CN112263587B - miR-3065-5p在制备预防和/或治疗肾纤维化的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了将miR‑3065‑5p用于制备预防和/或治疗肾纤维化的药物，其中所述药物中miR‑3065‑5p或其模拟物可以促进E‑cadherin表达，抑制Vimentin表达，有利于缓解和/或治疗肾纤维化。本发明利用miR‑3065‑5p标志物检测肾纤维化不仅能够快速有效的做到早期检测，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。本发明还提供了肾纤维化相关的miR‑3065‑5p用于制备检测肾纤维化的诊断试剂盒，可用于诊断miR‑3065‑5p相关的肾纤维化，从而为有针对性地治疗该疾病提供依据。

Description

miR-3065-5p在制备预防和/或治疗肾纤维化的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体本发明涉及miR-3065-5p在制备预防和 /或治疗肾纤维化的药物中的应用。

背景技术

慢性肾脏疾病是严重威胁人类健康的常见疾病。肾纤维化(renal fibrosis,RF)是慢性肾病的主要病理特征之一，它是肾脏的功能由健康到损伤，再到损坏，直至功能丧失的渐进过程。肾纤维化的主要特征在于肾小管和肾小管周围毛细血管之间的区域病理性纤维状基质的沉积。在病理条件下，肾小管上皮细胞可分化成间充质细胞和活化的成纤维细胞，最终形成肌成纤维细胞，该过程被称为上皮间质转化(Epithelial–MesenchymalTransition，EMT)。肾脏由于受到创伤、感染、炎症、血循环障碍，以及免疫反应等多种致病因素刺激，其固有细胞受损，发展到后期出现大量胶原沉积和积聚，造成肾实质逐渐硬化，形成瘢痕，直至肾脏完全丧失脏器功能。

肾纤维化发生机制较为复杂，与多种因素有关，其中主要与细胞外基质细胞产生细胞的增殖和活化、血管活性物质、细胞因子以及细胞外基质转换失衡有关，肾间质纤维化几乎是所有原发或继发肾脏疾病进展到终末期肾衰竭的共同途径。肾纤维化的程度与患者预后密切相关。随着临床上肾功能的进行性下降，从病理上将肾纤维化分成炎症反应期、纤维化形成期和瘢痕形成期。其中，炎症反应期和纤维化形成期是可逆期，如能在可逆期尽早对肾功能受损的患者做出诊断和干预，这对于减缓和逆转慢性肾病的进程，改善肾脏功能，指导临床治疗，提高肾病患者的生活质量具有重要意义。

miRNA(microRNA)是一类长度为20～25个核苷酸的非编码小分子 RNA，涉及多种生物学过程，包括对发育时机、凋亡、脂肪代谢和造血细胞分化等的调节，通过影响其靶基因的稳定性或抑制其翻译转录水平来调控细胞的分化、增殖和凋亡。miRNA广泛表达于人体各个组织和器官，在机体的病理生理过程中发挥着广泛的作用；同时，miRNA有显著的组织特异性，不同的组织器官中miRNA的表达强度是截然不同的。

研究表明，miRNA在细胞中表达失调会导致肾脏纤维化在内的多种疾病的发生，miRNA在各种原因所致肾间质纤维化进程中有明确的特异性表达，为肾纤维化机制的研究提供了良好的前景和平台，也为肾纤维化治疗的靶点提供新的思路。一些miRNA在肾纤维化患者肾脏和尿液中异常表达，提示miRNA与肾纤维化的发生、发展有关。因此，寻找与肾纤维化发生、发展有关的miRNA，可以为临床上诊断和治疗肾纤维化提供有效的手段。

发明内容

为了寻找与肾纤维化发生、发展有关的miRNA，本发明目的在于提供一种肾纤维化的标志物-miR-3065-5p以及其模拟物的应用。

为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：

本发明提供了miR-3065-5p或其模拟物在制备预防和/或治疗肾纤维化的药物中的应用。

在一些实施方式中，与未发生肾纤维化的细胞系相比，所述miR-3065-5p 在肾纤维化的细胞系中表达水平下调。

在一些实施方式中，所述miR-3065-5p的模拟物包括与SEQ IDNO:1或 SEQ ID NO:2完全相同的核苷酸序列和具有所述miR-3065-5p生物活性的其各种变体形式。

在一些实施方式中，所述miR-3065-5p或其模拟物促进E-cadherin蛋白的表达，抑制Vimentin蛋白表达，从而抑制引起肾纤维化的EMT途径发生。

E-cadherin(E钙粘蛋白)是细胞黏附分子钙黏蛋白家族中重要成员，其在维持细胞间黏附性、细胞极性及细胞间信息传递方面发挥重要作用。其表达降低或缺失是EMT最显著的特征。

Vimentin(波形蛋白)作为中间丝蛋白家族的主要成员，几乎表达于所有正常的间质细胞中，对维持细胞完整性和抵御外界应急的损伤起了重要的作用。是EMT显著标志物。

进一步地，本发明提供了一种检测与肾纤维化相关miR-3065-5p的表达水平的试剂，其特征在于，所述试剂包括特异性扩增miR-3065-5p的引物和 /或探针。

在一些实施方式中，所述引物包括序列分别为SEQ ID NO:3的反转录引物，以及SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的cDNA扩增引物对。

在一些实施方式中，所述的检测与肾纤维化相关miR-3065-5p的表达水平的试剂在制备肾纤维化的检测试剂盒中的应用。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包括10×Buffer、dNTP、MgCl₂、Taq 酶和SYBRGreen荧光染料。

进一步地，本发明还提供了miR-3065-5p和/或其模拟物在制备 E-cadherin蛋白表达激活剂和/或Vimentin蛋白表达抑制剂中的应用。

在一些实施方式中，所述miR-3065-5p和/或其模拟物能促进肾纤维化细胞中的E-cadherin蛋白表达，抑制Vimentin蛋白表达，从而抑制引起肾纤维化的EMT途径发生。

基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

本发明利用miR-3065-5p标志物检测肾纤维化不仅能够快速有效的做到早期检测，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。本发明还提供了肾纤维化相关的miR-3065-5p用于制备检测肾纤维化的诊断试剂盒，可用于诊断miR-3065-5p相关的肾纤维化，从而为有针对性地治疗该疾病提供依据。本发明提供将miR-3065-5p用于制备预防和/或治疗肾纤维化的药物，其中所述药物中miR-3065-5p或其模拟物可以促进E-cadherin 蛋白表达，抑制Vimentin蛋白表达，有利于缓解和/或治疗肾纤维化。

附图说明

图1为相比正常对照HK-2细胞，在由TGF(转化生长因子)-β诱导的 EMT(上皮细胞间充质转化)细胞模型中，肾纤维化HK-2细胞的miR-3065-5p 的相对表达量显著降低；

图2A为通过HE和masson染色观察，未经UOO处理的对照(Ctrl)组小鼠的肾组织细胞具有典型的鹅卵石样形态特征，胞间衔接紧密；经UOO处理小鼠单侧肾组织细胞显示出梭形的形态，细胞间间隙明显，细胞较为瘦缩，类似成纤维细胞的形态；图2B为相比对照大鼠，在肾纤维化模型大鼠组织中，miR-3065-5p的相对表达量显著降低；

图3为转染miR-3065-5p mimic的HK-2细胞中，E-cadherin表达相比对照(Ctrl)细胞明显增加，Vimentin表达相比对照(Ctrl)细胞明显降低，而与肾纤维化不相关的微管蛋白tubulin的表达则没有发生明显变化。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明的发明人在对肾纤维化的相关研究中发现miR-3065-5p在肾纤维化对象如人(Homo sapiens)或大鼠(Rattus norvegicus)的肾脏组织或肾细胞中含量显著降低。。进一步，发明人通过miR-3065-5p mimic转染肾纤维化HK-2 细胞中，发现miR-3065-5p mimic可以促进E-cadherin表达，进而有利于缓解和/或治疗肾纤维化对象或患者的肾纤维化。证实了miR-3065-5p是与肾纤维化显著相关的标志物。

在本发明中，术语“miR-3065-5p”是指包含SEQ ID NO:1(has- miR-3065-5p，UCAACAAAAUCACUGAUGCUGGA)或SEQ ID NO:2(rno- miR-3065-5p，UCAACAAAAUCACUGAUGCU)所示序列或其同源序列的 miRNA，例如本领域中已知各种来源如人、鼠、兔等的miR-3065-5p。

本发明的“miR-3065-5p”还包含上述天然存在的miR-3065-5p序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，或经过生物学化学修饰后仍具有 miR-3065-5p生物活性的miR-3065-5p衍生物。

本发明的“miR-3065-5p”还包含人工合成的以及可以通过购买市售商品方式获得的具有miR-3065-5p生物学活性的miR-3065-5p模拟物。

此外，本发明所述的miR-3065-5p也可以为前体形式，miR-3065-5p前体是指在被施用对象的细胞内或体内可以被加工成为miR-3065-5p的前体。获得天然存在的miR-3065-5p前体的方法为本领域技术人员所公知。

本领域技术人员公知，miR-3065-5p的初始转录产物经过一系列的加工后，形成成熟的miR-3065-5p。miR-3065-5p前体只有在加工为成熟的 miR-3065-5p后才具有相应的生物学功能。

实施例1 miR-3065-5p在EMT细胞模型的肾纤维化细胞中相对表达下调

上皮间质转化(EMT)是指上皮细胞间充质转化，是肾纤维化过程的一部分。诱导EMT细胞模型：采用人肾小管上皮细胞系HK-2细胞，在HK-2 细胞培养液中加入TGF(转化生长因子)-β至终浓度为10ng/mL，培养72h后收取细胞，拍照观察并检测miR-3065-5p。

具体操作如下：

1.miRNA提取

分别收集未发生肾纤维化的对照(Ctrl)组HK-2细胞和诱导的EMT细胞模型的肾纤维化(EMT)细胞。使用Tiangen公司的miRNA提取试剂盒，每 50mg细胞样本中加入1ml裂解液，振荡器振荡混匀30秒。室温放置5min 后，12,000rpm离心10min，取上清，加入200μl氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置5min后，12,000rpm离心15min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中，缓慢加入转移液体积1/3体积的无水乙醇混匀，一起转入吸附柱，室温放置 2min,12,000rpm离心30秒，保留流出液。缓慢加入流出液体积2/3体积的无水乙醇，混匀，一起转入吸附柱，室温放置2min后12,000rpm离心30秒，离心后保留吸附柱。向吸附柱中加入500μl去蛋白液，室温12,000rpm离心30sec，弃废液。500μl漂洗液，室温12,000rpm离心30秒。将吸附柱放入 2ml收集管中，室温12,000rpm离心1min，去除残余液体。再将吸附柱转入一个新的1.5ml离心管中，加15-30μl无RNA酶的水，室温12,000rpm离心 2min。

2.逆转录

将10pg-1μg的RNA模板与2μl 10倍缓冲液、2μl dATP(10mM)、0.5μl 引物、0.5μl核糖核酸酶抑制剂和无核糖核酸酶水混合，体积最后为20μl， 37℃孵育1h。然后反应管中加入1μl 0.5μg/μl特异性反转录引物(miR-3065-5p 的反转录引物如SEQ ID NO:3所示)，70℃孵育5min后立刻冰上孵育至少 2min，打断RNA和引物的二级结构。最后，将上述20μl反应混合物与4μl 5倍缓冲液、1μl dNTP(10mM)，0.5μl M-MLV逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶抑制剂，10μl polyA反应混合液和4μl无核糖核酸酶水混合，42℃孵育1h。

反转录引物：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTC CAGCAT-3’，SEQ IDNO:3。

3.Q-PCR

采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。按照常规步骤操作，其中miR-3065-5p的 cDNA扩增引物对序列分别如SEQID NO:4(正向引物5’-TCAACAAAATC ACTG-3’)和SEQ ID NO:5(反向引物5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’)所示。配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物 (5μM/l)1μl，反向引物(5μM/l)1μl，模板cDNA 2μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃10min,(95℃20s，60℃55s)40个循环。以 SYBR Green作为荧光标记物，在荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应。通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

结果如图1所示，在发生肾纤维化(EMT)的细胞中，miR-3065-5p的相对表达量显著低于其在对照(Ctrl)细胞系中的相对表达量(*p<0.05)，在EMT 中的相对表达量约为对照中的25％。这表明miR-3065-5p可作为肾纤维化发生过程的标记物。

实施例2 miR-3065-5p在单侧输尿管结扎(UUO)动物模型的肾纤维化细胞系中相对表达下调

通过单侧输尿管结扎(UUO)构建肾纤维化动物模型，并通过HE(苏木精-伊红)染色和masson染色来验证该肾纤维化模型。然后，检测miR-3065-5p 的含量。

如图2A所示，通过HE和masson染色观察到，未进行单侧输尿管结扎 (UUO)的对照(Ctrl)组大鼠的肾组织细胞具有典型的鹅卵石样形态特征，胞间衔接紧密；经UUO处理大鼠的单侧肾组织细胞显示出梭形的形态，细胞间间隙明显，细胞较为瘦缩，类似成纤维细胞的形态。证明UUO处理成功构建了肾纤维化的动物模型。

分别收集未发生肾纤维化的对照(Ctrl)组大鼠肾组织细胞和经UUO处理大鼠单侧的肾组织细胞。参照实施例1分别提取miRNA并进行逆转录，用 Q-PCR检测miR-3065-5p的相对表达量(按照常规步骤操作，其中 miR-3065-5p的反转录引物如SEQ ID NO:3所示，cDNA扩增引物对分别如 SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示)。结果如图2B所示，在发生肾纤维化的 UUO处理大鼠单侧肾组织细胞(UUO)中，miR-3065-5p的相对表达量显著低于其在未经处理的对照(Ctrl)组大鼠的肾组织细胞中的相对表达量 (*p<0.05)，在UUO处理大鼠单侧肾组织细胞中miR-3065-5p的相对表达量约为对照组中的15％。这表明miR-3065-5p可作为肾纤维化发生过程的标记物。

实施例3肾纤维化细胞中转染miR-3065-5p模拟物后，检测上皮间质转化(EMT)标志物

用转染试剂lipofectamine 3000将miR-3065-5p模拟物(mimics)(购买自广州锐博生物科技有限公司)转染人肾小管上皮细胞系HK-2细胞，48小时后分别收集对照(Ctrl)组HK-2细胞和转染该模拟物后的HK-2细胞。参照实施例1分别提取miRNA并进行逆转录，用Q-PCR检测miR-3065-5p的相对表达量(按照常规步骤操作，其中miR-3065-5p的反转录引物如SEQ ID NO:3 所示，cDNA扩增引物对分别如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示)。结果用miR-3065-5p模拟物转染HK-2细胞后，所述细胞中miR-3065-5p的表达量显著性上升，证明该模拟物能够模拟miR-3065-5p的表达。

进一步使用免疫印迹方法检测各组细胞中皮间质转化(EMT)标志物 E-cadherin和Vimentin的表达情况。免疫印迹按照常规步骤操作(E-cadherin 抗体的生产商：abcam公司，产品批号：ab15148；Vimentin抗体的生产商： abcam公司，产品批号：ab92547；Tubulin抗体的生产商：abcam公司，产品批号：ab18207；二抗为羊抗兔或羊抗鼠，生产商：中山金桥公司)。结果如图3所示，在施用miR-3065-5p mimic的HK-2细胞中，与对照细胞(Ctrl) 相比，E-cadherin蛋白的表达明显增加，Vimentin蛋白表达明显降低，而与肾纤维化不相关的微管蛋白tubulin的表达则没有发生明显变化。

本实验说明了miR-3065-5p模拟物可以促进E-cadherin表达，抑制 Vimentin蛋白的表达，进而有利于缓解和/或治疗肾纤维化对象或患者的肾纤维化。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 河北仁博科技有限公司

<120> miR-3065-5p在制备预防和/或治疗肾纤维化的药物中的应用

<130> P20277

<141> 2020-10-23

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> hsa-miR-3065-5p

<400> 1

ucaacaaaau cacugaugcu gga 23

<210> 2

<211> 20

<212> RNA

<213> rno-miR-3065-5p

<400> 2

ucaacaaaau cacugaugcu 20

<210> 3

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactccagc at 52

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

tcaacaaaat cactg 15

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

gtgcagggtc cgaggt 16

Claims (6)

1.miR-3065-5p的模拟物在制备治疗肾纤维化的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，与未发生肾纤维化的细胞系相比，所述miR-3065-5p在肾纤维化的细胞系中表达水平下调。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述miR-3065-5p的模拟物包括与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2完全相同的核苷酸序列。

4.检测与肾纤维化相关miR-3065-5p的表达水平的试剂在制备肾纤维化的检测试剂盒中的应用，所述试剂包括特异性扩增miR-3065-5p的引物和/或探针。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述引物包括序列如SEQ ID NO:3所示的反转录引物，以及序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的cDNA扩增引物对。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括10×Buffer、dNTP、MgCl₂、Taq酶和SYBR Green荧光染料。

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