidell et al.,American Journal of Physiology,251:H1076-H1084,(1986)；Tamamori et al.,American Journal of Physiology,275:H2036-H2040,(1998)）等。
另外，作为培养心肌细胞，不限定于上述的例子，还包括由各种干细胞分化诱导而得到的心肌细胞。本发明的实施中所使用的干细胞是指具有如下性质的细胞：在试管内培养下可分化成具有心肌细胞样表型的细胞，具体而言，可列举出已经作为培养细胞而广泛使用的小鼠、猴子、人等哺乳动物来源的胚胎干细胞（ES细胞）、人工多能干细胞（iPS细胞）、胚胎生殖细胞（EG细胞）等多能干细胞。关于这些细胞的制作、累代、保存方法，已经确立了标准的方案（protocol），本领域技术人员可以参照多种参考书籍，例如Manipulating the MouseEmbryo：A laboratory manual（Hogan等编，Cold Spring HarborLaborayory Press,1994），Embryonic Stem Cells（Turksen编，Humana Press,2002），及多个参考文献（Matsui et al.,Cell,70:841-847,(1992)；Shamblott et al.,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America,95:13726-13731,(1998)；Okita et al.,Nature,448:313-317,(2007)；Takahashi et al.,Cell,131:861-872,(2007)），从而能够容易地使用这些多能干细胞。可用于本发明的干细胞不限定于上述干细胞，只要是具有与ES细胞类似的表型的干细胞，则可以任意使用。此时，与ES细胞类似的表型可定义为具有如下性质：ES细胞中特异性表面（抗原）标志的存在、ES细胞特异性基因的表达、以及畸胎瘤（teratoma）形成能力、嵌合体小鼠形成能力等ES细胞特异性细胞生物学性质。
此外，即使是不具有与ES细胞类似表型的细胞或并非多能干细胞的细胞，只要是至少具有如下性质的细胞：在试管内培养下可分化成具有心肌细胞样表型的细胞，则可以使用本发明所记载的方法。作为这样的细胞的例子，可列举出骨髓细胞来源的骨髓间充质干细胞（Bruder et al.,USP 5,736,396；Pittengeret al.,Science,284:143-147,(1999)）、CMG细胞（Makino et al.,The Journal of Clinical Investigation,103:697-705,(1999)；WO01/048151）、肌肉组织来源的S poc细胞（WO03/035382）等细胞作为例子。
本发明中，作为由干细胞制备心肌细胞的培养法，只要是适于心肌细胞的分化诱导的方法，则可以使用任一培养法。关于具体的分化诱导法，已经确立了多种方法，本领域技术人员可参照例如Embryonic Stem Cells（Turksen编，Humana Press,2002）这类参考书籍、多个参考文献（Klug et al.,The Journal ofClinical Investigation,98:216-224,(1996)；Wobus et al.,Journalof Molecular and Cellular Cardiology,29:1525-1539,(1997)；Kehat et al.,The Journal of Clinical Investigation,108:407-414,(2001)；Xu et al.,Circulation Research,91:501-508,(2002)；Takahashi et al.,Circulation,107:1912-1916,(2003)；Field et al.,USP 6,015,671；Xu et al.,WO03/06950），由干细胞分化诱导心肌细胞。
微小RNA（miRNA）
本发明提供具有心肌细胞的增殖促进作用的微小RNA（miRNA）。作为本发明的miRNA，只要能够促进心肌细胞的增殖，则什么样的miRNA都可以，可用于使上述心肌细胞增殖。
本发明中，miRNA是指包括哺乳类在内的真核生物中大量表达的不编码蛋白质的小RNA，认为其参与发生、分化、增殖等各种生命现象。作为本发明中可使用的miRNA，包括成熟型miRNA及该miRNA的前体、以及它们的突变体及类似物。本发明的miRNA可以为单链，也可以为双链。
本发明中，成熟型miRNA是指完全加工后的miRNA，为15至30个核苷酸的长度（多为21至25个核苷酸的长度）。成熟型miRNA可构成miRNA家族，所述miRNA家族由共有成熟型miRNA分子的5’侧的1至12的核苷酸中的至少6个连续的核苷酸（该核苷酸部分也称作“种子区域”（Brennecke et al.,PLoSBiology,3:e 85,(2005)）的一组miRNA构成。因此，miRNA家族中包含成熟型miRNA的5’区域相同但3’侧不同的多个成熟型miRNA。只要属于相同的miRNA家族，则即使3’侧区域的核酸序列不同，也具有同样的机能，例如报道了关于Bagpipe 3’UTR中的1处8-mer的种子区域的序列（种子序列）（Brennecke et al.,PLoS Biology,3:e 85,(2005)），在该事例的情况下，构成如下miRNA家族的miRNA中，2个不同的miRNA虽然3’侧不同，但均可抑制含有8-mer靶的报告基因的表达，所述miRNA家族在5’区域中共有与前述1处8-mer种子区域的序列所结合的序列互补的序列。
miRNA的前体是指成熟型miRNA的前体RNA。在制备成熟型miRNA的过程中，在活细胞内，就miRNA而言，基因组DNA上存在的miRNA基因首先被转录为数百～数千个碱基左右的miRNA初级转录产物（pri-miRNA），该产物在核内由被称作Drosha的RNase III酶加工，变成约70个碱基左右的具有发卡结构的前体miRNA（pre-miRNA）。因此，本发明中，称作miRNA的前体时，包括miRNA初级转录产物（pri-miRNA）及前体miRNA（pre-miRNA）。
miRNA突变体是指与生物体原本具有的成熟型miRNA或成熟型miRNA的前体相比，1个或数个核苷酸缺失、置换、插入或添加而成的miRNA。这里，数个是指例如最多7～6个，优选最多5～4个，进一步优选最多3～1个。如上所述，构成miRNA家族的成熟型miRNA分子的5’侧存在“种子区域”，只要属于同一miRNA家族，则即使3’侧区域的核酸序列不同，也具有同样的机能。因此，miRNA突变体优选为在成熟型miRNA的种子区域以外的部分缺失、置换、插入或添加核苷酸而成的miRNA。
miRNA类似物是指模仿内源性的成熟型miRNA或成熟型miRNA的前体而合成的miRNA。该物质已有市售，可以（例如从Ambion公司）容易地获得。
为了提高本发明的miRNA的稳定性，例如，可使用核酸衍生物和/或具有改进型核苷间键的核酸。这些核酸衍生物可以适当选择公知的物质使用。具体而言，例如可列举出甲基膦酸酯（methylphosphonate）、硫代磷酸酯（phosphorothioate）、二硫代磷酸酯（phosphorodithioate）、氨基磷酸酯（phosphoramidate）、磷酸三酯(phosphotriester)、砜(sulfone)、硅氧烷（siloxane）、碳酸酯（carbonate）、羧甲基酯（carboxymethylester）、乙酰亚胺（acetamidate）、氨基甲酸酯(carbamate)、硫醚（thioether）、交联型氨基磷酸酯（bridged phosphoramidate）、交联型亚甲基磷酸酯（bridged methylene phosphonate）、交联型硫代磷酸酯（bridged phosphorothioate）、二甲基硫醚(dimethylene-sulfide)、二甲基亚砜(dimethylene-sulfoxide)、二甲基砜(dimethylene-sulfone)、2'-O-烷基(2'-O-alkyl)、及2'-脱氧-2'-氟代硫代磷酸酯(2'-deoxy-2'-fluoro phosphorothioate)等含有核苷间键的核酸等（Uhlmann & Peyman,Chemical Reviews,90:543-584,(1990)，Schneider et al.,Tetrahedron Letters,31:335-338,(1990)）。进而可列举出Locked Nucleic Acid（Koshkin et al.,Journal of the American Chemical  Society,120:13252-13253(1998)）、ENA（US7335765）等衍生物。本发明中将这样的核酸衍生物和/或具有改进型核苷间键的miRNA称作miRNA衍生物。miRNA衍生物包括成熟型miRNA的衍生物、miRNA的前体的衍生物、miRNA突变体的衍生物、及miRNA类似物的衍生物。
本发明中可使用的miRNA例如可通过使用公知的方法从天然物中分离、化学合成、或利用基因重组技术产生从而获取，此外，还可以以市售品的方式获得。例如，成熟型miRNA已经注册为Sanger miRbase，该注册过的全部miRNA可以从Ambion公司、Qiagen公司、Sigma公司、Thermo Scientific公司等获得。
作为用于将miRNA送达至生物体内的细胞或体外细胞的细胞内的方法，可以使用表达载体或脂质体等该技术领域中通常使用的基因送达方法的任一种。上述成熟型miRNA或miRNA的前体也可以以低聚核酸或衍生物的形式使用，但从其表达效率、效果持续时间等方面来看，优选以重组至表达载体的形式使用。
使用表达载体作为基因送达方法时，只要是具有可表达miRNA的启动子的表达载体，则可以为任意，可以使用病毒性表达载体或非病毒性表达载体。
作为病毒性表达载体，可例示出腺病毒、腺伴随病毒（AAV）、反转录病毒、日本血球凝集病毒（HVJ；别名，仙台病毒）、慢病毒、牛痘病毒、鸡痘病毒、以SV40为代表的乳多空病毒等来源的载体，优选通过使用腺病毒载体、AAV载体、HVJ载体、或慢病毒载体，进行有效的基因导入以及导入的基因的高水平表达。
利用这些病毒载体进行的基因的导入是向哺乳动物的细胞中导入基因的最强大的方法之一，事实上，可用于向所有种类的人细胞及多数非人细胞中导入。
另外，由于这些病毒的感染不依赖于细胞周期，因此能够在各种原代培养细胞系及转化细胞系内使基因表达。特别是即使在心肌细胞这样的不发生DNA合成、细胞分裂的细胞内也能够效率良好地导入基因。感染后多数细胞接受数个重组DNA（或RNA）拷贝，因此导入的基因暂时进行高水平表达。
在利用腺病毒载体、HVJ载体等时，通常，DNA/RNA留在细胞质内，并不进入核内。因此，使用这些病毒载体时，存在如下优点：外来基因重组至宿主细胞基因组内时，几乎不发生随机发生的诱导突变的错误。
作为本发明的优选方式之一使用的腺病毒载体可通过如下方法调制：以人胎儿肾脏293细胞或大肠菌作为宿主使用同源重组的方法（Miyake et al.,Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America,93:1320-1324,(1996)），或利用简单的体外连接的方法（Mizuguchi & Kay,Human Gene Therapy,9:2577-2583,(1998)）。
腺病毒为具有双链DNA基因组的DNA病毒之一，研究最多的是人的腺病毒5型和2型。通过使这些野生型腺病毒的E1和E3基因的大部分缺失，从而能够制作不具有复制能力的病毒载体，能够插入数kb的外来DNA而不对病毒颗粒形成带来有害作用。该重组腺病毒虽然欠缺转录调节因子E1基因，但通过插入的基因特异性转录单元，能够仅使插入的目的基因表达，而不依赖于靶细胞的增殖、或其他病毒基因的有无。
腺伴随病毒（AAV）为属于细小病毒科的约4.7kb的单链DNA病毒，已知1型至12型的血清型的AAV。AAV载体通过将插入两端的ITR（Inverted terminal repeat，末端反向重复序列）的Rep（参与复制或插入）和Cap（病毒壳体）置换为目的基因从而制作。将该载体与表达Rep、Cap的质粒一起导入293细胞，进而以腺病毒作为辅助病毒使其感染，调制蓄积于核内的重组腺伴随病毒载体。最近还开发了一种通过向表达E1A、E1B的293细胞中导入表达E2A、E4、VA的质粒而不需要辅助病毒的方法。
仙台病毒（Sendai virus；SeV）为属于副粘病毒属的啮齿类的病毒，别名也称作日本血球凝集病毒（HemagglutinatingVirus of Japan；HVJ）。SeV的基因组由单股负链RNA（与mRNA互补）构成，编码核蛋白（NP）、核蛋白磷酸化酶（P）、病毒表面支架蛋白（M）、红血球凝集蛋白（HN）、膜融合蛋白（F）、及RNA合成酶（L）的6个基因。SeV通过血凝神经氨酸苷酶HN（hemaglutination-neuraminidase）蛋白吸附/分解宿主细胞的唾液酸从而结合，将基因组注入细胞质内。迁移至细胞内的病毒基因组通过自编码的L蛋白的作用进行基因的转录/复制。与通常的病毒不同，该步骤在细胞质内进行，病毒基因组不迁移至核内。
就SeV载体而言，通过使一个或数个对于导入细胞内的载体的自主复制而言所必须的N、P、L基因以外的F、HN、M基因缺损，从而可制作成非传播性载体。F基因缺失型载体如下而制作：使用在由噬菌体T7来源的RNA聚合酶识别的T7启动子下游插入重组载体cDNA而得的质粒、T7启动子支配下的N、P、F、L表达质粒、进而T7RNA聚合酶表达重组牛痘病毒，导入至猴子肾来源的LLC-MK2细胞，最近，仅基于6种质粒（在T7启动子下游插入重组载体cDNA而得到的质粒和CAG启动子支配下的N、P、L、F、T7RNA聚合酶基因表达质粒）的转染的简便的制作方法也变得可能。
关于腺病毒载体及其他病毒载体的概论、以及制作方法、使用方法，本领域技术人员可以参考多种参考书籍。例如，可列举出Gene Therapy Protocols:Methods in Molecular Medicine（Robbins编，Humana Press,1997），Gene Transfer inCardiovascular System:Experimental Approaches & TherapeuticImplications（March编，Kluwer Academic Publishers,1997），Adenoviral Vectors for Gene Therapy（Curiel & Douglas编，Academic Press,2002）等。另外，用于制作腺病毒载体的试剂盒已有市售，可以容易地（从Invitrogen公司的ViraPowerTM腺病毒表达系统（#K4930）、Takara Bio公司的AdenovirusExpres sion Vector Kit（#6170）等）获得，可利用于本发明的实施中。
另外，用于制作AAV载体、SeV载体的试剂盒也已有市售（AAV Helper-Free系统（Stratagene公司；#240071）、重组仙台病毒迷你载体调制试剂盒（MBL公司；DV-0001)等）可容易地获得，可用于本发明的实施中。
作为非病毒性表达载体，例如，可列举出具有如下启动子的载体：SV（Simian virus）40病毒启动子、巨细胞病毒（Cytomegaro virus；CMV）启动子、劳氏肉瘤病毒（Roussarcoma virus）启动子等病毒来源的启动子、β-肌动蛋白启动子、EF（elongation factor）1α启动子等、向鸟β-肌动蛋白启动子中重组CMV的增强子及兔子β-球蛋白基因的聚A附加信号序列而得的嵌合启动子CAG启动子（Niwa et al.,Gene,108:193-199,(1991)）、及作为Pol.III启动子的U6或H1启动子等，但不限于这些载体。可利用这些启动子的表达载体已有市售，可容易地（从Ambion公司、Invitrogen公司、TAKARA BIO公司等）获得。
作为导入上述基因或基因载体的方法，可以使用所有公知的方法，例如使用了磷酸钙、电脉冲的转染法；向脂质体等中封入目的基因然后转染至细胞的方法；以及向反转录病毒、腺病毒等病毒载体中重组目的基因，使该重组病毒感染细胞的方法等。此时，病毒载体是指，向病毒DNA或RNA的全长或使一部分缺损·变异而得到的核酸序列中重组目的基因并能够进行表达的构建物。
作为脂质体的具体例，可以使用包括三甲基[2,3-(二油烯基氧基)丙基]氯化铵（DOTMA）、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）等在内的脂质制剂。
具体的miRNA的获取
本发明人等基于在导入心肌细胞时是否显示显著的BrdU的引入能力，对成熟型miRNA文库进行检索，发现了miR-148a（SEQ ID NO:3）、miR-148b（SEQ ID NO:5）、miR-152（SEQID NO:7）、及miR-373（SEQ ID NO:9）等作为具有心肌细胞的增殖促进作用的成熟型miRNA，将它们用于进一步的实验。
作为本发明中可使用的优选的miRNA，还包括这些成熟型miRNA的前体。例如，作为成熟型miRNA的前体，作为例子可列举出各miRNA的miRNA初级转录产物（pri-miRNA）或前体miRNA（pre-miRNA）等。作为其具体例，例如，作为编码前述具体的成熟型miRNA的基因的初级转录产物（pri-miRNA）的以下的物质也包括在本发明中可使用的优选的miRNA内：mir-148a（miR-148a的前体，SEQ ID NO:4）、mir-148b（miR-148b的前体，SEQ ID NO:6）、mir-152（miR-152的前体，SEQ ID NO:8）以及mir-373（miR-373的前体，SEQ ID NO:10）。
[表1]
Figure BDA00002130343100241
本发明中可使用的miRNA还包括上述表1所示的成熟型miRNA及前体miRNA的突变体或类似物，或上述表1所示的miRNA的前体以外的miRNA的前体（例如，miRNA初级转录产物（pri-miRNA）等）及其突变体或类似物。
例如，本发明中可使用的成熟型miRNA即miR-148a（SEQID NO:3）、miR-148b（SEQ ID NO:5）及miR-152（SEQ ID NO:7）在各miRNA的5’侧具有共有的种子序列ucagugca（SEQ IDNO:1），构成miR-148家族。以下列示出属于miR-148家族的miRNA的各序列。对保守种子序列附上下划线。
miR-148a：ucagugcacuacagaacuuugu（SEQ ID NO:3）
miR-148b：ucagugcaucacagaacuuugu（SEQ ID NO:5）
miR-152：ucagugcaugacagaacuugg（SEQ ID NO:7）。
因此，作为本发明的miRNA之一，包括5'末端含有由ucagugca（SEQ ID NO:1）形成的种子序列的成熟型miRNA或该miRNA的前体、或它们的突变体或类似物。这些miRNA包含选自由miR-148a（SEQ ID NO:3）、miR-148b（SEQ ID NO:5）、miR-152（SEQ ID NO:7）及该miRNA的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的miRNA。例如，作为成熟型miRNA即miR-148a（SEQ ID NO:3）、miR-148b（SEQ ID NO:5）、及miR-152（SEQ ID NO:7）的前体，可列举出各miRNA的pri-miRNA、pre-miRNA等。作为其具体例，例如，可列举出分别以下述的SEQ ID NO:4、6和8表示的前体。
人mir-148a：gaggcaaagu ucugagacac uccgacucug aguaugauagaagucagugc acuacagaac uuugucuc（SEQ ID NO:4）
人mir-148b：caagcacgau uagcauuuga ggugaaguucuguuauacac ucaggcugug gcucucugaa agucagugca ucacagaacuuugucucgaa agcuuucua（SEQ ID NO:6）
人mir-152：uguccccccc ggcccagguu cugugauaca cuccgacucgggcucuggag cagucagugc augacagaac uugggcccgg aaggacc（SEQ IDNO:8）。
另外，作为在本发明中可使用的其他成熟型miRNA的miR-373，在其miRNA的5’侧具有共通的种子序列gaagugcu（SEQ ID NO:2），构成miR-373家族。示出属于miR-373家族的miRNA的序列。种子序列附上下划线。
miR-373：gaagugcuucgauuuuggggugu（SEQ ID NO:9）。
因此，作为本发明的miRNA之一，包括5'末端含有由gaagugcu（SEQ ID NO:2）形成的种子序列的成熟型miRNA或该miRNA的前体、或它们的突变体或类似物。这些miRNA包括选自由miR-373（SEQ ID NO:9）及该miRNA的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的miRNA。例如，作为成熟型miRNA即miR-373（SEQ ID NO:9）的前体，可列举出该miRNA的pri-miRNA、pre-miRNA等。作为其具体例，例如，可列举出下述SEQ ID NO:10所表示的前体。
人miR-373：gggauacuca aaaugggggc gcuuuccuuuuugucuguac ugggaagugc uucgauuuug ggguguccc（SEQ ID NO:10）。
已经明确：这样而得到的本发明的miRNA对心肌细胞显示显著的增殖活性。
需要说明的是，本发明的miRNA对于正常细胞的株化细胞即MRC-5(来源于人类胎儿的肺）细胞、WI-38(来源于人类胎儿的肺）细胞及MC3T3-E1(来源于小鼠的颅顶盖）细胞等不显示显著的增殖促进活性。
作为基因治疗法的应用
作为本发明的其他方式，提供一种含有表达载体的基因治疗用药物组合物，所述表达载体为用于本发明的实施的病毒载体或非病毒性载体等表达载体，为含有规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸的表达载体（以下，简称为“基因表达载体”），优选为病毒载体，进一步优选为腺病毒载体或HVJ载体、AAV载体、慢病毒载体等。基因表达载体中所含的用于规定miRNA的核酸，只要是限定已说明的“具体的miRNA的获取”这项中说明的miRNA的核酸，则可以为任意。由于该基因治疗用药物组合物含有规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸，因此通过miRNA的作用，可以用作心肌再生药或心脏病治疗药。作为成为治疗对象的心脏病，只要是伴随着心肌细胞的衰弱、机能停止或死亡的疾病，则没有特别限定，作为具体例，可列举出心肌梗塞、缺血性心脏病、充血性心力衰竭、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、心肌炎、慢性心力衰竭等。
药物组合物的剂型没有特别限定，可以通过惯用的方法制剂化。例如，可以为在灭菌水、缓冲化生理盐水等药学上可接受的药剂载体、稀释液中含有本发明的基因表达载体的可注射的调制物的形态。作为药剂载体，还可以含有其他适当的稳定剂（例如，核酸酶抑制剂等）、螯合剂（例如，EDTA等）、和/或其他的助剂。含有上述成分的药物组合物根据需要可通过过滤等方法灭菌，可填充至无菌安瓿等容器。
本发明的药物组合物的投与量需要根据患者的年龄、性别、体重、症状、及给药途径等条件适当增减而使用，若是本领域技术人员，则可适当设定需要的用量。一般而言，成人每1次的用量中作为有效成分的DNA量为1.0μg/kg～1.0g/kg左右的范围，优选为10μg/kg～100mg/kg左右的范围。另外，使用腺病毒载体等病毒载体时，期望病毒的最终效价优选为107～1013pfu/mL、进一步优选为109～1012pfu/mL。
本发明的药物组合物在基因表达载体为基于非病毒性载体的载体的情况下，特别是以与脂质体的复合体的形式供给较佳。通过这样的形态，具有特别是在心肌细胞内实现高转染效率的可能性。作为脂质体的具体例，开发了较多新型的包括三甲基[2,3-(二油烯基氧基)丙基]氯化铵（DOTMA）、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）等在内的脂质制剂，正在对使用了各种细胞系的转染进行实验（Banerjee,Journal of BiomaterialsApplications,16:3-21,(2001)；Maurer et al.,Expert Opinion on BiologicalTherapy,1:923-947,(2001)）。另外，使用了HVJ来源的具有融合形成性包膜的融合形成性病毒脂质体方法，所谓的HVJ-脂质体法（Yonemitsu et al.,International Journal of Oncology,12:1277-1285,(1998)；Kaneda et al.,Molecular Medicine Today,5:298-303,(1999)）也是有效的。以这些核酸导入为目的的脂质体已有市售，特别是以miRNA的导入为对象的脂质体，可以利用Lipofectamine RNAi MAX（Invitrogen公司），Oligofectamine（Invitrogen公司），siLentFect（BIO-RAD公司），HiPerFect（Qiagen公司）等。
上述基因表达载体或含有其的药物组合物可以导入心脏病患者的整个心脏，但优选局限于损伤部位进行导入。本发明中，损伤部位是指个体（人或非人动物：以下相同）心肌细胞衰弱、机能停止或死亡的部位及其附近区域，或者是可以预想到个体心肌细胞的衰弱、机能降低的进行或死亡的部位。此时，作为将基因表达载体或含有其的药物组合物导入损伤部位的方法，也可以使用浸透泵、浸透管等将制剂连续地输送到损伤部位，还可以列举出在开胸的基础上使用注射器直接地注入心脏的方法、或在X射线透视下使用导管经由血管（间接的）注入的方法等。
经由血管的方法由于将基因的导入局限于心脏，故优选，此时，基因表达载体或含有其的药物组合物可注入血管内、介由血流输送至心肌细胞，也可以直接注入心肌层内使其与心肌细胞接触。这种使用导管等的外科手术技术在该领域是公知的，作为参考书籍，例如，可列举出Gene Transfer in CardiovascularSystem:Experimental Approaches & Therapeutic Implications（March编，Kluwer Academic Publishers,1997）、VascularSurgery第5版（Rutherford,W.B.Saunders,2000）、Textbook ofInterventional Cardiology第4版（Topol编，W.B.Saunders,2002）等的。另外，用于实施上述方法的导管已有市售，可以（从Boston Scientific公司、Edwards Lifesciences Corporation公司等）容易地获得。
利用本发明的方法增殖的心肌细胞的用途
利用本发明的方法增殖的心肌细胞通过随后使用基于公知方法的细胞回收、分离、纯化法，能够有效且大量地获得高纯度的心肌细胞。以下将这样获得的心肌细胞称作通过本发明而调制的心肌细胞。
心肌细胞的纯化方法只要是公知的细胞分离纯化的方法即可以使用，作为其具体的例子，可列举出流式细胞仪、磁珠、淘选法等基于抗原－抗体反应的方法，或基于使用了蔗糖、Percoll等载体的密度梯度离心的细胞分级法。
另外，作为其他的心肌细胞筛选法，可列举出，事先向成为心肌细胞源的动物或ES细胞等的干细胞的基因中人为地添加用于赋予药剂耐性、异位蛋白质的表达能力的各种修饰，以这些指标为基础选择性回收心肌细胞的方法。例如，Field及共同研究者等报道了：通过将可在α型肌球蛋白重链启动子的控制下使耐新霉素（G418）基因表达的基因盒导入小鼠ES细胞，从而构筑了仅在与ES细胞分化为心肌细胞相伴的α型肌球蛋白重链基因表达时才可在添加了G418的培养基中生存的细胞系，通过该方法筛选作为G418耐性细胞的细胞，99％以上的概率为心肌细胞（USP 6,015,671；Klug et al.,The Journal of ClinicalInvestigation,98:216-224,(1996)）。
作为本发明的另一其他方式，通过本发明调制的心肌细胞对于各种生理活性物质（例如，药物）、机能未知的新型基因产物等的药理评价及活性评价有用。例如，可用于与心肌细胞的机能调节相关的物质、药剂或对于心肌细胞具有毒性、伤害性的物质、药剂的筛选。在进一步的方式中，含有通过本发明调制的心肌细胞的评价试剂盒对于上述筛选有用。
作为供于筛选的待测物质，只要是可添加至培养系中的物质，则不限定种类，例如，可列举出低分子化合物、高分子化合物、有机化合物、无机化合物、蛋白质、肽、基因、病毒、细胞、细胞培养液、微生物培养液等。作为将基因有效地导入培养系中的方法，可列举出使用反转录病毒、腺病毒等的病毒载体添加至培养系中的方法，或封入脂质体等内添加至培养系中的方法等。
待测物质的评价可通过测定心肌细胞机能的质的或量的变化来进行。若将心肌细胞的生存性作为一例来列举，将通过本发明调制的心肌细胞按照达到适当细胞密度的方式播种至培养皿中，若在不含血清的培养基中培养，则可诱导细胞死（细胞凋亡），此时，将适量的待测物质添加至培养基中，测定心肌细胞的生存率或死亡率即可。作为心肌细胞的生存率或死亡率的测定方法，可以使用如下方法：将台盼蓝等色素的摄入作为指标的、利用肉眼进行观察的方法；以脱氢酶的活性（还原活性）作为指标的方法；以及将凋亡细胞特异性半胱天冬酶活性、或膜联蛋白V的表达作为指标的方法。利用了该机理的试剂盒已有市售，可容易地（从Sigma公司、Clonetech公司、Promega公司等）获得。
通过上述筛选方法而得到的物质、药剂具有心肌细胞的分化诱导作用、机能调节作用，因此可用作例如心肌梗塞、缺血性心脏病、充血性心力衰竭、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、心肌炎、慢性心力衰竭等心脏病预防药或治疗药。这些化合物可以为新型化合物，也可以为公知的化合物。
另外，通过本发明调制的心肌细胞可用作心肌再生或心脏病治疗用的移植用细胞。作为心脏病，可列举出心肌梗塞、缺血性心脏病、充血性心力衰竭、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、心肌炎、慢性心力衰竭等。作为移植用细胞，只要以高纯度含有通过本发明调制的心肌细胞，则可以为使细胞浮游于培养基等水性载体上的细胞、将细胞包埋于生物体分解性基质等固相载体中的细胞、或者加工成单层或多层的心肌细胞层（Shimizuet al.,Circulation Research,90:e40-e48,(2002)）的细胞等，无论哪种形状的细胞均可使用。
作为将上述移植用心肌细胞移植到损伤部位的方法，可列举出开胸、使用注射器直接注入心脏的方法、将心脏的一部分外科切开进行移植的方法、以及利用使用导管的经由血管的方法进行移植的方法等（Murry et al.,Cold Spring HarborSymposia on Quantitative Biology,67:519-526,(2002)；Menasche,The Annals of Thoracic Surgery,75:S20-S28,(2003)；Do孔 et al.,Cardiovascular Research,58:336-350,(2003)），并不特别限定于此。报道通过这样的方法，将由胎儿心脏回收的心肌细胞移植到心病变动物的心脏中时，显示了非常良好的治疗效果（Menasche,The Annals of Thoracic Surgery,75:S20-S28,(2003)；Reffelmann et al.,Heart Failure Reviews,8:201-211,(2003)）。ES细胞来源的心肌细胞呈现与胎儿心脏来源的心肌细胞非常相似的表型（Maltsev et al.,Mechanisms of Development,44:41-50,(1993)；Maltsev et al.,Circulation Research,75:233-244,(1994)）。另外，实际上在将ES细胞来源的心肌细胞移植到成体心脏中的动物实验例中，与移植胎儿心肌的例子几乎同样，确认到显示极高的植入性（Klug et al.,The Journal ofClinical Investigation,98:216-224,(1996)）。因此，期待对于起因于心肌细胞的疲惫及脱落的上述心脏病而言，通过将利用本发明所述的方法调制的心肌细胞补充性地移植入病变心脏组织中，可以促进心脏机能的改善。
实施例
以下，列举实施例更具体地说明本发明，但以下的实施例只是本发明的纯粹的例示，并不限定本发明的范围。
实施例1：使用了原代培养心肌细胞的以BrdU摄取为指标 的miRNA文库筛选
从出生后第2～4天的大鼠（Wistar系，由清水实验材料株式会社获得）中摘出心脏，从通过胶原酶处理而得到的细胞组中利用Percoll浓度梯度离心分离（将悬浮了细胞的密度1.082g/mL的Percoll溶液层叠于密度1.050g/mL、1.060g/mL的Percoll溶液，以4℃、3000rpm（2000G）离心25分钟）回收心肌细胞级分。将这样而得到的心肌细胞悬浮于添加了5％小牛血清（FCS；SAFC Bioscience公司）的最低必需培养基（nakalaitesque）中后，播种至培养用皿中，在二氧化碳培养箱中，在37℃下进行培养。对这样调制的心肌细胞（96孔板，15,000cells/孔），使用LipofectamineTM RNAiMAX（Invitrogen）转染各2pmolPre-miRTM miRNA Precursor Library-HumanV2（Ambion：模仿miRBase Sequence Database Version 8.0中收载的328个人成熟型miRNA而设计的文库），2天后使用细胞增殖ELISA、BrdU化学发光试剂盒（Roche）测定BrdU的摄取量，与作为阴性对照的Pre-miRTM miRNA前体分子阴性对照#1（Ambion）添加组中的BrdU的摄取量进行比较，选择呈现显著高的BrdU的摄取效果的，作为能够显著促进DNA的合成能力的候补miRNA。在该试验中，作为上述候补miRNA的例子，可选择miR-148a、miR-148b、miR-152及miR-373。
[表2]
  miRNA   SEQ ID N0   BrdU值
  miR-148a   3   2.7
  miR-148b   5   2.3
  miR-152   7   2.6
  miR-373   9   2.9
实施例2：利用原代培养心肌细胞中的miRNA强制表达解 析细胞周期进展标志
对于心肌细胞（24孔板，100,000cells/孔），利用LipofectamineTMRNAiMAX（Invitrogen），转染1pmol实施例1中得到的候补miRNA、miR-148a、miR-148b、miR-152及miR-373这些模仿人成熟型miRNA而设计的Pre-miRTM miRNA前体分子和阴性对照的阴性对照#1（全来自Ambion），在转染2～4天后用4％低聚甲醛固定细胞。
接着与抗Ki67抗体（ThermoSCIENTIFIC）（1：200稀释）及抗肌钙蛋白T抗体（Thermo SCIENTIFIC）（1：200稀释）反应，然后使用Alexa FluorTM标记抗体（Alexa-488及Alexa-568；Molecular Probes）（均1：400稀释）染色。另外，细胞核用4',6-二脒基-2'-苯基吲哚二盐酸盐（4',6-Diamidine-2'-phenylindoledihydrochloride：DAPI）溶液（1μg/mL）染色。
对于通过上述方法进行免疫染色的细胞，使用In CellAnalyzer1000（GE Healthcare公司）计测心肌细胞中的Ki67阳性率。Ki67核蛋白质在细胞周期的全部周期内在增殖的细胞中表达（Scholzen & Gerdes,Journal of Cellular Physiology,182:311-22,2000），因此可用于检测细胞周期持续中的细胞。
将该结果示于图1。
由该结果可知，鉴定出miR-148a、miR-148b、miR-152及miR-373，作为与使用了阴性对照#1的情况相比具有显著的心肌细胞的增殖促进作用的miRNA。
实施例3利用原代培养心肌细胞中的腺病毒表达miRNA 强制表达解析细胞周期进展标志
作为用于表达miR-148a、miR-152、miR-373的腺病毒载体，使用ViraPowerTM Adenoviral Expression System（Invitrogen公司）来制作。即，以人类基因组DNA为模板通过以下所示的引物使用PCR，来扩增含有各miRNA的前体序列及邻接的数百核苷酸的人类基因组DNA片段。
hsa-miR-148a-F：5’-caccgaacacacctgcaggaagaaact-3’（SEQID NO:11）
hsa-miR-148a-R：5’-gttcccatttacagggtttaaccca-3’（SEQ IDNO:12）
hsa-miR-152-F：5’-caccgtcccagactcggctcccatca-3’（SEQ IDNO:13）
hsa-miR-152-R：5’-actcgaggtggacaccctgtgt-3’（SEQ ID NO:14）
hsa-miR-373-F：5’-caccgtgaccaaggggctgtatgca-3’（SEQ IDNO:15）
hsa-miR-373-R：5’-ctgcccaccccagaatatgcca-3’（SEQ ID NO:16）。
将这些PCR产物插入pENTR/D-TOPO载体（Invitrogen公司）中，进行其碱基序列的确认，使用Gateway system（Invitrogen公司）重组至pAd/CMV/V5-DEST载体（Invitrogen公司），制作pAd/CMV-miR-148a、pAd/CMV-miR-152、及pAd/CMV-miR-373。接着将这些载体用制限酶PacI切断，使用Lipofectamine2000（Invitrogen公司）转染人肾脏来源的293A细胞，制作重组腺病毒Ad-miR-148a、Ad-miR-152、及Ad-miR-373。由上述方法制作的重组腺病毒成为在CMV启动子的控制下表达各插入miRNA的前体的结构，可在哺乳动物细胞内进行高表达。哺乳动物中表达的miRNA的前体通过哺乳动物细胞内的酶组而成为具有功能的成熟型miRNA。
另外，在该实验中，使用了市售的用于LacZ表达的重组腺病毒Ad-LacZ（takara-bio株式会社）。
接着，对各重组病毒进行高效价病毒液的调制，调制的病毒液的效价使用293A细胞通过噬菌斑测定来确定，均为109～1010pfu/mL的范围内。另外，本说明书中，以下用感染复数（multiplicity of infection；moi）来表示每个细胞感染的活病毒颗粒数。即，将使1个细胞感染1个病毒颗粒的情况表示为moi＝1。
另外，将调制的各重组病毒以moi＝10～1000添加至心肌细胞中，2天后使用miRNeasy mini kit（Qiagen公司）回收包括miRNA在内的总RNA。使用10ng该总RNA，使用TaqManMicroRNA reverse transcription kit（Applied Biosystems公司）和TaqMan MicroRNA Assay（Applied Biosystems公司）附带的各miRNA特异性逆转录用引物来合成cDNA，接着使用TaqManMicroRNA Assay（Applied Biosystems公司）附带的各miRNA特异性正向及逆向引物和TaqMan探针，通过Applied Biosystems7900HT Fast Real time PCR system进行实时PCR法，对成熟型miRNA的表达量进行定量。
使用RNU6B作为内源性对照，对表达量进行标准化。其结果，确认到成熟型miRNA的表达是依赖于病毒的用量的。
将如此而调制的重组病毒Ad-miR-148a、Ad-miR-152及Ad-miR-373和作为阴性对照的Ad-LacZ以moi＝10～100添加至心肌细胞（24孔板，100,000cells/孔）中，在2～4天后用4％低聚甲醛固定细胞。
接着与抗Ki67抗体（ThermoSCIENTIFIC公司）（1：200稀释）及抗肌钙蛋白T抗体（ThermoSCIENTIFIC公司）（1：200稀释）反应，然后用Alexa FluorTM标记抗体（Alexa-488及Alexa-568；Molecular Probes）（均1：400稀释）染色。另外，细胞核用DAPI溶液（1μg/mL）染色。
对通过上述方法进行免疫染色的细胞，使用In CellAnalyzer1000计测心肌细胞中的Ki67阳性率。
将其结果示于图2。在该图中，None表示未处理。
由该结果可知，在miR-148a、miR-152及miR-373的任一情况下，与阴性对照（LacZ）的情况相比，作为细胞周期进展标志的Ki67为阳性，心肌细胞的细胞周期加速，确认到具有心肌细胞的增殖促进作用。
实施例4利用原代培养心肌细胞中的miRNA强制表达或 腺病毒表达miRNA强制表达解析细胞分裂标志
以与实施例2同样的方法，用miR-148a、miR-148b、miR-152、miR-373及作为阴性对照的阴性对照#1转染心肌细胞。另外，以与实施例3同样的方法将Ad-miR-148a、Ad-miR-152及Ad-miR-373和阴性对照的Ad-LacZ添加至心肌细胞中。分别在添加后2～3天后用4％低聚甲醛固定细胞。
接着与抗磷酸化组蛋白H3（H3P）抗体（MILLIPORE公司）（1：200稀释）及抗肌钙蛋白T抗体（ThermoSCIENTIFIC公司）（1：200稀释）反应后，使用Alexa FluorTM标记抗体（Alexa-488及Alexa-568；Molecular Probes）（均1：400稀释）染色。另外，细胞核用DAPI溶液（1μg/mL）染色。
对通过上述方法进行免疫染色的细胞，使用In CellAnalyzer1000计测心肌细胞中的H3P阳性率。由于组蛋白H3的Ser-10的磷酸化与细胞的有丝分裂时所见的染色质的聚集密切相关（Adamas,R,The Journal of Cell Biology,153:p.865-880,2001），因此用作细胞分裂的标志。
将该结果示于图3-1、图3-2。该图中，None表示未处理。另外，将进行了上述免疫染色的细胞的显微镜照片示于图3-3。
由该结果可知，即使在miR-148a、miR-152及miR-373的任一种情况下，图3-1的情况与阴性对照（阴性对照#1）相比，图3-2的情况与阴性对照（Ad-LacZ）相比，作为细胞分裂标志的H3P为阳性，可观察到有丝分裂中和正在进行细胞质分裂的细胞，因此心肌细胞的细胞分裂加速，确认到这些微小RNA具有心肌细胞的增殖促进作用。
实施例5：生物体内的心肌细胞的增殖可能性的研究
为了确认miR-148a、miR-152、miR-373的表达是否引起生物体内心肌细胞的增殖，将Wistar系大鼠（250～300ｇ）开胸，通过目视使用30G注射针向心尖部（apical region）的共4处注入总量200μL的实施例3中调制的重组病毒Ad-miR-148a、Ad-miR-152及Ad-miR-373（分别1×109pfu/mL）。作为阴性对照，使用miR-141，将成为目标的序列按照实施例3的方法、以人类基因组DNA为模板通过以下所示引物使用PCR进行扩增：
hsa-miR-141-F：5’-caccgcagggatcctgggcctga-3’（SEQ ID NO:17）
hsa-miR-141-R：5’-cgggaagacaatggaggtgcct-3’（SEQ ID NO:18），使用该PCR产物如实施例3所述的那样制作Ad-miR-141，将Wistar系大鼠（250～300ｇ）开胸，通过目视使用30G注射针向心尖部（apical region）的共4处注入总量200μL的Ad-miR-141（1×109pfu/mL）。
注入后经过4天后，将4％低聚甲醛灌流固定心脏组织，制作切片，与抗Ki67抗体（ThermoSCIENTIFIC公司）（1：500稀释）及抗肌钙蛋白T抗体（ThermoSCIENTIFIC公司）（1：600稀释）反应，然后使用Alexa FluorTM标记抗体（Alexa-488及びAlexa-568；Molecular Probes）（均1：400稀释）分别染色成绿色及红色从而可视化。另外，细胞核使用DAPI染色成蓝色从而可视化。
使用荧光显微镜观察染色的心脏组织切片，将DAPI和肌钙蛋白T均为阳性的细胞作为心肌细胞，将Ki67和肌钙蛋白T均为阳性的细胞作为正在进行细胞周期的心肌细胞，测定正在进行细胞周期的心肌细胞的比例。各个体所测定的细胞数为300以上。将其结果示于图4。图4中，可知感染了miR-148a、miR-152或miR-373的腺病毒的心脏中Ki67阳性心肌细胞的比例明显增加。另一方面，在感染了作为阴性对照的miR-141的腺病毒的心脏中，几乎未确认到Ki67阳性心肌细胞。
由该结果显示，即使在生物体内，通过使miR-148a、miR-152及miR-373表达，从而作为细胞周期进展的标志的Ki67为阳性，心肌细胞的细胞周期加速，获得了增殖能力。
序列表自由文字：
SEQ ID NO:1：miR-148家族的5’侧共通的种子序列；
SEQ ID NO:2：miR-373家族的5’侧共通的种子序列；
SEQ ID NO:11：用于扩增miR-148a基因的编码区域的正向引物，hsa-miR-148a-F；
SEQ ID NO:12：用于扩增miR-148a基因的编码区域的反向引物，hsa-miR-148a-R；
SEQ ID NO:13：用于扩增miR-152基因的编码区域的正向引物，hsa-miR-152-F；
SEQ ID NO:14：用于扩增miR-152基因的编码区域的反向引物，hsa-miR-152-R；
SEQ ID NO:15：用于扩增miR-373基因的编码区域的正向引物，hsa-miR-373-F；
SEQ ID NO:16：用于扩增miR-373基因的编码区域的反向引物，hsa-miR-373-R；
SEQ ID NO:17：用于扩增miR-141基因的编码区域的正向引物，hsa-miR-141-F；
SEQ ID NO:18：用于扩增miR-141基因的编码区域的反向引物，hsa-miR-141-R；
其他的序列请参考表1。
Figure IDA00002130343600011
Figure IDA00002130343600021
Figure IDA00002130343600031
Figure IDA00002130343600041
Figure IDA00002130343600051

Claims (20)

1.一种心脏病治疗用药物组合物，其含有规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，miRNA为选自由成熟型miRNA及该miRNA的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的物质。
3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中，miRNA为包含由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2构成的种子序列的物质。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中，包含由SEQ IDNO:1构成的种子序列的物质为选自由miR-148a（SEQ ID NO:3）、miR-148b（SEQ ID NO:5）、miR-152（SEQ ID NO:7）及它们的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的物质。
5.根据权利要求3所述的药物组合物，其中，包含由SEQ IDNO:2构成的种子序列的物质为选自由miR-373（SEQ ID NO:9）及其前体、以及其突变体及类似物所组成组中的物质。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的药物组合物，其以用于将其导入心肌细胞内并使其表达的表达载体形式，含有规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中，载体为病毒载体。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的药物组合物，其中，miRNA为含有至少一个修饰核苷间键、至少一个修饰糖部分、至少一个修饰碱基、或它们的组合的miRNA衍生物。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的药物组合物，其中，心脏病为心肌梗塞、缺血性心脏病、充血性心力衰竭、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、心肌炎或慢性心力衰竭。
10.一种心脏病的治疗方法，其特征在于，通过将规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸导入个体的心脏的损伤部位，从而使心肌细胞在该部位增殖。
11.一种规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸在用于制造心脏病治疗用药物组合物中的用途。
12.一种规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸，其在心脏病的治疗中使用。
13.一种心肌细胞的增殖方法，其特征在于，将规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸导入心肌细胞内并使其表达。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，miRNA为选自由成熟型miRNA及该miRNA的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的物质。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中，miRNA为包含由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2构成的种子序列的物质。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，包含由SEQ ID NO:1构成的种子序列的物质为选自由miR-148a（SEQ ID NO:3）、miR-148b（SEQ ID NO:5）、miR-152（SEQ ID NO:7）、及它们的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的物质。
17.根据权利要求15所述的方法，其中，包含由SEQ ID NO:2构成的种子序列的物质为选自由miR-373（SEQ ID NO:9）及其前体、以及其突变体及类似物所组成组中的物质。
18.根据权利要求13～17中任一项所述的方法，其包括：利用表达载体将规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸导入心肌细胞内。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，载体为病毒载体。
20.根据权利要求13～19中任一项所述的方法，其中，miRNA为含有至少一个修饰核苷间键、至少一个修饰糖部分、至少一个修饰碱基、或它们的组合的miRNA衍生物。
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