TW202206093A - Ｓｅｍａ３ｄ拮抗劑用於預防或治療神經退化性疾病以及延長壽命之用途 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種組合物用於製備預防或治療神經退化性疾病的藥物的用途，其中該組合物包含一治療有效劑量的Sema3D拮抗劑。本發明亦關於一種組合物用於製備延長壽命或促進神經再生的藥物的用途，其中該組合物包含一治療有效劑量的Sema3D拮抗劑。

Description

SEMA3D拮抗劑用於預防或治療神經退化性疾病以及延長壽命之用途

本發明係關於一種組合物用於製備預防或治療神經退化和延長壽命的藥物的用途，其中該組合物包含一Sema3D的拮抗劑。

年老會影響神經元的代謝、功能和存活，而這些都會導致認知能力下降和神經退化性疾病(neurodegenerative diseases)。海馬迴(hippocampus)對於學習和記憶鞏固至關重要；但不幸的是，這個大腦區域是年老過程中最脆弱的區域之一。海馬迴中發生的神經退化被報導在認知缺陷(cognitive deficit)和腦萎縮(brain atrophy)中發揮作用，這意味著海馬迴神經元在年老和與年齡相關的認知衰退(age-associated cognitive decline)中的重要性。此外，越來越多的證據顯示神經退化會縮短壽命。

屍體剖檢(autopsy)和分子研究表明，蛋白質代謝異常、樹突棘(dendritic spine)減少和神經元死亡為神經退化性疾病的屬性特徵，例如阿茲海默症(Alzheimer’s disease，AD)和額顳葉退化症(frontotemporal lobar degeneration，FTLD)。此外，神經幹細胞(neural stem cells，NSCs)的損失所導致的神經再生的減少可能會加劇老化大腦的功能衰退。鑑於高齡化人口規模不斷擴大和神經退化的複雜性，故需要不斷尋找控制大腦衰 老過程的關鍵因素。

先前報導指出微小RNA-195(miR-195)在急性中風大鼠中可以發揮神經保護作用並改善功能恢復。其他研究也證實miR-195下調類澱粉蛋白β(amyloid-β)，類澱粉蛋白β是阿茲海默症的斑塊的核心成分，而miR-195可緩解低灌注引起的失智症。因此，合理推測miR-195可能在調節年老的大腦中的神經元功能中發揮作用。第3類訊號蛋白(Class III Semaphorins，Sema3)A-G先前已被報導為軸突導向分子(axon guidance molecules)。訊號蛋白3A(semaphorin 3A，Sema3A)和訊號蛋白3D(semaphorin 3D，Sema3D)都已被證明可以刺激來自細胞本體(soma)的軸突的外緣分支。Sema3是主要與A類叢狀蛋白受體(class A plexin receptors)(PlexinA1-PlexinA4)結合的分泌蛋白。最近的研究表明，Sema3家族成員還參與了與多種疾病的發病機制相關的其他功能，例如神經退化性疾病和糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy)。此外，最近的研究顯示出Sema3A是miR-195的直接標靶，且Sema3A參與急性中風引起的神經元損傷。

本發明提供一種預防或治療於一個體中的神經退化性疾病的方法，包含向罹患神經退化性疾病的所述個體施予一包含一治療有效劑量的訊號蛋白3D(Sema3D)拮抗劑的醫藥組合物。

根據本發明的該方面的附加特色，提供一種於一個體中的延長壽命的方法，包含向需要延長壽命的所述個體施予一包含一治療有效劑量的訊號蛋白3D(Sema3D)拮抗劑的醫藥組合物。

根據本發明的該方面的另一個附加特色，還提供了一種於一個體中促進神經再生的方法，包含向需要神經再生的所述個體施予一包含一治療有效劑量的訊號蛋白3D(Sema3D)拮抗劑的醫藥組合物。

此外，根據本發明的該方面的另一個附加特色，提供了一種預防或治療於一個體中的視網膜神經退化性疾病的方法，包含向罹患視網膜神經退化性疾病的所述個體施予一包含一治療有效劑量的訊號蛋白3D(Sema3D)拮抗劑的醫藥組合物。

如本文所使用的，術語「個體(subject)」是指動物，尤其是哺乳動物。在一較佳實施例中，術語「個體」是指人類。

除非另有說明，「一」或「一個」是指一個或多個。

本發明提供一種預防或治療於一個體中的神經退化性疾病的方法，包含向罹患神經退化性疾病的所述個體施予一包含一治療有效劑量的訊號蛋白3D(Sema3D)拮抗劑的醫藥組合物。

本發明也提供一種組合物用於製備預防或治療神經退化性疾病的藥物之用途，其中該組合物包含一治療有效劑量的訊號蛋白3D(Sema3D)拮抗劑。

如本文中所使用，術語「預防」係指預防疾病或病症或其一或多種症狀之發作、復發或擴散。在某些實施例中，該等術語係指在症狀發作之前，在有或沒有一或多種其他額外活性劑之情形中，利用本文所提供之藥物治療特定而言處於本文所提供之疾病或病症之風險之個體，或向其施予本文所提供之藥物。

如本文所使用，術語「治療」是指緩解症狀或併發症；延緩 疾病、病症或病情的進展；減輕或緩解症狀和併發症；及/或治癒或消除疾病、病症或病情。

於一具體實施例中，該個體罹患中樞神經系統的神經退化性疾病。本文中所使用之術語「神經退化性疾病(neurodegenerative diseases)」也用來描述一種由中樞神經系統的損害所引起之急性、漸進性或慢性疾病，且該損害根據本發明可透過該Sema3D拮抗劑的治療來減少及/或減輕。於一具體實施例中，該神經退化性疾病包含阿茲海默症(AD)、帕金森氏症(Parkinson's disease)、額顳葉退化症(FTLD)、具有泛素包含體之額顳葉退化症(frontotemporal lobar degeneration with ubiquitinated inclusions，FTLD-U)、年齡相關的認知衰退(age-associated cognitive decline)、血管性失智症(Vascular dementia)、皮質基底核退化症(cortico-basal ganglionic degeneration，CBD)、進行性核上麻痺(progressive supranuclear palsy，PSP)、路易氏體失智症(Lewy body dementia)、亨汀頓氏舞蹈症(Huntington's chorea)、纏結為主型老年癡呆、皮克氏病(Pick's disease，PiD)、嗜銀顆粒性失智症(argyrophilic grain dementia)、關島型帕金森氏症-癡呆綜合症(Guam parkinsonism-dementia complex)、利替可-波帝格症(Lytico-Bodig disease)、肌肉萎縮性側索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、脊髓小腦萎縮症、脊髓延髓性肌肉萎縮症(spinal and bulbar muscular atrophy，SBMA)、運動神經元疾病(Motor Neuron Disease)、多發性硬化(Multiple Sclerosis)或創傷性腦損傷(Traumatic Brain Injur，TBI)。於一較佳具體實施例中，該神經退化性疾病包含阿茲海默症、帕金森氏症、額顳葉退化症、具有泛素包含體之額顳葉退化症或年齡相關的認知衰退。

於另一具體實施例中，該個體是一老年個體。

根據本發明，包含該Sema3D拮抗劑的該藥物或該醫藥組合物可透過增加海馬迴的樹突棘(dendritic spine)和促進神經再生來防止/抑制神經退化。因此，該Sema3D拮抗劑能用於預防或治療神經退化。於一具體實施例中，該Sema3D拮抗劑透過增加海馬迴的樹突棘和促進神經再生來預防或治療該神經退化性疾病。

於另一具體實施例中，該Sema3D拮抗劑增加海馬迴中的CA1錐體神經元(pyramidal neurons)的樹突棘密度。於一較佳具體實施例中，該Sema3D拮抗劑透過增加海馬迴中的CA1錐體神經元的樹突棘密度來預防或治療神經退化。於一更佳具體實施例中，該Sema3D拮抗劑透過增加海馬迴中的CA1錐體神經元的樹突棘密度來預防或治療該神經退化性疾病。

根據本發明，該Sema3D拮抗劑的促進神經再生的功效是透過增加神經幹細胞、上調自噬作用以及促進神經元增生來達成。於一具體實施例中，該促進神經再生包含增加神經幹細胞、上調自噬作用以及促進神經元增生。關於增加神經幹細胞的方面，該Sema3D拮抗劑能增加海馬齒狀回(hippocampal dentate gyrus)和腦室下區(subventricular zone，SVZ)中的神經幹細胞來促進神經再生。於另一具體實施例中，該Sema3D拮抗劑增加海馬齒狀回和腦室下區中的神經幹細胞來促進神經再生以預防或治療神經退化。於一較佳具體實施例中，該Sema3D拮抗劑增加海馬齒狀回和腦室下區中的神經幹細胞來促進神經再生以預防或治療該神經退化性疾病。

如本文中所使用，「拮抗劑(antagonist)」包含但不限於破壞、防止、抑制、降低或中和目標之活性或表現的分子。「Sema3D拮抗劑」意指任何一種可阻斷、抑制或降低(包含顯著地影響)Sema3D生物活性或表現之分子，其生物活性包含Sema3D下游訊息傳導路徑。「拮抗」一詞並未暗示特定的生物活性機制，其表達係包含對Sema3D所有可能直接或間接的藥理作用、生理作用與生化作用。於一具體實施例中，該Sema3D拮抗劑包含一對抗(aganist)Sema3D的結合物，其中該結合物包含化合物、多肽、抗體、抗體片段或寡核苷酸(oligonucleotide)。該Sema3D拮抗劑之示範例包含抗Sema3D抗體或其片段、對應Sema3D之反義分子(anti-sense molecules)(包含對應Sema3D核酸編碼之反義分子)、對應Sema3D之短小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)、對應Sema3D之小髮夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)、對應Sema3D之微小RNA(microRNA，miRNA)、對應Sema3D之適體(aptamer)以及Sema3D抑制性化合物，但本發明之Sema3D拮抗劑並非僅限於此。於一較佳具體實施例中，該Sema3D拮抗劑包含一抗Sema3D之抗體、一抗Sema3D之抗體片段、一抑制Sema3D表現之反義核酸、一抑制Sema3D表現之siRNA、一抑制Sema3D表現之shRNA、一抑制Sema3D表現之miRNA或一抑制Sema3D表現之適體。

於一具體實施例中，該化合物包含一分子化合物。於一較佳具體實施例中，該分子化合物包含一小分子化合物和一大分子化合物。

於另一具體實施例中，該抗體或該抗體片段包含多株抗體、單株抗體、人源化抗體、雙功能抗體、抗體Fab、Fv、F(ab')₂片段、單鏈Fv(scFv)、Fv片段或抗體之類肽物。

於本發明中，該寡核苷酸包含利用核酸互補的原理所製造出的反義股。於一具體實施例中，該寡核苷酸包含一與該Sema3D基因具有足夠互補性的核苷酸序列，以直接結合Sema3D RNA來干擾Sema3D RNA功能。於一較佳具體實施例中，該寡核苷酸包含反義DNA、反義RNA、siRNA、shRNA、miRNA或適體。於一更佳具體實施例中，該siRNA的序列包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7。於另一具體實施例中，該Sema3D拮抗劑包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7。

於另一具體實施例中，該Sema3D拮抗劑包含一微小RNA-195(miRNA-195)、一經修飾的miRNA-195或一miRNA-195之擬態物(mimics)。但在一些情況下，本發明的該Sema3D拮抗劑並不包含miRNA-195、經修飾的miRNA-195或miRNA-195之擬態物等分子來預防或治療神經退化性疾病。

本發明提供一種於一個體中延長壽命的方法，包含向需要延長壽命的所述個體施予一包含一治療有效劑量的訊號蛋白3D(Sema3D)拮抗劑的醫藥組合物。

本發明也提供一種組合物用於製備延長壽命的藥物之用途，其中該組合物包含一治療有效劑量的訊號蛋白3D(Sema3D)拮抗劑。

根據本發明，該Sema3D拮抗劑透過延緩衰老來延長壽命。於一較佳具體實施例中，該Sema3D拮抗劑具有延緩衰老的功效。於一較佳具體實施例中，該Sema3D拮抗劑透過延緩衰老來延長壽命。於一更佳具體實施例中，該Sema3D拮抗劑用以延緩衰老和延長壽命。

根據本發明，該Sema3D拮抗劑透過防止/抑制神經退化來延緩衰老，進而延長壽命。於一具體實施例中，該Sema3D拮抗劑透過防止/抑制神經退化來延緩衰老，進而延長壽命。於一較佳具體實施例中，該Sema3D拮抗劑透過增加海馬迴的樹突棘和促進神經再生來防止/抑制神經退化。

於另一具體實施例中，該Sema3D拮抗劑抑制一年老相關生物標誌的表現。於一較佳具體實施例中，該年老相關生物標誌包含衰老相關的β半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase，SA β-gal)、p16^Ink4a以及p19^Arf。

根據本發明，該Sema3D拮抗劑能延緩腦老化來延長壽命。於一較佳具體實施例中，該Sema3D拮抗劑促進神經新生來延緩腦老化以延長壽命。於一較佳具體實施例中，該Sema3D拮抗劑增加海馬齒狀回和腦室下區中的神經幹細胞來促進神經新生。因此，該Sema3D拮抗劑具有促進神經新生的功效，進而延長壽命。

於一具體實施例中，該個體是一老年個體。

於另一具體實施例中，該Sema3D拮抗劑包含一對抗Sema3D的結合物，其中該結合物包含分子化合物、多肽、抗體、抗體片段或寡核苷酸。於一較佳具體實施例中，該寡核苷酸包含反義DNA、反義RNA、siRNA、shRNA、miRNA或適體。於一更佳具體實施例中，該siRNA的序列包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7。於另一具體實施例中，該Sema3D拮抗劑包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7。

於一具體實施例中，該Sema3D拮抗劑包含一微小RNA-195(miRNA-195)、一經修飾的miRNA-195或一miRNA-195之擬態物。

本發明提供一種於一個體中促進神經再生的方法，包含向需要神經再生的所述個體施予一包含一治療有效劑量的訊號蛋白3D(Sema3D)拮抗劑的醫藥組合物。

本發明也提供一種組合物用於製備促進神經再生的藥物之用途，其中該組合物包含一治療有效劑量的訊號蛋白3D(Sema3D)拮抗劑。

於一具體實施例中，該Sema3D拮抗劑透過增加神經幹細胞、上調自噬作用以及促進神經元增生來促進神經再生。

根據本發明，該Sema3D拮抗劑可上調PI3K/AKT/mTOR路徑來上調自噬作用來促進神經再生以抑制神經退化。於一具體實施例中，該上調自噬作用包含上調PI3K/Akt/mTOR訊號路徑。

於一具體實施例中，該個體是一老年個體。

於另一具體實施例中，該Sema3D拮抗劑包含一對抗Sema3D的結合物，其中該結合物包含分子化合物、多肽、抗體、抗體片段或寡核苷酸。於一較佳具體實施例中，該寡核苷酸包含反義DNA、反義RNA、siRNA、shRNA、miRNA或適體。於一更佳具體實施例中，該siRNA的序列包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7。於另一具體實施例中，該Sema3D拮抗劑包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7。

於一具體實施例中，該Sema3D拮抗劑包含一微小RNA-195 (miRNA-195)、一經修飾的miRNA-195或一miRNA-195之擬態物。但在一些情況下，本發明的該Sema3D拮抗劑並不包含miRNA-195、經修飾的miRNA-195或miRNA-195之擬態物等分子來促進神經再生。

本發明提供一種預防或治療於一個體中的視網膜神經退化性疾病的方法，包含向罹患視網膜神經退化性疾病的所述個體施予一包含一治療有效劑量的訊號蛋白3D(Sema3D)拮抗劑的醫藥組合物。

本發明也提供一種組合物用於製備預防或治療視網膜神經退化性疾病的藥物之用途，其中該組合物包含一治療有效劑量的訊號蛋白3D(Sema3D)拮抗劑。

於一具體實施例中，該視網膜神經退化疾病包含糖尿病性視網膜病變(diabetic retinopathy)、老年性黃斑部退化(age-related macular degeneration)、視神經炎、近視誘發的視網膜病變(myopia-induced retinopathy)或青光眼相關的視網膜病症(glaucoma-associated retinal disorders)。於一較佳具體實施例中，該視網膜神經退化疾病包含糖尿病性視網膜病變。

於一具體實施例中，該個體是一老年個體。

於另一具體實施例中，該Sema3D拮抗劑包含一對抗Sema3D的結合物，其中該結合物包含分子化合物、多肽、抗體、抗體片段或寡核苷酸。於一較佳具體實施例中，該寡核苷酸包含反義DNA、反義RNA、siRNA、shRNA、miRNA或適體。於一更佳具體實施例中，該siRNA的序列包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7。於另一具體實施例中，該Sema3D拮抗劑包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7。

於一具體實施例中，該藥物或該醫藥組合物進一步包含一醫藥上可接受的鹽、載體、佐劑或賦形劑。於一較佳具體實施例中，該藥物或該醫藥組合物進一步包含一醫藥上可接受的載體(pharmaceutically acceptable carrier)。如本文所使用，術語「醫藥上可接受的載體」為透過特定組合施用及特定方法施用組合物所決定。如本文所用「載體」一詞包含但不侷限任何及所有溶劑、分散介質、載具、包衣、稀釋劑、抗細菌和抗真菌劑等滲透和吸收延遲劑、緩衝劑、載體溶液、懸浮液或膠體等。用於藥物活性物質的這些介質和試劑在本領域中是公知的。除非任何常規介質或試劑與活性成分不相容，其用於治療的組合就需要被考慮。補充的活性成分也可摻入組合物中。術語「醫藥上可接受的」係指分子實體和組合物施用於受試者時不產生過敏或類似的不良反應。以蛋白質作為活性物質的水組合物製備在本領域中是習知的。通常，此組合物被製備為液體溶液、錠劑、膠囊或懸浮液注射劑；亦可製備為可用於注射劑之可溶解或懸浮液之固體形式。

此外，前述之藥學上可接受之鹽類可包括但不限於：無機陽離子鹽類(inorganic cation salt)，例如，鹼金屬鹽類，如鈉鹽、鉀鹽或胺鹽；鹼土金族鹽類，如鎂鹽或鈣鹽；以及含二價或四價陽離子之鹽類，如鋅鹽、鋁鹽或鋯鹽。此外，也可以是有機鹽類，如二環己胺鹽類、甲基-D-葡糖胺(methyl-D-glucamine)、以及胺基酸鹽類，如精胺酸、離胺酸、組織胺酸或麩胺酸醯胺。

因此，本發明的藥物或醫藥組合物係可利用熟習此技藝者所 詳知的技術，將上述的Sema3D拮抗劑與醫藥上可接受的載體製備成一適用本發明之劑型。故所述之醫藥上可接受的載體的態樣包含但不限於脂質體(liposome)、水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氫化合物(hydrocarbons)(諸如石油膠(petroleum jelly)以及白凡士林(white petrolatum))、蠟(wax)(諸如石蠟(paraffin)以及黃蠟(yellow wax))、保存劑(preserving agents)、抗氧化劑(antioxidants)、溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspendingagent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、吸收增強劑(absorption enhancers)、活性劑(active agents)、保濕劑(humectants)、氣味吸收劑(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH調整劑(pH adjusting agents)、閉塞劑(occlusive agents)、軟化劑(emollients)、增稠劑(thickeners)、助溶劑(solubilizing agents)、滲透增強劑(penetration enhancers)、抗刺激劑(anti-irritants)、著色劑(colorants)、推進劑(propellants)表面活性劑(surfactant)，或其他類似或適用本發明之載體。

另外，本發明的該寡核苷酸或該微小RNA-195(miRNA-195)可結合以下的醫藥上可接受的載體一起施予，其包含但不限於：微脂體(liposome)、微胞(micelle)、金屬顆粒(metal particle)、聚合物顆粒(polymer particle)、溶劑、分散媒(dispersion medium)、套膜(coating)、抗菌與抗真菌試劑，或一等滲透壓與吸收延遲(absorption delaying)試劑等與藥學投予相容者。對於不同的給藥方式，可利用一般方 法將醫藥組合物配置成不同劑型(dosage form)。在一實施例中，上述之醫藥上可接受的載體可為微脂體、微胞、金屬顆粒或聚合物顆粒。上述顆粒可由各種材料製備而成，例如，脂質(lipids)、蛋白質(proteins)、多醣(polysaccharides)與合成聚合物(synthetic polymers)。而依據製備方法的不同，可獲得奈米顆粒(nanoparticles)、奈米球(nanospheres)、奈米膠囊(nanocapsules)等。

如本文中所使用，術語「施予」意謂向個體提供藥物或醫藥組合物。於另一具體實施例中，包含該Sema3D拮抗劑的該藥物或該醫藥組合物可透過任何合適的腸內或腸外給藥路徑施予至該個體。本發明中合適的腸內給藥路徑包括如口服、直腸、或鼻內給藥。合適的腸外給藥路徑包含如血管內給藥(例如靜脈單次全劑量注射(intravenous bolus injection)、靜脈輸液、動脈內單次全劑量注射、動脈灌注及導管滴注至血管)；組織周圍和組織內注射(例如肌肉內注射、腫瘤周圍和瘤內注射、視網膜內注射或視網膜下注射)；皮下注射或沉積，包括皮下輸注(如透過滲透幫浦)；直接投予至感興趣的組織，例如透過導管或其他的放置裝置(例如一視網膜顆粒(retinal pellet)或栓劑或包含一多孔、非多孔、或者凝膠狀物質的植入物)；以及吸入。特別合適的給藥路徑為注射、輸液和直接注射到目標。

該領域中之熟習技藝人士可藉由考慮如以下之因素：個體的大小和重量；疾病的嚴度程度；個體的年齡、健康和性別；施予途徑；和施予為局部或全身，以決定要施予給一給定個體之Sema3D拮抗劑的有效劑量。該領域中之熟習技藝人士亦可輕易地測定在施予分離的該Sema3D拮抗劑至一給定個體時適當的劑量用法。例如，該Sema3D拮抗劑可投予 至該個體一次或兩次。當一劑量用法包含多次施予時，可瞭解到施予至該個體的該Sema3D拮抗劑的有效量可包含全部劑量用法期間施予的藥物總量。

根據本發明，為寡核苷酸型態的該Sema3D拮抗劑可用重組載體來遞送到該個體體內。於一具體實施例中，該重組載體包含DNA質體或病毒載體。於一較佳具體實施例中，該病毒載體包含腺病毒載體、慢病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、逆轉錄病毒載體、脊髓灰質炎病毒載體、單純皰疹病毒(HSV)載體或基於鼠馬隆尼(Maloney)病毒的載體。透過上述方式，該Sema3D拮抗劑能抑制體內的Sema3D的表現來達成上述功效。

是以，本發明證實Sema3D的表現程度與腦部的神經退化和神經再生、壽命減少和視網膜退化性疾病有關。因此，透過抑制Sema3D以及其相關訊息傳導路徑，就可改善腦部的神經退化、壽命減少、視網膜退化性疾病等徵狀和促進神經再生。

圖1顯示原先具有兩個miR-195基因的小鼠，其中一個miR-195基因被剔除(Knockout，KO)則稱為miR-195a KO小鼠。圖1A和圖1B顯示與年齡匹配的野生型(wild type，WT)小鼠相比，miR-195a KO小鼠在中樞神經系統和其他器官中的miR-195量較低，每個器官的數量為3。圖1C顯示野生型(WT)小鼠(數量為3/組)的全腦(total brain)中miR-195量會呈現年齡依賴性降低。*p<0.05；**p<0.01與4個月大的小鼠相比。

圖2A顯示學習試驗和記憶試驗的方案。圖2B顯示到達隱藏平台的較長逃避潛伏期(escape latency)表明較低的學習能力。圖2C顯示到達平台的較長逃避潛伏期表明記憶力較差。雙因子變異數分析(Two-way ANOVA)用於評估基因剔除(KO)和野生型(WT)鼠之間多天數的整體差異。圖2D顯示miR-195a KO和WT小鼠的記憶試驗(平台象限中的頻率)(the frequency in the platform quadrant)。

圖3A顯示Y迷宮測試(Y-maze test)是藉由測量到達新玩具的臂的時間來評估工作記憶；定量數據顯示在右圖中。圖3B顯示運動(locomotor)功能是藉由曠野測試(open field test)來測量。代表性圖像(左圖)顯示WT和miR-195a KO小鼠在曠野中的行走軌跡；定量數據顯示在右圖中。3M：3-5個月大的小鼠；6M：6-9個月大的小鼠；12M：10-12個月大的小鼠；18M：15-18個月大的小鼠；以及24M：21-24個月大的小鼠。

圖4A顯示miR-195a KO小鼠壽命的分析(數量為28)。WT小鼠的歷史數據作為參考。平均壽命(mean lifespan)、中位壽命(median lifespan)和減少百分比的結果顯示在表3中。圖4B顯示海馬迴中衰老相關的β半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase，SA β-gal)的染色。左圖中的代表性圖像顯示海馬迴衰老細胞(綠色)。比例尺=100μm；定量數據顯示於下圖中，其使用4個月大的WT小鼠作為參考組(數量為3/每組)。圖4C顯示使用基於X-gal的染色來測定衰老相關的β半乳糖苷酶(SA β-gal)的活性。綠色訊號的強度代表SA β-gal酶的活性。代表性圖像顯示WT小鼠的皮層和海馬迴中SA β-gal的活性呈年齡依賴性增加。4個月大的miR-195a KO小鼠和12個月大的WT小鼠之間的綠色訊號強度相似。比例 尺：200μm。圖4D顯示4個月大的miR-195a KO小鼠和年齡匹配的WT小鼠(數量為3/組)的整個腦(whole brain)中p16^Ink4a(左圖)和pl9^Arf(右圖)表現的定量PCR分析。數據表示為平均值±平均值標準誤差(SEM)。*p<0.05；**p<0.01。4M WT：4個月大的WT小鼠；12M WT：12個月大的WT小鼠；24M WT：24個月大的WT小鼠；及4M miR-195a KO：4個月大的miR-195a KO小鼠。

圖5A顯示miR-195a KO小鼠與年齡匹配的WT小鼠相比，神經幹細胞(neural stem cells，NSCs)族群較少。代表性圖像顯示WT小鼠(左側的前3圖)和miR-195a KO小鼠(最右側的圖)的海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)中的SOX2⁺(紅色)神經幹細胞。DG中SOX2⁺神經幹細胞的定量顯示在右側，其使用4個月大的WT小鼠作為參考組(數量為3/組)。放大倍率：20X。比例尺=200μm。圖5B顯示miR-195a KO小鼠中樹突棘(dendritic spine)密度降低。來自4個月大的miR-195a KO小鼠和年齡匹配的WT小鼠(數量為3/每組)的CA1錐體神經元(pyramidal neurons)的頂端樹突軸(apical dendritic shaft)的代表性圖像。比例尺=5μm。來自三個獨立實驗的樹突棘密度的定量。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001與年齡匹配的WT小鼠相比。圖5C顯示WT小鼠(左側的前3圖)和miR-195a KO小鼠(最右側的圖)的腦室下區(subventricular zone，SVZ)中SOX2⁺(紅色)神經幹細胞的代表性圖像。SVZ中SOX2⁺神經幹細胞的定量顯示在右側。放大倍率：20X。比例尺=200μm。數量為3/組。數據表示為平均值±SEM。*p<0.05；**p<0.01與4個月大的WT小鼠相比。數據表示為來自三個獨立實驗的平均值±SEM，*p<0.05和**p<0.01。4M WT：4個 月大的WT小鼠；12M WT：12個月大的WT小鼠；21M WT：21個月大的WT小鼠；及4M miR-195a KO：4個月大的miR-195a KO小鼠。

圖6A顯示攜帶野生型或突變型Sema3D 3'-UTR的報告質體(reporter plasmids)被轉染到HEK293細胞中。在被轉染攜帶野生型Sema3D 3'-UTR的質體的細胞中，miR-195呈劑量依賴性地降低螢光素酶(luciferase)活性。圖6B顯示4個月大的WT和miR-195a KO小鼠海馬迴中Sema3A和Sema3D蛋白程度的西方墨點法(western blot)和定量數據(數量為3/組)。WT小鼠海馬迴中的Sema3A作為參考組。圖6C顯示4個月大的miR-195a KO小鼠和年齡匹配的WT小鼠(數量為3/組)的海馬迴中的Sema3A和Sema3D之mRNA表現。WT小鼠作為參照組。圖6D顯示根據來自艾倫腦部地圖(Allen Brain Atlas)的RNA定序數據，人類海馬迴中的Sema3D和Sema3A之mRNA表現(數量為95)。數據表示為平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。NC：陰性控制組。

圖7A顯示腦中Sema3D蛋白的免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)染色。根據Sema3D的表現程度，其顯示整個腦和海馬迴呈年齡依賴性增加。上圖：整個腦的切片；下圖：海馬迴。圖7B顯示神經退化性疾病轉錄組(transcriptome)的選擇和分析流程圖。計算分析(computational analyses)由橢圓框中所顯示的四個主要步驟組成。4M WT：4個月大的WT小鼠；13M WT：13個月大的WT小鼠；以及21M WT：21個月大的WT小鼠。

圖8A顯示在第7天，西方墨點法的數據顯示在將表現Sema3D的慢病毒(lentivirus)(Lv.Sema3D)雙側注射到4個月大的WT 小鼠的海馬迴後，海馬迴中的Sema3D蛋白程度較高，但皮層中沒有。注射控制用的慢病毒(Lv.Ctrl)作為控制組(數量為3/組)。西方墨點法的定量數據顯示在右圖。圖8B顯示來自圖8A所顯示的同一隻小鼠的海馬迴，其用高爾基-考克斯染色(Golgi-cox stain)。使用高爾基-考克斯染色測量海馬迴中的樹突棘密度。代表性圖像顯示海馬迴CA1錐體神經元的頂端樹突軸。比例尺=5μm。樹突棘密度的定量顯示在右圖。數據表示為平均值±平均值標準誤差(SEM)。*p<0.05。圖8C顯示對WT小鼠施予Lv.Sema3D或Lv.Ctrl；並根據方案進行學習試驗和記憶試驗。圖8D至8F顯示控制組和過量表現Sema3D的4個月大之小鼠(數量為4/組)透過莫里斯水迷宮(Morris Water Maze test，MWM)測試來測驗學習和空間記憶性能。圖8D顯示學習試驗顯示Sema3D過量表現的小鼠需要更長的時間才能到達隱藏平台，這暗示學習能力較低。圖8E和8F分別顯示在記憶試驗中所測量的逃避潛伏期和頻率。Sema3D過量表現的小鼠在目標象限中具有更長的避潛伏期和更低的頻率。圖8G顯示透過新物體識別測試(novel object recognition test)來評估Sema3D對短期記憶的影響(數量為4/組)。右圖中顯示定量數據。圖8B至8E中的數據表示為平均值±SEM。*p<0.05與在同一實驗日的Lv.Ctrl小鼠相比。雙因子變異數分析用於評估Sema3D過量表現小鼠和控制組的小鼠之間多天數的總體差異。**p<0.01和***p<0.001。圖8H顯示透過Y迷宮測驗注射Lv.Ctrl和Lv.Sema3D的小鼠的記憶性能(數量為3/組)。定量數據顯示，過量表現Sema3D的小鼠花費更多時間到達有新玩具的臂，這意味著記憶障礙(memory impairment)(p=0.071)。數據表示為平均值±SEM。圖8I透過曠野測試測量注射Lv.Ctrl和Lv.Sema3D的小 鼠的運動活力(Locomotor activity)(Lv.Ctrl的距離=116.4±4.01cm，Lv.Sema3D的距離=100.1±11.35cm；p=0.248；數量為3/組)。Pre：預處理。

圖9A顯示海馬齒狀回(DG)中免疫螢光染色的代表性圖像顯示Sema3D減弱(knockdown)的效率。將siRNA-Sema3D(si-Sema3D)或siRNA-Ctrl(si-Ctrl)注射到12個月大的miR-195a KO小鼠雙側的海馬迴。在siRNA給藥後的第7天進行免疫螢光染色(數量為3/組)。右圖為定量數據。圖9B至9D顯示透過Y迷宮測試測量接受siRNA-Ctrl或siRNA-Sema3注射的miR-195a KO小鼠(12個月大)(數量為7/每組)的空間工作記憶和運動功能。圖9B顯示該方案顯示了向miR-195a KO小鼠施予siRNA、測試和大腦樣本收集的日期的詳細訊息。圖9C顯示允許小鼠自由探索Y迷宮15分鐘。更高百分比的交替表明更好的空間工作記憶。圖9D顯示利用總行走距離來判定運動功能，距離越長表明運動功能越好。siRNA-Sema3D和siRNA-Ctrl小鼠的測試在同一實驗日進行。雙因子變異數分析用於評估siRNA-Sema3D和siRNA-Ctrl小鼠之間多天數的整體差異。*p<0.05與siRNA-Ctrl處理的小鼠相比。**p<0.01和***p<0.001。圖9E顯示注射siRNA-Sema3D的小鼠中CA1錐體神經元的樹突棘密度的代表性圖像(數量為3/每組)。將siRNA-Sema3D或siRNA-Ctrl注射到12個月大的miR-195a KO小鼠雙側的海馬迴，並於注射後第15天犧牲。比例尺=5μm。右圖顯示樹突棘密度的定量。

圖10A顯示過量表現Sema2A的果蠅和控制組的果蠅(數量為300/每組)的存活曲線。果蠅的Sema2A是人類和老鼠Sema3D的同源基因。Gehan-Breslow-Wilcoxon測試用於比較果蠅的壽命。平均壽命、中 位壽命、最長存活時間和減少壽命的百分比顯示在表6中。圖10B顯示成年的Sema2A過量表現的果蠅在羽化(eclosion)後2、3和4週透過負趨地性分析(negative geotaxis assay)顯示與年齡相關的運動下降(p=0.020，曼-惠特尼(Mann-Whitney)檢驗)。圖10C顯示Sema3D治療後48小時，人類神經幹細胞形成神經球(neurosphere)的代表性圖像。比例尺=200μm。定量數據的表示為來自三個獨立實驗的平均值±SEM。**p<0.01和***p<0.001。圖10D顯示Sema3D以劑量依賴性方式減少神經幹細胞族群。接受Sema3D注射的小鼠的海馬齒狀回(DG)中SOX2⁺(紅色)神經幹細胞的代表性圖像(上圖)。下圖為DG中SOX2⁺神經幹細胞的定量。放大倍率：20X。比例尺=200μm；數量為3/組。定量數據的表示為來自三個獨立實驗的平均值±SEM。*p<0.05和**p<0.01與Sham WT小鼠的數據相比。圖10E顯示在Sema3D以腦室內(ICV)注射後72小時測量4個月大WT小鼠的神經幹細胞族群。注射Sema3D的小鼠的腦室下區(SVZ)中SOX2⁺(紅色)神經幹細胞的代表性圖像(上圖)。下圖為SVZ中SOX2⁺神經幹細胞的定量。放大倍率：20X。比例尺=200μm。數量為3/組。數據表示為平均值±SEM。*p<0.05；**p<0.01與假手術組(sham group)的數據相比。Naive：空白組小鼠。

圖11A顯示Lv.Sema3D或Lv.Ctrl注射到4個月大的WT小鼠雙側的海馬迴。在第14天，透過西方墨點法測量海馬迴中的Sema3D和自噬相關蛋白(autophagy-associated proteins)(數量為3/組)。右圖為定量的西方墨點法的數據。圖11B顯示在Sema3D處理後72小時，人類神經元的自噬相關蛋白p62、Beclin-1和LC3-II/I的西方墨點法。右圖為定量的 西方墨點法的數據。圖11C顯示在Sema3D處理後24小時，Sema3D對PI3K/Akt/mTOR訊號路徑磷酸化的影響的西方墨點法。右圖為定量的西方墨點法的數據。所有定量數據均表示為來自三個獨立實驗的平均值±SEM，*p<0.05和**p<0.01。圖11D顯示雷帕黴素(Rapamycin)逆轉Sema3D抑制細胞增殖作用。人類神經元細胞(SY5Y)同時用Sema3D和雷帕黴素處理72小時。使用Ki67染色來判定神經元細胞的增殖。Ki67和DAPI染色的代表性螢光圖像。比例尺=50μm。定量數據表示為來自三個獨立實驗的平均值±SEM。*p<0.05和**p<0.01基於沒有Sema3D和雷帕黴素處理的SY5Y細胞數據。圖11E顯示Lv.Sema3D有無合併使用雷帕黴素或只有Lv.Ctrl注射到4個月大的WT小鼠雙側的海馬迴，在第14天測量樹突棘密度。CA1錐體神經元的頂端樹突軸的代表性圖像(數量為3/組)。比例尺=5μm。下圖為樹突棘密度的定量。**p<0.01。

圖12顯示Sema3D在糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)大鼠和小鼠的眼中高度表現。圖12A顯示糖尿病發病4週後，Sema3D mRNA表現增加，且定量數據顯示與Sema3A mRNA相比，Sema3D mRNA的表現程度較高。*p<0.05與控制組的大鼠的Sema3A程度相比；##p<0.01與控制組的大鼠的Sema3D程度相比，數量為2/組。數據表示為來自三個獨立實驗的平均值±SEM。圖12B顯示代表性IHC圖像顯示視網膜中Sema3D蛋白會隨著糖尿病發病時間而增加(棕色；數量為3/組)。

以下實施例是非限制性的並且僅代表本發明的各個方面和特徵。

材料與方法

試劑

MiR-195和陰性控制的微小RNA(negative control microRNA，NC-miR)是從Ambion Inc.(Austin,TX,USA)所購買，序列訊息為：

miR-195擬態物：5’-UAGCAGCACAAGAAAUAUUGGC-3’(SEQ ID NO：1)；

抗miR-195：5'-GCCAATATTTCTGTGCTGCTA-3'(SEQ ID NO：2)；

以及

陰性控制序列：5'-AGUACUGCUUACGAUACGG-3'(SEQ ID NO：3)。SYBR^® Green PCR Master Mix、MultiScribe® Reverse Transcriptase Kit是從Applied Biosystems(Foster City,CA,USA)所購買。雷帕黴素(Rapamycin)是一種化學mTOR抑制劑，購自Sigma Aldrich(St.Louis,MO,USA)。重組小鼠Sema3D和人類Sema3D蛋白購自R&D Systems(Minneapolis,MN,USA)。除非另有說明，所有其他試劑均為分析等級(analytical grade)。初級抗體：抗SOX2(ab97959,Abcam；Cambridge,MA,USA)、抗Sema3D(ab180147,Abcam)、抗GAPDH(5174,Cell Signaling；Beverly,MA,USA)、抗Ki67(ab16667,Abcam)、抗Beclin-1(ab207612,Abcam)、抗LC3(ab48394,Abcam)、抗p62/SQSTM1(ab56416,Abcam)、抗PI3K(E-AB-32575,Elabscience；Houston,Texas,USA)、抗phospho-PI3K(E-AB-20966,Elabscience)、抗Akt(9272S,Cell Signaling)、抗phospho-Akt(9271S,Cell Signaling)、抗mTOR(E-AB-32128,Elabscience)和抗phospho-mTOR (E-AB-20929，Elabscience)用於西方墨點法(western blot)、免疫組織化學染色和免疫螢光實驗。靶向人類Sema 3D的siRNA和非靶向(控制)的RNA的寡核苷酸池(oligonucleotide pools)是從Dharmacon(Lafayette,CO,USA)所購買。siRNA-Sema3D的序列為5'-CUGUGAUGUAUAAGUCCGU-3'(SEQ ID NO：4)、5'-GCAAUAUGAUGGAAGGAUA-3(SEQ ID NO：5)、5'-CUGCCAACUUAUAAUGUUU-3'(SEQ ID NO：6)和5'-GCUAUGUGCUUAAUGUUUC-3'(SEQ ID NO：7)。siRNA-Ctrl的序列為5'-UGGUUUACAUGUCGACUAA-3'(SEQ ID NO：8)、5'-UGGUUUACAUGUUUUCUGA-3'(SEQ ID NO：9)、5'-UGGUUUACAUGUUUUCCUA-3'(SEQ ID NO：10)和5'-UGGUUUACAUGUUGUGUGA-3'(SEQ ID NO：11)。

細胞培養和細胞研究

人類神經元細胞系SY5Y(ATCC CRL-2266)是從美國模式培養物收藏中心(American Type Culture Collection)所獲得。HEK293細胞(BCRC90016)是從台灣生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center,Taiwan)所獲得。SY5Y細胞和HEK293細胞維持在具有37℃和5%CO₂的加濕培養箱內有補充10% FBS(Invitrogen,Waltham,MA,USA)、1%青黴素(penicillin)和鏈黴素(streptomycin)(Biowest,Loire Valley,France)和1% L-榖胺醯胺(glutamine)(Invitrogen)的DMEM中。人類神經幹細胞(neural stem cells，NSCs)是從人類誘導型多功能幹細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)誘導而來的。簡單來說，人類iPSCs首先在塗覆基質膠(matrigel)(BD Biosciences；Franklin Lakes,NJ,USA) 的培養皿上的胚體(embryoid bodies，EB)培養基中培養成胚體，並輔以重組人頭蛋白(recombinant Noggin protein)(250ng/ml，R&D)。在第10天，將培養基更換為有補充音猬因子(Sonic Hedgehog，SHH，20ng/ml，R&D)和纖維母細胞生長因子8(fibroblast growth factor 8，FGF8)(100ng/ml，R&D)的EB培養基。直到出現玫瑰花狀結構後(第14天)，將培養基更換為有補充BDNF、抗壞血酸(ascorbic acid)、SHH和FGF8的培養基。在第22天，去除FGF8，將細胞維持在有補充BDNF、抗壞血酸和SHH的培養基中。在第29天，將細胞接種在完整的StemPro NSC培養基中的塗覆聚-L-鳥胺酸(ornithine)/層連結蛋白(laminin)的培養皿上，然後擴增至10代。

Sema3D和神經退化

為了研究Sema3D是否經由PI3K/Akt/mTOR/自噬路徑誘導神經退化(neurodegeneration)，用重組Sema3D蛋白處理SY5Y細胞72小時，並收集細胞裂解物以用於西方墨點法分析。對於救援(rescue)分析，將1μM雷帕黴素和Sema3D共同給藥到培養的SY5Y細胞中72小時，並在72小時時透過Ki67染色檢測細胞活力。CHOV20191024(新型Sema3D拮抗劑(antagonist))和Sema3D與SY5Y細胞共同處理，以證明CHOV20191024的生物活性。MTT分析、西方墨點法和細胞存活分析用於評估CHOV20191024的救援能力。

Sema3D影響神經幹細胞

將Sema3D加入到人類神經幹細胞的培養基中。評估Sema3D是否可影響神經幹細胞特性(stemness)。在Sema3D治療後第5天 進行球體形成分析(sphere formation assay)以及計算球體數量。

野生型(WT)、miR-195a剔除(KO)小鼠和老年小鼠

本發明中使用C57BL/6出身的WT C57BL/6小鼠和miR-195a KO小鼠。MiR-195a KO小鼠由國家實驗動物中心生產。4、12和21個月的野生型C57BL/6小鼠是從國家實驗動物中心所獲得。小鼠在行為實驗或犧牲前至少適應2週。中國醫藥大學的動物照護及使用委員會批准了動物實驗方案，該方案嚴格符合實驗動物照護及使用指引第8版(2011)。

Sema3D過量表現小鼠和慢病毒施予

使用4個月大的C57BL/6小鼠來產生Sema3D過量表現的小鼠。透過使用舒泰(Zoletil)與若朋(Rompun)的混合物(比例：3：1，1mg kg^-1，腹腔內)來麻醉小鼠，以對其進行立體定向注射程序(Stereotaxic injection procedures)。將含有Sema3D慢病毒(lentivirus)(Lv.Sema3D；4.5×10⁵TU/ml)的溶液注射到雙側海馬迴(-1.2mm前-後，1mm內側-外側，以及-2mm背側-腹側相對於前囟(bregma)；-3.6mm前-後，3.2mm內側-外側以及-4mm背側-腹側相對於前囟)。在注射後第7天，對Sema3D過量表現的小鼠進行行為測試、高爾基-考克斯染色(Golgi-cox stain)或訊號路徑分析。接受控制慢病毒(Lv.Ctrl)的小鼠作為對照組。

動物研究

首先，使用miR-195a KO和WT小鼠來研究miR-195在認知功能、神經新生(neurogenesis)和腦衰老(brain senescence)中的作用。miR-195a KO和WT小鼠的認知功能是透過莫里斯水迷宮(Morris Water Maze，MWM)測試、Y迷宮測試(Y-maze test)和曠野測試(open field test， OFT)來評估。透過定量齒狀回(dentate gyrus，DG)和腦室下區(subventricular zone，SVZ)中的SOX2⁺神經幹細胞來評估神經新生能力。衰老相關的β半乳糖苷酶(SA β-gal)活性和p16^INK4a/p19^Arf表現用於評估腦衰老。

其次，透過使用Sema3D過量表現小鼠來探索Sema3D在認知功能、神經退化(neurodegeneration)和神經新生中的作用。透過MWM測試、新物體識別測試(novel object recognition test)、Y迷宮測試和曠野測試來評估認知功能。認知測試在給慢病毒後第7天進行。為了支持本發明在行為測試中的發現，在行為測試後使用高爾基-考克斯染色來檢測相同小鼠的神經退化。如果高爾基-考克斯染色顯示神經元的樹突棘(dendritic spine)密度下降，則大腦存在神經退化。為了探索Sema3D對自噬(autophagy)的影響，從進行行為測試的相同小鼠身上收集海馬迴，並使用西方墨點法分析自噬相關蛋白(autophagy-related proteins)。為了研究Sema3D對神經新生的影響，將重組Sema3D蛋白透過腦室內(intracerebroventricularly，ICV)注射到4個月大的WT小鼠中。透過定量齒狀回(DG)和腦室下區(SVZ)中的SOX2⁺神經幹細胞來評估神經新生能力。

進行了兩項體內救援(rescue)研究以確認Sema3D的有害影響。首先，將雷帕黴素遞送到Sema3D過量表現小鼠的海馬迴中以救援自噬效率。雷帕黴素和Lv.Sema3D注射到小鼠雙側的海馬迴。進行高爾基-考克斯染色來顯示樹突棘密度以評估Sema3D誘導的神經退化的嚴重程度。其次，將Sema3D siRNA或控制siRNA遞送到12個月大的miR-195a KO 小鼠的海馬迴中。透過Y迷宮測試所獲得的空間工作記憶和運動功能來用於評估Sema3D siRNA對認知功能的影響。再次使用高爾基-考克斯染色來評估救援效果。

Y迷宮

透過Y迷宮測試來評估空間工作記憶。Y迷宮是由三個封閉的臂所組成，該臂長50cm，寬11cm，高10cm，並由黑色有機玻璃(Plexiglas)製成；且三臂彼此成120°，呈Y形。有兩種不同的Y迷宮方案用於本發明。

第一種方案為由miR-195a KO小鼠和Sema3D過量表現小鼠執行以15分鐘為間隔的分開的兩次試驗所組成。簡單來說，在第一次試驗(習得試驗(acquisition trial))中，小鼠被放置在選定臂(起始臂)的末端，並允許在其中一個臂閉合(註記為新臂)的情況下探索迷宮5分鐘。然後將小鼠放回遠離測試房的家籠中15分鐘。在第二次試驗(保留試驗(retention trial))中，允許小鼠自由探索迷宮的所有三個臂5分鐘，並記錄到達新臂(先前在第一次試驗中閉合)所花費的時間。到達新臂的時間越長，工作記憶的性能越差。

第二個方案由Sema3D/控制siRNA處理的miR-195a KO小鼠來進行。簡單來說，每隻動物都被放置在Y迷宮的中心，可以自由探索活動場所(arena)8分鐘。小鼠傾向於探索最近最少探訪的臂，因此傾向於在三個臂之間交替探訪。為了有效交替，小鼠需要使用工作記憶，以及牠們應該保持最近探訪過的臂的持續記錄，並不斷更新這些記錄。當小鼠將四隻爪子放在臂內時，就對進入的該臂進行評分。空間工作記憶透過交 替百分比進行評估。交替(alternation)的定義為連續選擇進入三個不同的臂。交替百分比的計算為實際交替次數與最大交替次數之比率。可能交替的最大次數的定義為進入臂的總次數減2。交替的低百分比表明空間工作記憶受損，因為小鼠不記得牠剛剛探訪過哪個臂，因此顯示自發性交替減少。

曠野測試(Open field test，OFT)

使用曠野測試(OFT)檢查運動功能。簡單來說，將小鼠放置在配備16束光束的曠野設備中，進行一節15分鐘的實驗。運動功能是用小鼠的總行走距離來判定。

莫里斯水迷宮(Morris Water Maze，MWM)

透過MWM測試來測驗空間學習和空間記憶。簡單來說，訓練小鼠在不透明的水中尋找隱藏平台5天，每天從偽隨機(pseudorandomized)起始位置進行4次習得試驗。在為期5天的習得試驗中，找到隱藏平台的潛伏期(latency)被記錄為空間學習能力的指標。接下來，為了評估空間記憶能力，在習得試驗後的第1、7和14天進行探索試驗(probe trials)(其中隱藏平台被移除)，從而記錄尋找隱藏平台所花費的總時間。將尋找隱藏平台的潛伏期和到達平台象限的頻率記錄為空間記憶能力的指數。所有MWM試驗的記錄和分析是使用ANY-Maze追縱系統(Stoelting,Chicago,IL,USA)。

新物體識別測試(Novel Object Recognition test)

透過新物體識別測試來評估識別記憶。首先將小鼠與兩個相同的物體放在活動場所(arena)的中心10分鐘。然後將小鼠放回遠離測試房的家籠中另待15分鐘。接下來，5分鐘一次測試識別記憶，其中一個熟 悉的物體會被一個新物體所替換。用影像追蹤系統(video tracking system)(ViewPoint Behavior Technology；Lyon,France)記錄測試期間每隻動物探索每個物體所花費的時間。物體記憶能力用探索新物體所花費的時間與探索所有物體所花費的時間相比的比例(判別指數(discrimination index))來顯示。

高爾基-考克斯染色和樹突棘密度測量

在CA1區中的海馬迴神經元的樹突棘密度透過高爾基-考克斯染色來顯示。根據製造商(FD Rapid GolgiStainTM Kit,FD Neuro Technologies Inc.,MD,USA)的方案將大腦浸入高爾基染色溶液中。然後使用振盪切片機(vibratome)(Leica VT1000S)將染色的大腦進行切片，獲得來自背側海馬迴的100μm厚度的冠狀切片。切片包埋在塗覆明膠的載玻片上，然後在柯達膠片固定液(Kodak Film Fixer)中放置15分鐘，並用以二甲苯(xylene)為基底的介質脫水。

使用共軛焦顯微鏡(Leica SP2/SP8X)以獲得明視野顯微鏡圖像。使用Image J軟體半自動追蹤海馬迴CA1樹突。將選擇被其他細胞最少遮掩且具有未受損樹突樹(dendritic tree)的錐體神經元進行分析。

神經幹細胞(NSCs)的免疫螢光染色和定量

為了評估體內神經新生能力，使用免疫螢光染色檢測神經幹細胞。透過具有清晰可辨的細胞核(DAPI陽性細胞)的SOX2陽性訊號來確認和定量神經幹細胞。簡單來說，用4%多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)固定大腦，在4℃下用30%蔗糖溶液冷凍保存24小時，然後包埋進OCT中。收集15μm厚的冷凍切片並儲存在-20℃下直至使用。對於免疫染 色，將腦切片與SOX2抗體孵育在含5%BSA的PBS中於4℃下過夜，並與和Alexa Fluor 647(Invitrogen)偶聯的二級抗體一起孵育。透過免疫螢光共軛焦顯微鏡(Leica SP2/SP8X)獲得圖像。透過Image J軟體定量位於齒狀回(DG)和腦室下區(SVZ)的SOX2陽性細胞的數量。

球體形成分析(Sphere formation assay)

球體形成分析是用於判定Sema3D對神經幹細胞特性的影響。簡單來說，將人類神經幹細胞接種在超低附著性的24孔板(Corning；NY,USA)上。在培養的第5天計算球體的數量(直徑>50μm)。

基因表現資料集的挑選和分析

查詢基因表現綜合(Gene Expression Omnibus，GEO)資料庫(截至2019年12月)以獲取與神經退化性疾病和年老有關的人類海馬迴微陣列基因表現資料集(datasets)。使用的具體檢索字詞為：“神經退化(neurodegeneration)”、“失智(dementia)”、“認知障礙(cognitive impairment)”和“死後大腦(postmortem brain)”。檢索到的資料集根據以下標準進行過濾：(1)源自人類海馬迴組織可用的原始數據；(2)對於神經退化性疾病資料集，至少有一個控制組(正常人)和一個疾病組；以及(3)Sema3D應在微陣列結果中檢測到。表1總結了所有檢索到的資料集以及在本發明的分析中將它們包含或排除的原因。

表1、選定的海馬迴中基因表現的GEO資料集

從GEO資料庫獲得的原始基因表現數據和疾病嚴重程度分類。檢索到的資料集是從兩個平台獲得的微陣列數據集：Affymetrix人類基 因體U133和Affymetrix人類基因1.0 ST陣列(表1)。過濾後，保留來自失智、年老、具有泛素包含體之額顳葉退化症(frontotemporal lobar degeneration with ubiquitinated inclusions，FTLD-U)和阿茲海默症(AD)的六個人類海馬迴微陣列資料集(GSE84422、GSE11882、GSE13162、GSE1297、GSE48350和GSE36980)以用於進一步分析。

對於每個轉錄組(transcriptome)資料集，查詢關於Sema3D和Sema3A的原始表現數據並透過log2方法轉換為訊號強度。接下來，將訊號強度的結果透過控制個體的平均強度進行標準化，並根據原始文章提供的疾病嚴重程度進行分類。最後，透過比較疾病組和控制組之間的訊號強度來計算Sema3D/Sema3A表現的倍數變化。

從艾倫腦部地圖獲得的基因表現數據

為了研究人類海馬迴中的Sema3A和Sema3D表現程度，從艾倫腦部地圖(Allen Brain Atlas)(https：//portal.brain-map.org/)下載了RNA定序數據。在本發明中，分析了94名年齡在77至100歲以上的捐贈者的RNA定序數據的Sema3A和Sema3D基因表現。

衰老相關的β半乳糖苷酶(SA β-gal)活性分析

使用SPiDER-βGal分析套組和X-gal基底的染色來判定衰老相關的β半乳糖苷酶活性。簡單來說，首先將腦切片固定在含有4%多聚甲醛(paraformaldehyde)的PBS中。用PBS洗滌3次後，將0.5mm腦切片暴露於X-gal溶液(1mg/ml X-gal；5mM K₃Fe(CN)₆；5mM K₄Fe(CN)₆；1mM MgCl₂，在PBS中；pH=6.0)或SPiDER-βGal染色液中。包埋在載玻片上並使用解剖或免疫螢光共軛焦顯微鏡(Leica SP2/SP8X)研究皮層和海馬迴 中的訊號。SPiDER-βGal陽性細胞的訊號強度透過DAPI訊號進行標準化，並透過Image J軟體定量。

RNA分離和mRNA程度的測量

使用Trizol試劑從細胞中提取全部RNA。根據製造商的說明，使用AB7900即時PCR系統(Applied Biosystems)對來自細胞和組織的cDNA進行定量即時PCR分析。使用對小鼠Sema3A、Sema3D、p16^INK4a、p19^Arf和GAPDH的特異性引子。將每個基因的比例標準化作為內部控制組(GAPDH)，並採用2^-△△Ct相對定量方法來對表現程度進行定量。

靶向位點預測和螢光素酶(luciferase)報告基因分析

兩種演算法(algorithms)用於預測miR-195靶向基因和結合位點：miRanda(http：//microrna.sanger.ac.uk/targets/v5/)和TargetScan(http：//ta_rgetscan.org)。Sema3D 3'-UTR中對應的種子區域(seed region)被突變以破壞Sema3D和miR-195之間的鹼基配對。使用螢光素酶活性來測試Sema3D是否為miR-195靶向基因。構建含有預測性的Sema3D結合位點或突變結合位點的報告質體並轉染到HEK293細胞中。24小時後，透過HiPerFect轉染試劑(Invitrogen)將miR-195或陰性控制微小RNA(microRNA)轉染到HEK-293細胞中，以研究miR-195是否可以直接與目標3'-非翻譯區(3’-untranslated region，3'-UTR)序列結合。比較轉染正常或突變質體的細胞之間的螢光素酶活性。如果Sema3D是miR-195的標靶，則轉染突變質體的細胞中的螢光素酶活性應該更高，因為miR-195無法發揮其減弱(knockdown)作用。

西方墨點法分析

對於西方墨點法分析，使用有補充蛋白酶和磷酸酶抑製劑(Complete and Phosphostop,Roche)的RIPA緩衝液將細胞顆粒(cell pellets)或大腦樣本均質化(homogenized)並裂解。將20μg蛋白質進行SDS-PAGE，並將電泳後的蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride membrane)(Millipore)上。免疫墨點與初級抗體在4℃下孵育過夜。洗滌後，免疫墨點與辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)偶聯的二級抗體在4℃下孵育1小時。根據製造商的說明，使用ECL西方墨點法檢測試劑(GE)進行免疫墨點分析。

Sema2A過量表現果蠅(Drosophila)、壽命和運動分析

攜帶elav-Gal4或UAS-Sema2a-GFP的果蠅獲自布魯明頓果蠅庫存中心(Bloomington Drosophila stock center)(Indiana University,Bloomington,IN,USA)，並於2℃、12小時光暗循環以及60%相對濕度下的標準玉米粉培養基上成長。為了在神經系統中過量表現Sema2A，將攜帶神經元特異性驅動基因elav-Gal4的處女雌性果蠅與攜帶UAS-Sema2a-GFP的雄性果蠅雜交，牠們的F1後代會是過量表現Sema2A的果蠅。攜帶elav-Gal4的處女雌性果蠅和雄性野生型果蠅的F1後代作為控制組的果蠅。

為了研究Sema2A對壽命的影響，使用過量表現Sema2A的果蠅和控制組的果蠅(數量為300/組)，並且每7天計算一次存活的果蠅。記錄死掉的果蠅的數量並繪製存活曲線。Gehan-Breslow-Wilcoxon檢驗用於判定Sema2A過量表現果蠅和控制組的果蠅之間的統計差異。

使用負趨地性分析(negative Geotaxis assay)判定過量表現Sema2的果蠅的運動活性。簡單來說，將一組大約15隻的果蠅放置在具有 錐形底端的垂直柱狀體(長25cm，直徑1.5cm)中。在輕輕敲擊時，果蠅會受到驚嚇並做出爬上去的反應。30秒後，對到達頂部一半的果蠅進行計數，並透過計算超過中線以上的果蠅與果蠅總數的比率來判定攀爬分數。曼-惠特尼檢驗用於判定Sema2A過量表現的果蠅和控制組的果蠅之間的統計差異。

模板鑑定(Template identification)和蛋白質同源性建模(protein homology modeling)

人類Sema3D的結構不可用於RCSB蛋白質數據銀行(RCSB Protein Data Bank)(http：//www.rcsb.org/)。BLASTP用於鑑定RCSB蛋白質數據銀行中的同源物(homologs)。來自小鼠(Mus musculus)(PDB代碼為4GZ8)的Sema3A的X射線晶體結構，與Sema3D具有60.04%的序列同一性，其在SWISS-MODEL工具期間作為模板。在最佳化後，經由結構分析和驗證服務器(Structural Analysis and Verification Server，SAVES)(http：//nihserver.mbi.ucla.edu/SAVES)中可用的VERIFY 3D和PROCHECK程式確認Sema3D的預測模型。VERIFY 3D程式檢查了具有任何胺基酸序列(1D)的蛋白質3D模型的相容性。PROCHECK程式用於評估蛋白質二級結構的立體化學質量(stereochemical quality)。

研究批准

中國醫藥大學的動物照護和使用委員會批准了動物實驗方案(批准號：CMUIACUC-2017-292)，該方案嚴格符合NIH實驗動物照護和使用指引(NIH公開號：85-23，1996年修訂)。

統計分析

文中和圖中的所有值均表示為平均值±平均值標準誤差(SEM)。使用學生t檢驗(Student’s t test)評估統計差異。透過雙因子變異數分析(ANOVA)評估認知測試的組間比較。Gehan-Breslow-Wilcoxon檢驗用於果蠅壽命分析，曼-惠特尼檢驗(Mann-Whitney test)用於分析果蠅的攀爬得分。在所有實驗中，小於0.05的p值被認為是具有統計上的差異。使用Prism7軟體(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA,USA)進行數據分析和圖形繪製。

結果

低miR-195程度導致認知障礙

全身性miR-195a剔除(KO)小鼠已經製造出。值得注意的是，一隻小鼠具有兩個miR-195基因(miR-195a和miR-195b)，而本發明的小鼠模型中只有miR-195a基因是被剔除的。大腦中的miR-195程度高於幾個內臟器官。miR-195表現程度在本發明的miR-195a KO小鼠的大腦中顯著降低了25~50%，在其他器官中顯著降低了50~75%(圖1A-1B)。此外，WT小鼠的大腦miR-195程度隨著年齡的增長而降低(圖1C)。

為了研究低miR-195程度是否可影響認知功能，比較了不同年齡的miR-195a KO和WT小鼠之間的學習、記憶和運動功能(表2)。

表2、不同年齡層的miR-195a KO與WT小鼠的行為測試結果

空間學習和記憶透過莫里斯水迷宮(MWM)測試來評估，工作記憶透過Y迷宮測試來測量，並且運動活性透過曠野測試(OFT)來評估。MWM測試是根據圖2A中描述的方案來進行的。

對於空間學習，3-5個月大的miR-195a KO小鼠的表現不如WT小鼠，其證據為需要更長的時間來找到隱藏平台(圖2B)。有三項記憶測量，兩項來自MWM測試，一項來自Y迷宮測試(表2)。當小鼠3到12個月大時，透過MWM測試中更長的逃避潛伏期(圖2C)和在Y迷宮 測試中更長的潛伏期到達有玩具的臂(圖3A)，因此判斷miR-195a KO小鼠的記憶力較差。然而，在12個月大後，KO和WT小鼠在這兩項記憶測試中的表現變得沒有差異。MWM測試中的另一項記憶參數是目標象限的進入頻率，但無論年齡如何，都沒有顯示KO和WT小鼠之間具有任何差異(圖2D)。與6-12個月大的WT小鼠相比，miR-195a KO小鼠的運動活性較差(圖3B)。與記憶和空間學習相似，老年的KO和WT小鼠在運動活性方面沒有差異。上述結果暗示miR-195a KO小鼠可能加速了大腦的老化過程，導致認知功能較差。

miR-195表現量低會加速老化並加劇神經退化

由於認知功能不全(cognitive dysfunction)是一種重要的年老特徵，因此推測miR-195缺陷也與其他年老表型相關，包括壽命、分子生物標誌、神經幹細胞(NSCs)和樹突棘。因此本發明比較WT小鼠和miR-195a KO小鼠的壽命、平均壽命(mean lifespan)、中位壽命(median lifespan)和減少百分比的結果顯示在表3中。與WT小鼠相比，miR-195a KO小鼠的平均壽命和中位數壽命縮短了約25%(圖4A)。此外，本發明檢查了大腦中的兩種年老生物標誌，其為衰老相關的β半乳糖苷酶(SA β-gal)活性以及p16^Ink4a/p19^Arf表現。使用了兩種不同的SA β-gal染色方法，兩種都顯示出SA β-gal活性的大幅度增加，這是早在4個月大的miR-195a KO小鼠的海馬迴和皮層中所觀察到的。相反地，在WT小鼠中，SA β-gal活性直到12月大才增加(圖4B-4C)。此外，本發明在WT小鼠的SA β-gal染色數據與之前的報告一致。一致地，與WT小鼠相比，4個月大的miR-195a KO小鼠大腦中p16^Ink4a和p19^Arf的表現顯著升高(圖4D)。

表3、WT小鼠和miR-195a KO小鼠的壽命分析

神經幹細胞數量或樹突棘密度的減少與年老相關。本發明比較miR-195a KO和WT小鼠之間的齒狀回(DG)和腦室下區(SVZ)中Sox2⁺神經幹細胞的數量。如預期的，在WT小鼠的DG(圖5A)和SVZ(圖5C)中，神經幹細胞數量隨著年齡的增長而減少。然而，在4個月大的miR-195a KO小鼠中，DG和SVZ中的神經幹細胞數量分別減少了40%和50%，這與在12個月大WT小鼠中觀察到的結果相同。此外，高爾基-考克斯染色的組織學分析顯示，與年齡匹配的WT小鼠相比，miR-195a KO小鼠的海馬迴中的樹突棘密度顯著下降50%(圖5B)。

上述所有實驗一致表明，當miR-195表現量低會促進大腦老化和認知功能受損，這促使本發明尋找參與促進腦老化過程的關鍵miR-195所調節的分子。

miR-195對腦中Sema3的調節

之前已經報導Sema3A是miR-195的直接標靶，並且神經細胞在壓力下，Sema3A會過量表現而促進了細胞凋亡。為了探索其他Sema3成員是否涉及miR-195a KO小鼠的腦老化過程，使用生物資訊學演算法(bio-informatics algorithms)(miRanda和TargetScan)來預測Sema3家族中的miR-195標靶基因。在Sema3家族成員中，Sema3A和Sema3D被顯 示為miR-195的直接標靶。因此，Sema3D 3'-UTR中對應的種子區域(seed region)被突變以破壞Sema3D和miR-195之間的鹼基配對。本發明針對Sema3D 3’-UTR的第2772-2792位置進行突變，其突變位置如表4所示。

表4、Sema3D 3’-UTR的第2772-2792位置

攜帶野生型或突變型Sema3D 3'-UTR的報告質體(reporter plasmids)被轉染到HEK293細胞中。螢光素酶報告基因檢測證實miR-195直接與Sema3D RNA 3'-UTR結合(圖6A)。Sema3A和Sema3D的量在miR-195a KO小鼠的海馬迴中均增加(圖6B-6C)，並且在WT小鼠中Sema3D蛋白量比Sema3A高3倍(圖6B)。同樣地，艾倫腦部地圖的RNA序列分析顯示，在人類海馬迴中的Sema3D mRNA的量比Sema3A高50%(圖6D)。由於報導指出Sema3A與神經退化性疾病有關，而Sema3D在腦功能中的作用尚不清楚，故本發明決定進一步研究Sema3D在這方面的作用。

Sema3D程度與年老特徵和神經退化性疾病相關

為了探索Sema3D與年齡相關的神經退化之間的相關性，在4、13和21個月大的WT小鼠中檢測大腦Sema3D的表現。組織學染色顯示Sema3D呈年齡依賴性增加(圖7A)。然後，本發明使用NCBI基因表現綜合(GEO)資料庫測試Sema3D與人類神經退化性疾病之間的潛在相關性。根據方法部分和圖7B中描述的過濾標準，有六個可用的GEO資料集， 其包含具有Sema3D表現數據的人類海馬迴基因表現檔案(gene expression profiles)(表5)。這些資料集包括一個根據臨床失智評量表(Clinical Dementia Rating)的有失智症個體的資料集、三個阿茲海默症(AD)患者的資料集、一個患有具有泛素包含體之額顳葉退化症(FTLD-U)患者的資料集以及一個正常年老個體的資料集。此外，還對Sema3A數據進行分析並呈現於表5中。

在三個AD資料集中，海馬迴Sema3D程度在兩個資料集(GSE1297和GSE48350)中較嚴重的AD個體內顯著更高(表5)。同樣地，在失智症(GSE84422)和FTLD-U(GSE13162)數據中，較嚴重的個體的海馬迴Sema3D表現程度更高。此外，在不同年齡的正常個體的資料集(GSE11882)中，海馬迴Sema3D程度顯示出年齡依賴性增加，這與本發明的鼠類(rodent)大腦樣本的發現一致(圖7A)。總之，這些數據表明失智患者和正常個體的神經退化都會出現Sema3D高表現量，這暗示Sema3D可能直接導致神經退化。

表5、神經退化性疾病和年老資料集中的海馬迴Sema3D和Sema3A表現的列表

Sema3D是神經退化和認知障礙的直接原因

為了建立海馬迴Sema3D蛋白與神經退化以及認知功能不全之間的因果關係，將表現Sema3D的慢病毒(Lv.Sema3D)施予到4個月大的WT小鼠雙側的海馬迴。這種注射避免Sema3D在皮質中過量表現。透過在第7天測量Sema3D蛋白的程度來確認病毒轉染的效率。免疫墨點數據顯示海馬迴中的Sema3D表現量增加了3倍，而皮層中的Sema3D表現量僅略有增加(圖8A)。高爾基-考克斯染色的組織學分析顯示Sema3D過量表現小鼠的海馬迴中樹突棘密度顯著下降(圖8B)，這支持Sema3D對神經元細胞形態的負面影響。

接著，進行四項測試來檢驗Sema3D對Sema3D過量表現小鼠的認知功能的有害影響。除了在miR-195a KO小鼠中所進行的三項相同的測試外，還在Sema3D過量表現小鼠中使用新物體識別測試來進行識別記憶。MWM測試方案如圖8C所示。與控制組的小鼠相比，Sema3D過量表現小鼠表現出明顯的學習缺陷(p=0.0015；圖8D)。在MWM測試的記 憶試驗中，Sema3D過量表現小鼠在平台象限的潛伏期(p=0.0025；圖8E)和頻率(p<0.0001；圖8F)方面均不及控制組。一致地，Sema3D過量表現小鼠表現出識別記憶受損，這反映在較低的判別指數上(p=0.0007；圖8G)。雖然Sema3D過量表現小鼠的工作記憶較差，但由於變異太大，該測試在統計上並不顯著(p=0.071；圖8H)。因為Sema3D只有在海馬迴過量表現，Sema3D過量表現小鼠並沒有降低運動活性(p=0.248；圖8I)。

為了進一步證實Sema3D可以解釋miR-195a KO小鼠的認知障礙，透過對12個月大的miR-195a KO小鼠單次注射siRNA來減弱(knockdown)海馬迴的Sema3D。透過免疫螢光分析來評估Sema3D的減弱效率(圖9A)，並透過Y迷宮測試來評估空間工作記憶和運動功能(參見圖9B中描述的方案)。該結果顯示，接受siRNA-Sema3D注射的小鼠比接受siRNA-Ctrl的小鼠表現出更好的空間工作記憶，這可以透過更高的交替(alteration)百分比和具有p值為0.042的最佳適配線(the best-fit-line)的較陡斜率(steeper slope)來證明(圖9C)。與Sema3D過量表現的影響相似，siRNA-Sema3D不影響運動功能(圖9D)，因為siRNA是特地注射到海馬迴中，而海馬迴不應影響運動功能。降低miR-195a KO小鼠的Sema3D，神經退化的影響也反映在海馬迴神經元中樹突棘密度的降低(圖9E)。

總結來說，組織學和行為結果暗指Sema3D與認知障礙和神經退化具有因果關係。此外，抑制Sema3D可能是解釋miR-195在大腦中的保護功能的一個主要原因。

Sema3D高表現量會縮短壽命並損害果蠅的攀爬活動

越來越多的證據支持神經退化可以縮短壽命的觀點。果蠅(Drosophila)模型用於測試Sema3D程度與壽命之間的關聯。由於果蠅中的Sema2A基因是人和小鼠中Sema3D基因的同源基因，因此Sema2A在果蠅的神經系統中過量表現(註記為Sema2A過量表現的果蠅)。如圖10A所示，過量表現Sema2A的果蠅的壽命明顯短於控制組的果蠅(數量為300/每組，p<0.0001)。如表6所示，Sema2A組的平均壽命減少26%，最大壽命也從75天顯著減少到63天。果蠅壽命的減少與miR-195a KO小鼠的壽命數據一致(圖4A)。此外，本發明在成年蒼蠅中使用攀爬分析來評估神經功能是否完好，因為作為行為輸出的運動需要神經型態的精細協調，並且對功能中斷很敏感。Sema2A過量表現果蠅的運動功能降低，即攀爬分數降低所示(p=0.020；圖10B)。

表6、Sema2A過量表現的果蠅的壽命分析

Sema3D對大腦的有害影響的機制

本發明探索Sema3D有害影響的兩種可能機制，它們是神經幹細胞的功能和自噬作用(autophagy)。

神經再生

神經幹細胞的功能與神經再生有關。本發明推測Sema3D是否可以破壞神經幹細胞功能以解釋其對神經退化的影響，並部分解釋miR-195a KO小鼠中的低神經幹細胞族群密度(圖5A和圖5C)。進行神經 球形成分析並定量神經幹細胞的數量。該結果顯示，Sema3D劑量呈依賴性地抑制人類神經幹細胞的神經球形成，暗示Sema3D損害神經幹細胞的幹細胞特性(圖10C)。當重組Sema3D用腦室內(ICV)注射到小鼠時，Sema3D呈劑量依賴性地減少了DG和SVZ中的神經幹細胞族群大小(圖10D中的DG結果和圖10E中的SVZ結果)。因此，Sema3D降低了神經幹細胞特性並導致神經幹細胞損失，這可能會導致神經退化。

自噬作用

自噬作用的破壞在神經退化性疾病中扮演重要的角色，據報導PI3K/AKT/mTOR路徑在自噬過程中作為主要調節者。因此，本發明假設Sema3D可能透過調節自噬作用和PI3K/AKT/mTOR路徑來誘導神經退化。為了驗證本發明的假設，本發明首先透過在小鼠的海馬迴中過量表現Sema3D和用Sema3D處理的SY5Y細胞來探索Sema3D對自噬作用效率的影響。與Lv.Ctrl處理的小鼠相比，Lv.Sema3D處理的小鼠在海馬迴中具有較高程度的p-mTOR/mTOR和p62，以及較低程度的Beclin-1和LC3-II/I比率(圖11A)。一致地，Sema3D呈劑量依賴性地增加p62，並降低在Sema3D處理的SY5Y細胞Beclin-1和LC3-II/I的比率(圖11B)。因此，體外和體內模型均表明Sema3D顯著破壞自噬作用。

接著，本發明評估PI3K/AKT/mTOR路徑是否可以被Sema3D調節以及Sema3D誘導的神經退化是否可以被作為mTOR抑製劑的雷帕黴素所救援。事實上，本發明的結果顯示Sema3D呈劑量依賴性地增加了SY5Y細胞中PI3K、Akt和mTOR的磷酸化(圖11C)。此外，Sema3D抑制SY5Y細胞的增生，這被雷帕黴素所逆轉(圖11D)。為了證明本發明 在體內的發現，在注射Lv.Sema3D到雙側海馬迴5分鐘後，將單劑量的雷帕黴素注射到雙側海馬迴。組織學圖像顯示雷帕黴素逆轉了Sema3D所誘導的神經退化，其透過樹突棘的密度增加所證實(圖11E)。總結來說，這些數據表明Sema3D透過mTOR依賴性路徑損害神經元的自噬作用，而這種路徑被雷帕黴素所救援。

Sema3D在糖尿病大鼠中高度表現

Sema3D表現程度也在糖尿病視網膜中增加。此外，Sema3D在糖尿病動物的視網膜中的表現程度高於Sema3A。大鼠於糖尿病發病後第4週，視網膜Sema3D mRNA量顯著增加了1.6倍(p=0.0014；每組數量為2，圖12A)。IHC染色也顯示小鼠於糖尿病後的第8週，視網膜中Sema3D蛋白增加(圖12B，數量為3)。

本發明適當地描述可以在本文未具體公開的要件或限制下實施。已被用作描述的術語並不是限制。在使用這些術語和除此之外的任何同等物的表達和描述是沒有差別的，但應當認識到本發明內的權利是可修改的。因此，雖然本發明已說明實施例和其他情況，本文中所公開的內容可以被本領域的技術人員進行修飾和變化，並且這樣的修改和變化被認為是在本發明的權利範圍之內。

<110> 中國醫藥大學

<120> SEMA3D拮抗劑用於預防或治療神經退化性疾病以及延長壽命之用途

<130> 3684-CMU-TW

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> miR-195 mimic

<400> 1

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> anti-miR195

<400> 2

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> negative control

<400> 3

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> siRNA-Sema3D

<400> 4

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> siRNA-Sema3D

<400> 5

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> siRNA-Sema3D

<400> 6

<210> 7

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> siRNA-Sema3D

<400> 7

<210> 8

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<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> siRNA-Ctrl

<400> 8

<210> 9

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<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> siRNA-Ctrl

<400> 9

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<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> siRNA-Ctrl

<400> 10

<210> 11

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> siRNA-Ctrl

<400> 11

<210> 12

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> WT mouse

<400> 12

<210> 13

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> has-miR-195

<400> 13

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> mutant mouse

<400> 14

Claims (17)

1. 一種組合物用於製備預防或治療神經退化性疾病的藥物之用途，其中該組合物包含一治療有效劑量的訊號蛋白3D(Sema3D)拮抗劑，且該Sema3D拮抗劑不包含微小RNA-195。
2. 如請求項1所述之用途，其中該神經退化性疾病包含阿茲海默症、帕金森氏症、額顳葉退化症、具有泛素包含體之額顳葉退化症、年齡相關的認知衰退、血管性失智症、皮質基底核退化症、進行性核上麻痺、路易氏體失智症、亨汀頓氏舞蹈症、纏結為主型老年癡呆、皮克氏病、嗜銀顆粒性失智症、關島型帕金森氏症-癡呆綜合症、利替可-波帝格症、肌肉萎縮性側索硬化症、脊髓小腦萎縮症、脊髓延髓性肌肉萎縮症、運動神經元疾病、多發性硬化或創傷性腦損傷。
3. 如請求項1所述之用途，其中該Sema3D拮抗劑透過增加海馬迴的樹突棘和促進神經再生來預防或治療該神經退化性疾病。
4. 如請求項3所述之用途，其中該增加海馬迴的樹突棘包含增加海馬迴中的CA1錐體神經元的樹突棘密度。
5. 如請求項3所述之用途，其中該促進神經再生包含增加神經幹細胞、上調自噬作用以及促進神經元增生。
6. 如請求項5所述之用途，其中該增加神經幹細胞包含增加海馬齒狀回和腦室下區中的神經幹細胞。
7. 一種組合物用於製備延長壽命的藥物之用途，其中該組合物包 含一治療有效劑量的訊號蛋白3D(Sema3D)拮抗劑。
8. 如請求項7所述之用途，其中該Sema3D拮抗劑透過延緩衰老來延長壽命。
9. 如請求項7所述之用途，其中該Sema3D拮抗劑抑制一年老相關生物標誌的表現。
10. 如請求項9所述之用途，其中該年老相關生物標誌包含衰老相關的β半乳糖苷酶、p16^Ink4a以及p19^Arf。
11. 一種組合物用於製備促進神經再生的藥物之用途，其中該組合物包含一治療有效劑量的訊號蛋白3D(Sema3D)拮抗劑，且該Sema3D拮抗劑不包含微小RNA-195。
12. 如請求項11所述之用途，其中該Sema3D拮抗劑透過增加神經幹細胞、上調自噬作用以及促進神經元增生來促進神經再生。
13. 如請求項12所述之用途，其中該上調自噬作用包含上調PI3K/Akt/mTOR訊號路徑。
14. 一種組合物用於製備預防或治療視網膜神經退化性疾病的藥物之用途，其中該組合物包含一治療有效劑量的訊號蛋白3D(Sema3D)拮抗劑。
15. 如請求項14所述之用途，其中該視網膜神經退化疾病包含糖尿病性視網膜病變、老年性黃斑部退化、視神經炎、近視誘發的視網膜病變或青光眼相關的視網膜病症。
16. 如請求項1、7、11或14中任一項所述的用途，其中該Sema3D拮抗劑包含一對抗Sema3D的結合物，其中該結合物包含化合物、多肽、抗體、抗體片段或寡核苷酸。
17. 如請求項16所述的用途，其中該寡核苷酸包含反義DNA、反義RNA、短小干擾RNA(siRNA)、小髮夾RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)或適體。

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