CN111778322B

CN111778322B - 克氏综合征的遗传标记物和其应用

Info

Publication number: CN111778322B
Application number: CN201910274344.4A
Authority: CN
Inventors: 陈子江; 刘洪彬; 李卫; 张浩波; 赵跃然; 王丽; 刘超; 李孟静; 路钢
Original assignee: Sdivf R&d Centre Ltd; Institute of Zoology of CAS; Shandong University
Current assignee: Sdivf R&d Centre Ltd; Institute of Zoology of CAS; Shandong University
Priority date: 2019-04-04
Filing date: 2019-04-04
Publication date: 2023-03-28
Anticipated expiration: 2039-04-04
Also published as: CN111778322A

Abstract

本发明提供了诊断男性受试者的后代患有克氏综合征的风险的方法，其包括检测遗传标记USP26。男性受试者的年龄越大，后代患有克氏综合征越高。本发明还提供了诊断男性受试者的后代患有克氏综合征的风险的试剂盒和仪器。

Description

克氏综合征的遗传标记物和其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和疾病诊断和治疗领域。具体的，本发明涉及克氏综合征的遗传标记物和使用所述遗传标记物诊断或治疗克氏综合征的方法和试剂盒。

背景技术

克氏综合征(Klinefelter's syndrome，KS)或称XXY、47XXY综合征，是以47XXY核型为特征的，男性有两条或两条以上的X染色体所导致的疾病。克氏综合征是男性中最常见的染色体畸变，约500至1,000个男性中就有一个受到影响。KS的主要症状和体征包括小而坚固的睾丸，男性乳房发育症，高促性腺激素性腺机能减退，无精子症，透明化少精症，生精小管纤维化等。克氏综合征患者不可避免地存在不孕症，在不育男性中克氏综合征患病率高达3％-4％，在无精子症患者中高达10％-12％。KS的几种合并症也已有报道，包括代谢紊乱，对某些肿瘤的形成和某些心理社会问题的易感性。由于克氏综合征患者的临床表现可能与正常男性相似，因此存在严重的诊断不足问题。

自从Harry Klinefelter于1942年首次描述克氏综合征以来，大量的研究试图揭示KS起源的致病机制。在克氏综合征中存在额外的X染色体，可能是由于在母体卵子发生的减数分裂I或减数分裂II期间，或在父本精子发生的减数分裂期间的染色体不分离造成的。母亲高龄是克氏综合征唯一的循证风险因素，这也是其他常染色体三体性的重要病因。但这种影响仅限于源自MI的一部分病例，而源于母亲MII的病例似乎与产妇年龄无关。已发现KS中的父系因子似乎有显着差异。另外，KS被认为不是遗传性的，而是在减数分裂期间随机发生的。到目前为止，尽管克氏综合征已被发现和研究超过70年，但是KS起源的分子机制从未真正阐明过。

因此，本领域还需要对克氏综合征的分子机制做更多的研究，以及需要新的诊断以致治疗的方法和试剂盒。

发明内容

本发明提供了一种克氏综合征的遗传标记物和其用于诊断受试者后代患有克氏综合征的风险的用途。具体的，本发明首次通过对克氏综合征患者进行了研究，确定USP26突变是克氏综合征其中一种发生的根源。在可育男性中，USP26变异增加了XY非整倍体精子的比例，从而增加了产生KS后代的风险。由此，本发明提供了克氏综合征的遗传标记物，以及使用所述遗传标记物来诊断受试者后代患有克氏综合征的风险的方法和用于该诊断方法的仪器和试剂盒。

具体的，本发明提供了诊断受试者的后代患有克氏综合征的风险的方法，其包括检测受试者的遗传标记，所述遗传标记为USP26。在本发明的其中一个方面，所述受试者为男性受试者。所述方法中包括选择男性受试者的步骤，或者包括分辨待测样本是否为来自男性的样本的步骤。在本发明的其中一个方面，提供了USP26在用于制备诊断受试者的后代患有克氏综合征的风险的试剂盒中的用途。

本发明中，“受试者的后代患有克氏综合征的风险”是指受试者，特别是男性受试者产生的后代出现克氏综合征的概率。所述风险还包括不同年龄的受试者产生的后代患有克氏综合征风险的程度。在本发明的其中一个方面，年纪越大的受试者产生的后代患有克氏综合征风险程度越高，因此需要获知或考虑受试者的年龄因素。

本发明中，“遗传标记物”是指成为判断受试者的后代患有克氏综合征的遗传因素的标记。本发明的遗传标记包含基因和所述基因编码的蛋白。蛋白遗传标记还可涉及蛋白的量和蛋白的活性的变化。基因遗传标记包括基因组的部分变异或单点突变。这些突变可影响对应蛋白产物的产生的量或活性变化。本领域的技术人员可根据本发明的教导，利用本领域已知的技术手段发现和验证哪些基因突变影响对应蛋白产物的产生的量或活性变化，乃至导致后代患有克氏综合征。

USP26(ubiquitin specific peptidase 26)，即泛素特异肽酶26，是泛素特异性肽酶家族(ubiquitin-specific processing(UBP)family of proteases)的成员之一。通过辐射杂交分析，Wang等(Nature Genet.27:422-426,2001)将人Usp26基因定位于X染色体。Stouffs等(Europ.J.Hum.Genet.13:336-340,2005)报道Usp26基因定位于染色体Xq26.2(Genbank NM_031907)，其编码序列具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。Usp26基因编码的USP26蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。在本文中对Usp26基因或USP26蛋白发生变异的核苷酸位点或的氨基酸位点的描述分别基于SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。例如，cDNA变异“c.125T>C”导致氨基酸变异“p.F42S”是指Usp26基因上对应SEQ ID NO.2的第125位的“t”突变为“c”，导致翻译得到的USP26蛋白上对应SEQ ID NO.1的第42位的“F”突变为“S”。

在本发明的其中一个方面，本发明提供的诊断受试者的后代患有克氏综合征的风险的方法中包括考虑受试者年龄的步骤。年纪越大的受试者产生的后代患有克氏综合征风险程度越高，因此需要通过问答或检测技术手段获知或考虑受试者的年龄因素。

在本发明的其中一个方面，本发明提供的诊断受试者的后代患有克氏综合征的风险的方法中包括检测Usp26基因的步骤。

在本发明的其中又一个方面，所述方法包括检测Usp26基因的以下突变的其中一个或其中任意多个的组合：

(a)c.191A>G[p.Y64C]；

(b)c.313G>A[p.E105K]；

(c)c.1691A>T[p.D564V]；或

(d)c.370-371insACA/494T>C/1423C>T。

在本发明的其中又一个方面，所述方法包括检测Usp26基因的以下连锁突变：

c.370-371insACA/c.494T>C/c.1423C>T。

在本发明的其中又一个方面，所述方法包括检测Usp26基因的以下突变的一个或其组合：

(a)c.191A>G[p.Y64C]；

(b)c.313G>A[p.E105K]；和

(c)c.1691A>T[p.D564V]。

用于本发明的检查基因变异的方法是本领域通常用于基因的检测的方法，没有特别限定。例如，可列举出Invader(商标、Third Wave Technologies公司)法、TaqMan(商标、Applied Biosystems公司)法、MALDI-TOF质谱法、微阵列法、测序法、利用PCR(聚合酶链反应)等碱基序列扩增法的检测法等。特别是优选像TaqMan法、PCR法、微阵列法等那样的使用与各点突变基因型杂交的引物或探针来检测变异或点突变的方法。

另外，使用对各基因/基因变异/点突变特异性的引物进行PCR时获得的PCR产物的检测可通过通常用于检测和定量PCR产物时的任意方法来进行。例如，可通过电泳来检测，可以通过使用SYBR Green等荧光嵌入剂的实时PCR来检测，也可以通过单分子荧光分析法(single molecule fluorescence analysis)来检测。

能够作为用于检测基因变异/点突变的引物或探针使用的体外受精风险判定用的多核苷酸，只要是能够与包含该基因变异/点突变的基因的部分区域或其互补链杂交的多核苷酸，则没有特别限定。另外，本发明所用多核苷酸的碱基长度、Tm值等可考虑分型方法、反应条件等适当决定，例如为10～60个碱基长度，或为15～50个碱基长度。

多核苷酸的设计可采用该技术领域中众所周知的方法中的任一者来进行。例如，利用公知的基因组序列数据和通用的引物设计工具，能够简便地设计。作为该引物设计工具，例如有网络上能够利用的Primer3等。另外，公知的基因组序列数据通常能够在作为国际性的碱基序列数据库的NCBI中获得。

在本发明的其中一个方面，本发明提供的诊断受试者的后代患有克氏综合征的风险的方法包括检测USP26蛋白的步骤，例如检测所述蛋白的表达情况(包括是否存在，以及相对正常或标准是否存在表达减少的现象)或其活性。

在本发明的其中又一个方面，所述方法中包括通过免疫测定USP26蛋白的表达的步骤。例如通过特异性识别所述蛋白的抗体进行ELISA或蛋白质印迹来检测USP26的表达。又例如通过检测所述蛋白的mRNA的存在或其数量来检测所述USP26的表达，例如通过RT-PCR检测样品中编码USP26的mRNA的量。

在本发明的其中又一个方面，所述方法中包括测定USP26蛋白的活性的步骤。

本方面还提供了诊断受试者的后代患有克氏综合征的风险的试剂盒或仪器(包括基因芯片)，其包括检测遗传标记的试剂，所述遗传标记为USP26。

在本发明的其中又一个方面，所述试剂盒或仪器包括检测所述受试者是否为男性的试剂或获得所述受试者是否为男性的信息的装置。例如，所述仪器提供了询问、输入和记录受试者是否为男性的装置。例如，所述试剂盒包括检测染色体的试剂。

在本发明的其中又一个方面，所述试剂盒或仪器包括测定受试者年龄的试剂或获得受试者年龄的装置。例如，所述仪器提供了询问、输入和记录受试者年龄的装置。

在本发明的其中又一个方面，所述试剂盒或仪器包括检测USP26蛋白的表达或活性的试剂。例如，所述试剂盒或仪器包括免疫测定的试剂，例如通过特异性识别所述蛋白的抗体进行ELISA或蛋白质印迹来检测USP26的表达的试剂。又例如，所述试剂盒或仪器包括通过检测所述蛋白的mRNA的存在或其数量来检测所述USP26的表达的试剂，例如通过RT-PCR检测样品中编码USP26的mRNA的量的试剂。

在本发明的其中又一个方面，所述试剂盒或仪器包括检测Usp26基因的试剂。

在本发明的其中又一个方面，所述试剂盒或仪器包括检测Usp26基因的以下突变的其中一个或其中任意多个的组合的试剂：

(a)c.191A>G[p.Y64C]；

(b)c.313G>A[p.E105K]；

(c)c.1691A>T[p.D564V]；或

(d)c.370-371insACA/494T>C/1423C>T。

在本发明的其中又一个方面，所述试剂盒或仪器包括检测Usp26基因的以下连锁突变的试剂：

c.370-371insACA/c.494T>C/c.1423C>T。

在本发明的其中又一个方面，所述试剂盒或仪器包括检测Usp26基因的以下突变的一个或其组合的试剂：

(a)c.191A>G[p.Y64C]；

(b)c.313G>A[p.E105K]；和

(c)c.1691A>T[p.D564V]。

在本发明的其中一个方面，在上述本发明的方法和试剂盒或仪器中，所述用于检测样品中的遗传标记的试剂包括用于检测基因遗传标记的引物或探针，或是检查蛋白遗传标记的试剂，如特异性抗体或检测所述蛋白的mRNA的试剂等。

在本发明中，还提供了检测遗传标记的试剂在制备如前所述的用于诊断受试者的后代患有克氏综合征的风险的试剂盒或仪器中的用途，所述遗传标记为USP26。所述用于检测遗传标记的试剂包括用于检测基因遗传标记的引物或探针，或是检查蛋白遗传标记的试剂，如特异性抗体或检测所述蛋白的mRNA的试剂等。

在本文中，蛋白符号不用斜体，并全部大写；基因符号使用斜体。例如USP26为蛋白质，编码该蛋白质的基因写为Usp26。但有时在本文中基因符号也不使用斜体。例如有时本文中“USP26”或“USP26基因”表示编码USP26蛋白质的基因Usp26。

附图说明

图1显示Usp26变异是克氏综合征起源的原因。

图1A对照组和克氏综合征患者的核型。

图1B克氏综合征患者中序列变体的基因组定位。

图1C X染色体上变异的基因。睾丸特异性表达的基因(ESX1，LOC101059915和USP26)标记为红色。

图1D在KS患者中鉴定的ESX1，LOC101059915和USP26中的变体。

图1E ESX1，LOC101059915和USP26在KS患者与1000基因组计划之间的变异频率。

图2显示Usp26缺陷小鼠产生41XXY后代

图2A显示Usp26^-/Y睾丸中不存在USP26蛋白。在Usp26^+/Y和Usp26^-/Y睾丸中进行USP26免疫印迹。组蛋白3用作上样对照。

图2B和图2C显示Usp26^-/Y小鼠的生育能力随着年龄的增加而降低。在2个月大和6个月大的Usp26^+/Y，Usp26^-/Y小鼠中进行生育能力评估实验(图2B)，并观察它们的窝产仔数(图2C)。

图2D显示WT和Usp26突变等位基因。

图2E显示Usp26^-/Y小鼠后代的基因分型。

图2F显示在2个月大和6个月大的Usp26^+/Y，Usp26^-/Y小鼠的后代中41XXY小鼠的比例。

图2G显示Usp26^+/-/Y小鼠的睾丸小于对照组。

图2H显示Usp26^+/Y和Usp26^+/-/Y小鼠中睾丸重量/体重的比率。

图2I左图显示通过苏木精和伊红(H&E)染色对Usp26^+/Y和Usp26^+/-/Y小鼠的曲细精管和尾部附睾进行组织学分析。右图显示在Usp26^+/-/Y小鼠中，尾部附睾中的精子数量显着减少。

图3显示USP26通过调节TEX11的稳定性参与性染色体配对。

图3A显示USP26主要在睾丸中表达。在心脏，肝脏，脾脏，肺，肾，肠，脑，卵巢和睾丸中进行USP26的免疫印迹。组蛋白3用作上样对照。

图3B显示USP26在减数分裂过程中的定位。在WT精母细胞中进行SCP3(红色)，USP26(白色)的免疫荧光分析。细胞核用DAPI(蓝色)染色。

图3C显示在Usp26^-/Y精母细胞中X和Y染色体未配对。在Usp26^+/Y和Usp26^-/Y精母细胞中进行Chr X-FISH(绿色)，Chr Y-FISH(红色)和SCP3(白色)的免疫荧光分析。箭头表示X染色体。

图3D显示未配对的Chr X和Chr Y的定量。

图3E显示在Usp26^+/Y和Usp26^-/Y精母细胞中进行SCP3(绿色)，ATR(红色)和p-ATM(粉红色)的免疫荧光分析。细胞核用DAPI(蓝色)染色。箭头表示性染色体。

图4显示Usp26缺陷小鼠产生XY非整倍体精子。

图4A和图4B显示在Usp26^-/Y精母细胞的中期I中观察到落后染色体。在Usp26^+/Y和Usp26^-/Y精母细胞中进行微管蛋白(绿色)的免疫荧光分析。细胞核用DAPI(蓝色)染色。箭头表示落后的染色体。

图4C显示在Usp26^+/Y和Usp26^-/Y小鼠中表现出落后染色体的中期I精母细胞的比例。

图4D显示Usp26缺陷型小鼠产生XY非整倍体精子。在Usp26^+/Y和Usp26^-/Y精子中进行Chr X(绿色)，Chr Y(红色)的FISH测定。细胞核用DAPI(蓝色)染色。箭头表示Y染色体，箭嘴表示X染色体。

图4E显示在2个月和6个月大的Usp26^+/Y和Usp26^-/Y小鼠中不同类型的精子的定量。

图5显示USP26突变的可育雄性产生XY非整倍体精子。

图5A和图5B显示对有或没有USP26突变的可育男性中不同类型精子的定量。

图5C显示具有USP26簇突变的可育男性产生XY和O非整倍体精子。在有或没有USP26连锁突变的可育男性中进行Chr X(绿色)，ChrY(红色)的FISH测定。细胞核用DAPI(蓝色)染色。箭头表示Y染色体，箭嘴表示X染色体。

图5D和图5E显示在MI期的不分离导致性染色体非整倍体精子。

图6显示Usp26的破坏对雌性小鼠的卵泡发育和染色体分离没有影响。

图6A显示Usp26^+/+和Usp26^-/-小鼠中卵巢的苏木精和伊红(H&E)染色。

图6B显示在Usp26^+/+和Usp26^-/-卵母细胞中进行Tub(绿色)的免疫荧光分析。细胞核用DAPI(蓝色)染色。

图7显示Usp26的缺陷导致粗线期和减数分裂停滞。

Usp26^+/Y和Usp26^-/Y睾丸中产生的代表性的TUNEL。用TUNEL(绿色)和DAPI(蓝色)染色来自Usp26^+/Y和Usp26^-/Y睾丸的Paraffin切片，以显示分别具有粗线期和中期精母细胞的IV期和XII期小管中的死亡细胞。箭嘴表示落后的染色体。

图8显示未配对的性染色体也可以在其他类型的Usp26缺陷小鼠中检测到。

图8A显示X和Y染色体在两种类型的Usp26缺陷小鼠精母细胞中未配对。在WT和Usp26缺陷精母细胞中进行SCP3(绿色)，γH2AX(红色)的免疫荧光分析。细胞核用DAPI(蓝色)染色。

图8B显示在WT和Usp26缺陷精母细胞中进行SCP3(绿色)，TRF1(红色)和ATR(白色)的免疫荧光分析。细胞核用DAPI(蓝色)染色。

具体实施方式

下面将结合实施例进一步说明本发明的实质内容和有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。

实施例1病人和样品

受试者包括来自中国济南山东大学生殖医学中心的1020名克氏综合征患者。根据世界卫生组织的指导方针，克氏综合征不育男性患者至少通过精液分析和Papanicolaou染色的两次证实。所有KS男性都有47，XXY核型。使用272个无亲属关系的匿名的无关男性供体的DNA样品作为对照。研究方案经山东大学生殖医学机构审查委员会批准，并获得所有参与者的知情同意。

实施例2实验方法和材料

通过CRISPR-Cas9系统制备Usp26敲除小鼠

使用以下引物通过PCR扩增将T7启动子和引导序列添加至sgRNA：

Usp26-ugRNA1：AGTCCAGATGTGGAGTGCAAAGG；

Usp26-ugRNA2：TAAATGCTCAAGTCCAGATGTGG；

Usp26-ugRNA3：GTAAATCCCCCCGAGTACTCTGG；

Usp26-ugRNA4：TATCCATCCATCCGCAGTTGAGG；

Usp26-dgRNA5：GTAATTCTGGTCTTCGCCATAGG；

Usp26-dgRNA6：GGTCTTCGCCATAGGTTTGAAGG；

Usp26-dgRNA7：GCGGCCTAATCAGTACCATCAGG；

Usp26-dgRNA8：GACACCGTACTTGTATTAACTGG。

B6D2F1(C57BL/6×DBA2，RRID：IMSR_JAX：100006)雌性小鼠和ICR雌性小鼠分别用作胚胎供体和代孕母鼠。超数排卵的雌性B6D2F1小鼠(6-8周龄)与B6D2F1雄性种鼠交配，从输卵管收集受精胚胎。将Cas9mRNA(20ng)和sgRNA(10ng)注射到M2培养基(Sigma，M7167-50ml，Santa Clara，CA)中的具有明显原核的受精卵的细胞质中。注射了的受精卵在37℃，含5％CO₂的空气下，在含有氨基酸的KSOM(modified simplex-optimized medium,Millipore)中培养，然后将15-25个胚泡转移到假孕ICR雌鼠的子宫中。所有动物实验均根据中国科学院动物研究所的动物护理和使用委员会(institutional animal care anduse committee，IACUC)方法(#08-133)进行。

抗体

小鼠抗γH2AX抗体(05-636)购自Merck Millipore(Darmstadt，Germany)。兔抗USP26抗体(A7999)和抗TEX11抗体(A15868)购自Abclonal(武汉，中国)。小鼠抗MLH1(51-1327GR)抗体购自BD Pharmingen(SanDiego，CA)。兔抗SYCP1抗体(NB300-228c)和兔抗TRF2抗体(NB110-57130)购自Novus Biologicals(Littleton，CO)。小鼠抗SYCP3抗体(SC-74569)，山羊抗ATR抗体(SC-1187)，兔抗DMC1抗体(SC-22768)购自Santa CruzBiotechnology(Dallas，TX)。抗组蛋白3抗体(17168-1-AP)购自Proteintech Group(Rosemont，IL)。抗-FLAG抗体(M20008)，抗泛肌动蛋白抗体(M20010L)购自Abmart(中国上海)。山羊抗兔FITC(ZF-0311)，山羊抗小鼠FITC(ZF-0312)和山羊抗小鼠TRITC(ZF-0313)的缀合二抗购自中杉金桥(中国北京)。用于免疫印迹的Alexa Fluor 680-缀合的山羊抗小鼠抗体(A21057)和Alexa Fluor 680-缀合的山羊抗兔抗体(A21109)购自Invitrogen(Carlsbad，CA)。

评估Usp26缺陷小鼠的生育能力

将每只雄性小鼠(8或9周)与2只野生型CD1雌性(7或8周)一起笼养，并且每天早晨检查它们的阴道栓。将发生堵塞的雌性分开并单独笼养，记录妊娠结果。如果雌性在第22天后没有产生任何幼崽，则认为小鼠未怀孕并安乐死以确认结果。每只雄性进行6-10个循环的上述育种试验。

附睾精子计数

解剖尾部附睾。从尾部附睾中挤出精子，并在37℃，5％CO₂下孵育30分钟。然后将孵育的精子的培养基以1：500稀释并转移至血细胞计数器中进行计数。

组织收集和组织学分析

每种基因型至少3只小鼠的睾丸在小鼠安乐死后立即解剖，用4％(质量/体积)多聚甲醛(PFA；Solarbio，北京，中国，P1110)固定长达24小时，以70％(体积/体积)乙醇储存，并用石蜡封嵌。制备5μm切片并将其安装在载玻片上。脱蜡后，将载玻片用H&E染色用于组织学分析。对于PAS染色，通过用Bouin's固定剂(Polysciences，Warrington，PA)灌注小鼠来固定睾丸。脱蜡后，将载玻片用PAS和苏木精染色。根据Harvey,J等The Parental Originof 47,Xxy Males.Birth Def 1991；26:289-96记载的方法测定生精上皮细胞周期和精子细胞发育的阶段。

免疫荧光

精母细胞在载玻片上铺展以进行免疫染色。吹气干燥后，用PBS洗涤载玻片3次，并用5％牛血清白蛋白(Amresco，Solon，OH，AP0027)封闭。将第一抗体加入切片中并在4℃温育过夜，然后与第二抗体一起温育。用DAPI染色细胞核。使用LSM 780/710显微镜(Zeiss，Oberkochen，Germany)或SP8显微镜(Leica，Wetzlar，Germany)立即拍摄IF图像。

免疫沉淀

将pRK-FLAG-Usp26和pEGFP-TEX11共转染到HEK293T细胞中。将转染的细胞在TAP裂解缓冲液(50mM HEPES-KOH，pH7.5,100mM KCl，2mM EDTA，10％甘油，0.1％NP-40 10mMNaF，0.25mM Na₃VO₄，50mMβ-甘油磷酸盐)和蛋白酶抑制剂(Roche，04693132001)中裂解。在冰上保持30分钟，并以13,000g离心15分钟。对于免疫沉淀，将细胞裂解物与抗FLAG抗体在4℃温育过夜，然后与蛋白A-Sepharose(GE，17-1279-03)在4℃温育2小时。此后，用IP缓冲液(20mM Tris，pH7.4，2mM EGTA，1％NP-40)洗涤沉淀2次，并用含有1％SDS的样品缓冲液在55℃洗脱免疫复合物10分钟，通过免疫印迹进行分析。

人体精子制备和精子FISH分析

收集的精液首先在含有6mM EDTA的PBS中洗涤三次以消除杂质(300g，持续5分钟)，用Carnoy溶液(纯甲醇/冰醋酸＝3/1)固定两次，然后铺在载玻片上进行精子FISH。精子头部用1N NaOH去除，通过乙醇系列(70％，85％，100％)脱水。将载玻片置于42℃加热器上以蒸发剩余的EtOH，然后在预热的加湿箱中与探针(CEP Chromosome Enumeration DNAFISH探针，466279)杂交至少16小时。将切片依次在含有0.1％吐温的2X生理盐水柠檬酸钠(SSC)65℃下和2X SSC(两次)在室温下洗涤5分钟，然后用DAPI染色。

小鼠精子制备和精子FISH分析

从Usp26^+/Y和Usp26^-/Y小鼠分离附睾尾部，从附睾尾部释放精子，并在5％CO₂下于37℃温育30分钟。首先用PBS洗涤收集的精子以消除杂质(300g，持续5分钟)，用Carnoy溶液(纯甲醇/冰醋酸＝3/1)固定两次，然后铺在载玻片上进行精子FISH。精子头部用1N NaOH去除，通过乙醇系列(70％，85％，100％)脱水。将载玻片置于80℃加热器上以蒸发剩余的EtOH。用探针(Empire Genome，Chromosome X Green,Chromosome Y Red)在85℃变性10分钟后，在预热的加湿箱中于37℃杂交24小时。将切片依次在含有0.1％吐温的2X生理盐水柠檬酸钠(SSC)65℃下和2X SSC(两次)在室温下洗涤5分钟，然后用DAPI染色。

遗传分析

从外周血白细胞中提取基因组DNA。对近亲家庭的不育患者进行全外显子组测序(Whole-exome sequencing)以鉴定致病突变。根据供应商提供的使用方法，使用SureSelect Human All Exon V5(Agilent Technologies，5190-6208，Santa Clara，CA，USA)进行全外显子组捕获和富集。外显子组测序在HiSeq X10测序平台(Illumina Inc.，SanDiego，CA，USA)上进行。Burrows-Wheeler Alignment软件用于将序列读数与人参考序列(UCSC Genome Browser hg19)比对。采用ANNOVAR软件分析包括单核苷酸多态性和插入/缺失的序列变体。

统计分析

所有数据均以平均值±SEM表示。通过Student t检验以配对的双尾分布测量不同基因型的平均值之间差异的统计学显著性。当P值小于0.05(*)或0.01(**)时，数据被认为是显着的。

实施例3在人类中，USP26突变与克氏综合征有关

为了研究KS发生的潜在遗传基础，对无亲属关系的具有典型47XXY核型的108个克氏综合征患者进行了全外显子组测序(图1A和图1B)。然后，进一步研究了X染色体上以下三个睾丸特异性基因：ESX1，LOC101059915和USP26在这些克氏综合征患者的情况(图1C和图1D)。将KS患者中这三个基因的变异频率与人类1000基因组计划(1000Genomes Project)中这三个基因的变异频率进行比较，发现USP26变异的频率与ESX1和LOC101059915相比，具有最高的增加倍数(图1E)，表明USP26是与克氏综合征发生相关的潜在致病基因。

为进一步证实，发明人又对更多的克氏综合征患者(354名)和272名可育男性的USP26编码区进行了测序和比较。在其中的49名KS患者中发现了USP26变体(见表1)。两名患者中有两个同义突变，12名患者中有3个错义突变，35名患者发生了连锁突变(clusteredmutation)。

表1.克氏综合征患者的USP26变异

实施例4Usp26缺陷小鼠产生41XXY后代

为了确定USP26突变是否导致KS后代，根据实施例2描述的方法通过CRISPR-Cas9系统制备Usp26敲除小鼠。

测量了得到的Usp26敲除小鼠的敲除效率，发现USP26蛋白在Usp26^-/Y睾丸中完全没有(图2A)，表明得到的敲除小鼠是Usp26-null。缺乏Usp26的小鼠是存活的，并且到达成年期，没有任何可观察到的缺陷。

对Usp26^-/-雌性小鼠进行观察和检测。发现Usp26^-/-雌性小鼠是可育的，并且在减数分裂期间显示正常的卵泡发育和染色体分离(图6)。其中，图6A显示Usp26^+/+和Usp26^-/-小鼠中卵巢的苏木精和伊红(H&E)染色。图6B显示在Usp26^+/+和Usp26^-/-卵母细胞中进行Tub(绿色)的免疫荧光分析。细胞核用DAPI(蓝色)染色。

对Usp26缺陷雄性小鼠的繁殖力进行评估。发现随着年龄的增长，与对照组相比，Usp26^-/Y小鼠的妊娠率和产仔数均显着降低(图2B和2C)。没有从2个月大的Usp26^-/Y小鼠繁殖得到任何XXY F2小鼠，但确实从6个月大的Usp26^-/Y小鼠繁殖得到了KS小鼠(图2D-F)，因为在超过20％的雄性后代中可以检测到WT等位基因和Usp26敲除等位基因(图2D-F)：Usp26位于X染色体上，所以Usp26“加/减”雄性小鼠应该含有两条X染色体。

由于大多数克氏综合征患者和已报道的XXY小鼠模型显示无精子症，因此在本实验分析了Usp26^+/-/Y小鼠的精子发生。结果发现睾丸大小和重量显着降低(图2G和2H)，并且通过苏木精和曙红(H&E)染色的组织学检查显示Usp26^+/-/Y睾丸缺乏减数分裂后细胞(图2I)。在附睾尾部只检测到很少的精子，并且在Usp26^+/-/Y小鼠中精子的总数显着减少(图2I)，这与KS患者的现象相似。

因此，在较老的Usp26-null雄性小鼠中产生41XXY后代的机会更大。

实施例5USP26参与性染色体配对

为了研究USP26的生理功能，检测了它的表达，发现USP26主要在睾丸中表达，但不在任何其他组织或器官中表达(图3A)。

然后，通过扩散核的免疫染色表征USP26在精子发生过程中的精确定位，发现USP26与早期粗线期阶段的联会染色体轴一起出现，并且在后期粗线期和双线期阶段主要定位于XY体区域(图3B)，表明USP26可能参与重组和联会，但主要作用于性染色体。发明人确实发现在Usp26缺陷的精母细胞中有大约40％未配对的性染色体(图3C和3D)。USP26主要定位于XY体区域，它的破坏会导致未配对的性染色体(图3C-E)。其中，图3C显示在Usp26^-/Y精母细胞中X和Y染色体未配对。在Usp26^+/Y和Usp26^-/Y精母细胞中进行Chr X-FISH(绿色)，Chr Y-FISH(红色)和SCP3(白色)的免疫荧光分析。图3D显示未配对的X和Chr Y的定量。图3E显示在Usp26^+/Y和Usp26^-/Y精母细胞中进行SCP3(绿色)，ATR(红色)和p-ATM(粉红色)的免疫荧光分析。

在其他类型的Usp26缺失小鼠中也可以检测到未配对的性染色体(图8)，表明所有Usp26缺失的雄性小鼠的表型都是由同样的原因引起的。

实施例6Usp26缺陷型小鼠中未配对的性染色体导致XY非整倍体精子

由于染色体配对和联会对减数分裂中期的正确同源性排列至关重要，因此减数分裂重组和染色体联会的错误会增加细胞携带单价染色体进入中期的可能性。Usp26缺陷的精母细胞中的未交叉(achiasmate)性染色体可能导致中期I的分离错误(mis-segregation)。发明人确实观察到具有落后染色体的Usp26^-/Y纺锤体的比例显着增加(图4A-C)，表明Usp26的缺失导致了未交叉性染色体并导致中期I的染色体单价。非交换染色体通常由纺锤体装配检查点(spindle assembly checkpoint，SAC)监测并导致细胞死亡，而在一些具有落后染色体的Usp26缺陷的中期I精子细胞的TUNEL信号为阴性(图7)，表明这些具有分离错误的性染色体Usp26^-/Y精母细胞可以逃避纺锤体装配检查点监测。

然后还检查了精子中的X和Y染色体，发现与对照组相比，在6个月大的Usp26^-/Y小鼠中可以检测到更高比例的XY非整倍体精子(图4D和4E)，而在2个月大的对照小鼠和Usp26^-/Y小鼠中几乎没有XY非整倍体精子(图4E)，以及在所有这些小鼠中都没有发现XX和YY精子，这表明Usp26的破坏只影响减数分裂I但不影响减数分裂II(图5D和5E)。

因此，Usp26的破坏扰乱了性染色体重组和配对，导致它们在中期I的分离错误，并最终导致XY非整倍体精子，造成41XXY后代的产生。

实施例7USP26变异增加了人类中XY非整倍体精子的比例

根据上述对小鼠的研究和在人的样品中的研究，具有USP26变异的人类男性是可育的，但具有更高的产生XY非整倍体精子的风险。

由此，发明人分别测量了具有4种不同USP26变体的可育男性中XY非整倍体精子的比例。与没有USP26变体的人相比，在携带USP26变异的男性中发现了显著较高比例的XY非整倍体精子(图5A)，表明这些父系USP26变异增加了产生克氏综合征后代的风险。在这些变异中，USP26连锁突变(c.370-371insACA/494T>C/1423C>T)产生的XY非整倍体精子比例最高(图5B和5C)，这种连锁突变在KS患者中最常见(表1)。

进一步研究了558名克氏综合征患者的这种连锁突变，并鉴定出96个患者(17.20％)含有这种连锁突变。

而所有在本研究发现的USP26缺陷占父本克氏综合征的约30％。

本发明通过对大量克氏综合征患者的研究，首次发现USP26突变是KS父系起源的重要因素和遗传标记。USP26主要定位于XY体区域，它的破坏会导致未配对的性染色体(图3C-E)。减数分裂重组和染色体联会的错误增加细胞以单价染色体形式进入中期的可能性。理论上，如果性染色体在减数分裂I中随机分离，则分别有25％的X，Y，XY和O精子(图5D和5E)。如果性染色体在减数分裂II中随机分离，则分别有25％X，25％Y，12.5％XX，12.5％YY和25％O精子。本专利的发明人首次研究和发现从6个月大的Usp26敲除雄性小鼠产生约10％的XY精子，而不是XX或YY精子(图4D和4E)。最重要的是，本专利的发明人从6个月的Usp26敲除雄性小鼠中获得了一些XXY小鼠(图2F)。这些结果表明，一旦Usp26被敲除，性染色体就不能有效配对和突触，导致性染色体在减数分裂I中随机分离，产生XY非整倍体精子，最终导致XXY小鼠的产生。USP26的缺乏并不能绝对导致其后代产生XXY小鼠(图2F)，但是通过非经典的孟德尔遗传模式大大增加了KS后代产生的频率。

本专利的发明人还发现2个月大的Usp26缺陷雄性小鼠是可育的，但随着鼠龄的增加，怀孕率和产仔数均减少(图2B和2C)，表明Usp26缺陷型雄性小鼠的生育能力与年龄高度相关。因此，有USP26突变的年轻男性可具有生育能力，但随着年龄的增长可能会失去生育能力，被诊断出为少精子症乃至无精子症。同时，本专利的发明人还发现除了生育能力之外，41XXY后代的比例也与Usp26缺陷雄性小鼠的年龄有关，因为41XXY后代的产生仅来自6个月大的Usp26缺陷型雄性小鼠，而2个月大的Usp26缺陷型雄性小鼠则没有。

因此，本发明通过首次发现USP26突变是克氏综合征父系起源的重要因素和遗传标记，提供了一种有效地判断产生克氏综合征后代的风险的方法，和有关的试剂盒或仪器(包括基因芯片)。

上面是对本发明进行的说明，不能将其看成是对本发明进行的限制。除非另外指出，本发明的实践将使用有机化学、聚合物化学、生物技术等的常规技术，显然除在上述说明和实施例中所特别描述之外，还可以别的方式实现本发明。其它在本发明范围内的方面与改进将对本发明所属领域的技术人员显而易见。根据本发明的教导，许多改变和变化是可行的，因此其在本发明的范围之内。

如无特别表示，本文中出现的温度的单位“度”是指摄氏度，即℃。

序列表

<110> 山东大学中国科学院动物研究所山大生殖研发中心有限公司

<120> 克氏综合征的遗传标记物和其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 913

<212> PRT

<213> 人()

<400> 1

Met Ala Ala Leu Phe Leu Arg Gly Phe Val Gln Ile Gly Asn Cys Lys

1 5 10 15

Thr Gly Ile Ser Lys Ser Lys Glu Ala Phe Ile Glu Ala Val Glu Arg

20 25 30

Lys Lys Lys Asp Arg Leu Val Leu Tyr Phe Lys Ser Gly Lys Tyr Ser

35 40 45

Thr Phe Arg Leu Ser Asp Asn Ile Gln Asn Val Val Leu Lys Ser Tyr

50 55 60

Arg Gly Asn Gln Asn His Leu His Leu Thr Leu Gln Asn Asn Asn Gly

65 70 75 80

Leu Phe Ile Glu Gly Leu Ser Ser Thr Asp Ala Glu Gln Leu Lys Ile

85 90 95

Phe Leu Asp Arg Val His Gln Asn Glu Val Gln Pro Pro Val Arg Pro

100 105 110

Gly Lys Gly Gly Ser Val Phe Ser Ser Thr Thr Gln Lys Glu Ile Asn

115 120 125

Lys Thr Ser Phe His Lys Val Asp Glu Lys Ser Ser Ser Lys Ser Phe

130 135 140

Glu Ile Ala Lys Gly Ser Gly Thr Gly Val Leu Gln Arg Met Pro Leu

145 150 155 160

Leu Thr Ser Lys Leu Thr Leu Thr Cys Gly Glu Leu Ser Glu Asn Gln

165 170 175

His Lys Lys Arg Lys Arg Met Leu Ser Ser Ser Ser Glu Met Asn Glu

180 185 190

Glu Phe Leu Lys Glu Asn Asn Ser Val Glu Tyr Lys Lys Ser Lys Ala

195 200 205

Asp Cys Ser Arg Cys Val Ser Tyr Asn Arg Glu Lys Gln Leu Lys Leu

210 215 220

Lys Glu Leu Glu Glu Asn Lys Lys Leu Glu Cys Glu Ser Ser Cys Ile

225 230 235 240

Met Asn Ala Thr Gly Asn Pro Tyr Leu Asp Asp Ile Gly Leu Leu Gln

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

Tyr Met Asn Ala Val Leu Gln Ser Leu Leu Ser Ile Pro Ser Phe Ala

305 310 315 320

Asp Asp Leu Leu Asn Gln Ser Phe Pro Trp Gly Lys Ile Pro Leu Asn

325 330 335

Ala Leu Thr Met Cys Leu Ala Arg Leu Leu Phe Phe Lys Asp Thr Tyr

340 345 350

Asn Ile Glu Ile Lys Glu Met Leu Leu Leu Asn Leu Lys Lys Ala Ile

355 360 365

Ser Ala Ala Ala Glu Ile Phe His Gly Asn Ala Gln Asn Asp Ala His

370 375 380

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385 390 395 400

Leu Asn Thr Ile Trp Lys Pro Lys Ser Glu Phe Gly Glu Asp Asn Phe

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Pro Lys Gln Val Phe Ala Asp Asp Pro Asp Thr Ser Gly Phe Ser Cys

420 425 430

Pro Val Ile Thr Asn Phe Glu Leu Glu Leu Leu His Ser Ile Ala Cys

435 440 445

Lys Ala Cys Gly Gln Val Ile Leu Lys Thr Glu Leu Asn Asn Tyr Leu

450 455 460

Ser Ile Asn Leu Pro Gln Arg Ile Lys Ala His Pro Ser Ser Ile Gln

465 470 475 480

Ser Thr Phe Asp Leu Phe Phe Gly Ala Glu Glu Leu Glu Tyr Lys Cys

485 490 495

Ala Lys Cys Glu His Lys Thr Ser Val Gly Val His Ser Phe Ser Arg

500 505 510

Leu Pro Arg Ile Leu Ile Val His Leu Lys Arg Tyr Ser Leu Asn Glu

515 520 525

Phe Cys Ala Leu Lys Lys Asn Asp Gln Glu Val Ile Ile Ser Lys Tyr

530 535 540

Leu Lys Val Ser Ser His Cys Asn Glu Gly Thr Arg Pro Pro Leu Pro

545 550 555 560

Leu Ser Glu Asp Gly Glu Ile Thr Asp Phe Gln Leu Leu Lys Val Ile

565 570 575

Arg Lys Met Thr Ser Gly Asn Ile Ser Val Ser Trp Pro Ala Thr Lys

580 585 590

Glu Ser Lys Asp Ile Leu Ala Pro His Ile Gly Ser Asp Lys Glu Ser

595 600 605

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610 615 620

Gln Gln Lys Tyr Leu Gly Lys Asn Ser Lys Pro Asn Glu Leu Glu Ser

625 630 635 640

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645 650 655

Leu Met Thr Tyr Leu Glu Asp Thr Ser Leu Cys Gln Phe His Lys Ala

660 665 670

Gly Gly Lys Pro Ala Ser Ser Pro Gly Thr Pro Leu Ser Lys Val Asp

675 680 685

Phe Gln Thr Val Pro Glu Asn Pro Lys Arg Lys Lys Tyr Val Lys Thr

690 695 700

Ser Lys Phe Val Ala Phe Asp Arg Ile Ile Asn Pro Thr Lys Asp Leu

705 710 715 720

Tyr Glu Asp Lys Asn Ile Arg Ile Pro Glu Arg Phe Gln Lys Val Ser

725 730 735

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740 745 750

Gln Gln Ala Leu Pro Gln Ser Phe Pro Lys Pro Gly Thr Gln Gly His

755 760 765

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770 775 780

Arg Asn Ser Leu Leu Ala Leu Gly Ser Asn Lys Asn Pro Arg Asn Lys

785 790 795 800

Asp Ile Leu Asp Lys Ile Lys Ser Lys Ala Lys Glu Thr Lys Arg Asn

805 810 815

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865 870 875 880

Phe Phe Tyr Met His Asn Glu Ile Phe Glu Glu Met Leu Lys Arg Glu

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900 905 910

Glu

<210> 2

<211> 2742

<212> DNA

<213> 人()

<400> 2

atggctgccc tattcctacg tggttttgtc caaataggga actgcaagac tgggatatct 60

aagtcaaaag aagcattcat tgaagcagtg gaaagaaaga agaaagatag actggtgctg 120

tatttcaaaa gtggaaaata tagcactttt cggctaagtg ataatattca aaatgtagtc 180

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ttgtttattg aaggattatc ctccacagat gctgaacaat tgaagatatt cttggacaga 300

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ttgagtgagg atggagaaat tacagatttc caattattaa aagttattcg aaagatgact 1740

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cacattggat cagataagga gtctgaacaa aaaaaaggcc agacagtctt taaaggggca 1860

agcagaagac agcagcaaaa gtaccttgga aaaaattcta aaccaaatga gctagaatct 1920

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tatgaagata aaaatatcag aattccagaa agattccaaa aagtgtctga acagactcag 2220

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ccaaagccag gcacccaggg gcacacaaag aacctcctaa gacctacaaa attaaatcta 2340

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gacattttag ataagataaa atctaaagcc aaggaaacaa aaagaaatga tgataaggga 2460

gatcatacct accggctcat tagtgttgtc agccatcttg ggaagactct aaagtcaggc 2520

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cgggtgttag gtatccagga ggcccagatg caggaggata ggcgttgcac tgggtacatc 2640

ttcttttaca tgcataatga gatctttgaa gagatgttga aaagagaaga gaatgcccag 2700

cttaatagca aggaggtaga ggagaccctt cagaaggaat aa 2742

Claims

1.检测遗传标记的试剂在用于制备诊断男性受试者的后代患有克氏综合征的风险的试剂盒或仪器中的用途，其中所述遗传标记为USP26。

2.权利要求1的用途，其中所述检测遗传标记的试剂包括检测Usp26基因的试剂。

3.权利要求1的用途，其中所述检测遗传标记的试剂包括检测USP26蛋白的试剂。