CN101113478A - 诊断睾丸精原细胞瘤的方法 - Google Patents

Abstract

本文描述了用于检测和诊断睾丸精原细胞瘤(TS)的客观方法。在一个实施方案中，该诊断方法包含测定在TS和正常细胞之间有区别的TS－相关性基因的表达水平。本发明还提供了筛选用于治疗TS的治疗剂的方法，治疗TS的方法和接种受试者抗TS疫苗的方法。

Description

诊断睾丸精原细胞瘤的方法

本申请是申请日为2003年9月12日、申请号为03825373.9、题目为“诊断睾丸精原细胞瘤的方法”的分案申请。

发明领域

本发明涉及诊断睾丸精原细胞瘤的方法。

优先权信息

本申请要求2002年9月30日申请的美国临时申请系列号60/414,677的优先权。

技术背景

尽管睾丸生殖细胞肿瘤(TGCTs)占男性所有癌症的1-2％，但是它们是在年龄从20到40岁的男性群体中发现的最常见的癌症(1)，且在过去几十年中发病率显著递增(2，3)。TGCTs分成两种主要的组织学类型，即精原细胞瘤，类似于未分化的生殖细胞，和非精原细胞瘤，类似于胚胎和胚外两种组织，因为它们具有沿两者中任一途径分化的能力(7)。精原细胞瘤是TGCTs中最常见的组织学睾丸肿瘤且占所有TGCTs的大约60％到65％(8)。目前，甲胎蛋白(AFP)，人绒毛膜促性腺激素β-亚基(HCG)和乳酸脱氢酶(LDH)用作TGCTs的诊断肿瘤标记(9)。然而，尚未鉴定出无合胞体滋养层巨细胞的精原细胞瘤特异性肿瘤标记。

cDNA微阵列技术能够获得正常和恶性细胞的全面(comprehensive)基因表达谱，且能够比较在恶性和相应正常细胞中的基因表达(Okabe et al.，Cancer Res 61：2129-37(2001)；Kitahara et al.，Cancer Res 61：3544-9(2001)；Lin et al.，Oncogene 21：4120-8(2002)；Hasegawa et al.，Cancer Res 62：7012-7(2002))。该方法能够揭示癌症细胞的复杂特性，和帮助了解癌发生的机理。鉴定肿瘤中去调节的基因可导致更准确和精确地诊断个体癌症，和开发新的治疗靶(Bienz and Clevers，Cell 103：311-20(2000))。为了从基因组揭示肿瘤的机理，即普遍性观点，和探索用于诊断和新治疗性药品开发的靶分子，本发明人使用23040个基因的cDNA微阵列分析了肿瘤细胞的表达谱(Okabeet al.，Cancer Res 61：2129-37(2001)；Kitahara et al.，Cancer Res 61：3544-9(2001)；Lin et al.，Oncogene 21：4120-8(2002)；Hasegawa et al.，Cancer Res62：7012-7(2002))。

设计用于揭示癌发生机理的实验已经帮助鉴定了抗肿瘤剂的分子靶。例如，最初开发用于抑制与Ras相关的生长-信号传导途径的，其活化依赖于翻译后的法尼基化的法尼基转移酶(FTIs)的抑制剂，在动物模型中治疗Ras-依赖型肿瘤有效(He et al.，Cell 99：335-45(1999))。使用组合或抗癌药物与抗-HER2单克隆抗体，即trastuzumab对人体进行了临床试验以拮抗原癌基因受体HER2/neu；且成功改善了乳腺癌患者的临床反应和总体存活率(Lin et al.，Cancer Res 61：6345-9(2001))。已经开发了选择性灭活bcr-abl融合蛋白的酪氨酸激酶抑制剂，即STI-571，用于治疗bcr-abl酪氨酸激酶的组成型活化在白细胞转化中起决定性作用的慢性骨髓性白血病。这些类型的试剂设计成抑制特定基因产物的致癌活性(Fujita et al.，Cancer Res 61：7722-6(2001))。因此，在癌细胞中通常上调的基因产物可用作开发新抗癌剂的潜在靶。

已证实CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)识别在MHC I型分子上呈递的肿瘤相关性抗原(TAAs)产生的表位肽，并裂解肿瘤细胞。自从发现MAGE家族是TAAs的第一个例子后，使用免疫学方法发现了许多其它的TAAs(Boon，Int J Cancer 54：177-80(1993)；Boon and van der Bruggen，J ExpMed 183：725-9(1996)；van der Bruggen et al.，Science 254：1643-7(1991)；Brichard et al.，J Exp Med 178：489-95(1993)；Kawakami et al.，J Exp Med 180：347-52(1994))。一些发现的TAAs现在处于作为免疫疗法靶的临床开发阶段。至今发现的TAAs包括MAGE(van der Bruggen et al.，Science 254：1643-7(1991))，gp100(Kawakami et al.，J Exp Med 180：347-52(1994))，SART(Shichijo et al.，J Exp Med 187：277-88(1998))，和NY-ESO-1(Chen et al.，ProcNatl Acad Sci USA 94：1914-8(1997))。另一方面，已证实在肿瘤细胞中特异性过量表达的基因产物显示出作为诱导细胞免疫反应的靶。该基因产物包括p53(Umano et al.，Brit J Cancer 84：1052-7(2001))，HER2/neu(Tanaka et al.，Brit J Cancer 84：94-9(2001))，CEA(Nukaya et al.，Int J Cancer 80：92-7(1999))，等等。

尽管在涉及TAAs的基础和临床研究中取得了重要进展(Rosenbeg et al.，Nature Med 4：321-7(1998)；Mukherji et al.，Proc Natl Acad Sci USA 92：8078-82(1995)；Hu et al.，Cancer Res 56：2479-83(1996))，但是仅有有限数量的候选TAAs可用于治疗腺癌，包括结肠直肠癌。在癌细胞中大量表达且同时其表达局限于癌细胞的TAAs是作为免疫治疗靶的有前景的候选物。另外，对诱导潜在和特异性抗肿瘤免疫反应的新TAAs的鉴定预期可支持在各种癌症类型中临床使用肽接种方法(Boon and can der Bruggen，J Exp Med 183：725-9(1996)；van der Bruggen et al.，Science 254：1643-7(1991)；Brichard et al.，J Exp Med 178：489-95(1993)；Kawakami et al.，J Exp Med 180：347-52(1994)；Shichijo et al.，J Exp Med 187：277-88(1998)；Chen et al.，Proc Natl Acad SciUSA 94：1914-8(1997)；Harris，J Natl Cancer Inst 88：1442-5(1996)；Butterfield et al.，Cancer Res 59：3134-42(1999)；Vissers et al.，Cancer Res 59：5554-9(1999)；van der Burg et al.，J Immunol 156：3308-14(1996)；Tanaka et al.，Cancer Res 57：4465-8(1997)；Fujie et al.，Int J Cancer 80：169-72(1999)；Kikuchi et al.，Int J Cancer 81：459-66(1999)；Oiso et al.，Int J Cancer 81：387-94(1999))。

已经反复报导了来自某些健康供体的肽刺激的外周血单核细胞(PBMCs)与该肽应答产生明显水平的IFN-，但在⁵¹Cr-释放试验中很少以HLA-A24或-A0201限制性方式发挥对肿瘤细胞的细胞毒性(Kawano et al.，Cance Res 60：3550-8(2000)；Nishizaka et al.，Cancer Res 60：4830-7(2000)；Tamura et al.，Jpn J Cancer Res 92：762-7(2001))。然而，HLA-A24和HLA-A0201都是在日本人以及高加索人中常见的HLA等位基因之一(Date etal.，Tissue Antigens 47：93-101(1996)；Kondo et al.，J Immunol 155：4307-12(1995)；Kubo et al.，J Immunol 152：3913-24(1994)；Imanishi et al.，Proceedingof the eleventh International Hictocompatibility Workshop and ConferenceOxford University Press，Oxford，1065(1992)；Williams et al.，Tissue Antigen 49：129(1997))。因此，由这些HLAs呈递的癌抗原肽对于治疗日本人和高加索人中的癌症特别有用。另外，已知低亲和性CTL的体外诱导通常由使用高浓度的肽引起，在抗原呈递细胞(APCs)上产生高水平的特异性肽/MHC复合物，它会有效激活这些CTL(Alexander-Miller et al.，Proc Natl Acad Sci USA 93：4102-7(1996))。

含有PYRIN的Apaf-1-样蛋白质(PYPAFs)是最近鉴定的蛋白质(37)。已有报导在人类(Homo sapiens)中存在14个PYPAFs基因(38)。据认为含有富含亮氨酸的重复区，PYRIN，NACHT和NACHT-相关性结构域的所有PYPAF蛋白在凋亡和炎症信号传导途径中起作用。据报道N末端的PYRIN结构域与蛋白-蛋白相互作用相关(38)。另外，NACHT结构域与凋亡蛋白酶激活因子-1(APAF-1)的核苷酸结合基序具有序列同源性，且预期结合ATP(37)。然而，含有PYRIN的Apaf-1-样蛋白质从未与肿瘤发生相联系。

发明内容

本发明以发现与睾丸精原细胞瘤(TS)相关的基因表达谱为基础。在TS中差异表达的基因本文统称为“TS核酸”或“TS多核苷酸”且相应编码的多肽称为“TS多肽”或“TS蛋白质”。

因此，本发明的特征在于通过测定诸如组织样品的患者生物学样品中TS-相关性基因的表达水平来诊断或确定受试者的TS易感性(predisposition)的方法。TS相关性基因是指其特征在于与正常细胞相比在从睾丸生殖细胞肿瘤细胞获得的细胞中表达水平存在差异的基因。正常细胞是从睾丸组织获得的细胞。TS-相关性基因是TS 1-939中的一种或多种。与该基因的正常对照水平相比基因表达水平的改变，例如升高或降低，表明该受试者患有TS或者存在形成TS的风险。

正常对照水平是指在正常健康个体或已知没有患TS的个体的群体中检测的基因表达水平。对照水平是来自单个参照群体或来自多个表达谱的单个表达谱。例如，对照水平可以是来自以前检测的细胞的表达谱数据。正常个体是无TS临床症状且无TS家族史的个体。

与正常对照水平相比在试验样品中检测到TS 1-346水平升高表明该受试者(从他们获得样品)患有TS或者存在形成TS的风险。相反，与正常对照水平相比在试验样品中检测到TS 347-939水平降低表明该受试者患有TS或者存在形成TS的风险。

作为选择，可比较在该样品中一组TS-相关性基因的表达与同一组基因的TS对照水平。TS对照水平是指在患有TS的群体中发现的TS-相关性基因的表达谱。

基因表达比对照水平升高或降低10％，25％，50％。或者，基因表达比对照水平升高或降低0.1，0.2，1，2，5，10或更多倍。表达可通过检测例如，阵列上TS-相关性基因探针与患者组织样品的基因转录子的杂交来测定。

患者组织样品可以是来自试验受试者，例如已知或怀疑患有TS的患者的任何组织。例如，该组织含有睾丸生殖细胞肿瘤细胞。例如，该组织是来自睾丸的细胞。

本发明还提供了TS 1-346中的两个或多个基因表达水平的TS参照表达谱。另外，本发明提供了TS 1-346或TS 347-939中的两个或多个的表达水平的TS参照表达谱。

本发明还提供了通过将表达TS相关性基因的试验细胞与试剂接触并测定TS相关性基因的表达水平来鉴定可抑制或增强诸如TS 1-939的TS-相关性基因的表达或活性的试剂。该试验细胞是睾丸细胞，例如，来自睾丸生殖细胞肿瘤的睾丸细胞。与该基因的正常对照水平相比水平降低表明该试剂是TS-相关性基因的抑制剂且减少TS的症状。另外，与该基因的正常对照水平或活性相比水平或活性升高表明该试剂是TS相关性基因的表达或功能的增强剂且减少TS的症状，例如，TS 347-939。

本发明还提供了具有与两个或多个TS核酸序列结合或者与该核酸序列编码的基因产物结合的检测试剂的试剂盒。还提供了与两个或多个TS核酸结合的核酸阵列。

治疗方法包括通过给受试者施用反义组合物治疗或预防受试者TS的方法。反义组合物降低特异性靶基因的表达，例如，该反义组合物含有与选自TS 1-346的序列互补的核苷酸。另一方法包括给受试者施用短干扰RNA(siRNA)组合物的步骤。siRNA组合物降低选自TS 1-346的核酸的表达。我们证实了PYPAF3在睾丸精原细胞瘤中普遍上调且通过小干扰RNA(siRNA)敲除PYPAF3转录子抑制睾丸生殖细胞肿瘤细胞的细胞生长。

在另一方法中，治疗或预防受试者TS通过给受试者施用核酶组合物来实现。核酸特异性核酶组合物降低选自TS 1-346的核酸的表达。其它治疗方法包括给受试者施用增加TS 347-939的表达或TS 347-939编码的多肽活性的化合物的那些方法。另外，通过施用TS 347-939编码的蛋白质可治疗TS。该蛋白质可直接施用给患者，或者作为选择，可通过例如，施用携带下调目的标记基因的表达载体或宿主细胞导入患者后体内表达。用于体内表达目的基因的合适机理是本领域已知的。

本发明还包括疫苗和接种方法。例如，治疗或预防受试者TS的方法可通过给受试者施用含有选自TS 1-346的核酸编码的多肽或者该多肽的免疫学活性片段的疫苗来实现。免疫学活性片段是长度比全长天然存在的蛋白质要短且诱导免疫反应的多肽。例如，免疫活性片段至少有8个残基长且刺激诸如T细胞或B细胞的免疫细胞。免疫细胞刺激可通过检测细胞增殖，细胞因子(例如，IL-2)的作用，或抗体的产生来测量。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常的理解具有相同的含义。尽管与本文所述相似或相当的方法和材料可用于实施或试验本发明，但是下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物，专利申请，专利，和其它参考文献以其整体引用以供参考。如有冲突，以本说明书，包括定义为准。另外，材料，方法，和实施例仅仅是例证性的而不是限制性的。

本文所述方法的一个优势在于在检测到明显的临床症状之前就可鉴定该疾病。本发明的其它特征和优势从下面的详细描述和权利要求书将是显而易见的。

附图说明

图1表示DNA琼脂糖凝胶的照片，显示了使用扩增RNA制备的cDNA通过半定量RT-PCR检查的代表性28个基因和TUBA的表达。前11个泳道显示了不同TS患者中这些基因的表达水平。最后一条泳道显示了正常个体睾丸中各基因的表达水平。基因代号表示这些基因。

图2A显示了在8个睾丸精原细胞瘤临床样品(编号1，2，7，8，9，10，11和13)，正常人睾丸(TES)，心脏(HER)，肺(LUN)，肝脏(LIV)，肾(KID)，脑(BRA)和骨髓(BM)中通过半定量RT-PCR检查的PYPAF3表达。TUBA3的表达用作内部对照。图2B显示了使用PYPAF3 cDNA片段作为探针的多组织印迹的northern分析。

图3显示了myc-标记的PYPAF3蛋白质的亚细胞定位。用pcDNA3.1-myc/His-PYPAF3质粒转染的COS-7细胞的提取物中Myc-标记的PYPAF3蛋白。用小鼠抗-myc单克隆抗体染色转染细胞并通过FITC-偶连的抗小鼠IgG第二抗体观察。细胞核用DAPI复染。

图4显示经设计用于减少睾丸生殖细胞肿瘤系Tera-2中PYPAF3表达的小干扰RNAs(siRNA)的生长-抑制效果。(A)半定量RT-PCR表明在两周时抑制睾丸生殖细胞肿瘤系Tera-2中PYPAF3的内源性表达的抑制(siRNAs导入睾丸生殖细胞肿瘤系Tera-2细胞后在含有新霉素的选择培养基中培养。β2-微球蛋白(β2MG)用作内部对照。(B)集落形成试验证实了在两周时与作为对照的psiU6BX-EGFP(siEGFP)，psiU6BX-Luciferase(siLuc)相比，在睾丸生殖细胞肿瘤系Tera-2细胞中敲除PYPAF3(Si1，Si2，Si3，Si4，和Si5)的集落的数目减少。(C)在1周时使用细胞计数试剂盒-8对psiU6BX-PYPAF3(Si1，Si2，Si3，Si4，和Si5)，psiU6BX-EGFP(siEGFP)，psiU6BX-Luciferase(siLuc)之一所处理的睾丸生殖细胞肿瘤系Tera-2细胞进行MTT测定。这些实验也进行三次。

详细描述

本发明部分以发现TS患者睾丸细胞中多个核酸序列表达谱的改变为基础。使用全面(comprehensive)cDNA微阵列系统鉴定基因表达的差异。

使用含有23,040个基因的cDNA微阵列，构建了13个患者的全面基因表达谱。某些基因在TS患者中低或高水平表达。在选择具有检测患者血清或唾液中癌症相关性蛋白的潜力的候选分子标记的过程中，发现了在人睾丸癌症中形成信号抑制策略的一些潜在靶。

本文鉴定的差异表达基因作为TS标记和基因靶用于诊断目的，改变其表达以治疗或减轻TS症状。

在TS患者中其表达水平调整(即，增加或降低)的基因在表3，4中概括且本文统称为“TS-相关性基因”，“TS核酸”或“TS多核苷酸”，且相应编码的多肽称为“TS多肽”或“TS蛋白质”。除非另有说明，“TS”是指本文公开的任一序列。(例如，TS 1-939)。该基因以前已有描述且与数据库登录号一起提供。

通过测量细胞样品中各种基因的表达，可诊断TS。同样，通过测量与各种试剂反应这些基因的表达，可鉴定治疗TS的试剂。

本发明涉及测定(例如，测量)至少一个到多达全部的表3，4所列TS序列的表达。使用GeneBank^TM数据库登录项提供的已知序列的序列信息，可使用本领域的普通技术人员熟知的技术检测和测量该TS相关性基因。例如，相应于TS序列的序列数据库登录项中的序列可用于构建探针以便在例如，northern印迹杂交分析中检测TS RNA序列。探针包括参照序列的至少10，20，50，100，200个核苷酸。作为另一例子，该序列可用于构建特异性扩增该TS序列的引物，例如，在基于扩增的检测方法中，例如基于逆转录的聚合酶链式反应。

然后比较试验细胞群体，例如患者组织样品中一或多个该TS序列的表达水平与参照群体中相同序列的表达水平。参照细胞群体包括其比较参数已知的一种或多种细胞，即，TS细胞或非TS细胞。

与参照细胞群体相比试验细胞群体中的基因表达谱是否表明为TS或对其易感依赖于参照细胞群体的组成。例如，如果参照细胞群体由非-TS细胞组成，则试验细胞群体与参照细胞群体中基因表达谱相似表明该试验细胞群体是非-TS。相反，如果参照细胞群体由TS细胞构成，则试验细胞群体与参照细胞群体之间基因表达谱相似表明该试验细胞群体包括TS细胞。

如果其表达水平相对于参照细胞群体的改变超过参照细胞群体中相应TS序列表达水平的1.0，1.5，2.0，5.0，10.0或更多倍，则在试验细胞群体中TS标记基因的表达水平认为在表达水平上有改变。

试验细胞群体与参照细胞群体之间的差异基因表达相对于对照核酸，例如管家基因正态化。例如，对照核酸是依赖于该细胞的子宫内膜异位(endometriotic)或非子宫内膜异位(non-endometriotic)状态已知无区别的核酸。试验中的对照核酸和参照核酸的表达水平可用于正态化所比较群体中的信号水平。对照基因包括β-肌动蛋白，甘油醛3-磷酸脱氢酶或核糖体蛋白P1。

将试验细胞群体与多种参照细胞群体进行比较。多种参照细胞群体中每一种的已知参数可能有差异。因此，可将试验细胞群体与已知含有，例如，TS细胞的第二种参照细胞群体，以及已知含有，例如，非-TS细胞(正常细胞)的第二种参照群体进行比较。试验细胞包含在已知含有，或者怀疑含有TS细胞的受试者的组织类型或细胞样品中。

试验细胞从身体组织或体液，例如，生物学液体(例如血液或尿)中获得。例如，试验细胞从组织中纯化。优选的是，试验细胞群体含有上皮细胞。上皮细胞来源于已知或怀疑是TS的组织。

参照细胞群体中的细胞来自于与试验细胞相似的组织类型。任选的是，参照细胞群体是细胞系，例如TS细胞系(阳性对照)或正常非-TS细胞系(阴性对照)。作为选择，对照细胞群体可来源于其测定参数或条件已知的细胞的分子信息数据库。

受试者优选是哺乳动物。该哺乳动物可以是，例如，人，非人灵长类，小鼠，大鼠，狗，猫，马，或奶牛。

使用本领域已知的方法在蛋白质或核酸水平上测定本文公开的基因的表达。例如，使用特异性识别一或多个该序列的探针进行的Northern杂交分析可用于测定基因表达。作为选择，使用基于逆转录的PCR测定法，例如使用对差异表达序列特异性的引物可测量表达。也可以在蛋白质水平上测定表达，即，通过测量本文所述的基因产物编码的多肽的水平，或其生物学活性。该方法是本领域熟知的且包括，例如，以抗该基因编码的蛋白质的抗体为基础的免疫测定法。该基因编码的蛋白质的生物学活性也是熟知的。

诊断TS

通过测量试验细胞群体，(即，患者生物学样品)中一种或多种TS核酸序列的表达水平可诊断TS。优选的是，该试验细胞群体含有上皮细胞，例如，从睾丸组织获得的细胞。基因表达也可从血液或诸如尿的其它体液中测量。其它生物学样品可用于测量蛋白质水平。例如，来自待诊断的受试者的血液，或血清中的蛋白质水平可通过免疫测定法或生物学测定法测量。

测定试验细胞或生物学样品中一种或多种TS-相关性基因，例如TS1-939的表达并与正常对照水平的表达进行比较。正常对照水平是在已知没有患TS的群体中发现的典型TS-相关性基因的表达谱。患者组织样品中TS相关性基因的表达水平升高或降低表明该受试者患有TS或者存在形成TS的风险。例如，与正常对照水平相比在试验群体中TS 1-346的表达增加表明该受试者患有TS或者存在形成TS的风险。相反，与正常对照水平相比在试验群体中TS 347-939的表达降低表明该受试者患有TS或者存在形成TS的风险。

与正常对照水平相比，在试验群体中一或多个TS-相关性基因改变表明该受试者患有TS或者存在形成TS的风险。例如，一组TS-相关性基因(TS1-346，TS 347-939，或TS 1-939)改变至少1％，5％，25％，50％，60％，80％，90％或更多。

鉴定抑制或增强TS-相关性基因表达的试剂

通过将表达TS相关性上调基因的试验细胞群体与试剂接触并测定该TS相关性基因的表达水平可鉴定抑制TS-相关性基因的表达或活性的试剂。与正常对照水平相比(或与没有该试剂时的水平相比)在该试剂存在时的表达下降表明该试剂是TS相关性上调基因的抑制剂且可用于抑制TS。

作为选择，通过将表达TS相关性基因的试验细胞群体与试剂接触并测定该TS相关性下调基因的表达水平或活性可鉴定增强TS下调相关性基因的表达或活性的试剂。与TS相关性基因的正常对照表达水平或活性相比表达或活性增加表明该试剂增加下调的TS相关性基因的表达或活性。

试验细胞群体可以是任何表达TS-相关性基因的细胞。例如，该试验细胞群体含有上皮细胞，例如，该细胞是或者来源于睾丸。例如，该试验细胞是来源于睾丸生殖细胞肿瘤的永生化细胞系。作为选择，该试验细胞是用TS-相关性基因转染的细胞或者是用与报道基因可操作地连接的TS相关性基因的调控序列(例如，启动子序列)转染的细胞。

评估受试者中TS的治疗效果

本文鉴定的差异表达的TS序列还允许用于监测TS的治疗过程。在该方法中，试验细胞群体由进行TS治疗的受试者提供。如果需要，可在治疗前，治疗期间或治疗后的各个时间点从受试者获得试验细胞群体。然后测定细胞群体中一或多个TS序列的表达并与包括其TS状况已知的细胞的参照细胞群体进行比较。该参照细胞未接受治疗。

如果参照细胞群体不含TS细胞，在试验细胞群体和参照细胞群体中TS序列之间表达的相似性表明该治疗是有效的。然而，在试验群体和正常对照参照细胞群体中TS序列之间表达的差异表明临床效果或预后不佳。

“有效”是指治疗导致病理性上调基因的表达减少，病理性下调基因的表达增加或受试者睾丸肿瘤的大小，流行，或转移潜力减小。当治疗用于预防性时，“有效”是指治疗延缓或防止TS形成或延缓，防止，或减轻临床TS的症状。使用标准临床方法进行睾丸肿瘤的评估。

有效性可与用于诊断或治疗TS的任何已知方法联合来测定。例如，通过鉴定症状异常，例如睾丸的无痛肿大，可诊断TS。

选择适合于特定个体的治疗TS的治疗剂

个体遗传组成的差异可导致在其代谢各种药物的相对能力上存在差异。在受试者中代谢充当抗-TS剂的试剂可通过诱导受试者细胞从TS状态特征性的基因表达谱改变成非-TS状态特征性的基因表达谱来自我证实。因此，本文公开的差异表达的TS序列允许在来源于选定受试者的试验细胞群体中检测TS的推定治疗性或预防性抑制剂以便确定该试剂是否是受试者中合适的TS抑制剂。

为了鉴定适合于特定受试者的TS抑制剂或增强剂，可将受试者的试验细胞群体与治疗剂接触，并测定一或多个TS 1-939序列的表达。

试验细胞群体含有表达TS相关性基因的TS细胞。优选的是，该试验细胞是上皮细胞。例如，在候选试剂存在下培养试验细胞群体，测量该试验样品的基因表达谱并与一或多个参照谱，例如，TS参照表达谱或非-TS参照表达谱进行比较。

相对于含有TS的参照细胞群体在试验细胞群体中一或多个序列TS1-346表达的减少或者一或多个序列TS 347-939表达的增加表明该试剂是治疗剂。

该试剂可以是任何化合物或组合物。例如，该试剂是免疫调节剂。

鉴定治疗剂的筛选试验

本文公开的差异表达序列也可用于鉴定治疗TS的候选治疗剂。该方法基于筛选候选治疗剂以确定其是否能将TS症状特征性的TS 1-939序列的表达谱转变成非-TS症状的指标谱。

在该方法中，将细胞与试剂或联合试剂(依次或随后)接触并测量细胞中一或多个TS 1-939序列的表达。将试验群体中TS序列的表达谱与未接触该试剂的参照细胞群体中TS序列的表达水平进行比较。

有效刺激表达不足的基因表达，或者抑制过度表达的基因表达的试剂相信会产生临床效益，可进一步试验该化合物防止动物或试验受试者中子宫内膜囊肿生长，例如子宫内膜腺体和/或基质生长的能力。

在另一实施方案中，本发明提供了筛选候选试剂的方法，该试剂是TS治疗中的潜在目标。正如上文的详细描述，通过控制标记基因的表达水平或活性，可控制TS的发作和进行。因此，通过使用标记基因的表达水平和活性作为指标的筛选可鉴定作为TS治疗的潜在目标的候选试剂。在本发明内容中，该筛选可包括，例如，下列步骤：

a)将试验化合物与TS 1-939编码的多肽接触；

b)检测该多肽与试验化合物之间的结合活性；和

c)选择与该多肽结合的化合物。

作为选择，本发明的筛选方法可包含下列步骤：

a)将候选化合物与表达一种或多种标记基因的细胞接触，其中一或多个标记基因选自TS 1-939；和

b)选择降低选自TS 1-346的一或多个标记基因的表达水平，或者升高选自TS 347-939的一或多个标记基因的表达水平的化合物。

表达标记基因的细胞包括，例如，从TS建立的细胞系；该细胞可用于本发明的上述筛选。

作为选择，本发明的筛选方法可包括下列步骤：

a)将试验化合物与选自TS 1-939编码的多肽接触；

b)检测步骤(a)的多肽的生物学活性；和

c)选择与不存在该试验化合物时检测的生物学活性相比抑制TS 1-346编码的多肽的生物学活性，或者与不存在该试验化合物时检测的生物学活性相比增强TS 347-939编码的多肽的生物学活性的化合物。

筛选所需的蛋白质可使用该标记基因的核苷酸序列作为重组蛋白获得。根据该标记基因的信息，本领域的技术人员可选择该蛋白质的任一生物学活性作为基于选定生物学活性的筛选和测量方法的指标。

作为选择，本发明的筛选方法可包括下列步骤：

a)将候选化合物与细胞接触，该细胞导入了含有一或多个标记基因的转录调控区和在该转录调控区控制下表达的报道基因的载体，其中一或多个标记基因选自TS 1-939

b)测量所述报道基因的活性；和

c)选择与对照相比，当所述标记基因是选自TS 1-346的上调标记基因时降低所述报道基因的表达水平或者当所述标记基因是选自TS 347-939的下调标记基因时增强所述报道基因的表达水平的化合物。

合适的报道基因和宿主细胞是本领域熟知的。筛选所需的报道基因构建体可通过使用标记基因的转录调控区来制备。当标记基因的转录调控区是本领域的技术人员已知的时，报道基因构建体可使用现有的序列信息来制备。当标记基因的转录调控区尚未鉴定时，可根据该标记基因的核苷酸序列信息从基因组文库分离含有该转录调控区的核苷酸片段。

通过筛选分离的化合物是抑制标记基因编码的蛋白质的活性且可用于治疗或预防TS的药物的候选物。

另外，通过本发明的筛选方法可获得的化合物也包括这样的化合物，即通过添加，缺失和/或取代改变了可抑制标记基因编码的蛋白质的活性的该化合物的部分结构。

当作为人类和其它哺乳动物，例如小鼠，大鼠，豚鼠，兔，猫，狗，绵羊，猪，牛，猴，狒狒，和黑猩猩的药物施用以本发明的方法分离的化合物时，该分离的化合物可直接给药或者可使用已知的药品制备方法配制成剂型。例如，根据需要，该药品可作为糖衣片剂，胶囊，酏剂和微胶囊口服，或者以含有水或任何其它可药用液体的无菌溶液或悬液的注射剂形式非口服。例如，该化合物可与可药用载体或介质，特别是无菌水，生理盐水，植物油，乳化剂，悬浮剂，表面活性剂，稳定剂，调味剂，赋形剂，载体，防腐剂，结合剂等以普遍接受的药品添加所需的单位剂量形式混合。在这些制品中活性成份的量使得可获得所需范围内的合适剂量。

可混合成片剂和胶囊的添加剂的例子是诸如明胶，玉米淀粉，黄芪胶和阿拉伯树胶的结合剂；诸如晶状纤维素的赋形剂；诸如玉米淀粉，明胶和海藻酸的膨胀剂；诸如硬脂酸镁的润滑剂；诸如蔗糖，乳糖或糖精的甜味剂；和诸如薄荷，Gaultheria adenothrix油和樱桃的调味剂。当单位剂量形式是胶囊时，在上述成份中也可进一步包含诸如油类的液体载体。注射用无菌混合物可在正常的药品添加后使用诸如注射用蒸馏水的载体配制。

生理盐水，葡萄糖，和包括诸如D-山梨醇，D-甘露糖，D-甘露醇，和氯化钠的佐剂的其它等渗液可用作注射用水溶液。它们可与诸如醇的合适增溶剂，特别是乙醇，诸如丙二醇和聚乙二醇的多元醇，诸如吐温80(TM)和HCO-50的非离子表面活性剂结合使用。

芝麻油或大豆油可用作油质液体且可与作为增溶剂的苯甲酸苄酯(benzyl benzoate)或苯甲醇结合使用且可用诸如磷酸盐缓冲液和醋酸钠缓冲液的缓冲液；诸如盐酸普鲁卡因的止痛剂；诸如苯甲醇和苯酚的稳定剂；和抗氧化剂配制。制备的注射剂可装入合适的安瓿中。

可使用本领域的技术人员熟知的方法给患者施用本发明的药物组合物，例如作为动脉内，静脉内，或皮下注射剂且也可作为鼻内，经支气管，肌肉内或口服给药。给药的剂量和方法根据患者的体重和年龄和给药方法而变化；然而，本领域的技术人员可按常规选择合适的给药方法。如果所述的化合物可由DNA编码，则可将该DNA插入用于基因治疗的载体中并将该载体施用给患者进行治疗。给药的剂量和方法可根据体重，年龄，和患者的症状而变化，但本领域的技术人员可合适地选择它们。

例如，尽管与本发明的蛋白质结合并调节其活性的化合物的剂量取决于该症状，但是当给正常成年人(体重60kg)口服给药时，该剂量是每天大约0.1mg到大约100mg，优选每天大约1.0mg到大约50mg且更优选每天大约1.0mg到大约20mg。

当给正常成年人(体重60kg)不经肠道，以注射形式给药时，尽管根据患者，靶器官，症状和给药方法有一些区别，但是合适的是以每天大约0.01mg到大约30mg的剂量，优选每天大约0.1到大约20mg且更优选每天大约0.1到大约10mg的剂量静脉内注射。另外，对于其它动物，可相对于60kgs体重换算出一个给药量。

评估患有TS的受试者的预后

通过比较试验细胞群体中一或多个TS序列的表达与超过发病期表达谱的来自患者的参照细胞群体中该序列的表达还提供了评估患有TS的受试者的预后的方法。通过比较试验细胞群体和参照细胞群体中一或多个TS序列的基因表达，或者通过比较来自受试者的试验细胞群体在一段时间中的基因表达谱，可评估该受试者的预后。

与正常对照相比一或多个序列TS 347-939表达的降低或与正常对照相比一或多个序列TS 1-346表达的增加表明预后不佳。一或多个序列TS347-939表达的增加表明预后良好，序列TS 1-346表达降低也表明受试者预后良好。

试剂盒

本发明还包括TS-检测试剂，例如，特异性结合或鉴定一或多个TS核酸的核酸，例如与TS核酸的一部分互补的寡核苷酸序列或者与TS核酸编码的蛋白质结合的抗体。该试剂可以试剂盒的形式包装在一起。该试剂可包装在分开的容器中，例如，核酸或抗体(与固体基质结合或者与将它们结合到基质上的试剂分开包装)，对照试剂(阳性和/或阴性)，和/或检测标记。该试剂盒中可包括进行该试验的说明书(例如，书面，磁带，VCR，CD-ROM，等)。该试剂盒的测定形式是本领域已知的Northern杂交或夹心ELISA。

例如，可将TS检测试剂固定在诸如多孔条的固体基质上以形成至少一个TS检测位点。该多孔条的测量或检测区可包括多个含有核酸的位点。试验条也可含有阴性和/或阳性对照的位点。另外，对照位点可位于与试验条分开的条上。任选的是，不同检测位点可含有不同量的固定核酸，即第一个检测位点的量更高且随后位点的量更低。加入试验样品时，显示有可检测信号的位点数目提供了样品中存在的TS量的定量指标。该检测位点可构成任何合适的可检测形状且一般是横跨试验条宽度的条或点状。

作为选择，该试剂盒可含有核酸底物阵列，该阵列含有一或多个核酸序列。阵列上的核酸可特异性鉴定TS 1-939所示的一或多个核酸序列。根据与阵列试验条或芯片结合的水平可鉴定TS 1-939所示的2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，40或50或更多个序列的表达。底物阵列可以在例如，固体基质，例如美国专利号5,744,305所述的“芯片”上。

阵列和多个的情况

本发明还包括核酸底物阵列，该阵列含有一或多个核酸序列。阵列上的核酸特异性相应于TS 1-939所示的一或多个核酸序列。通过检测与该阵列结合的核酸来鉴定TS 1-939所示的2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，40或50或更多个序列的表达水平。

本发明还包括分离的多个核酸序列(即，两个或多个核酸的混合物)。该核酸序列存在于液相或固相中，例如，固定在诸如硝酸纤维素膜的固相支持物上。多个的情况包括TS 1-939所示的一或多个核酸序列。在各种实施方案中，多个的情况包括TS 1-939所示的2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，40或50或更多个序列。

抑制TS的方法

本发明提供了通过降低TS 1-346的表达或活性或者增加TS 347-939的表达或活性来治疗或减轻受试者TS症状的方法。给患有TS或者具有形成TS风险(或对TS易感)的受试者预防性或治疗性施用治疗化合物。使用标准临床方法或通过检测(例如，TS 1-939)的异常表达或活性水平可鉴定该受试者。治疗剂包括细胞周期调控，细胞增殖，和蛋白激酶活性的抑制剂。

治疗方法包括增加相对于产生TS的相同组织类型中的正常细胞在TS细胞中其表达减少的基因(“表达不足的基因”)中一或多个基因产物的表达或功能或者两者。在这些方法中，可用有效量的化合物治疗该受试者，该化合物可增加受试者中一或多个表达不足的基因的量。给药可以是系统的或者局部的。治疗性化合物包括表达不足的基因的多肽产物，或其生物学活性片段，编码该表达不足的基因且具有允许在TS细胞中表达的表达调控元件的核酸；例如可增加TS细胞中内源性的该基因的表达水平(即，上调该表达不足的基因的表达)的试剂。施用该化合物可抵抗受试者睾丸细胞中该基因异常性表达不足的影响并改善受试者的临床症状。

该方法还包括减少睾丸细胞中其表达异常性增加的基因(“过度表达基因”)中的一或多个基因产物的表达，或功能或两者。以本领域已知的任一方式可抑制表达。例如，通过给受试者施用抑制，或拮抗该过度表达基因的表达的核酸，例如破坏该过度表达基因的表达的反义寡核苷酸或小干扰RNA可抑制表达。

如上所述，可使用相应于TS 1-346的核苷酸序列的反义核酸降低TS1-346的表达水平。相应于在TS中上调的TS 1-346的反义核酸可用于治疗TS。具体地说，本发明的反义核酸可通过结合TS 1-346或与其相应的mRNAs，从而抑制该基因的转录或翻译，促进mRNAs的降解，和/或抑制TS 1-346编码的蛋白质的表达，最终抑制该蛋白质的功能来起作用。本文使用的术语“反义核酸”包含与靶序列完全互补的多核苷酸和具有一或多个核苷酸错配，只要该反义核酸可与靶序列特异性杂交的那些多核苷酸。例如，本发明的反义核酸包括在至少15个连续核苷酸的范围内具有至少70％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高，甚至更优选95％或更高的同源性的多核苷酸。可使用本领域已知的算法测定同源性。

本发明的反义核酸衍生物在可产生由标记基因编码的蛋白质的细胞中通过结合编码该蛋白质的DNAs或mRNAs，抑制其转录或翻译，促进mRNAs的降解，和抑制该蛋白质的表达，从而导致抑制该蛋白质的功能来起作用。

本发明的反义核酸衍生物可通过与对该衍生物无活性的合适基质材料混合制成外用制品，例如擦剂或敷剂。

同样，如果需要，该衍生物可通过添加赋形剂，等渗剂，增溶剂，稳定剂，防腐剂，止痛剂等配制成片剂，粉剂，粒剂，胶囊，脂质体胶囊，注射剂，溶液，滴鼻剂和冻干剂。可按已知的方法制备它们。

通过直接施用到患病位点或者通过注射进血管使其到达患病位点可给予患者该反义核酸衍生物。也可使用封固有反义物的介质以增加持久性和膜渗透性。例子有脂质体，多聚-L-赖氨酸，脂类，胆固醇，脂转染剂或它们的衍生物。

本发明的反义核酸衍生物的剂量可根据患者的状况适当调节且按需要量使用。例如，给药的剂量范围为0.1至100mg/kg，优选0.1至50mg/kg。

本发明的反义核酸可抑制本发明的蛋白质的表达且因此可用于抑制本发明的蛋白质的生物学活性。另外，可使用含有本发明的反义核酸的表达抑制剂，因为它们可抑制本发明的蛋白质的生物学活性。

本发明的反义核酸包括修饰的寡核苷酸。例如，可使用硫化(thioated)核苷酸给寡核苷酸提供核酸酶抗性。

另外，可使用抗标记基因的siRNA减少该标记基因的表达水平。术语“siRNA”是指防止靶mRNA翻译的双链RNA分子。可使用标准技术将siRNA导入细胞，包括其中DNA是从其转录RNA的模板的那些方法。在本发明的内容中，siRNA包含针对上调标记基因，例如TS 1-346的有义核酸序列和反义核酸序列。构建siRNA以便单个转录子同时具有靶基因的有义和互补反义序列，例如发夹结构。

该方法可用于改变例如，由于细胞恶性转化而上调的细胞中的表达。siRNA与相应于靶细胞中TS 1-346之一的转录子结合导致细胞中该蛋白质的产量减少。该寡核苷酸的长度是至少10个核苷酸且可与天然存在的该转录子一样长。优选的是，该寡核苷酸是19-25个核苷酸长。最优选的是，该寡核苷酸不超过75，50，25个核苷酸长。例如，含有作为靶序列的SEQ ID NO：85或86的核苷酸序列的PYPAF3的siRNAs可抑制TS的细胞增殖。

siRNAs的核苷酸序列可使用可从Ambion网址(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)获得的siRNA设计计算机程序来设计。该计算机程序根据下列方法选择用于siRNA合成的核苷酸序列。

siRNA靶位点的选择：

1.从目标转录子的AUG起始密码子开始，向下游扫描AA双核苷酸序列。记录各AA的出现并将3’相邻的19个核苷酸作为潜在的siRNA靶位点。Tuschl等建议针对5′和3′非翻译区(UTRs)和靠近起始密码子(75个碱基之内)的区域设计siRNA，因为这些区域的调控性蛋白结合位点更丰富。UTR-结合蛋白和/或翻译起始复合物可能干涉siRNA核酸内切酶复合物的结合。

2.比较潜在的靶位点与人基因组数据库并排除与其它编码序列具有明显同源性的任何靶序列的因素。同源性检索可使用BLAST进行，BLAST可在NCBI服务器上以：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/找到。

3.选择限定的靶序列用于合成。在Ambion上，可沿该基因长度选择一些优选的靶序列用于评估。

本发明的反义寡核苷酸或siRNA抑制本发明的多肽的表达，因此可用于抑制本发明的多肽的生物学活性。另外，表达抑制剂，包括本发明的反义寡核苷酸或siRNA也是有用的，因为它们可抑制本发明的多肽的生物学活性。因此，含有本发明的反义寡核苷酸或siRNA的组合物可用于治疗TS。

作为选择，通过施用与该基因产物结合或者抑制该基因产物的功能的化合物可抑制过度表达基因中一或多个基因产物的功能。例如，该化合物是结合该过度表达基因产物的抗体。

本发明涉及使用抗体，特别是抗上调标记基因编码的蛋白质的抗体，或该抗体的片段。本文所用的术语“抗体”是指具有仅与用于合成该抗体的抗原(即，上调标记基因产物)或与其近亲的抗原相互作用(即，结合)的特异性结构的免疫球蛋白分子。另外，抗体可以是抗体的片段或修饰抗体，前提是它能结合一或多个标记基因编码的蛋白质。例如，该抗体片段可以是Fab，F(ab’)₂，Fv，或单链Fv(scFv)，其中来自H和L链的Fv片段通过合适的接头连接(Huston J.S.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5879-5883(1988))。更具体地说，通过用诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶的酶处理抗体可产生抗体片段。作为选择，可构建编码该抗体片段的基因，插入表达载体中，并在合适的宿主细胞中表达(参见，例如，Co M.S.et al.J.Immunol.152：2968-2976(1994)；Better M.and Horwitz A.H.Methods Enzymol.178：476-496(1989)；Pluckthun A.and Skerra A.Methods Enzymol.178：497-515(1989)；Lamoyi E.Methods Enzymol.121：652-663(1986)；Rousseaux J.et al.Methods Enzymol.121：663-669(1986)；Bird R.E.and Walker B.W.Trends Biotechnol.9：132-137(1991))。

通过与诸如聚乙二醇(PEG)的各种分子连接可修饰抗体。本发明提供了该修饰的抗体。该修饰的抗体可通过化学修饰抗体获得。这些修饰方法是本领域常规的。

作为选择，抗体可作为来自非人抗体的可变区和来自人抗体的恒定区之间的嵌合抗体，或者作为含有来自非人抗体的互补决定区(CDR)，来自人抗体的构架区(FR)，和恒定区的人源化抗体获得。可使用已知技术制备这些抗体。

通过抗癌药的临床开发和控制批准已经验证了针对在癌症细胞中出现的特定分子改变的癌症疗法，例如用于治疗晚期乳腺癌的trastuzumab(Herceptin)，用于慢性骨髓性白血病的imatinib methylate(Gleevec)，用于非小细胞肺癌(NSCLC)的gefitinib(Iressa)，和用于B-细胞淋巴瘤和套细胞淋巴瘤的rituximab(anti-CD20 mAb)(Ciardiello F，Tortora G.一种治疗癌症的新方法：靶向表皮生长因子受体。Clin Cancer Res.2001 Oct；7(10)：2958-70。Review.；Slamon DJ，Leyland-Jones B，Shak S，Fuchs H，Paton V，Bajamonde A，Fleming T， Eiermann W，Wolter J，Pegram M，Baselga J，Norton L.使用化疗加抗HER2的单克隆抗体用于过度表达HER2的转移乳腺癌。N Engl J Med.2001 Mar 15；344(11)：783-92.；Rehwald U，Schulz H，Reiser M，Sieber M，StaakJO，Morschhauser F，Driessen C，Rudiger T，Muller-Hermelink K，Diehl V，Engert A.用单克隆抗体治疗复发性CD20+Hodgkin淋巴瘤有效且耐受性好：德国Hodgkin淋巴瘤研究小组的2期试验。Blood.2003 Jan15；101(2)：420-424.；Fang G，Kim CN，Perkins CL，Ramadevi N，Winton E，Wittmann S and Bhalla KN.(2000).Blood，96，2246-2253.)。这些药物在临床上有效且比传统抗癌剂具有更好的耐受性，因为它们仅靶向转化细胞。因此，这些药物不仅提高了癌症患者的存活率和生活质量，而且证实了分子靶向性癌症疗法的观念。此外，当联合使用时靶向药物可增强标准化疗的效力(Gianni L.(2002).Oncology，63 Suppl 1，47-56.；Klejman A，Rushen L，Morrione A，Slupianek A and Skorski T.(2002).Oncogene，21，5868-5876.)。因此，将来的癌症治疗很可能包含联合常规药物与针对诸如血管发生和侵入性的肿瘤细胞区别特征的靶特异性试剂。

这些调节方法可离体或体外(例如，通过用该试剂培养细胞)或者，作为选择，在体内(例如，通过给受试者施用该试剂)进行。该方法包含施用蛋白质或蛋白质的组合或核酸分子或核酸分子的组合作为抵消差异表达基因的异常表达或活性的疗法。

其特征在于该基因的水平或生物学活性增加(相对于没有患该疾病或紊乱的受试者)的疾病和紊乱可用拮抗(即，减小或抑制)该过度表达基因的活性的治疗剂进行治疗。拮抗活性的治疗剂可治疗性或预防性给药。

可利用的治疗剂包括，例如，(i)表达不足的序列的多肽，或类似物，衍生物，片段或其同源物；(ii)抗过度表达序列的抗体；(iii)编码表达不足序列的核酸；(iv)反义核酸或“机能障碍性”核酸(即，由于在一或多个过度表达序列的编码序列内有异源性插入)；(v)小干扰RNA(siRNA)；或(vi)调节物(即，改变过度表达/表达不足的多肽与其结合配偶体之间的相互作用的抑制剂，促效剂和拮抗剂。该机能障碍性反义分子用于通过同源重组“敲除”多肽的内源性功能(参见，例如，Capecchi，Science 244：1288-1292 1989)。

其特征在于降低了(相对于没有患该疾病或紊乱的受试者)水平或生物学活性的疾病和紊乱可用增加活性的治疗剂(即，促效剂)进行治疗。上调活性的治疗剂可以治疗性或预防性方式给药。可利用的治疗剂包括，但不限于，多肽(或其类似物，衍生物，片段或同源物)或增加生物利用率的促效剂。

通过获取患者组织样品(例如，从活检组织)并体外测定其中的RNA或肽水平，表达肽(或其表达改变的基因的mRNAs)的结构和/或活性来定量肽和/或RNA可容易地检测增加或降低的水平。本领域熟知的方法包括，但不限于，免疫测定法(例如，通过Western印迹分析，免疫沉淀之后的十二烷基磺酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳，免疫细胞化学，等)和/或检测mRNAs表达的杂交试验(例如，Northern试验，斑点印迹，原位杂交，等)。

预防性给药在表现出疾病的明显临床症状之前进行，以便在其进程上防止或者延迟疾病或紊乱。

治疗性方法包括将细胞与可调节差异表达基因的基因产物的一种或多种活性的试剂接触。调节蛋白质活性的试剂包括核酸或蛋白质，这些蛋白质的天然存在的同类配体，肽，肽模拟物，或其它小分子。例如，该试剂刺激一或多个差异表达不足基因的一种或多种蛋白质活性。

本发明还涉及治疗或预防受试者TS的方法，包括给所述的受试者施用含有选自TS 1-346的核酸编码的多肽或所述多肽的免疫活性片段，或者编码该多肽或其片段的多核苷酸的疫苗。施用该多肽可诱导受试者的抗肿瘤免疫性。为了诱导抗肿瘤免疫性，可施用选自TS 1-346的核酸编码的多肽或所述多肽的免疫活性片段，或编码该多肽的多核苷酸。该多肽或其免疫活性片段可用作抗TS的疫苗。在某些情况下，该蛋白质或其片段可与T细胞受体(TCR)结合或者由诸如巨噬细胞，树突细胞(DC)，或B-细胞的抗原呈递细胞(APC)呈递的形式给药。由于DC的优良抗原呈递能力，在APCs中使用DC是最优选的。

在本发明中，抗TS的疫苗是指当给动物接种时具有诱导抗肿瘤免疫性功能的物质。根据本发明，TS 1-346编码的多肽或其片段建议是可诱导针对表达TS 1-346的TS细胞的有效和特异性免疫反应的HLA-A24或HLA-A*0201限制性表位肽。因此，本发明还包含使用该多肽诱导抗肿瘤免疫性的方法。一般来说，抗肿瘤免疫性包括如下的免疫反应：

-诱导抗肿瘤的细胞毒性淋巴细胞，

-诱导识别肿瘤的抗体，和

-诱导抗肿瘤细胞因子的产生。

因此，当某一蛋白质接种进动物后诱导这些免疫反应中任一项时，该蛋白质确定为具有抗肿瘤免疫性诱导效力。蛋白质诱导的抗肿瘤免疫性可通过体内或体外观察宿主免疫系统对该蛋白质的应答来检测。

例如，检测细胞毒性T淋巴细胞的诱导的方法是熟知的。进入活体的外源物质通过抗原呈递细胞(APCs)的作用呈递给T细胞和B细胞。由于该抗原的刺激T细胞与APC呈递的抗原反应以抗原特异性方式分化成细胞毒性T细胞(或细胞毒性T淋巴细胞；CTLs)，然后增殖(这称为T细胞的活化)。因此，通过APC将该肽呈递给T细胞，并检测CTL的诱导可评估某一蛋白质的CTL诱导。另外，APC具有激活CD4+T细胞，CD8+T细胞，巨噬细胞，嗜曙红细胞，和NK细胞的效力。由于CD4+T细胞和CD8+T细胞在抗肿瘤免疫性中也是重要的，因此使用这些细胞的激活效力作为指标可评估该肽的抗肿瘤免疫性诱导作用。

使用树突细胞(DCs)作为APC评估CTL的诱导作用的方法是本领域熟知的。DC是APCs中具有最强CTL诱导作用的代表性APC。在该方法中，待测多肽最初与DC接触，然后该DC与T细胞接触。检测与DC接触后对目的细胞具有细胞毒性效力的T细胞表明该待测多肽具有诱导细胞毒性T细胞的活性。可检测CTL的抗肿瘤活性，例如，使用⁵¹Cr-标记的肿瘤细胞的裂解作为指示剂。作为选择，使用³H-胸苷吸收活性或LDH(乳糖脱氢酶)-释放作为指示剂评估肿瘤细胞损伤程度的方法也是熟知的。

除了DC外，外周血单核细胞(PBMCs)也可用作APC。据报道通过在GM-CSF和IL-4存在下培养PBMC可增强CTL的诱导。同样，已表明通过在匙孔帽贝血蓝蛋白(KLH)和IL-7存在下培养PBMC可诱导CTL。

通过这些方法证实具有CTL诱导活性的待测多肽是具有DC活化效力和随后的CTL诱导活性的多肽。因此，诱导抗肿瘤细胞的CTL的多肽可用作抗肿瘤的疫苗。另外，通过与该多肽接触获得诱导抗肿瘤的CTL的能力的APC可用作抗肿瘤疫苗。另外，由于APC呈递该多肽抗原而获得细胞毒性的CTL也可用作抗肿瘤疫苗。这种使用APC和CTL产生的抗肿瘤免疫性治疗肿瘤的方法称为细胞免疫疗法。

一般来说，当使用多肽用于细胞免疫治疗时，已知通过联合具有不同结构的多种多肽并将它们与DC接触可增加CTL-诱导的效力。因此，当用蛋白质片段刺激DC时，使用多种类型的片段混合物是有利的。

作为选择，通过观察诱导抗肿瘤的抗体产生可证实该多肽诱导的抗肿瘤免疫性。例如，当在用该多肽免疫的实验动物中可诱导抗多肽的抗体，且当这些抗体可抑制肿瘤细胞的生长时，该多肽可测定为具有诱导抗肿瘤免疫性的能力。

通过施用本发明的疫苗可诱导抗肿瘤免疫性，且抗肿瘤免疫性的诱导可治疗和预防TS。抗癌疗法或癌症发作的预防包括诸如抑制癌细胞生长，癌症退化，和抑制癌症发生的任一步骤。癌症的治疗或预防也包括患有癌症的个体死亡率的减少，血液中肿瘤标记的减少，伴随癌症的可检测症状的减轻等。该治疗性和预防性效果优选是统计学上显著的。例如，在观察中，疫苗抗细胞增殖疾病的治疗性或预防性效果与没用疫苗给药的对照相比时，显著性水平为5％或更低。例如，可使用Student’s t-检验，Mann-WhitneyU-检验，或ANOVA进行统计学分析。

上述具有免疫学活性的蛋白质或编码该蛋白质的载体可与佐剂结合。佐剂是指当与具有免疫活性的蛋白质一起(或连续)给药时可增强对该蛋白质的免疫反应的化合物。佐剂的例子包括霍乱毒素，沙门氏菌毒素，明矾等等，但不限于此。此外，本发明的疫苗可与可药用载体适当结合。该载体的例子有无菌水，生理盐水，磷酸盐缓冲液，培养液，等等。另外，该疫苗可按需要含有稳定剂，悬浮剂，防腐剂，表面活性剂，等等。该疫苗可系统或局部给药。可通过单次给药，或通过多次给药加强来进行疫苗给药。

当使用APC或CTL作为本发明的疫苗时，例如，可通过离体方法治疗或预防肿瘤。更具体地说，收集接受治疗或预防的受试者的PBMCs，将该细胞与该多肽离体接触，并在诱导APC或CTL之后，给受试者施用该细胞。通过将编码该多肽的载体离体导入PBMCs中也可诱导APC。体外诱导的APC或CTL可在给药前进行克隆。通过克隆和生长具有高活性的损伤靶细胞的细胞，可更有效地进行细胞免疫疗法。另外，以该方式分离的APC和CTL可用于不仅针对产生该细胞的个体，而且针对来自其它个体的相似类型肿瘤的细胞免疫疗法。

另外，提供了含有药用有效量的本发明多肽的药用组合物用于治疗或预防诸如癌症的细胞增殖性疾病。该药用组合物可用于产生抗肿瘤免疫性。

抑制TS的药用组合物

药用配制品包括适合于口服，直肠，鼻，局部(包括口腔和舌下)，阴道或肠胃外(包括肌肉内，皮下和静脉内)给药，或者通过吸入或吹入给药的那些配制品。优选的是，通过静脉内给药。该配制品任选以分开的剂量单位包装。

适合于口服给药的药用配制品包括分别含有预定量活性成份的胶囊，扁囊剂或片剂。配制品还包括粉剂，粒剂或溶液，悬液或乳剂。该活性成份任选作为丸状干药糖剂(bolus electuary)或糊剂给药。用于口服给药的片剂和胶囊可含有常规赋形剂，例如结合剂，填充剂，润滑剂，分解剂或润湿剂。片剂可通过压紧或模压制备，任选含有一种或多种配方成份。压紧的片剂可通过在合适的机器中压缩诸如粉末或颗粒的自由流动形式的活性成份来制备，任选与结合剂，润滑剂，惰性稀释剂，润滑剂，表面活性剂或分散剂混合。模压片剂可通过在合适的机器中模压用惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物来制备。片剂可按照本领域熟知的方法包衣。口服液体制品可以是例如，含水或含油悬液，溶液，乳剂，糖浆或酏剂，或者可作为干燥产品提供，在使用前与水或其它合适的载体进行配制。该液体制品可含有常规添加剂，例如悬浮剂，乳化剂，非水载体(可包括食用油)，或防腐剂。任选可配制该片剂以便提供缓释或控制释放其中的活性成份。一个片剂包装可含有一片到每月服用的片数。

用于肠胃外给药的配制品包括可含有抗氧化剂，缓冲剂，制菌剂和导致该配制品与所需接受者血液等渗的溶质的含水和无水无菌注射溶液；和可包含悬浮剂和增稠剂的含水和无水无菌悬液。该配制品在单位剂量或多剂量容器，例如密封的安瓿和小瓶中提供，且可在冷冻干燥(冻干)的条件下贮存，仅需要在使用前直接加入诸如盐水，注射用水的无菌液体载体。作为选择，可提供该配制品用于连续输注。可从前面所述类型的无菌粉剂，粒剂和片剂制备临时注射溶液和悬液。

用于直肠给药的配制品包括含有诸如椰子油或聚乙二醇的标准载体的栓剂。用于在口腔局部给药，例如颊部或舌下给药的配制品包括在诸如蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶的香味基质中含有该活性成份的锭剂，和在诸如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶的基质中含有该活性成份的锭剂。对于鼻内给药，本发明的化合物可作为液体喷雾剂或可分散的粉剂或以滴剂的形式使用。滴剂可用含水或无水基质配制，可还含有一种或多种分散剂，增溶剂或悬浮剂。

对于通过吸入给药，该化合物可从吹入器，喷雾器，增压包或气溶胶喷雾剂给药的其它合适的工具中方便地给药。增压包可含有合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合适的气体。对于增压气溶胶，该剂量单位可通过提供一个阀门以释放标明的量来确定。

作为选择，对于吸入或吹入给药，该化合物可采用干粉组合物的形式，例如该化合物与诸如乳糖或淀粉的合适粉状基质的粉状混合物。该粉状组合物可在单位剂量形式，例如，胶囊，药筒，明胶或泡状包(blister packs)中提供，从其中借助于吸入器或吹入器施用该粉末。

其它配制品包括释放治疗剂的可植入装置和粘贴膏药。

如果需要，可使用上述配制品调整为持续释放该活性成份。该药用组合物也可含有诸如抗微生物剂，免疫抑制剂或防腐剂的其它活性成份。

应明白除了上文具体提及的成份外，本发明的配制品可包含对于所述配制品类型本领域常规的其它试剂，例如，适合于口服给药的那些配制品可包含香味剂。

优选的单位剂量配制品是含有如下所述的有效剂量，或其合适部分的活性成份的那些配制品。

对于上述每一种情况，该组合物，例如多肽和有机化合物可按从每天大约0.1到大约250mg/kg的剂量口服或通过注射给药。成人的剂量范围一般从大约5mg到大约17.5g/天，优选大约5mg到大约10g/天，最优选大约100mg到大约3g/天。以分散单位提供的片剂或其它单位剂量形式可方便地含有在该剂量或者多个该剂量下有效的量，例如，含有大约5mg到大约500mg的单位，通常从大约100mg到大约500mg的单位。

使用的剂量依赖于许多因素，包括受试者的年龄和性别，治疗的确切疾病，及其严重性。给药途径也依赖于病症及其严重性而变化。

在下面实施例中将进一步描述本发明，该实施例不是对权利要求书所述的本发明的范围的限制。下面实施例举例说明了在TS细胞中差异表达的基因的鉴定和特征描述。

实施例1：试验样品的制备

评估从患病组织(例如，来自睾丸生殖细胞肿瘤的睾丸细胞)和正常组织获得的组织以鉴定差异表达的基因或疾病状态，例如，TS。按如下进行该试验。

患者，组织样品，和激光获取的显微解剖(LCM)

TGCT样品从进行睾丸切除术的13个患者获得。这些患者的临床特征在表1中概括。使用了诊断为精原细胞瘤的12个样品和同时为精原细胞瘤和卵黄囊肿瘤的1个样品。

所有样品在-80℃下冷冻，然后包埋于TissueTek OCT培养基(Sakura)中。冷冻标本用恒冷切片机(Sakura)以8-μm切片进行连续切片并用苏木精和曙红染色以明确分析区域。然后，使用PixCell II LCM System(ArcturusEngineering)按照带有一些修改的厂商方案(21)从各染色组织选择性显微分离精原细胞瘤细胞。

表1.  13个睾丸精原细胞瘤的临床特征

病例号	年龄	病理组织学类型	阶段	结果
					12345678910111213	43203433263445244427494233	精原细胞瘤精原细胞瘤精原细胞瘤精原细胞瘤精原细胞瘤精原细胞瘤精原细胞瘤精原细胞瘤精原细胞瘤精原细胞瘤精原细胞瘤精原细胞瘤精原细胞瘤+卵黄囊肿瘤	IIIIIIIIIIIIII BII B	存活存活存活存活存活存活存活存活存活存活存活存活存活

提取和纯化RNA和基于T7的RNA扩增

从放入350μl RLT裂解缓冲液(QIAGEN)中的获取的细胞提取总RNAs。提取的RNAs在室温下用30个单位的DNase I(QIAGEN)处理15分钟。使用Ampliscribe T7转录试剂盒(Epicentre Technologies)(20)对所有DNase I处理的RNAs进行基于T7的扩增。对每个组织进行两轮扩增产生30-238μg的扩增RNA(aRNA)。对于对照探针，通过基于T7的扩增对正常人poly(A)⁺RNA(Clontech)进行两轮扩增。来自各癌症组织和对照的2.5μg的aRNAs等分试样分别在Cy5-dCTP和Cy3-dCTP存在下进行逆转录(22)。

制备cDNA微阵列

建立了“全基因组(genome-wide)”cDNA微阵列系统，它含有选自国家生物技术信息中心(NCBI)UniGene数据库(build#131)的23,040个cDNAs。简单的说，使用从各种人器官分离的poly(A)⁺RNA作为模板通过RT-PCR扩增cDNAs；扩增子的长度范围不包括重复或poly(A)序列为从200到1,100bp。使用第III代微阵列点样器(Amersham Biosciences)在7型玻璃片上点样PCR产物；在单个玻璃片上以一式两份点样4608个基因。制备5组不同的玻璃片(即，总共23,040个基因)，每组上还点样相同的52个管家基因和两个阴性对照基因(23)。

杂交和数据的获取

除了所有的过程都用自动玻璃片处理器(Amersham Biosciences)进行外按照以前所述的方法进行杂交和洗涤。通过ArrayVision计算机程序(Amersham Biosciences)以光学测定法计算各杂交信号的强度并扣除背景强度。使用52个管家基因的平均信号进行各Cy3-和Cy5-信号强度的正态化。根据背景波动自动计算各表达水平的临界(cut-off)值。计算Cy5/Cy3作为相对表达比率。当Cy3和Cy5信号强度都低于临界值时，根据以前的报道(23)将该样品中相应基因的表达评估为无。对于其它基因，使用各样品的原始数据计算Cy5/Cy3比率。

实施例2：鉴定TS-相关性基因

鉴定对TS共有的上调或下调基因时，根据下列标准分析该基因。选择其相对表达水平在超过50％的病例中能够计算且在超过70％的病例中其表达上调或下调的起始基因。另外，如果在35到50％的病例中能够计算相对表达比率，也评估该基因上调或下调的所有病例。各基因的相对表达比率(Cy5/Cy3强度比率)分成如下四类之一：(1)上调(表达比率超过5.0)；(2)下调(表达比率低于0.2)；(3)表达无改变(表达比率在0.2和5.0之间)；和(4)不表达(或微弱表达但在检测临界值之下)。这些类型用于检测其表达比率的改变在样品中是共有的以及是某一亚群特异性的一组基因。为了检测在精原细胞瘤细胞中通常上调或下调的候选基因，筛选23,040个基因的全面表达谱以选择表达比率超过5.0或低于0.2的基因。

鉴定具有TS细胞临床相关性表达谱的基因

为了阐明TGCTs形成和进行潜在的遗传事件，我们借助于全基因组的cDNA微阵列分析了临床材料中的基因表达。微阵列技术使得可以在单次实验中分析几千个基因的表达，并获得对癌症分子机制的新认识。预期该数据有助于改善临床管理，从而给癌症患者提供更好的生活质量。

一组研究者使用定制的位于第17号染色体上的基因的cDNA微阵列分析了基因表达谱(13)，因为第17号染色体长臂在TGCTs中通常过量出现。然而在该研究中仅分析了第17号染色体上的636个基因和基因组中其它处的512个基因。根据我们的了解，我们首次对TGCTs进行了“全基因组”cDNA微阵列分析。

我们特别针对TS，使用含有23,040个基因的全面cDNA微阵列系统检查了以LCM纯化的精原细胞瘤细胞群体。以该方法选择的癌细胞比例通过显微镜检测定估计达到几乎100％。

鉴定了其表达比率超过5.0的346个上调基因(表3)，同时鉴定了其表达比率低于0.2的593个下调基因(表4)。此外，特别是鉴定了其表达比率超过10.0的213个高度上调基因(数据未显示)。另一方面，鉴定了其表达比率低于0.1的376个下调基因(数据未显示)。

它们中的一些可能提供了新治疗剂的潜在分子靶，和/或用作诊断性肿瘤标记。表3列出的基因包括CCND2(1)，POV1(24)，PIM2(25)，JUP(26)，和MYCN(14)，即已知与TS的癌发生或细胞增殖相关的基因。例如CCND2，它调节RB蛋白的磷酸化并控制G1-S细胞周期关卡，在TS中通常高表达；通过过量表达D-型细胞周期蛋白破坏该关卡是人类肿瘤形成的主要途径之一(1)。POV1首先鉴定为在前列腺癌中过量表达的基因(24)，后来表明在所有TS以及睾丸原位癌中高度表达(13)。该基因编码具有12个跨膜结构域的膜转运蛋白且可运输细胞生长必需的营养物和/或代谢产物(27)。因此，其产物可以是治疗TS和前列腺癌的抗癌药物的潜在分子靶。PIM2，即编码丝氨酸苏氨酸激酶的原癌基因，以前报道在造血干细胞，白血病和淋巴瘤细胞系，和TS中高度表达；其产物在造血和致癌性转化中似乎具有决定性作用(25)。JUP也称为γ-连环蛋白，在细胞粘着和Wnt信号传导途径中起重要作用；JUP受到APC肿瘤抑制基因的调控，据认为其在结肠癌中的致癌活性不同于β-连环蛋白(26)。在各种人类肿瘤，最常见的是成神经细胞瘤中已经观察到MYCN基因的扩增，且在精原细胞瘤和非-精原细胞瘤中都报道了其过量表达(14)。因此，抑制这些致癌性功能可能是治疗TS的一种新方法。另外，这些上调元件包括与信号转导途径，癌基因，细胞周期，和细胞粘着及细胞骨架相关的重要基因(表5)。

除了已知与睾丸癌有一些相关性的基因外，我们注意到包括PIM-1，RET和VAV2的其它癌基因的过量表达。PIM-1编码丝氨酸/苏氨酸激酶(28)，它在我们的微阵列检查的所有11个提供信息的精原细胞瘤中都过量表达。RET在所有6个提供信息的精原细胞瘤中也过量表达。RET基因编码受体酪氨酸激酶，它是转导细胞生长和分化信号的细胞表面分子；RET基因的种系突变引起两种遗传性癌综合征，即多发性内分泌腺瘤形成2A和2B型(29)。VAV2，即VAV癌基因家族的一个成员，在我们的微阵列检测的12个提供信息的精原细胞瘤病例中有11个过量表达。VAV蛋白与细胞转化和癌发生相关；它似乎增强转化细胞的转移特性或用作引起诸如Ras的癌蛋白的转化活性的辅助因子(30)。

在另一方面，我们列出的下调基因包括至少一个已知的肿瘤抑制基因，即WT1，其失活引起Wilms肿瘤和WAGR综合征，其特征在于易感Wilms肿瘤，无虹膜，泌尿生殖异常，和智力迟钝(31)。在睾丸生殖细胞肿瘤中通常观察到含有WT1的染色体区域丧失杂合性(32)。另外，Wilms中瘤1-缔合蛋白(KIAA0105，WTAP)，即WT1-结合配偶体，在我们的研究中也下调。由于WT1与泌尿生殖系统的正常发育相关，因此其产物可以是与睾丸癌发生相关的一个候选物，尽管其分子机制仍不清楚。

最近通过使用分子靶向药物实现的临床改善强调了发现新分子靶在开发治疗特异性癌症的药物中的重要性。例如，抗-HER2单克隆抗体，即trastuzumab，与抗癌药物联合可拮抗原癌基因受体HER2/neu并导致临床反应的改善和一些乳腺癌患者的存活(33)。STI-571，即酪氨酸激酶抑制剂靶向性bcr-abl，它是现在治疗慢性骨髓性白血病的首选药物(34)，表皮生长因子受体抑制剂，即gefitinib，用于治疗非小细胞肺癌(35)。抗-CD20单克隆抗体，即rituximab，可提高B-细胞淋巴瘤或套细胞淋巴瘤患者的完全缓解率和总体存活率(36)。因此，本文鉴定的且与细胞增殖相关的上调基因产物可以是用于设计新型TS治疗剂的有希望的潜在靶。具体地说，在自分泌细胞生长途径中起作用的分泌蛋白质应当是药物开发中的优良候选物且可成为该癌症类型的新诊断标记。

在本研究分析的13例中有11例按临床病理学分类为I期。因此，在我们的微阵列上普遍上调或下调的基因很可能与相对早期的癌发生相关。因此，我们的数据不仅提供了关于癌症相关性基因的新信息而且提供了已知基因与癌发生的新关联。然而，在本文中描述的信息揭示了TS形成期间遗传活性改变的高度复杂性；该结果以这一类型癌症的潜在治疗靶和/或生物学标记的一个长表提供。

表3  在睾丸精原细胞瘤中普遍上调5倍或更多的346个基因

TS编号	登录号	标记	基因名称
				123456789101112131415161718	AI141839X02994U41767AF024714H57960U24266AA180314AA910946AA676726U79268X00570L08424D89052AF038195M88714AF001383W91908R43935	ABCD4ADAADAM15AIM2AK3ALDH4ANKRD2AP1M2APELINAPEXAPOC1ASCL1ATP6FBCS1LBDKRB2BIN1BRAGCACNA1G	ATP-结合序列盒，亚家族D(ALD)，4号成员腺苷脱氨酶解联蛋白和金属蛋白酶结构域15(metargidin)在黑素瘤2中缺失腺苷酸激酶3醛脱氢酶4(谷氨酸γ-半醛脱氢酶；吡咯啉-5-羧酸盐脱氢酶)锚蛋白重复结构域2(牵张反应肌)衔接子相关蛋白复合物1，mu 2亚基Apelin；APJ受体的肽配体APEX核酸酶(多功能DNA修复酶)载脂蛋白C-Iachaete-scute复合物(果蝇)同源物-样1ATPase，H+转运，溶酶体(液泡质子泵)21kDBCS1(酵母同源物)-样基因缓激肽受体B2桥连整合基因1B细胞RAG结合蛋白钙通道，电压依赖型，α1G亚基

192021222324252627282930313233343536373839404142434445464748495051525354

U66063AA682870U45983M16445AA083656M37033M81934X63629M16965U51095AA319695U14518U58514X14830AC002115X59932AW167729AA579959N20321U79775AI092999Z29093U49785T78186D78011U88047AA128470X92896AA233853S49592AA422074M57736U07695U15655D12765X86779

CAMK2GCCND2CCR8CD2CD37CD53CDC25BCDH3CDR1CDX1CEBPDCENPACHI3L2CHRNB1COX6BCSKCTSCCYP2S1D19S1177ED21S2056ED2S448DDR1DDTDNMT3ADPYSDRIL1DSPDXS9879EE1B-AP5E2F1ENO2ENPP1EPHB4ERFETV4FASTK

钙/钙调蛋白依赖型蛋白质激酶(CaM激酶)IIγ细胞周期蛋白D2趋化因子(C-C基序)受体8CD2抗原(p50)，绵羊红血细胞受体CD37抗原CD53抗原细胞分裂周期25B钙粘着蛋白3，1型，P-钙粘着蛋白(胎盘)小脑变性相关性蛋白(34kD)尾部型同源盒转录因子1CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)，δ着丝粒蛋白A(17kD)几丁质酶3-样2胆碱能受体，尼古丁，β多肽1(肌肉)细胞色素c氧化酶亚基VIbc-src酪氨酸激酶组织蛋白酶C从ESTs推测的细胞色素P540家族成员19号染色体上的DNA片段(特有的)1177表达序列21号染色体上的DNA片段(特有的)2056表达序列黑素瘤相关性基因盘基菌蛋白结构域受体家族，成员1D-多巴色素互变异构酶DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶3α二氢嘧啶酶dead ringer(果蝇)-样基因1桥粒斑蛋白(DPI，DPII)X染色体上的DNA片段(特有的)9879表达序列E1B-55kDa-结合蛋白5E2F转录因子1烯醇化酶2，(γ，神经元)外切核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1EphB4Ets2抑制因子Ets变异体基因4(E1A增强子结合蛋白，E1AF)Fas-活化的丝氨酸/苏氨酸激酶

555657585960616263646566676869707172737475767778798081828384858687888990

J04162M60922R72881AF077740M18185AA669536U78027N26076D64154AF062006AA877534X68314AI346758J04501U26174X57129AA904505M16707M58285AA903016D66904AW084318AA564686AA775500AI189477AA436509X16302AJ001563M87790AI189680M20566J05272S78296M15395X16260AA226073

FCGR3BFLOT2GABBR1GCATGIPGJA5GLAGOVGP110GPR49GPRC5CGPX2GYG2GYS1GZMKH1F2H3FDH4F2HEM1HM74HRMT1L2HSPB1HSPC025HsPOX2IDH2IER5IGFBP2IGHG3IGLλIL1RAPIL6RIMPDH1INAITGB2ITIH1ITM2C

IgG的Fc片段，低亲和性IIIb，(CD16)的受体筏蛋白2γ-氨基丁酸(GABA)B受体，1甘氨酸C-乙酰转移酶(2-氨基-3-丁酮酸辅酶A连接酶)胃抑制性多肽间隙连接蛋白，α5，40kD(连接蛋白40)半乳糖苷酶，α成胶质细胞瘤过量表达细胞膜糖蛋白，110000M(r)(表面抗原)G蛋白偶连受体49G蛋白偶连受体，家族C，第5组，成员C谷胱甘肽过氧化物酶2(胃肠道)糖原蛋白2糖原合酶1(肌肉)粒酶K(丝氨酸蛋白酶，粒酶3；类胰蛋白酶II)H1组蛋白家族，成员2H3组蛋白家族，成员DH4组蛋白，家族2造血蛋白1推定的趋化因子受体；GTP-结合蛋白HMT1(hnRNP甲基转移酶，啤酒糖酵母)-样2热休克27kD蛋白1HSPC025脯氨酸氧化酶2异柠檬酸脱氢酶2(NADP+)，线粒体立即早期反应5胰岛素-样生长因子结合蛋白2(36kD)免疫球蛋白重链恒定区γ3(G3m标记)免疫球蛋白λ基因座白介素1受体辅助蛋白白介素6受体IMP(肌苷单磷酸)脱氢酶1丝联蛋白神经元中间体纤丝蛋白，α整联蛋白，β2(抗原CD18(p95)，淋巴细胞功能相关性抗原1；巨噬细胞抗原1(mac)β亚基)inter-alpha(球蛋白)抑制剂，H1多肽整合膜蛋白2C

919293949596979899100101102103104105106107108109110111112113114115116117118119120121

AI205103Z68228AA707252D52745H06478U06698AA845512X77744X87342BF971926AI298111AA714315D89078U42376AC005546AA179832D87116AA583183AA744607X74795U78313L10612J05070H46518AA101822N70019AI094778J04031X13293Y00664AI188406

ITPK1JUPKIAA0468KIAA0821KIF3CKIF5AKLF4KR18LLGL2LMNALOC51116LOC51181LTB4RLY6ELYL1M6PRMAP2K3MAP4K3MASL1MCM5MDFIMIFMMP9MRPS26MSDC1MT1EMT2AMTHFD1MYBL2MYCNNDUFA4

肌醇1，3，4-三磷酸5/6激酶连接斑珠蛋白多配体蛋白聚糖3(N-多配体蛋白聚糖)lectomedin-2驱动蛋白家族成员3C驱动蛋白家族成员5AKruppel-样因子4(肠)KRAB锌指蛋白KR18致死性巨大幼虫(果蝇)同源物2核纤层蛋白A/CCGI-91蛋白羰基还原酶白三烯b4受体(趋化因子受体-样基因1)淋巴细胞抗原6复合物，基因座E成淋巴细胞白血病产生的序列1甘露糖-6-磷酸受体(阳离子依赖型)促细胞分裂剂活化的蛋白激酶激酶3促细胞分裂剂活化的蛋白激酶激酶激酶激酶3富含亮氨酸串联重复的MFH-扩增的序列1小染色体维持缺陷型(啤酒糖酵母)5(细胞分裂周期46)MyoD家族抑制剂巨噬细胞迁移抑制因子(糖基化抑制因子)基质金属蛋白酶9(明胶酶B，92kD明胶酶，92kD的IV型胶原酶)线粒体核糖体蛋白质S26中胚层发育候选物1金属硫蛋白1E(功能型)金属硫蛋白2A亚甲基四氢叶酸脱氢酶(NADP+依赖型)，次甲基四氢叶酸环化水解酶，甲酰基四氢叶酸合成酶v-myb鸟类成髓细胞性白血病病毒癌基因同源物-样基因2V-myc鸟类髓细胞瘤病病毒相关性癌基因，成神经细胞瘤产生NADH脱氢酶(泛醌)1α亚复合物，4(9kD，MLRQ)

122123124125126127128129130131132133134135136137138139140141142143144145146147148149150151152153154155

AA989104X83957H08616AA977227W46617AI300590X77909AJ001258U23070X17620L16785AA242961AI085648U56079AA628440R16767AI049668D10523X17094AI146846AI248183AI265770X54936AA532444X80907M16750U77735D00244X07743M80397S90469AF045584S57501N44532

NDUFB2NEBNESCANET-6NF2NFE2L3NFKBIL1NIPSNAP1NMANME1NME2NOD1NOLA3NPY5RNR1I3NRBPOAZ1OGDHPACEPAR3PAX5PDLIM1PGFPHLDA3PIK3R2PIM1PIM2PLAUPLEKPOLD1PORPOV1PPP1CAPPP1R14C

NADH脱氢酶(泛醌)1β亚复合物，2(8kD，AGGG)伴肌动蛋白Nesca蛋白tetraspan NET-6蛋白神经纤维瘤蛋白2(双侧听觉神经瘤)核因子(红细胞衍生的2)-样基因3B-细胞抑制剂中κ轻链多肽基因增强子的核因子-样基因1NIPSNAP，C.elegans，同源物1推定的跨膜蛋白非转移性细胞1，表达的蛋白质(NM23A)非转移性细胞2，表达的蛋白质(NM23B)Caspase募集结构域4核蛋白家族A，成员3(H/ACA小核RNPs)神经肽Y受体Y5核受体亚家族1，I组，成员3核受体结合蛋白鸟氨酸脱羧酶抗酶1氧化戊二酸脱氢酶(硫辛酰胺)成对碱性氨基酸裂解酶(弗林蛋白酶，膜联受体蛋白)相似于C.elegans PAR3的含三个-PDZ的蛋白质(分区缺陷型)成对盒基因5(B-细胞谱系特异性激活蛋白质)PDZ和LIM结构域1(elfin)胎盘生长因子，血管内皮生长因子相关性蛋白质血小板-白细胞C激酶底物同源物-样结构域，家族A，成员3磷酸肌醇-3-激酶，调控亚基，多肽2(p85β)pim癌基因pim-2癌基因纤溶酶原活化剂，尿激酶血小板-白细胞C激酶底物聚合酶(DNA指导型)，δ1，催化亚基(125kD)P450(细胞色素)氧化还原酶前列腺癌过度表达基因1蛋白质磷酸酶1，催化亚基，α同种型蛋白质磷酸酶1，调控(抑制)亚基14C

156157158159160161162163164165166167168169170171172173174175176177178179180181182183184185186187188189

AI274279AI309741AF027208M24398U47025Y15233AA346311M29893Y00291Y12336X64652AF040105AA807607AA932768X12949NM139176AA921313L11566AA402920AA9625 80AI123363AI341159AA313541R50505AI131289M81757L04483N27409U14970X99920AI261620U72355X98834T30682

PRDM4PRG6PROML1PTMSPYGBPYGLRAI3RALARARBRASGRP2RBMS1RCLRDGBBREPRIMORETPYPAF3RPL11RPL18RPL18ARPL22RPL23ARPL26RPL37RPLP1RPLP2RPS19RPS21RPS23RPS5S100A13SAASSAFBSALL2SCO2

含PR结构域4p53-反应性基因6prominin(小鼠)-样基因1parathymosin磷酸化酶，糖原；脑磷酸化酶，糖原；肝(Hers疾病，糖原贮存疾病VI型)视黄酸诱导的基因3v-ral猿猴白血病病毒性癌基因同源物A(ras相关性基因)视黄酸受体，βRAS鸟苷释放蛋白2(钙和DAG-调控的基因)RNA结合基序，单链相互作用蛋白1推定的c-Myc-反应性基因视网膜变性Bβp53-依赖型G2停滞的候选介导剂ret原癌基因(多发性内分泌腺瘤形成MEN2A，MEN2B和髓质甲状腺癌1，Hirschsprung疾病)含PYRIN的Apaf-1-样蛋白3核糖体蛋白L11核糖体蛋白L18核糖体蛋白L18a核糖体蛋白L22核糖体蛋白L23a核糖体蛋白L26核糖体蛋白L37核糖体蛋白，大型，P1核糖体蛋白，大型P2核糖体蛋白S19核糖体蛋白S21核糖体蛋白S23核糖体蛋白S5S100钙结合蛋白A13granin-样神经内分泌肽前体支架附着因子Bsal(果蝇)-样基因2SCO细胞色素氧化酶缺陷型同源物2(酵母)

190191192193194195196197198199200201202203204205206207208209210211212213214215216217218

AB000887AA534943AI080351K01396AI050752AA421248L11932T29731U44403J03592AW511361D84454M65105AW504047AI143147X70683U49240J03161AA683 542AI151087AA235074X82240AA399645U85658AI049960AA293042AJ005895AA536113AI261341

SCYA19SCYB14SEC63LSERPINA1SGCBSH3BGRL3SHMT1SHMT2SLASLC25A6SLC29A1SLC35A2SLC6A2SMARCA4SNRPFSOX4SPKSRFSTAU2T1A-2TCF19TCL1ATCOF1TFAP2CTGIF2THY1TIM17BTMEPAITMP21

小诱导型细胞因子亚家族A(Cys-Cys)，成员19小诱导型细胞因子亚家族B(Cys-X-Cys)，成员14(BRAK)SEC63，内质网易位子成份(啤酒糖酵母)样基因丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂，分支A(α抗蛋白酶，抗胰蛋白酶)，成员1肌聚糖，β(43kD肌营养不良蛋白相关性糖蛋白)SH3结构域结合的富含谷氨酸的蛋白样基因3丝氨酸羟甲基转移酶1丝氨酸羟甲基转移酶2(线粒体)Src-样-衔接子溶质载体家族25(线粒体载体；腺嘌呤核苷酸易位子)，成员6溶质载体家族29(核苷转运蛋白)，成员1溶质载体家族35(UDP-半乳糖转运蛋白)，成员2溶质载体家族6(神经递质转运蛋白，去甲肾上腺素)，成员2SWI/SNF相关性，基质相关性，肌动蛋白依赖型染色质调节蛋白，亚家族a，成员4小核核糖核蛋白多肽FSRY(性别决定区Y)-序列盒4symplekin；Huntingtin相互作用蛋白I血清反应因子(c-fos血清反应元件-结合转录因子)staufen(果蝇，RNA-结合蛋白)同源物2肺I型细胞膜相关性糖蛋白转录因子19(SC1)T-细胞白血病/淋巴瘤1ATreacher Collins-Franceschetti综合征1转录因子AP-2γ(活化增强子-结合蛋白2γ)TGFB-诱导因子2(TALE家族同源框)Thy细胞表面抗原线粒体内膜移位酶17(酵母)同源物B跨膜蛋白，前列腺雄性激素诱导的RNA跨膜运输蛋白

219220221222223224225226227228229230231232233234235236237238239240241242243244245246247248249250251252253254255256257258259

M64247M19309M19713AA890188AA481924U73379AA465240Z71621AA644644AA555115AA056472R37098AA776240AA609417N80485W18181U69190AA287875AI206219AA368409AI014673AA219141AA477929AK026707AA306716AI017753AA843844AI360274AI276023AA058761Z24980AA813912AA394063AI090862AB007925AB014544AB014590AA954348AA737525AA443202W90578

TNNI3TNNT1TPM1TUBG2TYROBPUBCH10yAy2WNT2BYWHAHLOC51260LOC57228DKFZp547M236DKFZP586J0917DKFZp762M136FLJ10199FLJ10430FLJ10432FLJ10549FLJ10634FLJ10688FLJ10709FLJ10713FLJ10767FLJ11328FLJ11937FLJ20069FLJ20171FLJ20494FLJ20539FLJ20550FLJ22195KIAA0130KIAA0144KIAA0147KIAA0456KIAA0644KIAA0690KIAA0870KIAA1031KIAA1053KIAA1198

肌钙蛋白I，心脏肌钙蛋白T1，骨骼，迟缓原肌球蛋白1(α)微管蛋白，γ2TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白遍在蛋白载体蛋白E2-Cvav 2癌基因无翼型MMTV整合位点家族，成员2B酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋白，eta多肽假定蛋白质来自克隆643的假定蛋白质假定蛋白质DKFZp547M236DKFZP586J0917蛋白质假定蛋白质DKFZp762M136假定蛋白质FLJ10199假定蛋白质FLJ10430假定蛋白质假定蛋白质FLJ10549假定蛋白质FLJ10634假定蛋白质FLJ10688假定蛋白质FLJ10709假定蛋白质FLJ10713假定蛋白质FLJ10767假定蛋白质FLJ11328假定蛋白质FLJ11937假定蛋白质FLJ20069假定蛋白质FLJ20171相似于小鼠神经元蛋白质15.6假定蛋白质FLJ20539假定蛋白质FLJ20550假定蛋白质FLJ22195KIAA0130基因产物KIAA0144基因产物果蝇Scribble的人类同源物KIAA0456蛋白质KIAA0644基因产物KIAA0690蛋白质KIAA0870蛋白质KIAA1031蛋白质KIAA1053蛋白质KIAA1198蛋白质

260261262263264265266267268269270271272273274275276277278279280281282283

AA191449AI076459AA579859AA731891AI093595AA149846AA741366AA400449AI168147L02326F09520AA975205AI348289AA669034W76303T04932AA147751N91027AA188494AA903456AA628522AA626414AA610175AW083127

KIAA1254KIAA1272KIAA1273KIAA1517LOC55895DKFZp434K0621ESTFLJ113352FLJ12195

KIAA1254蛋白质人cDNA FLJ12819 fis，克隆NT2RP2002727，与Rattus norvegicustulip 2 mRNA微弱相似KIAA1273蛋白质KIAA1517蛋白质22kDa过氧化物酶体膜蛋白-样基因人mRNA；cDNA DKFZp762B 195(来自克隆DKFZp762B195)人mRNA；cDNA DKFZp761K2312(来自克隆DKFZp761K23 12)人mRNA；cDNA DKFZp434K0621(来自克隆DKFZp434K0621)；部分编码区人HSPC289 mRNA，部分编码区人克隆Huλ7λ-样蛋白(IGLL2)基因，部分编码区人克隆24841 mRNA序列人克隆23570 mRNA序列人cDNA：FLJ23227 fis，克隆CAE00645，与AF052138人克隆23718 mRNA序列高度相似人cDNA：FLJ23125 fis，克隆LNG08217人cDNA：FLJ22662 fis，克隆HSI08080人cDNA：FLJ21545 fis，克隆COL06195人cDNA FLJ14146 fis，克隆MAMMA 1002947人cDNA FLJ13549 fis，克隆PLACE 1007097人cDNA FLJ13352fis，克隆OVARC1002165，与3-氧-5-α-类固醇4-脱氢酶2(EC 1.3.99.5)微弱相似人cDNA FLJ13325 fis，克隆OVARC1001762，与N-末端乙酰转移酶1(EC 2.3.1.88)微弱相似人cDNA FLJ12758 fis，克隆NT2RP2001 328人cDNA FLJ12436 fis，克隆NT2RM 1000062人cDNA FLJ12195 fis，克隆MAMMA 1000865人cDNA FLJ11856 fis，克隆HEMBA1006789

284285286287288289290291292293294295296297298299300301302303304305306307308309310311312313314

F18016AA442071AA036947AA234475AI041186K01505Z38677AA236315AA411333AA150200AI341906AI349804W94363AA053248AA514648T03298T55019AI088718AA024920R77448W31174AA463626AI344249R61891AA479350AA327207AA528140AA826148AA913950AI243620AI039201

ESTNCOA6IPESTPLXNA2EST

人cDNAFLJ11018 fis，克隆PLACE1003602，与胎盘中表达的人mRNA高度相似人cDNA FLJ10247 fis，克隆HEMBB1000705人cDNA FLJ10229 fis，克隆HEMBB1000136含有甲基转移酶结构域的PRIP-相互作用蛋白HSPC182蛋白DC II型组织相容性抗原α-链密蛋白10染色体1阅读框27ESTs，与锌指-样蛋白[人]微弱相似ESTs，与tuftelin[M.musculus]微弱相似ESTs，与ORF YNL310c[啤酒糖酵母]微弱相似ESTs，与IQGA_人RAS GTPASE-活化-样蛋白IQGAP1[人]微弱相似ESTs，与ALU4_人ALU亚家族SB2序列污染预警登录序列微弱相似[人]ESTs，与RS10_人40S核糖体蛋白S10[人]高度相似ESTs，与LMA1_人层粘连蛋白α链前体[人]高度相似ESTs，与LDHH_人L-乳酸脱氢酶H链[人]高度相似ESTs，胎儿脾脏ESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTs

315316317318319320321322323324325326327328329330331332333334335336337338339340341342343344345346

AA936889AA687757AI366259AA317670AI141923AA778238T72555AA602585AA527570C75253AA351680N75945AA528243AA688195AA063157AA419568D85376AA521342AI365844T55926R94687T61564AI305234AA233870T16470T16802AA830668AA489212AA758394AA609658AA683373N34387

ESTLOC152217EST

ESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTESTESTESTESTEST

表4在睾丸精原细胞瘤中普遍下调0.2倍或更低的593个基因

TS编号	登录号	标记	基因名称
				347348349	U57961M35296AA406601	13CDNA73ABL2ABLIM	推定的基因产物v-abl Abelson鼠白血病病毒性癌基因同源物2(arg，Abelson-相关性基因)肌动蛋白结合LIM蛋白1

350351352353354355356357358359360361362363364365366367368369370371372373374375376377378379380381382383384385386387

AA815365AI357650AF029900X74210X03350L22214X66503AA766028AA434178AF038564AI028271AA398240U05861D17793K03000M18786M19383Y12226AI278652AA421206AI168526AI025137AB002305U47054AA928117H80325M55575D87461AA620708U70824AA916688U03274D31716W45244U36448X56667AA600048R39610

ACTAD026ADAM21ADCY2ADH2ADORA1ADSSAF15Q14AGPAT1AIP4AKAP3AKAP4AKR1C1AKR1C3ALDH1AMY1AANXA4AP1G1AP1S2APGARHGAP5ARHGEF3ARNT2ART3ATP8A2BAZ1ABCKDHBBCL2L2BCLGBLuBRF1BTDBTEB1C3CADPSCALB2CALD1CAPN2

睾丸CREM的激活剂AD026蛋白解联蛋白和金属蛋白酶结构域21腺苷酸环化酶2(脑)乙醇脱氢酶2(I型)，β多肽腺苷A1受体腺苷酸琥珀酸合成酶AF15q14蛋白1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶1(溶血磷脂酸酰基转移酶，α)萎缩蛋白相互作用蛋白4激酶(PRKA)锚蛋白3激酶(PRKA)锚蛋白4醛-酮还原酶家族1，成员C1(二氢二醇脱氢酶1；20-α(3-α)-羟基类固醇脱氢酶)醛-酮还原酶家族1，成员C3(3-α羟基类固醇脱氢酶，II型)醛脱氢酶1，可溶性淀粉酶，α1A；唾液膜联蛋白A4衔接子相关性蛋白复合物1，γ1亚基衔接子相关性蛋白复合物1，σ2亚基热休克蛋白(hsp110家族)Rho GTPase活化蛋白5Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)3芳基-烃受体核转运蛋白2ADP-核糖基转移酶3ATPase，氨基磷脂转运蛋白-样蛋白，I类，8A型，成员2与锌指结构域相邻的溴结构域，1A支链酮酸脱氢酶E1，β多肽(槭糖尿病)BCL2-样基因2凋亡调节蛋白BCL-GB1u蛋白丁酸反应因子1(EGF-反应因子1)生物素酰胺酶基本转录元件结合蛋白1补体成份3用于分泌的Ca2+-依赖型活化蛋白钙结合蛋白2，(29kD，钙网膜蛋白)钙调结合蛋白1钙蛋白酶2，(m/II)大亚基

388389390391392393394395396397398399400401402403404405406407408409410411412413414415416417418419420

AI085802M58583D78333AA917718L27711AI140736AF083322AI142230J03483D10704AA400791U65092AI333035AI078139D86322M64722D17408L25286T93566F21182AI334396M55268X16312U16306M33146AA780301AB001928AA417733Z22780M14564U62015AA608804AA640753

CAV2CBLN1CCT6BCDC10CDKN3CDVCEP1CETN3CHGACHKCHST3CITED1CKAP2CKN1CLGNCLUCNN1COL15A1CPECRATCRSP9CSNK2A2CSNK2BCSPG2CSRP1CTSFCTSL2CUL1CYLC1CYP17CYR61D6S51EDDAH1

小窝蛋白2小脑肽1前体含有TCP1的陪伴蛋白，亚基6B(zeta 2)CDC10(细胞分裂周期10，啤酒糖酵母，同源物)细胞周期蛋白-依赖型激酶抑制剂3(CDK2-相关性双特异性磷酸酶)CDV蛋白中心体蛋白1中心粒蛋白，EF-hand蛋白，3(CDC31酵母同源物)嗜铬粒蛋白A(甲状旁腺分泌蛋白1)胆碱激酶糖类(软骨素6/角质素)磺基转移酶3Cbp/p300-相互作用反式激活蛋白，羧基末端结构域富含Glu/Asp，1细胞骨架相关性蛋白2Cockayne综合征1(典型性)calmegin簇蛋白(补体裂解抑制剂，SP-40，40，硫酸化糖蛋白2，睾酮抑制型前列腺信息2，载脂蛋白J)肌钙样蛋白1，碱性，平滑肌胶原蛋白，XV型，α1羧肽酶E肉毒碱乙酰基转移酶Sp1转录激活需要的辅因子，亚基9(33kD)酪蛋白激酶2，α误切(prime)多肽酪蛋白激酶2，β多肽硫酸软骨素蛋白聚糖2(多功能蛋白聚糖)富含半胱氨酸和甘氨酸的蛋白质1组织蛋白酶F组织蛋白酶L2滞蛋白1cylicin，精子头细胞骨架碱性蛋白1细胞色素P450，亚家族XVII(类固醇17-α-羟化酶)，肾上腺增生富含半胱氨酸，血管发生诱导蛋白，61HLA-B相关性转录-2二甲基精氨酸二甲基氨水解酶1

421422423424425426427428429430431432433434435436437438439440441442443444445446447448449450451452453454455456457458

X62535AI209130AA432207AJ000522U53445AA488466X68277AA313118U89278M62829AA398573AI097529U62740M14354D10040L13923AI194045AI351061D14446U60115AA678103L37033AA876478AI141417AA813008X74142AI025916X03674N34138U13044S68805AA583339AI014575AA578014AA523541AA293636AA608780AA887118

DGKADJ402G11.8DMRT1DNAH17DOC1DRG1DUSP1DUSP10EDR2EGR1EIF5A2EPAS1EXT2F13A1FACL2FBN1FE65L2FEM1BFGL1FHL1FKBP5FKBP8FLJ10578FLJ10873FOPFOXG1BFSP-2G6PDGABARAPGABPAGATMGCNT3GCP60GGA1GILZGJA1GKP2GLRX2

二酰甘油激酶，α(80kD)相似于小鼠MOV10的新蛋白质双性和mab-3相关性转录因子1动力蛋白，轴丝，重多肽17在卵巢癌中下调的基因1发育调节的GTP-结合蛋白1双特异性磷酸酶1双特异性磷酸酶10早期发育调节蛋白2(polyhomeotic 2的同源物)早期生长反应1真核翻译启动因子5A2内皮PAS结构域蛋白1exostoses(multiple)2凝血因子XIII，A1多肽脂肪酸辅酶A连接酶，长链2原纤蛋白1(Marfan综合征)FE65-LIKE 2FEM(C.elegans)同源物b纤维蛋白原-样基因1四个半LIM结构域1FK506-结合蛋白5FK506-结合蛋白8(38kD)Sec61α型2UDP-葡萄糖：糖蛋白葡萄糖基转移酶2FGFR1癌基因配偶体forkhead box G1B纤维鞘蛋白(fibrousheathin)II葡萄糖-6-磷酸脱氢酶GABA(A)受体相关性蛋白GA-结合蛋白转录因子，α亚基(60kD)甘氨酸脒基转移酶(L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶)葡萄糖氨基(N-乙酰基)转移酶3，粘蛋白型高尔基体定居蛋白GCP60ADP-核糖基化因子结合蛋白GGA1糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链结构基因间隙连接蛋白，α1，43kD(连接蛋白43)甘油激酶假基因2谷氧还蛋白2

459460461462463464465466467468469470471472473474475476477478479480481482483484485486487488489490491492493494495

AA446421AF055013AA401492AF007548AA031372AI126171L42324X71973L76687AI015487D87119AA993251L13275L02321U14193AI126491AF019214W95267U40992M11058X83618AI215478Y09980AF070616Y12711AA825654AI027700M65217AI205684AA971601AA493561AA916823M27492D61009L08488AI192189W76477

GMPSGNAI1GNAS1GOSR2GPC4GPP130GPR18GPX4GRB14GRTHGS3955GSTA2GSTA3GSTM5GTF2A2HBACHHBP1HIBADHHLJ1HMGCRHMGCS2HMMRHOXD3HPCAL1HPR6.6HRBHS1-2HSF2HSPA2HSSOX6IGSF4IL1AIL1R1ING1LINPP1INPP5AJUN

鸟嘌呤单磷酸合成酶鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)，α抑制活性多肽1鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)，α刺激活性多肽1高尔基体SNAP受体复合物成员2磷脂酰肌醇聚糖4II型高尔基体膜蛋白G蛋白偶连受体18谷胱甘肽过氧化物酶4(磷脂氢过氧化物酶)生长因子受体结合蛋白14促性腺激素调节的睾丸RNA解旋酶GS3955蛋白谷胱甘肽S-转移酶A2谷胱甘肽S-转移酶A3谷胱甘肽S-转移酶M5通用转录因子IIA，2(12kD亚基)胞质乙酰辅酶A硫代酸酯水解酶含HMG-盒的蛋白质13-羟基异丁酸脱氢酶DnaJ-样热休克蛋白403-羟基-3-甲基戊二酰基辅酶A还原酶3-羟基-3-甲基戊二酰基辅酶A合成酶2(线粒体)透明质酸介导的活动受体(RHAMM)同源框D3海马钙蛋白-样基因1孕酮结合蛋白HIV Rev结合蛋白推定的跨膜蛋白热休克转录因子2热休克70kD蛋白质2SRY(性别决定区Y)-序列盒6免疫球蛋白超家族，成员4白介素1，α白介素1受体，I型生长抑制剂家族，成员1-样基因肌醇聚磷酸盐-磷酸酶肌醇聚磷酸盐-5-磷酸酶，40kDv-jun鸟肉瘤病毒17癌基因同源物

496497498499500501502503504505506507508509510511512513514515516517518519520521522523524525526527528529530

AA933702U25138AF064093D14661AB014531H98203AA037452Y08319AL044356M59832AF064492L13210AA252389AA191662AI160184AA569922AA527435AA173168M83202AA459595U44378X74837M69226AA157731U07620D10511X68836AA228022X12556AI215620AA815051L38486AA135566X53331U77604

KCNK4KCNMB1KEO4KIAA0105KIAA0631KIAA0987KIAA0992KIF2KPNB3LAMA2LDB2LGALS3BPLHFPLOC51617LOC51673LOC51706LOC63928LRRFIP2LTFLZK1MADH4MAN1A1MAOAMAP1ALC3MAPK10MATMAT2AMCAMMCF2MCSPMDG1MFAP4MGEA6MGPMGST2

钾内向整流通道，亚家族K，成员4钾大传导性钙活化通道，亚家族M，β成员1类似于Caenorhabditis elegans蛋白质C42C1.9Wilms′肿瘤1-缔合蛋白极长链酰基-CoA合成酶；lipidosin在肺腺癌中差异表达的基因palladin驱动蛋白重链成员2核周蛋白(输入蛋白)β3层粘连蛋白，α2(分区蛋白，先天性肌肉营养障碍)结合LIM结构域的基因2凝集素，半乳糖苷结合蛋白，可溶性，3结合蛋白(半乳凝集素6结合蛋白)脂肪瘤HMGIC融合配偶体HMP19蛋白质脑特异性蛋白细胞色素b5还原酶1(B5 R.1)肝细胞癌抗原基因520亮氨酸富集重复(以FLII)相互作用蛋白2乳运铁蛋白C3HC4-型锌指蛋白MAD(mothers against decapentaplegic，果蝇)同源物4甘露糖苷酶，α，1A型，成员1一元胺氧化酶A微管结合蛋白1A和1B，轻链3促细胞分裂剂活化的蛋白激酶10线粒体乙酰乙酰基-CoA硫解酶甲硫氨酸腺苷转移酶II，α黑素瘤粘附分子MCF.2细胞系产生的转化序列线粒体囊中的含硒蛋白质微血管内皮分化基因1微原纤维蛋白结合蛋白4脑膜瘤表达的抗原6(螺旋型富含脯氨酸的螺旋)基质Gla蛋白质微粒体谷胱甘肽S-转移酶2

531532533534535536537538539540541542543544545546547548549550551552553554555556557558559560561562563564565566567

M16279U38320M93405AI140756AA868815X59657J05581AA401638AA319638X85337D87930J02854D50370AA906200AA855085U22897AI088622Y00067M58603U83843AA707108AA340728AA215284X55740X76732AJ007558AA902823AA699559AI208877AA729034AF012549AA889218AA922747M37721X76770U02020AA626775

MIC2MMP19MMSDHMP1MSL3L1MTPMUC1MULMYH9MYLKMYPT1MYRL2NAP1L3NAP4NCOA4NDP52NDUFS2NEF3NFKB1NIP7-1NKX3ANR2F2NSFNT5NUCB2NUP155NYD-SP12NYD-SP15NYD-SP21ODC1ODF2OGNOXR1PAMPAPPBEFPCDHA5

以单克隆抗体12E7，F21和O13鉴定的抗原基质金属蛋白酶19甲基丙二酸-半醛脱氢酶金属蛋白酶1(pitrilysin家族)雄性特异性致死因子-3(果蝇)-样基因1微粒体甘油三酯转移蛋白(大型多肽，88kD)粘蛋白1，跨膜蛋白Mulibrey侏儒症肌球蛋白，重多肽9，非肌肉肌球蛋白，轻多肽激酶肌球蛋白磷酸酶，靶亚基1肌球蛋白调控轻链2，平滑肌同种型核小体装配蛋白1-样蛋白3Nck，Ash和磷脂酶C结合蛋白核受体共激活剂4核结构域10蛋白NADH脱氢酶(泛醌)Fe-S蛋白2(49kD)(NADH-辅酶Q还原酶)神经丝3(150kD介质)B-细胞中κ轻多肽基因增强子的核因子1HIV-1 Nef相互作用蛋白NK同源框(果蝇)，家族3，A核受体亚家族2，F组，成员2N-乙基马来酰亚胺-敏感性因子5核苷酸酶(CD73)核结合蛋白2核孔蛋白155kDNYD-SP12蛋白蛋白质激酶NYD-SP15睾丸发育相关性NYD-SP21鸟氨酸脱羧酶1精子尾外部密集纤维2Osteoglycin(骨诱导因子，mimecan)氧化抗性蛋白1肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶poly(A)聚合酶前-B-细胞集落增强因子原钙粘着蛋白α5

568569570571572573574575576577578579580581582583584585586587588589590591592593594595596597598599600601

D84307AA004890AA400893AI192411C05229U79296J00123AF048755D25328W58700AA057243AA515710AA634825U09117AA777648AF023455AF034803Z50749M60484U37352AI299911N29328X75756AI357236X07862AI242370U51990Y00971D87258M61900M57399W84417AA635922AB008109

PCYT2PDCD8PDE1APDGFRAPDK4PDX1PENKPEX13PFKPPHKBPHRET1PIGNPINK1PLCD1PMP22PPEF1PPFIBP2PPP1R7PPP2CBPPP2R5CPPP3CAPPP4R1PRKCMPRM1PRM2PRNDPRP18PRPS2PRSS11PTGDSPTNRANBP9RANGAP1RGS5

磷酸胞苷转移酶2，乙醇胺凋亡因子8(凋亡诱导因子)磷酸二酯酶1A，钙调蛋白依赖型血小板衍生的生长因子受体，α多肽丙酮酸脱氢酶激酶，同工酶4丙酮酸脱氢酶复合物，含硫辛酰成份X；E3-结合蛋白脑啡肽原过氧化物酶体生物发生因子13磷酸果糖激酶，血小板磷酸化酶激酶，β视网膜中含PH结构域的蛋白质1磷脂酰肌醇聚糖，N型PTEN诱导的推定激酶1磷脂酶C，δ1外周髓鞘质蛋白22蛋白质磷酸酶，EF hand钙结合结构域1PTPRF相互作用蛋白，结合蛋白2(liprinβ2)蛋白质磷酸酶1，调控亚基7蛋白质磷酸酶2(以前的2A)，催化性亚基，β同种型蛋白质磷酸酶2，调控亚基B(B56)，γ同种型蛋白质磷酸酶3(以前的2B)，催化性亚基，α同种型(钙调磷酸酶Aα)蛋白质磷酸酶4，调控亚基1蛋白质激酶C，mu鱼精蛋白1鱼精蛋白2朊病毒基因复合物，下游相似于啤酒糖酵母Prp18的前-mRNA剪接因子磷酸核糖基焦磷酸合成酶2蛋白酶，丝氨酸，11(IGF结合蛋白)前列腺素D合成酶基因多效营养因子(pleiotrophin)(肝素结合生长因子8，轴突生长启动因子1)RAN结合蛋白9Ran GTPase活化蛋白1G-蛋白信号传导调节蛋白5

602603604605606607608609610611612613614615616617618619620621622623624625626627628629630

AA778308AA854469AI095724AF056929Y13647AJ224677T36260AA401227AA703667AI026695Z11793AF042081AF036269T35854N53491AA639599N30856M55531AA838741AA758636M88163W70141AI222903AI351686AA946930W56480Z46629AA760720AI459767

RNASE1RNF6RPL17SARCOSINSCDSCRG1SEC23BSEC31B-1SEC8SENP1SEPP1SH3BGRLSH3GL3SIAH2SIRT3SLC12A2SLC19A2SLC2A5SLC35A1SMAPSMARCA1SMARCA3SMARCD2SMOC1SNRPGSOS1SOX9SPAG6SPARCL1

核糖核酸酶，RNase A家族，1(胰腺)环指蛋白(C3H2C3型)6核糖体蛋白L17肌节肌蛋白硬脂酰-CoA去饱和酶(δ-9-去饱和酶)瘙痒病反应蛋白1Sec23(啤酒糖酵母)同源物B分泌途径成份Sec3 1B-1分泌蛋白，SEC8Sentrin/SUMO-特异性蛋白酶含硒蛋白质P，血浆，1SH3结构域结合的富含谷氨酸的蛋白质样蛋白SH3-结构域GRB2-样蛋白3seven in absentia(果蝇)同源物2sir2-样蛋白3溶质载体家族12(钠/钾/氯转运蛋白)，成员2溶质载体家族19(硫胺素转运蛋白)，成员2溶质载体家族2(促进葡萄糖的转运蛋白)，成员5溶质载体家族35(CMP-唾液酸转运蛋白)，成员1甲状腺激素受体共激活蛋白染色质的SWI/SNF相关性，基质相关性，肌动蛋白依赖型调节蛋白，亚家族a，成员1染色质的SWI/SNF相关性，基质相关性，肌动蛋白依赖型调节蛋白，亚家族a，成员3染色质的SWI/SNF相关性，基质相关性，肌动蛋白依赖型调节蛋白，亚家族d，成员2分泌模块钙结合蛋白1小核核糖核蛋白多肽Gson of sevenless(果蝇)同源物1SRY(性别决定区Y)-盒9(campomelicdysplasia，常染色体性别逆转)精子相关性抗原6SPARC-样蛋白1(mast9，hevin)

631632633634635636637638639640641642643644645646647648649650651652653654655656657658659660661662663664665

AA779272M61199AI024234U17280U14550L77564AA935437H10341AA643682Z21437AI093734AA628669AI243203S95936AA573143AI086204U81006L01042X64559X07948J04088U54831AA913471X66397M25532X63679AF064801AI346969AF065388AA432312AA456299X69490AA709190X02308AI344684

SPINK2SSFA2SSTKSTARSTHMSTK22BSTRINSULTX3SUV39H2TAF2GTAZTBL2TEX14TFTIMP2TM4SF6TM9SF2TMF1TNATNP1top2Atop2BtopKTPRTPX1TRAMTRC8TRIM14TSPANTSPYLT-STARTTNTUBA2TYMSUBE2N

丝氨酸蛋白酶抑制剂，Kazal型，2(顶体蛋白-胰蛋白酶抑制剂)精子特异性抗原2丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶STK类固醇生成急性调控蛋白唾液酸转移酶丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶22B(精子形成相关性蛋白)STRIN蛋白磺基转移酶相关性蛋白杂色抑制蛋白3-9(果蝇)同源物2；假定蛋白质FLJ23414TATA盒结合蛋白(TBP)-相关性因子，RNA聚合酶II，G，32kD含有PDZ-结合基序的转录共激活蛋白(TAZ)转导素(β)-样蛋白2睾丸表达序列14转铁蛋白金属蛋白酶的组织抑制剂2跨膜蛋白4超家族成员6跨膜蛋白9超家族成员2TATA元件调控因子1四连蛋白(纤溶酶原结合蛋白)转换蛋白1(组蛋白替换为精蛋白期间)拓扑异构酶(DNA)IIα(170kD)拓扑异构酶(DNA)IIβ(180kD)PDZ-结合激酶；T-细胞起源的蛋白激酶易位启动子区(活化MET癌基因)睾丸特异性蛋白1(探针H4 p3)转运链相关性膜蛋白肾癌中转移的修补相关性蛋白含三部分基序的基因14四穿膜区(tetraspan)1TSPY-样基因Sam68-样磷酸酪氨酸蛋白，T-STAR肌联蛋白微管蛋白，α2胸苷酸合成酶遍在蛋白-连接酶E2N(与酵母UBC13同源)

666667668669670671672673674675676677678679680681682683684685686687688689690691692693694695696697698699700701702703704705

AA416852N44888AA116022AA846445BG028760T29210AI018129D87459S69790AA364135AA160764X51630W55933N66453D83407M92843X84801AF017433AA703988AA897714U54996AA936961AA234377N35437Z20328H19830AI127752T65389AA284134AI192351AA865478AI306435AA709155AA582581AI076154AA759066AA452368U69201AA418149AA775271

UBL3UPF3AUSP18USP6USP7UTRNVAMP4WASF1WASF3WDR10WHSC1WT1WW45XPCZAKI4ZFP36ZNF165ZNF213ZNF259ZNF6ZW10LOC57032CL25022DJ1181N3.1DKFZp434C0328DKFZP434G156DKFZP434I092DKFZP434J214DKFZP434L243DKFZP564B167DKFZP564J0863DKFZP5 86A0522FLJ10134FLJ10159FLJ10283FLJ10392FLJ10582FLJ10761FLJ10850FLJ10914

遍在蛋白-样蛋白3相似于酵母Upf3，变异体A遍在蛋白特异性蛋白酶18遍在蛋白特异性蛋白酶6(Tre-2癌基因)遍在蛋白特异性蛋白酶7(疱疹病毒相关性蛋白)肌养相关蛋白(与肌营养不良蛋白同源)泡囊相关性膜蛋白4WAS蛋白家族，成员1WAS蛋白家族，成员3WD重复结构域10Wolf-Hirschhorn综合征候选物1Wilms肿瘤1含WW结构域的基因着色性干皮病，补充组C唐氏综合征决定区基因1-样基因1与小鼠Zfp-36同源的锌指蛋白锌指蛋白165锌指蛋白213锌指蛋白259锌指蛋白6(CMPX1)ZW10(果蝇)同源物，着丝粒/着丝点蛋白相应于乙酰辅酶A合成酶假定蛋白质假定蛋白质dJ1181N3.1假定蛋白质DKFZp434C0328假定蛋白质DKFZp434G156DKFZP434I092蛋白质DKFZP434J214蛋白质DKFZP434L243蛋白质DKFZP564B167蛋白质DKFZP564J0863蛋白质DKFZP586A0522蛋白质假定蛋白质FLJ10134假定蛋白质FLJ10159假定蛋白质FLJ10283假定蛋白质FLJ10392假定蛋白质FLJ10582假定蛋白质FLJ10761假定蛋白质FLJ10850假定蛋白质FLJ10914

70670770870971071171271371471571671771 8719720721722723724725726727728729730731732733734735736737738739740741742743744745746

AA293776AI221110AA634293D81610AA056538AA781142AA214211AI147953C00491AK024920AA634416AA809070H20535AI346388AI016734AA677445AA126461AI003803AI300283D38521D86984D87438D87465AF007170AA910738N30392AB014534AI167680AA506972AA665890N49366H09503AF052170AA234129AA399583H03641AI253232AA339816AI187395AA056734AI217997

FLJ10921FLJ10980FLJ11088FLJ11109FLJ11210FLJ11307FLJ13110FLJ20010FLJ20121FLJ20152FLJ20425FLJ20535FLJ21324FLJ21347FLJ22104H41HSA272196HSD-3.1IMPACTKIAA0077KIAA0231KIAA0251KIAA0275KIAA0452KIAA0579KIAA0608KIAA0634KIAA0643KIAA0668KIAA0729KIAA0737KIAA0740KIAA0750KIAA0863KIAA0874KIAA0914KIAA0996KIAA1028KIAA1053KIAA1110KIAA1128

假定蛋白质FLJ10921假定蛋白质FLJ10980假定蛋白质FLJ11088假定蛋白质FLJ11109假定蛋白质FLJ11210假定蛋白质FLJ11307假定蛋白质FLJ13110假定蛋白质假定蛋白质FLJ20121假定蛋白质假定蛋白质FLJ20425假定蛋白质FLJ20535假定蛋白质FLJ21324假定蛋白质FLJ21347假定蛋白质FLJ22104假定蛋白质假定蛋白质，克隆2746033假定蛋白质假定蛋白质IMPACTKIAA0077蛋白质KIAA0231蛋白质KIAA0251蛋白质KIAA0275基因产物DEME-6蛋白质KIAA0579蛋白质KIAA0608蛋白质KIAA0634蛋白质人cDNA FLJ13257 fis，克隆OVARC1000846，与核仁素微弱相似KIAA0668蛋白质KIAA0729蛋白质KIAA0737基因产物KIAA0740基因产物KIAA0750基因产物KIAA0863蛋白质KIAA0874蛋白质KIAA0914基因产物KIAA0996蛋白质KIAA1028蛋白质KIAA1053蛋白质KIAA1110蛋白质KIAA1128蛋白质

747748749750751752753754755756757758759760761762763764765766767768769770771772773774

AA037467AA994997W68261AA781940AI082425AI243817AA824313D59339AA044905T34177AA776749R00068AI302506AF113020AI218544AI214973AI215074AA587860AA043562AI277493AI078809AI028392AA830551AA853955AA320463AA393838AA400674AA148493

KIAA1165IAA1223KIAA1327KIAA1336KIAA1430KIAA1494KIAA1505KIAA1529KIAA1596LOC51255LOC57821PRO1580PRO1912PRO2463FLJ20425KIAA1223

假定蛋白质KIAA1165KIAA1223蛋白质KIAA1327蛋白质KIAA1336蛋白质KIAA1430蛋白质人cDNA：FLJ23073 fis，克隆LNG05726KIAA1505蛋白质人mRNA；cDNA DKFZp434I2420(来自克隆DKFZp434I2420)KIAA1596蛋白质假定蛋白质假定蛋白质LOC57821假定蛋白质PRO1580PRO1912蛋白质PRO2463蛋白质假定蛋白质FLJ20425KIAA1223蛋白质人cDNA FLJ11095 fis，克隆PLACE1005374人cDNA FLJ11205 fis，克隆PLACE1007843人cDNAFLJ11667 fis，克隆HEMBA1004697人cDNA FLJ11756 fis，克隆HEMBA1005595，与胞质动力蛋白重链微弱相似人cDNA FLJ12627 fis，克隆NT2RM4001813，与凝集素BRA-2微弱相似人cDNA FLJ13229 fis，克隆OVARC1000106人cDNA FLJ13848 fis，克隆THYRO1000855人cDNA FLJ13992 fis，克隆Y79AA1002139，与DNAJ蛋白同源物1微弱相似人cDNA：FLJ21127 fis，克隆CAS06212人cDNA：FLJ21849 fis，克隆HEP01928人cDNA：FLJ21962 fis，克隆HEP05564人cDNA：FLJ22300 fis，克隆HRC04759

775776777778779780781782783784785786787788789790791792793794795796797

AA411157AA631197T65582AI192127AA148566AA633352AI084531AA450190AA975521AI097058AA405953N32181AA262802AA293837AA970955AA843455AA421199AA393597AA976808AI280901AA443685N41310AI299718

人cDNA：FLJ22448 fis，克隆HRC09541人cDNA：FLJ22477 fis，克隆HRC10815人cDNA：FLJ22637 fis，克隆HSI06677人cDNA：FLJ22712 fis，克隆HSI13435人cDNA：FLJ22790 fis，克隆KAIA2176，与HUMPMCA人原生质膜钙泵ATPase(PMCA4)mRNA高度相似人cDNA：FLJ23067 fis，克隆LNG04993人cDNA：FLJ23093 fis，克隆LNG07264人cDNA：FLJ23316 fis，克隆HEP12031人cDNA：FLJ23518 fis，克隆LNG04878人cDNA：FLJ23538 fis，克隆LNG08010，与β2人MEN1区克隆ε/βmRNA高度相似人染色体11未知mRNA序列人克隆25056 mRNA序列人克隆SP329未知mRNA人GKAP42(FKSG21)mRNA，完整编码区人mRNA；cDNA DKFZp434B0610(来自克隆DKFZp434B0610)；部分编码区人mRNA；cDNA DKFZp434E232(来自克隆DKFZp434E232)人mRNA；cDNA DKFZp434L0217(来自克隆DKFZp434L0217)；部分编码区人mRNA；cDNA DKFZp434P2072(来自克隆DKFZp434P2072)；部分编码区人mRNA；cDNA DKFZp564C046(来自克隆DKFZp564C046)人mRNA；cDNA DKFZp564D016(来自克隆DKFZp564D016)人mRNA；cDNA DKFZp564H142(来自克隆DKFZp564H142)人mRNA；cDNA DKFZp564P046(来自克隆DKFZp5 64P046)人mRNA；cDNA DKFZp586B1922(来自克隆DKFZp586B1922)

798799800801802803804805806807808809810811812813814815816817818

AA280818AI150152AI016755AI014769AA004698AA431698AA126472AA651872A25270AA650281AI015633N47682AA578684Z21254R61253W67209AA609891W86641AA815470AA992324AA446449

KIAA1673KIAA1674KIAA1771KIAA1877KIAA0251

人mRNA；cDNA DKFZp586G2222(来自克隆DKFZp5 86G2222)来自7q34-q36的人PAC克隆RP5-981O7人ropporin mRNA，完整编码区人TRAF4相关性因子1 mRNA，部分编码区人遍在蛋白-样融合蛋白mRNA，完整编码区来自染色体20p11.212.3上的克隆1068E13的人DNA序列。含有两个推定的新基因，一个新蛋白质的基因相似于牛SCP2(固醇载体蛋白2)和部分HSD17B4(羟基类固醇(17-β)脱氢酶4)，EEF1A1(来自染色体6q135上的克隆747H23的人DNA序列。含有可溶性苹果酶1(NADP-依赖型苹果酶，苹果酸氧化还原酶，EC 1.1.1.40)的ME1基因的3′部分，一个新基因和N-乙酰葡萄糖胺基因的5′部分来自染色体6q24.1-25.2上的克隆RP12G14的人DNA序列。含有新亲环蛋白型肽基-脯氨酰顺-反异构酶基因的5′端，一个新基因，RPS18(40S核糖体蛋白S18)假基因，KATNA1基因的3′端IFN-γ拮抗剂细胞因子很可能是小鼠肿瘤坏死-α-诱导的脂肪-相关性蛋白的直向同源基因溶质载体家族26，成员8ESTsESTsESTs，与无名蛋白产物微弱相似[人]ESTsESTs，与p53调控的PA26-T2核蛋白中等相似[人]ESTESTESTESTEST

819820821822823824825826827828829830831832833834835836837838839840841842843844845846847848849850851852853854855856857858859860

AI004873AI093982AA393055AI168436AA809072AA926704AI183575AA121865AA725836AA621076AI018394AA885079AI148659AA460513AA758005AA868233AA488768AA496024AA496252AI339257T64080AA844729AI041148AA813319AI138555AA633536AA688025U51712N50822R38569AA889533AA629398AA628190AI041289AI204513AA001410AI027500AA658107AA923244AA723819AA437069AA400934

ESTESTESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTs

861862863864865866867868869870871872873874875876877878879880881882883884885886887888889890891892893894895896897898899900901902

M32093AA262466AA897137AA446184AA036631H86103AA401541H05826AA406039AA448082AA446064H81935AA889152AI127656AI033705AI138800AI183653AA969732AI024328AA913732AA397520AI025509AA382504AI341170AA909257AA812677AA416673AA972840W31789AI261804AI091533AA991994AI024578AI040955AA953477AA846324AA417966AA150262AA724720AI031941AA620800AA813092

ESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTsESTs

903904905906907908909910911912913914915916917918919920921922923924925926927928

AA101229AA025055AA382809R60655AA521265D50640W44613AA400550AA648782AA496122AI039250AI187883AA865734D20934AI434204AA876372AI150114AA533191AA885514AA960902AI336338AI208582AA927467AA789329AA453640AA744373

ESTsESTsESTsESTs，与人ESTs AA412402证实的AC0055342高度相似[人]ESTs，与AF1170651雄性-特异性致死因子-3同源物1高度相似[人]ESTs，与CN3B_人CGMP-抑制型3′，5′-环磷酸二酯酶B高度相似[人]ESTs，与在Fanconi贫血症中差异表达的基因高度相似[人]ESTs，与ALU4_人ALU亚家族SB2序列污染预警登录序列中等相似[人]ESTs，与GNPI_人葡糖胺-6-磷酸异构酶中等相似[人]ESTs，与KIAA1165蛋白中等相似[人]ESTs，与p60剑蛋白中等相似[人]ESTs，与肌动蛋白结合蛋白MAYVEN微弱相似[人]ESTs，与AF1413261 RNA解旋酶HDB/DICE1微弱相似[人]ESTs，与AF1488561未知蛋白微弱相似[人]ESTs，与Afg1p微弱相似[啤酒糖酵母]ESTs，与ALU1_人ALU亚家族J序列污染预警登录序列微弱相似[人]ESTs，与ALU1_人ALU亚家族J序列污染预警登录序列微弱相似[人]ESTs，与ALU7_人ALU亚家族SQ序列污染预警登录序列微弱相似[人]ESTs，与CAYP_人钙磷蛋白微弱相似[人]ESTs，与COXM_人细胞色素C氧化酶多肽VIIB PRECURSO微弱相似[人]ESTs，与dJ1108D11.1微弱相似[人]ESTs，与dJ134E15.1微弱相似[人]ESTs，与I38428 T-复合物蛋白10A微弱相似[人]ESTs，与剑蛋白p80亚基微弱相似[人]ESTs，与KCC1_人钙/钙调蛋白依赖型蛋白激酶I型微弱相似[人]ESTs，与KIAA1006蛋白微弱相似[人]

929930931932933934935936937938939

AA393227AI126471AA843459R79064AA708149AA946954AA045194AA223199AA843452AI224867AI024879

ESTs，与KIAA1016蛋白质微弱相似[人]ESTs，与MRJ微弱相似[人]ESTs，与PRP2小鼠富含脯氨酸的蛋白质MP-2前体微弱相似[M.musculus]ESTs，与推定的III型乙醇脱氢酶微弱相似[D.melanogaster]ESTs，与人ADP/ATP载体蛋白微弱相似[C.elegans]ESTs，与睾丸缩合酶微弱相似[M.musculus]ESTs，与睾丸筑丝蛋白B1-样蛋白微弱相似[人]ESTs，与未知基因产物微弱相似[人]ESTs，与SP:YAD5 CLOAB微弱相似[C.elegans]ESTs，与锌指蛋白微弱相似[人]ESTs，与透明带结合蛋白微弱相似[人]

表5在睾丸精原细胞瘤中具有已知功能的代表性上调基因

TS编号	登录号	标记	基因名称
				与信号转导途径相关的基因
10797108162163120	D87116AA845512AA583183AA346311M29893M13228	MAP2K3KLF4MAP4K3RAI3RALAMYCN	促细胞分裂剂活化的蛋白激酶激酶3Kruppel-样因子4(肠)促细胞分裂剂活化的蛋白激酶激酶激酶激酶3视黄酸诱导的基因3v-ral猿猴白血病病毒癌基因同源物A(ras相关性)v-myc鸟髓细胞瘤病病毒相关性癌基因，成神经细胞瘤衍生的基因
				与癌发生相关的基因
153147148225170	AF045584M16750U77735AA465240X12949	POV1PIM1PIM2VAV2RET	前列腺癌过度表达基因1pim癌基因pim-2癌基因vav2癌基因ret原癌基因
				与细胞周期相关的基因
20	AA682870	CCND2	细胞周期蛋白D2

25	M81934	CDC25B	细胞分裂周期25B
				与细胞粘着和细胞骨架相关的基因
92452696	Z68228AA128470X63629U06698	JUPDSPCDH3KIF5A	连接斑珠蛋白桥粒斑蛋白(DPI，DPII)钙粘着蛋白3，1型，P-钙粘着蛋白(胎盘)驱动蛋白家族成员5A

半定量RT-PCR

选择29个上调基因并通过应用半定量RT-PCR实验检查其表达水平。使用随机引物(Roche)和Superscript II(Life Technologies，Inc.)从各样品aRNA的3-μg等分试样逆转录单链cDNAs。稀释各cDNA混合物用于随后使用制备靶DNA-或α-tublin-特异性反应的相同引物组进行PCR扩增。引物序列在表2中列出。α-tublin的表达用作内部对照。对PCR反应进行多轮优化以确保产物强度在扩增的线性期内。比较在几乎所有提供信息的病例中其表达为过量表达的29个上调基因(CCND2，GIP，H1F2，NMA，PIM2，POV1，PRDM4，PTMS，RAI3，PYPAF3，T1A-2，TCOF1，TGIF2，FLJ10713，FLJ20069，KIAA0456，KIAA1198，DKFZp434K0621，EST(270)，FLJ13352，FLJ12195，EST(285)，NCOA6IP，EST(295)，PLXNA2，EST(311)，EST(320)，LOC152217，EST(341))的表达水平的比率，结果与在绝大多数试验病例的微阵列分析的结果高度相似(图1，图2A)。

表2：RT-PCR的引物序列

TS编号	基因	正向引物	SEQIDNO	反向引物	SEQIDNO
						205970130148153156	CCND2GIPH1F2NMAPIM2POV1PRDM4	5′-TGATCAGTGTATGCGAAAAGGT-3′5′-TTGCCATGGACAAGATTCAC-3′5′-CGGAACCAAACCTAAGAAGC-3′5′-CCTCTGCAAACAGAATCTTG-3′5′-GGAAATAAGGCTTGCTGTTTGT-3′5′-CACAACATGCAATGTGTCTGTG-3′5′-CATGAAGGAAAACGGGATTATG-3′	135791113	5′-GGTCAAGGTGAGTTTATTGTCCA-3′5′-TTGTCTGATCCAGCAAGCAG-3′5′-CTTCACAGCCTTAGCAGCACTT-3′5′-AAGATGTAGAAGCTTACATAGGGCA-3′5′-AATAGTGGGTTTCCACACATGG-3′5′-TCCTCTAAGACTTGCAAGCAGC-3′5′-GTGCAGAAAGAGACTCATCCG-3′	2468101214

159162171209212214240244253259267270278282285287295303311320337341

PTMSRAI3PYPAF3T1A-2TCOF1TGIF2FLJ10713FLJ20069KIAA0456KIAA1198DKFZp434K0621ESTFLJ13352FLJ12195ESTNCOA6IPESTPLXNA2ESTESTLOC152217EST

5′-TCCCACCTAACCTCTGCATC-3′5′-GGCTGATACTTCTCTCATCTTGC-3′5′-TGGGGTTCTAAGACAAAGAACTG-3′5′-TGCTGGTGCTATTTACTGACGTA-3′5′-AAGTGACCTCCTCTCCTTCC-3′5′-GAACCCAGTGGATGTAACAGAAC-3′5′-ACTTATAGTCCTGCGAGTCTGGG-3′5′-CATCTCCTTTGTTTCGATAGGA-3′5′-GGGCTGGTGCAGATCTACTT-3′5′-CACTCAGAATTCTTACCTCCCCT-3′5′-GCCAAAAATGGCTCTCTAGG-3′5′-GTGTCCACTTAGAGCCTCACG-3′5′-TTTAATCAGGCCCTGTCTGC-3′5′-CTGGAAGAAGAAGGAACAGGTCT-3′5′-CAAATGCTCTGCTTTGTACTCCT-3′5′-CGGGAGGATTGTAAGATACTGTG-3′5′-GTAGATGTGGGGACAACAGAGAG-3′5′-GTTTTTGTGGGGACTAAGAGTG-3′5′-CTTTTCCCACAAGAACCATTTC-3′5′-CTCATCTGTACCCTCACTGGGAT-3′5′-AAGCCAGAGAGCCTTTCCTC-3′5′-ACCTAACGTTTGTGCCTTATGTG-3′

15171921232527293133353739414345474951535557

5′-GAAGCGCGACCATTTCTTTA-3′5′-GCCACCACATCTTTATTGCATAC-3′5′-GTGAGAAAACCAGTGTCAAATCC-3′5′-AAAAGACCGTTTCTGACTCTGTG-3′5′-CACCCTTCCTCCAAGTCTTTTAT-3′5′-TACTGCAGAGACTTAGCTGGTCC-3′5 ′-GGCAGGAGAGAAGAACATCTTG-3′5′-GATCACTGTGGGTCTTAAGCAA-3′5′-TCCAACATCTGTTGAGTGACAGT-3′5′-GTGATGTGAAGCAAGGTAGTTCC-3′5′-CAGACACGCACTTGTGGTTTATT-3′5′-ATCCTTCTTCCTATACTTCCCCC-3′5′-GGGGTATAGAAATGGAATGGAGA-3′5′-GGTTGCTGAGATTTTATCTGTGG-3′5′-CATGAATGAGCCTGAAATAGTCC-3′5′-ACTTCTCATGAGTTCAGCCTCAG-3′5′-TTTAAAGTCACCTTAGGTTGGGG-3′5′-GGAGGAAGTAGCTAGAAGCTAAG-3′5′-CTGGTGTAATCAGACACCACGTA-3′5′-CTAAAGTCTCCCAGTTTCCCCT-3′5′-CGGTATTCTTAACACATCTTGCC-3′5′-AGGTTGGAAGATCCATTTCCTT-3′

16182022242628303234363840424446485052545658

TUBAβ2MG

5′-CTTGGGTCTGTAACAAAGCATTC-3′5′-TTAGCTGTGCTCGCGCTACT-3′

5961

5′-AAGGATTATGAGGAGGTTGGTGT-3′5′-TCACATGGTTCACACGGCAC-3′

6062

实施例3：设计成减少PYPAF3表达的SIRNA的生长抑制效应

通过cDNA微阵列分析全基因组的表达谱，我们分离了用于诊断性肿瘤标记，睾丸生殖细胞肿瘤的治疗和预防的新分子靶。在睾丸精原细胞瘤中普遍上调的基因中，我们注意到含有PYRIN的Apaf-1-样蛋白3(PYPAF3(NM_139176))，通过半定量RT-PCR分析与包括睾丸，心脏，肺，肝脏，肾，脑和骨髓的正常人器官相比，在具有睾丸精原细胞瘤的8个病例中有7个其显著上调。尽管目前我们将PYPAF3鉴定为睾丸精原细胞瘤中的上调基因(bulid#160)，但是我们最初使用代表从国家生物技术信息中心的Unigene数据库(build#131)检索的23,040个基因的cDNA微阵列通过表达谱将该基因列为RMP:RMB5-介导的蛋白质。

使用PYPAF3 cDNA片段作为探针进行的多组织Northern印迹分析揭示了仅在睾丸中表达的大约3.3kb的转录子。免疫细胞化学试验揭示了PYPAF3蛋白质存在于整个细胞质中。转染PYPAF3的小干扰RNA(siRNA)可抑制PYPAF3的mRNA表达和睾丸生殖细胞肿瘤细胞的细胞生长。这些发现表明PYPAF3可能与睾丸精原细胞瘤的肿瘤发生相关，并提供了用于睾丸生殖细胞肿瘤的靶向治疗开发的有希望的候选物。

细胞系和组织样品

COS-7细胞和Tera-2细胞从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)获得。所有的细胞系在补充了10％胎牛血清和1％抗生素/抗霉菌溶液(Sigma，St.Louis，MO)的合适培养基中以单层生长，Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(Sigma)用于COS-7 McCoy’s 5A(Invitrogen，Carlsbad CA)，并在37℃下含有5％CO₂的潮湿空气中维持。

半定量RT-PCR

正常人睾丸，心脏，肺，肾，肝脏，脑，和骨髓poly(A)⁺RNA通过Clontech(Palo Alto，CA)获得。来自各样品的扩增RNA的3-μg等分试样使用随机引物(Roche)和Superscript II逆转录酶(Invitrogen)逆转录成单链cDNAs。稀释各单链cDNA用于随后的PCR扩增。在20ml体积的PCR缓冲液(Takara，Kyoto，Japan)中完成标准RT-PCR程序，扩增在94℃变性5分钟，接着进行94℃ 30秒，55℃ 30秒和72℃ 30秒的22个(对于TLUBA3)或31个(对于PYPAF3)循环。引物序列如下：对于TUBA3，正向引物5′-CTTGGGTCTGTAACAAAGCATTC-3′(SEQ ID NO：59)，反向为5′-AAGGATTATGAGGAGGTTGGTGT-3′(SEQ ID NO：60)；对于PYPAF3，正向为5’-TGGGGTTCTAAGACAAAGAACTG-3’(SEQ ID NO：19)，反向为5’-GTGAGAAAACCAGTGTCAAATCC-3’(SEQ ID NO：20)。

Northern印迹分析

人多组织印迹(Clontech)与作为探针的³²P-标记的PYPAF3 cDNA片段进行杂交。按上述通过RT-PCR制备cDNA。按照厂商的建议进行预杂交，杂交和洗涤。印迹用增感屏在-80℃下进行放射自显影7天。

免疫细胞化学染色

使用正向引物5’-CGCGGATCCCACTATGACATCGCCCCAGC-3’(SEQID NO：63)和反向引物5’-CCGCTCGAGGCAAAAAAAGTCACAGCACGG-3’(SEQ ID NO：64)通过RT-PCR扩增PYPAF3的完整编码区。PCR产物用BamH1和Xho1消化后，将它克隆进质粒载体pcDNA3.1-myc/His(Invitrogen)的合适克隆位点。COS7细胞用与FuGene6转染剂(Roche，Basel，Switzerland)混合的pcDNA3.1(+)-PYPAF3-myc/His转染。COS7-衍生的瞬时转染子用PBS(-)洗涤两次，用4％低聚甲醛溶液在4℃下固定15分钟，用含有0.1％Triton X-100的PBS(-)使其通透2.5分钟。细胞用含有3％BSA的PBS(-)覆盖60分钟以便在与第一抗反应前封闭非特异性抗体结合位点。PYPAF3蛋白质用小鼠抗人c-Myc 9E10抗体(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)作为第一抗且山羊抗小鼠FITC(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)作为第二抗进行检测。细胞核用4’，6’-二脒-2’-苯基吲哚二氢氯化物(Vector Laboratories，Burlingame，CA)复染。用Eclipse E800显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)获得荧光图像。

用小干扰RNA(siRNA)处理睾丸生殖细胞肿瘤细胞

通过RNA聚合酶III转录U6RNA基因产生在3′端含尿苷的短转录子。我们使用引物5′-TGGTAGCCAAGTGCAGGTTATA-3′(SEQ ID NO：65)，和5′-CCAAAGGGTTTCTGCAGTTTCA-3′(SEQ ID NO：66)和人胎盘DNA作模板通过PCR扩增了含U6RNA启动子区的基因组片段。纯化该产物并使用TA克隆试剂盒按照厂商方案(Invitrogen)克隆进pCR2.1质粒载体。纯化含有U6RNA的BamHI，XhoI片段并克隆进pcDNA3.1(+)的核苷酸56和1257之间，使用引物5′-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3′(SEQ IDNO：67)和5′-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3′(SEQ ID NO：68)通过PCR扩增该片段。连接的DNA成为用引物5′-TTTAAGCTTGAAGACCATTTTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACA-3′(SEQ ID NO：69)和5′-TTTAAGCTTGAAGACATGGGAAAGAGTGGTCTCA-3′(SEQ ID NO：70)进行PCR扩增的模板。用HindIII消化该产物并随后自我连接以产生psiU6BX载体质粒。抗PYPAF3的SiRNA表达载体(psiU6BX-PYPAF3)和对照质粒(psiU6BX-EGFP，psiU6BX-Luciferace)通过将表6的双链寡核苷酸克隆进psiU6BX载体的BbsI位点来制备。各siRNA表达载体用Fugene6(Roche)转染进内源性表达PYPAF3的睾丸生殖细胞肿瘤细胞系Tera-2中。通过Geneticin(Invitrogen)选择后，通过集落形成试验使用吉姆萨染色评估两周后的细胞增殖并通过细胞计数试剂盒-8(Dojindo，Kumamoto，日本)评估一周后的细胞增殖(39)。通过半定量RT-PCR鉴定PYPAF3 mRNA的敲除效应。

通过半定量RT-PCR证实睾丸精原细胞瘤中的PYPAF3表达

我们使用cDNA微阵列分析了13个患者睾丸精原细胞瘤中23,040个基因的基因表达谱(12)。在上调基因中，我们注意到PYPAF3在8个提供信息的病例中有7个过量表达，该基因的信号强度比睾丸精原细胞瘤患者中的临界值更高。另外，我们进行了半定量RT-PCR分析，然后证实了与正常人睾丸，心脏，肺，肝脏，肾，脑和骨髓相比在8例精原细胞瘤中有7例的PYPAF3表达提高(图2A)。

多组织Northern印迹分析和PYPAF3蛋白的亚细胞定位

使用PYPAF3 cDNA片段作为探针的Northern分析(见材料和方法)揭示了一个仅在睾丸中表达的大约3.3kb的转录子(图2B)。另外，为了研究PYPAF3蛋白质在哺乳动物细胞中的作用，我们构建了一个质粒来表达myc-标记的PYPAF3蛋白质(见材料和方法)。当该质粒DNA瞬时转染进COS-7细胞中时，标记的PYPAF3蛋白质存在于转染细胞的整个细胞质中(图3)。

设计成减少PYPAF3表达的小干扰RNA(siRNA)的生长抑制效应

为了评估PYPAF3的生长促进作用，我们借助于以哺乳动物载体为基础的RNA干扰(RNAi)技术敲除睾丸生殖细胞肿瘤细胞系Tera-2细胞中的内源性PYPAF3表达并检查对细胞生长的影响(参见材料和方法)。如图4a所示，导入psiU6BX-PYPAF3(Si 4)清楚地降低了Tera-2细胞系中PYPAF3转录子的表达而用对照质粒(psiU6BX-EGFP和psiU6BX-Luciferase siRNA表达载体)转染的细胞中观察到无影响。为了证实psiU6BX-PYPAF3降低该基因特异性生长，我们对相同的两个细胞系进行了集落形成试验；如图4b和4c所示，导入psiU6BX-PYP-3(Si 4)显著抑制Tera-2细胞的生长，与上述降低表达的结果一致，而导入Si3显著抑制Tera-2细胞的生长，尽管显示PYPAF3转录子水平的敲除几乎无减少。另外，MTT试验还表明使用psiU6BX-PYPAF3(Si 3和Si 4)抑制PYPAF3表达时显著抑制Tera-2细胞的生长(图4a，b)。每个结果都通过三个独立的实验进行了证实。

表6.PYPAF3的小干扰RNA的寡核苷酸序列

			SEQ ID NO
				Si1Si2Si3Si4Si5SiEGFPSiLuciferace	有义反义有义反义有义反义有义反义有义反义有义反义有义反义	5′-CACCGAGGCTGATGGCAAGAAACTTCAAGAGAGTTTCTTGCCATCAGCCTC-3′5′-AAAAGAGGCTGATGGCAAGAAACTCTCTTGAAGTTTCTTGCCATCAGCCTC-3′5′-CACCGAGATGAATCTCACGGAATTTCAAGAGAATTCCGTGAGATTCATCTC-3′5′-AAAAGAGATGAATCTCACGGAATTCTCTTGAAATTCCGTGAGATTCATCTC-3′5′-CACCGTAGGACACTTCTTATTCGTTCAAGAGACGAATAAGAAGTGTCCTAC-3′5′-AAAAGTAGGACACTTCTTATTCGTCTCTTGAACGAATAAGAAGTGTCCTAC-3′5′-CACCGTGATGCATTGTTCCTTCATTCAAGAGATGAAGGAACAATGCATCAC-3′5′-AAAAGTGATGCATTGTTCCTTCATCTCTTGAATGAAGGAACAATGCATCAC-3′5′-CACCGCTTGGCTGTAGATATCTCTTCAAGAGAGAGATATCTACAGCCAAGC-3′5′-AAAAGCTTGGCTGTAGATATCTCTCTCTTGAAGAGATATCTACAGCCAAGC-3′5′-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3′5′-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3′5′-CACCGTGCGCTGCTGGTGCCAACTCTCTTGAAGTTGGCACCAGCAGCGCAC-3′5′-AAAAGTGCGCTGCTGGTGCCAACTTCAAGAGAGTTGGCACCAGCAGCGCAC-3′	7172737475767778798081828384

工业实用性

通过结合激光获取解剖和全基因组cDNA微阵列获得的对本文所述的TS的基因表达分析鉴定了作为癌症预防和治疗靶的特异性基因。根据这些差异表达基因的亚组表达，本发明提供了用于鉴定或检测TS的分子诊断标记。

本文所述的方法也用于鉴定其它的分子靶用于预防，诊断和治疗TS。本文报道的数据增加了对TS的全面了解，有利于开发新的诊断策略，并提供了鉴定用于治疗性药物和预防剂的分子靶的线索。该信息有助于更深入地了解睾丸肿瘤发生，并提供了开发用于诊断，治疗，和最终预防TS的新策略的指导。

本文引证的所有专利，专利申请，和出版物以其整体引用以供参考。另外，尽管详细地并以其具体实施方式描述了本发明，但是对于本领域的技术人员而言显而易见的是可在其中进行各种改变和修饰而不偏离本发明的实质和范围。

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序列表

<110>肿瘤疗法科学股份有限公司(ONCOTHERAPY SCIENCE，INC.)

JAPAN AS REPRESENTED BY THE PRESIDENT OF THE UNIVERSITY OF TOKYO

<120>诊断睾丸精原细胞瘤的方法

<130>ONC-A0215P

<150>US 60/414,677

<151>2002-09-30

<160>86

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

<400>1

tgatcagtgt atgcgaaaag gt                                        22

<210>2

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<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

<400>2

ggtcaaggtg agtttattgt cca                                        23

<210>3

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<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

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ttgccatgga caagattcac                             20

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<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

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ttgtctgatc cagcaagcag                             20

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<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

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cggaaccaaa cctaagaagc                             20

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<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

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cttcacagcc ttagcagcac tt                          22

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cctctgcaaa cagaatcttg                             20

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aagatgtaga agcttacata gggca                       25

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ggaaataagg cttgctgttt gt                           22

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<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

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aatagtgggt ttccacacat gg                            22

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<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

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cacaacatgc aatgtgtctg tg                            22

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<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

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tcctctaaga cttgcaagca gc                            22

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<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

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 catgaaggaa aacgggatta tg                          22

<210>14

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<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

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gtgcagaaag agactcatcc g                        21

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tcccacctaa cctctgcatc                          20

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gaagcgcgac catttcttta                          20

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<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

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ggctgatact tctctcatct tgc                      23

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<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

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gccaccacat ctttattgca tac                       23

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<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

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tggggt tcta agacaaagaa ctg                      23

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<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

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gtgagaaaac cagtgtcaaa tcc                       23

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<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

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tgctggtgct atttactgac gta                      23

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<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

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aaaagaccgt ttctgactct gtg                      23

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aagtgacctc ctctccttcc                          20

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<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

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cacccttcct ccaagtcttt tat                     23

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<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

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gaacccagtg gatgtaacag aac                        23

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<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

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tactgcagag acttagctgg tcc                         23

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acttatagtc ctgcgagtct ggg                         23

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catctccttt gtttcgatag ga                      22

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<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

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cactcagaat tcttacctcc cct                      23

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<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

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<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

<400>38

atccttcttc ctatacttcc ccc                       23

<210>39

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

<400>39

tttaatcagg ccctgtctgc                           20

<210>40

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

<400>40

ggggtataga aatggaatgg aga                       23

<210>41

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

<400>41

ctggaagaag aaggaacagg tct                      23

<210>42

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

<400>42

ggttgctgag attttatctg tgg                      23

<210>43

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

<400>43

caaatgctct gct ttgtact cct                         23

<210>44

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

<400>44

catgaatgag cctgaaatag tcc                          23

<210>45

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

<400>45

cgggaggatt gtaagatact gtg                          23

<210>46

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

<400>46

acttctcatg agttcagcct cag                          23

<210>47

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

<400>47

gtagatgtgg ggacaacaga gag                            23

<210>48

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

<400>48

tttaaagtca ccttaggttg ggg                            23

<210>49

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

<400>49

gtttttgtgg ggactaagag tg                              22

<210>50

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

<400>50

ggaggaagta gctagaagct aag                        23

<210>51

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

<400>51

cttttcccac aagaaccatt tc                        22

<210>52

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

<400>52

ctggtgtaat cagacaccac gta                       23

<210>53

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

<400>53

ctcatctgta ccctcactgg gat                       23

<210>54

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

<400>54

ctaaagtctc ccagtttccc ct                        22

<210>55

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

<400>55

aagccagaga gcctttcctc                          20

<210>56

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

<400>56

cggtattctt aacacatctt gcc                      23

<210>57

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

<400>57

acctaacgtt tgtgccttat gtg                       23

<210>58

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

<400>58

aggttggaag atccatttcc tt                        22

<210>59

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

<400>59

cttgggtctg taacaaagca ttc                        23

<210>60

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

<400>60

aaggattatg aggaggttgg tgt                        23

<210>61

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

<400>61

ttagctgtgc tcgcgctact                            20

<210>62

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

<400>62

tcacatggtt cacacggcac                            20

<210>63

<211>29

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

<400>63

cgcggatccc actatgacat cgccccagc                  29

<210>64

<211>30

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

<400>64

ccgctcgagg caaaaaaagt cacagcacgg                30

<210>65

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于PCR的人工合成的引物序列

<400>65

tggtagccaa gtgcaggtta ta                            22

<210>66

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于PCR的人工合成的引物序列

<400>66

ccaaagggtt tctgcagttt ca                            22

<210>67

<211>30

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于PCR的人工合成的引物序列

<400>67

tgcggatcca gagcagattg tactgagagt                    30

<210>68

<211>29

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于PCR的人工合成的引物序列

<400>68

ctctatctcg agtgaggcgg aaagaacca                      29

<210>69

<211>48

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于PCR的人工合成的引物序列

<400>69

tttaagcttg aagaccattt ttggaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaca      48

<210>70

<211>34

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于PCR的人工合成的引物序列

<400>70

tttaagcttg aagacatggg aaagagtggt ctca                      34

<210>71

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸序列

<400>71

caccgaggct gatggcaaga aacttcaaga gagtttcttg ccatcagcct c    51

<210>72

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸序列

<400>72

aaaagaggct gatggcaaga aactctcttg aagtttcttg ccatcagcct c    51

<210>73

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸序列

<400>73

caccgagatg aatctcacgg aatttcaaga gaattccgtg agattcatct c    51

<210>74

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸序列

<400>74

aaaagagatg aatctcacgg aattctcttg aaattccgtg agattcatct c    51

<210>75

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸序列

<400>75

caccgtagga cacttcttat tcgttcaaga gacgaataag aagtgtccta c    51

<210>76

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸序列

<400>76

aaaagtagga cacttcttat tcgtctcttg aacgaataag aagtgtccta c    51

<210>77

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸序列

<400>77

caccgtgatg cattgttcct tcattcaaga gatgaaggaa caatgcatca c    51

<210>78

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸序列

<400>78

aaaagtgatg cattgttcct tcatctcttg aatgaaggaa caatgcatca c    51

<210>79

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸序列

<400>79

caccgcttgg ctgtagatat ctcttcaaga gagagatatc tacagccaag c    51

<210>80

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸序列

<400>80

aaaagcttgg ctgtagatat ctctctcttg aagagatatc tacagccaag c    51

<210>81

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸序列

<400>81

caccgaagca gcacgacttc ttcttcaaga gagaagaagt cgtgctgctt c    51

<210>82

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸序列

<400>82

aaaagaagca gcacgacttc ttctctcttg aagaagaagt cgtgctgctt c    51

<210>83

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸序列

<400>83

caccgtgcgc tgct ggtgcc aactctcttg aagttggcac cagcagcgca c    51

<210>84

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸序列

<400>84

aaaagtgcgc tgctggtgcc aacttcaaga gagttggcac cagcagcgca c    51

<210>85

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>siRNA的靶序列

<400>85

gtaggacact tcttattcg                                        19

<210>86

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>siRNA的靶序列

<400>86

gtgatgcatt gttccttca                                        19

Claims (35)

1.一种诊断受试者的TS或TS发病诱因的方法，包括测定来自患者的生物学样品中TS-相关性基因表达水平的步骤，其中与所述基因的正常对照水平相比所述的水平升高或降低表明所述受试者患有TS或者存在TS发病风险。

2.权利要求1的方法，其中所述的TS-相关性基因选自TS 1-346，且与正常对照水平相比水平升高表明该受试者患有TS或者存在TS发病风险。

3.权利要求2的方法，其中所述的升高是比所述的正常对照水平高至少10％。

4.权利要求1的方法，其中所述的TS-相关性基因选自TS 347-939，且与正常对照水平相比水平降低表明该受试者患有TS或者存在形成TS的风险。

5.权利要求4的方法，其中所述的降低是比所述的正常对照水平低至少10％。

6.权利要求1的方法，其中所述的方法还包括测定多个TS-相关性基因的表达水平的步骤。

7.权利要求1的方法，其中通过选自如下的任一方法测定表达水平：

(a)检测TS-相关性基因的mRNA，

(b)检测TS-相关性基因编码的蛋白质，和

(c)检测TS-相关性基因编码的蛋白质的生物学活性。

8.权利要求1的方法，其中通过检测TS-相关性基因探针与所述来自患者的生物学样品的基因转录产物的杂交测定所述的表达水平。

9.权利要求8的方法，其中所述的杂交步骤在DNA阵列上进行。

10.权利要求1的方法，其中所述的生物学样品包含上皮细胞。

11.权利要求1的方法，其中所述的生物学样品包含TS细胞。

12.权利要求8的方法，其中所述的生物学样品包含来自TS的上皮细胞。

13.一种TS参照表达谱，它含有选自TS 1-939中的两个或两个以上基因的基因表达谱。

14.一种TS参照表达谱，它含有选自TS 1-346中的两个或两个以上基因的基因表达谱。

15.一种TS参照表达谱，它含有选自TS 347-939中的两个或两个以上基因的基因表达谱。

16.一种筛选用于治疗或预防TS的化合物的方法，所述的方法包括下列步骤：

a)使试验化合物与TS 1-939编码的多肽接触；

b)检测多肽与试验化合物之间的结合活性；和

c)选择与多肽结合的化合物。

17.一种筛选用于治疗或预防TS的化合物的方法，所述的方法包括下列步骤：

a)使候选化合物与表达一种或多种标记基因的细胞接触，其中一种或多种标记基因选自TS 1-939；和

b)选择降低选自TS 1-346的一种或多种标记基因的表达水平，或者升高选自TS 347-939的一种或多种标记基因的表达水平的化合物。

18.一种筛选用于治疗或预防TS的化合物的方法，所述的方法包括下列步骤：

a)使试验化合物与选自TS 1-939的基因编码的多肽接触；

b)检测步骤(a)的多肽的生物学活性；和

c)选择与不存在该试验化合物时检测的生物学活性相比，抑制TS1-346编码的多肽的生物学活性、或者与不存在该试验化合物时检测的生物学活性相比增强TS 347-939编码的多肽的生物学活性的化合物。

19.权利要求17的方法，其中所述的试验细胞包含睾丸精原细胞瘤细胞。

20.一种筛选用于治疗或预防TS的化合物的方法，所述的方法包括下列步骤：

a)使候选化合物与细胞接触，该细胞导入了含有一种或多种标记基因的转录调控区和在该转录调控区控制下表达的报道基因的载体，其中一种或多种标记基因选自TS 1-939；

b)测定所述报道基因的活性；和

c)与对照相比较，当所述标记基因是选自TS 1-346的上调标记基因时，选择降低所述报道基因的表达水平的化合物；或者当所述标记基因是选自TS 347-939的下调标记基因时，选择增强所述报道基因的表达水平的化合物。

21.试剂盒，包含其中包含与选自TS 1-939的两个或多个核酸序列结合的检测试剂。

22.阵列，包含与选自TS 1-939的两个或多个核酸序列结合的核酸。

23.一种治疗或预防受试者TS的方法，包括给所述的受试者施用反义组合物的步骤，所述的组合物包含与选自TS 1-346的编码序列互补的核苷酸序列。

24.一种治疗或预防受试者TS的方法，包括给所述的受试者施用siRNA组合物的步骤，其中所述的组合物降低选自TS 1-346的核酸序列的表达。

25.权利要求24的方法，其中所述的siRNA包含作为靶序列的核苷酸序列SEQ ID NO：85或86。

26.一种治疗或预防受试者TS的方法，包括给所述的受试者施用药用有效量的与选自TS 1-346的任一基因编码的蛋白质结合的抗体或其片段。

27.一种治疗或预防受试者TS的方法，包括给所述的受试者施用一种疫苗，该疫苗含有由选自TS 1-346的核酸编码的多肽或所述多肽的免疫学活性片段，或者编码该多肽的多核苷酸。

28.一种治疗或预防受试者TS的方法，包括给所述的受试者施用增强TS347-939的表达或活性的化合物的步骤。

29.一种治疗或预防受试者TS的方法，所述方法包括施用按照权利要求16-20任一项的方法获得的化合物的步骤。

30.一种治疗或预防受试者TS的方法，包括给所述的受试者施用药用有效量的选自TS 347-939的多核苷酸或其编码的多肽的步骤。

31.一种用于治疗或预防TS的组合物，所述组合物包含药用有效量的针对选自TS 1-346的多核苷酸的反义多核苷酸或小干扰RNA。

32.权利要求31的组合物，其中所述的小干扰RNA包含作为靶序列的核苷酸序列SEQ ID NO：85或86。

33.一种用于治疗或预防TS的组合物，所述组合物包含药用有效量的与选自TS 1-346的任一基因编码的蛋白质结合的抗体或其片段。

34.一种用于治疗或预防TS的组合物，所述组合物包含活性成份和可药用载体，所述活性成分是药用有效量的用权利要求16-20任一项的方法选出的化合物。

35.一种小干扰RNA，其有义链包含核苷酸序列SEQ ID NO：85或86。

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