CN113684274B - 用于恶性女性生殖细胞肿瘤诊断和治疗试剂盒 - Google Patents

用于恶性女性生殖细胞肿瘤诊断和治疗试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于女性恶性生殖细胞肿瘤诊断和治疗试剂盒，所述试剂盒包括OVOL2表达水平的检测试剂以及用于化疗的顺铂药物。通过采用本发明用于女性恶性生殖细胞肿瘤诊断和治疗试剂盒，有助于提早预测女性恶性生殖细胞肿瘤对顺铂化疗的敏感程度，从而优化治疗方案，减少不必要的化疗，提高患者生活质量的同时改善患者的预后。

Description

用于恶性女性生殖细胞肿瘤诊断和治疗试剂盒
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于女性恶性生殖细胞肿瘤诊断和治 疗试剂盒及其应用。
背景技术
卵黄囊瘤(YSTs)是卵巢恶性生殖细胞肿瘤(MOGCTs)常见的组织学亚型，多见 于青少年和年轻女性，甲胎蛋白(AFP)是其较为特异的肿瘤标志物。绝大多数YSTs在 组织形态上表现出原始的胚外结构和网状微囊结构，这是最常见的诊断性特征。由于 Schiller-Duval小体的形态与小鼠胎盘中的内胚窦相似，因此YSTs也被称为内胚窦瘤。与 其他MOGCTs相似，YSTs的标准治疗是手术和以顺铂为基础的化疗。尽管＞80％的 MOGCTs患者经正规治疗后可得以长期生存，但与其他组织学亚型相比，YSTs患者的预 后相对较差。一旦复发，治疗十分棘手，即使经过手术和挽救性化疗，仍有超过50％的 复发患者死于疾病进展。化疗耐药是复发难治的主要原因。因此，阐明YSTs化疗耐药相 关的分子机制在临床上具有十分重要的意义。
目前，在分子水平上对YSTs的理解非常有限，并且主要来源于对睾丸生殖细胞肿瘤 (TGCTs)的研究。MOGCTs和TGCTs均来源于原始生殖细胞，并具有相似的发病年龄、 组织学亚型和治疗方案。TGCTs的分子特征包括低体细胞突变率和高体细胞拷贝数改变(SCNAs)。KIT和KRAS是两个最常见的突变基因。与几乎所有其他实体瘤不同，TP53 突变在TGCTs中很少见，完整的p53通路被认为是化疗敏感性的重要机制，在DNA损 伤时可迅速诱导凋亡反应。但是，YSTs具有一些不同于其他MOGCTs和TGCTs的特定 分子特征。例如，与无性细胞瘤和GCTs相比，YSTs中参与WNT/β-catenin和TGF-β/BMP 通路的基因高表达。尽管近年来有众多癌症基因组学特征的研究，但YSTs的基因组特征、 肿瘤演化模式以及与化疗抗性相关的机制在很大程度上仍是未知的，从而影响了用于研 发新的诊断、治疗策略的进程。
发明内容
基于上述现有技术的状况，发明人尝试阐明与YST对化疗抗性相关的分子机制，从而提供一种有助于得到提高对于顺铂化疗的敏感性的试剂盒。为了实现本发明的发明目的，拟采用如下技术方案：
本发明一方面涉及用于女性恶性生殖细胞肿瘤诊断和治疗试剂盒，所述试剂盒包括 OVOL2表达水平的检测试剂以及用于化疗的顺铂药物。
OVOL2(NCBI RefSeq ID：NM_021220.4；Ensembl Gene ID：ENSG00000125850；Ensembl Transcript ID：ENST00000278780.7)是Ovo基因家族中的一员，编码进化上保守的锌指转录因子，在胚胎发育和肿瘤进展过程中发挥重要作用。OVOL2调控血管生成、 颅神经管及心脏的形成，其典型的编码序列如SEQ ID NO.1所示。同时，OVOL2参与调 控上皮间充质转化(EMT)，维持细胞的上皮表型。已有研究表明，在结直肠癌、乳腺癌、 肺腺癌中，当OVOL2在肿瘤细胞中表达下降时，促进细胞向间质表型转化，进而促进肿 瘤进展，且OVOL2蛋白表达水平与患者预后相关。
本发明的另一方面，还涉及试剂盒在提早诊断女性恶性生殖细胞肿瘤患者对顺铂敏 感性的试剂中的应用，所述的试剂盒包括OVOL2表达水平的检测试剂。
本发明发现，与化疗敏感肿瘤相比，OVOL2基因在复发化疗耐药肿瘤中表达显著升高，并且OVOL2的高表达与不同的肿瘤细胞系中顺铂抗性相关。因此，如果在采用顺铂 化疗之前采用OVOL2表达水平的检测试剂检测肿瘤组织中OVOL2表达水平，则有助于 提早预测患者对于顺铂化疗的敏感性。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的试剂盒中还包括OVOL2基因敲除试剂和/或OVOL2基因沉默试剂；优选的，所述的OVOL2基因敲除试剂和/或OVOL2基因沉默 试剂为小干扰RNA。通过OVOL2基因敲除试剂或者和/或OVOL2基因沉默试剂，抑制患 者的OVOL2基因的表达，有助于提高患者对于顺铂化疗的敏感性。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的女性恶性生殖细胞肿瘤是指卵黄囊瘤(YSTs)组织学亚型。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的试剂盒中还包括TP53突变检测试剂。经过 本发明的研究，在所有癌症类型中，YSTs的TP53突变频率较低，而合并性腺发育异常 的YSTs患者的特征是KRAS和TP53以及与性腺发育相关的基因突变。
有益效果
通过采用本发明用于女性恶性生殖细胞肿瘤预测化疗敏感性的诊断和治疗试剂盒， 有助于提早预测女性恶性生殖细胞肿瘤对于顺铂化疗的敏感程度，从而优化治疗方案， 减少不必要的化疗，提高患者生活质量的同时改善患者的预后。
附图说明
图1.研究设计概述和YSTs的肿瘤突变负荷
(A)研究设计。该研究包括来自30位患者的41个YSTs样本。根据对化疗的反应， 将患者分为化疗抗性组(n＝10)和化疗敏感性组(n＝20)。值得注意的是，两名XY单纯性 腺发育不全的YST患者标有男性符号。原发性和复发性肿瘤样品分别标记为黑色和红色点。 (B)初始治疗结束六个月后对化疗敏感性和抗性患者的AFP水平进行统计比较。(C)在 TheCancer Genome Atlas的33种癌症类型的背景下YSTs的TMB分布。YSTs和两种相关的 癌症类型卵巢癌(OV)和睾丸生殖细胞肿瘤(TGCT)以方框突出显示。(D)TSTs的TMB 与诊断时的年龄之间的相关性。(E)原发肿瘤样本与其对应的复发肿瘤样本之间的TMB差 异。对于具有多个复发样本的患者，使用平均TMB值。(F)抗性和敏感性肿瘤样本之间 的微卫星不稳定性(MSI)评分。(C、D、F)仅包括原发肿瘤。在方框图中，方框中的中 线是中间值，方框的底部和顶部是第一和第三四分位数，并且须(whiskers)分别延伸到较 低和较高四分位数的1.5倍四分位数范围。(B、D、E)P值基于two-side Wilcoxon rank-sum tests。
图2.YSTs的突变标记
(A)突变标记W1-W3。使用贝叶斯NMF方法将41个YST肿瘤样品中的突变谱分解 为不同的突变标记。每个碱基被相邻的5′和3′侧核苷酸进一步分层。(B)每个肿瘤样品中每个标记的相对贡献。(C)对化疗敏感的原发性、化疗抗性的原发性和复发性样本中每个突变标记的比较。基于Kruskal-Wallistest计算P值。方框中的中线是中位数，方框的底部和顶部 是第一和第三四分位数，并且须分别延伸到较低和较高四分位数的1.5×四分位数范围。
图3.YSTs原发肿瘤样本中体细胞突变模式
(A)在所有原发肿瘤样本(n＝24)中，YSTs体细胞突变图谱，顶部和右侧的条分别显示了每个肿瘤的突变率和所选基因中突变的组成。两个已知的癌症驱动基因以粗体显示， 并且通过MuSiC2和MutSigCV鉴定了三个新的候选驱动因子基因。(B)YSTs和TCGA中 33种癌症类型中TP53突变频率的比较。(C)YSTs中拷贝数的扩增和缺失，通过GISTIC2 分析，在FDR＝10-3处鉴定到显着扩增的峰(左图)或缺失的峰(右图)。(D)原发肿瘤样 本的肿瘤驱动拷贝数变化频率。
图4.性腺发育异常的YSTs患者的关键驱动基因和克隆进化
(A、D)来自患者P02(A)和P03(D)的原发肿瘤样本中全外显子组测序数据映射 到SRY基因。(B、E)来自P02(B)和P03(E)的原发和复发样本中TP53、KRAS、DMRT1 和KCTD1的等位基因频率。(C、F)患者中获得的驱动基因突变P02(C)和P03(F)的 推定演变的示意图。
图5.一名多次复发患者的肿瘤演变
(A)患者P07在不同诊断时间点的PET-CT断层扫描。(B)来自P07的原发性和三 个复发性肿瘤样品中所有突变的比对。括号中显示用于分析的突变数目。(C)显示肿瘤样 品之间的进化关系的系统树。选择的突变沿谱系显示。(D)对P07的四个肿瘤样本基于LOH 模式构建系统发生树。
图6.化疗敏感的原发性和复发性YST样品之间差异表达的基因
(A)火山图，显示在原发和复发的YST样品中差异表达的基因(倍数变化＞2且FDR＜0.1)。(B)癌症标志性途径中差异基因的富集。(C)药物敏感性和表达水平的相关性分析确定OVOL2为最佳候选基因。(D)OVOL2高表达水平的癌细胞系对顺铂抗性更高(Wilcoxsigned-rank test，p＝4.8×10-8)。(E)OVOL2高表达水平的卵巢癌细胞系对顺铂抗性更高(Wilcox signed-rank test，p＝6.7×10-3)。(D和E)方框中的中线是中位数，方框的底部和顶 部是第一和第三四分位数，并且须分别延伸到较低和较高四分位数的1.5倍四分位数范围。
图7.OVOL2表达对NOY1细胞系对顺铂敏感性的影响
(A)OVOL2蛋白在NOY1和HOSEpiC细胞中的表达。(B)在对照和siRNA敲除细 胞中OVOL2基因的相对mRNA表达水平。(C)不同药物浓度下的药物反应。(D)不同治 疗时间点的药物反应。(E)来自不同顺铂处理的细胞组的代表性流式细胞仪图，显示 Annexin-V和PI阳性凋亡细胞。(F)OVOL2 siRNA敲除对细胞凋亡的影响。(G、H)OVOL2 siRNA敲除对caspase-3和裂解的caspase-3的影响。误差bar表示±SD；*，p＜0.05，**，p ＜0.01，和***，p＜10-3。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行 清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施 例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所 有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买 获得。
实施例1
1实验方法
1.1患者选择和样本队列
本研究中的30名YST患者是从中国北京协和医院招募的。该研究是根据赫尔辛基宣言 进行的，并得到北京协和医院伦理委员会的批准(项目编号：JS-1747)。所有患者在治疗、 本收集和分析之前均应提供书面知情同意书。30名患者的病理特征是由多名独立的高级病 理学家根据标准标准严格评估的。
除P14和P22外，所有YST患者均接受手术治疗，然后进行标准的铂类化疗。由于P14和P22的肿瘤负担非常高，因此如上所述，在开始标准治疗之前先进行化疗。对初始治疗的完全反应被定义为令人满意的手术切除，肿瘤标志物阴性，并且没有影像学证据显示肿块。接受初始治疗并在至少六个月没有任何复发迹象的情况下获得完全缓解的患者被分类为化 疗敏感组。否则，将患者分为化疗抗性组。敏感组中只有三名患者(P21、P24和P25)在标准治疗后六个月后复发，并接受了进一步的减瘤手术，然后进行挽救性化疗。所有三名患者在没有疾病迹象的情况下生活了至少两年。空腹血清AFP水平通过电化学发光测定法(Roche Diagnostics，上海，中国)测量。在化疗抗性组中，两名患者P02(确诊年龄：33岁)和P03 (确诊年龄：18岁)从未月经，被确诊为46，XY纯性腺发育不良。基于全外显子组测序数据，检查了位于Y染色体上的性别决定基因SRY的阅读覆盖率。
1.2全外显子组和RNA-seq数据生成
使用GeneRead DNA FFPE试剂盒(QIAGEN)或
Figure RE-GDA0002639480430000051
FFPE Plus DNA试剂盒(Promega)提取FFPE肿瘤样本的基因组DNA。使用QIAamp DNA Mini试剂盒(QIAGEN) 从新鲜肿瘤样本中提取基因组DNA；使用TGuide Blood Genomic DNA试剂盒(TIANGEN) 提取YST患者的血液样本。然后，使用Covaris试剂盒(Covaris，MA，USA)将0.1-1μg DNA 剪切成200-300bp片段。修复所得的DNA片段并加3'A尾。将接头连接到片段的两端，然 后选择大小。通过聚合酶链反应(PCR)扩增经大小选择的片段。使用SureSelect Human All Exon V6(Agilent)按照制造商的方案进行外显子组捕获，然后进行PCR扩增。使用KAPA 文库定量试剂盒(Kapa Biosystems,MA,USA)制备文库。经验证的DNA文库通过Illumina XTEN或NovaSeq 6000进行测序。对于RNA测序，使用Trizol方法提取了来自10位YST 患者的12个新鲜冷冻样本的总RNA。对于每个样本，使用NEBNext Ultra II RNA文库制备 试剂盒(Illumina，USA)使用1μg总RNA生成文库。该文库经由Illumina NovaSeq 6000 测序，每个样本平均产生2800万个2×150bp配对末端读数。
1.3体细胞突变率和突变特征分析
修整全外显子组测序读取对，仅保留了N碱基＜3％的读取对和50％以上的高质量碱基 用于后续分析。使用Burrows-WheelerAligner(0.7.17)将所得的高质量读段与人类参考基因 组(Homo_sapiens_assembly19)进行比对。为了提高比对准确性，使用GenomeAnalysis Toolkit (版本3.8.1)处理BAM文件，包括标记重复项以及围绕高置信度插入和删除进行局部重新 比对。基于约7,000个高频SNP位点，使用BAM-matcher，确认匹配的原发肿瘤、复发性肿 瘤和正常样本的确来自同一患者(相同的基因型≥80％)。此外，还用另一个工具 NGSCheckMate进一步证实了这一点。为了准确地调用体细胞突变，使用了TCGA MC3 project开发的变量调用管道(variant calling pipeline)。简而言之，该管道使用六个调用者来 调用取代突变，并使用三个调用者来识别小插入缺失突变，并带有详细的注释。仅保留至少 两个调用者支持的取代突变和插入缺失突变，以进行进一步分析。为了比较YST与其他癌 症类型的突变率，使用了来自33种癌症类型的9，125个样本的突变数据集，这些样本已使 用相同的TGCA MC3管道进行了分析。为了计算TMB，仅使用了错义/无义突变或ORF移 位突变。
突变特征发现是由基于NMF贝叶斯变体的SignatureAnalyzer进行的。使用所有41个样 本的突变数据，重复了100次分析，发现在＞85％的分析中，突变谱被分解为四个突变特征。 为了比较突变特征，将所有YST样本分为三组：原发性化疗敏感性、原发性化疗抗性和复 发性。使用Kruskal-Wallis test来检测三组之间突变特征的贡献差异。根据mSINGS软件包 中的2539个位点，使用MANTIS调用了每个肿瘤的MSI状态。
1.4鉴定明显突变的基因
使用MuSiC2并使用原发样本(不包括两名患有性腺发育不良的患者，P02和P03)来鉴定显著突变的基因(FDR＜0.2)。在20个SMGs中，在先前的研究中鉴定出两个癌基因。 为了鉴定YST特异性新驱动因子，使用MutSigCV进一步确认了其余18个候选的SMG显 著性。Mafttools用于生成所选基因的瀑布图。TP53的突变频率比较基于使用同一MC3管道 的TCGA数据，并且仅保留导致氨基酸变化或移码的突变(SNVs和插入缺失突变)进行此 分析。
1.5体细胞拷贝数改变分析
基于YST肿瘤样本(不包括来自性腺发育不良患者的样本)的大量分割数据，与突变 分析同时进行了SCNA分析。鉴于配对的肿瘤-正常全基因组测序数据，首先使用具有默认 参数的CNVkit(v0.9.3)确定了SCNA。然后，基于相应的分割值，使用GISTIC2来识别具有统计学上显著的拷贝数变化频率的区域。为了确定潜在的SCNA驱动因子，使用了由GISTIC2生成的all_thresholded.by_genes.txt文件，该文件同时应用了低水平(截止值+/-1) 和高水平(截止值+/-2)阈值来定义基因水平SCNAs。集中研究了一组已知基因，这些基 因由先前定义的频繁扩增的癌基因或缺失的肿瘤抑制基因组成。并且仅将高水平(+/-2) SCNAs视为扩增/删除。为了比较原发性和复发性样本之间的模式，对所有肿瘤样本进行了 相似性分析，除了两名患有性腺发育不良患者的四个样本。
1.6克隆结构分析
为了探讨两名性腺发育不良患者的肿瘤克隆进化，使用sciClone推断了克隆结构的动态 变化。根据如上所述的CNVkit v0.9.3的分段输出，将高置信度SCNAs定义为分段值(log2)＞ 0.5或＜-0.5的那些，并从克隆分析中排除。
1.7系统发育树的构建
为了构建来自同一患者的多个肿瘤样本之间的进化关系，基于来自至少一个肿瘤样本中 被识别为错义突变的所有位点的核苷酸，使用MEGA7进行了最大简约分析。进行了自展检 验(1000次)以估计内部节点的统计置信度。
1.8 RNA-seq数据分析
使用TopHat2通过cufflinks(v2.2.1)将RNA-seq读数与参考值和量化的基因表达水平 进行比对。为了鉴定原发性(敏感)和复发性(抗性)肿瘤样本之间差异表达的基因，使用 符合以下标准的DESeq2：绝对倍数变化＞2且FDR＜0.1(原始p值＜9×10-4)。由Rpackage 生成了一个火山图(EnhancedVolcano)。为了鉴定可能导致化疗抗性的基因，从DepMap (https://depmap.org)获得了癌细胞系的顺铂敏感性和基因表达数据。对于上面鉴定的153 个差异表达基因中的每一个，使用Spearman等级相关性评估了其表达水平与顺铂敏感性的 相关性。
1.9细胞培养与处理
人卵黄囊肿瘤细胞系(NOY1)购自名古屋大学(日本名古屋)的实验室。在含有10％胎牛血清(FBS；Hyclone，美国)、青霉素(100单位/mL)、链霉素(100mg/mL)(Gibco， USA)的和2mM谷氨酰胺的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基(美国康 宁)中培养NOY1细胞。人卵巢表面上皮细胞(HOSEpiC)购自北京协和医学院基础所细 胞中心，并在含有10％胎牛血清、青霉素(100单位/mL)和链霉素(100mg/mL)和2mM 谷氨酰胺的Dulbecco′s Modified Eagle培养基(DMEM；美国康宁)中生长。将所有细胞在 37℃下保持在合有5％CO2的潮湿气氛中。
1.10 siRNA的瞬时转染
为了敲除NOY1细胞系中的OVOL2，使用RNAimax试剂(Invitrogen，目录号13778150) 按照制造商的说明瞬时转染NOY1。简而言之，3×105 NOY1细胞在6孔板中生长，并用 OVOL2-siRNA转染6h。转染后，通过RT-PCR验证敲除效率。
1.11细胞活力测定
根据生产商的规程，使用CellTiter-Glo One Solution Assay(Promega，USA)检测培养 物中活细胞的数量。简而言之，在siRNA转染后24小时，将5×103 NOY1细胞接种到96 孔板中，使其生长过夜，然后进行顺铂处理。在指定的处理时间结束时，除去培养上清液， 并在每孔加入100μL
Figure RE-GDA0002639480430000081
(
Figure RE-GDA0002639480430000082
底物溶解在
Figure RE-GDA0002639480430000083
缓冲液中) 之前用PBS洗涤细胞一次。加入试剂30分钟后记录发光数据。
1.12流式细胞仪分析
通过对Annexin-V-APC(BD Biosciences，USA)和碘化丙锭(PI，Biolegend，USA)染色检测NOY1细胞程序化死亡。顺铂处理后，使用胰蛋白酶消化液(无EDTA，Solarbio， 中国)收集NOY1细胞，并在黑暗中与APC Annexin-V和PI在室温下孵育15分钟。将染 色的细胞用PBS洗涤一次，重悬于200μl 1x结合缓冲液中，并在流式细胞仪(BD Biosciences， CA，USA)中进行分析。
1.13总RNA的分离和RT-qPCR
siRNA转染后，使用Trizol试剂(TaKaRa，日本)提取NOY1总RNA。使用逆转录试 剂盒(TaKaRa)将1μg RNA反转录为cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa) 在CFX96实时系统(Bio-Rad，USA)中扩增cDNA。使用2-ΔΔCT法计算OVOL2的相对 mRNA表达，并标准化为内源性β-肌动蛋白表达。使用了以下引物：OVOL2，正向引物， 5′-ACAGGCATTCGTCCCTACAAA-3′，反向引物，5′-CGCTGCTTATAGGCATACTGC-3′； β-肌动蛋白，正向引物，5′-GAGAAAATCTGGCACCACACC-3′，反向引物，5′- GGATAGCACAGCCTGGATAGCAA-3′。
1.14蛋白质印迹分析
顺铂处理后，将NOY1细胞在合有蛋白酶抑制剂混合物(Roche DiagnosticsCorp.)的 RIPA缓冲液(Beyotime公司，中国)中溶解，并在4℃以15,000g离心25分钟。收集上清 液，并按照制造商的说明使用BCA蛋白测定试剂盒(Beyotime，中国)进行定量。然后将20μg总蛋白上样并在SDS-PAGE凝胶上分离，然后转移到NC膜上。将膜与之后的一抗一 起孵育：caspase-3(Cell Signaling Technology(CST)，9662)、剪切的caspase-3(CST，9664)、OVOL2(Abcam，ab 69469)和β-肌动蛋白(1∶1000，Sigma-Aldrich，A5441)。TBST 洗涤后，应用适当的二抗：与辣根过氧化物酶(1∶3000，Abcam，ab6721)结合的抗兔和 与辣根过氧化物酶(1∶3000，Abcam，ab6728)结合的抗小鼠。使用蛋白质印迹检测系统 (Bio-Rad，USA)将蛋白条带可视化。所有实验至少重复三遍。
1.15统计分析
对于细胞实验，使用GraphPad Prism 5.0进行统计分析和作图。数据通过单因素方差分 析进行分析，P＜0.05被认为具有统计学意义。
2.结果与讨论
2.1体细胞突变率和微卫星稳定状态
为了表征YSTs的基因组特征，我们对30例YST患者的4１例肿瘤样本(包括配对外周血)行全外显子测序，包括26个原发性YST样本和15个复发性YST样本(4名患者没有 原发性样本，7名患者既有原发性样本又有复发性样本，其中1名具有多个复发性样本，图 1A、表1)。大多数患者接受了标准治疗，即手术后进行基于顺铂的化疗。根据初始治疗后 六个月内是否复发，将30名入选患者分为化疗敏感性(n＝20)和化疗抗性(n＝10)组(图 1A)。AFP是用于YSTs诊断和治疗评估的标准肿瘤标志物，发现在初始治疗六个月后，化 疗抗性组的AFP水平明显高于敏感组(t test，p＝3.2×10-4，图1B)，进一步证实了响应组分 类。
表1病人信息
Sample ID Sample type Sample site Age Sex Staqe(FlGO) Chemotherapy response
P01-P Primary Ovary 16 F I S
P02-P Primary Gonad 33 M III R
P02-R Relapse Pelvic cavity 33 M III R
P03-P Primary Gonad 18 M || R
P03-R Relapse Pelvic cavitv 18 M || R
P04-P Primary Ovary 19 F I R
P04-R Relapse Pelvic cavity 19 F I R
P05-P Primary Ovary 27 F IV R
P05-R Relapse Pelvic cavitv 27 F IV R
P06-P Primary Ovary 33 F || S
P07-P Primary Ovary 20 F III R
P07-R1 Relapse1 Transverse colon 20 F III R
P07-R2 Relapse2 Spleen 20 F III R
P07-R3 Relapse3 Pelvic cavity 20 F III R
P08-R1 Relapse1 Ascending colon 29 F III R
P08-R2 Relapse2 Ascending colon 29 F III R
P09-P Primary Ovary 14 F IV S
P10-P Primary Ovary 25 F IV S
P11-P Primary Ovary 27 F I R
P11-R Relapse Pelvic cavity 27 F I R
P12-P Primary Ovary 29 F III S
P13-P Primary Vagina 29 F I S
P14-P Primary Ovary 39 F III S
P15-P Primary Ovary 15 F || S
P16-R Relapse Pelvic cavity 28 F I R
P17-P Primary Ovary 24 F I S
P18-P Primary Ovary 21 F I S
P19-R1 Relapse1 Instestine 24 F III R
P19-R2 Relapse2 Stomach 24 F III R
P20-P Primary Ovary 23 F I S
P21-R Relapse Lung 27 F III S
P22-P Primary Ovary 3 F IV S
P23-P Primary Ovary 36 F III R
P23-R Relapse Pelvic cavity 36 F III R
P24-P Primary Ovary 29 F III S
P25-P Primary Ovary 24 F III S
P26-P Primary Ovary 27 F I S
P27-P Primary Ovary 13 F I S
P28-P Primary Ovary 8 F I S
P29-P Primary Ovary 19 F I S
P30-P Primary Ovary 17 F III S
基于全外显子组测序数据(平均测序深度：肿瘤243×，正常139×)，采用了multiple-caller-based MC3方法来鉴定单核苷酸变异(SNV)和小插入缺失突变。MC3方法比单个调用更准确，并且最近被用于以一致的方式生成含33种癌症类型的高质量TheCancer Genome Atlas(TCGA)突变数据。在30例患者的41个YST样本中，确定了平均878个SNV (范围：244-5，326)和36个插入缺失突变(范围：13-92)。与其他癌症类型相比，YSTs表现出中等水平的肿瘤突变负担(TMB)，显著低于卵巢癌(OV)非常相似(Wilcoxon rank-sumtest，p＝04.2×10-4)，但显著高于TGCT或者是其亚型(Wilcoxon rank-sum test，TGCTvs.YST p＜4.2×10-10，TGCT_non-seminoma vs.YST：p＝5.5×10-10；TGCT_seminomavs.YST： p＝3.8×10-10)(图1C)。发现TMB水平与诊断时的年龄呈显著正相关(Spearman′srank test， p＝0.001，图1D)，大概反映了随着时间推移的突变积累效应。还检查了TMB与化疗反应的 相关性，发现化疗敏感组性和化疗抗性组之间无显著差异。与匹配的原发肿瘤相比，复发肿 瘤的TMB更高(paired Wilcoxon rank-sum test，p＝0.005，图1E)，这些可能是由于化疗药引 起的。最后，使用MANTIS检查了26个主要YSTs中的微卫星不稳定性(MSI)分数的分 布。有趣的是，发现抗药性组的MSI评分显著高于敏感组(Wilcoxon rank-sumtest，p＝0.03， 图1F)。由于已将MSI高水平确定为结肠癌化疗抗性的生物标志物，因此结果表明MSI状 况也可作为YST患者对化疗抗性的预测标志物。
2.2突变特征
肿瘤的突变特征为癌症基因组上潜在的突变过程提供了有价值的信息。因此，表征了所 有原发肿瘤样本中六个碱基取代的突变谱(图2A)，并将其与TGCT和OV的突变谱进行了 比较，发现YSTs的C＞A/G＞T突变较少，但有较多T＞C/A＞G突变。为了研究YSTs的突变 特征，使用Signature Analyzer(一种广泛使用的基于贝叶斯非负矩阵分解算法的突变特征分 析工具)分解了突变谱，并确定了四个特征W1、W2和W3(图2B)。余弦相似度分析表明， W1、W3很大程度上分别对应于带注释的Sanger特征23(0.74)和特征26(0.77)，W2是 特征6(0.86)和特征1(0.76)的混合。
为了检查这四个突变特征的潜在临床效用，接下来检查了它们在三个YST样本组之间 的占比：敏感的原发性肿瘤、耐性原发性肿瘤和复发性肿瘤(图2C)。特征W1在复发性肿 瘤中的贡献远高于原发性肿瘤(Kruskal-Wallis test，p＝1.4×10-5)，并且在原发性肿瘤中，其 在敏感肿瘤中的贡献显著高于耐性肿瘤(Wilcoxon rank-sum test，p＝0.035)。W3特征显示 出从敏感的原发性肿瘤、耐性原发性肿瘤到复发性肿瘤的明显下降趋势(Kruskal-Wallis test， p＝2.1×10-3)(图2C)。这些不同的模式表明，YST突变特征也有助于预测肿瘤反应。
2.3显著突变的基因和体细胞拷贝数变化
为了研究YST中的突变驱动因子基因，使用MuSiC2基于相对于背景预期观察到的突 变频率来识别明显突变的基因(SMG)。包括来自正常性腺发育患者的24个原发性YST样本用于此分析(该分析排除了两个来自性腺发育不良患者的原发性肿瘤样本，并单独进行了 分析)。在鉴定的前16名SMGs中(FDR＜0.2，表2)，KRAS和KIT是TGCT和许多癌症类 型的已知驱动因素(图3A)。在其余14个SMGs中，ZNF708、NPAS1和FRG1的重要性已 通过另一种工具MutSigCV证实，这表明它们是新颖的驱动因子。有趣的是，最著名的癌症 基因TP53在所有这些YST样本中均未发生突变，这与TP53在其他癌症类型(尤其是卵巢 癌)中的高突变频率形成鲜明对比，后者在33个TCGA癌症类型中具有第二高频TP53突 变(图3B)。此外，比较了匹配的原发性和复发性肿瘤之间的已知癌症基因的突变模式，发 现复发性肿瘤获得了更多的突变，这些突变可能是导致治疗复发性肿瘤复杂性的因素。
表2显著突变的基因
Figure BDA0002497160430000121
为了识别潜在的SCNA驱动因子，首先使用CNVkit根据24个原发肿瘤和正常样本对执行SCNA分割，然后使用GISTIC2识别出明显的SCNA峰。检测到18个扩增峰和15个 缺失峰(FDR＝10-3，图3C)。着眼于一套完善的SCNA驱动因子基因，发现ARID1A和PARK2 是最频繁缺失的基因，而ZNF217、CDKN1B和KRAS是最频繁的扩增基因(图3D)。比较 匹配的原发性和复发性肿瘤，发现SCNA驱动因子基因被频繁获得或丢失。这些结果为YSTs 中的SCNA景观提供了一个全局视图。
2.4性腺发育不良患者YSTs的突变模式
在研究组中确定了两名YST患者(即P02和P03)，他们被诊断为46位XY单纯性腺 发育不良。这些患者在诊断时患有性腺发育不良和恶性YST(诊断时年龄：P02，33；P03， 18)。两名患者均具有女性外生殖器和原始子宫。基于WES数据，确实检测到大量可作图到 Y染色体相关的雄性特异性性别决定基因SRY(图4A，4D)的读码，证实了Y染色体结构。 因此，针对这两名患者的肿瘤样本进行详细研究。令人惊讶的是，两名患者的肿瘤在KRAS 和TP53中均具有双重突变(P02，TP53 p.C176Y和p.G262D，KRAS p.P34L，图4B；P03， TP53 p.I225T和KRAS p.Q61R，图4E)。相比之下，在9，125例TCGA患者中，只有2.3％(9，125个中的208个)同时发生TP53和KRAS突变，这表明YST患有性腺发育不良的患 者倾向于富含TP53和KRAS双重突变(Fisher’s exact test，p＝5.3×10-4)。此外，注意到P02 肿瘤在性别决定基因DMRT1中具有高度有害的移码突变(图4B)，并且P03肿瘤拥有KCTD1 基因突变，KCTD1与头皮-耳-乳头综合症有关，该综合症的患者经常表现出与性别有关的畸 变，例如乳头不良或缺失，以及乳房组织缺失(图4E)。与原发性肿瘤相比，这些基因的突 变等位基因频率在复发性肿瘤中更低(paired test，图4B、4E)。这些结果首次描述了性腺异 常发育患者的肿瘤分子特征，并表明经典癌症驱动因子和性别特异性基因双重突变可能在这 一特殊患者群体的肿瘤进化中起重要作用。(图4C、4F)。
2.5具有多重复发样本的YST的演化
为了探索YST中转移途径的演化，我们将重点放在患者P07上，该患者具有一个原发 性(P07-P)和三个复发性肿瘤样本(P07-R1、P07-R2和P07-R3)。该患者在第一次手术后9个月就发现了横结肠转移灶(P07-R1)，七个月后又发现了另外两个转移灶：一个位于脾脏(P07-R2)，另一个位于骨盆腔(P07-R3)(图5A)。对突变重叠的分析表明，在四个肿瘤 样本之间仅共享少数突变(图5B)。两种独立的系统发生方法分析产生一致结论，即后期转 移样本(P07-R2与P07-R3)来自原发肿瘤(P07-P)，而早期转移样本(P07-R1)为独立于 原发肿瘤(P07-P)独立演化。系统发育分析(图5C)表明，早期转移样本(P07-R1)源自 原发性肿瘤(P07-P)，而晚期转移样本(P07-R2和P07-R3)显示出相对于原发性肿瘤(P07-P) 而言独立的演化路径。P07-R1在MUC16、BCLAF1、PDGFRA和PTCH1中获得了突变，而 P7-R2在KMT2C、CSMD3、NTRK1、ERBB4中获得了突变，而P7-R3在ITK和TERT中获 得了突变。进一步实验杂合度丢失分析的方法推测样本间的演化关系表明，四个肿瘤样本中， 除P07-R1外，均表现出全基因组范围的杂合度丢失。这些结果表明，YST的进化模式可能 比传统的线性进程即原发性-＞早期转移-＞晚期转移更为复杂。
2.7 OVOL2过表达在化疗抗性中的作用
为了更全面地寻找与YSTs的化疗抗性相关的分子机制，我们对12例YST样本(3个敏感的原发肿瘤和9个复发性肿瘤)行全转录组测序。通过比较化疗敏感样本和复发样本之间的基因表达谱，确定了153个表达差异显著的基因(倍数变化＞2和FDR＜0.1；上调：136；下调：17)(图6A)。这些差异基因富含于KRAS信号传导、胰腺β细胞和胆汁酸代谢(图 6B)。为了进一步明确与顺铂抗性相关的基因，使用癌细胞系的药物敏感性数据将这些差异 基因的表达水平与对顺铂(YST患者的化疗标准)的抗性互相关联(图6C)。发现OVOL2 是最佳候选者。该基因在复发性肿瘤中显示出比敏感肿瘤中显著更高的表达水平(图6C)， 并且OVOL2的高表达与不同谱系的癌细胞系中的顺铂抗性相关(Wilcoxon rank-sum test， p＝4.8×10-9，图6D)，特别是在卵巢癌细胞系中(Wilcoxon rank-sum test，p＝6.7×10-3，图6E)。这些结果表明，OVOL2的过表达可能与YSTs的化疗抗性机制有关。
接下来，进行了体外实验，以评估OVOL2表达是否影响顺铂敏感性。选择了一个卵巢 卵黄囊肿瘤细胞系(NOY1)，OVOL2该细胞系显示出比正常人卵巢表面上皮细胞系(HOSEpiC)表达升高(图7A)。使用两个独立的小干扰RNA(siRNA)沉默了OVOL2的 表达(图7B)，发现在NOY1中在存在顺铂的情况下，OVOL2的敲除可剂量和时间依赖性 地降低细胞活力(p＜0.01，图7C-D)。此外，在顺铂处理后，OVOL2的沉默使NOY1凋亡 率升高(p＜10-3，图7E、F)。与这些结果一致，在OVOL2-敲除样本中发现了更多的Caspase-3 及其活性片段(Cleaved-Caspase3)(p＜0.05，图7G、H)。这些数据表明，OVOL2敲除可 通过增强细胞凋亡来使NOY1细胞对顺铂敏感。
本研究首次表征了卵巢恶性生殖细胞肿瘤的主要组织学亚型亚型YST的突变图谱。确 定了突变的驱动因子基因候选物，包括已知的驱动因子KRAS和KIT，以及新候选物如ZNF708和FRG1。与其他癌症类型相比，YSTs的TP53突变频率最低。评估临床反应时， MSI和某些突变特征在预测原发肿瘤对化疗的抗性方面可能提供信息。同时，使用RNA测 序来表征原发和复发的YST样本的转录组，并确定OVOL2在顺铂抗性中的潜在作用。总体 而言，这些结果为开发该疾病的新型生物标志物和治疗靶标奠定了基础。
研究还调查了两名性腺发育异常的患者，即46，XY染色体组型。与其他YST患者相对， 他们的肿瘤以KRAS和TP53双重突变为特征，这是一种罕见的模式。有性发育障碍的人患 生殖细胞肿瘤的风险增加，但是这种癌症患者在该领域尚未得到研究。考虑到它们独特的分 子畸变，结果突出表明需要为这一特殊的癌症患者群体开发替代治疗策略。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此 公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。
序列表
<110> 普瑞基准生物医药（苏州）有限公司
<120> 用于恶性女性生殖细胞肿瘤诊断和治疗试剂盒
<130> CP20227
<141> 2020-05-18
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1583
<212> DNA/RNA
<213> Human
<400> 1
aagtttcctg gtgccttttc tattccacct tatgaaactt tttccccggc gtggtctcac 60
tcgcgattta aggcataggt gtcgccgagc cgggaggctg ggagtcgcca ggcgtgcggg 120
ggagaggcct gggccgcgcc gcggcggggg gtggaggaag agggcaggcg aggcgggaag 180
gtgggctctg gccgccggga gccggggacg gagccgccgc cgttgcccct agcggggagc 240
agccgggagg agggggccgc agtcgggaga ggggacccca ccatgcccaa agtcttcctg 300
gtgaagagga ggagcctggg ggtctcggtc cgcagctggg atgagctccc ggatgagaaa 360
agggcagaca cctacatccc agtgggccta ggccgcctgc tccacgaccc ccccgaggac 420
tgccgcagcg acggcggcag cagcagcggc agcggcagca gcagcgcggg ggagcctgga 480
ggagcagaga gcagctcgtc cccgcacgcc cccgagagcg aaacccccga gcccggcgac 540
gccgagggcc ccgatggaca cctggcgacc aagcagcgcc cggtcgccag atcgaaaatc 600
aagttcacca caggcacgtg cagcgactcg gtggttcaca gctgtgacct gtgtggcaag 660
ggcttccgtc tgcagcgcat gctgaaccgt cacctcaagt gccacaacca ggtgaaaaga 720
cacctgtgca ccttctgcgg caagggcttc aacgacacct tcgacctgaa gaggcacgtc 780
cgcacacaca caggcattcg tccctacaaa tgcaacgtct gcaataaagc cttcacccag 840
cgctgctctc tggagtccca cctgaagaaa atccatgggg tgcagcagca gtatgcctat 900
aagcagcggc gggacaagct ctacgtctgc gaggattgcg gctacacggg ccccacccag 960
gaggacctgt acctgcacgt gaacagtgcc catccgggca gctcgtttct caaaaagaca 1020
tctaaaaaac tggcagccct tctgcagggc aagctgacat ccgcacacca ggagaatacc 1080
agcctgagtg aggaggagga gaggaagtga ggagaaggaa ggggaggaca gacgttcaca 1140
ctgccacgta tgtctacgtg gatttttggt tttcagcttc ccccacccca ctggctcttc 1200
ttaattagaa gtgaccagtt cacctctgtg tccttttgaa acatcagcag tagggtccat 1260
tccaagattg tcagttgccg ttagtgacgt caggccctgt aacctgtgtc ctgtctggcg 1320
cagttgctca cattcaccaa agtttgtttt catgatcctg atggccaaga acaccgtgtg 1380
ggattttttt ttcccccaag gattttcaca cacggaagga gaggtatttc ttagagagat 1440
catcatttta tggtgccttg aaataaaaat acttctactt gaaatgctgt ttaagcaagg 1500
caagtgaatt ttgttattct gaaagagttt acagaaacta ttttaataaa tgaaatgttc 1560
ttgtgaagct tttaaaagca aaa 1583
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Human
<400> 2
acaggcattc gtccctacaa a 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Human
<400> 3
cgctgcttat aggcatactg c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Human
<400> 4
gagaaaatct ggcaccacac c 21
<210> 5
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> Human
<400> 5
ggatagcaca gcctggatag caa 23

Claims (4)

1.检测OVOL2表达水平的试剂在制备预测女性恶性生殖细胞肿瘤患者对顺铂敏感性的试剂盒中的应用，所述的试剂盒包括OVOL2表达水平的检测试剂，所述的女性恶性生殖细胞肿瘤是指卵黄囊瘤（YSTs）组织学亚型。
2.根据权利要求1所述的应用，所述的试剂盒中还包括OVOL2基因敲除试剂和/或OVOL2基因沉默试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，所述OVOL2基因沉默试剂为小干扰RNA。
4.根据权利要求1所述的应用，所述的试剂盒中还包括TP53突变检测试剂。
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