JPH06508262A - 個体の免疫系の抗体（Ａｂ）およびＴ細胞受容体（ＴｃＲ）のレパートリーを記載するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 個体の免疫系の抗体（Ａｂ）およびＴ細胞受容体（Ｔ　ｃ　Ｒ）のレパートリ− を記載するための方法技　術　分　野 本発明は、個体の免疫レパートリ−（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）を記載することを 可能にし且つかくて成る病理学的状態を検出し且つ／または監視することを可能 にする方法に関する。

背　景　技　術 免疫系の必須の特徴は、大多数の抗原を特異的に認識する能力である。を椎動物 においては、ＴおよびＢリンパ球は、主として、少なくとも３種の膜内性分子複 合体（Ｂ細胞の場合には免疫グロブリンおよびＴリンパ球の場合には２種のＴ受 容体二αβ受容体およびγδ受容体、かくてこれらは捕集１９２８球のうち２種 の亜母集団を規定する）によってこの認識機能を果たす（ウィルソン等、１９８ ８年；ラウレット、１９８９年）。

認識すべき多種多様の抗原に、これらの３種の受容体の非常に広い潜在的多様性 が対応する。事実上、関連構造のこれらの３種の分子複合体は、２個（Ｔ受容体 の各々の場合）または４個の（免疫グロブリンの場合）ペプチド鎖（そのＮＨ２ 末端ドメインは高度に可変である）からなる。分子レベルの認識現象での発現を 構成するものは、所定の抗原決定基とこれらの可変ドメインからなる部位との間 の強い相互作用の存在である。かくて、マウスのゲノムに含有される情報は、異 なる可変領域の少なくとも１０１１個の免疫グロブリン、１０１５個の異なるα βＴ受容体および１０１８個の異なるγδＴ受容体を潜在的に産生ずることを可 能にする。

かくて、レパートリ−の考えは、出現している。生体に所定の瞬間に存在する免 疫グロブリン可変領域のセットは、゛免疫グロブリンの現在のレパートリ−を構 成する。

同様に、マウスゲノムによって場合によって産生ずることができるγδｔＴ受容 体可変領域のセットは、γδリンパ球の潜在的レパートリ−を構成する。

Ｔ受容体レパートリ−がαβＴ受容体およびγδＴ受容体レパートリーに細分し なければならないので、免疫系は、従って、事実、３種の複合体レパートリ−を 含有とを可能にする機構は、今や周知である（トネガワ、１９８３年）。免疫グ ロブリンまたはＴ受容体の可変領域は、２個のペプチド鎖のＮＨ２末端ドメイン からなる。

これらの２個のタンパク質用の遺伝子コーディングは、■セグメント、鎖に依存 する１または２個のＤセグメント、およびＪセグメントを並置する体細胞転位の 結果である。異なる遺伝子座に入手できるＶ、ＤおよびＪセグウメントの数は、 組み合わせ多様性と呼ばれる第−多様性源を与える（表１参照）。更に、これら のセグメントの２つの間の結合（Ｖ−Ｄ、Ｄ−Ｄ、Ｄ−ＪまたはＶ−Ｊ結合）の 精密さの欠如は、結合多様性と呼ばれる第二多様性源を導入する。その理由は、 一方で２個の並置末端の各々がそれから切断される若干の塩基を有することがで き、且つ他方で若干のヌクレオチドが結合部位で挿入できるからである。最後に 、免疫グロブリンの遺伝子コーディングの場合には、体細胞突然変異が、転位遺 伝子の第二エキソンで生ずることができ、それによって第三多様性源を構成する 。

受容体、αβ、γδまたは免疫グロブリンの種類に応じて、これらの３つの多様 性源の各々は、全多様性のより大きいかより小さい成分である。かくて、入手で きるＶ、ＤおよびＪセグメントの数は、γδ受容体の場合に最小であるが、この 受容体のレパートリ−の程度は、潜在的に非常に大きいままである。このことは 、本質上、δ鎖用遺伝子コーディングが０．１または２個のＤエレメントからな ることができ（これらは更に３つの読み枠で読み取ることができる）という事実 から生ずる一方、ＶＨおよびβ鎖は、１つおよび１つだけのＤエレメントを保育 する。事実、γδ受容体レパートリーの多様性は、下記方法で記載してもよい： 小数のＶおよびＪセグメントが入手できるらしいが、δ鎖のＶセグメントの数は 、依然として適当には既知ではなく且つ特にδ鎖用遺伝子コーディングの場合に は転位遺伝子の第二エキソンの長さの大きい変動を明示する非常に広い潜在的な 結合多様性がある（ラウレット、１９８９年）。

αβＴリンパ球の機能は、比較的周知である。それらは、キラー細胞による細胞 溶解に関与し、抗体合成を調節する反応に関与し、且つ炎症現象に関与する。γ δＴリンパ球の機能は、まだ貧弱にしか理解されていない。

免疫系の個体発生におけるありそうな役割に加えて、γδＴ細胞は免疫監視に関 与することが一般に受け入れられている。抗体の各種の機能に関しては、これら は、比較的周知であり且つここでは再述しないであろう。

個体中で所定の瞬間に発現される捕集抗体およびＴ受容体（即ち、ＡｂおよびＴ ｃＲレパートリ−）を記載できるものは現在ない。レパートリ−の各々が多分数 百万の異なる分子を含有するので、それは記念碑的な仕事を表わす。かかるレパ ートリ−のこれまたはあのエレメントを特異的に認識できる小数の試薬のみしか まだ入手できない。勿論、成る多数の発現遺伝子の配列を決定することによって より抜は目なく仕事することは可能である。

しかしながら、実際的な考慮は、通例約１０個よりも多い遺伝子または多分１０ ０個の遺伝子を分析することはめったに考えられず且つ操作は高価であり且つ非 常に長い。要するに、抗体およびＴ受容体のレパートリ−は、小数のパラメータ ーによってのみ現時点で記載されている。従って、これらのレパートリ−の陳述 と関連づけられる生理学および病理学的状況の迅速な有効な分析を可能にする方 法は、入手できない。例えば、これらのレパートリ−は、随意免疫化時（ワクチ ン）、または病原性微生物による感染時または自己免疫病理の進行時に変化する ことが明らかである。後者の場合には、これらの疾患への素因がレパートリ−の 成る組成を反映させることを信するべき多くの理由がある。従って、レパートリ −の良好な分析法は、医学の副産物を有するであろうし且つ医学分析技術および 診断技術の基準を構成できることが非常にありそうである。

免疫グロブリンおよびαβおよびγδ受容体の３つのレパートリ−の多様性およ び分布を研究する目的で非常に広く今や使用されている方法は、ＰＣＲ（ポリメ ラーゼ連鎖反応）による増幅法である。この技術は、ゲノムＤＮＡまたは相補的 ＤＮＡを一連の特異的プライマー対（Ｖ、Ｃ）または（Ｖ、Ｊ）で増幅し、適当 な場合にはクローン化し、次いで、得られた増幅生成物を配列決定することから なる（タカガキ等、１９８９年；アサルナウ等、１９８９年）。この強力な方法 は、アーチファクトなしである。定量化と関連づけられる問題と一緒に無視して 、例えば、プライマー（Ｖｌ、Ｃ）および（Ｖ２、Ｃ）の２つの異なる対を使用 して行う２つの増幅から例えば研究中の母集団で他方と比較しての一方のセグメ ントの優先的な利用を演鐸ことは危険であるらしい（ラジャセ力−等、１９９０ 年）。技術の現在の状態においては、異なるＶセグメントの利用度をこの方法に よって決定することは困難である。更に、それらの配列を決定する目的で増幅生 成物のクローニングも、アーチファクトを発生することがある。例えば、これら の生成物の成る割合は、事実、ヘテロ二本鎖であり（増幅母集団が不均質である ならば）、そのためにそれが細菌の形質転換後に「修復」する仕方を予測できな い（アバスタド等、１９８４年、１９８７年）。

最近の改良は、プライマーの単一対（一方を一定領域Ｃでハイブリッド形成し、 他方をすべての相補的ＤＮＡ鎖の３′末端で加える同一の配列で）を使用して相 補的ＤＮＡの不均質母集団の増幅を行うことからなるアンカー化ＰＣＲ技術に従 っての増幅である。従って、増幅収率が転位で使用するＶセグメントに依存しな いであろうことが希望されることがある。

最近、評価すべき不均質転写物の母集団中の異なるＶセグメントの利用度を可能 にするかなり敏感な方法が、開発されてきた（オカダおよびワイスマン、１９８ ９年；シンガー等、１９９０年）。この正確な再現性のある方法は、概念的に単 純であり、従って偏りをほとんど導入しないという利点を有する。しかしながら 、■利用およびＪ利用を同時に規定することが可能ではなく、可視化された転写 物が枠内にあるかどうかを決定することも可能ではない。

ポリクローナル母集団からの増幅に付随して、別の広く使用されているアプロー チは、ハイブリドーマまたはクローナルエラインのバンクを作り、次いで、発現 された抗体またはＴ受容体を分子レベルで特徴づけることからなっている。この 方法は、明らかに、大規模で行うことが困難である。それは、融合またはクロー ニングの工程時に評価することが困難である偏りを導入するが、Ｔ受容体の両方 の鎖の配列を同時に決定することを可能にするか既知の特異性のレパートリ−を 決定することを可能にする唯一の現在の技術である。

前記方法は、すべてメツセンジャーＲＮＡからであってタンパク質からではない レパートリ−を特徴づけ、それゆえ転写後制御が既知ではないことに留意すべき である。モノクローナル抗体およびフローサイトフルオロメトリーの使用は、レ パートリ−を受容体自体のレベルで分析することを可能にし且つ同時に研究中の 細胞の表現型についての多量の情報を与える。しかしながら、この方法は、むし ろ敏感ではなく、且つ最も特に、レパートリ−を詳細に研究することを可能にし ない。その理由は、試薬の不在下では、レパートリ−の結合多様性へのアクセス を得ることが不可能であるからである。更に、それは、よく特徴づけられたモノ クローナル抗体の大きいバッテリーの入手を必要とする。

発　明　の　開　示 本発明の主題は、より詳細には、個体の免疫レパートリ−を記載することを可能 にし且つ容易に自動化でき、非常に大多数のパラメーターを考慮に入れ且つ前記 方法の偏りなしである方法である。

より詳細には、本発明は、 生物学的試料から出発して、それが含有するｍＲＮＡの逆転写を行い、 転写生成物について、または直接試料から抽出されたＤＮＡについて、別個の増 幅を次いで各プライマー対Ｖ。

Ｃ（Ｖは問題のレパートリ−の可変セグメントに対応し、Ｃは研究中のレパート リ−の一定セグメントでハイブリッド形成する）用のＰＣＲ型方法によって行い 、プライマーとしてのＪセグメントおよび鋳型としての増幅生成物に特異的な標 識オリゴヌクレオチドを使用して、これらの増幅生成物の各々について、延長工 程をレパートリ−の各Ｊセグメントの場合に行い、それによって得られるトリブ レット（Ｖ、Ｃ）Ｊに対応する各延長生成物に対して、異なる延長生成物の大き さをＤＮＡ配列の決定に一般に使用されている方法によって１個のヌクレオチド 内に現わし、 レパートリ−の記載はレパートリ−の各エレメントに対してＶ、Ｃ，Ｊ　トリブ レットおよびエレメントの大きさに対応する ことを特徴とする個体の免疫系の抗体（Ａｂ）およびＴ細胞受容体（Ｔ　ｃ　Ｒ ）のレパートリ−を記載するための方法に関する。

別法は、ＤＮＡを生物学的試料から抽出し、産生転位が可変セグメントおよび一 定領域を集めそれゆえ使用する可変セグメントのみが増幅に実際に役立つという 事実を使用して変性ＤＮＡについて増幅を行うことからなる。

本発明に係る方法は、３つのレパートリ−の１つ、でなければそれらのすべての ３つまたは２つだけを記載するために使用してもよい。下記においては、γδＴ レパートリーは、特に記載するであろうが、同じ方法は、αβＴレパートリーお よび免疫グロブリンに使用してもよい。

発明を実施するための最良の形態 「レパートリ−の記載」は、例えば、二次元または三次元表およびゲルのグラフ 的表示および／または再現の形の陳述を示すと理解される。

事実上、本発明の価値の１つは、これらのレパートリ−を特に特定の生理学また は病理学と関連づけることができる典型的なレパートリ−陳述と比較できること 、または或いは若干の癌、自己免疫病、エイズなどの成る疾患の開始および／ま たは進行におけるこれらのレパートリ−の変化を監視できることである。例えば 、少なくとも若干の種類の癌で生ずる免疫反応時に、腫瘍浸潤リンパ球（Ｔ　Ｉ 　Ｌ）の迅速な検出およびそれらの変化の観察並びに免疫療法による治療時のレ パートリ−の残部の変化の観察は、有利なアプローチを証明できる。方法のパワ ーを自己免疫病の出現時のレパートリ−変化の研究に適用することをもくろむこ とが可能である。事実上、多くの自己免疫病においては、１９２８球は、鍵の重 要性の位置を占めることが既知である。若干の入手できる動物モデルで行われる 研究に従ってこれらの病理学の成るものと提示された方法に従って測定されたレ パートリ−陳述または連続のレパートリ−陳述との間に厳格な相関が観察される ならば、予測値はこの分析法に与え、従って現在入手できる試験よりも早い診断 の価値が与えられるであろうことを十分にもくろむことができる。この方法は、 従って、免疫系の研究および監視用の強力な研究分析道具になることができる。

水洗で使用する手順の原理は、既知である。

かくて、試料を患者から採取する時には、ＲＮＡ　（またはＤＮＡ）は、試料（ 例えば、末梢血液またはバイオプシー）に依存することがある既知の方法によっ て調製するであろう。

逆転写による相補的ＤＮＡの合成は、ポリ（Ｔ）プライマーによって、この全Ｒ ＮＡに存在するメツセンジャーｍＲＮＡのみを転写することを可能にする方法と 同様に既知である。

増幅は、ＰＣＲ型方法により、即ち、ＰＣＲ法により、または多くの変形法の１ つにより行ってもよい。

方法は、好ましくは、放射性、着色または蛍光トレーサーの添加なしでＰＣＲ（ ポリメラーゼ連鎖反応）により行う。ＤＮＡは、増幅し、後者は血液試料から、 または別の試料またはバイオプシーから生ずることが可能である。しかしながら 、初期試料は、爾後の結果が統計的に有意であるように十分な程大多数の細胞を 含有しなければならない。増幅は、逆転写工程で（または試料中の細胞から抽出 されたＤＮＡから）生ずる。この後、試料は、分け、数がオリゴヌクレオチド対 （ＶＳＣ）の数に等しい別個の増幅反応は、行う。

次いで、試料の各々は、細分して、それらの各々に対して数がＪセグメントの数 に等しいいわゆる延長また番よ「ランオフ」反応を行う。これらの反応を行うた めに、これらのＪセグメントに特異的なオリゴヌクレオチドカ（使用され、これ らのオリゴヌクレオチドはこの時点で放射性トレーサーで標識するか、より有利 には蛍光体で標識するか、他の方法によって標識する。「ランオフ」反応におい ては、ポリメラーゼは、Ｊオリゴヌクレオチドから増幅されるセグメントを末端 までリコピーする。これらは長さが不均質であるならば、それらのＪ末端で標識 される一連の分子（その大きさは正確に測定できる）は、従って、得られる。

この大きさ測定は、放射性標識を行ったならば通常のＤＮＡ配列決定ゲルについ て行ってもよく、または有利には自動シークエンサー、特に蛍光体を検出できる もので行ってもよい。装置は、従って、延長生成物の長さおよび強度を測定する ためにだけ使用される。当然、異なる「色」の４種の市販の蛍光体があるので、 異なる蛍光体を使用した４種の異なる反応の生成物は、ＤＮＡ配列決定で行うの と同様であるが完全に異なる理由で混合してもよい。例えば、参照試料で行われ る相同反応の生成物（所定の色で標識）を研究中の３種の試料のものと混合する ことが特に有用であることがある。このようにして、直接の比較は、試料と参照 との間で得られるが、他の実験デザインが可能である。若干の市販の装置は、同 時に２４レーンで４色の分析（９６の試料に等価）を行う。分析は、数時間かか り且つ結果は電算機で処理する。

シークエンサーの使用によって、長い通常の配列におけるオートラジオダラムの 読み取りを単純化することが可能である。例に記載の特定の場合には、各実験を 読む取ること、および１，０００個よりも多いエレメントを記憶し且つ解釈する ことが必要である。自動シークエンサーの場合には、情報は、直ちに記憶し、且 つ現存のソフトウェア並びに本発明の文脈で書き込まれたソフトウェアの使用は 、結果のマトリックスを得ることを可能にする。

実際的な問題は、約６０，０００個のエレメントの分析を包含する場合にはマウ スのαβレパートリ−に依然としてかなりあることが認められるであろう。βレ パートリ−の問題は、γおよびδレパートリーに採用された戦略に従って完全に 解決できる。αレパートリ−の問題は、困難であるが（各レパートリ−に対して 分析すべき５．０００の試料）、戦略を単純化することが開発してもよい。同じ ことは、抗体レパートリ−およびヒトレパートリ−にあてはまる。

容易に適応できる装置のうちには、アプライド・バイオシステムズ社によって市 販されているモデル３７３Ａシークエンサーおよび関連モデルを述べるべきであ る。

本発明の文脈で開発されたソフトウェアによって、データは、三次元表示（平面 、高さが長さの遺伝子エレメント）または二次元表のいずれかで組織化する。こ の表示は、ドツトのマトリックスにおいて反応生成物の存在量を表わすこと（例 えば、ドツトはシークエンサーによって検出されるバンドの強度に従ってより暗 いか、より明るい）、および次いで２つのマトリックス（２種の異なるレパート リ−１同じレパートリ−の２つの陳述など）を容易に比較することを可能にする ので好ましい。

可能な改良は、レパートリ−を依然としてより精巧に分析することを可能にする 第四パラメーターを導入することからなる。現在のレパートリ−の変化を分析で きることが望まれるならば、分解能のこの考えは最大の重要性を有することを思 い出すべきである。事実上、測定のパラメーターの数が多ければ多い程、分解能 は大きく且つレパートリ−の微変動をピックアップできる機会は高い。この第四 パラメーターは、第三のものと同様に、結合多様性へのアクセスを与える。それ は、「ランオフ」生成物に、温度または他の変性因子の勾配で行われる電気泳動 法を適用し、それゆえ同じ大きさの生成物が固定プローブで多少の相同性に従っ て分離することを包含する（リースナー等、１９８９年）。捜されていることは 、従って、可変領域の配列への間接的なアクセスである。

実験は、プローブとしてｌ＼ビイブリドーマ中転位された遺伝子を使用して進行 中である。

下記例は、本発明の他の利点および特徴を実証しようとする。

添付図において、 第１図はアダルトＢａ１ｂ／ｃマウスの胸腺（Ｔ）および肺臓（Ｓ）およびＦ１ マウス（Ｃ３ＨｘＣ５７／Ｂ１６）の胎盤（Ｐ）中のγδＴレパートリーの一部 分を示し、第２図はＶβおよびＣβセグメントに特異的なプライマーでのＰＣＨ によって増幅された、リン、＜節から抽出されたＤＮＡについて異なるＪβプラ イマーで得られた延長生成物の変性ゲルについての分析を示す：ＡおよびＢ：ハ トのチトクロームＣで免疫化されたＢ１０．Ａマウス： １−非免疫化 ２−一次免疫化後 ３−一次免疫化後に生体外回刺激 Ｃ：　ハトのチトクロームＣで免疫化されたＣ３Ｈマウス： ４．５．６−３Ｎの異なる非免疫化マウス７−一群のマウスの一次免疫化後に生 体外回刺激 図の右または左に現われる値は、産生的Ｖβ−Ｊβ組み合わせの場合に得られた 延長生成物の大きさくヌクレオチド）に対応する。

使用したオリゴヌクレオチドを３８１Ａ　ＤＮＡシンセサイザー（アプライド・ バイオシステムズ）自動化装置上で合成した。カラムがら連結解除することおよ びホスフェート官能（β−シアノエチル基によって保ｔＪ）のブロック解除は、 ２８％アンモニア溶液１．５ｍｌを０．５ｍｌ／３０分の速度でカラムに注入す ることによって行う。溶離液を５６℃で１２時間インキュベートしてオリゴヌク レオチドの塩基を脱保護する（ベンゾイルおよびイソブチリル基の除去）。凍結 乾燥後、オリゴヌクレオチドを５０ＭＭの濃度で水に再懸濁する。

マウス、細胞 マウス：使用したすべての菌株（Ｂａｌｂ／　ｃ　、　Ｂａ１ｂ／　ｂ　。

ＤＢＡ／２、ＣＢ２Ｏ、ＳＪＬおよびＣ３Ｈ／　Ｈｅ　）は、パスツール・イン スティテユートの動物ハウスから生ずる。交配を行った時、妊娠の第−日、腟プ ラグが検出された日を０日と称する。

細胞：使用したハイブリドーマ（５１５、Ｔ１４、Ｔ１６、Ｔ１８）は、アダル トＣ３Ｈ／　Ｈｅ　７ウスの胸腺細胞とパートナ−ＢＷ５１４７α−β−（もは やαβ受容体を発現しないＡＫＲ胸腺腫ＢＷ５１４７の突然変異体）との融合か ら生ずる。

ＲＮＡの調製 培養物中の組織および細胞のＲＮＡを３種の異なる方法に従って調製した。

培養物中の細胞のＲＮＡを調製するために使用する第−法：細胞を遠心分離し、 得られたペレットを１０ｍＭＮ　ａ　Ｃ１／　ＣＨａ　ＣＯＯＮ　ａ　（ｐＨ５ ）のＳＤ３　１％の溶液１０ｍ１に再懸濁する。４℃で２分間インキュベーショ ン後、６５℃の非緩衝フェノール溶液１０ｍ１を加える。

混合物を５分間強攪拌する。３．０００ｒｐ■で１０分間遠心分離後、水相を排 出し、クロロホルム／イソアミルアルコール１容量と再混合する。遠心分離後、 水相に含有されるＲＮＡは、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）０．１容量およ びエタノール２容量を加えることによって沈殿する。

ＡＧＰＣ（酸性グアニジニウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム）法 と呼ばれる第二法：細胞ベレットまたは器官のＲＮＡを調製するために同等によ く使用可能：この方法は、一旦細胞を溶菌したら生じゃすいリボ核酸の分解を非 常に大きい尺度で回避することを可能にする。しかしながら、ＤＮＡの痕跡は、 調製で存続し且つ若干の応用でやっかいであることがある。

第三法は、リボ核酸とデオキシリボ核酸との間の密度の差を利用することによっ て、ＤＮＡでのこの汚染を排除する。これらの２種の分離は、不連続ＣｓＣ１勾 配の存在下で溶菌液の超遠心分離によって行う：ＤＮＡを勾配の界面で保持する 一方、より密なＲＮＡは沈殿する。

この方法は、従って、組織または細胞ベレットのＲＮＡとＤＮＡとの両方を回収 することを可能にする。簡単に言えば、Ｎ−ラウリルサルコシンナトリウム０， ５％とＥ　Ｄ　Ｔ　Ｍ　２５　ｍ　Ｍと消泡剤０．１３％とを含有するチオンア ン酸グアニジンの４Ｍ溶液を調製する。ＣｓＣ１勾配は、ＣｓＣ１５，７Ｍと酢 酸ナトリウム２５ｍＭ（ｐＨ５，２）とＥＤＴＡ　ｌｏｍＭとの溶液３ｍｌと、 ＣｓＣｌ　２．４Ｍと酢酸ナトリウム２５ｍＭ（＋）Ｈ５，２）とＥＤＴＡ　１ ０ｍＭとの溶液０．７ｍｌとからなる。ボッターホモジナイザーを使用して、組 織を４Ｍチオシアン酸グアニジン溶液７　ｍｌ中で粉砕し、得られた溶菌液をＨ Ｂ−４０−ター中で８，０ＯＯｒｐ−において１０分間遠心分離して固体粒子を 除去する。上澄みをＣｓＣ１のクッション上で穏やかに析出する：全体を５Ｗ４ １０−ター中で３０．ＯＯＯｒｐｍにおいて２０℃で２４時間遠心分離する。次 いで、液相を除去しくこの工程で、界面に配置されたＤＮＡは回収してもよい） 、ベレットを水５００μｇに再懸濁し、エタノールｍｌと３Ｍ酢酸ナトリウム（ ｐＨ５，２）５０Ｍｇとを加えることによって一２０℃で沈殿する。

相補的ＤＮＡの調製 相補的ＤＮＡの合成は、前記の３つの方法の１つに従って調製した全ＲＮＡから 行う。使用した緩衝液は、ＰＣＲ増幅工程のものと同じである（　Ｃｅｔｕｓ緩 衝液）。

事実上、提案された異なる緩衝液は、実質上より大きい効能（３２Ｐ標識ｄＣＴ Ｐの取り込みの測定によって比較）を有することが証明されなかった。対照的に 、これらの緩衝液のＭｇ　＋濃度は、ＰＣＲ増幅を更に他の中間工程なしに行う ことを可能にしない。相補的ＤＮＡ鎖の重合のプライマーとして使用するオリゴ ヌクレオチドは、ポリ−ｄＴ１５−ｍａｒである。簡単に言えば、アダルトマウ ス器官から生ずる時には全ＲＮＡ１０Ｍｇ１または培養物または胎児胸腺から生 ずる１０５個の細胞のＲＮＡをＫＣＩ　５０ｍＭとトリス−ＨＣｌ　ＩＱｍＭ（ ｐＨ８，２）とＭｇ　Ｃｌ　２１　、　５　ｍ　Ｍとゼラチン０．０１％とＥＤ ＴＡ　Ｏ，１ｍＭとｐｄＴ（１５）５μＭとｄＮＴＰｏ、２ｍＭとの溶液５０ｕ 、１７中テア０℃において１０分間インキュベートする。次いで、氷上で５分後 、ＡＭＶＲＴ　（プロメガまたはベーリンガー）５単位並びにＲＮａｓｉｎ（フ ァルマシア）３４単位を加える。混合物を４３℃で１時間インキュベートし、５ 分間で１００℃にさせる。

ＰＣＲ技術による増幅 増幅を記載の技術（サイキ等、１９８８年）に従ってパーキン・エルマー・セッ ス・エンド・ブレム自動化装置上で行った。

相補的ＤＮＡを増幅するために、使用したプロトコールは、次の通りであった： 上で調製した溶液５μｇを、ＫＣｌ　５０ｍＭとトリス−ＨＣ１（ｐＨ８，２） 　１０ｍＭとゼラチン０．０１％と使用した２種のオリゴヌクレオチドの各々０ ．２μＭと１００μｇ当たり２ｕのＴａｇポリメラーゼ（ベックマン）とヌクレ オチドｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰの各々２００μＭとを含む 溶液５０または１００μｇ中で増幅する。使用したＭｇ２＋イオン濃度は、２〜 ２．５ｍＭで変化する。混合物を鉱油５０μｇで覆い、１０分間８０℃に加熱し 、４０サイクル（９４℃で１分、６０℃で１分、７２℃で１分）によって増幅し 、次いで、７２℃で１０分間インキュベートする。

方法の背景を減少することを可能にするパラメーターのうちには、増幅または延 長工程でのマグネシウムイオンの最適濃度の使用を述べなければならない。かく て、マグネシウムイオン１〜３ｍＭは、好ましくは使用されるであろう。

プライマーの標識、「ランオフ」による延長「ランオフ」工程を行うために使用 するＪプライマーは、〔３２Ｐ〕ホスフエートを使用して５′末端のリン酸化に よって予め放射性標識した。プロトコールは、次の通りである：オリゴヌクレオ チド１００ｐモルを１０Ｐｇ中で３７℃で増幅緩衝液中でＭｇ”２．５ｍＭの濃 度で（３２Ｐ）−ＡＴＰの４０μＣｉ　（１２Ｐモルに等価）およびＴ４ポリヌ クレオチドキナーゼ３単位の存在下で３０分間インキュベートする。次いで、酵 素は、混合物を１０分間７０℃にさせることによって不活性化する。

標識Ｊプライマーからの「ランオフ」による延長を下記条件下で行う。上で増幅 された混合物１μｇを増幅に使用したものと同一の溶液（最適Ｍｇ２＋濃度（２ 〜２．５ｍＭ）　、ｄＮＴＰの各々２００μＭ、Ｔａｇポリメラーゼ０．２ｕを 有する増幅緩衝液）１０Ｐｇ中で希釈し、それに１μＭの濃度の標識Ｊプライマ ーを加える（Ｊプライマーは従って増幅混合物μｇによって供給される他のプラ イマーＶおよびＣと比較して少なくとも５倍過剰の〔ラクナ〕である）。「ラン オフ」反応は、９４℃で３分、６０℃で１分、その後７２℃で１５分か増幅生成 物および配列の分析をＴＢＥ緩衝液中で（マニアチス等、１９８２年）変性条件 下で（ホルムアミド９５％、ＥＤＴＡ　２０ｍＭ、ボロモフェノールブルー０． ２５％、キシレンシアツール０．２５％）厚さ４００μｍの６％ポリアクリルア ミドゲル（架橋：ビスアクリルアミド１ｇ対アクリルアミド１９ｇ）上での電気 泳動によって行い、８０℃で１０分間インキュベートする。泳動をＴＢＥ緩衝液 中で４．０００Ｖｍ−１の電界下で配列分析のために２時間または４時間行い、 増幅生成物の分析のために５〜６時間行う。

例１−マウス中のＴ受容体のγ鎖の遺伝子多様性の研究方法の原理 各可変績（αβ−またはγδＴ受容体に対してＶα、Ｖβ、Ｖγまたは■δ）の 場合に、特異的オリゴヌクレオチドを合成し且つメツセンジャーＲＮＡのｃＤＮ Ａコピーを別個に増幅するのを可能にする。下記表は、下記分析で使用したオリ ゴヌクレオチドのリストを与える。

可変領域Ｖγ１、Ｖγ２・・・Ｖγ７に対応する転写物をＶδ１、Ｖδ２・・・ Ｖδ９に対応するものと同様に別個に増幅する。各増幅生成物の場合には、Ｊセ グメントに特異的な反応を行う。最後に、生成物の大きさを配列決定ゲル上で測 定する。このことは、メツセンジャーＲＮＡを大体１０〜２０個のヌクレオチド で変化できる可変領域（特にＮ領域）の長さに従って破壊することを可能にする 。加えて、タンパク質への翻訳のために枠外であるメツセンジャーＲＮＡを同定 することが可能である。要するに、試料をＶ鎖の使用のために（１）、Ｊセグメ ントの使用のために（２）、大きさのために（３）のパラメーターで表わす。

遺伝子多様性は、マウスのγδＴ受容体の場合には、受容体のγ鎖の場合には１ ５個の遺伝子エレメントおよびδ鎖の１１個のエレメントのマツチングアップ（ ａａｔｃｈｉｎｇ　ｕｐ）から生ずる。構造　Ｖ−Ｄ−Ｊ−Ｃの活性遺伝子を生 ずる組換え時に、各種の機構は、活性遺伝子の長さがＶγ−Ｊγ−Ｃγ遺伝子の 場合には約０〜２０個のヌクレオチド、Ｖδ−Ｊδ−Ｃδ遺伝子の場合あるよう に成る組換えセグメントの結合で操作する。

γδＴ受容体のレパートリ−を、 使用されるＶ、ＪおよびＣセグメントの測定、転位遺伝子の長さの測定 によってパラメーターで表わした。

表１中、これはγδＴ受容体の場合に約１０００よりも多い測定を表わすことが わかる。αβＴ受容体の場合には、５０，０００よりも多い測定が包含される。

実験法 マウスのγδＴ受容体のレノ＜−トリーの場合１こ番ヨ、下記のものを合成する ： Ｖγ鎖に特異的な７個のオリゴヌクレオチド、Ｊγ鎖に特異的な３個のオリゴヌ クレオチド、Ｃγ鎖に特異的な４個のオリゴヌクレオチド、Ｖδ鎖に特異的な９ 個のオリゴヌクレオチド、Ｊδ鎖に特異的な２個のオリゴヌクレオチド、Ｃδ鎖 に特異的な１個のオリゴヌクレオチド。

プライマーの測定法は、特に強い相同性力（区別しようとする配列、例えば、■ γ１、Ｖγ２およびＶγ３の間に存在する場合には、既知である。

添付表２は、使用したオリゴヌクレオチドの１ストを与える。得られた結果は、 Ｊ利用なしで第１図１こ記録する。

表１ （１）　ウィルソン等（１９８８） （２）　ラウレット（１９８９） （３）　デービスおよびブジョークマン（１９８ｇ）（４）　メインドル等（１ ９９０） 表２ Ｖ７１：　ＡＧＴＴＴＧＡＧＴＡＴＣＴＡＡＴＡＴＡＴＧＴＣＴ■γ２＋　ＡＣ ＧＡＣＣＣＴＴＡＧＧＡＧＧＧＡＡＧＣ■γ３：　ＴＴＧＡＧＴＡＴＣＴＡＡＴ ＡＴＡＴＧＴＣＧＡＧＶγ２および３：　ＣＧＧＣＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＣＡ ＡＣＡＧＶ７４：　ＴＧＴＣＣＴＴＧＣＡＡＣＣＣＣＴＡＣＣＣＶ７５：　ＴＧ ＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＴＧＡＶγ５：　ＧＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＧＡ ＡＡＡＣＡＴＴＧＴＣＴＶγ７：　ＡＡＧＣＴＡＧＡＧＧＧＧＴＣＣＴＣＴＧＣ Ｊγｌ：　ＣＴＧＣＡＡＡＴＡＣＣＴＴＧＴＧＡＡＡＡＪγ２：　ＣＴＧＣＡＡ ＡＴＡＣＣＴＴＧＴＧＡＡＡＧＪγｌ　ＧＡＡＴＴＡＣＴＡＣＧＡＧＣＴＴＴＧ ＴＣＣγｌ：　ＴＴＴＣＡＧＣＡＡＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＧＣγ２：　ＴＣＣＡ ＧＧＡＴＡＧＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣγ３：　ＧＧＡＡＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣ ＡＡＧＣＴＣγ４：　ＧＣＴＴＧＧＧＡＧＡＡＡＡＧＴＣＴＧＡＧｐａｎ−Ｃγ ：　ＣＴＴＡＴＧＧＡＧＡＴＴＴＧＴＴＴＣＡＧＣＶδｌ：　ＧＧＡＡＴＴＣＡ ＧＡＡＧＧＣＡＡＣＡＡＴＧＡＡＡＧＶ６２：ＧＴＴＣＣＣＹＧＣＡＧＡＴＣＣ ＡＡＧＣＣＶδ３：　ＴＴＣＣＴＧＧＣＴＡＴＴＧＣＣＴＣＴＧＡＣ■δ４：　 ＣＣＧＣＴＴＣＴＧＴＧＴＧＡＡＣＴＴＣＣ■δ５：　ＣＡＧＡＴＣＣＴＴＧＣ ＡＧＴＴＣＡＴＣＣＶδ７−Ｔ：　ＣＧＣＡＧＡＧＣＴＧＣＡＧＴＧＴＡＡＧＴ Ｖδ８：　ＧＣＴＡＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＣＪδｌ：　ＴＣＣＡＣＡ ＧＴＣＡＣＴＴＧＧＧＴＴＣＣＪδ２：　ＴＣＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＣＴＡＴ ＧＣＣＣδ：　ＣＧＡＡＴＴＣＣＡＣＡＡＴＣＴＴＣＴＴＧ（１）使用した命名 法は、γ遺伝子座の場合（こ４よ）＼イリッヒおよびトネガワ（１９８６）のも の、δ遺伝子座の場合にはラウレット（１９８９）のものである。オリゴヌクレ オチドの一部分の選択は、直接タカガキ等（１９８９ｂ）から生ずる。

（２）Ｖδ７−Ｒは、ラウμ・ノド（１９８９）ｌ：：参照された可変セグメン トＶδ７に特異的な第１ノゴヌクレオチドであり；Ｖδ７−Ｔはタカガキ等（１ ９８９ａ）参照された可変セグメントＶδ７に特異的な第１ノゴヌクレＢＩＯ， Ａマウスのリンノく節玉のＴ受容体のβ鎖の遺伝子多様性は、／Ｘ）チトクロー ムＣでの免疫イヒ後１；、よく文書化された文献系を構成する。特に、発表され た研究によれば、抗原で生体外免疫／再刺激後屯；単離されたクローンの７５〜 ８０％のβ鎖番よ、転位Ｖβ３−Ｊβ１．２−Ｃβからなること力（既知である 。

免疫または非免疫化マウスのリンノく節を水切りすることから生ずるメツセンジ ャーＲＮＡの試料をｃＤＮＡＩこ変換した。これを一方でＶβ可変領域の１つ１ こ、他方で一定領域に配置されたオリゴヌクレオチド対でＰＣＲ（ポリメラーゼ 連鎖反応）によって増幅した。この操作を各Ｖβ領域について繰り返した（約２ ０回）。この後、１２の試料（各Ｊβにつ０て１）１こ付番すられた各増幅反応 は、１２の放射性標識Ｊβの１つでの延長サイクル用鋳型として役立った。

添付第２図は、２つの独立の実験（Ａ図およびＢ図）で８１０．Ａ７ウス（Ｈ− ２ａ）上でＪβ１．２を含めて４つの異なるＪβで再分析された対Ｖβ１−Ｖβ ３およびＶβ１６−Ｃβの場合に得られた結果の一部分を図示する。Ａ図中、対 Ｖβ３−Ｖβ１．２の場合には、優勢のバンドは、ハトチトクロームＣで生体外 回刺激されたリンパ節のＴ細胞に現われることがわかる（Ａ図、トラック３）。

このバンドを構成するフラグメントの大きさは、予想の結果と一致する（Ｖβ３ −Ｖβ１．２の場合には１１５個のヌクレオチド）。これらの結果は、１実験か ら別のものまで再現性があり（Ｂ図）、且つ加えて転位Ｖβ３−Ｖβ１．２の優 勢が第−免疫化後に既に検出可能であることを示す（Ｂ図、Ｊβ１．２、トラッ ク２）。

０図に図示するように（トラック４〜６）、１マウスから別のものまで存在する 最小変動の問題を回避するために１マウスおよび同じマウス上でのこの種の分析 を行うことができることは除外しない。

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リースナー等（１９８９）　ｏ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　１０　。

サイキ等（１９８８）　、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３９．４８７−シンガー等（１ ９９０）。ＥＭＢＯＪ、（印刷中）タカガキ等（１９８９）　ｏ　Ｎａｔｕｒｅ 　３３９　、　７１２−トネガワ（１９８３）　ｏ　Ｎａｔｕｒｅ　３０２　、 　５７５−ウィルソン等（１９８８）　ｏ　Ｉｍａ＋ｕｎｏｌｏｇｆｃａｌ　Ｒ ｅｖｉｅｗｓｌｏｌ、１４９−１７２ 国際調査報告 国際調査報告 ＦＲ９２０００１４ Ｓ＾　５６３８７ フロントページの続き （７２）発明者　パンヌチェ、クリストリフフランス国パリ、ブールバール、パ ンサン−オリオル、１２ （７２）発明者　コシェ、マドレーヌ フランス国フォントネーオーローズ、アブニュ、ガブリエル−ぺり、１５

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．生物学的試料から出発して、それが含有するｍＲＮＡの逆転写を行い、 転写生成物について（または直接試料から抽出されたＤＮＡについて）、別個の 増幅を次いで各プライマー対Ｖ、Ｃ（Ｖは問題のレパートリーの可変セグメント に対応し、Ｃは研究中のレパートリーの一定セグメントでハイブリッド形成する ）用のＰＣＲ型方法によって行い、プライマーとしてのＪセグメントおよび鋳型 としての増幅生成物に特異的なオリゴヌクレオチドを使用して、これらの増幅生 成物の各々について、延長工程を標識レパートリーの各Ｊセグメントの場合に行 い、それによって得られるトリプレット（Ｖ、Ｃ）Ｊに対応する各延長生成物に 対して、異なる延長生成物の大きさを現わし、 レパートリーの記載はレパートリーの各エレメントに対してＶＣＪトリプレット およびエレメントの大きさに対応する ことを特徴とする個体の免疫系の抗体（Ａｂ）およびＴ細胞受容体（ＴｃＲ）の レパートリーを記載するための方法。
2. ２．延長生成物の大きさを延長混合物の電気泳動および標識の検出によって現わ すことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. ３．標識が放射性、比色または蛍光であることを特徴とする、請求項１ないし２ のいずれか１項に記載の方法。
4. ４．工程をＭｇ２＋イオン１〜３ｍＭの存在下で行うことを特徴とする、請求項 １ないし３のいずれか１項に記載の方法。
5. ５．分子大きさの各信号の強度を測定して対応配列の程度の定量的測定を得るこ とを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
6. ６．各信号の強度を内標準と比較して評価することを特徴とする、請求項５に記 載の方法。
7. ７．同じ分子大きさの生成物を固定プローブに対する多少の親和力に従って分離 することを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
8. ８．温度または他の変性剤の勾配を有する電気泳動を使用して、この工程を行う ことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
9. ９．自動配列決定装置を使用して延長生成物の大きさを現わし且つ記載すること を特徴とする、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。