JP2023519871A

JP2023519871A - Ｓｔｍｎ２レベルを回復させるための方法及び組成物

Info

Publication number: JP2023519871A
Application number: JP2022558277A
Authority: JP
Inventors: ケビンシー．エガン，; ジョセフロバートクリム，; ロバートエイチ．ジュニアブラウン，; ジョナサンケー．ワッツ，
Original assignee: Harvard College
Current assignee: Harvard College
Priority date: 2020-03-25
Filing date: 2021-03-25
Publication date: 2023-05-15
Also published as: US20240011027A1; EP4127172A2; WO2021195446A3; CN116034161A; CA3176884A1; WO2021195446A2

Abstract

本開示は、対象の神経細胞におけるＴＤＰ病変またはＴＤＰ－４３の機能性の減退に関連する疾患または状態を処置するための、及び不完全なまたは変化したＳＴＭＮ２ＲＮＡ配列の包含を抑制または防止する候補薬剤を同定するための、組成物及び方法に関する。

Description

関連出願
本出願は、２０２１年１月４日に出願された米国仮特許出願第６３／１３３，７４９号、２０２０年８月７日に出願された米国仮特許出願第６３／０６３，１７４号、及び２０２０年３月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／９９４，７９７号に対する優先権を主張する。上記出願の教示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、上位運動ニューロン及び下位運動ニューロンの両方の選択的喪失を特徴とする致死性の神経変性疾患である（１）。ＡＬＳ患者は進行性麻痺を経験し、発声困難、嚥下困難、及び最終的には呼吸困難を発症し（２、３）、通常、診断時から１～５年後にこの疾患により死亡する。疾患の進行を若干変化させる２つのＦＤＡ承認薬を除いて（４）、ＡＬＳの処置は支持療法に限られている。ＡＬＳは現在、初老期認知症の最も一般的な原因である前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）と同じ臨床的及び病理学的範囲にあると認識されている。ＦＴＤは、効果的な処置が存在しない、行動の変化、言語障害、及び実行機能の喪失を特徴とする（５）。ほとんどのＡＬＳ及びＦＴＤ症例の病因は依然として不明であるが、病理学的所見及び家族ベースの連鎖研究により、両疾患に関与する分子経路に重複があることが実証されている（１、６）。

ＫｌｉｍＪＲ，ＷｉｌｌｉａｍｓＬＡ，ＬｉｍｏｎｅＦ，ＧｕｅｒｒａＳａｎＪｕａｎＩ，Ｄａｖｉｓ－ＤｕｓｅｎｂｅｒｙＢＮ，ＭｏｒｄｅｓＤＡ，ＢｕｒｂｅｒｒｙＡ，ＳｔｅｉｎｂａｕｇｈＭＪ，ＧａｍａｇｅＫＫ，ＫｉｒｃｈｎｅｒＲ，ＭｏｃｃｉａＲ，ＣａｓｓｅｌＳＨ，ＣｈｅｎＫ，ＷａｉｎｇｅｒＢＪ，ＷｏｏｌｆＣＪ，ＥｇｇａｎＫ．ＡＬＳ－ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎＴＤＰ－４３ｓｕｓｔａｉｎｓｌｅｖｅｌｓｏｆＳＴＭＮ２，ａｍｅｄｉａｔｏｒｏｆｍｏｔｏｒｎｅｕｒｏｎｇｒｏｗｔｈａｎｄｒｅｐａｉｒ．ＮａｔＮｅｕｒｏｓｃｉ．２０１９；２２（２）：１６７－７９．Ｅｐｕｂ２０１９／０１／１６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９３－０１８－０３００－４．ＰｕｂＭｅｄＰＭＩＤ：３０６４３２９２．ＭｅｌａｍｅｄＺ，Ｌｏｐｅｚ－ＥｒａｕｓｋｉｎＪ，ＢａｕｇｈｎＭＷ，ＺｈａｎｇＯ，ＤｒｅｎｎｅｒＫ，ＳｕｎＹ，ＦｒｅｙｅｒｍｕｔｈＦ，ＭｃＭａｈｏｎＭＡ，ＢｅｃｃａｒｉＭＳ，ＡｒｔａｔｅｓＪＷ，ＯｈｋｕｂｏＴ，ＲｏｄｒｉｇｕｅｚＭ，ＬｉｎＮ，ＷｕＤ，ＢｅｎｎｅｔｔＣＦ，ＲｉｇｏＦ，ＤａＣｒｕｚＳ，ＲａｖｉｔｓＪ，Ｌａｇｉｅｒ－ＴｏｕｒｅｎｎｅＣ，ＣｌｅｖｅｌａｎｄＤＷ．Ｐｒｅｍａｔｕｒｅｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄｌｏｓｓｏｆｓｔａｔｈｍｉｎ－２ｉｓａｈａｌｌｍａｒｋｏｆＴＤＰ－４３－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．ＮａｔＮｅｕｒｏｓｃｉ．２０１９；２２（２）：１８０－９０．Ｅｐｕｂ２０１９／０１／１６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９３－０１８－０２９３－ｚ．ＰｕｂＭｅｄＰＭＩＤ：３０６４３２９８；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ６３４８００９．ＰｒｕｄｅｎｃｉｏＭ，ＨｕｍｐｈｒｅｙＪ，ＰｉｃｋｌｅｓＳ，ＢｒｏｗｎＡＬ，ＨｉｌｌＳＥ，ＫａｃｈｅｒｇｕｓＪ，ＳｈｉＪ，ＨｅｃｋｍａｎＭ，ＳｐｉｅｇｅｌＭ，ＣｏｏｋＣ，ＳｏｎｇＹ，ＹｕｅＭ，ＤａｕｇｈｒｉｔｙＬ，ＣａｒｌｏｍａｇｎｏＹ，Ｊａｎｓｅｎ－ＷｅｓｔＫ，ＦｅｒｎａｎｄｅｚＤｅＣａｓｔｒｏＣ，ＤｅＴｕｒｅＭ，ＫｏｇａＳ，ＷａｎｇＹＣ，ＳｉｖａｋｕｍａｒＰ，ＢｏｄｏＣ，ＣａｎｄａｌｉｊａＡ，ＴａｌｂｏｔＫ，ＳｅｌｖａｒａｊＢＴ，ＢｕｒｒＫ，ＣｈａｎｄｒａｎＳ，ＮｅｗｃｏｍｂｅＪ，ＬａｓｈｌｅｙＴ，ＨｕｂｂａｒｄＩ，ＣａｔａｌａｎｏＤ，ＫｉｍＤ，ＰｒｏｐｐＮ，ＦｅｎｎｅｓｓｅｙＳ，ＦａｇｅｇａｌｔｉｅｒＤ，ＰｈａｔｎａｎｉＨ，ＳｅｃｒｉｅｒＭ，ＦｉｓｈｅｒＥＭ，ＯｓｋａｒｓｓｏｎＢ，ｖａｎＢｌｉｔｔｅｒｓｗｉｊｋＭ，ＲａｄｅｍａｋｅｒｓＲ，Ｇｒａｆｆ－ＲａｄｆｏｒｄＮＲ，ＢｏｅｖｅＢ，ＫｎｏｐｍａｎＤＳ，ＰｅｔｅｒｓｅｎＲ，ＪｏｓｅｐｈｓＫ，ＴｈｏｍｐｓｏｎＥＡ，ＲａｊＴ，ＷａｒｄＭＥ，ＤｉｃｋｓｏｎＤ，ＧｅｎｄｒｏｎＴＦ，ＦｒａｔｔａＰ，ＰｅｔｒｕｃｅｌｌｉＬ．Ｔｒｕｎｃａｔｅｄｓｔａｔｈｍｉｎ－２ｉｓａｍａｒｋｅｒｏｆＴＤＰ－４３ｐａｔｈｏｌｏｇｙｉｎｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌｄｅｍｅｎｔｉａ．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ．２０２０．Ｅｐｕｂ２０２０／０８／１４．ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ１３９７４１．ＰｕｂＭｅｄＰＭＩＤ：３２７９０６４４．ｖａｎＥｅｒｓｅｌＪ，ＫｅＹＤ，ＧｌａｄｂａｃｈＡ，ＢｉＭ，ＧｏｔｚＪ，ＫｒｉｌＪＪ，ＩｔｔｎｅｒＬＭ．ＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎａｎｄａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎｏｆＴＤＰ－４３ｕｐｏｎｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｉｎｃｕｌｔｕｒｅｄｎｅｕｒｏｎｓ．ＰＬｏＳＯｎｅ．２０１１；６（７）：ｅ２２８５０．Ｅｐｕｂ２０１１／０８／１１．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２２８５０．ＰｕｂＭｅｄＰＭＩＤ：２１８２９５３５；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３１４６５１６．ＳｈｉｎＪＥ，ＭｉｌｌｅｒＢＲ，ＢａｂｅｔｔｏＥ，ＣｈｏＹ，ＳａｓａｋｉＹ，ＱａｙｕｍＳ，ＲｕｓｓｌｅｒＥＶ，ＣａｖａｌｌｉＶ，ＭｉｌｂｒａｎｄｔＪ，ＤｉＡｎｔｏｎｉｏＡ．ＳＣＧ１０ｉｓａＪＮＫｔａｒｇｅｔｉｎｔｈｅａｘｏｎａｌｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐａｔｈｗａｙ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２０１２；１０９（５２）：Ｅ３６９６－７０５．Ｅｐｕｂ２０１２／１１／２９．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２１６２０４１０９．ＰｕｂＭｅｄＰＭＩＤ：２３１８８８０２；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３５３５６７１．

ＴＤＰ－４３は、主に核内ＤＮＡ／ＲＮＡ結合タンパク質であり、転写調節、スプライシング、プレマイクロＲＮＡプロセシング、ストレス顆粒形成、ならびにメッセンジャーＲＮＡの輸送及び安定性において機能的役割を有する。ＴＤＰ－４３は、ＡＬＳ及びＦＴＤの多くの散発性症例における封入体の主要構成成分であることが見出された。ＴＤＰ－４３の異常な発現に応答して、ＳＴＭＮ２レベルの低下が見られる。ＳＣＧ１０としても知られるＳＴＭＮ２は、微小管安定性の調節因子であり、正常ヒト運動ニューロンの成長及び修復に必要なタンパク質をコードすることが示されてきた。本明細書には、ＳＴＭＮ２レベルを回復または増加させるための方法及び組成物が記載される。
本明細書には、ＳＴＭＮ２ｍＲＮＡ配列、プレｍＲＮＡ配列、または新生ＲＮＡ配列に特異的に結合し、それにより不完全なまたは変化したＳＴＭＮ２ＲＮＡ配列の包含を抑制または防止するアンチセンスオリゴヌクレオチドが開示される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＴＭＮ２ＲＮＡ配列のポリアデニル化部位に結合しない。いくつかの実施形態では、不完全なまたは変化したＳＴＭＮ２ＲＮＡ配列は、ＴＤＰ－４３の機能が減退しているかまたはＴＤＰ病変が存在する場合に発生しかつ存在量が増加する。

本明細書では、潜在性エクソンをコードするＳＴＭＮ２ｍＲＮＡ配列、プレｍＲＮＡ配列、または新生ＲＮＡ配列に特異的に結合し、それによりＳＴＭＮ２ＲＮＡへの潜在性エクソンの包含を抑制または防止するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、ＳＴＭＮ２ｍＲＮＡ配列、プレｍＲＮＡ配列、または新生ＲＮＡ配列のポリアデニル化部位に結合しないアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた開示される。

本明細書では、ＳＴＭＮ２ｍＲＮＡ配列、プレｍＲＮＡ配列、または新生ＲＮＡ配列に特異的に結合し、ＳＴＭＮ２タンパク質発現を増加させるアンチセンスオリゴヌクレオチドが更に開示される。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’スプライス部位、３’スプライス部位、または通常のＴＤＰ－４３結合部位を標的とするように設計されている。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上のスプライス部位を標的とする。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＤＰ－４３結合部位とポリアデニル化部位との間に位置する一本鎖領域を標的とするように設計されている。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、血小板毒性を呈さない。

本明細書では、配列番号３７～８５からなる群から選択される配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた開示される。いくつかの態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号３７～７４からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４０、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５６、及び配列番号７８からなる群から選択される配列を含むか、またはより具体的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５２を含み得る。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５３、配列番号７２、及び配列番号７３からなる群から選択される配列を含むか、またはより具体的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号７３または配列番号５３を含む。

本明細書では、配列番号３７～８５からなる群から選択される配列を含む１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物が更に開示される。いくつかの実施形態では、１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号３７～７４からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４０、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５６、及び配列番号７８からなる群から選択される配列を含むか、またはより具体的には、１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５２を含み得る。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５３、配列番号７２、及び配列番号７３からなる群から選択される配列を含むか、またはより具体的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号７３または配列番号５３を含む。

本明細書では、多量体オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物が開示される。多量体オリゴヌクレオチドは、配列番号３７～８５からなる群から選択される１つ以上の配列を含む。いくつかの実施形態では、多量体オリゴヌクレオチドは、配列番号３７～８５からなる群から選択される２つ以上の配列を含む。多量体オリゴヌクレオチドは、配列の複数のコピーを含んでもよく、または代わりに複数の配列の単一コピーを含んでもよい。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＴＭＮ２ＲＮＡへの潜在性エクソンの包含を抑制または防止する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、潜在性エクソンをコードするＳＴＭＮ２ＲＮＡ配列、プレｍＲＮＡ配列、または新生ＲＮＡ配列に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＴＭＮ２タンパク質の分解を防止するかまたは遅延させる。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＴＭＮ２タンパク質を増加させる。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’スプライス部位、３’スプライス部位、または通常のＴＤＰ－４３結合部位を標的とするように設計されている。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖領域、例えば、ＴＤＰ－４３結合部位とポリアデニル化部位との間に位置する一本鎖領域を標的とするように設計されている。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、潜在性スプライス部位の近位部位、早期ポリアデニル化部位の近位部位、または潜在性スプライス部位と早期ポリアデニル化部位との間に位置する部位を標的とするように設計されている。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、構造化されていない潜在性エクソン内の標的領域に結合する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＤＰ－４３により調節される５’スプライス部位の近傍にまたはそれに隣接して結合する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、予測されるＴＤＰ－４３結合部位の近位領域を標的とする。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＤＰ－４３の通常の結合部位を標的とする。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上のスプライス部位を標的とする。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、潜在性スプライシングを抑制する。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、２つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、いくつかの態様では、３つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、２つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、共有結合されている。いくつかの実施形態では、１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＴＭＮ２タンパク質発現を増加させる。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、神経変性疾患を処置するための薬剤、外傷性脳損傷を処置するための薬剤、またはプロテアソーム阻害剤誘導性ニューロパチーを処置するための薬剤を更に含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、遺伝子治療薬としてＳＴＭＮ２を更に含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＪＮＫ阻害剤を更に含む。

本明細書では、ＴＡＲＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）の機能性の減退に関連する疾患もしくは状態を処置すること、またはその疾患もしくは状態の可能性を低減させることを必要とする対象の神経細胞における、その疾患もしくは状態を処置するか、またはその疾患もしくは状態の可能性を低減させる方法もまた開示される。本方法は、ＳＴＭＮ２タンパク質のレベルの低減を補正するアンチセンスオリゴヌクレオチドに神経細胞を接触させることを含み得、この薬剤は、標的転写物のポリアデニル化部位を標的としない。

本明細書では、ＴＡＲＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）の機能性の減退に関連する疾患もしくは状態を処置すること、またはその疾患もしくは状態の可能性を低減させることを必要とする対象の神経細胞における、その疾患もしくは状態を処置するか、またはその疾患もしくは状態の可能性を低減させる方法が更に開示される。本方法は、ＳＴＭＮ２タンパク質発現を増加させるアンチセンスオリゴヌクレオチドに神経細胞を接触させることを含み得る。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、潜在性エクソンをコードするＳＴＭＮ２ＲＮＡ配列、プレＲＮＡ配列、または新生ＲＮＡ配列に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’スプライス部位、３’スプライス部位、または通常のＴＤＰ－４３結合部位を標的とするように設計されている。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖領域、例えば、ＴＤＰ－４３結合部位とポリアデニル化部位との間に位置する一本鎖領域を標的とするように設計されている。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、潜在性スプライス部位の近位部位、早期ポリアデニル化部位の近位部位、または潜在性スプライス部位と早期ポリアデニル化部位との間に位置する部位を標的とするように設計されている。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、構造化されていない潜在性エクソン内の標的領域に結合する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＤＰ－４３により調節される５’スプライス部位の近傍にまたはそれに隣接して結合する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、予測されるＴＤＰ－４３結合部位の近位領域を標的とする。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上のスプライス部位を標的とするように設計されている。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、正常長のまたはタンパク質をコードするＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡを回復させる。

いくつかの実施形態では、対象は、ニューロンの成長及び修復の改善を示す。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、神経変性疾患、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、パーキンソン病、またはアルツハイマー病である。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、外傷性脳損傷である。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、プロテアソーム阻害剤誘導性ニューロパチーである。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、神経細胞におけるＴＤＰ－４３のレベルの変異または低減に関連する。

いくつかの実施形態では、本方法は、有効量の第２の薬剤を対象に投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、神経変性疾患または外傷性脳損傷を処置するために投与される。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、ＳＴＭＮ２（例えば、遺伝子治療薬として投与される）である。

本明細書では、ＴＡＲＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）の機能性の減退に関連する疾患もしくは状態を処置すること、またはその疾患もしくは状態の可能性を低減させることを必要とする対象の神経細胞における、その疾患もしくは状態を処置するか、またはその疾患もしくは状態の可能性を低減させる方法もまた開示される。本方法は、ＳＴＭＮ２タンパク質のレベルの低減を補正するアンチセンスオリゴヌクレオチドに神経細胞を接触させることを含み得、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号３７～８５からなる群から選択される配列を含む。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号３７～７４からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４０、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５６、及び配列番号７８からなる群から選択される配列を含むか、またはより具体的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５２を含み得る。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５３、配列番号７２、及び配列番号７３からなる群から選択される配列を含むか、またはより具体的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号７３または配列番号５３を含む。

本明細書では、ＴＡＲＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）の機能性の減退に関連する疾患または状態の可能性を低減させることを必要とする対象の神経細胞における、その疾患または状態の可能性を低減させる方法が更に開示される。本方法は、ＳＴＭＮ２ＲＮＡへの潜在性エクソンの包含を抑制または防止する１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドに神経細胞を接触させることを含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号３７～８５からなる群から選択される配列を含む。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４０、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５６、及び配列番号７８からなる群から選択される配列を含むか、またはより具体的には、配列番号５２を含む。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５３、配列番号７２、及び配列番号７３からなる群から選択される配列を含むか、またはより具体的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号７３または配列番号５３を含む。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、潜在性エクソンをコードするＳＴＭＮ２ＲＮＡ配列、プレＲＮＡ配列、または新生ＲＮＡ配列に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’スプライス部位、３’スプライス部位、または通常のＴＤＰ－４３結合部位を標的とするように設計されている。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖領域、例えば、ＴＤＰ－４３結合部位とポリアデニル化部位との間に位置する一本鎖領域を標的とするように設計されている。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、潜在性スプライス部位の近位部位、早期ポリアデニル化部位の近位部位、または潜在性スプライス部位と早期ポリアデニル化部位との間に位置する部位を標的とするように設計されている。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、構造化されていない潜在性エクソン内の標的領域に結合する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＤＰ－４３により調節される５’スプライス部位の近傍にまたはそれに隣接して結合する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、予測されるＴＤＰ－４３結合部位の近位領域を標的とする。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＤＰ－４３の通常の結合部位を標的とする。

いくつかの実施形態では、疾患または状態は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、パーキンソン病、及びアルツハイマー病からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、外傷性脳損傷である。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、プロテアソーム阻害剤誘導性ニューロパチーである。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、潜在性スプライシングを抑制する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＴＭＮ２タンパク質の分解を防止するかまたは遅延させる。いくつかの実施形態では、対象は、ニューロンの成長及び修復の改善を示す。

いくつかの実施形態では、本方法は、有効量の第２の薬剤を対象に投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、神経変性疾患または外傷性脳損傷を処置するために投与される。

本明細書では、ＴＡＲＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）の機能性の減退に関連する疾患もしくは状態を処置すること、またはその疾患もしくは状態の可能性を低減させることを必要とする対象の神経細胞における、その疾患もしくは状態を処置するか、またはその疾患もしくは状態の可能性を低減させる方法であって、ＳＴＭＮ２タンパク質のレベルの低減を補正する多量体オリゴヌクレオチドに神経細胞を接触させることを含み、この多量体オリゴヌクレオチドが、配列番号３７～８５からなる群から選択される２つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む方法が、更に開示される。いくつかの実施形態では、多量体オリゴヌクレオチドは、配列番号３７～７４からなる群から選択される２つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。

本明細書では、潜在性エクソン内の非構造化領域を標的とするように設計されている、ＳＴＭＮ２タンパク質のレベルの低減を補正するアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた開示される。いくつかの実施形態では、潜在性エクソン内の非構造化領域は、潜在性スプライス部位と早期ポリアデニル化部位との間に位置する。

本明細書では、対象におけるＳＴＭＮ２またはＥＬＡＶＬ３タンパク質のレベルの変化を検出する方法もまた開示される。本方法は、対象から試料を得ることと；ＳＴＭＮ２またはＥＬＡＶＬ３タンパク質レベルが変化しているか否かを検出することと、を含む。いくつかの実施形態では、対象は、筋萎縮性側索硬化症を有する。いくつかの実施形態では、ＳＴＭＮ２またはＥＬＡＶＬ３レベルが変化しているか否かを検出することは、ＳＴＭＮ２またはＥＬＡＶＬ３レベルが低下しているか否かを（例えば、ＥＬＩＳＡを使用して）判定することを含む。いくつかの実施形態では、試料は、生体液試料（例えば、ＣＳＦ試料）である。

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ｈＭＮにおけるＴＤＰ－４３ノックダウンのＲＮＡシーケンシングを示す。培養ＭＮにおけるＴＤＰ－４３ノックダウンのためのｈＭＮ分化、精製、及びＲＮＡｉ戦略を示す模式図を提供する。ｈＭＮにおけるＴＤＰ－４３ノックダウンのＲＮＡシーケンシングを示す。５００個の最も差次的に発現した遺伝子に基づく生物学的に独立した２つのＭＮ分化及びｓｉＲＮＡトランスフェクション実験から得られた、ＲＮＡ－Ｓｅｑデータセットの多次元尺度解析を提供する。ｈＭＮにおけるＴＤＰ－４３ノックダウンのＲＮＡシーケンシングを示す。ｓｉＴＤＰ－４３で処置したｈＭＮにおいて、スクランブル対照で処置したものと比較して統計学的に誤調節された遺伝子を示すボルケーノプロットを提供する。差次的発現解析後に有意（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ調整Ｐ値カットオフ０．０５、及びｌｏｇ倍率変化比カットオフ０）であると同定された遺伝子を、黄色で（アップレギュレートされた／存在量が増加した遺伝子について）及び青色で（ダウンレギュレートされた／存在量が低下した遺伝子について）強調表示する。ｈＭＮにおけるＴＤＰ－４３ノックダウンのＲＮＡシーケンシングを示す。対照ｓｉＲＮＡで処置したＭＮにおいて発現した全ての遺伝子についてのＴＰＭ値を、ｓｉＴＤＰ－４３で処置した細胞におけるそれらの遺伝子の発現の倍率変化と比較した散布図を提供する。ｈＭＮにおけるＴＤＰ－４３ノックダウンのＲＮＡシーケンシングを示す。ＴＤＰ４３ノックダウン実験において「ヒット」（有意にアップレギュレートされた）として最初に同定された１１個の遺伝子のサブセットを、ｑＲＴ－ＰＣＲによる検証のために選択したことを示す。これらの遺伝子１１個のうち合計９個（ＴＤＰ－４３を含む）は、ｑＲＴ－ＰＣＲで発現をアッセイしたときにＴＤＰ－４３枯渇に対して予測された応答を示した（対応のないｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。ｈＭＮにおけるＴＤＰ－４３ノックダウンのＲＮＡシーケンシングを示す。ＴＤＰ４３ノックダウン実験において「ヒット」（有意にダウンレギュレートされた）として最初に同定された１１個の遺伝子のサブセットを、ｑＲＴ－ＰＣＲによる検証のために選択したことを示す。これらの遺伝子１１個のうち合計９個（ＴＤＰ－４３を含む）は、ｑＲＴ－ＰＣＲで発現をアッセイしたときにＴＤＰ－４３枯渇に対して予測された応答を示した（対応のないｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。家族性ＡＬＳモデルを示す。変異型ＴＤＰ－４３を発現するｉＰＳ細胞由来ｈＭＮにおける遺伝子発現を評価するための戦略の模式図を提供する。家族性ＡＬＳモデルを示す。健常対照（１１ａ、１８ａ、２０ｂ、１７ａ）ならびにＴＡＲＤＰに変異（＋／Ｑ３４３Ｒ、＋／Ｇ２９８Ｓ、＋／Ａ３１５Ｔ、及び＋／Ｍ３３７Ｖ）を有する患者のｉＰＳ細胞に由来する１０日間培養したニューロンの形態を示す顕微鏡写真を提供する。家族性ＡＬＳモデルを示す。対照またはＴＤＰ－４３患者から分化したニューロンにおけるＴＤＰ－４３ノックダウン後に一貫してアップレギュレートされた遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を提供する（対応のないｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。家族性ＡＬＳモデルを示す。対照またはＴＤＰ－４３患者から分化したニューロンにおけるＴＤＰ－４３ノックダウン後に一貫してダウンレギュレートされた遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を提供する（対応のないｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。家族性ＡＬＳモデルを示す。対照またはＴＤＰ－４３患者から分化したニューロンにおけるＴＤＰ－４３ノックダウン後に一貫してダウンレギュレートされた遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を提供する（対応のないｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。家族性ＡＬＳモデルを示す。対照またはＴＤＰ－４３患者から分化したニューロンにおけるＴＤＰ－４３ノックダウン後に一貫してダウンレギュレートされた遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を提供する（対応のないｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。家族性ＡＬＳモデルを示す。対照またはＴＤＰ－４３患者から分化したニューロンにおけるＴＤＰ－４３ノックダウン後に一貫してダウンレギュレートされた（図２Ｄ～２Ｆ）またはアップレギュレートされた（図２Ｃ）遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を提供する（対応のないｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。家族性ＡＬＳモデルを示す。対照またはＴＤＰ－４３患者から分化したニューロンにおけるＴＤＰ－４３ノックダウン後に一貫してダウンレギュレートされた（図２Ｄ～２Ｆ）またはアップレギュレートされた（図２Ｃ）遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を提供する（対応のないｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。家族性ＡＬＳモデルを示す。ＴＤＰ－４３（赤色）、β－ＩＩＩチューブリン（緑色）について免疫染色し、ＤＡＰＩ（青色）で対比染色した対照及び患者ニューロンの代表的な顕微鏡写真を提供する。スケールバーは１００μｍ。家族性ＡＬＳモデルを示す。ＴＤＰ－４３（赤色）、β－ＩＩＩチューブリン（緑色）について免疫染色し、ＤＡＰＩ（青色）で対比染色した対照及び患者ニューロンの代表的な顕微鏡写真を提供する。スケールバーは１００μｍ。家族性ＡＬＳモデルを示す。対照ニューロンをＴＤＰ－４３変異を有するニューロンと比較したＴＤＰ－４３免疫染色及びＤＡＰＩ蛍光に関するピアソンの相関分析を提供する。小点は個々の細胞を表す（対応のないｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。ＳＴＭＮ２の調節及び局在化を示す。２つの異なるプライマー対のセットを使用した独立した実験におけるＳＴＭＮ２転写物のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を提供する（対応のないｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。ＳＴＭＮ２の調節及び局在化を示す。ｓｉＲＮＡノックダウンによるＴＤＰ－４３の部分的な枯渇後のＴＤＰ－４３及びＳＴＭＮ２タンパク質レベルの免疫ブロット分析を提供する。タンパク質レベルをＧＡＰＤＨに対して正規化し、ｓｉＲＥＤ対照で処置したＭＮ中のレベルと比較して示す。ＳＴＭＮ２の調節及び局在化を示す。３つのＡＬＳ関連遺伝子（ＴＤＰ－４３、ＦＵＳ、及びＣ９ＯＲＦ７２）を標的とするｓｉＲＮＡで処置したＨｂ９：：ＧＦＰ＋ＭＮにおけるＳＴＭＮ２転写物分析のためのｑＲＴ－ＰＣＲ分析を提供する（ダネットの多重比較検定、アルファ値＜０．０５）。ＳＴＭＮ２の調節及び局在化を示す。ＴＤＰ－４３に結合した転写物を同定するためにホルムアルデヒドＲＮＡ免疫沈降を使用したことを示す。ＴＤＰ－４３免疫沈降（図３Ｄ）後、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を使用して、試料インプットに対するＴＤＰ－４３転写物（図３Ｅ）及びＳＴＭＮ２転写物（図３Ｆ）の濃縮を試験した。ＳＴＭＮ２の調節及び局在化を示す。ＴＤＰ－４３に結合した転写物を同定するためにホルムアルデヒドＲＮＡ免疫沈降を使用したことを示す。ＴＤＰ－４３免疫沈降（図３Ｄ）後、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を使用して、試料インプットに対するＴＤＰ－４３転写物（図３Ｅ）及びＳＴＭＮ２転写物（図３Ｆ）の濃縮を試験した。ＳＴＭＮ２の調節及び局在化を示す。ＴＤＰ－４３に結合した転写物を同定するためにホルムアルデヒドＲＮＡ免疫沈降を使用したことを示す。ＴＤＰ－４３免疫沈降（図３Ｄ）後、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を使用して、試料インプットに対するＴＤＰ－４３転写物（図３Ｅ）及びＳＴＭＮ２転写物（図３Ｆ）の濃縮を試験した。ＳＴＭＮ２の調節及び局在化を示す。ＴＤＰ－４３（赤色）、β－ＩＩＩチューブリン（緑色）について免疫染色し、ＤＡＰＩ（青色）で対比染色したＨｂ９：：ＧＦＰ＋ＭＮの顕微鏡写真を提供する。ＳＴＭＮ２の調節及び局在化を示す。ＳＴＭＮ２（赤色）及びＭＡＰ２（緑色）及びＧＯＬＧＩＮ９７（緑色）について免疫染色したグリア上で共培養したＨｂ９：：ＧＦＰ＋ＭＮの顕微鏡写真を提供する。ＳＴＭＮ２の調節及び局在化を示す。ＳＴＭＮ２（赤色）、ＭＡＰ２（緑色）について免疫染色し、Ｆ－アクチン結合タンパク質ファロイジン（白色）で対比染色した、選別後３日目のＨｂ９：：ＧＦＰ＋ＭＮの顕微鏡写真を提供する。スケールバーは５μｍ。ＳＴＭＮ２ノックアウトを示す。ヒトＳＴＭＮ２遺伝子の２つの構成的エクソンであるエクソン２及びエクソン４を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を使用したノックアウト戦略の模式図を提供する。介在ＤＮＡセグメント（約１８Ｋｂ）を標的化し、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡヌクレアーゼ複合体によって導入された２つの二本鎖切断（ＤＳＢ）のＮＨＥＪ（非相同末端結合）修復の結果として欠失させる。ＳＴＭＮ２ノックアウトを示す。ゲノムＤＮＡのＲＴ－ＰＣＲ分析によって、ＨＵＥＳ３Ｈｂ９：：ＧＦＰ株においてＳＴＭＮ２ノックアウトが確認されたことを示す。ＳＴＭＮ２ノックアウトを示す。免疫ブロット分析によって、ＨＵＥＳ３Ｈｂ９：：ＧＦＰ株においてＳＴＭＮ２ノックアウトが確認されたことを示す。ＳＴＭＮ２ノックアウトを示す。免疫蛍光法によって、ＨＵＥＳ３Ｈｂ９：：ＧＦＰ株においてＳＴＭＮ２ノックアウトが確認されたことを示す。ＳＴＭＮ２ノックアウトを示す。ｈＭＮにおけるＳＴＭＮ２欠如の細胞への影響を評価するために使用される実験戦略を提供する。ＳＴＭＮ２ノックアウトを示す。ＳＴＭＮ２を有する及び有さない、神経突起成長を刺激するためのＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２、１０μＭ）の非存在下（図４Ｇ）または存在下（図４Ｈ）でのｈＭＮのＳｈｏｌｌ解析を示す（対応のないｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。ＳＴＭＮ２ノックアウトを示す。ＳＴＭＮ２を有する及び有さない、神経突起成長を刺激するためのＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２、１０μＭ）の非存在下（図４Ｇ）または存在下（図４Ｈ）でのｈＭＮのＳｈｏｌｌ解析を示す（対応のないｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。ＳＴＭＮ２ノックアウトを示す。ＳＴＭＮ２を有する及び有さない、神経突起成長を刺激するためのＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２、１０μＭ）の非存在下（図４Ｇ）または存在下（図４Ｈ）でのｈＭＮのＳｈｏｌｌ解析を示す（対応のないｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。ＳＴＭＮ２ノックアウトを示す。軸索損傷後のｈＭＮにおけるＳＴＭＮ２欠如の細胞への影響を評価するために使用される実験戦略を提供する。ＳＴＭＮ２ノックアウトを示す。損傷後の軸索再成長を示す。軸索切断の前後のマイクロ流体デバイスにおけるｈＭＮの代表的な顕微鏡写真。軸索切断後の軸索再生の測定（対応のないｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。ＳＴＭＮ２ノックアウトを示す。損傷後の軸索再成長を示す。軸索切断後の軸索再生の測定。（対応のないｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。散発性ＡＬＳモデルを示す。ヒト運動ニューロンにおけるＴＤＰ－４３局在化に対するプロテアソーム阻害の影響を評価するために使用される実験戦略を提供する。散発性ＡＬＳモデルを示す。ＭＧ－１３２（１μＭ）で処置した細胞のＴＤＰ－４３免疫染色及びＤＡＰＩ蛍光に関するピアソンの相関分析を示す（ダネットの多重比較検定、アルファ値＜０．０５）。散発性ＡＬＳモデルを示す。処置を行わないかまたはＭＧ－１３２で処置して、ＴＤＰ－４３（赤色）、β－ＩＩＩチューブリン（緑色）について免疫染色し、ＤＡＰＩ（青色）で対比染色したＨＵＥＳ３運動ニューロンの顕微鏡写真を提供する。スケールバーは１００μｍ。散発性ＡＬＳモデルを示す。ＭＧ－１３２で処置したニューロンにおける界面活性剤可溶性（ＲＩＰＡ）及び界面活性剤不溶性（ＵＲＥＡ）画分中のＴＤＰ－４３の免疫ブロット分析を提供する（対応のないｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。散発性ＡＬＳモデルを示す。ＤＭＳＯ対照と比較した、示された濃度及び持続時間でＭＧ－１３２で処置した運動ニューロンのＳＴＭＮ２発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を提供する（対応のないｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。散発性ＡＬＳモデルを示す。ＳＴＭＮ２潜在性エクソンのＲＴ－ＰＣＲ検出戦略の図を提供する。散発性ＡＬＳモデルを示す。ＭＧ－１３２（１μＭ）で処置したｈＭＮ対照細胞におけるＳＴＭＮ２潜在性エクソンのｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ分析を提供する。ＡＬＳ患者データを示す。脊髄疾患のエビデンスのない対象（対照）（図６Ａ）または散発性ＡＬＳと診断された患者２例（図６Ｂ～６Ｃ）から採取した死後試料由来の成人ヒト腰髄の組織学的分析を提供する。ＳＴＭＮ２に対する免疫反応性が脊髄運動ニューロンの核周囲領域（矢印で示す）で検出されたが、周囲のグリア細胞では検出されなかった。対照及びＡＬＳ症例からの腰髄運動ニューロンにおけるＳＴＭＮ２免疫反応性を、「強力」［対照（図６Ａ）及び散発性ＡＬＳ（図６Ｂ）中の矢印によって示される通り］、または「欠如」［散発性ＡＬＳ（図６Ｃ）中の矢尻によって示される通り］としてスコア化した。スケールバーは５０μｍ。ＡＬＳ患者データを示す。脊髄疾患のエビデンスのない対象（対照）（図６Ａ）または散発性ＡＬＳと診断された患者２例（図６Ｂ～６Ｃ）から採取した死後試料由来の成人ヒト腰髄の組織学的分析を提供する。ＳＴＭＮ２に対する免疫反応性が脊髄運動ニューロンの核周囲領域（矢印で示す）で検出されたが、周囲のグリア細胞では検出されなかった。対照及びＡＬＳ症例からの腰髄運動ニューロンにおけるＳＴＭＮ２免疫反応性を、「強力」［対照（図６Ａ）及び散発性ＡＬＳ（図６Ｂ）中の矢印によって示される通り］、または「欠如」［散発性ＡＬＳ（図６Ｃ）中の矢尻によって示される通り］としてスコア化した。スケールバーは５０μｍ。ＡＬＳ患者データを示す。脊髄疾患のエビデンスのない対象（対照）（図６Ａ）または散発性ＡＬＳと診断された患者２例（図６Ｂ～６Ｃ）から採取した死後試料由来の成人ヒト腰髄の組織学的分析を提供する。ＳＴＭＮ２に対する免疫反応性が脊髄運動ニューロンの核周囲領域（矢印で示す）で検出されたが、周囲のグリア細胞では検出されなかった。対照及びＡＬＳ症例からの腰髄運動ニューロンにおけるＳＴＭＮ２免疫反応性を、「強力」［対照（図６Ａ）及び散発性ＡＬＳ（図６Ｂ）中の矢印によって示される通り］、または「欠如」［散発性ＡＬＳ（図６Ｃ）中の矢尻によって示される通り］としてスコア化した。スケールバーは５０μｍ。ＡＬＳ患者データを示す。強力なＳＴＭＮ２免疫反応性を有する腰髄運動ニューロンのパーセンテージがＡＬＳ組織試料において有意に低かったことを示す（ｎ＝対照３例及びＡＬＳ症例３例；各対象についておよそ４０個のＭＮをスコア化した；両側ｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。ＡＬＳ患者データを示す。以前に公表されたデータセットである、Ｒａｂｉｎｅｔａｌ２００９（図６Ｅ）、Ｈｉｇｈｌｅｙｅｔａｌ２０１４（図６Ｆ）、及びＤ’Ｅｒｃｈｉａｅｔａｌ２０１７からのＳＴＭＮ２の遺伝子発現解析を示す（両側ｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。ＡＬＳ患者データを示す。以前に公表されたデータセットである、Ｒａｂｉｎｅｔａｌ２００９（図６Ｅ）、Ｈｉｇｈｌｅｙｅｔａｌ２０１４（図６Ｆ）、及びＤ’Ｅｒｃｈｉａｅｔａｌ２０１７からのＳＴＭＮ２の遺伝子発現解析を示す（両側ｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。ＡＬＳ患者データを示す。以前に公表されたデータセットである、Ｒａｂｉｎｅｔａｌ２００９（図６Ｅ）、Ｈｉｇｈｌｅｙｅｔａｌ２０１４（図６Ｆ）、及びＤ’Ｅｒｃｈｉａｅｔａｌ２０１７からのＳＴＭＮ２の遺伝子発現解析を示す（両側ｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。ＡＬＳ患者データを示す。ＡＬＳの病因の分子モデルを提供する。分化ヒト運動ニューロンの産生を示す。ｈＭＮの分化、精製、及び培養戦略を示す。分化ヒト運動ニューロンの産生を示す。分化ＨＵＥＳ３Ｈｂ９：：ＧＦＰ細胞のフローサイトメトリー分析を提供する。ＲＡ及びＳＨＨ経路アゴニストで処置していない細胞を、ＧＦＰ発現のゲーティングのための陰性対照として使用した。分化ヒト運動ニューロンの産生を示す。ＨＢ９について免疫染色し、ＤＡＰＩで対比染色した（図７Ｃ）（スケールバー＝１０μｍ）、またはＩＳＬ１及びニューロンマーカーβ－ＩＩＩチューブリン及びＭＡＰ２について免疫染色した（図７Ｅ）（スケールバー＝２０μｍ）精製Ｈｂ９：：ＧＦＰ＋細胞の顕微鏡写真及び定量化を提供する。分化ヒト運動ニューロンの産生を示す。ＨＢ９について免疫染色し、ＤＡＰＩで対比染色した（図７Ｃ）（スケールバー＝１０μｍ）、またはＩＳＬ１及びニューロンマーカーβ－ＩＩＩチューブリン及びＭＡＰ２について免疫染色した（図７Ｅ）（スケールバー＝２０μｍ）精製Ｈｂ９：：ＧＦＰ＋細胞の顕微鏡写真及び定量化を提供する。分化ヒト運動ニューロンの産生を示す。ＨＢ９について免疫染色し、ＤＡＰＩで対比染色した（図７Ｃ）（スケールバー＝１０μｍ）、またはＩＳＬ１及びニューロンマーカーβ－ＩＩＩチューブリン及びＭＡＰ２について免疫染色した（図７Ｅ）（スケールバー＝２０μｍ）精製Ｈｂ９：：ＧＦＰ＋細胞の顕微鏡写真及び定量化を提供する。分化ヒト運動ニューロンの産生を示す。ＨＢ９について免疫染色し、ＤＡＰＩで対比染色した（図７Ｃ）（スケールバー＝１０μｍ）、またはＩＳＬ１及びニューロンマーカーβ－ＩＩＩチューブリン及びＭＡＰ２について免疫染色した（図７Ｅ）（スケールバー＝２０μｍ）精製Ｈｂ９：：ＧＦＰ＋細胞の顕微鏡写真及び定量化を提供する。分化ヒト運動ニューロンの産生を示す。全細胞パッチクランプ記録によって判定した場合に、分化ＭＮが電気生理学的に活性であることを示す。電圧クランプモードでの脱分極の際、細胞は速い内向き電流を示し、遅い外向き電流がそれに続き、それぞれ、電圧活性化ナトリウム及びカリウムチャネルの発現及び開放を示していることを示す。分化ヒト運動ニューロンの産生を示す。全細胞パッチクランプ記録によって判定した場合に、分化ＭＮが電気生理学的に活性であることを示す。電流クランプモードにおいて、脱分極が反復活動電位の発火を誘発したことを示す。分化ヒト運動ニューロンの産生を示す。全細胞パッチクランプ記録によって判定した場合に、分化ＭＮが電気生理学的に活性であることを示す。カイニン酸に対する応答が興奮性グルタミン酸作動性伝達物質に対する機能的受容体の発現と一致することを示す。培養ｈＭＮにおけるＴＤＰ－４３ノックダウンを示す。培養ＭＮにおけるＴＤＰ－４３ノックダウンのためのＲＮＡｉ戦略を提供する。培養ｈＭＮにおけるＴＤＰ－４３ノックダウンを示す。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５にコンジュゲートしたスクランブルｓｉＲＮＡを含む様々なｓｉＲＮＡによる処置の４日後の培養ｈＭＮの位相顕微鏡写真及び赤色蛍光顕微鏡写真を示す。培養ｈＭＮにおけるＴＤＰ－４３ノックダウンを示す。様々なｓｉＲＮＡで処置した後のｈＭＮのフローサイトメトリー分析を提供する。培養ｈＭＮにおけるＴＤＰ－４３ノックダウンを示す。様々なｓｉＲＮＡに２日間、４日間または６日間曝露したＭＮ中のＴＤＰ－４３ｍＲＮＡの相対レベルを示す。各試料のレベルをＧＡＰＤＨに対して正規化し、トランスフェクションなしの対照と比較して表した。培養ｈＭＮにおけるＴＤＰ－４３ノックダウンを示す。示されたｓｉＲＮＡで処置したＲＮＡｉ後のｈＭＮの免疫ブロット分析を提供する。各試料をＧＡＰＤＨを使用して正規化し、ｓｉＳＣＲ＿５５５で処置した対照試料に対するＴＤＰ－４３タンパク質レベルを算出した。運動ニューロンのＲＮＡ－Ｓｅｑを示す。ヒートマップとして表す、示された通りに処置した運動ニューロンの全体的な転写解析を示す。発現プロファイルの教師なしクラスタリングにより、運動ニューロン産生及び分析に関するバッチに基づいて試料が分離したことが明らかとなった。運動ニューロンのＲＮＡ－Ｓｅｑを示す。ＲＮＡシーケンシングによりノックダウンが確認された後の、ＴＤＰ－４３転写物の存在量の分析を提供する（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ調整Ｐ値カットオフ０．０５）。運動ニューロンのＲＮＡ－Ｓｅｑを示す。ＰＯＬＤＩＰ３遺伝子のスプライシングパターンの変化が、ＴＤＰ－４３ノックダウンの結果として検出され、ｓｉＴＤＰ４３処置細胞が、アイソフォーム１の有意な低減及びスプライシングされたバリアント２（エクソン３を欠く）のレベルの増加を示したことを示す（偽発見率「ＦＤＲ」＞０．０５）。患者株におけるヘテロ接合性変異を確認するための、示されたｉＰＳ細胞株におけるＴＡＲＤＢＰのエクソン６の多能性幹細胞ジェノタイピングシーケンシングクロマトグラムを示す。患者株におけるヘテロ接合性変異を確認するための、示されたｉＰＳ細胞株におけるＴＡＲＤＢＰのエクソン６の多能性幹細胞ジェノタイピングシーケンシングクロマトグラムを示す。神経細胞の選別を示す。細胞表面マーカースクリーニングを使用して、ＧＦＰ＋運動ニューロン（象限１）及びＧＦＰ－細胞（象限３）で濃縮された抗体を同定したことを示す。神経細胞の選別を示す。ＮＣＡＭ＋及びＥｐＣＡＭ－細胞の選別後、ハイコンテントイメージングを使用して、選別方法が有糸分裂細胞（ＥｄＵ＋）の培養物を枯渇させ、運動ニューロン（Ｉｓｌ１＋）及びニューロン（ＭＡＰ２＋）を有意に濃縮することができるか否かを判定したことを示す。Ｎ＝６の異なるｉＰＳ細胞株。統計分析は、両側スチューデントのｔ検定を使用して実施した。神経細胞の選別を示す。運動ニューロンマーカーＩＳＬ１の選別後の培養物のｑＲＴ－ＰＣＲ分析により、未選別培養物と比較して濃縮されていること及び培養物がより均質であることが明らかとなったことを示す。神経細胞の選別を示す。ニューロンマーカーβＩＩＩ－チューブリンの選別後の培養物のｑＲＴ－ＰＣＲ分析により、未選別培養物と比較して濃縮されていること及び培養物がより均質であることが明らかとなったことを示す。神経細胞の選別を示す。示された健常対照（灰色）及びＴＤＰ－４３変異株（赤色）から分化した培養物の、ＥｐＣＡＭに対するフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗体（抗ｅｐＣＡＭ－ＰＥ）及びＮＣＡＭに対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００コンジュゲート抗体（抗ＮＣＡＭ－ＡＦ７００）を用いたフローサイトメトリー分析を提供する。神経細胞の選別を示す。示された健常対照（灰色）及びＴＤＰ－４３変異株（赤色）から分化した培養物の、ＥｐＣＡＭに対するフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗体（抗ｅｐＣＡＭ－ＰＥ）及びＮＣＡＭに対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００コンジュゲート抗体（抗ＮＣＡＭ－ＡＦ７００）を用いたフローサイトメトリー分析を提供する。神経細胞の選別を示す。４～６の独立した分化からの示された株に関するＮＣＡＭ＋細胞のパーセンテージを示す。ＮＣＡＭ＋細胞を産生する能力に関して、変異株と対照株との間で有意差は観察されなかった。統計分析は、両側スチューデントのｔ検定、Ｐ値＜０．０５を使用して実施した。ＴＤＰ－４３とＳＴＭＮ２の関係を示す。ｓｉＲＮＡ処置時のＡＬＳ遺伝子のダウンレギュレーションのｑＲＴ－ＰＣＲ検証を提供する。ＴＤＰ－４３の発現を、使用した全ての対照及び各ｓｉＲＮＡについて評価した（対応のないｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。ＴＤＰ－４３とＳＴＭＮ２の関係を示す。ｓｉＲＮＡ処置時のＡＬＳ遺伝子のダウンレギュレーションのｑＲＴ－ＰＣＲ検証を提供する。ＦＵＳの発現を、使用した全ての対照及び各ｓｉＲＮＡについて評価した（対応のないｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。ＴＤＰ－４３とＳＴＭＮ２の関係を示す。ｓｉＲＮＡ処置時のＡＬＳ遺伝子のダウンレギュレーションのｑＲＴ－ＰＣＲ検証を提供する。Ｃ９ＯＲＦ７２の発現を、使用した全ての対照及び各ｓｉＲＮＡについて評価した（対応のないｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。ＴＤＰ－４３とＳＴＭＮ２の関係を示す。運動ニューロン分化に沿った様々な細胞タイプにおけるＳＴＭＮ２タンパク質のウエスタンブロット分析を提供する。ＴＤＰ－４３とＳＴＭＮ２の関係を示す。ｓｉＳＣＲ（－）またはｓｉＴＤＰ－４３（＋）オリゴのいずれかで処置した運動ニューロンにおけるスタスミンファミリーのＲＮＡ－Ｓｅｑ発現レベルを示す。ＳＴＭＮ２レベルのみがＴＤＰ－４３ノックダウン後に変化した。ＴＤＰ－４３とＳＴＭＮ２の関係を示す。遺伝子の長さに対して正規化した（図１２Ｇ）、スタスミンファミリーの遺伝子内のＴＤＰ－４３結合部位（図１２Ｆ）を示す。ＳＴＭＮ２は結合モチーフの数が最も多い。ＴＤＰ－４３とＳＴＭＮ２の関係を示す。遺伝子の長さに対して正規化した（図１２Ｇ）、スタスミンファミリーの遺伝子内のＴＤＰ－４３結合部位（図１２Ｆ）を示す。ＳＴＭＮ２は結合モチーフの数が最も多い。ＳＴＭＮ２がニューロン成長を調節することを示す。ＷＡ０１株におけるＣＲＩＳＰＲ媒介性ＳＴＭＮ２ノックアウトを、ゲノムＤＮＡのＲＴ－ＰＣＲ分析によって確認した。ＳＴＭＮ２がニューロン成長を調節することを示す。ＷＡ０１株におけるＣＲＩＳＰＲ媒介性ＳＴＭＮ２ノックアウトを、免疫ブロット分析によって確認した。ＳＴＭＮ２がニューロン成長を調節することを示す。ＷＡ０１株におけるＣＲＩＳＰＲ媒介性ＳＴＭＮ２ノックアウトを、免疫蛍光法によって確認した。ＳＴＭＮ２がニューロン成長を調節することを示す。ＳＴＭＮ２を有する及び有さない、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ－２７６３２（１０μＭ）の存在下でのｈＭＮのＳｈｏｌｌ解析（図１３Ｆ）を提供する（対応のないｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。ＳＴＭＮ２がニューロン成長を調節することを示す。ＳＴＭＮ２を有する及び有さない、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ－２７６３２（１０μＭ）の存在下でのｈＭＮのＳｈｏｌｌ解析（図１３Ｆ）を提供する（対応のないｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。ＳＴＭＮ２がニューロン成長を調節することを示す。ＳＴＭＮ２を有する及び有さない、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ－２７６３２（１０μＭ）の存在下でのｈＭＮのＳｈｏｌｌ解析（図１３Ｆ）を提供する（対応のないｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。ＳＴＭＮ２がニューロン伸長を調節することを示す。損傷後の軸索再成長を示す。軸索切断の前後のマイクロ流体デバイスにおけるｈＭＮの代表的な顕微鏡写真。ＳＴＭＮ２がニューロン成長を調節することを示す。損傷後の軸索再成長を示す。軸索切断後の軸索再成長の分析（対応のないｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。細胞生存アッセイ及びプロテアソーム活性アッセイを示す。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏが光を生成するために代謝的に活性な細胞からのＡＴＰを使用することを示す。発光と数桁にわたる培養中の細胞数との間に直接的な関係が存在することを示す。細胞生存アッセイ及びプロテアソーム活性アッセイを示す。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏが光を生成するために代謝的に活性な細胞からのＡＴＰを使用することを示す。アッセイが増殖因子の非存在下におけるニューロン生存期間の差異を検出し得ることを示す。Ｎ＝ニューロンの６つの別々のウェル（対応のないｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。細胞生存アッセイ及びプロテアソーム活性アッセイを示す。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏが光を生成するために代謝的に活性な細胞からのＡＴＰを使用することを示す。ＭＧ－１３２ニューロン生存実験の概略を示す。細胞生存アッセイ及びプロテアソーム活性アッセイを示す。示された濃度のＭＧ－１３２とともに示された時間培養した運動ニューロンの用量反応曲線を示す。Ｎ＝三連のウェル。細胞は試験した全ての濃度で処置の１日後に生存可能であり、濃度が低いほど長期間の耐性を示す。細胞生存アッセイ及びプロテアソーム活性アッセイを示す。プロテアソームによる切断後にルシフェラーゼの基質が遊離し、これによりプロテアソーム活性の定量的測定が可能になることを示す。ＭＧ－１３２で処置したニューロンは、プロテアソーム活性の有意な低下を示す。Ｎ＝ニューロンの４つの別々のウェル（対応のないｔ検定、Ｐ値＜０．０５）。ＴＤＰ－４３がｈＭＮにおける潜在性エクソンスプライシングを調節することを示す。スクランブルｓｉＲＮＡで処置した細胞またはＴＤＰ－４３転写物を標的とするｓｉＲＮＡで処置した細胞についての、ＰＦＫＰの潜在性エクソンの可視化。ヒトＨＧ１９ゲノムへのアラインメントに関して、リードカバレッジ及びスプライスジャンクションを示す。ＴＤＰ－４３がｈＭＮにおける潜在性エクソンスプライシングを調節することを示す。スクランブルｓｉＲＮＡで処置した細胞またはＴＤＰ－４３転写物を標的とするｓｉＲＮＡで処置した細胞についての、ＥＬＡＶＬ３の潜在性エクソンの可視化。ヒトＨＧ１９ゲノムへのアラインメントに関して、リードカバレッジ及びスプライスジャンクションを示す。ＴＤＰ－４３がｈＭＮにおける潜在性エクソンスプライシングを調節することを示す。スクランブルｓｉＲＮＡで処置した細胞またはＴＤＰ－４３転写物を標的とするｓｉＲＮＡで処置した細胞についての、ＳＴＭＮ２の潜在性エクソンの可視化。ヒトＨＧ１９ゲノムへのアラインメントに関して、リードカバレッジ及びスプライスジャンクションを示す。ＴＤＰ－４３がｈＭＮにおける潜在性エクソンスプライシングを調節することを示す。ＳＴＭＮ２潜在性エクソンに関するＲＴ－ＰＣＲ検出戦略の図を提供する。ＴＤＰ－４３がｈＭＮにおける潜在性エクソンスプライシングを調節することを示す。ＳＴＭＮ２エクソン１と潜在性エクソンとのスプライシングを確認した、ＰＣＲ産物のサンガーシーケンシングの図を提供する。患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）試料からの潜在性ＳＴＭＮ２転写物のｑＰＣＲデータを提供する。健常対照に対して正規化した潜在性ＳＴＭＮ２の患者試料データをまとめたグラフを提供する。患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）試料からの潜在性ＳＴＭＮ２転写物のｑＰＣＲデータを提供する。健常対照に対して正規化した潜在性ＳＴＭＮ２の患者試料データをまとめたグラフを提供する。患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）試料からの潜在性ＳＴＭＮ２転写物のｑＰＣＲデータを提供する。健常対照に対して正規化した潜在性ＳＴＭＮ２の患者試料データをまとめたグラフを提供する。患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）試料からの潜在性ＳＴＭＮ２転写物のｑＰＣＲデータを提供する。健常対照に対して正規化した潜在性ＳＴＭＮ２の患者試料データをまとめたグラフを提供する。患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）試料からの潜在性ＳＴＭＮ２転写物のｑＰＣＲデータを提供する。個々の患者試料に関する詳細を示すグラフを提供する。患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）試料からの潜在性ＳＴＭＮ２転写物のｑＰＣＲデータを提供する。個々の患者試料に関する詳細を示すグラフを提供する。患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）試料からの潜在性ＳＴＭＮ２転写物のｑＰＣＲデータを提供する。個々の患者試料に関する詳細を示すグラフを提供する。患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）試料からの潜在性ＳＴＭＮ２転写物のｑＰＣＲデータを提供する。個々の患者試料に関する詳細を示すグラフを提供する。患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）試料からの潜在性ＳＴＭＮ２転写物のｑＰＣＲデータを提供する。個々の患者試料に関する詳細を示すグラフを提供する。患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）試料からの潜在性ＳＴＭＮ２転写物のｑＰＣＲデータを提供する。個々の患者試料に関する詳細を示すグラフを提供する。患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）試料からの潜在性ＳＴＭＮ２転写物のｑＰＣＲデータを提供する。個々の患者試料に関する詳細を示すグラフを提供する。患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）試料からの潜在性ＳＴＭＮ２転写物のｑＰＣＲデータを提供する。個々の患者試料に関する詳細を示すグラフを提供する。患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）試料からの潜在性ＳＴＭＮ２転写物のｑＰＣＲデータを提供する。個々の患者試料に関する詳細を示すグラフを提供する。患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）試料からの潜在性ＳＴＭＮ２転写物のｑＰＣＲデータを提供する。診断後の生存期間を示すグラフを提供する。患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）試料からの潜在性ＳＴＭＮ２転写物のｑＰＣＲデータを提供する。死亡時の年齢を示すグラフを提供する。患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）試料からの潜在性ＳＴＭＮ２転写物のｑＰＣＲデータを提供する。肺活量を示すグラフを提供する。ＳＴＭＮ２マルチプレックスｑＰＣＲアッセイを示す。体液中のＳＴＭＮ２に関するＱ－ＲＴＰＣＴアッセイを示す。実験スキームを提供し、ＳＴＭＮ２マルチプレックスＴａｑＭａｎアッセイが、潜在性ＳＴＭＮ２、正常ＳＴＭＮ２転写物、及びハウスキーピング遺伝子ＲＮＡ１８Ｓ５を同時に検出することを示す。ＲＮＡをＣＳＦ由来エクソソームから採取し、次いでｃＤＮＡに変換し、完全ＳＴＭＮ２転写物及び潜在性ＳＴＭＮ２転写物ならびに正規化のための対照ＲＮＡについてアッセイすることができる。ＳＴＭＮ２マルチプレックスｑＰＣＲアッセイを示す。ＡＳＯまたはｓｉＲＮＡのいずれかを使用してＴＤＰ－４３レベルを低減させた細胞におけるマルチプレックスアッセイのｉｎｖｉｔｒｏでの検証を示す。ＳＴＭＮ２マルチプレックスｑＰＣＲアッセイを示す。ＳＴＭＮ２マルチプレックスｑＰＣＲアッセイを使用して、ＭＧＨＣＳＦ試料から生成されたｃＤＮＡ試料中の潜在性ＳＴＭＮ２転写物レベルを探索したことを示す。ＳＴＭＮ２潜在性スプライシングはＡＬＳ患者において有意に誘導される。ＳＴＭＮ２タンパク質を検出するためのサンドイッチＥＬＩＳＡを示す。ＳＴＭＮ２サンドイッチＥＬＩＳＡの模式図を提供する。ＳＴＭＮ２タンパク質を検出するためのサンドイッチＥＬＩＳＡを示す。ピコグラム量に対するＳＴＭＮ２ＥＬＩＳＡの感度を示す。ＳＴＭＮ２タンパク質を検出するためのサンドイッチＥＬＩＳＡを示す。組換えＳＴＭＮ２タンパク質を使用してサンドイッチＥＬＩＳＡを検証したこと、及びサンドイッチＥＬＩＳＡがピコグラムレベルのＳＴＭＮ２を検出することができることを示す。ＳＴＭＮ２タンパク質を検出するためのサンドイッチＥＬＩＳＡを示す。ＳＴＭＮ２ＥＬＩＳＡを使用して評価した場合に、ＳＴＭＮ２レベルが患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）において低減していることを示す。各遺伝子を発見された年に対してプロットした、ＡＬＳの遺伝現象を示す図表を提供する。Ａｌｓｕｌｔａｎｅｔａｌ．ＤｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅＮｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄＮｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒＤｉｓｅａｓｅ．２０１６，６，４９－６４を参照されたい。ＴＤＰ－４３が多機能核酸結合タンパク質であることを示す。ＴＤＰ－４３は、ＲＮＡスプライシング、ｍｉＲＮＡプロセシング、それ自体の転写物の自己調節、ＲＮＡ輸送及び安定性、ならびにストレス顆粒形成を含む様々な機能において役割を果たすことが示されている。転写物ＴＤＰ－４３は、高度に種及び細胞タイプ依存的に調節する。ＢｕｒａｔｔｉａｎｄＢａｒａｌｌｅＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．．２０１２，６，２３７－２４７を参照されたい。ＴＤＰ－４３枯渇の転写効果を測定するための戦略を提供する。模式図は、ｈＭＮの分化、精製、及び培養戦略を示す。この戦略では、初期発生を模倣する小分子を使用して、２週間で幹細胞を有糸分裂後ニューロンに変換する。ニューロンを選別し、試験するために様々な方法を開発した。ＲＮＡシーケンシングと組み合わせたｓｉＲＮＡ技術を使用して、ＴＤＰ－４３によって調節される転写物を同定した。ＴＤＰ－４３がＳＴＭＮ２に結合することを示す。ＡＬＳ患者の脊髄をＳＴＭＮ２について染色したところ、ＰＧＫ１（ｆＲＩＰ）に対する倍率濃縮に基づいて、ＡＬＳ患者におけるＳＴＭＮ２タンパク質の低下が観察された。Ｋｌｉｍｅｔａｌ．ＮａｔｕｒｅＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｖｏｌ．２２，ｐａｇｅｓ１６７－１７９（２０１９）を参照されたい。ＴＤＰ－４３枯渇後のスプライシング変化を示す。ｓｉＴＤＰで処置した運動ニューロン由来のＲＮＡ－ｓｅｑ試料で差次的エクソン使用分析を実施した。スプライシング変化がＳＴＭＮ２において観察された。ＴＤＰ－４３がＳＴＭＮ２の潜在性エクソンを抑制することを示す。統合的ゲノムビューアを使用して、ＲＮＡｓｅｑのリードがヒトゲノムにマッピングされた場所（上のグラフのリードの数）及びリードがエクソン間でどのように再連結されたか（スプライストラック（ｓｐｌｉｃｅｔｒａｃｋ））を調べた。グラフは、遺伝子領域にマッピングされたリードの数を示す。ＳＴＭＮ２スプライシング欠損の概要を提供する。通常の条件下では、ＳＴＭＮ２は５つのエクソン全てとともに転写され、２０ｋＤａのＳＴＭＮ２タンパク質に翻訳されるｍＲＮＡとなる。ＴＤＰ－４３の摂動後、潜在性エクソンが転写を妨害するため、１７アミノ酸のポリペプチドのみが翻訳され得る。ＳＴＭＮ２が一貫して低下していることを示す。３つのヒトＲＮＡｓｅｑデータセット（ＡＬＳ患者データセット及びｓｉＴＤＰ４３幹細胞運動ニューロンデータセット）における低下した転写物の重複を比較したところ、ＳＴＭＮ２は３つのデータセット全てにおいて低下した唯一の転写物である。ＳＴＭＮ２潜在性エクソンがＡＬＳ患者の脊髄に存在することを示す。ヒトＨＧ１９ゲノムへのアラインメントに関して、リードカバレッジ及びスプライスジャンクションを示す。ＡＬＳ患者のヒトゲノムにマッピングされたリードを観察したところ、６例中５例の患者についてはリードが潜在性エクソンにマッピングされ、スプライシングが潜在性エクソンに及んだが、対照のいずれもそうではなかった。ＴＤＰ－４３枯渇が神経突起成長及び軸索再成長の欠損をもたらすことを示す。Ｓｈｏｌｌ解析を実施するために、示されたｓｉＲＮＡで処置してβ－ＩＩＩチューブリンについて免疫染色したｈＭＮの代表的な顕微鏡写真を提供する。ｓｉＲＮＡ処置後のｈＭＮのＳｈｏｌｌ解析を提供する。線は試料平均値を表し、陰影はｓ．ｅ．ｍ．を表し、ｓｉＴＤＰ４３とｓｉＳＣＲとの間の対応のないｔ検定（両側、Ｐ＜０．０５）を用いる。軸索再生を調査するためのマイクロ流体デバイスを示す。マイクロ流体デバイスは、体細胞区画（左パネル）及び軸索区画（右パネル）を含む。ＴＤＰ－４３枯渇が神経突起成長及び軸索再成長の欠損をもたらすことを示す。Ａは、軸索切断後のマイクロ流体デバイスにおけるｈＭＮの代表的な顕微鏡写真を提供する。スケールバーは１５０μＭ。Ｂは、軸索切断後の軸索再成長及び再生の測定値を提供する（対応のないｔ検定、両側、Ｐ値＜０．０５、１８時間≦０．０００１、２４時間≦０．０００１、４８時間≦０．０００１及び７２時間≦０．０００１）。ＳＴＭＮ２が軸索変性経路におけるｃ－ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）標的であることを示す。ＪＮＫ１がＳＴＭＮ２に結合しそれをリン酸化し、リン酸化ＳＴＭＮ２は速やかに分解されることを示す。Ｊ．ＥｕｎＳｈｉｎｅｔａｌ．ＰＮＡＳ２０１２，１０９，Ｅ３６９６－３７０５を参照されたい。ＪＮＫｉがｓｉＴＤＰ４３表現型をレスキューすることができるか否かを判定するための戦略を提供する。Ｋｌｉｍｅｔａｌ．ＮａｔｕｒｅＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｖｏｌ．２２，ｐａｇｅｓ１６７－１７９（２０１９）を参照されたい。ＪＮＫ阻害剤（ＳＰ６００１２５）がＳＴＭＮ２レベルを押し上げることを示す。ＳＴＭＮ２タンパク質レベルはＪＮＫｉで処置したニューロンで増加し、ｓｉＴＤＰ４３で処置した細胞で観察されたより低いレベルをレスキューすることができた。ＪＮＫｉ（ＳＰ６００１２５）が神経突起成長を増加させることを示す。ＪＮＫｉで処置した細胞は、神経突起分枝の増加を示した。ＪＮＫｉ（ＳＰ６００１２５）が神経突起成長を増加させることを示す。Ｓｈｏｌｌ解析により、全ての条件下で、ＪＮＫｉが損傷後の神経突起分枝及び再成長を増加させたことを確認した。ＪＮＫｉが軸索再生を増加させることを示す。マイクロ流体デバイスにより、全ての条件下で、ＪＮＫｉが損傷後の神経突起分枝及び再成長を増加させたことを確認した。プロテアソーム阻害のモデルを提供する。タンパク質恒常性の破壊は、ＴＤＰ－４３の誤局在化及びＳＴＭＮ２レベルの変化を招き、これは軸索の生物学的性質を破壊する。ＴＤＰ－４３局在化を示す。ＴＤＰ－４３は、通常、核内であるが（Ａ）、化合物ウォッシュアウト後、明確な核内ＴＤＰ－４３染色の喪失が観察された（Ｂ）。細胞質凝集は観察されず、核内ＴＤＰ－４３の喪失のみが観察された。ＴＤＰ－４３の誤局在化が可逆的であることを示す。ＳＴＭＮ２転写物がＴＤＰ－４３誤局在化後に低下したことを示す。ＳＴＭＮ２の低下は、変異型ＴＤＰ－４３を発現する細胞におけるものよりも更に明白であった。様々なＡＬＳ及びＦＴＤコホートならびに関連経路における最近のＡＬＳ遺伝子を、それらの相対変異頻度とともにまとめた表を提供する。ＷＧＳ及びＷＥＳの進歩により、稀な原因バリアント、すなわちＴＢＫ１、ＣＨＣＨＤ１０、ＴＵＢＡ４Ａ、ＭＡＴＲ３、ＣＣＮＦ、ＮＥＫ１、Ｃ２１ｏｒｆ２、ＡＮＸＡ１１、及びＴＩＡ１を保有する遺伝子が同定されるようになった。ＴＢＫ１は、様々なコホートにおいてＡＬＳ－ＦＴＤの変異頻度が最も高い（３～４％）ことが示されている。Ｎｇｕｙｅｎ，ｅｔａｌ．，ＴｒｅｎｄｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓ，２０１８を参照されたい。オートファジーの異なる時点で作用するＡｔｇ７及びＴＢＫ１を示す。Ｈａｎｓｅｎ，ｅｔ，ａｌ，．ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ．２０１８を参照されたい。ＴＢＫ１を除去することがオートファジー開始を遮断することと類似性を共有しているが、それとは異なることを示す。ＴＢＫ１ノックアウトは機能的ＴＤＰ－４３及びＳＴＭＮ２レベルを低下させるが、ＡＴＧ７の除去は影響を及ぼさないことを示す。ＴＢＫ１の喪失は、オートファジー非依存性機序を介して運動ニューロンにおけるＴＤＰ－４３病変を誘導する。ＴＢＫ１の喪失が軸索損傷後の軸索再生の障害を示すことを示す。プロテアソーム阻害が、ＴＢＫ１変異運動ニューロンにおけるＴＤＰ－４３の誤局在化を誘導したことを示す。プロテアソーム阻害が、ＴＢＫ１変異運動ニューロンにおけるＴＤＰ－４３の誤局在化を誘導したことを示す。ＣＲＩＳＰＲを使用したＳＴＭＮ２イントロンの標的化を示す。ＳＴＭＮ２標的化のためのＣＲＩＳＰＲ戦略、及びＳＴＭＮ２のジェノタイピングを提供する。ＣＲＩＳＰＲを使用したＳＴＭＮ２イントロンの標的化を示す。ＳＴＭＮ２標的化のためのＣＲＩＳＰＲ戦略、及びＳＴＭＮ２のジェノタイピングを提供する。ＣＲＩＳＰＲを使用したＳＴＭＮ２イントロンの標的化を示す。ＳＴＭＮ２に対するＣＲＩＳＰＲ標的化戦略及びジェノタイピングをまとめた表を提供する。ＳＴＭＮ２マウスがＲｏｓａ２６対照マウスよりも有意に小さく、運動遂行課題における欠落を、これらの欠落の経時的な進行徴候を伴わずに示すことを示す。ＳＴＭＮ２マウスがＲｏｓａ２６対照マウスよりも有意に小さく、運動遂行課題における欠落を、これらの欠落の経時的な進行徴候を伴わずに示すことを示す。行動結果及びオープンフィールドアッセイにおいて移動した総距離が、２つのマウスコホート間で類似しているように見えることを示す。変異体コホート由来の脳組織において、ＳＴＭＮ２転写物レベルが有意に低減しているか、または転写物が存在しないことを示す。変異体マウスコホートにおけるＳＴＭＮ２タンパク質の喪失または有意な低減を検証する脳組織のウエスタンブロットを提供する。成体マウス脊髄の前角のＣｈＡＴ＋運動ニューロンに主に局在するＳＴＭＮ２を示す。ＳＴＭＮ２コホートが脊髄の前角上のＳＴＭＮ２＋／ＣｈＡＴ＋運動ニューロン数の有意な低下を示すことを示す。対照マウスとＳＴＭＮ２マウスとの間の器官重量または筋重量の差を示すグラフを提供する。ＳＴＭＮ２マウスでは、下肢筋がより軽いことが示される（枠で囲んだ２つのグラフを参照されたい）。ＳＴＭＮ２腓腹筋（ＧＡ）及びＲｏｓａ２６対照腓腹筋（ＧＡ）のシナプス前部及びシナプス後部の染色を提供する。染色は、ＳＴＭＮ２－／－動物における脱神経支配（ｄｅ－ｉｎｎｅｒｖａｔｉｏｎ）を示唆している。ＳＴＭＮ２腓腹筋（ＧＡ）及びＲｏｓａ２６対照腓腹筋（ＧＡ）のシナプス前部及びシナプス後部の染色が、ＳＴＭＮ２－／－動物における脱神経支配を示唆していることを示す。神経筋接合部（ＮＭＪ）形態が、ＳＴＭＮ２変異体の腓腹筋における活動性脱神経支配を裏付けることを示す。変異型ＴＤＰ－４３が病理学的な誤局在化を示さないことを示す。ＴＤＰ－４３についての対照及びＡＬＳ患者ニューロンの染色は、対照及びＡＬＳ患者ニューロンの両方についてＴＤＰ－４３が主に核内であったことを示す。様々なクラスのプロテアソーム阻害剤を同定し、それらの化学構造を提供する。構造的に異なるプロテアソーム阻害剤で処置した際のｈＭＮにおける完全長ＳＴＭＮ２の発現低下を示す。ＭＧ－１３２またはボルテゾミブで処置したｈＭＮのＰＣＲアッセイを示す。完全長ＳＴＭＮ２は、対照として全ての試料中で検出された。ＳＴＭＮ２潜在性エクソンを含有する転写物の存在は、プロテアソーム阻害剤で処置した細胞に特異的であった。ＳＴＭＮ２ＲＮＡに結合するＴＤＰ－４３に関するｉｎｖｉｔｒｏアッセイを示す。ゲノムＤＮＡを使用して、ＳＴＭＮ２の潜在性エクソン領域からのＴＤＰ－４３結合部位を含有するＲＮＡをｉｎｖｉｔｒｏ転写した（Ａ）。ＲＮＡを使用して、ヒトニューロンタンパク質溶解物からＩＰＴＤＰ－４３タンパク質をプルダウンできるか否かを評価した。ｉｎｖｉｔｒｏアッセイは、ＴＤＰ－４３をプルダウンした潜在性エクソン領域を含有する転写物を示す（Ｂ）。ＳＴＭＮ２ＲＮＡに結合するＴＤＰ－４３に関するｉｎｖｉｔｒｏアッセイを示す。５’及び３’ＴＤＰ－４３結合領域を含有するＲＮＡを、図６３に記載したものと同様にｉｎｖｉｔｒｏ転写した。５’及び３’転写物は両方とも一部のＴＤＰ－４３をプルダウンすることができるが、濃縮は完全な潜在性エクソンほど強くない。潜在性エクソンを有さない標的化変異細胞株の作製のためのｇＲＮＡの設計を示す。エクソン１とエクソン２の間のＳＴＭＮ２イントロン内の潜在性エクソン内の１０５ヌクレオチドを欠失させる戦略を用意した。欠失はＴＤＰ－４３結合モチーフを除去するが、予測されるポリアデニル化部位には影響を及ぼさない。変異状態の確認を示す。ＴＩＤＥ分析を使用してクローンの変異状態を分析し、対照細胞に対する配列アラインメントを確認して、欠失の大きさ及び位置のより正確な見解を得た。１つの細胞株はホモ接合性の１０５ｎｔの欠失を含有しており、これはゲル電気泳動と一致した。欠失はＴＤＰ－４３結合モチーフを除去したが、予測されるポリアデニル化部位には影響を及ぼさなかった。ＴＤＰ－４３結合部位がＳＴＭＮ２発現の潜在的な負の調節因子であることを示す。３つの細胞株、ＨＵＥＳ３、ＩＧ２（Ｓｔｍｎ２ＫＯ）、及びＣＮ７（潜在性エクソン欠失）を、標準培地または培地＋１ｕＭＭＧ１３２で２４時間処置して、細胞にストレスを負荷した。ＨＵＥＳ３細胞では、ストレス負荷条件は、非ストレス負荷条件と比較してＳＴＭＮ２ｍＲＮＡ発現が５２％であった。ＩＧ２（Ｓｔｍｎ２ＫＯ）条件では、非ストレス負荷細胞は発現が１３％であり、ストレスを負荷した場合、発現は４２％まで増加した。ＣＮ７（潜在性エクソン欠失）細胞株における発現レベルは他の２つの細胞株よりも著しく高く、非ストレス負荷では発現は７２９％であり、ストレス負荷では発現は４７３％であった。いくつかのエクソンをノックアウトすると発現は低下するが、ＴＤＰ－４３結合部位を除去すると発現は上昇することが示された。推定ＴＤＰ－４３結合部位の欠失がＳＴＭＮ２タンパク質レベルの増加をもたらすことを示す。遺伝子発現データと一致して、ＳＴＭＮ２潜在性エクソン内のＴＤＰ－４３結合領域の欠失は、タンパク質発現の増加を引き起こす。推定ＴＤＰ－４３結合部位の欠失がＳＴＭＮ２タンパク質レベルの増加をもたらすことを示す。遺伝子発現データと一致して、ＳＴＭＮ２潜在性エクソン内のＴＤＰ－４３結合領域の欠失は、タンパク質発現の増加を引き起こす。ＳＴＭＮ２遺伝子座の保存を示す。ヒトＳＴＭＮ２が第８染色体の長腕に位置し、一般に５つの標準的なエクソンを含むいくつかのアイソフォームとして転写されることを示す。潜在性エクソンの位置を橙色で強調表示する。遺伝子座に沿った１００種の脊椎動物間の保存により、エクソン及びいくつかのイントロン領域での強力な保存が明らかとなる。ＳＴＭＮ２遺伝子座の保存を示す。ヒトＳＴＭＮ２が第８染色体の長腕に位置し、一般に５つの標準的なエクソンを含むいくつかのアイソフォームとして転写されることを示す。潜在性エクソンの位置を橙色で強調表示する。遺伝子座に沿った１００種の脊椎動物間の保存により、エクソン及びいくつかのイントロン領域での強力な保存が明らかとなる。ＳＴＭＮ２遺伝子座の保存を示す。１２種の霊長類及び２種のげっ歯類に関する複数の配列アラインメントと組み合わせたヌクレオチド分析による、ＳＴＭＮ２潜在性エクソン（橙色）におけるより高分解能のゲノムビューを示す。ヒト遺伝子の突出した特徴及び種のリストの下方へのその保存の程度を下線で示しており、これには、スプライスアクセプター部位（暗青緑色）、推定コード領域（黄色）、終止コドン（赤色）、ＴＤＰ－４３結合モチーフ（青色）、及びポリＡシグナル（紫色）が含まれる。潜在性ＳＴＭＮ２を検出するためのマルチプレックスアッセイを示す。ｓｉＴＤＰ－４３及びＴＤＰ－４３ＡＳＯがＳＴＭＮ２の低減及び潜在性エクソンの誘導を誘導することを示す。ＳＣＲＡＳＯ、ＴＤＰＡＳＯ、またはｓｉＴＤＰで処置した場合のＴＡＲＤＢＰ（Ａ）、ＳＴＭＮ２エクソン３～４（Ｂ）、及び潜在性ＳＴＭＮ２（Ｃ）の相対発現レベルを示す。スクランブルＡＳＯ、ＴＤＰ－４３ＡＳＯ、またはＳＯＤ１ＡＳＯで６日間にわたり処置した後のＴＡＲＤＰ（Ａ）、ＳＴＭＮ２（Ｂ）、及び潜在性ＳＴＭＮ２（Ｃ）のｍＲＮＡ相対レベルを示す。潜在性ＳＴＭＮ２の発現を示す。スクランブルＡＳＯ、ＴＤＰ－４３ＡＳＯ、ＳＯＤ１ＡＳＯ、ｓｉＴＤＰ－４３、及びｓｉＲＥＤで処置後の潜在性ＳＴＭＮ２発現のｍＲＮＡレベルを示す。ＮｅｕｒｏＰｏｒｔｅｒ５、ＮｅｕｒｏＰｏｒｔｅｒ１、ＲＮＡｉＭＡＸ、またはＬｉｐｏＦｅｃａｍｉｎｅを使用して各処置を施したところ、ＲＮＡｉｍａｘが最も効果的であった。ＳＴＭＮ２スプライススイッチングＡＳＯを試験するための戦略を示す模式図を提供する。ＡＳＯスクリーニング設定プレート１の模式図を提供する。ＡＳＯスクリーニング設定プレート２の模式図を提供する。ＡＳＯスクリーニング設定プレート３の模式図を提供する。ＡＳＯスクリーニング設定プレート４の模式図を提供する。全てのウェルについて比較可能なｃＤＮＡを用いたＡＳＯスクリーニングの結果を提供する。スクリーニングしたＡＳＯは、ＳＴＭＮ２イントロンを標的とするＡＳＯである。スプライスジャンクション近傍のＡＳＯが潜在性エクソンの包含を抑制することを示すＡＳＯスクリーニングの結果を提供する。用量依存性または最低濃度に対する抑制を示すＡＳＯスクリーニングからのベストヒットを提供する。ＴＤＰ－４３のタンパク質構造、病原性変異、及び機能を示す。ＴＤＰ－４３が、核局在化シグナル（ＮＬＳ、ａａ８２～９８）を有するＮ末端領域（ａａ１～１０２）；２つのＲＮＡ認識モチーフ：ＲＲＭ１（ａａ１０４～１７６）及びＲＲＭ２（ａａ１９２～２６２）；核外輸送シグナル（ＮＥＳ、ａａ２３９～２５０）；プリオン様グルタミン／アスパラギンリッチ（Ｑ／Ｎ）ドメイン（ａａ３４５～３６６）を包含するＣ末端領域（ａａ２７４～４１４）；ならびにグリシンリッチ領域（ａａ３６６～４１４）という６つのドメインを含むことを示す。散発性及び家族性ＡＬＳ患者ならびに稀なＦＴＬＤ患者のＴＤＰ－４３において、主にＣ末端グリシンリッチ領域にある４６個の優性変異が同定されている。ＴＤＰ－４３のタンパク質構造、病原性変異、及び機能を示す。突出したＴＤＰ－４３機能が疾患の病因に強く関与していることを示す。ＴＤＰ－４３について同定された最も一般的なモチーフは（ＴＧ）ｎであり、これは（ＵＧ）ｎＲＮＡ結合モチーフに対応する。ＴＤＰ－４３は、ＲＮＡとの相互作用により、プレｍＲＮＡスプライシングを調節して潜在性エクソンの包含を阻害し、加えてポリアデニル化部位の選択に影響を及ぼすことが可能となる。ＴＤＰ－４３のサイトゾルでの役割には、神経突起に沿ったＲＮＡの輸送と、ＴＤＰ－４３の核排出及びストレス顆粒への局在化を誘発し得るプロテオスタシスに影響を及ぼすものを含むストレスへの応答とが含まれる。これらの基本的な分子機能の多くは、スプライシング及びポリアデニル化を含むＴＤＰ－４３の自己調節に寄与している。ＳＴＭＮ２タンパク質の構造及び機能を示す。ＳＴＭＮ２が、更に細分化することができる２つのドメイン、すなわち、１）保存されたゴルジ体特定配列と、膜挿入を可能にする２つのパルミトイル化部位とを含有するＮ末端ドメイン、ならびに２）各々がチューブリンに結合する２つのチューブリン結合リピート（ＴＢＲ１及びＴＢＲ２）と、ＪＮＫによって調節されてチューブリンと相互作用するＳＴＭＮ２の能力を潜在的に調節することができ、かつＳＴＭＮ２の分解を促進することができる、２つのリン酸化部位を保有するプロリンリッチドメイン（ＰＲＤ）と、チューブリン重合を阻害するペプチドを含有するスタスミンＮ末端ドメイン（ＳＬＤＮ）とを含有するスタスミン様ドメイン、を含むことを示す。ＰｈｏｓｐｈｏｓｉｔｅＰｌｕｓに従って同定した翻訳後修飾（ＰＴＭ）をタンパク質構造に沿って表示する。ＳＴＭＮ２タンパク質の構造及び機能を示す。報告されたＳＴＭＮ２タンパク質の細胞内局在化を示す。ＳＴＭＮ２はゴルジ装置に局在し、樹状突起及び軸索全体に輸送される小胞中に見られ、発生中のニューロンの成長円錐内及び損傷後の再生中の軸索先端に集中する。ＳＴＭＮ２のＴＤＰ－４３調節の提案されたモデルを提供する。ＡＬＳの病理学的特徴は、ＴＤＰ－４３の核内喪失とその凝集である。本発明者らは、エクソン１と２の間のイントロンでＴＤＰ－４３がＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡに結合するＳＴＭＮ２のＴＤＰ－４３調節のモデルを提案する。ＴＤＰ－４３レベルの低減または核外輸送のいずれかは、トランケートされたＳＴＭＮ２ｍＲＮＡ転写物がもたらされる潜在性エクソンの早期のポリアデニル化及びスプライシングを招く。有効でない（ｂｌｕｎｔｅｄ）転写物は、推定１７アミノ酸ポリペプチドをコードし、したがってＳＴＭＮ２タンパク質のレベルを低減させる。ＳＴＭＮ２の喪失は、神経突起伸長の低減及び損傷後の軸索修復の低減につながる。アンチセンスオリゴヌクレオチド及びＳＴＭＮ２配列に対するそれらの位置を示す。ＳＴＭＮ２遺伝子座に対するＡＳＯの配列、化学的性質、及びアラインメントを示す。ヒト遺伝子の突出した特徴を強調表示しており、これには、スプライスアクセプター部位（暗青緑色）、推定コード領域（黄色）、終止コドン（赤色）、ＴＤＰ－４３結合モチーフ（橙色）、及びポリＡシグナル（紫色）が含まれる。黄色で強調表示したＡＳＯは、ロックド核酸の化学的性質を有する。ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡの潜在性エクソン含有領域を調査する。様々な突出した特徴を強調表示した、ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡの潜在性エクソン含有領域の配列を提供する。ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡの潜在性エクソン含有領域を調査する。ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡの潜在性エクソン含有領域の予測されるＲＮＡ構造を提供し、緑色で強調表示した領域は部分的に構造化されておらず、同様のエネルギーで異なる結合相互作用を用いることができることを示している。ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡの潜在性エクソン含有領域を調査する。ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡの潜在性エクソン含有領域の予測されるＲＮＡ構造を提供し、緑色で強調表示した領域は部分的に構造化されておらず、同様のエネルギーで異なる結合相互作用を用いることができることを示している。患者特異的な人工多能性幹細胞の特徴付けを示す。Ａは、未分化患者ｉＰＳ細胞を示す顕微鏡写真を提供する。Ｂは、患者株中の重要ではないヘテロ接合性Ｌ３０６Ｉ非病理学的バリアントを確認する、示されたｉＰＳ細胞株においてＴＢＫ１のエクソン８から増幅したＰＣＲ産物のシーケンシングクロマトグラムを提供する。Ｃ～Ｄは、患者ｉＰＳ細胞から分化した運動ニューロンを示す顕微鏡写真を提供する。患者ニューロンで観察された核内ＴＤＰ－４３の低下を示す。Ａは、ＴＤＰ－４３（赤色）、β－ＩＩＩチューブリン（緑色）について免疫染色し、核を標識するＤＡＰＩ（青色）で対比染色した対照及び患者ニューロンの代表的な顕微鏡写真を提供する。スケールバーは１００μｍ。Ｂは、対照ニューロンを患者と比較した、ＴＤＰ－４３免疫染色及びＤＡＰＩ蛍光に関するピアソンの相関分析を提供する。小点は個々の細胞を表し、ｎ＝対照株４つ及び患者株１つからの少なくとも２５個の細胞の平均値＋ｓ．ｄ．として示す（対応のないｔ検定、両側、Ｐ＜０．０５）。患者の運動ニューロンが、ＴＤＰ－４３の枯渇に応答してトランケートされたＳＴＭＮ２を産生することを示す。患者ｉＰＳ細胞から分化した運動ニューロンにおけるｓｉＴＡＲＤＢＰによるＴＤＰ－４３ノックダウン後に、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析によって分析したＲＮＡレベル。Ａは、ＴＤＰ－４３のＲＮＡレベルを示す。Ｂは、完全長ＳＴＭＮ２のＲＮＡレベルを示す。Ｃは、対照（ｓｉＣＴＲＬ）と比較した潜在性ＳＴＭＮ２のＲＮＡレベルを示す。患者のＳＴＭＮ２遺伝子座シーケンシングを示す。参照配列にアラインメントした患者ｉＰＳ細胞株におけるＳＴＭＮ２の第１イントロンから増幅したＰＣＲ産物のシーケンシングの結果を示す。患者のＳＴＭＮ２遺伝子座シーケンシングを示す。患者と、共通の一塩基バリアント（ＳＮＰ）からなる参照配列との間の１つのミスマッチを同定する。患者のＳＴＭＮ２遺伝子座シーケンシングを示す。ＳＴＭＮ２の第１イントロンのＡＳＯ標的領域から増幅したＰＣＲ産物のシーケンシングクロマトグラムにより、この遺伝子座にヘテロ接合性がないことが確認されることを示しており、ＡＳＯのマッチを強調表示している。患者の運動ニューロンにおける、ＳＪ＋９４ＡＳＯ（配列番号７３）を用いた潜在性及び完全長ＳＴＭＮ２ＲＮＡのレベルを示す。潜在性ＳＴＭＮ２のＲＮＡレベルを示す。患者の運動ニューロンにおける、ＳＪ＋９４ＡＳＯ（配列番号７３）を用いた潜在性及び完全長ＳＴＭＮ２ＲＮＡのレベルを示す。患者の運動ニューロンにおけるｓｉＴＡＲＤＰによるＴＤＰ－４３低減後の完全長ＳＴＭＮ２ＲＮＡレベルを示す。ニューロンを、左から右に３０、３、０．３、または０．０３ｎＭのＳＴＭＮ２標的化ＡＳＯ（ＳＪ＋９４）または非標的化対照ＡＳＯ（ＮＴＣ）とともに培養した。患者の運動ニューロンにおいて、完全長ＳＴＭＮ２ＲＮＡがＴＤＰ４３の核内枯渇による抑制後にＡＳＯＳＪ＋９４によって増加することを示す。患者のニューロンにおけるＭＧ－１３２（１μＭ）を用いたプロテアソーム阻害（ＴＤＰ－４３の核内枯渇を誘導する）後の完全長ＳＴＭＮ２のｑＲＴ－ＰＣＲ分析により、ＳＴＭＮ２の発現低下がもたらされる。完全長ＳＴＭＮ２ＲＮＡは、非標的化対照ＡＳＯ（ＮＴＣ）で処置したものと比較した場合、これらの条件下でＡＳＯＳＪ＋９４によって増加する。ｓｉＲＮＡによるＴＤＰ－４３低減後のＳＴＭＮ２タンパク質レベルの免疫ブロット分析を示す。タンパク質インプットをＢＣＡで正規化し、ＳＴＭＮ２レベルを対照ｓｉＲＮＡで処置したｈＭＮにおけるレベルと比較して示す。データはｎ＝３の独立した実験による技術的反復試験の平均値＋ｓ．ｄ．として示す（対応のないｔ検定、両側、Ｐ＜０．０５）。ｓｉＲＮＡによるＴＤＰ－４３低減後のＳＴＭＮ２タンパク質レベルの免疫ブロット分析を示す。タンパク質インプットをＢＣＡで正規化し、ＳＴＭＮ２レベルを対照ｓｉＲＮＡで処置したｈＭＮにおけるレベルと比較して示す。データはｎ＝３の独立した実験による技術的反復試験の平均値＋ｓ．ｄ．として示す（対応のないｔ検定、両側、Ｐ＜０．０５）。患者の運動ニューロンにおいて、ＴＤＰ－４３枯渇後の成長欠損をＳＴＭＮ２ＡＳＯＳＪ＋９４によってレスキューすることができることを示す。軸索損傷後のｈＭＮにおけるＳＴＭＮ２回復の細胞への影響を評価するために使用される実験戦略の概略を示す。患者の運動ニューロンにおいて、ＴＤＰ－４３枯渇後の成長欠損をＳＴＭＮ２ＡＳＯＳＪ＋９４によってレスキューすることができることを示す。軸索切断の１８時間後のマイクロ流体デバイスにおける患者の運動ニューロンの代表的な顕微鏡写真を提供する。ＮＴＣ及びＳＪ＋９４の赤色長方形で強調表示した視野を、それぞれ画像（ｉ）及び（ｉｉ）に拡大する。患者の運動ニューロンにおいて、ＴＤＰ－４３枯渇後の成長欠損をＳＴＭＮ２ＡＳＯＳＪ＋９４によってレスキューすることができることを示す。小点として表した個々の神経突起の長さを平均値及び標準偏差とともに示す（対応のないｔ検定、両側）。患者の運動ニューロンにおいて、ＴＤＰ－４３枯渇後の成長欠損をＳＴＭＮ２ＡＳＯＳＪ＋９４によってレスキューすることができることを示す。軸索切断の１８時間後のマイクロ流体デバイスにおける患者の運動ニューロンの代表的な顕微鏡写真を提供する。ＮＴＣ及びＳＪ－１の赤色長方形で強調表示した視野を、それぞれ画像（ｉ）及び（ｉｉ）に拡大する。患者の運動ニューロンにおいて、ＴＤＰ－４３枯渇後の成長欠損をＳＴＭＮ２ＡＳＯＳＪ＋９４によってレスキューすることができることを示す。小点として表した個々の神経突起の長さを平均値及び標準偏差とともに示す（対応のないｔ検定、両側）。ＴＤＰ－４３枯渇後の神経突起成長欠損をＳＴＭＮ２ＡＳＯＳＪ－１、ＳＪ＋９４、及びＳＪ＋１０１によってレスキューすることができることを示す。個々の神経突起を小点として表す。ＴＤＰ－４３が枯渇したニューロンにおいて、ＳＴＭＮ２ＡＳＯＳＪ－１、ＳＪ＋９４、及びＳＪ＋１０１によってＳＴＭＮ２を回復させることができることを示す。ＴＤＰ－４３が枯渇したニューロンにおいて、ＳＴＭＮ２ＡＳＯＳＪ－１、ＳＪ＋９４、及びＳＪ＋１０１によって潜在性ＳＴＭＮ２を低減させることができることを示す。患者の運動ニューロンにおける、ＳＪ－１ＡＳＯを用いた潜在性及び完全長ＳＴＭＮ２ＲＮＡのレベルを示す。Ａは、潜在性ＳＴＭＮ２のＲＮＡレベルを示す。Ｂは、患者の運動ニューロンにおけるｓｉＴＡＲＤＢＰ（ｓｉＴＤＰ－４３）によるＴＤＰ－４３低減後の完全長ＳＴＭＮ２のＲＮＡレベルを示す。ニューロンを、左から右に３０、３、０．３、または０．０３ｎＭのＳＴＭＮ２標的化ＡＳＯ（ＳＪ－１）または非標的化対照ＡＳＯ（ＮＴＣ）とともに培養した。患者の運動ニューロンにおいて、完全長ＳＴＭＮ２ＲＮＡが、ＴＤＰ３の核内誤局在化による抑制後にＡＳＯＳＪ－１によって増加することを示す。患者のニューロンにおけるＭＧ－１３２（１μＭ）を用いたプロテアソーム阻害（ＴＤＰ－４３の核内誤局在化を誘導する）後の完全長ＳＴＭＮ２のｑＲＴ－ＰＣＲ分析により、ＳＴＭＮ２の発現低下がもたらされる。完全長ＳＴＭＮ２ＲＮＡは、非標的化対照ＡＳＯ（ＮＴＣ）で処置したものと比較した場合、これらの条件下でＡＳＯＳＪ－１によって増加する。ｓｉＲＮＡによるＴＤＰ－４３の低減後に、患者の運動ニューロンにおいてウエスタンブロットによって測定したＳＴＭＮ２タンパク質レベルを示す。タンパク質充填量を総タンパク質含有量で正規化し、ＳＴＭＮ２レベルを対照ｓｉＣＴＲＬで処置したｈＭＮにおけるレベルと比較して示す。データはｎ＝３の独立した実験による技術的反復試験の平均値＋ｓ．ｄ．として示す。非標的化対照（ＮＴＣ）と比較した、ＳＪ－１、ＳＪ＋９４、及びＳＪ＋１０１によって誘導されたＳＴＭＮ２レベルの増加に関するｐ値を各結果の上に示す。いずれの場合も増加は有意である（対応のないｔ検定、両側、Ｐ＜０．０５）。

ＲＮＡ結合タンパク質ＴＤＰ－４３の誤局在化または枯渇は、微小管調節因子をコードするＳＴＭＮ２の発現低下をもたらす。ＳＴＭＮ２は、正常な軸索の成長及び再生に不可欠である。ＴＤＰ－４３の機能低下により、ＳＴＭＮ２タンパク質の発現低減をもたらす、不完全なまたは変化したＳＴＭＮ２ＲＮＡ配列が生じる。ＳＴＭＮ２は、有望な治療標的及び疾患リスク（例えば、神経変性疾患）のバイオマーカーである可能性がある。

本明細書に記載の研究は、ＳＴＭＮ２ｍＲＮＡへの潜在性エクソンの包含を抑制または防止するための組成物及び方法に関する。ＳＴＭＮ２ｍＲＮＡへの潜在性エクソンの包含により、トランケートされた転写物及びタンパク質がもたらされる可能性がある。いくつかの態様では、潜在性エクソンの包含は、早期ポリアデニル化をもたらす。ＳＴＭＮ２の発現は、ＴＤＰ－４３が隔離されたときまたはその機能が低減したときに生じるＳＴＭＮ２の潜在性スプライシング形態の抑制を通じて、（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与により）潜在性形態の出現または蓄積を遮断して、それを機能的なＳＴＭＮ２ＲＮＡへと再度変換するか、またはそれを回復させることなどによって、回復させることができる。更に、本明細書に記載の研究は、ＳＴＭＮ２のタンパク質合成を増加させる、すなわちＳＴＭＮ２タンパク質発現を増加させるための組成物及び方法に関する。

薬剤及び医薬組成物
本開示は、ＴＤＰ－４３の機能が減退しているかまたはＴＤＰ病変が存在する場合に発生しかつ存在量が増加するＳＴＭＮ２ｍＲＮＡ配列、プレｍＲＮＡ配列、または新生ＲＮＡ配列に特異的に結合し、それにより不完全なまたは変化したＳＴＭＮ２ＲＮＡ配列の包含を抑制または防止する薬剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を企図する。いくつかの態様では、薬剤は、ＳＴＭＮ２タンパク質の分解を防止する。いくつかの態様では、薬剤は、ＳＴＭＮ２タンパク質レベルを回復させる。いくつかの態様では、薬剤は、ＳＴＭＮ２ＲＮＡへの潜在性エクソンの包含を抑制または防止する。特定の態様では、薬剤は、潜在性エクソンをコードするＳＴＭＮ２ｍＲＮＡ配列、プレｍＲＮＡ配列、または新生ＲＮＡ配列に特異的に結合する。

いくつかの態様では、本開示は、ＥＬＡＶＬ３ｍＲＮＡ配列、プレｍＲＮＡ配列、または新生ＲＮＡ配列に特異的に結合する薬剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を更に企図する。ＥＬＡＶＬ３は、ＴＤＰ－４３の機能が減退しているかまたはＴＤＰ病変が存在する場合にダウンレギュレートされ得る。いくつかの態様では、薬剤は、ＥＬＡＶＬ３の潜在性スプライシングを抑制または防止する。

いくつかの実施形態では、薬剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、ＳＴＭＮ２ＲＮＡ配列（例えば、不完全なまたは変化したＳＴＭＮ２ＲＮＡ配列）に結合する。いくつかの態様では、短く不完全なまたは変化したＳＴＭＮ２ＲＮＡ配列へ薬剤が結合すると、ＲＮＡポリメラーゼによって継続的に生成されるようになる。例えば、薬剤は、潜在性エクソンのポリアデニル化部位での早期転写終結を直接抑制し得るか、またはその標的部位でのＴＤＰ－４３結合の活性を模倣することにより、潜在性エクソンでの転写終結を変化させ得る。いくつかの態様では、薬剤は、ＳＴＭＮ２ＲＮＡへの潜在性エクソンの包含を抑制または防止する。いくつかの態様では、薬剤は、ＳＴＭＮ２タンパク質の分解を防止する。いくつかの態様では、薬剤は、（例えば、エクソンスキッピングを通じて）ＳＴＭＮ２レベルを増加させる。いくつかの態様では、薬剤は、正常長のまたはタンパク質をコードするＳＴＭＮ２ＲＮＡ（例えば、プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ）を回復させる。いくつかの態様では、薬剤は、ＳＴＭＮ２ＲＮＡの量または活性を増加させる。いくつかの態様では、薬剤は、ＳＴＭＮ２のタンパク質発現を増加させる。

「増加した」または「増加する」という用語は、本明細書では概して、統計学的に有意な量の増加を意味するために使用される。疑義を避けるために述べると、「増加した」または「増加する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％の増加、もしくは１００％までの増加、または１０～１００％の間の任意の増加、あるいは参照レベルと比較して少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約１０倍の増加、または２倍～１０倍以上の間の任意の増加を意味する。

いくつかの態様では、薬剤は、ＳＴＭＮ２ＲＮＡの量または活性を、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍増加させる。いくつかの態様では、薬剤は、ＳＴＭＮ２タンパク質発現を、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍増加させる。

いくつかの実施形態では、薬剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、１つ以上の部位、例えば、ＳＴＭＮ２転写物の５’スプライス部位、３’スプライス部位、通常の結合部位、及び／またはポリアデニル化部位を標的とする。いくつかの態様では、薬剤は、１つ以上の部位、例えば、ＳＴＭＮ２転写物の５’スプライス部位の近位部位、３’スプライス部位の近位部位、通常の結合部位の近位部位、及び／またはポリアデニル化部位の近位部位を標的とする。特定の実施形態では、薬剤は、ＴＤＰ－４３により調節される５’スプライス部位、ＴＤＰ－４３の通常の結合部位、及び／または潜在性ポリアデニル化部位を含む、１つ以上の部位を標的とする。いくつかの実施形態では、薬剤は、一本鎖部位を標的とする。特定の実施形態では、薬剤は、ＴＤＰ－４３結合部位とポリアデニル化部位との間に位置する一本鎖領域を標的とする。いくつかの実施形態では、薬剤は、潜在性スプライス部位の近位部位を標的とする。いくつかの実施形態では、薬剤は、早期ポリアデニル化部位の近位部位を標的とする。いくつかの実施形態では、薬剤は、潜在性スプライス部位と早期ポリアデニル化部位との間に位置する領域を標的とする。いくつかの実施形態では、薬剤は、ポリアデニル化部位を標的としないか、またはそれに結合しない。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＳＴＭＮ２転写物のポリアデニル化部位を標的としないか、またはそれに結合しない。いくつかの実施形態では、薬剤は、潜在性ポリアデニル化部位を標的としないか、またはそれに結合しない。いくつかの態様では、薬剤は、ＳＴＭＮ２エクソン２からエクソン１へのスプライシングを標的とし、促進する。

ＳＴＭＮ２エクソン１は、
ＡＧＣＴＣＣＴＡＧＧＡＡＧＣＴＴＣＡＧＧＧＣＴＴＡＡＡＧＣＴＣＣＡＣＴＣＴＡＣＴＴＧＧＡＣＴＧＴＡＣＴＡＴＣＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＡＡＴＧＧＧＧＧＧＡＧＣＣＧＡＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＣＴＧＡＴＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＡＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＧＧＴＡＣＴＴＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＣＡＣＣＡＴＴＧＧＣＣＧＡＴＣＡＡＴＡＴＴＴＡＡＴＧＣＴＴＧＧＡＧＡＴＴＣＴＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＧＡＧＴＣＡＴＧＴＣＡＧＧＧＧＡＣＣＴＴＧＧＧＡＧＣＣＡＡＴＣＴＧＣＴＴＧＡＧＣＴＴＣＴＧＡＧＴＧＡＴＡＡＴＴＡＴＴＣＡＴＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＴＴＧＣＴＣＴＴＴＣＴＣＴＡＧＣＡＣＧＧＴＣＣＣＡＣＴＣＴＧＣＡＧＡＣＴＣＡＧＴＧＣＣＴＴＡＴＴＣＡＧＴＣＴＴＣＴＣＴＣＴＣＧＣＴＣＴＣＴＣＣＧＣＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＧＧＡＣＣＣＴＴＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＡＣＴＧＣＴＣＡＧＣＧＴＣＴＧＣＡＣＡＴＣＣＣＴＡＣＡＡＴＧＧＣＴＡＡＡＡＣＡＧＣＡＡＴＧＧＧＡＣＴＣＧＧＣＡＧＡＡＧＡＣＣＴＴＣＧＡＧＡＧＡＡＡＧＧＴＡＧＡＡＡＡＴＡＡＧＡＡＴＴＴＧＧＣＴＣＴＣＴＧＴＧＴＧＡＧＣＡＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＧＣＣＴＧＣＣＴＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＧＡＡＴＧＴＧＡＡＴＧＣＧＧＣＴＴＧＴＧＧＣＡＣＡＧＴＴＧＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＴＡＡＡＴＣＡＡＴＡＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＡＣＴＡＴＣＡＴＴＴＡＴＧＡＡＴＡＧＣ（配列番号１）の配列を有し得る。

ＳＴＭＮ２エクソン２は、
ＣＣＴＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣＡＴＧＣＴＧＴＣＡＣＴＧＡＴＣＴＧＣＴＣＴＴＧＣＴＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＡＣＣＴＣＧＣＡＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＴＡＴＡＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧ（配列番号２）の配列を有し得る。

潜在性エクソンは、ＧＡＣＴＣＧＧＣＡＧＡＡＧＡＣＣＴＴＣＧＡＧＡＧＡＡＡＧＧＴＡＧＡＡＡＡＴＡＡＧＡＡＴＴＴＧＧＣＴＣＴＣＴＧＴＧＴＧＡＧＣＡＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＧＣＣＴＧＣＣＴＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＧＡＡＴＧＴＧＡＡＴＧＣＧＧＣＴＴＧＴＧＧＣＡＣＡＧＴＴＧＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＴＡＡＡＴＣＡＡＴＡＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＡＣＴＡＴＣＡＴＴＴＡＴＧＡＡＴＡＧＣ（配列番号３）の配列を有し得る。

使用することができる薬剤の例示的なタイプとしては、有機小分子または無機小分子；サッカリン；オリゴ糖；多糖；ペプチド、タンパク質、ペプチド類似体及び誘導体からなる群から選択される生体高分子；ペプチド模倣物；ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、及びアプタマーからなる群から選択される核酸；細菌、植物、真菌、動物細胞、及び動物組織からなる群から選択される生体物質から作製される抽出物；天然に存在する組成物または合成組成物；抗体；ならびにこれらの任意の組み合わせが挙げられる。

いくつかの実施形態では、薬剤は、オリゴヌクレオチド、タンパク質、または小分子である。いくつかの実施形態では、薬剤は、１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、スプライススイッチングオリゴヌクレオチドである。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。いくつかの実施形態では、薬剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。いくつかの実施形態では、薬剤は、標的部位（例えば、ＳＴＭＮ２転写物）に結合して標的の代謝をシフトさせることができる小分子（例えば、ブラナプラム（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）またはリスジプラム（Ｒｏｃｈｅ））である。

いくつかの実施形態では、薬剤は、オリゴヌクレオチド、タンパク質、または小分子である。いくつかの実施形態では、薬剤は、１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。複数のオリゴヌクレオチドを含む薬剤は、多量体化合物と見なされ得る。いくつかの態様では、薬剤は、オリゴヌクレオチドの１つ以上のコピーを含む。いくつかの態様では、薬剤は、複数のオリゴヌクレオチドの１つ以上のコピーを含む。いくつかの態様では、複数のオリゴヌクレオチドは共有結合され得る。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、スプライススイッチングオリゴヌクレオチドである。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。いくつかの実施形態では、薬剤は、標的部位（例えば、ＳＴＭＮ２転写物）に結合して標的の代謝をシフトさせることができる小分子（例えば、ブラナプラム（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）またはリスジプラム（Ｒｏｃｈｅ））である。いくつかの態様では、薬剤は、毒性、例えば血小板毒性を呈さない。

薬剤は、５’スプライス部位、３’スプライス部位、通常の結合部位、またはポリアデニル化部位のうちの１つ以上を標的とし得る。いくつかの態様では、薬剤は、ＳＴＭＮ２転写物の５’スプライス部位の近位部位、３’スプライス部位の近位部位、通常の結合部位の近位部位、及び／またはポリアデニル化部位の近位部位のうちの１つ以上を標的とする。いくつかの実施形態では、薬剤は、潜在性スプライス部位の近位部位を標的とする。いくつかの実施形態では、薬剤は、早期ポリアデニル化部位の近位部位を標的とする。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＳＴＭＮ２転写物の一本鎖領域を標的とする。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＴＤＰ－４３結合部位とポリアデニル化部位との間に位置する一本鎖領域を標的とする。いくつかの実施形態では、薬剤は、潜在性スプライス部位と早期ポリアデニル化部位との間に位置する領域を標的とする。いくつかの態様では、ポリアデニル化部位は、ＳＴＭＮ２転写物のポリアデニル化部位である。いくつかの態様では、ポリアデニル化部位は、潜在性エクソンのポリアデニル化部位である（例えば、潜在性ポリアデニル化部位である）。いくつかの実施形態では、薬剤は、５’スプライス部位（例えば、ＴＤＰ－４３の５’スプライス部位）を標的としない。いくつかの実施形態では、薬剤は、通常の結合部位（例えば、通常のＴＤＰ－４３結合部位）を標的としない。いくつかの実施形態では、薬剤は、ポリアデニル化部位（例えば、潜在性ポリアデニル化部位）を標的としない。いくつかの態様では、

特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’スプライス部位、３’スプライス部位、通常の結合部位、またはポリアデニル化部位のうちの１つ以上を標的とし得る。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’スプライス部位（例えば、ＴＤＰ－４３の５’スプライス部位）を標的としない。特定の態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＴＭＮ２転写物の５’スプライス部位の近位部位、３’スプライス部位の近位部位、通常の結合部位の近位部位、及び／またはポリアデニル化部位の近位部位のうちの１つ以上を標的とする。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＴＭＮ２転写物の一本鎖領域を標的とする。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＤＰ－４３結合部位とポリアデニル化部位との間に位置する一本鎖領域を標的とする。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、潜在性スプライス部位の近位部位を標的とする（例えば、潜在性スプライス部位から－１の部位を標的とする）。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、早期ポリアデニル化部位の近位部位を標的とする。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、潜在性スプライス部位と早期ポリアデニル化部位との間に位置する領域を標的とする。いくつかの態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、潜在性スプライスジャンクションを基準として＋９０～＋１０５、またはより具体的には＋９４または＋１０１の領域を標的とする。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常の結合部位（例えば、通常のＴＤＰ－４３結合部位）を標的としない。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ポリアデニル化部位（例えば、潜在性ポリアデニル化部位）を標的としない。

特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号３７～８５からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号３７～７４からなる群から選択される配列を含む。いくつかの態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４０、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５６、及び配列番号７８からなる群から選択される配列を含む。特定の態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５２を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５３、配列番号７２、及び配列番号７３からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号７３を含む。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５３を含む。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号７２を含む。

表１は、例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドのリストを示し、場合によっては、ＳＴＭＮ２イントロン内の対応する標的部位を示す。配列番号９３～１０８内の下線付きの塩基は、潜在性スプライス部位に隣接する塩基を表す。配列番号１１２～１１４内の下線付きの塩基は、ＴＤＰ－４３タンパク質の結合部位を表す。本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、複数の化学修飾により合成された。例えば、配列番号３７～７４のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の構造：

を有するＭＯＥ糖及びホスホロチオエート結合により完全に修飾された。追加の修飾を試験することもできる。

オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を、５’キャップでのリボソーム会合を防止するか、ｍＲＮＡ成熟化の間のポリアデニル化を防止するか、またはスプライシング事象に影響を及ぼすｍＲＮＡ領域に結合するように設計することができる（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、ＢｅｎｎｅｔｔａｎｄＳｗａｙｚｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，２０１０、ＷａｔｔｓａｎｄＣｏｒｅｙ，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，２０１２、Ｋｏｌｅｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ．，２０１２、Ｓａｌｅｈｅｔａｌ，ＩｎＥｘｏｎＳｋｉｐｐｉｎｇ：ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１２）。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、例えば、５’ＴＤＰ－３スプライス部位、またはＴＤＰ－４３の通常の結合部位を含む、１つ以上の部位を標的とするように設計されている。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上のスプライス部位を標的とする。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、ＴＤＰ－４３により調節される５’スプライス部位またはＴＤＰ－４３の通常の結合部位のうちの１つ以上を標的とする。いくつかの態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ポリアデニル化部位（例えば、潜在性ポリアデニル化部位）を標的としないように設計されている。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、潜在性スプライス部位とポリアデニル化部位との間に位置する非構造化領域を標的とする（図８３を参照されたい）。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ワトソン－クリック塩基対形成によってＲＮＡ転写物を標的とし、タンパク質発現の低減または修飾をもたらすことができる、ＤＮＡの小さな配列（例えば、約８～５０塩基対長）である。オリゴヌクレオチドは、リン酸骨格及び糖環で構成されている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは修飾されていない。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの溶解性、結合性、効力、及び／または安定性を向上させるための、１つ以上の修飾を含む。修飾オリゴヌクレオチドは、非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡに対して少なくとも１つの修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合修飾、糖修飾、及び／または核酸塩基修飾を含むように修飾される。そのような修飾の例は、当業者に公知である。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチドを修飾ヌクレオチドで置換することによって修飾され、その結果、ｉｎｖｉｖｏ安定性が、対応する非修飾オリゴヌクレオチドと比較して増強される。いくつかの態様では、修飾ヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオチドである。別の態様では、修飾ヌクレオチドは、核酸塩基修飾ヌクレオチドである。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド類似体を含有し得る。ヌクレオチド類似体は、例えば、オリゴヌクレオチド分子の５’末端及び／または３’末端の領域中の、標的特異的活性、例えば、スプライス部位選択調節活性が実質的に影響されない位置に位置し得る。いくつかの態様では、末端は、修飾ヌクレオチド類似体を導入することによって安定化され得る。

いくつかの態様では、好ましいヌクレオチド類似体には、糖修飾及び／または骨格修飾リボヌクレオチドが含まれる（すなわち、リン酸－糖骨格への修飾が含まれる）。例えば、リボヌクレオチドのホスホジエステル結合は、窒素または硫黄ヘテロ原子のうちの少なくとも１つを含むように修飾され得る。好ましい骨格修飾リボヌクレオチドにおいて、隣接するリボヌクレオチドに連結するリン酸エステル基は、修飾基、例えば、ホスホチオエート基の修飾基によって置換される。好ましい糖修飾リボヌクレオチドにおいて、２’－ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２またはＯＮから選択される基（式中、ＲはＣ１～Ｃ６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである）によって置換される。

いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾糖部分を含む１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含む１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合を含む。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾糖部分を含む１つ以上の修飾ヌクレオシド、修飾核酸塩基を含む１つ以上の修飾ヌクレオシド、及び１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合のうちの少なくとも２つを含む。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾糖部分を含む１つ以上の修飾ヌクレオシド、修飾核酸塩基を含む１つ以上の修飾ヌクレオシド、及び１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合を含む。

糖修飾
いくつかの実施形態では、修飾糖部分は、非二環式修飾糖部分である。いくつかの実施形態では、修飾糖部分は、二環式または三環式糖部分である。いくつかの実施形態では、修飾糖部分は、糖代替物である。そのような糖代替物は、他のタイプの修飾糖部分の置換に対応する１つ以上の置換を含み得る。

いくつかの実施形態では、修飾糖部分は、１つ以上の置換基を有するフラノシル環であって、その置換基のいずれもフラノシル環の２つの原子を架橋して二環式構造を形成しないフラノシル環を含む、非二環式修飾糖部分である。そのような非架橋置換基は、２’位、４’位及び／または５’位の置換基を含むがこれらに限定されない、フラノシルの任意の位置に存在し得る。特定の実施形態では、非二環式修飾糖部分の１つ以上の非架橋置換基は、分枝状である。

いくつかの実施形態では、修飾糖部分は、フラノシル環の２つの原子を架橋して第２の環を形成し二環式糖部分を生じさせる置換基を含む。いくつかの態様では、二環式糖部分は、４’フラノース環原子と２’フラノース環原子との間に架橋を含む。

いくつかの態様では、二環式糖部分及びそのような二環式糖部分を組み込むヌクレオシドは、異性体配置により更に定義される。いくつかの実施形態では、ＬＮＡヌクレオシドは、α－Ｌ配置で存在する。いくつかの実施形態では、ＬＮＡヌクレオシドは、β－Ｄ配置で存在する。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド修飾は、２’－ヒドロキシル基が糖環の３’または４’炭素原子に連結され、それにより二環式糖部分を形成するロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。結合は、好ましくは２’酸素原子と４’炭素原子とを架橋するメチレン（－ＣＨ２－）ｎ基である（式中、ｎは１または２である）。ＬＮＡ及びその調製はＷＯ９８／３９３５２及びＷＯ９９／１４２２６に記載されており、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、修飾糖部分は、１つ以上の非架橋糖置換基及び１つ以上の架橋糖置換基（例えば、５’で置換され４’－２’で架橋された糖）を含む。

いくつかの実施形態では、修飾糖部分は、糖代替物である。いくつかの態様では、糖部分の酸素原子は、例えば、硫黄、炭素または窒素原子によって置換されている。いくつかの態様では、そのような修飾糖部分はまた、本明細書に記載の架橋及び／または非架橋置換基も含む。いくつかの態様では、糖代替物は、５つ以外の原子を有する環を含む。特定の態様では、糖代替物は、６員のテトラヒドロピラン（「ＴＨＰ」）を含む。いくつかの態様では、糖代替物は、非環式部分を含む。

核酸塩基修飾
修飾オリゴヌクレオチドは、非修飾核酸塩基を含む１つ以上のヌクレオシドを含み得る。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含む１つ以上のヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、核酸塩基を含まない１つ以上のヌクレオシドを含む。

特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、アルキルまたはアルキニル置換ピリミジン、アルキル置換プリン、ならびにＮ－２、Ｎ－６、及びＯ－６置換プリンから選択される。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、２－アミノプロピルアデニン、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、６－Ｎ－メチルグアニン、６－Ｎ－メチルアデニン、２－プロピルアデニン、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－プロピニル（－Ｃ℃－Ｃ］３／４）ウラシル、５－プロピニルシトシン、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン、６－アゾチミン、５－リボシルウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル、８－アザ及び他の８－置換プリン、５－ハロ（特に、５－ブロモ、５－トリフルオロメチル、５－ハロウラシル、及び５－ハロシトシン）、７－メチルグアニン、７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、３－デアザグアニン、３－デアザアデニン、６－Ｎ－ベンゾイルアデニン、２－Ｎ－イソブチリルグアニン、４－Ｎ－ベンゾイルシトシン、４－Ｎ－ベンゾイルウラシル、５－メチル４－Ｎ－ベンゾイルシトシン、５－メチル４－Ｎ－ベンゾイルウラシル、ユニバーサル塩基、疎水性塩基、無差別塩基（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓｂａｓｅ）、サイズ拡張塩基（ｓｉｚｅ－ｅｘｐａｎｄｅｄｂａｓｅ）ならびにフッ素化塩基から選択される。更なる修飾核酸塩基としては、三環式ピリミジン、例えば、１，３－ジアザフェノキサジン－２－オン、１，３－ジアザフェノチアジン－２－オン、及び９－（２－アミノエトキシ）－１，３－ジアザフェノキサジン－２－オン（Ｇ－クランプ）が挙げられる。修飾核酸塩基には、プリン塩基またはピリミジン塩基が他の複素環で置換されているもの、例えば７－デアザ－アデニン、７－デアザグアノシン、２－アミノピリジン、及び２－ピリドンも含まれ得る。

また、核酸塩基修飾リボヌクレオチド、すなわち、天然に存在する核酸塩基の代わりに少なくとも１つの天然に存在しない核酸塩基を含有するリボヌクレオチドも好ましい。修飾核酸塩基の例としては、５位でのウリジン及び／またはシチジン修飾、例えば、５－（２－アミノ）プロピルウリジン、５－ブロモウリジン；８位で修飾されたアデノシン及び／またはグアノシン、例えば、８－ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば、７－デアザ－アデノシン；Ｏ－アルキル化及びＮ－アルキル化ヌクレオチド、例えば、Ｎ６－メチルアデノシンが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のオリゴヌクレオチド試薬はまた、オリゴヌクレオチド試薬のｉｎｖｉｖｏ薬理学的特性を向上させる化学的部分で修飾され得る。

ヌクレオシド間修飾
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、任意のヌクレオシド間結合を使用して一緒に連結される。ヌクレオシド間結合基の２つの主なクラスは、リン原子の有無により定義される。代表的なリン含有ヌクレオシド間結合としては、ホスホジエステル結合（「Ｐ＝Ｏ」）（非修飾結合または天然に存在する結合とも称される）を含むリン酸、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホロアミダート、及びホスホロチオエート（「Ｐ＝Ｓ」）、及びホスホロジチオエート（「ＨＳ－Ｐ＝Ｓ」）が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な非リン含有ヌクレオシド間結合基としては、メチレンメチルイミノ（－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－Ｏ－ＣＨ_２－）、チオジエステル、チオノカルバメート（－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）（ＮＨ）－Ｓ－）；シロキサン（－Ｏ－ＳｉＨ_２－Ｏ－）；及びＮ，Ｎ’－ジメチルヒドラジン（－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－Ｎ（ＣＨ_３）－）が挙げられるが、これらに限定されない。修飾ヌクレオシド間結合は、天然に存在するリン酸結合と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を変化させる（通常は増加させる）ために使用することができる。特定の実施形態では、キラル原子を有するヌクレオシド間結合を、ラセミ混合物として、または別個の鏡像異性体として調製することができる。リン含有及び非リン含有ヌクレオシド間結合を調製する方法は、当業者に周知である。

更なる修飾は当業者に公知であり、例をＷＯ２０１９／２４１６４８、ＵＳ１０，３０７，４３４、ＵＳ９，０４５，５１８、及びＵＳ１０，２６６，８２２に見ることができ、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。

オリゴヌクレオチドは、不完全なまたは変化したＳＴＭＮ２ＲＮＡを標的とするのに十分な任意のサイズ及び／または化学組成であり得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約５～３００ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドである。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、約１０～１００、１５～８５、２０～７０、２５～５５、または３０～４０ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドである。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、約１５～３５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、または３０～３５ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドである。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド及び標的ＲＮＡ配列（例えば、不完全なまたは変化したＳＴＭＮ２ＲＮＡ）は１００％の配列相補性を有する。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、標的配列と比較して、配列変動、例えば、挿入、欠失、及び単一点変異を含み得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡ（例えば、ＳＴＭＮ２ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、または新生ＲＮＡ）に対して少なくとも７０％の配列同一性または相補性を有する。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。

不完全なまたは変化したＳＴＭＮ２ＲＮＡ配列（例えば、ＳＴＭＮ２ｍＲＮＡ配列、プレｍＲＮＡ配列、または新生ＲＮＡ配列）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者に公知の任意の方法によって設計され得る。特定の態様では、１つ以上のオリゴヌクレオチドが合成される。

いくつかの実施形態では、ＳＴＭＮ２は、遺伝子治療薬として投与される。いくつかの実施形態では、ＳＴＭＮ２は、本明細書に記載の薬剤と併用投与される。

いくつかの実施形態では、薬剤は、ｃ－ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の阻害剤である。いくつかの態様では、ＪＮＫ阻害剤は、有機小分子または無機小分子；サッカリン；オリゴ糖；多糖；ペプチド、タンパク質、ペプチド類似体及び誘導体からなる群から選択される生体高分子；ペプチド模倣物；ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、及びアプタマーからなる群から選択される核酸；細菌、植物、真菌、動物細胞、及び動物組織からなる群から選択される生体物質から作製される抽出物；天然に存在する組成物または合成組成物；抗体；ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。特定の態様では、薬剤は、小分子阻害剤、オリゴヌクレオチド（例えば、ＪＮＫの発現を低減させるように設計されたもの）、または遺伝子治療薬（例えば、ＪＮＫを阻害するように設計されたもの）である。いくつかの態様では、ＪＮＫの阻害は、ＳＴＭＮ２タンパク質レベルを回復または増加させる。特定の実施形態では、薬剤は、ＪＮＫを標的とするオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）である。

本開示は更に、不完全なまたは変化したＳＴＭＮ２ＲＮＡ配列に結合する薬剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を含む医薬組成物を企図する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、潜在性エクソンをコードするＳＴＭＮ２ｍＲＮＡ配列、プレｍＲＮＡ配列、または新生ＲＮＡ配列に結合する薬剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＳＴＭＮ２タンパク質の分解を防止する薬剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＳＴＭＮ２タンパク質の発現を増加させる、例えば、ＳＴＭＮ２タンパク質の発現を活性化する薬剤を含む。いくつかの態様では、組成物は、オリゴヌクレオチド、タンパク質、または小分子を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、潜在性エクソンをコードするＳＴＭＮ２ｍＲＮＡ配列、プレｍＲＮＡ配列、または新生ＲＮＡ配列に特異的に結合するオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を含む。いくつかの態様では、薬剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、ＳＴＭＮ２ＲＮＡへの潜在性エクソンの包含を抑制または防止する。いくつかの態様では、薬剤は、潜在性スプライシングを抑制する。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１つ以上の部位、例えば、１つ以上のスプライス部位、結合部位、またはポリアデニル化部位を標的とする薬剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１つ以上のスプライス部位（例えば、ＴＤＰ－４３により調節される５’スプライス部位）を標的とする薬剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、通常の結合部位（例えば、通常のＴＤＰ－４３結合部位）を標的とする薬剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ポリアデニル化部位（例えば、潜在性ポリアデニル化部位）を標的とする薬剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、潜在性スプライス部位の近位部位またはポリアデニル化部位（例えば、早期ポリアデニル化部位）の近位部位を標的とする薬剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、潜在性スプライス部位とポリアデニル化部位との間に位置する部位を標的とする薬剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１つ以上のスプライス部位（例えば、ＴＤＰ－４３により調節される５’スプライス部位）を標的としない薬剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、通常の結合部位（例えば、通常のＴＤＰ－４３結合部位）を標的としない薬剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ポリアデニル化部位（例えば、潜在性ポリアデニル化部位）を標的としない薬剤を含む。

いくつかの態様では、医薬組成物は、多量体化合物、例えば、２つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む化合物を含む。２つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、同じ配列を有する２つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでもよく、または代わりに、異なる配列を有する２つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの態様では、２つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、共有結合されている。いくつかの態様では、医薬組成物は、２つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。更に２つのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、同じアンチセンスオリゴヌクレオチドの複数のコピーの組み合わせ及び／または複数の異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドの個々のコピーを含み得る。

特定の実施形態では、医薬組成物は、配列番号３７～８５からなる群から選択される配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、配列番号３７～７４からなる群から選択される配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、医薬組成物は、配列番号４０、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５６、及び配列番号７８からなる群から選択される配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。特定の態様では、医薬組成物は、配列番号５２を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、配列番号５３、配列番号７２、及び配列番号７３からなる群から選択される配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、配列番号７３を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、潜在性エクソンをコードするＳＴＭＮ２ｍＲＮＡ配列に結合する有効量の薬剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）及び有効量の第２の薬剤を含む。いくつかの態様では、第２の薬剤は、神経変性障害を処置または阻害する薬剤である。いくつかの態様では、第２の薬剤は、外傷性脳損傷を処置または阻害する薬剤である。いくつかの態様では、第２の薬剤は、プロテアソーム阻害剤誘導性ニューロパチーを処置または阻害する薬剤である。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、不完全なまたは変化したＳＴＭＮ２ＲＮＡ配列に結合する有効量の薬剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）及び有効量のＳＴＭＮ２（例えば、遺伝子治療薬として投与される）を含む。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、不完全なまたは変化したＳＴＭＮ２ＲＮＡ配列に結合する有効量の第１の薬剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）及びＪＮＫを阻害する第２の薬剤を含む。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、潜在性エクソンをコードするＳＴＭＮ２ｍＲＮＡ配列、プレｍＲＮＡ配列、または新生ＲＮＡ配列に結合する有効量の薬剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）、有効量の第２の薬剤、及び薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む。

不完全なまたは変化したＳＴＭＮ２ＲＮＡ配列に結合する薬剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を含む組成物は、ＴＤＰ－４３の機能の減退またはＴＤＰ病変に関連する疾患または状態を処置するために使用され得る。いくつかの態様では、不完全なまたは変化したＳＴＭＮ２ＲＮＡ配列に結合する薬剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を含む組成物は、本明細書に記載されている、（例えば、神経細胞における）ＳＴＭＮ２タンパク質のレベルの変異または低減に関連する疾患または状態を処置するために使用され得る。

処置方法
本開示は、正常長ＳＴＭＮ２ＲＮＡまたはタンパク質をコードするＳＴＭＮ２ＲＮＡを回復させる薬剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を含む組成物を利用する様々な処置方法を企図する。いくつかの態様では、薬剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、ＴＤＰ－４３の機能が減退しているかまたはＴＤＰ病変が存在する場合に発生しかつ存在量が増加するＳＴＭＮ２ｍＲＮＡ配列、プレｍＲＮＡ配列、または新生ＲＮＡ配列に特異的に結合し、それにより不完全なまたは変化したＳＴＭＮ２ＲＮＡ配列の包含を抑制または防止する。いくつかの態様では、薬剤は、正常な完全長ＳＴＭＮ２ＲＮＡまたはタンパク質をコードするＳＴＭＮ２ＲＮＡの発現を回復させる。いくつかの態様では、薬剤は、ＳＴＭＮ２ＲＮＡへの潜在性エクソンの包含を抑制または防止する。いくつかの態様では、薬剤は、ＳＴＭＮ２のタンパク質発現を活性化する。

いくつかの態様では、本開示は、疾患がＴＤＰ－４３の機能の減退またはＴＤＰ病変に関連する、任意の疾患または状態の処置を企図する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される発明は、神経細胞におけるＴＤＰ－４３のレベルの変異または低減（例えば、ＴＤＰ－４３関連病変を有する疾患または状態）を処置する方法に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される発明は、ＴＤＰ－４３関連認知症（例えば、ＡＬＳ、ＦＴＤ、アルツハイマー病、パーキンソン病、またはＴＢＩ）を処置する方法に関する。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される発明は、ＴＤＰ－４３のレベルの変異、増加、または低減に関連する疾患または状態を処置する方法に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される発明は、誤局在化したＴＤＰ－４３に関連する疾患または状態を処置する方法に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される発明は、ＳＴＭＮ２タンパク質のレベルの変異もしくは低減、及び／またはＳＴＭＮ２タンパク質の誤局在化に関連する疾患または状態を処置する方法に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される発明は、プロテアソーム阻害剤誘導性ニューロパチー（例えば、機能的な核内ＴＤＰ－４３の量の低減の結果として生じるニューロパチー）に関連する疾患または状態を処置する方法に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される発明は、神経変性障害を処置する方法に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される発明は、ＴＢＩ（例えば、脳震盪）に関連するか、またはその結果として生じる障害または状態を処置する方法に関する。

いくつかの態様では、ＴＤＰ－４３（例えば、核内ＴＤＰ－４３）のレベルの変異または低減は、ＳＴＭＮ２タンパク質のレベルを変異させるかまたは低減させる。ＴＤＰ－４３の誤局在化は、サイトゾルにおけるＴＤＰ－４３のレベルを増加させ得るが、核内ＴＤＰ－４３のレベルを低下させ得る。更に、ＳＴＭＮ２レベルは、ＴＤＰ－４３の変異の結果として低下し得る。いくつかの態様では、ＴＤＰ－４３（例えば、核内ＴＤＰ－４３）のレベルの変異または増加は、ＳＴＭＮ２タンパク質のレベルを変異させるかまたは低減させる。

いくつかの態様では、処置方法は、ＳＴＭＮ２タンパク質のレベルの増加及び／またはＳＴＭＮ２タンパク質の分解もしくは遅延の防止を含む。いくつかの態様では、処置方法は、ＳＴＭＮ２タンパク質のレベルの変異または低減を補正することを含む。いくつかの態様では、処置方法は、ＳＴＭＮ２ＲＮＡの量または活性を増加させることを含む。いくつかの態様では、処置方法は、ＳＴＭＮ２タンパク質の量を増加させること、例えば、タンパク質発現の活性化を増大させることを含む。いくつかの態様では、処置方法は、ＳＴＭＮ２ＲＮＡ（例えば、ＳＴＭＮ２ｍＲＮＡ）への潜在性エクソンの包含を抑制または防止することを含む。いくつかの態様では、処置方法は、神経突起成長及び軸索再生をレスキューすることを含む。

いくつかの実施形態では、処置方法は、有効量の薬剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を対象に投与することを含み、この薬剤は、ＳＴＭＮ２タンパク質の分解を防止する。いくつかの実施形態では、処置方法は、有効量の薬剤を対象に投与することを含み、この薬剤は、正常長ＳＴＭＮ２ＲＮＡまたはタンパク質をコードするＳＴＭＮ２ＲＮＡを回復させる。いくつかの実施形態では、処置方法は、有効量の薬剤を対象に投与することを含み、この薬剤は、不完全なまたは変化したＳＴＭＮ２ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、処置方法は、有効量の薬剤を対象に投与することを含み、この薬剤は、（例えば、神経細胞における）ＳＴＭＮ２ＲＮＡへの潜在性エクソンの包含を抑制または防止する。いくつかの態様では、薬剤は、エクソンスキッピングを通じてＳＴＭＮ２レベルを増加させる。いくつかの態様では、薬剤は、オリゴヌクレオチド、タンパク質、または小分子である。例えば、薬剤は、潜在性エクソンをコードするＳＴＭＮ２ｍＲＮＡ配列、プレｍＲＮＡ配列、または新生ＲＮＡ配列に特異的に結合するオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）であり得る。

特定の実施形態では、処置方法は、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含み、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号３７～８５からなる群から選択される配列を含む。いくつかの態様では、処置方法は、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含み、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号３７～７４からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、処置方法は、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含み、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４０、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５６、及び配列番号７８からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、処置方法は、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含み、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５２を含む。いくつかの実施形態では、処置方法は、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含み、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５３、配列番号７２、及び配列番号７３からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、処置方法は、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含み、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号７３を含む。いくつかの実施形態では、神経変性疾患または障害（例えば、ＡＬＳ、ＦＴＤ、アルツハイマー病、パーキンソン病、またはＴＢＩ）を処置する方法は、配列番号３７～８５からなる群から、または代わりに配列番号３７～７４からなる群から選択される配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、神経変性疾患または障害（例えば、ＡＬＳ、ＦＴＤ、アルツハイマー病、パーキンソン病、またはＴＢＩ）を処置する方法は、配列番号４０、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５６、及び配列番号７８からなる群から選択される配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、神経変性疾患または障害（例えば、ＡＬＳ、ＦＴＤ、アルツハイマー病、パーキンソン病、またはＴＢＩ）を処置する方法は、配列番号５２を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、神経変性疾患または障害（例えば、ＡＬＳ、ＦＴＤ、アルツハイマー病、パーキンソン病、またはＴＢＩ）を処置する方法は、配列番号５３、配列番号７２、及び配列番号７３からなる群から選択される配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、神経変性疾患または障害（例えば、ＡＬＳ、ＦＴＤ、アルツハイマー病、パーキンソン病、またはＴＢＩ）を処置する方法は、配列番号７３を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、処置方法は、第２の薬剤を投与することを含む。

いくつかの実施形態では、薬剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、ＳＴＭＮ２タンパク質レベルを増加及び／または回復させるために有効な量で（例えば、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏで）投与される。

いくつかの態様では、薬剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、潜在性スプライシングを抑制する。いくつかの実施形態では、ＳＴＭＮ２ＲＮＡへの潜在性エクソンの包含を抑制または防止する薬剤で処置された対象は、ニューロン（例えば、運動性軸索）の成長及び／または修復の改善を示す。いくつかの態様では、薬剤は、ＳＴＭＮ２タンパク質の分解を防止する。いくつかの態様では、薬剤は、運動失調、ニューロパチー、シナプス機能障害、認知の欠損、及び／または寿命の低下を含む神経変性疾患の症状を改善する。

いくつかの実施形態では、ＳＴＭＮ２ＲＮＡへの潜在性エクソンの包含は、ゲノム編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）を使用して抑制または防止される。

本明細書で使用される場合、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、または「緩和」は疾患、障害または病態に関して使用される場合、状態の治療的処置を指し、その目的は、症状または状態の進行または重症度を逆転、軽減、緩和、阻害、減速または停止させることである。「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、状態の少なくとも１つの有害な影響または症状を低減または軽減させることを含む。１つ以上の症状または臨床マーカーが低減した場合、処置は一般に「有効」である。あるいは、状態の進行が低減または停止した場合、処置は「有効」である。すなわち、「処置」には、症状またはマーカーの改善だけではなく、処置が行われない場合に予想される症状の進行または悪化を中断することまたは少なくとも減速させることも含まれる。有益なまたは望ましい臨床結果としては、１つ以上の症状（複数可）の軽減、欠損の程度の縮小、（例えば、神経変性障害の）安定化（すなわち、悪化しない）状態、神経変性障害の進行の遅延または減速、及び処置が行われない場合に予想されるものと比較した寿命の増加が挙げられるが、これらに限定されない。

「神経変性障害」は、神経幹細胞及び／または前駆細胞の変質のうちの少なくとも１つによって媒介されるか、または少なくとも部分的に特徴付けられる神経損失を含む疾患状態を指す。神経変性障害の非限定的な例としては、ポリグルタミン伸長障害（例えば、ＨＤ、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、ケネディ病（球脊髄性筋萎縮症とも称される）、及び脊髄小脳失調症（例えば、１型、２型、３型（マシャド・ジョセフ病とも称される）、６型、７型及び１７型））、その他のトリヌクレオチドリピート伸長障害（例えば、脆弱性Ｘ症候群、脆弱性ＸＥ精神遅滞、フリードライヒ運動失調症、筋強直性ジストロフィー、脊髄小脳失調症８型、及び脊髄小脳失調症１２型）、アレキサンダー病、アルパーズ病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病（スピルマイヤー・フォークト・シェーグレン・バッテン病とも称される）、カナバン病、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ギラン・バレー症候群、虚血性脳卒中、クラッベ病、クールー病、レビー小体型認知症、多発性硬化症、多系統萎縮症、非ハンチントン型舞踏病、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッヘル病、ピック病、原発性側索硬化症、進行性核上性麻痺、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、脊髄損傷、脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ）、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー病、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、ならびに脊髄癆が挙げられる。いくつかの状況において、神経変性障害は、身体的損傷（例えば、頭部外傷、軽度から重度の外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、びまん性軸索損傷、脳挫傷、急性脳腫脹など）に関連するＣＮＳまたはＰＮＳへの神経損傷またはダメージを包含する。

いくつかの実施形態では、神経変性障害は、神経細胞におけるＴＤＰ－４３のレベルの変異または低減に関連する障害である。いくつかの実施形態では、神経変性障害は、ＳＴＭＮ２タンパク質のレベルの変異もしくは低減、及び／またはＳＴＭＮ２タンパク質の誤局在化に関連する障害である。いくつかの実施形態では、神経変性障害は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、封入体筋炎（ＩＢＭ）及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの態様では、神経変性障害は、ＡＬＳである。いくつかの態様では、神経変性障害は、ＦＴＤ及び／またはＦＴＬＤと組み合わされたＡＬＳである。いくつかの態様では、神経変性障害は、アルツハイマー病である。いくつかの態様では、神経変性障害は、パーキンソン病である。

「プロテアソーム阻害剤誘導性ニューロパチー」は、本明細書では、機能的な核内ＴＤＰ－４３の量の低減の結果として生じる障害または状態を指すために使用される。核内ＴＤＰ－４３は、全体的なレベルで低下し得るか、またはレベルの低下は、核内ＴＤＰ－４３の排出を誘導するＴＤＰ－４３の細胞質凝集の増加の結果として生じ得る。いくつかの態様では、プロテアソーム阻害は、ＳＴＭＮ２の発現低下を招く。

「外傷性脳損傷」または「ＴＢＩ」は、外力により脳が損傷したときに生じる頭蓋内損傷を指す。ＴＢＩは、その重症度（例えば、軽度、中等度、もしくは重度）、機序（例えば、閉鎖性もしくは穿通性頭部損傷）、またはその他の特徴（例えば、位置）に基づいて分類され得る。ＴＢＩは、身体症状、認知症状、社会症状、情緒症状、及び行動症状をもたらす可能性がある。ＴＢＩに関連する状態には、脳震盪が含まれる。ＴＢＩ及びＴＢＩに関連する状態は、ＴＤＰ－４３病変に関連している。いくつかの態様では、ＳＴＭＮ２の変化は、ＴＢＩまたはそれに関連する状態において生じる。

いくつかの実施形態では、外傷性脳損傷は、神経細胞におけるＴＤＰ－４３のレベルの変異に関連する障害であるか、またはそれをもたらす。いくつかの実施形態では、外傷性脳損傷は、ＳＴＭＮ２タンパク質のレベルの変異もしくは低減、及び／またはＳＴＭＮ２タンパク質の誤局在化に関連する障害であるか、またはそれをもたらす。いくつかの実施形態では、外傷性脳損傷の重症度は、神経細胞における機能的ＴＤＰ－４３の低下に基づいて測定される。いくつかの実施形態では、脳震盪の重症度は、神経細胞における機能的ＴＤＰ－４３の低下に基づいて測定される。

対象への投与のために、本明細書に開示される薬剤は、薬学的に許容される組成物で提供することができる。これらの薬学的に許容される組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体（添加剤）及び／または希釈剤とともに製剤化された、治療有効量の薬剤のうちの１つ以上を含む。本発明の医薬組成物は、固体または液体形態で投与するために特別に製剤化することができ、以下に適合するものを含む：（１）経口投与、例えば、水薬（水性もしくは非水性の溶液もしくは懸濁液）、胃管栄養、ロゼンジ、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、錠剤（例えば、頬側、舌下、及び全身吸収を目的とするもの）、ボーラス、粉剤、顆粒剤、舌に適用するためのペースト；（２）非経口投与、例えば、滅菌溶液もしくは懸濁液、もしくは徐放性製剤としての、例えば、皮下注射、筋肉内注射、髄腔内注射、頭蓋骨間（ｉｎｔｅｒｃｒａｎｉａｌｌｙ）注射、静脈内注射もしくは硬膜外注射によるもの；（３）局所適用、例えば、皮膚に適用するクリーム、軟膏、もしくは制御放出パッチ、もしくはスプレーとして；（４）膣内もしくは直腸内、例えば、ペッサリー、クリームもしくは泡として；（５）舌下；（６）眼内；（７）経皮；（８）経粘膜；または（９）経鼻。更に、薬剤は患者に埋入することができ、または薬物送達システムを使用して注射することができる（例えば、Ｕｒｑｕｈａｒｔ，ｅｔａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２４：１９９－２３６（１９８４）、Ｌｅｗｉｓ，ｅｄ．“ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅｏｆＰｅｓｔｉｃｉｄｅｓａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ”（ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８１）、米国特許第３，７７３，９１９号；及び同第３５３，２７０，９６０号を参照されたく、これらの全ての内容は参照により本明細書に組み込まれる）。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題もしくは合併症を伴うことなく、ヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに適しており、妥当な利益／リスク比に見合った薬剤、物質、組成物、及び／または剤形を指す。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、１つの器官または身体の部分から、別の器官または身体の部分への対象薬剤の運搬または輸送に関与する、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造補助剤（例えば、滑沢剤、タルクマグネシウム、カルシウムもしくはステアリン酸亜鉛、もしくはステリック酸（ｓｔｅｒｉｃａｃｉｄ））、または溶媒カプセル化物質などの、薬学的に許容される物質、組成物、またはビヒクルを意味する。各々の担体は、製剤の他の成分と適合し、かつ対象に有害ではないという意味において「許容され」なければならない。薬学的に許容される担体として機能し得る物質のいくつかの例としては、（１）ラクトース、グルコース、及びスクロースなどの糖類、（２）トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン、（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、及び酢酸セルロースなどのセルロースならびにその誘導体、（４）粉末トラガカント、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、及びタルクなどの滑沢剤、（８）カカオバター及び坐剤用ワックスなどの賦形剤、（９）ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、及び大豆油などの油、（１０）プロピレングリコールなどのグリコール、（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリオール、（１２）オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル、（１３）寒天、（１４）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、（１５）アルギン酸、（１６）パイロジェンフリー水、（１７）等張食塩水、（１８）リンガー液、（１９）エチルアルコール、（２０）ｐＨ緩衝液、（２１）ポリエステル、ポリカーボネート、及び／またはポリ無水物、（２２）ポリペプチド及びアミノ酸などの増量剤、（２３）血清アルブミン、ＨＤＬ、及びＬＤＬなどの血清成分、（２２）エタノールなどのＣ_２～Ｃ_１２アルコール、ならびに（２３）医薬製剤に用いられる他の非毒性適合性物質が挙げられる。湿潤剤、着色剤、剥離剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、防腐剤、及び酸化防止剤も、製剤中に存在し得る。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」などの用語は、本明細書において互換的に使用される。

本明細書で使用される場合、「治療有効量」という語句は、任意の医学的処置に適用可能な妥当な利益／リスク比で、動物の細胞の少なくとも亜集団において何らかの所望の治療効果を生じさせるのに有効である、本明細書に記載の薬剤を含む薬剤、物質、または組成物の量を意味する。例えば、対象に投与される薬剤の量は、統計学的に有意な、測定可能なＴＤＰ－４３の機能の増加を生じさせるのに十分である。

本明細書に開示される薬剤及び組成物の治療有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。一般に、治療有効量は、対象の既往、年齢、状態、性別、及び他の薬学的に活性な薬剤の投与によって変化し得る。

本明細書で使用される場合、「投与する」という用語は、所望の効果が生じるように、所望の部位における薬剤または組成物の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による、対象（例えば、必要な対象）への薬剤または組成物の配置を指す。本発明の方法に適した投与経路には、局所及び全身の両方の投与経路が含まれる。一般に、局所投与は、対象の全身と比較して、投与された薬剤のより多くを特定の位置に送達させるのに対し、全身投与は、実質的に対象の全身へ薬剤を送達させる。

本明細書に開示される組成物及び薬剤は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、気道（エアロゾル）投与、経肺投与、経鼻投与、直腸投与、ならびに局所投与（頬側投与及び舌下投与を含む）を含む、経口または非経口経路を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で公知の任意の適切な経路によって投与され得る。例示的な投与様式には、注射、注入、点滴注入、吸入、または摂取が含まれるが、これらに限定されない。「注射」には、限定されるわけではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、頭蓋内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ）、及び胸骨内の注射及び注入が含まれる。本明細書に記載の態様の好ましい実施形態では、組成物は、静脈内注入または静脈内注射によって投与される。

本明細書で使用される場合、「対象」は、ヒトまたは動物（例えば、哺乳動物）を意味する。通常、動物は、霊長類、げっ歯類、家畜または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類には、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、及びマカク（例えば、アカゲザル）が含まれる。家畜及び狩猟動物には、雌ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、スイギュウ、ネコ種、例えば飼いネコ、イヌ種、例えばイヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、例えばニワトリ、エミュー、ダチョウ、及び魚、例えばマス、ナマズ及びサケが含まれる。患者または対象には、前述の任意のサブセット、例えば、ヒト、霊長類またはげっ歯類などの１つ以上の群または種を除く上記の全てが含まれる。本明細書に記載の態様の特定の実施形態では、対象は哺乳動物、例えば、霊長類（例えば、ヒト）である。「患者」及び「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用される。対象は、雄または雌であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、（例えば、神経細胞における）ＴＤＰ－４３のレベルの変異または低減に関連する疾患または状態に罹患している。

スクリーニング方法
本開示は、ＴＤＰ病変に関連する疾患もしくは状態を処置するか、またはその疾患もしくは状態の可能性を低減させるための候補薬剤を同定するための、１つ以上の試験薬剤（例えば、１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド）をスクリーニングする方法を企図する。いくつかの態様では、疾患または状態は、（例えば、神経細胞における）ＴＤＰ－４３のレベルの変異または低減に関連する。本開示は更に、ＳＴＭＮ２タンパク質のレベルの変異または低減のいずれかに関連する疾患もしくは状態を処置するか、またはその疾患もしくは状態の可能性を低減させるための候補薬剤を同定するための、１つ以上の試験薬剤をスクリーニングする方法を企図する。

いくつかの実施形態では、本方法は、ＴＤＰ－４３レベルが低減した神経細胞を提供することと；この細胞を１つ以上の試験薬剤と接触させることと；接触させた細胞がＳＴＭＮ２タンパク質のレベルの増加を有するか否かを判定することと；接触させた細胞がＳＴＭＮ２タンパク質のレベルの増加を有する場合に、この試験薬剤を候補薬剤として同定することと、を含む。いくつかの態様では、接触させた細胞がＳＴＭＮ２タンパク質のレベルの増加を有するか否かを判定するステップは、接触させた細胞中のＳＴＭＮ２タンパク質レベルを測定することを含む。いくつかの態様では、ＳＴＭＮ２タンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡ（例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、ドットブロット、及び／またはウエスタンブロットを使用して測定される。いくつかの態様では、接触させた細胞がＳＴＭＮ２タンパク質のレベルの増加を有するか否かを判定するステップは、接触させた細胞の形態または機能を評価することを含む。例えば、ＳＴＭＮ２を欠くニューロンは、ＳＴＭＮ２を有するニューロンの形態から変化した形態を有し得る。いくつかの態様では、接触させた細胞の形態または機能を、免疫ブロッティング及び／または免疫細胞化学を使用して評価する。いくつかの態様では、接触させた細胞を更に評価して、それが完全長ＳＴＭＮ２ＲＮＡを発現するか否かを判定することができる。ＳＴＭＮ２ＲＮＡの発現は、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して測定することができる。

いくつかの実施形態では、本方法は、ＴＤＰ－４３レベルが変異した神経細胞を提供することと；この細胞を１つ以上の試験薬剤と接触させることと；接触させた細胞がＳＴＭＮ２タンパク質のレベルの増加を有するか否かを判定することと；接触させた細胞がＳＴＭＮ２タンパク質のレベルの増加を有する場合に、この試験薬剤を候補薬剤として同定することと、を含む。いくつかの態様では、接触させた細胞がＳＴＭＮ２タンパク質のレベルの増加を有するか否かを判定するステップは、接触させた細胞中のＳＴＭＮ２タンパク質レベルを測定することを含む。いくつかの態様では、ＳＴＭＮ２タンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡ、ドットブロット、及び／またはウエスタンブロットを使用して測定される。いくつかの態様では、接触させた細胞がＳＴＭＮ２タンパク質のレベルの増加を有するか否かを判定するステップは、接触させた細胞の形態または機能を評価することを含む。例えば、ＳＴＭＮ２を欠くか、またはＳＴＭＮ２の量が低減しているニューロンは、正常レベルのＳＴＭＮ２（すなわち、対照試料からのＳＴＭＮ２のレベル）を有するニューロンの形態から変化した形態を有し得る。いくつかの態様では、接触させた細胞の形態または機能を、免疫ブロッティング及び／または免疫細胞化学を使用して評価する。いくつかの態様では、接触させた細胞を更に評価して、それが完全長ＳＴＭＮ２ＲＮＡを発現するか否かを判定することができる。ＳＴＭＮ２ＲＮＡの発現は、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して測定することができる。

いくつかの実施形態では、本方法は、ＴＤＰ－４３レベルが低減した神経細胞を提供することと；この細胞を１つ以上の試験薬剤と接触させることと；接触させた細胞がＳＴＭＮ２ＲＮＡ中に潜在性エクソンを有するか否かを判定することと、を含む。接触させた細胞をＦＩＳＨＲＮＡ、またはＲＴ－ＰＣＴ、ｑＰＣＲ、ｑＲＴ－ＰＣＲ、またはＲＮＡシーケンシングを使用して評価し、ＳＴＭＮ２ＲＮＡ中に潜在性エクソンが存在するか否かを同定することができる。いくつかの実施形態では、本方法は、ＴＤＰ－４３レベルが低減した神経細胞を提供することと；この細胞を１つ以上の試験薬剤と接触させることと；接触させた細胞が完全長ＳＴＭＮ２ＲＮＡを発現するか否かを判定することと、を含む。接触させた細胞を、ＲＮＡＦＩＳＨまたはＲＴ－ＰＣＴ、ｑＰＣＲ、ｑＲＴ－ＰＣＲ、またはＲＮＡシーケンシングを使用して評価することができる。

いくつかの実施形態では、本方法は、ＴＤＰ－４３レベルが変異した神経細胞を提供することと；この細胞を１つ以上の試験薬剤と接触させることと；接触させた細胞がＳＴＭＮ２ＲＮＡ中に潜在性エクソンを有するか否かを判定することと、を含む。接触させた細胞をＦＩＳＨＲＮＡ、またはＲＴ－ＰＣＴ、ｑＰＣＲ、またはＲＮＡシーケンシングを使用して評価し、ＳＴＭＮ２ＲＮＡ中に潜在性エクソンが存在するか否かを同定することができる。いくつかの実施形態では、本方法は、ＴＤＰ－４３レベルが変異した神経細胞を提供することと；この細胞を１つ以上の試験薬剤と接触させることと；接触させた細胞が完全長ＳＴＭＮ２ＲＮＡを発現するか否かを判定することと、を含む。接触させた細胞を、ＲＮＡＦＩＳＨまたはＲＴ－ＰＣＴ、ｑＰＣＲ、ｑＲＴ－ＰＣＲ、またはＲＮＡシーケンシングを使用して評価することができる。

バイオマーカー
いくつかの態様では、本開示は、ＴＤＰ－４３の機能性の減退に関連する疾患または状態（例えば、実質的なＴＤＰ－４３関連病変を有する疾患または状態）のためにＳＴＭＮ２及び／またはＥＬＡＶＬ３をバイオマーカーとして使用することを企図する。いくつかの態様では、ＳＴＭＮ２及び／またはＥＬＡＶＬ３は、疾患または状態の存在に関するバイオマーカーとして機能し得る。他の態様では、ＳＴＭＮ２及び／またはＥＬＡＶＬ３は、疾患または状態の進行をモニタリングするためのバイオマーカーとして機能し得る。いくつかの態様では、ＳＴＭＮ２及び／またはＥＬＡＶＬ３タンパク質レベルが評価される。いくつかの態様では、ＳＴＭＮ２及び／またはＥＬＡＶＬ３転写物レベルが評価される。

いくつかの実施形態では、疾患または状態は、神経細胞におけるＴＤＰ－４３のレベルの変異または低減に関連する。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、神経細胞におけるＴＤＰ－４３のレベルの変異または増加に関連する。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、神経変性疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、または前頭側頭型認知症（ＦＴＤ））である。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、外傷性脳損傷に関連するか、またはその結果として生じる。

いくつかの態様では、ＴＤＰ－４３の機能性の減退に関連する疾患または状態を検出するための方法は、対象から試料を得ることと、試料を評価して、それがＳＴＭＮ２及び／またはＥＬＡＶＬ３タンパク質のレベルの変異または低減のいずれかを示すか否かを判定することと、を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＭＮ２及び／またはＥＬＡＶＬ３タンパク質レベルは、免疫ブロット、免疫細胞化学、ドットブロット、及び／またはＥＬＩＳＡを含む、当業者に公知の任意の方法を使用して測定される。特定の態様では、ＳＴＭＮ２及び／またはＥＬＡＶＬ３タンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡを使用して測定される。いくつかの態様では、ＴＤＰ－４３の機能性の減退に関連する疾患または状態を検出するための方法は、対象から試料を得ることと、試料を評価して、それがＳＴＭＮ２及び／またはＥＬＡＶＬ３転写物のレベルの低減を示すか否かを判定することと、を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＭＮ２及び／またはＥＬＡＶＬ３転写物レベルは、ＲＮＡＦＩＳＨ、ＲＴ－ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、またはＲＮＡシーケンシングを含む、当業者に公知の任意の方法を使用して測定される。特定の態様では、ＳＴＭＮ２及び／またはＥＬＡＶＬ３転写物レベルは、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して測定される。ＳＴＭＮ２及び／またはＥＬＡＶＬ３タンパク質及び／または転写物のレベルの低減は、疾患または障害の結果としてのＴＤＰ－４３の機能性の減退に関する指標であり得る。いくつかの態様では、ＴＤＰ－４３の機能性の減退に関連する疾患または状態の進行は、（例えば、処置プロトコルに応じて）長時間にわたって対象からの複数の試料を分析し、ＳＴＭＮ２及び／またはＥＬＡＶＬ３タンパク質及び／または転写物のレベルをモニタリングすることにより評価される。

いくつかの態様では、対象における神経変性疾患（例えば、ＡＬＳ、ＦＴＤ、パーキンソン病、アルツハイマー病）を検出するための方法は、罹患対象から試料（例えば、生体液試料）を得ることと、試料がレベルの変化したＳＴＭＮ２及び／またはＥＬＡＶＬ３タンパク質を含有するか否かを判定することと、を含む。特定の態様では、判定は、ＥＬＩＳＡを使用して行われる。いくつかの態様では、対象における神経変性疾患（例えば、ＡＬＳ、ＦＴＤ、パーキンソン病、アルツハイマー病）を検出するための方法は、罹患対象から試料（例えば、生体液試料）を得ることと、試料がレベルの低減したＳＴＭＮ２及び／またはＥＬＡＶＬ３転写物を含有するか否かを判定することと、を含む。試料のスクリーニングは、ＲＮＡＦＩＳＨ、ＲＴ－ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、またはＲＮＡシーケンシングを使用して実施され得る。特定の態様では、ＳＴＭＮ２及び／またはＥＬＡＶＬ３転写物レベルは、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して測定される。ＳＴＭＮ２及び／またはＥＬＡＶＬ３タンパク質及び／または転写物のレベルの低減は、神経変性疾患または障害の結果としてのＴＤＰ－４３の機能性の減退に関する指標であり得る。

いくつかの態様では、対象における外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を検出するための方法は、対象から試料（例えば、生体液試料）を得ることと、試料がレベルの変化したＳＴＭＮ２及び／またはＥＬＡＶＬ３タンパク質を含有するか否かを判定することと、を含む。特定の態様では、判定は、ＥＬＩＳＡを使用して行われる。いくつかの態様では、対象における外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を検出するための方法は、対象から試料（例えば、生体液試料）を得ることと、ＳＴＭＮ２及び／またはＥＬＡＶＬ３転写物のレベルの低減に関して試料をスクリーニングすることと、を含む。試料のスクリーニングは、ＲＮＡＦＩＳＨ、ＲＴ－ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、またはＲＮＡシーケンシングを使用して実施され得る。特定の態様では、ＳＴＭＮ２及び／またはＥＬＡＶＬ３転写物レベルは、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して測定される。ＳＴＭＮ２及び／またはＥＬＡＶＬ３タンパク質及び／または転写物のレベルの低減は、ＴＢＩの結果としてのＴＤＰ－４３の機能性の減退に関する指標であり得る。

いくつかの態様では、本開示は、ＴＤＰ－４３の機能性の減退に関連する疾患または状態（例えば、実質的なＴＤＰ－４３関連病変を有する疾患または状態）のためにＳＴＭＮ２の潜在性バリアントをバイオマーカーとして使用することを企図する。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、神経変性疾患（例えば、ＡＬＳ、ＦＴＤ、アルツハイマー病、パーキンソン病）である。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、外傷性脳損傷に関連するか、またはその結果である。

いくつかの態様では、ＴＤＰ－４３の機能性の減退に関連する疾患または状態を検出するための方法は、対象から試料を得ることと、試料を評価して、それがＳＴＭＮ２の潜在性バリアントを含むか否かを判定することと、を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＭＮ２転写物は、ＲＮＡＦＩＳＨ、ＲＴ－ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、またはＲＮＡシーケンシングを使用して評価される。特定の態様では、ＳＴＭＮ２転写物は、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して測定される。ＳＴＭＮ２の潜在性バリアントの存在は、ＴＤＰ－４３の機能性の減退に関する指標であり得る。

いくつかの態様では、神経変性疾患を検出するための方法は、対象から試料（例えば、生体液試料）を得ることと、ＳＴＭＮ２の潜在性バリアントに関して試料をスクリーニングすることと、を含む。試料のスクリーニングは、ＰＣＲを使用して実施され得る。ＳＴＭＮ２の潜在性バリアントの存在は、神経変性疾患または障害の結果としてのＴＤＰ－４３の機能性の減退に関する指標であり得る。

いくつかの態様では、ＴＢＩを検出するための方法は、対象から試料（例えば、生体液試料）を得ることと、ＳＴＭＮ２の潜在性バリアントに関して試料をスクリーニングすることと、を含む。試料のスクリーニングは、ＰＣＲを使用して実施され得る。ＳＴＭＮ２の潜在性バリアントの存在は、外傷性脳損傷の結果としてのＴＤＰ－４３の機能性の減退に関する指標であり得る。

実施例１：
画期的な知見において、ＴＤＰ－４３（ＴＡＲＤＮＡ結合タンパク質４３）は、ＡＬＳの多数の散発性症例及びＦＴＤの多くのサブセットにおけるユビキチン陽性封入体の主要構成成分であることが見出された（７）。ＴＤＰ－４３は、主に核内ＤＮＡ／ＲＮＡ結合タンパク質（８）であり、転写調節（９）、スプライシング（１０、１１）、プレｍｉＲＮＡプロセシング（１２）、ストレス顆粒形成（１３、１４）、ならびにｍＲＮＡの輸送及び安定性（１５、１６）において機能的役割を有する。その後、常染色体優性であり明らかに原因となるＴＡＲＤＢＰの変異がＡＬＳ家系及びＦＴＤ家系の両方において同定され、遺伝学と神経変性に関する病理学とが結び付けられた（１７～２１）。したがって、散発性ＡＬＳと家族性ＡＬＳの両方を理解するためには、ＴＤＰ－４３の誤局在化及び変異が疾患において担う役割を解明することが不可欠である。

ＴＤＰ－４３病変に関連する神経変性が、機能喪失機序、毒性獲得機序、または両者の組み合わせのいずれの結果であるかは未だ不明である（２２）。初期の研究では、野生型ＴＤＰ－４３と変異型ＴＤＰ－４３の両方の過剰発現が、その凝集及び核局在化の喪失につながることが示された（２２）。これらの研究は、ＴＡＲＤＢＰ変異の常染色体優性遺伝パターンとともに、毒性獲得の見解を支持するように思われるが、核内ＴＤＰ－４３の喪失（一般的にその凝集に関連する）により、その正常な機能もまた損なわれている可能性があることが示唆される。その後の知見から、発生中の胚または有糸分裂後の運動ニューロンにおけるＴＤＰ－４３の枯渇が、重大な結果をもたらし得ることが明らかとなった（２３～２７）。

ＴＤＰ－４３がニューロンのＲＮＡ代謝において果たしている無数の役割を考慮すると、ＴＤＰ－４３の誤局在化の際に誤調節されるＲＮＡ基質は何か、そしてそれらはいかにして運動ニューロパチーの一因となっているのか、という重要な疑問が生じた。この疑問に答えるための初期の取り組みは、ＴＡＲＤＢＰノックダウンを受けた患者またはマウスのいずれかからの全脳ホモジネートのＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）による架橋及び免疫沈降を利用した（１１、２８）。これらの結果として得られた発見により、多くの転写物がＵＧリピートと長いイントロンとを含む長いＲＮＡを優先してＴＤＰ－４３によって調節されるという一般的な理解につながった。しかしながら、これらの実験でシーケンシングされた脳ホモジネートにおいてグリアＲＮＡが顕著であることにより、ＴＤＰ－４３の特異的なニューロン標的への洞察が制限された。結果として、ＴＤＰ－４３標的ＲＮＡと運動ニューロン変性の機序との間の明確な関係をほとんど構築することができなかった。

誤調節された場合にニューロン変性の一因となる基質を同定するために、精製ヒト運動ニューロン中でＴＤＰ－４３によって調節されるＲＮＡの同定に努めた。生存ＡＬＳ患者の脆弱な運動ニューロンは、単離及び実験的摂動用に本質的に入手が困難であることから、ヒト多能性幹細胞を運動ニューロン（ｈＭＮ）に誘導して、ｉｎｖｉｔｒｏでＡＬＳ及び他の神経変性状態を試験するための指向性分化アプローチが開発されている（２９～３１）。ここでは、ＴＤＰ－４３ノックダウン後にｈＭＮのＲＮＡ－ｓｅｑを実施し、ＴＤＰ－４３の欠損によってその存在量が正または負に調節される転写物を同定した。合計で、正常なＲＮＡレベルを維持するためにＴＤＰ－４３を必要とする８８５個の転写物を同定した。任意数のこれらの標的の誤調節が運動ニューロンの変性にわずかな役割を担っている可能性があるが、ＳＴＭＮ２をコードする運動ニューロン中で最も豊富な転写物のうちの１つは、ＴＡＲＤＢＰの減退に対して特に感受性が高かったが、ＦＵＳまたはＣ９ＯＲＦ７２活性に対しては感受性が高くなかったことが認められた。更に、変異型ＴＤＰ－４３を発現するｈＭＮ及びプロテアソームが薬理学的に阻害されたｈＭＮにおいても、ＳＴＭＮ２レベルが低下することが判明し、これにより、げっ歯類ニューロンにおいてＴＤＰ－４３の細胞質蓄積及び凝集が誘導されることが示された（３２）。更に、微小管安定性の既知の調節因子であるＳＴＭＮ２が、正常ヒト運動ニューロンの成長及び修復に必要なタンパク質をコードすることが示された。重要なことに、ＴＤＰ－４３活性の喪失の結果としてのＳＴＭＮ２機能の喪失は、その発現もまた、ＡＬＳ患者の運動ニューロンにおいて再現性よく低下していることが判明したことから、ＡＬＳを有する人々と機能的に関連している可能性がある。

結果
ヒト運動ニューロン（ｈＭＮ）の分化及び精製
ｈＭＮを産生させるために、ヒト胚性幹細胞株ＨＵＥＳ３Ｈｂ９：：ＧＦＰ（３３、３４）を、改変１４日方策を使用して接着培養条件（３５、３６）下でＧＦＰ＋ｈＭＮに分化させた（図７Ａ）。このアプローチは、ＳＭＡＤシグナル伝達の小分子阻害を介した神経誘導、ＦＧＦ及びＮＯＴＣＨシグナル伝達阻害を介した神経分化の加速、ならびにレチノイン酸（ＲＡ）及びソニックヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化を介したＭＮパターニングに依拠する（図７Ａ）。分化１４日目に、約１８～２０％のＧＦＰ＋細胞を含む培養物を通常通り得た（図７Ｂ）。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）の２日後に、得られた細胞の９５％超が転写因子ＨＢ９を発現した（図７Ｃ～７Ｄ）。更に８日後、培養物は、転写因子Ｉｓｌｅｔ－１（８０％）、ならびに汎ニューロン細胞骨格タンパク質β－ＩＩＩチューブリン（９７％）及び微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２）（９０％）を発現するニューロンで構成されていた（図７Ｅ～７Ｆ）。ＦＡＣＳ及び神経栄養因子を補充したグリア馴化培地での１０日間の培養後の全細胞パッチクランプ記録により、これらの精製ｈＭＮが電気生理学的に活性であることが明らかとなった（図７Ｇ～７Ｉ）。脱分極の際に、ｈＭＮは、初期の速い内向き電流、続いて遅い外向き電流を示し、これは、機能的な電圧活性化ナトリウム及びカリウムチャネルの発現とそれぞれ一致した（図７Ｇ）。更に、ｈＭＮは反復活動電位を発火し（図７Ｈ）、興奮性神経伝達物質であるカイニン酸に応答した（図７Ｉ）。総合すると、これらのデータにより、これらの精製ｈＭＮ培養物が期待される機能特性を有していることが実証された。

ＴＤＰ－４３のレベルが低減したｈＭＮのＲＮＡ－Ｓｅｑ
ＡＬＳで観察される核内ＴＤＰ－４３の低減は、下流の神経変性事象に寄与し得る考えられる細胞機構として明らかになりつつある（７、３７）。したがって、ノックダウンとＲＮＡ－Ｓｅｑアプローチとの組み合わせにより、精製ｈＭＮ集団においてＴＤＰ－４３によって調節される特異的ＲＮＡを同定することが望まれた。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５にコンジュゲートした短鎖干渉ＲＮＡを使用して、まず、ｈＭＮへの高レベルの（約９４．６％）ｓｉＲＮＡ送達を達成するためのトランスフェクション条件を検証した（図８Ａ～８Ｃ）。次いで、ＴＤＰ－４３転写物を標的とする２つの別個のｓｉＲＮＡ（ｓｉＴＤＰ４３）、いかなる特定の遺伝子も標的としないスクランブル配列を有する２つの対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＳＣＲ及びｓｉＳＣＲ＿５５５）を使用して、ｓｉＲＮＡ送達後の異なる３つの時点（２日目、４日目及び６日目）において、精製ｈＭＮ中でＴＤＰ－４３ＲＮＡｉを行った（図８Ａ）。ｓｉＲＮＡトランスフェクション後、全ＲＮＡ及びタンパク質をニューロンから単離した。ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイにより、ｓｉＴＤＰ４３で処置したＭＮについて全ての時点でＴＤＰ－４３ｍＲＮＡレベルのダウンレギュレーションが確認されたが、スクランブル対照で処置したものでは確認されず、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの４日後に最大ノックダウンが生じた（図８Ｄ）。更に、ＴＤＰ－４３の枯渇はまた、免疫ブロットアッセイによってタンパク質レベルで確認され、ｓｉＴＤＰ４３処置ＭＮは、ＴＤＰ－４３レベルの５４～６５％の低減を示した（図８Ｅ）。

ｈＭＮにおけるＴＤＰ－４３の部分的喪失に応答した遺伝子発現の全体的な変化を捕捉するために、ＲＮＡ－ＳｅｑライブラリーをｓｉＲＮＡ処置細胞から調製した（図１Ａ）。次世代シーケンシングの後、１００万あたりの転写物数（ＴＰＭ）としてアノテーションした各遺伝子の発現データを得た。最初の教師なし階層クラスタリングにより、ＭＮ産生のバッチに基づく転写効果が明らかとなった（実験１対実験２）（図９Ａ）。続くＲＮＡ－Ｓｅｑ試料の主成分分析では、５００個の最も差次的に発現した遺伝子に焦点を当て、次いで、ｓｉＴＤＰ－４３処置（ｐｃ１）に基づいて試料を分離したところ、ＴＤＰ－４３レベルの低減が確実な転写差をもたらし、ＭＮ産生のバッチ（ｐｃ２）がそれに続いたことが示された（図１Ｂ）。ＴＤＰ－４３転写物に関するＴＰＭ値の検査により、その存在量がｓｉＴＤＰ４３で処置したＭＮにおいてのみ有意に低減したことを確認した（図９Ｂ）。次いで、ＤＥＳｅｑ２バイオインフォマティクスツール一式（３８）を使用して差次的遺伝子発現解析を実施し、５％の偽発見率（ＦＤＲ）で、ＴＤＰ－４３ノックダウン後のｈＭＮにおいて合計８８５個の統計学的に差次的に発現する遺伝子を同定した（図１Ｃ～１Ｄ）。これらの細胞において、ＴＰＭ値は、スクランブル配列ｓｉＲＮＡ対照で処置したＭＮにおけるＴＰＭ値と比較して、３９２個の遺伝子で有意に高く（「アップレギュレートされた」）、４９３個の遺伝子で有意に低かった（「ダウンレギュレートされた」）（図１Ｃ～１Ｄ）。

哺乳動物のＣＮＳにおける数百の遺伝子の全転写レベルを変化させる（１１）ことに加えて、ＴＤＰ－４３のレベルの低減は、遺伝子スプライシングにも影響を及ぼし得る（１１、３９～４２）。スプライシングバリアントの包括的解析には、従来、スプライシング感受性エクソンアレイを必要とする（１１、３９）が、ＲＮＡ－Ｓｅｑリードのアイソフォームデコンヴォルーションのための計算的アプローチの開発が急速に進化している（４３～４５）。バイオインフォマティクスアルゴリズム「Ｃｕｆｆｄｉｆｆ２」を用いたデータの限定的な試験（４５）は、実際に、２つの重要なアイソフォームスイッチング事象を伴う差次的スプライシングのための筆頭候補としてＰＯＬＤＩＰ３遺伝子を検出することができ（図９Ｃ）、これは、これまでｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏの両方でＴＤＰ－４３の機能の欠損に関連付けられていた（４２、４６）。

ＴＤＰ－４３ノックダウン後に有意に誤調節されたと同定した８８５個の遺伝子のうち、候補サブセットを更なる検証のために選択した。まず、ニューロン発現が豊富な遺伝子（ＳＴＭＮ２（４７、４８）、ＥＬＡＶＬ３（４９））、ならびに神経発生及び神経障害と関連のある遺伝子（ＲＣＡＮ１（５０）、ＮＡＴ８Ｌ（５１））を考慮した。更に、「陽性対照」として適正な発現レベル（ＴＰＭ≧５）及び高い倍率変化を有する遺伝子（ＳＥＬＰＬＧ、ＮＡＴ８Ｌ）を、これらの候補がより強力であり、かつ検証の見込みがあると仮定されていたため、考慮した。次に、ＴＤＰ－４３ノックダウン後の独立した生物学的反復試験からＲＮＡを得て、ＴＡＲＤＢＰを含む１１個の候補遺伝子の相対発現レベルをｑＲＴ－ＰＣＲによって判定した。注目すべきことに、これらの１１個の遺伝子のうち９個の差次的遺伝子発現が、スクランブル対照で処置したものと比較して、いずれかのｓｉＴＤＰ－４３で処置した細胞において確認された（図１Ｅ～１Ｆ）。これらの結果は、選択された遺伝子間の再現可能な発現差を示しており、ＲＮＡ－Ｓｅｑ解析からの知見を確証する。

ＳＴＭＮ２レベルは、変異型ＴＤＰ－４３を発現するｈＭＮにおいてダウンレギュレートされる
次に、ＴＤＰ－４３枯渇後に存在量が変化したＲＮＡのいずれかが、ＡＬＳの原因となるＴＤＰ－４３の変異型の発現によっても摂動されるか否かが問われた。この目的のために、ＴＡＲＤＢＰに病原性変異を保有する患者ｉＰＳ細胞由来の運動ニューロンにおいて、ＴＤＰ－４３ノックダウン後に再現性のよい発現の変化を示した推定ＴＤＰ－４３標的ＲＮＡを調査した（図１０）。多能性幹細胞を用いたこれまでの経験に基づいて、指向性分化アプローチは、不均質な培養物を生じる傾向があり、定量的な比較解析を困難にすることが知られていた（５２）。更に、有糸分裂前駆細胞の存在は、それらが培養物を圧倒し結果を歪める可能性があるため、特に問題となる。これらの障害を克服するために、細胞表面マーカーに対する２４２個の抗体を用いて、分化ＨＵＥＳ３Ｈｂ９：：ＧＦＰ細胞株に対して偏りのないＦＡＣＳベースの免疫プロファイリング解析を実施し（５３）、ＧＦＰ＋及びＧＦＰ細胞で濃縮されたシグネチャを同定した（図１１Ａ）。ＮＣＡＭ＋／ＥｐＣＡＭ－細胞を選別することにより、培養物から増殖中のＥｄｕ^＋細胞を除去し、多数の人工多能性幹細胞の分化にわたってＭＡＰ２＋／Ｉｓｌｅｔ－１＋ニューロンの数を正規化することができることが判明した（図１１Ｂ～１１Ｄ）。この細胞表面シグネチャを使用して、５つの対照ｉＰＳＣ株（１１ａ、１５ｂ、１７ａ、１８ａ、及び２０ｂ）ならびに異なるＴＤＰ－４３変異を有する４つのｉＰＳＣ株（３６ａ（Ｑ３４３Ｒ）、４７ｄ（Ｇ２９８Ｓ）、ＣＳ（Ｍ３３７Ｖ）、及びＲＢ２０（Ａ３２５Ｔ））を分化させ、得られたＭＮをＦＡＣＳ精製した。予想通り、各ｉＰＳ細胞株は、ＮＣＡＭ^＋ＭＮに分化する独自の性向を示した（図１１Ｅ～１１Ｆ）。しかしながら、選別後、全てのｉＰＳＣ株について均質なニューロン培養物が得られた（図２Ｂ）。

更に１０日間のニューロン培養後、これらのＦＡＣＳ精製ＭＮからの全ＲＮＡを採取し、ｑＲＴ－ＰＣＲを実施して、最も再現性よくＴＤＰ－４３枯渇の影響を受けた遺伝子産物（ＡＬＯＸ５ＡＰ、ＳＴＭＮ２、ＥＬＡＶＬ３、及びＲＣＡＮ１）のレベルを調査した。遺伝子のうちの２つ（ＳＴＭＮ２及びＥＬＡＶＬ３）について、転写物レベルの有意な低下が観察された（図２Ｃ～２Ｆ）。ＴＤＰ－４３枯渇実験と一致して、密接に関連するＳＴＭＮ１ＲＮＡの存在量に対する有意な変化は観察されず、ＴＤＰ－４３とＳＴＭＮ２との間の特異的な関係が示唆された（図２Ｈ、図１２Ｅ）。更に、変異ニューロンと対照ニューロンとの間のＴＤＰ－４３転写物レベルの有意差は観察されなかった（図２Ｇ）。総合すると、これらのデータは、ＴＤＰ－４３における病原性点変異の存在は、それ自体のレベルに影響を及ぼすことなくＳＴＭＮ２及びＥＬＡＶＬ３のｍＲＮＡレベルを変化させることができることを意味する。

続いて、標的転写物を調節するＴＤＰ－４３の能力をＡＬＳ関連変異がいかにして妨げることができるのかを調査した。先行研究は、変異型ＴＤＰ－４３を発現するｉＰＳＣ株に由来するｈＭＮが、ＴＤＰ－４３病変のいくつかの側面（可溶性及び不溶性の両方の細胞タンパク質抽出物へのその蓄積（５４、５５）ならびに細胞質誤局在化（５６）を含む）を再現することを報告している。変異ニューロンにおける核内ＴＤＰ－４３の低下は、ｓｉＲＮＡによって誘導される部分的喪失に類似し得ることから、ＴＤＰ－４３誤局在化の徴候を免疫蛍光法を使用して試験した。しかし、対照ニューロン及び変異ニューロンの両方において、主にＴＤＰ－４３の核染色が観察された（図２Ｉ）。ピアソンの相関係数分析によりこれらの観察結果が裏付けられ、変異ニューロン及び対照ニューロンの両方について、ＴＤＰ－４３免疫染色とＤＮＡ対比染色との間の強い相関が明らかとなった（図２Ｊ）。これらの結果は、一部のＴＤＰ－４３ｉＰＳ疾患モデリング研究（５６）と一致しているが、他の研究（５４）とは一致しておらず、ＴＤＰ－４３誤局在化を誘導するためには更なる細胞摂動が必要であり得る可能性が生じた（５７）。まとめると、データは、ＴＤＰ－４３枯渇後に影響を受けた遺伝子のサブセットが、変異型ＴＤＰ－４３を発現するニューロンにおいても変化しており、これらの変化がＴＤＰ－４３の特徴的な細胞質凝集に先行することを示唆している。したがって、少なくともこれらの限られた数の転写物の視点から、データは、ＴＤＰ－４３の変異が機能喪失型の転写表現型に部分的に寄与し得ることを示唆している。

ＳＴＭＮ２レベルはｈＭＮにおいてＴＤＰ－４３により調節される
変異型ＴＤＰ－４３を発現するニューロン及びＴＤＰ－４３枯渇後の両方においてスタスミン様２（ＳＴＭＮ２）の転写物の低下が見られたのは、興味深いことであった。ＳＴＭＮ２は、ニューロン細胞骨格の調節及び軸索再生経路において機能的役割を有する微小管結合タンパク質のスタスミンファミリーに属する４つのタンパク質（ＳＴＭＮ１、ＳＴＭＮ２、ＳＣＬＩＰ／ＳＴＭＮ３，及びＲＢ３／ＳＴＭＮ４）のうちの１つである（４７，４８，５８～６２）。ヒトにおいては、ＳＴＭＮ１及びＳＴＭＮ３遺伝子は遍在的発現を示すが、ＳＴＭＮ２及びＳＴＭＮ４はＣＮＳ組織に濃縮されている（６３）。ＡＬＳにおける細胞骨格経路の関連性（６４～６６）及びＣＮＳ内でのその濃縮に関するエビデンスの増加を考慮して、ＳＴＭＮ２とＴＤＰ－４３との関係を更に特徴付けることに焦点を当てることとした。

まず、ＳＴＭＮ２転写物の著しいダウンレギュレーションが、ＳＴＭＮ２タンパク質のレベルも低減させるか否かを試験した。独立したＲＮＡｉ実験において、ＳＴＭＮ２ｍＲＮＡに結合する２つの異なるプライマー対のセットを用いてｑＲＴ－ＰＣＲを実施したところ、ｓｉＴＤＰ４３処置ｈＭＮにおいて、対照と比較して有意なダウンレギュレーション（約５０～６０％）が認められた（図３Ａ）。次いで、免疫ブロットアッセイをｈＭＮタンパク質溶解物で行ったところ、ＳＴＭＮ２タンパク質レベルもまた、ｓｉＴＤＰ－４３で処置したｈＭＮにおいて低減することが認められた（図３Ｂ）。

次に、他の２つのＡＬＳ関連遺伝子であるＦＵＳまたはＣ９ＯＲＦ７２（５、６７）のダウンレギュレーションもまた、ｈＭＮ中のＳＴＭＮ２レベルを変化させるか否かを考察した。ＴＤＰ－４３と構造的に類似したＦＵＳタンパク質もＲＮＡ代謝に関与しており（６８）、ＦＵＳバリアントは家族性ＡＬＳ及びＦＴＤの症例で検出されている（６９）。Ｃ９ＯＲＦ７２の機能は活発な研究領域であるが、Ｃ９ＯＲＦ７２のイントロン領域における大きなリピート伸長が、相当数の家族性及び散発性ＡＬＳ及びＦＴＤ症例の原因となっている（７０～７２）。ＴＤＰ－４３、ＦＵＳ、またはＣ９ＯＲＦ７２を標的とするＲＮＡｉの誘導後、ｑＲＴ－ＰＣＲによるそれぞれのｓｉＲＮＡ標的遺伝子の有意なダウンレギュレーションが認められた。（図１２Ａ～１２Ｃ）。ＴＤＰ－４３のダウンレギュレーションは、ＦＵＳまたはＣ９ＯＲＦ７２の発現レベルを変化させず、ＦＵＳまたはＣ９ＯＲＦ７２のいずれかの発現の低減は、他のＡＬＳ関連遺伝子に対する影響を示さなかった（図１２Ａ～１２Ｃ）。ＴＤＰ－４３のノックダウンは更にＳＴＭＮ２のレベルを低減させたが、ＦＵＳまたはＣ９ＯＲＦ７２の場合は低減させなかった（図３Ｃ）。重要なことに、これらの結果は、ＳＴＭＮ２のダウンレギュレーションがＲＮＡｉ誘導の結果ではなく、ＴＤＰ－４３の部分的喪失に応答する特異的分子機構であることを実証する。

ＴＤＰ－４３は、高度に保存されたＲＮＡ認識モチーフ（７３）を介してＲＮＡ分子に結合しそれらを調節することができる。ＴＤＰ－４３が多くの標準的なＴＤＰ－４３結合モチーフを有するＳＴＭＮ２ＲＮＡと直接会合するか否かを判定するために（図１２Ｆ～１２Ｇ）、ＴＤＰ－４３免疫沈降のための条件を策定し（図３Ｄ）、続いてホルムアルデヒドＲＮＡ免疫沈降（ｆＲＩＰ）を実施した。架橋を逆転させた後、定量的ｑＲＴ－ＰＣＲを実施して結合したＲＮＡ分子を検出した。ＴＤＰ－４３ＲＮＡ転写物からの増幅を模索したが、これはこの自己調節がＳＴＭＮ２転写物と同様に、十分に確立されているからである（１１）。いずれの場合も、ＴＤＰ－４３プルダウン後の濃縮が観察されたが、ＩｇＧ対照については、または異なるＡＬＳ関連タンパク質であるＳＯＤ－１がプルダウンされた場合は観察されなかった（図３Ｅ～３Ｆ）。総合すると、結果はＴＤＰ－４３がＳＴＭＮ２ｍＲＮＡと直接会合し、ＴＤＰ－４３レベルの低減がＳＴＭＮ２レベルの低減をもたらすことを示している。

ｈＭＮにおけるＳＴＭＮ２の機能
次に、ｈＭＮにおけるＳＴＭＮ２の機能について調査した。まず、ＳＴＭＮ２の発現を、ＭＮを産生する分化プロセスにわたって試験した（図１２Ｄ）。先行する発現研究（６２、６３、７４）を裏付けるように、ＳＴＭＮ２タンパク質は、幹細胞またはニューロン前駆細胞において検出できなかったことから、分化ニューロンにおいて選択的に発現することが認められた（図１２Ｄ）。次いで、免疫細胞化学を使用してＳＴＭＮ２の細胞内局在化を探索したところ、ＳＴＭＮ２が、神経突起先端に存在する個々の細胞質斑点に局在しており、核周囲領域に特に濃縮されていることが認められた（図３Ｇ）。ゴルジ関連タンパク質ＧＯＬＧＩＮ９７に対するヒト特異的抗体を使用して、この領域がゴルジ装置に相当することを確認し（図３Ｈ）、ＳＴＭＮ２Ｎ末端が小胞輸送及び膜結合のためのパルミトイル化の標的であるという予測を実証した（７５）。ＳＴＭＮ２はまた、神経突起伸長及び損傷時に、成長円錐において機能することが予測されている（４７）。分化及び選別の直後にｈＭＮを染色すると、微小管と、成長円錐を定義する成分であるＦ－アクチン束との間の界面で、ＳＴＭＮ２の強い染色が観察された（図３Ｉ）。これらの知見は、成長円錐におけるＳＴＭＮ２微小管ダイナミクスの役割を裏付ける。総合すると、データは、ＳＴＭＮ２がＡＬＳの病因に関与する細胞骨格欠損及び軸索輸送経路の変化において機能し得ることを示している（７６）。

ｈＭＮにおけるＳＴＭＮ２レベルの低下の細胞での結果を調査するために、ＳＴＭＮ２ノックアウト幹細胞を作製した。具体的には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ゲノム編集戦略（図４Ａ）を使用して、２つのｈＥＳ細胞株（ＷＡ０１及びＨＵＥＳ３Ｈｂ９：：ＧＦＰ）中のヒトＳＴＭＮ２遺伝子座に大きな欠失を生成した。ＳＴＭＮ２遺伝子に１８ｋｂの欠失を保有するクローンを同定するための一次ＰＣＲスクリーニング（図４Ｂ）を行った後、分化ｈＭＮにおけるタンパク質ノックアウトを、免疫ブロッティング及び免疫細胞化学の両方によって確認した（図４Ｃ～４Ｄ）。予想通り、親ＳＴＭＮ２＋／＋株と比較した場合、候補欠失クローンに由来するｈＭＮは、ＳＴＭＮ２染色の完全な欠如を示すことが認められた。

微小管の動的不安定性を促進することにより軸索成長を調節するＳＴＭＮ２の報告された役割（７７）を考慮して、ＳＴＭＮ２－／－ｈＭＮにおける神経突起成長を特徴付ける表現型アッセイを行った。培養７日後、選別したｈＭＮを固定し、β－ＩＩＩ－チューブリンについて染色し、神経突起を標識した（図４Ｅ）。体細胞の中心から所与の間隔での交差の数を定量化するＳｈｏｌｌ解析（７８）により、ＳＴＭＮ２^＋／＋と比較した、ＳＴＭＮ２^－／－株における神経突起伸長の有意な低減が明らかとなった（図４Ｆ～４Ｇ）。これとは別に、神経突起伸長を増加させることが示されているＲＯＣＫ阻害剤Ｙ－２７６３２の存在下でニューロンを培養した。神経突起成長における差異は、ＳＴＭＮ^＋／＋株の成長を増強するがＳＴＭＮ^－／－株の成長を増強しない分子を用いたこれらの実験において更により際立っており、これにより、このシグナル伝達カスケードにおけるＳＴＭＮ２の役割が示唆された（図４Ｈ）。同様の結果がＷＡ０１細胞株で観察された（図１３）。

次に、ＳＴＭＮ２がニューロン成長においてのみならず、損傷後のニューロン修復においても機能するか否かが問われた。これらの仮説を試験するために、選別したｈＭＮを、神経細胞体由来の軸索の独立した培養を可能にするマイクロ流体デバイスに播種した（７９）（図４Ｉ）。デバイスの体細胞区画中で７日間培養した細胞は、軸索をマイクロチャネルを通して軸索チャンバーへと伸長した（図４Ｊ）。軸索が体細胞区画の細胞体を妨げることなく実質的に切断されるまで、軸索チャンバーの真空吸引及び再潅流を繰り返し実施した。次に、損傷後の軸索修復を評価するために、経時的にマイクロチャネルから神経突起の長さを測定した。分析により、測定した全ての時点で、ＳＴＭＮ２^＋／＋と比較したＳＴＭＮ２^－／－株における再成長の有意な低減が明らかとなった（図４Ｋ）。同様の結果がＷＡ０１細胞株で観察された（図１３）。総合すると、これらのデータは、ＳＴＭＮ２のレベルの低減が、ｈＭＮにおける神経突起の成長及び複雑性、ならびに軸索切断後の修復に対して測定可能な表現型の影響を与え得ることを示している。

プロテアソーム機能はＴＤＰ－４３局在化及びＳＴＭＮ２レベルを調節する
先行研究により、ｈＭＮにおけるプロテアソーム阻害が変異型ＳＯＤ－１の蓄積を誘発し得ることが立証された（３１）。したがって、散発性ＡＬＳの潜在的モデルとして、ＭＧ－１３２媒介性プロテアソーム阻害がｈＭＮにおけるＴＤＰ－４３局在化に影響を及ぼすか否かを試験した。まず、明らかな細胞毒性を誘導することなくプロテアソームを阻害することができる小分子処置の範囲及びタイミングを確立した（図１４Ａ～１４Ｄ）。プロテアソーム活性を正常活性の１０％未満に低下させる一晩の１μＭの処置に、ニューロンが耐え得ることを確認した（図１４Ｅ）。次に、パルス追跡実験を実施して、ＴＤＰ－４３局在化に対するプロテアソーム阻害の結果を確認した（図５Ａ）。驚くべきことに、前述のようにピアソンの相関係数分析を使用したところ、核におけるＴＤＰ－４３染色はＭＧ－１３２の２４時間の１μＭパルスの後に大幅に減少することが観察された（図５Ｂ～５Ｃ）。注目すべきことに、ウォッシュアウト後、ＴＤＰ－４３染色は４日後に未曝露のニューロンと区別不能となることが認められた（図５Ｂ～５Ｃ）。したがって、ｈＭＮにおけるプロテアソーム阻害は、可逆的なＴＤＰ－４３の誤局在化を誘導する。これらの知見は、プロテアソーム阻害が同様にＴＤＰ－４３核染色の喪失を引き起こした一次皮質及び海馬ニューロンに関するストレス条件試験と類似している（３２）。

プロテアソーム阻害後にＴＤＰ－４３に何が生じたかを確認するために、ＴＤＰ－４３レベルを、界面活性剤可溶性画分及び界面活性剤不溶性画分の両方で免疫ブロット分析によって試験した。低用量のＭＧ－１３２で処置した対照ニューロンから得られた可溶性溶解物（図５Ａ）では、ＴＤＰ－４３レベルの有意な低下が認められた（図５Ｄ）。ＵＲＥＡ、すなわち不溶性画分を探索したところ、プロテアソーム阻害がＴＤＰ－４３を不溶性となるように誘発することが見出された（図５Ｄ）。最後に、短期高用量または長期低用量のＭＧ－１３２のいずれかで処置したニューロンにおけるＳＴＭＮ２レベルを探索した。いずれの場合も、ＳＴＭＮ２ｍＲＮＡレベルの有意な低下が観察された（図５Ｅ）。総合すると、これらのデータは、タンパク質恒常性をＴＤＰ－４３局在化及びＳＴＭＮ２レベルと結び付ける。

ＴＤＰ－４３はｈＭＮにおける潜在性エクソンの出現を抑制する
ＴＤＰ－４３はＲＮＡスプライシングを調節する核において重要な役割を果たしており、最近の研究は、非保存エクソンまたは潜在性エクソンを抑制してイントロンの完全性を維持するＴＤＰ－４３の能力に光を当てている（８０）。ＲＮＡ転写物に潜在性エクソンが含まれている場合、多くの場合、それらの包含は、遺伝子産物の翻訳を妨害するか、またはナンセンス媒介性崩壊を促進することにより、遺伝子産物の正常レベルに影響を及ぼす可能性がある（８０）。興味深いことに、ＴＤＰ－４３潜在性エクソンの抑制により調節される遺伝子の重複は、マウスとヒトの間で観察されていない（８０）。ヒトがん細胞においてＴＤＰ－４３によって再現性よく調節されることが観察された遺伝子における潜在性エクソンのエビデンスについて、シーケンシングデータを調査した（８１）。これら９５個の遺伝子のうち９個に、潜在性エクソンにマッピングされるリードが見出され、これらには、ＲＮＡ－Ｓｅｑ実験で一貫してダウンレギュレートされたＰＦＫＰが含まれていた（図１５Ａ、図３Ｃ）。この観察に基づいて、ＴＤＰ－４３枯渇後のｈＭＮにおいて一貫して誤調節されている他の遺伝子にマッピングされるＲＮＡ－Ｓｅｑリードも精査した。ＥＬＡＶＬ３及びＳＴＭＮ２の両方における潜在性エクソンの包含に関する強力なエビデンスが見出された（図１５Ｂ～１５Ｃ）。次に、潜在性エクソンの包含が、プロテアソーム阻害後のｈＭＮにおけるＳＴＭＮ２レベルの低下の一因であり得るか否かが問われた。この目的を達成するために、潜在性エクソンを含有する転写物を検出するためのＲＴ－ＰＣＲアッセイを開発した（図５Ｆ）。プロテアソーム阻害剤で処置されたｈＭＮのみが、検出可能なレベルの予想されたＰＣＲ産物を有しており（図５Ｇ）、ＰＣＲ産物のサンガーシーケンシングにより、予期されたスプライスジャンクションが確認された（図１５Ｄ～１５Ｅ）。データを総合すると、ＳＴＭＮ２ダウンレギュレーションの機序は、ＴＤＰ－４３の枯渇及び誤局在化の両方に関して類似していることが示唆される。

ＳＴＭＮ２はヒト成人一次脊髄ＭＮで発現し、ＡＬＳにおいて変化する
最後に、ｉｎｖｉｔｒｏでの知見がｉｎｖｉｖｏでのＡＬＳ患者の運動ニューロンに関連するか否かを試験することを試みた。この目的のために、ヒト成人脊髄組織の免疫組織化学を使用して、対照及びＡＬＳ患者におけるＳＴＭＮ２発現を調査した。核内ＴＤＰ－４３染色の病理学的喪失及び細胞質ＴＤＰ－４３免疫反応性封入体の蓄積を典型的に示す散発性ＡＬＳ症例由来の死後脊髄ＭＮにおいて、ＳＴＭＮ２タンパク質のレベルが変化することが予測された（７、３７）。幹細胞由来のｈＭＮで観察されたものと同様に、強力なＳＴＭＮ２免疫反応性がヒト成人腰髄ＭＮの細胞質領域に存在したが、周囲のグリア細胞には存在しなかった（図６Ａ～６Ｃ）。対照症例３例（脊髄疾患のエビデンスなし）及びＡＬＳ症例３例の腰髄組織切片において、強力なＳＴＭＮ２免疫反応性を示すＭＮのパーセンテージを測定した。仮説と一致して、ＳＴＭＮ２抗体に対する明らかな免疫反応性を有する腰髄ＭＮのパーセンテージが、散発性ＡＬＳ症例から採取した組織試料において有意に低減したことが認められた（図６Ｄ）。この結果は、ＡＬＳ死後試料のいくつかの独立した発現試験によって更に裏付けられる。発現試験を実施するために、３つの試験でＡＬＳ患者由来の運動ニューロンのレーザー切開が実施されてきた（８２～８４）。このデータを調査したところ、対照試料と比較してＡＬＳ患者試料についてＳＴＭＮ２転写物レベルの低下が観察された（図６Ｅ～６Ｆ）。

考察
これらの試験から、数百の転写物の存在量は、ＡＬＳ研究に関連してこれまで明らかにされてきたいくつかのＲＮＡを含めて、ヒト運動ニューロンにおいてＴＤＰ－４３によって調節されている可能性があることが示唆される。例えば、この知見はＢＤＮＦ発現がＴＤＰ－４３によって部分的に調節され得ることを示唆しており、このニューロトロフィンの発現低下がこれまでに観察されていること（８５）を考慮すると、注目すべきである。ＭＭＰ９は、ＳＯＤ１ＡＬＳマウスモデルにおいて、変性に対して最も感受性の高い運動ニューロンの集団を定義することがこれまでに示されている（８６）。これらの試験により、ＴＤＰ－４３の機能の低減がこの因子の発現をより広範囲に誘導する可能性があり、このことが、変性に対する運動ニューロンの感度を高め得ることが示唆される。ここで同定された転写物の更なる調査により、ＴＤＰ－４３に対する摂動がいかにして運動ニューロン機能障害を招くかについての洞察がもたらされる可能性がある。

重要な未解決の疑問は、ＴＤＰ－４３の家族性変異の機構的意義とは何か、及びその影響が、ＴＤＰ－４３が散発性疾患患者において病理学的に再局在化したときに生じる事象とどのように関連しているのかということであった。ＴＤＰ－４３により調節される運動ニューロン転写物の同定により、家族性及び散発性疾患の両方に関連するＴＤＰ－４３への異なる操作の潜在的影響を調査する機会が得られた。まず、ＴＤＰ－４３枯渇後に低減したと同定された標的ＲＮＡのサブセットが、ＴＤＰ－４３変異を有する患者から産生された運動ニューロンにおいて有意な発現変化を示すか否かが問われた。興味深いことに、ＲＮＡ結合タンパク質ＥＬＡＶＬ３及び微小管調節因子ＳＴＭＮ２の発現には若干ではあるが有意な変化が認められたが、同定された他の推定標的では認められなかった。したがって、標的ＲＮＡの発現低減はＴＤＰ－４３表現型であると考えられ、患者の変異は部分的な機能喪失型の影響を示した。

変異型ＴＤＰ－４３は、過剰発現すると凝集する傾向にあることがこれまでに示されている（２２）。いくつかの研究においても、変異型ＴＤＰ－４３は、患者特異的運動ニューロンにおいて生来のレベルで発現した場合、同様に凝集する傾向にあることが示唆されている（５４、５６、５７）。実験において、核内変異型ＴＤＰ－４３の凝集または喪失がＳＴＭＮ２及びＥＬＡＶＬ３の発現低下の一因となり得るか否かを判定するために、ＴＤＰ－４３をこれらの患者の運動ニューロンにおいて注意深くモニタリングしたが、そのような欠損は特定されなかった。検出範囲を下回る若干の核内ＴＤＰ－４３の喪失または不溶性がＳＴＭＮ２及びＥＬＡＶＬ３発現の観察された減退の原因であることは否定できないが、この知見は、特定の基質を処理するための変異タンパク質の親和性または能力が単に低減している可能性があるという考えと一致する。これらの潜在的仮説を識別するためには、本試験の範囲を超えた更なる生化学的実験が必要となる可能性がある。

家族性患者の運動ニューロンにおいて、変異型ＴＤＰ－４３のより大規模な凝集、または核内喪失が生じている場合、それは検出可能であると考えられる。プロテアソーム阻害が、ＴＤＰ－４３の劇的な核内喪失をその不溶性の蓄積とともに誘導することが認められた。プロテアソーム阻害がＳＯＤ１ＡＬＳ患者特異的幹細胞由来の運動ニューロンにおいて不溶性ＳＯＤ１の蓄積をもたらすが、正常ＳＯＤ１のみを保有する対照運動ニューロンにおいては蓄積をもたらさないことを発見した後に、この操作を実施するための着想が生じた（３１）。興味深いことに、異なる状況において他者によって明らかに観察されたように（３２）、プロテアソーム阻害は、疾患遺伝子型の制御下にあるか否かにかかわらず、核内ＴＤＰ－４３の喪失及びその不溶性の蓄積を引き起こした。この結果は、ＡＬＳが関与する任意数の変異または事象によって誘導されるプロテオスタシスの破壊が、散発性ＡＬＳにおける最も一般的な組織病理学的所見の上流にあり得ることを示唆していたことから、魅力的であった。この知見により、更に、ＴＤＰ－４３の細胞質への再局在化が、破壊されたプロテオスタシスに対する保護的かつ適応的な応答を最初にもたらす可能性があると考えられた（８７）。しかし、この応答の生化学的性質及びこれらの複合体が受ける可能性のある液晶変換（ｌｉｑｕｉｄｃｒｙｓｔａｌｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）が、一過性の応答を引き起こし、ＴＤＰ－４３によって調節される重要なＲＮＡの運動ニューロンが慢性的に枯渇する病的状態になる可能性がある（８８）。ＴＤＰ－４３標的がプロテアソーム阻害後に運動ニューロンから枯渇するという知見は、そのモデルと一致する。

数百のＲＮＡがＴＤＰ－４３の枯渇により影響を受けることが判明したが、全ての転写物がＴＤＰ－４３の変化により等しく影響されるように思われるわけではなく、ＳＴＭＮ２、ＥＬＡＶＬ３をコードするものを含む若干数は、特に感受性が高いことが認められた。この観察結果は、患者におけるＴＤＰ－４３病変の主要な影響、ならびにそれが運動ニューロパチー及び変性に果たす可能性のある役割は少数の標的ＲＮＡを介して伝播されるか、という実質的な治療上の意味を伴う重要な疑問を提起する。もしそうであれば、これらの重要なＴＤＰ－４３標的の機能、それらが妨害される機序、及びそれらが回復され得るか否かを理解することは、運動ニューロンの機能性を回復させるためのＴＤＰ－４３病変の下流の経路に注目を向けることができるため、重要であり得る。ＳＴＭＮオルソログの確立された機能及びＳＴＭＮ２レベルに対するＴＤＰ－４３枯渇の影響の大きさを考慮すると、それがそのような標的であり得るかどうかは疑問に思われた。

スタスミンファミリーのタンパク質は、微小管安定性の調節因子として認識されており、ハエの運動性軸索の生物学的性質を調節することが実証されている（７７）。遺伝子編集を使用してＳＴＭＮ２がヒト幹細胞由来運動ニューロンにおいて重要な機能を果たしているか否かを確認したところ、このタンパク質が欠如していると運動性軸索の成長及び修復の両方が著しく損なわれることが認められた。ｉｎｖｉｔｒｏで産生されたｈＭＮは、真正のＭＮと多くの分子的及び機能的特性を共有しているが（２９）、ＡＬＳの幹細胞ベースモデルからの発見に関するｉｎｖｉｖｏ検証は、疾患機序及び治療戦略とのそれらの関連性の重要な試験である（８９）。したがって、ヒト成人脊髄組織を使用して、ＳＴＭＮ２レベルがＡＬＳにおいて変化するという知見を立証するｉｎｖｉｖｏのエビデンスを提供した。ＳＴＭＮ２の発現低減に関する考えられる機序は、潜在性エクソンの出現である。適切に標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、このスプライシング事象を抑制し、ＳＴＭＮ２の発現を回復させる可能性がある。

材料及び方法
細胞培養ならびにｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣのＭＮへの分化
多能性幹細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングした組織培養皿上でｍＴｅＳＲ１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて増殖させ、５％ＣＯ２インキュベーター内にて３７℃で維持した。幹細胞を、１ｍＭＥＤＴＡ処置後に細胞の小凝集体として継代した。１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤（Ｓｉｇｍａ、Ｙ－２７６３２）を、解離の１６～２４時間後に、細胞死を防止するために培養物に添加した。ＳＭＡＤシグナル伝達の二重阻害、ＮＯＴＣＨ及びＦＧＦシグナル伝達の阻害、ならびにレチノイン酸及びＳＨＨシグナル伝達によるパターニングと組み合わせた、接着培養条件に基づく改変プロトコルを使用してＭＮを分化させた。簡潔に述べると、ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＥＳ細胞を単一細胞に解離させ、ＲＯＣＫ阻害剤（１０μＭＹ－２７６３２、Ｓｉｇｍａ）を補充したｍＴｅＳＲ１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、マトリゲルでコーティングした培養プレート上に８０，０００細胞／ｃｍ^２の密度で播種した。細胞が１００％の培養密度に達したとき、培地を、分化培地（１×Ｂ－２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））、１×Ｎ－２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））、１×Ｇｉｂｃｏ（登録商標）ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））及び１００μＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）を補充した、１／２Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））１／２ＤＭＥＭ－Ｆ１２（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）））に交換した。この時点を、運動ニューロン分化の０日目（ｄ０）と規定した。小分子による処置を以下の通り行った：ｄ０～ｄ５に、１０μＭＳＢ４３１５４２（ＣｕｓｔｏｍＳｙｎｔｈｅｓｉｓ）、１００ｎＭＬＤＮ－１９３１８９（ＣｕｓｔｏｍＳｙｎｔｈｅｓｉｓ）、１μＭレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ）及び１μＭＳｍｏｏｔｈｅｎｄアゴニスト（ＣｕｓｔｏｍＳｙｎｔｈｅｓｉｓ）；ｄ６～ｄ１４に、５μＭＤＡＰＴ（ＣｕｓｔｏｍＳｙｎｔｈｅｓｉｓ）、４μＭＳＵ－５４０２（ＣｕｓｔｏｍＳｙｎｔｈｅｓｉｓ）、１μＭレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ）及び１μＭＳｍｏｏｔｈｅｎｄアゴニスト（ＣｕｓｔｏｍＳｙｎｔｈｅｓｉｓ）。

ＧＦＰ＋ＭＮの蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）
ｄ１４に、分化培養物を、５％ＣＯ２／３７℃のインキュベーター内で１時間のａｃｃｕｔａｓｅ（商標）処置を使用して単一細胞に解離させた。１０００μＬのＰｉｐｅｔｍａｎ（登録商標）を用いた穏やかなピペット操作を繰り返し（１０～２０回）用いて、単一細胞の調製を行った。細胞をスピンダウンし、ＰＢＳで１回洗浄し、選別緩衝液（ｐＨ７の１×カチオン不含ＰＢＳ１５ｍＭＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））、１％ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））、１×ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））、１ｍＭＥＤＴＡ、及びＤＡＰＩ（１μｇ／ｍＬ））に再懸濁させた。ＦＡＣＳ分析及び精製の直前に、細胞を４５μｍフィルタに通した。ＢＤＦＡＣＳＡｒｉａＩＩセルソーターを通常通り使用して、Ｈｂ９：：ＧＦＰ^＋細胞を、１０μＭＲＯＣＫ阻害剤（Ｓｉｇｍａ、Ｙ－２７６３２）ならびに１０ｎｇ／ｍＬの神経栄養因子ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ及びＣＮＴＦ（Ｒ＆Ｄ）を含むＭＮ培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））、１×Ｎ－２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））、Ｂ－２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））、ＧｌｕｔａＭａｘ及びＮＥＡＡ）が入った採取チューブ内に精製した。ＤＡＰＩシグナルを使用して細胞生存率を解明し、ＭＮパターニング分子（ＲＡ及びＳＡＧ）に曝露されていない分化細胞を、緑色蛍光についてゲーティングするための陰性対照として使用した。Ｈｂ９：：ＧＦＰレポーターを含有しない株については、単一細胞懸濁液を、ＮＣＡＭ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＢＤＢ５５７９１９、１：２００）及びＥｐＣＡＭ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＢＤＢ３４７１９８、１：５０）に対する抗体とともに選別緩衝液中で２５分間インキュベートし、次いでＰＢＳ１×で１回洗浄し、選別緩衝液中に再懸濁させた。ＲＮＡ－Ｓｅｑ実験では、１ウェルあたり２００，０００個のＧＦＰ^＋細胞を、マトリゲルで予めコーティングした２４ウェル組織培養皿に播種した。それぞれ１０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ及びＣＮＴＦ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を補充したＭＮ培地を使用して、精製ＭＮをフィーディングし、成熟させた。ＲＮＡ－Ｓｅｑ実験及び最も下流のアッセイを、０．１ｍｇ／ｍｌポリ－Ｄリジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び５μｇ／ｍｌラミニン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）でコーティングしたｄ１０精製ＭＮ（ＦＡＣＳ後１０日間培養したもの）を増殖させたプレートで、おおよそ１３００００細胞／ｃｍ^２の濃度で行った。

ＲＮＡｉ
精製ＧＦＰ^＋ＭＮの培養物中のＲＮＡｉを、ＴＤＰ－４３ｍＲＮＡを標的とするＳｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）ＳｅｌｅｃｔｓｉＲＮＡ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））を用いて、またはあらゆるヒト転写物に結合することが予測されていないスクランブル配列を有する非標的化ｓｉＲＮＡ対照を用いて誘導した。凍結乾燥させたｓｉＲＮＡをヌクレアーゼフリー水に再懸濁させ、使用できる状態になるまで２０μＭストックとして－２０℃で保存した。トランスフェクションのために、製造業者の指示に従って、ｓｉＲＮＡをＯｐｔｉｍｅｍ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））で希釈し、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した。３０分間のインキュベーション後、１：１のＯｐｔｉｍｅｍ：ＭＮ培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））、Ｎ２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））、Ｂ－２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））、ＧｌｕｔａＭａｘ及びＮＥＡＡ）、ならびにそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ及びＣＮＴＦ（Ｒ＆Ｄ）中で各ウェルの最終ｓｉＲＮＡ濃度が６０ｎＭとなるように、混合物をＭＮ培養物に滴加した。トランスフェクションの１２～１６時間後、培地を交換した。ＲＮＡ－Ｓｅｑ実験及び検証アッセイを、トランスフェクションの４日後に採取した材料を用いて行った。

免疫細胞化学
免疫蛍光法用に、細胞を氷冷４％ＰＦＡで１５分間４℃で固定し、１×ＰＢＳ中の０．２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘで４５分間透過処理し、１×ＰＢＳ－Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０）中の１０％ロバ血清で１時間ブロッキングした。次に、細胞を一次抗体（ブロッキング溶液で希釈）とともに４℃で一晩インキュベートした。１×ＰＢＳ－Ｔで少なくとも４回の洗浄（それぞれ５分間のインキュベーション）を行った後、細胞を二次抗体と室温で１時間インキュベートした（ブロッキング溶液で希釈した）。核をＤＡＰＩで染色した。本試験では、以下の抗体を使用した：Ｈｂ９（１：１００、ＤＳＨＢ、ＭＮＲ２８１．５Ｃ１０－ｃ）、ＴＵＪ１（１：１０００、Ｓｉｇｍａ、Ｔ２２００）、ＭＡＰ２（１：１００００、Ａｂｃａｍａｂ５３９２）、Ｋｉ６７（１：４００、Ａｂｃａｍ、ａｂ８３３）、ＧＦＰ（１：５００、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）、Ａ１０２６２）、Ｉｓｌｅｔ１（１：５００、Ａｂｃａｍａｂ２０６７０）、ＴＤＰ－４３（１：５００、ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈＧｒｏｕｐ）、ＳＴＭＮ２（１：４０００、Ｎｏｖｕｓ）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標）６４７－Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（１：２００）。使用した二次抗体（４８８、５５５、５９４、及び６４７）は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標）（１：１０００、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））及びＤｙＬｉｇｈｔ（１：５００、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）であった。顕微鏡写真を、相関係数を決定するためにＦＩＪＩソフトウェアを使用して分析した。

免疫ブロットアッセイ
ＴＤＰ－４３及びＳＴＭＮ２タンパク質の発現レベルの分析用に、ｄ１０ＭＮを、プロテアーゼ・ホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム；１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００；０．５％デオキシコール酸ナトリウム；０．１％ＳＤＳ；５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０）中にて氷上で２０分間溶解させ、高速で遠心分離した。２４ウェル培養物のウェルあたり２００μＬのＲＩＰＡ緩衝液を通常通り使用し、ＢＣＡ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による測定で約２０μｇである総タンパク質を得た。ＲＩＰＡ緩衝液で２回洗浄後、不溶性ペレットを２００μｌのＵＲＥＡ緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に再懸濁させた。免疫ブロットアッセイ用に、２～３μｇの総タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＢｉｏＲａｄ）によって分離し、ＰＤＶＦ膜（ＢｉｏＲａｄ）に移し、ＴＤＰ－４３（１：１０００、ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈＧｒｏｕｐ）、ＧＡＰＤＨ（１：１０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及びＳＴＭＮ２（１：３０００、Ｎｏｖｕｓ）に対する抗体でプローブした。不溶性ペレットを、対応するＲＩＰＡ可溶性対応物のタンパク質濃度に基づいてロードした。同じＰＤＶＦ膜を、Ｒｅｓｔｏｒｅ（商標）ＰＬＵＳＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔＳｔｒｉｐｐｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して２～３回免疫アッセイした。ＧＡＰＤＨレベルを使用して各試料を正規化し、ＬｉＣｏｒソフトウェアを使用してタンパク質バンドシグナルを定量化した。

ＲＮＡ調製、ｑＲＴ－ＰＣＲ、及びＲＮＡシーケンシング
ＲＮＡ－ｓｅｑ実験及びＴｒｉｚｏｌＬＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する検証アッセイ用に、製造業者の指示に従ってｄ１０ＭＮから全ＲＮＡを単離した。２４ウェル培養物のウェルあたり５００μＬを添加した。合計３００～１０００ｎｇの全ＲＮＡを使用して、ｉＳＣＲＩＰＴキット（Ｂｉｏ－ｒａｄ）に従って逆転写によりｃＤＮＡを合成した。次に、ＳＹＢＲグリーン（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）及びｉＣｙｃｌｅｒシステム（Ｂｉｏ－ｒａｄ）を使用して定量ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を実施した。アッセイした全ての遺伝子の定量レベルを、ＧＡＰＤＨ発現を使用して正規化した。正規化した発現を、関連する対照試料（大部分がｓｉｒｅｄ処置したＭＮまたは１×ＴＤＰ－４３レベルを有する細胞）に対して表示した。患者株間の比較のために、正規化した発現を、プールしたデータポイントの平均に対して表示した。全てのプライマー配列は、要請に応じて入手可能である。次世代ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）では、ｓｉＲＮＡ試料あたり少なくとも２つの技術的複製物またはＡＡＶＳ１－ＴＤＰ４３遺伝子型を分析に含めた。ＲＮＡ抽出後、ｂｉｏＡｎａｌｙｚｅｒにより決定したＲＮＡ完全性数（ＲＩＮ）が７．５超の試料を、ライブラリー調製に使用した。簡潔に述べると、製造業者の指示に従ってｉｌｌｕｍｉｎａＴｒｕＳｅｑＲＮＡキットｖ２を使用して、約２５０ｎｇの全ＲＮＡからＲＮＡシーケンシングライブラリーを作製した。ライブラリーを、ＨａｒｖａｒｄＢａｕｅｒＣｏｒｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ施設において、ＨｉＳｅｑ２０００プラットフォームでシーケンシングした。全てのＦＡＳＴＱファイルを、ｂｃｂｉｏＲＮＡＳｅｑワークフロー及びツールチェーンを使用して分析した（９０）。ＦＡＳＴＱファイルを、ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９参照ゲノムにアラインメントした。差次的発現試験を、ＤＥＳｅｑ２バイオインフォマティクスツール一式を使用して実施した（３８）。ＣｕｆｆｌｉｎｋｓのＣｕｆｆｄｉｆｆモジュールを使用して、差次的スプライシングを同定した。Ｓａｌｍｏｎを使用してカウントを生成し、ｔｘｉｍｐｏｒｔを使用して遺伝子レベルでそれらをロードした（９１、９２）。次いで、全てのｐ値を、ＢｅｎｊａｍｉｎｉとＨｏｃｈｂｅｒｇの方法（９３）を使用して、多重比較用に補正する。

電気生理学的記録
ＧＦＰ^＋ＭＮを、ポリ－Ｄ－リジン／ラミニンコーティングカバースリップ上に５，０００細胞／ｃｍ^２の密度で播種し、ＭＮ培地中で１０日間培養し、マウスグリア細胞で２～３日間馴化させて、それぞれ１０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ及びＣＮＴＦ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を補充した。電気生理学的記録を以前に報告されたように（３１、９４）行った。簡潔に述べると、Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ７００Ｂ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を使用して、室温（２１～２３℃）で全細胞電圧クランプまたは電流クランプ記録を行った。Ｄｉｇｉｄａｔａ１４４０ＡＡ／Ｄインターフェースでデータをデジタル化し、ｐＣＬＡＭＰ１０＿ソフトウェア（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を使用して記録した。データを２０ｋＨｚでサンプリングし、２ｋＨｚでローパスフィルタ処理した。パッチピペットを、ＳｕｔｔｅｒＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＰ－９７プラー上でホウケイ酸ガラスキャピラリーから引き抜き、抵抗は２～４ＭＷであった。ピペットキャパシタンスを、パラフィルムでシャンクを包むことによって低減させ、増幅回路を使用して補償した。直列抵抗は、通常は５～１０ＭＷであり、常に１５ＭＷ未満であり、少なくとも８０％補償された。Ｐ／４プロトコルを使用して直線リーク電流（ｌｉｎｅａｒｌｅａｋａｇｅｃｕｒｒｅｎｔ）をデジタル的に差し引いた。－８０ｍＶの保持電位から－８０ｍＶ～３０ｍＶの範囲の試験電位まで１０ｍＶ刻みで増加させ電圧を誘発した。細胞内溶液はカリウムベースの溶液であり、グルコン酸Ｋ、１３５；ＭｇＣｌ_２、２；ＫＣｌ、６；ＨＥＰＥＳ、１０；ＭｇＡＴＰ、５；０．５（ＫＯＨを用いてｐＨ７．４）を含有していた。細胞外はナトリウムベースであり、ＮａＣｌ、１３５；ＫＣｌ、５；ＣａＣｌ_２、２；ＭｇＣｌ_２、１；グルコース、１０；ＨＥＰＥＳ、１０（ＮａＯＨを用いてｐＨ７．４）を含有していた。カイニン酸はＳｉｇｍａから購入した。

ホルムアルデヒドＲＮＡ免疫沈降
ｈＭＮの６ウェルプレートのうちの１ウェル（２００万細胞）を架橋させ、ＭａｇｎａＲＩＰの説明書（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に従って処理した。本試験では、以下の抗体を使用した：ＳＯＤ１（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＴＤＰ－４３（ＦＬ９、Ｄ．Ｃｌｅｖｅｌａｎｄの寄贈品）、及びマウスＩｇＧ（ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。各ＲＩＰＲＮＡ画分のＣｔ値を、ＲＮＡ試料調製の差異を考慮して、同じｑＰＣＲアッセイのインプットＲＮＡ画分のＣｔ値に対して正規化した。ｄＣｔ［正規化ＲＩＰ］を算出するために、Ｃｔ［ＲＩＰ］－（Ｃｔ［インプット］－ｌｏｇ２（インプット希釈係数））を決定し、希釈係数は１００または１％であった。倍率濃縮を決定するために、ｄＣｔ［正規化ＲＩＰ］－ｄＣｔ［正規化ＩｇＧ］によるｄｄＣｔ、次いで倍率濃縮＝２＾－ｄｄＣｔを算出した。

ＳＴＭＮ２ノックアウトの作製
ＳＴＭＮ２ガイドＲＮＡを、以下のウェブリソース：ＳｃｈｉｅｒＬａｂのＣＨＯＰＣＨＯＰ（ｃｈｏｐｃｈｏｐ．ｒｃ．ｆａｓ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ）（９５）を使用して設計した。ヒトＵ６プロモーターを含有するベクター（ＢｒｏａｄＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅのカスタム合成）にガイドをクローニングし、続いて、ＢｂｓＩによる切断及びアンピシリン耐性によって利用可能なクローニング部位にクローニングした。クローニングを実施するために、指図する前に全てのｇＲＮＡを修飾した。ＢｂｓＩ付着末端に適合するオーバーハングを生成するために、センス鎖の５’ヌクレオチドがＧでない場合、このヌクレオチドを除去してＧで置換；逆相補鎖の場合、最も３’側のヌクレオチドを除去してＣで置換し、一方で５’末端にＡＡＡＣを付加、という修飾を使用した。得られた修飾ＳＴＭＮ２ｇＲＮＡ配列をＣａｓ９ヌクレアーゼゲノム編集（ガイド１：５’ＣＡＣＣＧＴＡＴＡＧＡＴＧＴＴＧＡＴＧＴＴＧＣＧ３’（エクソン２）（配列番号４）、ガイド２：５’ＣＡＣＣＴＧＡＡＡＣＡＡＴＴＧＧＣＡＧＡＧＡＡＧ３’（エクソン３）（配列番号５）、ガイド３：５’ＣＡＣＣＡＧＴＣＣＴＴＣＡＧＡＡＧＧＣＴＴＴＧＧ３’（エクソン４）（配列番号６））に使用した。クローニングを、最初にＰＣＲチューブ中の両方のｇＲＮＡをアニーリング及びリン酸化することにより実施した。濃度１００μＭの両方の鎖１μＬを、１μＬのＴ４ＰＮＫ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、１μＬのＴ４ライゲーション緩衝液、及び６μＬのＨ２Ｏに添加した。チューブをサーモサイクラーに入れ、３７℃で３０分間、続いて９５℃で５分間インキュベートし、５℃／分の速度で２５℃までゆっくりと下降させた。続いて、アニーリングしたオリゴを１：１００に希釈し、２μＬの１００μＭｐＵＣ６ベクター、２μＬのＮＥＢ緩衝液２．１、１μＬの１０ｍＭＤＴＴ、１μＬの１０ｍＭＡＴＰ、１μＬのＢｂｓＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、０．５μＬのＴ７リガーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）及び１０．５μＬのＨ２Ｏを含有するライゲーション反応物に２μＬを添加した。この溶液を、３７℃で５分間、続いて２１℃で５分間のサイクルを合計６回繰り返してサーモサイクラー内でインキュベートした。続いて、ベクターをＯｎｅＳｈｏｔＴｏｐ１０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）細胞にクローニングし、ＬＢ－アンピシリン寒天プレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。ＱｉａｇｅｎＭＩＤＩｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してベクターを単離し、ナノドロップを使用してＤＮＡ濃度を測定した。Ｍ１３Ｆ（－２１）プライマーを使用してＧｅｎｅｗｉｚによってベクターをシーケンシングすることにより、適切なクローニングを確認した。

幹細胞トランスフェクションを、１００μＬキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えたＮｅｏｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施した。トランスフェクションの前に、幹細胞を１０μＭのＲｏｃｋ阻害剤を含有するｍＴｅＳＲ１中で１時間インキュベートした。続いて、ａｃｃｕｔａｓｅを添加し、３７℃で５分間インキュベートすることにより、細胞を解離させた。細胞をＣｏｕｎｔｅｓｓを使用して計数し、２．５×１０^６細胞／ｍＬの濃度でＲ培地に再懸濁させた。次いで、細胞溶液を、ガイドを含有する各ベクター１μｇと、ｐＳｐＣａｓ９ｎ（ＢＢ）－２Ａ－Ｐｕｒｏ（ＰＸ４６２）Ｖ２．０（ＦｅｎｇＺｈａｎｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ）からの寄贈品）１．５μｇとを含有するチューブに添加した。ピューロマイシン耐性ベクターでトランスフェクトした場合、エレクトロポレーションした細胞を、１０ｃｍ皿中の１０μＭのＲｏｃｋ阻害剤を含有するプレインキュベートした３７℃のｍＴｅＳＲ培地中に直ちに放出した。ピューロマイシン耐性ベクターによるトランスフェクションの２４時間後、選択を開始した。培地を吸引し、異なる濃度のピューロマイシン（１μｇ／μＬ、２μｇ／μＬ、及び４μｇ／μＬ）を含有するｍＴＥＳＲ１培地に交換した。更に２４時間後、培地を吸引し、ｍＴｅＳＲ１培地に交換した。細胞を１０日間培養した後、コロニーを採取して細胞を２４ウェルプレートに入れ、増殖させた。

ＱｉａｇｅｎＤＮｅａｓｙＢｌｏｏｄａｎｄＴｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してピューロマイシンで選択したコロニーからゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲスクリーニングして、ＳＴＭＮ２遺伝子中の目的の欠失の存在を確認した。ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲルでの電気泳動後に分析した。簡潔に述べると、標的配列を、欠失クローンを検出するために１１００ｂｐの欠失バンドを生成するように設計した、欠失の外部にある一対のプライマーによってＰＣＲ増幅した。使用したプライマーの配列は以下の通りである：ＯＵＴ＿ＦＷＤ、５’ＧＣＡＡＡＧＧＡＧＴＣＴＡＣＣＴＧＧＣＡ３’（配列番号７）及びＯＵＴ＿ＲＥＶ、５’ＧＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＣ３’（配列番号８）。ノックアウト株を、免疫ブロット分析を使用して更に確認した。

神経突起成長アッセイ
Ｓｈｏｌｌ解析に使用する個々のＴｕｊ１陽性ニューロンをランダムに選択し、４０倍の対物レンズを備えたＮｉｋｏｎＥｃｌｉｐｓｅＴＥ３００を使用して画像化した。ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）プラグインＮｅｕｒｏｎＪ（７８）を使用して神経突起を追跡し、ＦｉｊｉのＳｈｏｌｌツール（９６）を使用してＳｈｏｌｌ解析を実施し、細胞体から１０μｍ間隔での交差の数を定量化した。Ｐｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈＰａｄ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、各１０μｍ間隔につきＫＯクローンと親ＷＴ株との交差の数を比較することにより、統計分析を実施した。有意性を標準的なスチューデントのｔ検定によって評価し、ｐ＜０．０５のｐ値を有意であると見なした。

軸索切断
選別した運動ニューロンを、０．１ｍｇ／ｍｌポリ－Ｄ－リジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び５μｇ／ｍｌラミニン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でコーティングしたガラスカバースリップ上にマウントした標準的なニューロンマイクロ流体デバイス（ＳＮＤ１５０、ＸＯＮＡＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）中で、おおよそ２５０，０００ニューロン／デバイスの濃度で培養した。培養７日目に、軸索が体細胞区画の細胞体を妨げることなく実質的に切断されるまで、軸索チャンバーの真空吸引及び再潅流を繰り返すことにより軸索切断を実施した。

ＴＤＰ－４３及びＳＴＭＮ２の免疫組織化学的分析
Ｐａｒｔｎｅｒｓ及びＨａｒｖａｒｄＩＲＢプロトコルに準拠して、散発性ＡＬＳ症例３例及び対照（脊髄疾患のエビデンスなし）３例の死後試料を、ＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓＡｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓＤｉｓｅａｓｅＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ（ＡＤＲＣ）から収集した。ＴＤＰ－４３免疫反応性（ウサギポリクローナル、ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈＧｒｏｕｐ）の組織学的分析を実施して、診断を確定した。ＳＴＭＮ２分析では、ホルマリン固定腰髄切片を、ブロッキング前にクエン酸緩衝液抗原回復を実施したことを除いて、標準的な免疫組織化学的手順を使用して染色した。簡潔に述べると、試料を再水和させ、水ですすぎ、３％過酸化水素、次いで正常血清中でブロッキングし、一次ＳＴＭＮ２ウサギ由来抗体（１：１００希釈、Ｎｏｖｕｓ）とインキュベートし、続いて適切な二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗ウサギＩｇＧ、１：２００）とインキュベートして、ＡＢＣＶｅｃｔａｓｔａｉｎキット及びＤＡＢペルオキシダーゼ基質に曝露させ、ヘマトキシリンで短時間対比染色してからマウントした。各試料について複数のレベルを試験した。

ＳＴＭＮ２スプライシング解析
ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の指示に従って使用して、ニューロンから全ＲＮＡを単離した。合計３００～１０００ｎｇの全ＲＮＡを使用して、ｉＳＣＲＩＰＴキット（Ｂｉｏ－ｒａｄ）に従って逆転写によりｃＤＮＡを合成した。次に、１つの潜在性エクソン特異的プライマーを使用してＲＴ－ＰＣＲを実施し、次いで、Ａｇｉｌｅｎｔ２２００Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎを使用して解析した。

統計分析
ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイ及びＳＴＭＮ２免疫組織化学的分析の統計学的有意性を、対応のない両側スチューデントのｔ検定を使用して評価し、＊ｐ＜０．０５のｐ値を有意であると見なした。第二種の過誤は、慣習的なレベルである０．０５で制御した。

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１６．Ｖｏｌｋｅｎｉｎｇ，Ｋ．，Ｌｅｙｓｔｒａ－Ｌａｎｔｚ，Ｃ．，Ｙａｎｇ，Ｗ．，Ｊａｆｆｅｅ，Ｈ．＆Ｓｔｒｏｎｇ，Ｍ．Ｊ．ＴａｒＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｏｆ４３ｋＤａ（ＴＤＰ－４３），１４－３－３ｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｃｏｐｐｅｒ／ｚｉｎｃｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ（ＳＯＤ１）ｉｎｔｅｒａｃｔｔｏｍｏｄｕｌａｔｅＮＦＬｍＲＮＡｓｔａｂｉｌｉｔｙ．ＩｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒａｌｔｅｒｅｄＲＮＡｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｉｎａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌｓｃｌｅｒｏｓｉｓ（ＡＬＳ）．ＢｒａｉｎＲｅｓｅａｒｃｈ１３０５，１６８－１８２（２００９）．
１７．Ｂｅｎａｊｉｂａ，Ｌ．ｅｔａｌ．ＴＡＲＤＢＰｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｄｉｓｅａｓｅｗｉｔｈｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌｌｏｂａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．ＡｎｎＮｅｕｒｏｌ．６５，４７０－４７３（２００９）．
１８．Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，Ｎ．Ｊ．ｅｔａｌ．ＮｏｖｅｌＭｕｔａｔｉｏｎｓｉｎＴＡＲＤＢＰ（ＴＤＰ－４３）ｉｎＰａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＦａｍｉｌｉａｌＡｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃＬａｔｅｒａｌＳｃｌｅｒｏｓｉｓ．ＰＬｏＳＧｅｎｅｔ４，（２００８）．
１９．Ｓｒｅｅｄｈａｒａｎ，Ｊ．ｅｔａｌ．ＴＤＰ－４３ｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｆａｍｉｌｉａｌａｎｄｓｐｏｒａｄｉｃａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３１９，１６６８－１６７２（２００８）．
２０．ＶａｎＤｅｅｒｌｉｎ，Ｖ．Ｍ．ｅｔａｌ．ＴＡＲＤＢＰｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌｓｃｌｅｒｏｓｉｓｗｉｔｈＴＤＰ－４３ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ：ａｇｅｎｅｔｉｃａｎｄｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓ．ＴｈｅＬａｎｃｅｔＮｅｕｒｏｌｏｇｙ７，４０９－４１６（２００８）．
２１．Ｙｏｋｏｓｅｋｉ，Ａ．ｅｔａｌ．ＴＤＰ－４３ｍｕｔａｔｉｏｎｉｎｆａｍｉｌｉａｌａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．ＡｎｎＮｅｕｒｏｌ．６３，５３８－５４２（２００８）．
２２．Ｌｅｅ，Ｅ．Ｂ．，Ｌｅｅ，Ｖ．Ｍ．－Ｙ．＆Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｑ．Ｇａｉｎｓｏｒｌｏｓｓｅｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＴＤＰ４３－ｍｅｄｉａｔｅｄｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３，３８－５０（２０１２）．
２３．Ｋｒａｅｍｅｒ，Ｂ．Ｃ．ｅｔａｌ．ＬｏｓｓｏｆｍｕｒｉｎｅＴＤＰ－４３ｄｉｓｒｕｐｔｓｍｏｔｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｐｌａｙｓａｎｅｓｓｅｎｔｉａｌｒｏｌｅｉｎｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ．ＡｃｔａＮｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ１１９，４０９－４１９（２０１０）．
２４．Ｓｅｐｈｔｏｎ，Ｃ．Ｆ．ｅｔａｌ．ＴＤＰ－４３ｉｓａｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｅａｒｌｙｅｍｂｒｙｏｎｉｃｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５，６８２６－６８３４（２０１０）．
２５．Ｗｕ，Ｌ．－Ｓ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｗ．－Ｃ．＆Ｓｈｅｎ，Ｃ．－Ｋ．Ｊ．ＴａｒｇｅｔｅｄｄｅｐｌｅｔｉｏｎｏｆＴＤＰ－４３ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｔｈｅｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｍｏｔｏｒｎｅｕｒｏｎｓｌｅａｄｓｔｏｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌｓｃｌｅｒｏｓｉｓ－ｌｉｋｅｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓｉｎｍｉｃｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７，２７３３５－２７３４４（２０１２）．
２６．Ｙａｎｇ，Ｃ．ｅｔａｌ．ＰａｒｔｉａｌｌｏｓｓｏｆＴＤＰ－４３ｆｕｎｃｔｉｏｎｃａｕｓｅｓｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓｏｆａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１，Ｅ１１２１－９（２０１４）．
２７．Ｉｇｕｃｈｉ，Ｙ．ｅｔａｌ．ＬｏｓｓｏｆＴＤＰ－４３ｃａｕｓｅｓａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｍｏｔｏｒｎｅｕｒｏｎｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｂｒａｉｎ１３６，１３７１－１３８２（２０１３）．
２８．Ｔｏｌｌｅｒｖｅｙ，Ｊ．Ｒ．ｅｔａｌ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇｔｈｅＲＮＡｔａｒｇｅｔｓａｎｄｐｏｓｉｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｓｐｌｉｃｉｎｇｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｂｙＴＤＰ－４３．ＮａｔＮｅｕｒｏｓｃｉ１４，４５２－４５８（２０１１）．
２９．Ｄａｖｉｓ－Ｄｕｓｅｎｂｅｒｙ，Ｂ．Ｎ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｌ．Ａ．，Ｋｌｉｍ，Ｊ．Ｒ．＆Ｅｇｇａｎ，Ｋ．Ｈｏｗｔｏｍａｋｅｓｐｉｎａｌｍｏｔｏｒｎｅｕｒｏｎｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１４１，４９１－５０１（２０１４）．
３０．Ｈａｎ，Ｓ．Ｓ．Ｗ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｌ．Ａ．＆Ｅｇｇａｎ，Ｋ．Ｃ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇａｎｄｄｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇｓｔｅｍｃｅｌｌｍｏｄｅｌｓｏｆｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｎ７０，６２６－６４４（２０１１）．
３１．Ｋｉｓｋｉｎｉｓ，Ｅ．ｅｔａｌ．ＰａｔｈｗａｙｓｄｉｓｒｕｐｔｅｄｉｎｈｕｍａｎＡＬＳｍｏｔｏｒｎｅｕｒｏｎｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｈｒｏｕｇｈｇｅｎｅｔｉｃｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎｏｆｍｕｔａｎｔＳＯＤ１．ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ１４，７８１－７９５（２０１４）．
３２．ｖａｎＥｅｒｓｅｌ，Ｊ．ｅｔａｌ．ＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎａｎｄａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎｏｆＴＤＰ－４３ｕｐｏｎｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｉｎｃｕｌｔｕｒｅｄｎｅｕｒｏｎｓ．ＰＬｏＳＯＮＥ６，ｅ２２８５０（２０１１）．
３３．ＤｉＧｉｏｒｇｉｏ，Ｆ．Ｐ．，Ｂｏｕｌｔｉｎｇ，Ｇ．Ｌ．，Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚ，Ｓ．＆Ｅｇｇａｎ，Ｋ．Ｃ．ＨｕｍａｎＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌ－ＤｅｒｉｖｅｄＭｏｔｏｒＮｅｕｒｏｎｓＡｒｅＳｅｎｓｉｔｉｖｅｔｏｔｈｅＴｏｘｉｃＥｆｆｅｃｔｏｆＧｌｉａｌＣｅｌｌｓＣａｒｒｙｉｎｇａｎＡＬＳ－ＣａｕｓｉｎｇＭｕｔａｔｉｏｎ．ＳｔｅｍＣｅｌｌ３，６３７－６４８（２００８）．
３４．Ａｍｏｒｏｓｏ，Ｍ．Ｗ．ｅｔａｌ．Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄｈｉｇｈ－ｙｉｅｌｄｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｌｉｍｂ－ｉｎｎｅｒｖａｔｉｎｇｍｏｔｏｒｎｅｕｒｏｎｓｆｒｏｍｈｕｍａｎｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ３３，５７４－５８６（２０１３）．
３５．Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｓ．Ｍ．ｅｔａｌ．ＨｉｇｈｌｙｅｆｆｉｃｉｅｎｔｎｅｕｒａｌｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆｈｕｍａｎＥＳａｎｄｉＰＳｃｅｌｌｓｂｙｄｕａｌｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＳＭＡＤｓｉｇｎａｌｉｎｇ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２７，２７５－２８０（２００９）．
３６．Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｓ．Ｍ．ｅｔａｌ．Ｃｏｍｂｉｎｅｄｓｍａｌｌ－ｍｏｌｅｃｕｌｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｔｉｍｉｎｇａｎｄｃｏｎｖｅｒｔｓｈｕｍａｎｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｔｏｎｏｃｉｃｅｐｔｏｒｓ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３０，７１５－７２０（２０１２）．
３７．Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ，Ｉ．Ｒ．Ａ．ｅｔａｌ．ＰａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌＴＤＰ－４３ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓｓｐｏｒａｄｉｃａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌｓｃｌｅｒｏｓｉｓｆｒｏｍａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌｓｃｌｅｒｏｓｉｓｗｉｔｈＳＯＤ１ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．ＡｎｎＮｅｕｒｏｌ．６１，４２７－４３４（２００７）．
３８．Ｌｏｖｅ，Ｍ．Ｉ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｗ．＆Ａｎｄｅｒｓ，Ｓ．ＭｏｄｅｒａｔｅｄｅｓｔｉｍａｔｉｏｎｏｆｆｏｌｄｃｈａｎｇｅａｎｄｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎｆｏｒＲＮＡ－ｓｅｑｄａｔａｗｉｔｈＤＥＳｅｑ２．ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌｏｇｙ１５，５５０（２０１４）．
３９．Ａｒｎｏｌｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔａｌ．ＡＬＳ－ｌｉｎｋｅｄＴＤＰ－４３ｍｕｔａｔｉｏｎｓｐｒｏｄｕｃｅａｂｅｒｒａｎｔＲＮＡｓｐｌｉｃｉｎｇａｎｄａｄｕｌｔ－ｏｎｓｅｔｍｏｔｏｒｎｅｕｒｏｎｄｉｓｅａｓｅｗｉｔｈｏｕｔａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎｏｒｌｏｓｓｏｆｎｕｃｌｅａｒＴＤＰ－４３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１０，Ｅ７３６－４５（２０１３）．
４０．Ｆｉｅｓｅｌ，Ｆ．Ｃ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｓ．Ｓ．，Ｓｕｐｐｅｒ，Ｊ．，Ｚｅｌｌ，Ａ．＆Ｋａｈｌｅ，Ｐ．Ｊ．ＴＤＰ－４３ｒｅｇｕｌａｔｅｓｇｌｏｂａｌｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｙｉｅｌｄｂｙｓｐｌｉｃｉｎｇｏｆｅｘｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎｃｏｍｐｌｅｘｃｏｍｐｏｎｅｎｔＳＫＡＲ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ４０，２６６８－２６８２（２０１２）．
４１．Ｐｒｕｄｅｎｃｉｏ，Ｍ．ｅｔａｌ．Ｍｉｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｓｏｒｔｉｌｉｎｓｐｌｉｃｉｎｇｌｅａｄｓｔｏｔｈｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆａｎｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｐｒｏｇｒａｎｕｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ．ＰＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵｓａ１０９，２１５１０－２１５１５（２０１２）．
４２．Ｙａｎｇ，Ｃ．ｅｔａｌ．ＰａｒｔｉａｌｌｏｓｓｏｆＴＤＰ－４３ｆｕｎｃｔｉｏｎｃａｕｓｅｓｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓｏｆａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１，Ｅ１１２１－９（２０１４）．
４３．Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｅ．，Ｊａｃｏｂ，Ｌ．，Ｍａｉｒａｌ，Ｊ．＆Ｖｅｒｔ，Ｊ．－Ｐ．ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＲＮＡｉｓｏｆｏｒｍｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｒｏｍＲＮＡ－Ｓｅｑｄａｔａｗｉｔｈｎｅｔｗｏｒｋｆｌｏｗｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ３０，２４４７－２４５５（２０１４）．
４４．Ｂｒｙａｎｔ，Ｄ．Ｗ．，Ｐｒｉｅｓｔ，Ｈ．Ｄ．＆Ｍｏｃｋｌｅｒ，Ｔ．Ｃ．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓｐｌｉｃｉｎｇｖａｒｉａｎｔｓｕｓｉｎｇＲＮＡ－ｓｅｑ．ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ８８３，９７－１１０（２０１２）．
４５．Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．ｅｔａｌ．ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｅｎｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｗｉｔｈＲＮＡ－ｓｅｑ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３１，４６－５３（２０１３）．
４６．Ｓｈｉｇａ，Ａ．ｅｔａｌ．ＡｌｔｅｒａｔｉｏｎｏｆＰＯＬＤＩＰ３ＳｐｌｉｃｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＬｏｓｓｏｆＦｕｎｃｔｉｏｎｏｆＴＤＰ－４３ｉｎＴｉｓｓｕｅｓＡｆｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈＡＬＳ．ＰＬｏＳＯＮＥ７，（２０１２）．
４７．Ｇｒｅｎｎｉｎｇｌｏｈ，Ｇ．，Ｓｏｅｈｒｍａｎ，Ｓ．，Ｂｏｎｄａｌｌａｚ，Ｐ．，Ｒｕｃｈｔｉ，Ｅ．＆Ｃａｄａｓ，Ｈ．ＲｏｌｅｏｆｔｈｅｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓＳＣＧ１０ａｎｄｓｔａｔｈｍｉｎｉｎｎｅｕｒｏｎａｌｇｒｏｗｔｈ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．５８，６０－６９（２００４）．
４８．Ｓｈｉｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｇｅｉｓｌｅｒ，Ｓ．＆ＤｉＡｎｔｏｎｉｏ，Ａ．ＤｙｎａｍｉｃｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＳＣＧ１０ｉｎｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇａｘｏｎｓａｆｔｅｒｉｎｊｕｒｙ．ＥｘｐＮｅｕｒｏｌ２５２，１－１１（２０１４）．
４９．Ｋａｓａｓｈｉｍａ，Ｋ．，Ｓａｋａｓｈｉｔａ，Ｅ．，Ｓａｉｔｏ，Ｋ．＆Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｈ．Ｃｏｍｐｌｅｘｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃＥＬＡＶ－ｌｉｋｅｈｕＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ３０，４５１９－４５２６（２００２）．
５０．Ｍａｒｔｉｎ，Ｋ．Ｒ．ｅｔａｌ．Ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＲＣＡＮ１ｃａｕｓｅｓＤｏｗｎｓｙｎｄｒｏｍｅ－ｌｉｋｅｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｄｅｆｉｃｉｔｓｔｈａｔａｌｔｅｒｌｅａｒｎｉｎｇａｎｄｍｅｍｏｒｙ．ＨｕｍａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ２１，３０２５－３０４１（２０１２）．
５１．Ａｒｉｙａｎｎｕｒ，Ｐ．Ｓ．ｅｔａｌ．Ｍｅｔｈａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄｎｅｕｒｏｎａｌｐｒｏｔｅｉｎＮＡＴ８ＬｉｓｔｈｅＮＡＡｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｅｎｚｙｍｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄａｃｅｔｙｌｃｏｅｎｚｙｍｅＡｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｔｈｅＣＮＳ．ＢｒａｉｎＲｅｓｅａｒｃｈ１３３５，１－１３（２０１０）．
５２．Ｂｏｕｌｔｉｎｇ，Ｇ．Ｌ．ｅｔａｌ．Ａｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｔｅｓｔｓｅｔｏｆｈｕｍａｎｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２９，２７９－２８６（２０１１）．
５３．Ｙｕａｎ，Ｓ．Ｈ．ｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ－ｓｕｒｆａｃｅｍａｒｋｅｒｓｉｇｎａｔｕｒｅｓｆｏｒｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ｇｌｉａａｎｄｎｅｕｒｏｎｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｈｕｍａｎｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳＯＮＥ６，ｅ１７５４０（２０１１）．
５４．Ｅｇａｗａ，Ｎ．ｅｔａｌ．ＤｒｕｇＳｃｒｅｅｎｉｎｇｆｏｒＡＬＳＵｓｉｎｇＰａｔｉｅｎｔ－ＳｐｅｃｉｆｉｃＩｎｄｕｃｅｄＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌｓ．ＳｃｉＴｒａｎｓｌＭｅｄ４，１４５ｒａ１０４－１４５ｒａ１０４（２０１２）．
５５．Ｓｅｒｉｏ，Ａ．ｅｔａｌ．Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｐａｔｈｏｌｏｇｙａｎｄｔｈｅａｂｓｅｎｃｅｏｆｎｏｎ－ｃｅｌｌａｕｔｏｎｏｍｙｉｎａｎｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｍｏｄｅｌｏｆＴＤＰ－４３ｐｒｏｔｅｉｎｏｐａｔｈｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１０，４６９７－４７０２（２０１３）．
５６．Ｂｉｌｉｃａｎ，Ｂ．ｅｔａｌ．ＭｕｔａｎｔｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｌｉｎｅｓｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅａｓｐｅｃｔｓｏｆＴＤＰ－４３ｐｒｏｔｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓａｎｄｒｅｖｅａｌｃｅｌｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９，５８０３－５８０８（２０１２）．
５７．Ｚｈａｎｇ，Ｚ．ｅｔａｌ．ＤｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＭｉｃｒｏＲＮＡ－９ｉｎｉＰＳＣ－ＤｅｒｉｖｅｄＮｅｕｒｏｎｓｏｆＦＴＤ／ＡＬＳＰａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＴＤＰ－４３Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．ＰＬｏＳＯＮＥ８，ｅ７６０５５（２０１３）．
５８．Ｍａｓｏｎ，Ｍ．，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ａ．Ｒ．，Ｇｒｅｎｎｉｎｇｌｏｈ，Ｇ．＆Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐ．Ｎ．ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＳＣＧ１０ａｎｄＣＡＰ－２３ｉｓｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｘｏｎｓｏｆｐｅｒｉｐｈｅｒａｌａｎｄｃｅｎｔｒａｌｎｅｕｒｏｎｓｉｎｖｉｖｏ．ＭｏｌＣｅｌｌＮｅｕｒｏｓｃｉ２０，５９５－６１５（２００２）．
５９．Ｍｏｒｉｉ，Ｈ．，Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ－Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｙ．＆Ｍｏｒｉ，Ｎ．ＳＣＧ１０，ａｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇｆａｃｔｏｒ，ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓｔｈｅｎｅｕｒｉｔｅｏｕｔｇｒｏｗｔｈｂｙｍｏｄｕｌａｔｉｎｇｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｄｙｎａｍｉｃｓｉｎｒａｔｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｄｎｅｕｒｏｎｓ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６６，１１０１－１１１４（２００６）．
６０．Ｓｈｉｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔａｌ．ＳＣＧ１０ｉｓａＪＮＫｔａｒｇｅｔｉｎｔｈｅａｘｏｎａｌｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐａｔｈｗａｙ．ＰＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵｓａ１０９，Ｅ３６９６－Ｅ３７０５（２０１２）．
６１．Ｓｏｂｃｚａｋ，Ａ．ｅｔａｌ．Ｃａｌｍｙｒｉｎ１ｂｉｎｄｓｔｏＳＣＧ１０ｐｒｏｔｅｉｎ（ｓｔａｔｈｍｉｎ２）ｔｏｍｏｄｕｌａｔｅｎｅｕｒｉｔｅｏｕｔｇｒｏｗｔｈ．ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ１８１３，１０２５－１０３７（２０１１）．
６２．Ｓｔｅｉｎ，Ｒ．，Ｍｏｒｉ，Ｎ．，Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｋ．，Ｌｏ，Ｌ．Ｃ．＆Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．ＴｈｅＮＧＦ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅＳＣＧ１０ｍＲＮＡｅｎｃｏｄｅｓａｎｏｖｅｌｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄｐｒｏｔｅｉｎｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇｒｏｗｔｈｃｏｎｅｓａｎｄａｂｕｎｄａｎｔｉｎｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｎｅｕｒｏｎｓ．Ｎｅｕｒｏｎ１，４６３－４７６（１９８８）．
６３．Ｂｉｅｃｈｅ，Ｉ．ｅｔａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｔａｔｈｍｉｎｆａｍｉｌｙｇｅｎｅｓｉｎｈｕｍａｎｔｉｓｓｕｅｓ：ｎｏｎ－ｎｅｕｒａｌ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｆｏｒＳＣＬＩＰ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ８１，４００－４１０（２００３）．
６４．Ｓｍｉｔｈ，Ｂ．Ｎ．ｅｔａｌ．Ｅｘｏｍｅ－ｗｉｄｅｒａｒｅｖａｒｉａｎｔａｎａｌｙｓｉｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓＴＵＢＡ４ＡｍｕｔａｔｉｏｎｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｆａｍｉｌｉａｌＡＬＳ．Ｎｅｕｒｏｎ８４，３２４－３３１（２０１４）．
６５．Ｗｕ，Ｃ．－Ｈ．ｅｔａｌ．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅｐｒｏｆｉｌｉｎ１ｇｅｎｅｃａｕｓｅｆａｍｉｌｉａｌａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ４８８，４９９－５０３（２０１２）．
６６．Ｎｉｃｏｌａｓ，Ａ．ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅＡｎａｌｙｓｅｓＩｄｅｎｔｉｆｙＫＩＦ５ＡａｓａＮｏｖｅｌＡＬＳＧｅｎｅ．Ｎｅｕｒｏｎ９７，１２６８－１２８３．ｅ６（２０１８）．
６７．Ｇｕｅｒｒｅｉｒｏ，Ｒ．，Ｂｒａｓ，Ｊ．＆Ｈａｒｄｙ，Ｊ．ＳｎａｐＳｈｏｔ：ＧｅｎｅｔｉｃｓｏｆＡＬＳａｎｄＦＴＤ．Ｃｅｌｌ１６０，７９８－Ｕ４８５（２０１５）．
６８．Ｌａｇｉｅｒ－Ｔｏｕｒｅｎｎｅ，Ｃ．ｅｔａｌ．ＤｉｖｅｒｇｅｎｔｒｏｌｅｓｏｆＡＬＳ－ｌｉｎｋｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓＦＵＳ／ＴＬＳａｎｄＴＤＰ－４３ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｎｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｌｏｎｇｐｒｅ－ｍＲＮＡｓ．ＮａｔＮｅｕｒｏｓｃｉ１５，１４８８－１４９７（２０１２）．
６９．Ｌａｔｔａｎｔｅ，Ｓ．，Ｒｏｕｌｅａｕ，Ｇ．Ａ．＆Ｋａｂａｓｈｉ，Ｅ．ＴＡＲＤＢＰａｎｄＦＵＳＭｕｔａｔｉｏｎｓＡｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＡｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃＬａｔｅｒａｌＳｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＳｕｍｍａｒｙａｎｄＵｐｄａｔｅ．Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．３４，８１２－８２６（２０１３）．
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９４．Ｓｏｎ，Ｅ．Ｙ．ｅｔａｌ．Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆｍｏｕｓｅａｎｄｈｕｍａｎｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｉｎｔｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｐｉｎａｌｍｏｔｏｒｎｅｕｒｏｎｓ．ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ９，２０５－２１８（２０１１）．
９５．Ｌａｂｕｎ，Ｋ．，Ｍｏｎｔａｇｕｅ，Ｔ．Ｇ．，Ｇａｇｎｏｎ，Ｊ．Ａ．，Ｔｈｙｍｅ，Ｓ．Ｂ．＆Ｖａｌｅｎ，Ｅ．ＣＨＯＰＣＨＯＰｖ２：ａｗｅｂｔｏｏｌｆｏｒｔｈｅｎｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＣＲＩＳＰＲｇｅｎｏｍｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ４４，Ｗ２７２－Ｗ２７６（２０１６）．
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実施例２：
近年、ヒト運動ニューロンにおけるＲＮＡ結合タンパク質ＴＤＰ－４３によって調節されたｍＲＮＡ転写物の同定が報告された。Ｋｌｉｍ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔａｌ．を参照されたい。ＡＬＳ関連タンパク質ＴＤＰ－４３は、運動ニューロンの成長及び修復のメディエーターであるＳＴＭＮ２のレベルを維持する。ＮａｔＮｅｕｒｏｓｃｉ，２０１９．２２（２）：ｐ．１６７－１７９。ＴＤＰ－４３はヒト運動ニューロン中の数百の転写物を調節するが、ＴＤＰ－４３枯渇により最も影響を受けた転写物のうちの１つはＳＴＭＮ２であった。ＳＴＭＮ２は微小管会合に関与するタンパク質であり、ニューロンによって発現される最も豊富な転写物のうちの１つである。データの詳細な分析により、ＴＤＰ－４３がＳＴＭＮ２転写物中の潜在性エクソンを抑制することが明らかとなった。この潜在性エクソンの包含により、完全長形態の発現が防止され、ＳＴＭＮ２タンパク質のレベルの劇的な低下がもたらされる。細胞培養物におけるＴＤＰ－４３のノックダウン、及びＴＤＰ－４３病変を示す患者由来の死後組織は、ＳＴＭＮ２スプライシングの変化を示す。潜在性エクソン含有転写物は、それ自体の終止部位及び開始部位を含有しているため、１７アミノ酸ペプチドをコードしている可能性がある。ヒトモデルにおけるこの変化を、死後脊髄由来のＲＮＡシーケンシングデータで検証した。このため、潜在性ＳＴＭＮ２転写物またはそれがコードするペプチドが、ＡＬＳを発症しているかもしくはＡＬＳを有する人々、またはＴＤＰ－４３タンパク質症（例えば、パーキンソン病、外傷性脳損傷、アルツハイマー病）を示す他の患者のＣＳＦ／体液バイオマーカーとして機能し得るか否かを考察した。

図１７Ａ～１７Ｃは、ＲＮＡをＣＳＦ由来エクソソームから容易に採取し、次いで、ｃＤＮＡに変換し、完全ＳＴＭＮ２転写物及び潜在性ＳＴＭＮ２転写物ならびに正規化のための対照ＲＮＡについてアッセイすることができることを示す（図１７Ａ）。ＴａｑＭａｎＱ－ＲＴ－ＰＣＲアッセイを、このアッセイがヒトニューロン中でＴＤＰ－４３ノックダウンアプローチを使用して完全ＳＴＭＮ２転写物及び潜在性ＳＴＭＮ２転写物の両方を同時に検出することを示すために検証した。ＳＴＭＮ２転写物をハウスキーピングリボソームサブユニットＲＮＡ１８Ｓ５に対して正規化する。ＴＤＰ－４３の細胞を枯渇させるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）またはＴＤＰ－４３ノックダウンを誘導するｓｉＲＮＡのいずれかを使用して、培養ヒトニューロン中のＴＤＰ－４３レベルを低減させた。両方の条件において、対照と比較した潜在性エクソンの強力な誘導が確認された（図１７Ｂ）。検証済みのマルチプレックスｑＰＣＲアッセイを使用して、次に、３００ｕｌの患者試料を使用してＣＳＦ由来エクソソームからＲＮＡを単離し、潜在性ＳＴＭＮ２のレベルを判定した（ｎ＝健常対照７例、ｎ＝疾患擬態２例、及びｎ＝ＡＬＳ患者９例）。対照試料と比較して、大部分のＡＬＳ試料はＳＴＭＮ２潜在性エクソンの平均レベルを上回っていることを示し、いくつかの試料は数桁高いレベルを示した（図１７Ｃ）。この比較的少ない試料のセットにおいてでさえ、ＡＬＳ患者における潜在性エクソン発現の増加が極めて有意であった（Ｐ＜０．００５）ことに留意されたい。非ＡＬＳ運動ニューロン疾患（擬態）を有する個体２例が対照レベルのスプライシングを示したことは更に注目に値する。最後に、患者データには興味深い「性質（ｔｅｘｔｕｒｅ）」があり、高レベルの発現を示す患者もいれば、より正常なレベルを示す患者もいる。比較的低レベルの患者は、その疾患の初期であるか、または非ＴＤＰ－４３疾患を有しているかのいずれかであり得るという仮説が立てられている。

ＡＬＳの最も一般的な病理学的特徴は、ＴＤＰ－４３の細胞質蓄積及び核クリアランスである。多くのグループ及び企業は、ＴＤＰ－４３の局在化及び機能におけるこれらの変化をレスキューする治療薬の開発に関心がある。しかしながら、これまでのところ、ＴＤＰ－４３機能障害またはそのレスキューをモニタリングするために生存している人に使用することができるバイオマーカーは存在しない。ここで説明するアッセイは、まさにこの方法で使用することができる。更に、ＡＬＳにおける標的としてのＳＴＭＮ２及びその潜在性スプライシング自体に関心が向けられている。このアッセイによって、臨床試験中の患者において標的の関与を直接測定することが可能になる。

実施例３
患者の背景
患者は現在４０歳の男性であり、ＡＬＳの症状は、左手の脱力感を伴って２０１７年４月に最初に始まった。脱力感は次第に悪化し、両手及び両腕の萎縮を伴うまでに広がった。２０１８年５月頃、患者は脚の痙縮、脱力感、及び萎縮、ならびに構音障害を発症し、これらは次第に悪化した。ＡＬＳの診断が２０１７年１１月に臨床的に確定し、２０１８年３月にＥＭＧ検査によって確認された。ＡＬＳの家族歴はなく、包括的なエクソーム及びゲノムスキャンでは、Ｃ９ＯＲＦ７２またはＳＯＤ１遺伝子の変異などの、ＡＬＳの原因となると証明されている変異は明らかにならなかった。

患者は、ＦＤＡが承認した３つのＡＬＳ治療薬であるリルゾール、エダラボン、及びニューデクスタを服用している。更に、患者は２０１９年６月及び１１月に韓国で自家間葉系幹細胞による処置を受けた。前述の治療にもかかわらず、患者の臨床経過及びＡＬＳＦＲＳの経過は加速している。

プロジェクトの論理的根拠
スタスミン２（ＳＴＭＮ２）は、微小管の安定性を制御する、ＣＮＳ（脊髄運動ニューロンで特に顕著）でのみ発現する１７９アミノ酸のタンパク質である。ＳＣＧ１０（上頸神経節１０）として長年研究されているＳＴＭＮ２は、損傷後の軸索再成長に不可欠である。驚くべきことに、スタスミン２の機能が、散発性ＡＬＳの多くの症例、ならびにＴＤＰ４３及びＣ９ＯＲＦ７２をコードする遺伝子の変異に起因するＡＬＳにおいて抑制されることが、２０１９年に２つの重要な論文により別々に証明された（１、２）。これらの知見は、最近、第３のラボによって独立して確認された（３）。

重要なことに、これらの研究により、ヒト運動ニューロンにおける最も豊富な転写物の１つであるＳＴＭＮ２が、ＴＤＰ－４３と相互作用する中心的ＲＮＡとして同定された。これらはまた、老化、環境への曝露、損傷、またはＡＬＳ／ＦＴＤの原因となる変異に起因するタンパク質恒常性の破壊が、ＴＤＰ４３の誤局在化、凝集、及びＲＮＡ代謝の変化（ほぼ全ての散発性ＡＬＳ症例に存在する病態）を招くという、散発性ＡＬＳにおける機序にそれぞれ裏付けを与えた。ＴＤＰ－４３機能の喪失により多くの転写物の存在量が変化するが、ＴＤＰ－４３ノックダウンまたは機能喪失後のＳＴＭＮ２の急激な喪失は、ＳＴＭＮ２をＴＤＰ－４３病変及び軸索を保護しニューロパチーを予防する機序の破壊に結び付ける説得力のあるエビデンスを提供する。

この印象的な最近の文献を踏まえて、患者から組織をサンプリングし、患者の運動ニューロンへの影響をモデル化するための培養条件を考案した。この経路及び患者の細胞を対象とした一連の試験を、エクソン１と２の間のイントロンでＴＤＰ－４３がＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡに結合するＳＴＭＮ２のＴＤＰ－４３調節の機序を試験するために行った。ＴＤＰ－４３レベルの低減または核外輸送のいずれかは、潜在性エクソンの早期のポリアデニル化及びスプライシングにより、完全長転写物を代償としてトランケートされたＳＴＭＮ２ｍＲＮＡ転写物がもたらされるという、ＳＴＭＮ２に関する同じ結果を招く（図８１）。したがって、脊髄性筋萎縮症に対するヌシネルセンの成功を考慮すると、ＳＴＭＮ２のＴＤＰ－４３調節は、疾患バイオマーカーとして、または更にはスプライススイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチドの治療標的として機能する可能性があるように思われる。

大規模スクリーニング後、３つのＡＳＯのパネルを同定した。うち１つ（ＳＪ＋９４）は、（ｉ）患者の運動ニューロンにおけるＴＤＰ－４３誘導性ＳＴＭＮ２ミススプライシングを効果的に補正し、（ｉｉ）非毒性である。パネル内の他の２つのＡＳＯについても、更に分析を実施した。

患者の運動ニューロンは、健常個体と比較した場合に核内ＴＤＰ－４３が少ない
ＳＪ＋９４及びＳＪ－１を含むパネル内のＡＳＯに最終的に至った科学的発見は、（１）散発性ＡＬＳ患者はＴＤＰ－４３が誤局在化していること、すなわち、健常個体と比較した場合に核内ＴＤＰ－４３が少ないこと、及び（２）このＴＤＰ－４３の誤局在化が、散発性ＡＬＳ患者において患者の疾患進行を促進するトランケートされた潜在性ＳＴＭＮ２をもたらす、ＳＴＭＮ２のミススプライシングの原因となることである。

患者から提供された細胞から細胞をリプログラミングして、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）ＭＧＨ１３８を作製した（図８４Ａ）。幹細胞株（ＭＧＨ１３８）の遺伝子型が患者のものであることを、配列解析を使用して確認した（図８４Ｂ）。この確認の上で、幹細胞由来の運動ニューロン（ｈＭＮ）を患者のｉＰＳ細胞から作製した（図８４Ｃ～８４Ｄ）。次に、患者の運動ニューロンを、本明細書に記載のｉｎｖｉｔｒｏ概念実証試験の全てに使用した。

患者の運動ニューロンを作製後、患者の運動ニューロンと健常対照の核内ＴＤＰ－４３に何らかの差異があるか否かを確認することを決定した。前述の通り、細胞質誤局在化として現れる可能性がある核内ＴＤＰ－４３の喪失は、死後ＣＮＳ組織の複数の分析に基づく散発性ＡＬＳの病理学的特徴である。運動ニューロン中での検出は死後組織よりもはるかに困難であるが、少なくとも１つの先行研究では、ＡＬＳ患者のｉＰＳＣ由来ニューロンが、ＴＤＰ－４３病変（その細胞質誤局在化を含む）を再現できることが報告されている。

患者のｉＰＳ細胞及び健常対照５例のｉＰＳＣ細胞株からニューロンを単離した。免疫細胞化学を使用して、ニューロンにおけるＴＤＰ－４３の細胞内局在化を探索した（図８５Ａ）。対照ニューロンでは、ピアソン係数分析を用いて主に核内ＴＤＰ－４３染色が観察され、これによりＴＤＰ－４３免疫染色とＤＮＡ対比染色との間の強い相関が明らかとなった（図８５Ｂ）。対照的に、患者ｉＰＳ細胞由来ニューロンは、ＴＤＰ－４３と核染色との間の相関の減少を示し、これは、対照と比較して患者の運動ニューロンにおける核内ＴＤＰ－４３のレベルが低いことを示すものであり、患者におけるＴＤＰ－４３病変が確認された（図８５Ｂ）。

患者特異的ｉｎｖｉｔｒｏモデル
過去２年間にわたって、公開された３つの独立した試験により、散発性ＡＬＳ患者における核内ＴＤＰ－４３の枯渇がＳＴＭＮ２のトランケーションを引き起こすことが示された。しかしながら、これらの試験には、散発性ＡＬＳ患者の死後組織が含まれていた。そのため、患者の運動ニューロンを試験して、患者のＳＴＭＮ２がＴＤＰ－４３によって同様に調節されているか否かを確認した。したがって、患者の運動ニューロンの核内ＴＤＰ－４３レベルが非ＡＬＳ対照と比較して低減していることが実証されているが、患者の運動ニューロンにおける潜在性ＳＴＭＮ２を抑制する際の（もしあれば、考えられるＡＳＯの）有効性をより明確に評価するために、このレベルをｉｎｖｉｔｒｏ細胞アッセイにおいて更に低減させた。ＴＤＰ－４３及びＳＴＭＮ２が機能不全であるという決定的な確証には、ＣＮＳ組織の詳細な分析及び切開が必要であり、これは生存ＡＬＳ患者に対しては選択されないことから、このアプローチが必要であった。更に、このｉｎｖｉｔｒｏアプローチは、散発性ＡＬＳ患者におけるｉｎｖｉｖｏＴＤＰ－４３病変（機能的ＴＤＰ－４３の喪失）と完全に一致している。

患者のＳＴＭＮ２がＴＤＰ－４３により調節されているか否かを試験するために、患者の運動ニューロンをｓｉＴＡＲＤＢＰＲＮＡで処置してＴＤＰ－４３レベルを低減させた。定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を実施してＴＤＰ－４３ｍＲＮＡレベルを測定したところ、患者の運動ニューロンにおいて、ＴＤＰ－４３ｍＲＮＡレベルが非標的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＴＲＬ）に曝露させたものと比較して低減していることが確認された（図８６Ａ）。患者の運動ニューロンにおけるＴＤＰ－４３枯渇が、ＳＴＭＮ２完全長転写物の減少及びＳＴＭＮ２ＲＮＡのトランケート（ミススプライシング）型の強力な誘導を引き起こすことが更に確認された（図８６Ｂ～８６Ｃ）。

したがって、これらの結果により、患者のＳＴＭＮ２がＴＤＰ－４３により調節されていることが確認された。更に、患者の運動ニューロンにおけるＴＤＰ－４３レベルの枯渇は、完全長転写物を代償としてトランケートされた潜在性ＳＴＭＮ２ｍＲＮＡ転写物をもたらす、ＳＴＭＮ２のミススプライシングを直接引き起こすということが確立された。これらの結果を用いて、患者の運動ニューロンにおける病理学的作用が、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した治療的調節（ヌシネルセン、エテプリルセン、ミポメルセン、ミラセン、及びジャシフセン（ｊａｃｉｆｕｓｅｎ）に使用される薬理学的アプローチ）に適用可能であるか否かを更に評価した。

ＡＳＯの設計及びスクリーニング
設計したＡＳＯが患者の遺伝子シグネチャと適合することを確実にするために、ＳＴＭＮ２潜在性エクソンの周辺領域（ＴＤＰ－４３機能不全時に保持されるイントロン領域）を、患者のｉＰＳ細胞から抽出したゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。この領域に焦点を合わせたのは、潜在性スプライス部位から潜在性ポリアデニル化部位までのＲＮＡ領域（これにはＴＤＰ－４３結合部位が含まれる）をＡＳＯの標的とすることによって、ＳＴＭＮ２転写の欠損をレスキューすることができると仮定したからである。次に、ＰＣＲ産物のサンガーシーケンシングを行い、標的領域が患者の配列と参照ゲノムとの間で完全に適合することを確認した（図８７Ａ、図８７Ｃ）。

患者の運動ニューロンのＳＴＭＮ２転写物で観察されたスプライシング欠損の補正を試みるために、この領域を標的とするＡＳＯを設計し合成した。特に、構造化されておらず、それによりＡＳＯが結合しやすい可能性があると予測されるプレｍＲＮＡの領域に相補的であるように、数個のＡＳＯを設計した（この領域は、潜在性スプライス部位以降の塩基９４～１２１である）。これらのＡＳＯを、２つの異なる化学物質（２’－Ｏ－メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ）、及びＭＯＥとロックド核酸とのキメラ。全ての配列にホスホロチオエート結合が含まれる）を使用して合成し、潜在性エクソンのちょうど５’から３’ポリアデニル化部位の範囲のイントロンに沿って並べた（図８２）。化合物にはＤＮＡが含まれていないため、これらの標的化ＡＳＯは転写物に結合し、立体的に作用して適切なＳＴＭＮ２スプライシングを促進することが予想された。

患者の運動ニューロンにおいて、合計５１個のＡＳＯを、（１）トランケートされたＳＴＭＮ２転写物の生成を抑制する能力、及び（２）完全長ＳＴＭＮ２転写物を回復させる能力についてスクリーニングした。ＡＳＯＳＪ＋９４及びＡＳＯＳＪ－１を、患者の運動ニューロンにおいて、ＳＴＭＮ２の潜在性スプライシングを抑制し、かつ（２つの異なる実験にて）完全長ＳＴＭＮ２ＲＮＡを回復させ、患者の運動ニューロンのＳＴＭＮ２タンパク質レベルを押し上げ、かつ患者の運動ニューロンの軸索再成長を促進する（すなわち、真の臨床的利益のための可能性を創出する）という能力に基づいて、下記の反復スクリーニング実験後に候補として選択した。

第１の実験では、患者の運動ニューロンをｓｉＴＡＲＤＢＰで処置し、次いで、全ＲＮＡを抽出する前に、患者の運動ニューロンをある濃度範囲（３０ｎＭ～０．０３ｎＭの範囲）にわたって様々なＡＳＯとともに培養した。抽出したＲＮＡを使用して、逆転写によってｃＤＮＡを合成した。ＲＮＡ１８Ｓ５発現を使用して正規化した、トランケートされたＳＴＭＮ２ＲＮＡ及び完全長ＳＴＭＮ２ＲＮＡの両方のレベルを、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して評価した。多くのＡＳＯが有望な結果を示す一方で、ＡＳＯＳＪ＋９４の結果は際立っていたが、これは、ＡＳＯＳＪ＋９４が患者の運動ニューロンにおいて非標的化対照ＡＳＯ－ＮＴＣと比較して、用量依存的に（ｉ）潜在性スプライシングを抑制し（図８８Ａ）、かつ（ｉｉ）完全長ＳＴＭＮ２ＲＮＡを回復させる（図８８Ｂ）ことができたからであった。更に、ＡＳＯＳＪ－１の結果は、患者の運動ニューロンにおいて非標的化対照ＡＳＯ－ＮＴＣと比較して、（ｉ）潜在性スプライシングの抑制（図９５Ａ）及び（ｉｉ）完全長ＳＴＭＮ２ＲＮＡの回復（図９５Ｂ）において有効かつ安全であった。

ＡＳＯの有効性の概要
ＡＳＯ（ＳＪ＋９４）及びＡＳＯ（ＳＪ－１）が、核内ＴＤＰ－４３が低減した場合に、患者の運動ニューロンにおいてＳＴＭＮ２の潜在性スプライシングを抑制し、完全長ＳＴＭＮ２ＲＮＡを回復したことが立証された。次に、ＴＤＰ－４３が誤局在化された場合に、別の実験パラダイムにおいてこのことが有効であると証明されるか否かを評価した。死後組織の試験により、ＴＤＰ－４３の誤局在化及び細胞質におけるその凝集が散発性ＡＬＳの特徴であることが示された。いくつかのグループは、散発性ＡＬＳ患者の死後組織で観察されるものと同類のＴＤＰ－４３の細胞質凝集が、プロテアソームの薬理学的阻害に応答して生じることを報告している（１、４）。このＴＤＰ－４３の誤局在化は、ＳＴＭＮ２を含むその転写物の発現変化を引き起こすことも示されている。

ＴＤＰ－４３の核内枯渇を誘導する、患者のニューロンにおけるプロテアソーム阻害（ＭＧ－１３２（１ｕＭ））は、ＳＴＭＮ２の発現低下をもたらした（図８９）。実際、ＡＳＯＳＪ＋９４で処置した患者の運動ニューロンは、非標的化対照ＡＳＯ（ＮＴＣ）で処置したものよりも有意に高いレベルの完全長ＳＴＭＮ２ＲＮＡを維持した（ｐ値０．００２４）（図８９）。更に、ＡＳＯＳＪ－１で処置した患者の運動ニューロンは、非標的化対照ＡＳＯ（ＮＴＣ）で処置したものよりも有意に高い（３０％高い）レベルの完全長ＳＴＭＮ２ＲＮＡを維持した（これはｐ値０．０００３に換算される）（図９６）。

ＳＴＭＮ２ＡＳＯが転写物レベルに影響を及ぼすことができることを立証及び検証した後、ＳＴＭＮ２ＡＳＯがＴＤＰ－４３の低減後に観察されたタンパク質レベルの減少もレスキューすることができるか否かの判定を試みた。患者の運動ニューロンを、ｓｉＲＮＡと、非標的化ＡＳＯ（ＮＴＣ）またはスクリーニングからのリード化合物のうちの１つのいずれかとで処置した（図９０、図９７）。陽性対照として、ＳＴＭＮ２タンパク質レベルを押し上げることがこれまでに実証されている確立されたＪＮＫ阻害剤（ＪＮＫｉ）ＳＰ６００１２５とともに、患者の運動ニューロンを培養した（１、５）。その後の免疫ブロット分析により、ＳＴＭＮ２タンパク質レベルが、ｓｉＴＤＰによる核内ＴＤＰ－４３の喪失後に低下し、ＪＮＫ阻害後に増加したことが示された（図９０）。非標的化対照ＡＳＯ（ＮＴＣ）で処置した細胞とは異なり、リード候補物では、ｓｉＲＮＡ対照のレベルまでＳＴＭＮ２が回復することが観察された。これらの総合的な結果により、試験したＡＳＯが、完全長転写物に有利に働き新生ＳＴＭＮ２ＲＮＡ転写物のトランケート型へのプロセシングを防止し、タンパク質レベルを正常に回復させることが実証された。

軸索再生に対するＡＳＯの有効性の概要
ＴＤＰ－４３の枯渇が損傷後の軸索再成長の低減につながることが過去に実証された（１）。同様の表現型が、ＳＴＭＮ２のレベルが低減したか、またはＳＴＭＮ２が完全に欠如したｈＭＮで観察され、これはＳＴＭＮ２の回復またはＳＴＭＮ２の翻訳後安定化によってレスキューすることができた（１、２）。これらの結果は、ＳＴＭＮ２をＡＬＳで観察される運動ニューロパチーに強く関連付ける。ＡＳＯＳＪ＋９４がＴＤＰ－４３枯渇及び損傷後の軸索再成長をレスキューすることができるか否かを試験するために、患者の運動ニューロンを、神経細胞体とは異なるチャンバーへの軸索成長を可能にするマイクロ流体デバイスで培養した（図９１Ａ）。デバイスの体細胞区画中で７日間培養したニューロンは、軸索をマイクロチャネルを通して軸索チャンバーへと伸長した。ニューロンをｓｉＴＡＲＤＢＰ及びＡＳＯＳＪ＋９４で処置してから、体細胞区画内の細胞体を妨害することなく軸索を切断した。次に、軸索伸長をマイクロチャネルから測定して、損傷後の再成長を評価した（図９１Ｂ、図９１Ｄ）。分析により、非標的化対照ＡＳＯと比較して、ＡＳＯＳＪ＋９４による再成長が有意に増加することが明らかとなった（図９１Ｃ）。分析により、非標的化対照ＡＳＯと比較して、ＡＳＯＳＪ－１による再成長が有意に増加し、平均値がそれぞれ２４３ｕｍ及び１７６ｕｍ（ｐ値０．００１４）であることが更に明らかとなった（図９１Ｅ）。

参照文献
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５．ＳｈｉｎＪＥ，ＭｉｌｌｅｒＢＲ，ＢａｂｅｔｔｏＥ，ＣｈｏＹ，ＳａｓａｋｉＹ，ＱａｙｕｍＳ，ＲｕｓｓｌｅｒＥＶ，ＣａｖａｌｌｉＶ，ＭｉｌｂｒａｎｄｔＪ，ＤｉＡｎｔｏｎｉｏＡ．ＳＣＧ１０ｉｓａＪＮＫｔａｒｇｅｔｉｎｔｈｅａｘｏｎａｌｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐａｔｈｗａｙ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２０１２；１０９（５２）：Ｅ３６９６－７０５．Ｅｐｕｂ２０１２／１１／２９．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２１６２０４１０９．ＰｕｂＭｅｄＰＭＩＤ：２３１８８８０２；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３５３５６７１．

当業者は、単なる通常の実験を使用して、本明細書に記載される特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、発明を実施するための形態またはその中に記載される詳細に限定されることを意図するものではない。「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」などの冠詞は、その反対が示されるか、または別途文脈から明らかでない限り、１つまたは２つ以上を意味し得る。群の１つ以上の要素の間に「または」または「及び／または」を含む請求項または説明は、その反対が示されるか、または別途文脈から明らかでない限り、１つ、２つ以上、または全ての群要素が、所与の製品またはプロセスにおいて存在するか、用いられるか、またはそれらに別途関連している場合に、満たされると考えられる。本発明は、群の正確に１つの要素が、所与の製品またはプロセスにおいて存在するか、用いられるか、またはそれらに別途関連している実施形態を含む。本発明は、２つ以上、または全ての群要素が、所与の製品またはプロセスにおいて存在するか、用いられるか、またはそれらに別途関連している実施形態を含む。更に、本発明は、請求項（当初の請求項であるかまたは後に追加された請求項であるかを問わない）のうちの１項以上からの１つ以上の制限、要素、条項、記述用語などが、別の請求項（当初のものであるかまたは後に追加されたものであるかを問わない）に導入される全ての変形、組み合わせ、及び順列を包含することを理解されたい。例えば、別の請求項に従属する任意の請求項は、任意の他の請求項、例えば、同一の基本請求項に従属する任意の他の請求項に見出される１つ以上の要素（複数可）、特徴（複数可）または制限（複数可）を含むように修正され得る。任意の１項以上の請求項を修正して、任意の１つ以上の実施形態（複数可）、要素（複数可）、特徴（複数可）などを明示的に除外することができる。例えば、任意の特定のシデロフレキシン（ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ）、シデロフレキシンモジュレーター、細胞タイプ、がんタイプなどを、任意の１項以上の請求項から除外することができる。

（ｉ）任意の分類方法、予測方法、処置選択方法、処置方法などは、試料、例えば、がんに関する分類、予測、処置選択、処置を必要とする対象から得られた試料、例えば、対象から得られたがん試料を提供するステップを含み得ること；（ｉｉ）任意の分類方法、予測方法、処置選択方法、処置方法などは、がんに関するそのような分類、予測、処置選択、または処置を、それを必要とする対象に提供するステップを含み得ることが理解されるべきである。

請求項が方法を記載している場合、本発明の特定の態様は、その方法を実施するのに適した製品、例えば、キット、薬剤、または組成物を提供する。

要素が、リストとして、例えば、マーカッシュ群形式で提示される場合、要素の各亜群も開示され、任意の要素（複数可）をこの群から除去することができる。簡潔にするためにこれらの実施形態のいくつかのみが本明細書に具体的に記載されているが、本開示は、そのような全ての実施形態を包含する。一般的に、本発明、または本発明の態様が特定の要素、特徴などを含むように言及される場合、本発明の特定の実施形態または本発明の態様が、そのような要素、特徴などからなるか、または本質的になることもまた、理解されるべきである。

本明細書で数値範囲が言及される場合、本発明は、端点が含まれる実施形態、両方の端点が除外される実施形態、及び一方の端点が含まれ、他方が除外される実施形態を含む。別途示されていない限り、両方の端点が含まれていると想定されるべきである。更に、別途示されるか、または別途文脈及び当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈上別途明確に示されない限り、その範囲の下限の単位の１０分の１まで、本発明の異なる実施形態の記載範囲内の任意の適正な値または部分範囲をとることができる。「Ｘ未満」、「Ｘより大きい」、または「少なくともＸ」などの語句が使用される場合（Ｘは数またはパーセンテージである）、任意の合理的な値が範囲の下限または上限として選択され得ることが理解されるべきである。数値のリストが本明細書に記載される場合（「少なくとも」で始まるか否かを問わない）、本発明は、リスト中の任意の２つの値によって定義される任意の介在値または範囲に関連する実施形態を含み、最も低い値を最小値と見なすことができ、最も大きな値を最大値と見なすことができることもまた、理解されるべきである。更に、パーセンテージなどの数のリストが「少なくとも」で始まる場合、この用語はリスト内の各数に適用される。数値が「約」または「およそ」で始まる本発明の任意の実施形態について、本発明は、厳密な値が記載されている実施形態を含む。数値が「約」または「およそ」で始まらない本発明の任意の実施形態について、本発明は、値が「約」または「およそ」で始まる実施形態を含む。「およそ」または「約」は、別途記載のない限りまたは別途文脈から明らか（例えば、そのような数が考えられる値の１００％を許容できないほど超える場合）でない限り、一般に、いずれかの方向（その数よりも大きいかまたは小さい）の数の１％、またはいくつかの実施形態では５％、またはいくつかの実施形態では１０％の範囲内にある数を含む。

反対のことが明確に示されない限り、２つ以上の行為を含む、本明細書で特許請求される任意の方法において、方法の行為の順序は、方法の行為が記載された順序に必ずしも限定されないが、本開示は、順序がそのように限定される実施形態を包含することが理解されるべきである。いくつかの実施形態では、方法は、個人または実体によって実施され得る。いくつかの実施形態では、方法のステップは、方法が集合的に実施されるように、２人以上の個人または２つ以上の実体によって実施され得る。いくつかの実施形態では、方法は、方法の１つ、２つ以上、または全てのステップを実施するように別の個人または実体に要求または許可することによって、少なくとも部分的に実施され得る。いくつかの実施形態では、方法は、２つ以上の実体または２人以上の個人に、それぞれが方法の少なくとも１つのステップを実施するように要求することを含む。いくつかの実施形態では、２つ以上のステップの実施は、方法が集合的に実施されるように調整される。別途示さない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書に記載の任意の製品または組成物が、「単離されている」と見なされ得ることも理解されるべきである。適用可能な場合、別途示さない限りまたは文脈から明らかでない限り、精神的に、または精神的ステップとして実施するか、またはペンもしくは鉛筆などの筆記用具及び紙などの筆記に適した表面を使用して実施するのに適し得る方法の任意の方法またはステップは、機械、例えば、コンピュータ、デバイス（装置）、またはシステムによって、少なくとも部分的に、実質的に、または全体的に実施されるものとして明示的に示すことができ、これは、いくつかの実施形態では、そのような方法もしくはステップまたはそれらの一部を実施することができるように特別に適合または設計され得ることもまた、理解されるべきである。

本明細書で使用されるセクション見出しは、いかなる意味においても限定するものであると解釈されるべきではない。任意のセクション見出しの下に提示される主題は、本明細書に記載の任意の態様または実施形態に適用可能であり得ることが明確に企図される。

本明細書の実施形態または態様は、本明細書に記載の任意の薬剤、組成物、物品、キット、及び／または方法に関し得る。任意の１つ以上の実施形態または態様は、適切な場合は常に、任意の１つ以上の他の実施形態または態様と自由に組み合わせることができることが企図される。例えば、相互に矛盾しない２つ以上の薬剤、組成物、物品、キット、及び／または方法の任意の組み合わせが提供される。本明細書における任意の場所の用語に関する任意の説明または例示は、別途示されないかまたは明白に明らかでない限り、そのような用語が本明細書中に現れる場合は常に（例えば、そのような用語が関連する任意の態様または実施形態において）適用され得ることが理解されよう。

Claims

ＳＴＭＮ２ｍＲＮＡ配列、プレｍＲＮＡ配列、または新生ＲＮＡ配列に特異的に結合し、ＳＴＭＮ２タンパク質発現を増加させる、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
ＳＴＭＮ２ｍＲＮＡ配列、プレｍＲＮＡ配列、または新生ＲＮＡ配列に特異的に結合し、それにより不完全なまたは変化したＳＴＭＮ２ＲＮＡ配列の包含を抑制または防止するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、
前記ＳＴＭＮ２ＲＮＡ配列のポリアデニル化部位に結合しない、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド。
不完全なまたは変化したＳＴＭＮ２ＲＮＡ配列が、ＴＤＰ－４３の機能が減退しているかまたはＴＤＰ病変が存在する場合に発生しかつ存在量が増加する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
潜在性エクソンをコードするＳＴＭＮ２ｍＲＮＡ配列、プレｍＲＮＡ配列、または新生ＲＮＡ配列に特異的に結合し、それによりＳＴＭＮ２ＲＮＡへの潜在性エクソンの包含を抑制または防止するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、
前記ＳＴＭＮ２ｍＲＮＡ配列、プレｍＲＮＡ配列、または新生ＲＮＡ配列のポリアデニル化部位に結合しない、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド。
５’スプライス部位、３’スプライス部位、または通常のＴＤＰ－４３結合部位を標的とするように設計されている、請求項１～４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
一本鎖領域を標的とするように設計されている、請求項１～４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
ＴＤＰ－４３結合部位とポリアデニル化部位との間に位置する一本鎖領域を標的とするように設計されている、請求項６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１つ以上のスプライス部位を標的とする、請求項１～７のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
配列番号３７～８５からなる群から選択される配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
配列番号３７～７４からなる群から選択される配列を含む、請求項９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
配列番号４０、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５６、及び配列番号７８からなる群から選択される配列を含む、請求項９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
配列番号５２を含む、請求項９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
配列番号５３、配列番号７２、及び配列番号７３からなる群から選択される配列を含む、請求項９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
配列番号７３を含む、請求項９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
配列番号５３を含む、請求項９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
ＳＴＭＮ２ＲＮＡへの潜在性エクソンの包含を抑制または防止する、請求項９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
潜在性エクソンをコードするＳＴＭＮ２ＲＮＡ配列、プレｍＲＮＡ配列、または新生ＲＮＡ配列に特異的に結合する、請求項９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
ＳＴＭＮ２タンパク質を増加させる、請求項９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５’スプライス部位、３’スプライス部位、または通常のＴＤＰ－４３結合部位を標的とするように設計されている、請求項９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
潜在性スプライス部位の近位部位、早期ポリアデニル化部位の近位部位、または潜在性スプライス部位と早期ポリアデニル化部位との間に位置する部位を標的とするように設計されている、請求項９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
一本鎖領域を標的とするように設計されている、請求項９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
ＴＤＰ－４３結合部位とポリアデニル化部位との間に位置する一本鎖領域を標的とするように設計されている、請求項９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
構造化されていない潜在性エクソン内の標的領域に結合する、請求項９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
ＴＤＰ－４３により調節される５’スプライス部位の近傍にまたはそれに隣接して結合する、請求項９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
予測されるＴＤＰ－４３結合部位の近位領域を標的とする、請求項９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
ＴＤＰ－４３の通常の結合部位を標的とする、請求項９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
配列番号３７～８５からなる群から選択される配列を含む１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、医薬組成物。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号３７～７４からなる群から選択される配列を含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号４０、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５６、及び配列番号７８からなる群から選択される配列を含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号５２を含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号５３、配列番号７２、及び配列番号７３からなる群から選択される配列を含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号７３を含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号５３を含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
前記組成物が、２つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
前記２つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、共有結合されている、請求項２７に記載の医薬組成物。
前記組成物が、３つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＳＴＭＮ２タンパク質発現を増加させる、請求項２７に記載の医薬組成物。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、５’スプライス部位、３’スプライス部位、または通常のＴＤＰ－４３結合部位を標的とするように設計されている、請求項２７に記載の医薬組成物。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、潜在性スプライス部位の近位部位、早期ポリアデニル化部位の近位部位、または潜在性スプライス部位と早期ポリアデニル化部位との間に位置する部位を標的とするように設計されている、請求項２７に記載の医薬組成物。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、一本鎖領域を標的とするように設計されている、請求項２７に記載の医薬組成物。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＴＤＰ－４３結合部位とポリアデニル化部位との間に位置する一本鎖領域を標的とするように設計されている、請求項２７に記載の医薬組成物。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、構造化されていない潜在性エクソン内の標的領域に結合する、請求項２７に記載の医薬組成物。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＴＤＰ－４３により調節される５’スプライス部位の近傍にまたはそれに隣接して結合する、請求項２７に記載の医薬組成物。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、予測されるＴＤＰ－４３結合部位の近位領域を標的とする、請求項２７に記載の医薬組成物。
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＴＤＰ－４３の通常の結合部位を標的とする、請求項２７に記載の医薬組成物。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、１つ以上のスプライス部位を標的とする、請求項２７に記載の医薬組成物。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＳＴＭＮ２ｍＲＮＡ配列、プレｍＲＮＡ配列、または新生ＲＮＡ配列に特異的に結合し、それにより不完全なまたは変化したＳＴＭＮ２ＲＮＡ配列の包含を抑制または防止する、請求項２７に記載の医薬組成物。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、潜在性エクソンをコードするＳＴＭＮ２ｍＲＮＡ配列、プレｍＲＮＡ配列、または新生ＲＮＡ配列に特異的に結合する、請求項２７に記載の医薬組成物。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＳＴＭＮ２ＲＮＡへの潜在性エクソンの包含を抑制または防止する、請求項２７に記載の医薬組成物。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、潜在性スプライシングを抑制する、請求項２７に記載の医薬組成物。
神経変性疾患を処置するための薬剤を更に含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
外傷性脳損傷を処置するための薬剤を更に含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
プロテアソーム阻害剤誘導性ニューロパチーを処置するための薬剤を更に含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
遺伝子治療薬としてＳＴＭＮ２を更に含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
ＪＮＫ阻害剤を更に含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
配列番号３７～８５からなる群から選択される１つ以上の配列を含む多量体オリゴヌクレオチドを含む、医薬組成物。
前記多量体オリゴヌクレオチドが、配列番号３７～８５からなる群から選択される２つ以上の配列を含む、請求項５６に記載の医薬組成物。
ＴＡＲＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）の機能性の減退に関連する疾患もしくは状態を処置すること、または前記疾患もしくは状態の可能性を低減させることを必要とする対象の神経細胞における、前記疾患もしくは状態を処置するか、または前記疾患もしくは状態の可能性を低減させる方法であって、
ＳＴＭＮ２タンパク質のレベルの低減を補正するアンチセンスオリゴヌクレオチドに前記神経細胞を接触させることを含み、薬剤が、標的転写物のポリアデニル化部位を標的としない、前記方法。
ＴＡＲＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）の機能性の減退に関連する疾患もしくは状態を処置すること、または前記疾患もしくは状態の可能性を低減させることを必要とする対象の神経細胞における、前記疾患もしくは状態を処置するか、または前記疾患もしくは状態の可能性を低減させる方法であって、
ＳＴＭＮ２タンパク質発現を増加させるアンチセンスオリゴヌクレオチドに前記神経細胞を接触させることを含む、前記方法。
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、潜在性エクソンをコードするＳＴＭＮ２ＲＮＡ配列、プレＲＮＡ配列、または新生ＲＮＡ配列に特異的に結合する、請求項５９に記載の方法。
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、５’スプライス部位、３’スプライス部位、または通常のＴＤＰ－４３結合部位を標的とするように設計されている、請求項５９に記載の方法。
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、潜在性スプライス部位の近位部位、早期ポリアデニル化部位の近位部位、または潜在性スプライス部位と早期ポリアデニル化部位との間に位置する部位を標的とするように設計されている、請求項５９に記載の方法。
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、一本鎖領域を標的とするように設計されている、請求項５９に記載の方法。
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＴＤＰ－４３結合部位とポリアデニル化部位との間に位置する一本鎖領域を標的とするように設計されている、請求項５９に記載の方法。
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、構造化されていない潜在性エクソン内の標的領域に結合する、請求項５９に記載の方法。
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＴＤＰ－４３により調節される５’スプライス部位の近傍にまたはそれに隣接して結合する、請求項５９に記載の方法。
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、予測されるＴＤＰ－４３結合部位の近位領域を標的とする、請求項５９に記載の方法。
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１つ以上のスプライス部位を標的とするように設計されている、請求項５９に記載の方法。
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、正常長のまたはタンパク質をコードするＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡを回復させる、請求項５９に記載の方法。
前記対象が、ニューロンの成長及び修復の改善を示す、請求項５９に記載の方法。
前記疾患または状態が、神経変性疾患である、請求項５９に記載の方法。
前記疾患または状態が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、パーキンソン病、及びアルツハイマー病からなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
前記疾患または状態が、外傷性脳損傷である、請求項５９に記載の方法。
前記疾患または状態が、プロテアソーム阻害剤誘導性ニューロパチーである、請求項５９に記載の方法。
前記疾患または状態が、神経細胞におけるＴＤＰ－４３のレベルの変異または低減に関連する、請求項５９に記載の方法。
有効量の第２の薬剤を前記対象に投与することを更に含む、請求項５９に記載の方法。
前記第２の薬剤が、神経変性疾患を処置するために投与される、請求項７６に記載の方法。
前記第２の薬剤が、外傷性脳損傷を処置するために投与される、請求項７６に記載の方法。
前記第２の薬剤が、遺伝子治療薬として投与されるＳＴＭＮ２である、請求項７６に記載の方法。
ＴＡＲＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）の機能性の減退に関連する疾患もしくは状態を処置するか、または前記疾患もしくは前記状態の可能性を低減させることを必要とする対象の神経細胞における、前記疾患もしくは前記状態を処置するか、または前記疾患もしくは前記状態の可能性を低減させる方法であって、
ＳＴＭＮ２タンパク質のレベルの低減を補正する１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドに前記神経細胞を接触させることを含み、前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号３７～８５からなる群から選択される配列を含む、前記方法。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号３７～７４からなる群から選択される配列を含む、請求項８０に記載の方法。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号４０、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５６、及び配列番号７８からなる群から選択される配列を含む、請求項８０に記載の方法。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号５２を含む、請求項８０に記載の方法。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号５３、配列番号７２、及び配列番号７３からなる群から選択される配列を含む、請求項８０に記載の方法。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号７３を含む、請求項８０に記載の方法。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号５３を含む、請求項８０に記載の方法。
ＴＡＲＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）の機能性の減退に関連する疾患もしくは状態を処置するか、または前記疾患もしくは前記状態の可能性を低減させることを必要とする対象の神経細胞における、前記疾患もしくは前記状態を処置するか、または前記疾患もしくは前記状態の可能性を低減させる方法であって、
ＳＴＭＮ２ＲＮＡへの潜在性エクソンの包含を抑制または防止する１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドに前記神経細胞を接触させることを含み、前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号３７～８５からなる群から選択される配列を含む、前記方法。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号３７～７４からなる群から選択される配列を含む、請求項８７に記載の方法。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号４０、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５６、及び配列番号７８からなる群から選択される配列を含む、請求項８７に記載の方法。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号５２を含む、請求項８７に記載の方法。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号５３、配列番号７２、及び配列番号７３からなる群から選択される配列を含む、請求項８７に記載の方法。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号７３を含む、請求項８７に記載の方法。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号５３を含む、請求項８７に記載の方法。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、潜在性エクソンをコードするＳＴＭＮ２ＲＮＡ配列、プレＲＮＡ配列、または新生ＲＮＡ配列に特異的に結合する、請求項８７に記載の方法。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、５’スプライス部位、３’スプライス部位、または通常のＴＤＰ－４３結合部位を標的とするように設計されている、請求項８７に記載の方法。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、潜在性スプライス部位の近位部位、早期ポリアデニル化部位の近位部位、または潜在性スプライス部位と早期ポリアデニル化部位との間に位置する部位を標的とするように設計されている、請求項８７に記載の方法。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、一本鎖領域を標的とするように設計されている、請求項８７に記載の方法。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＴＤＰ－４３結合部位とポリアデニル化部位との間に位置する一本鎖領域を標的とするように設計されている、請求項８７に記載の方法。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、構造化されていない前記潜在性エクソン内の標的領域に結合する、請求項８７に記載の方法。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＴＤＰ－４３により調節される５’スプライス部位の近傍にまたはそれに隣接して結合する、請求項８７に記載の方法。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、予測されるＴＤＰ－４３結合部位の近位領域を標的とする、請求項８７に記載の方法。
前記１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＴＤＰ－４３の通常の結合部位を標的とする、請求項８７に記載の方法。
前記疾患または状態が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、パーキンソン病、及びアルツハイマー病からなる群から選択される、請求項８７に記載の方法。
前記疾患または状態が、外傷性脳損傷である、請求項８７に記載の方法。
前記疾患または状態が、プロテアソーム阻害剤誘導性ニューロパチーである、請求項８７に記載の方法。
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、潜在性スプライシングを抑制する、請求項８７に記載の方法。
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＳＴＭＮ２タンパク質発現を増加させる、請求項８７に記載の方法。
前記対象が、ニューロンの成長及び修復の改善を示す、請求項８７に記載の方法。
有効量の第２の薬剤を前記対象に投与することを更に含む、請求項８７に記載の方法。
前記第２の薬剤が、神経変性疾患を処置するために投与される、請求項１０９に記載の方法。
前記第２の薬剤が、外傷性脳損傷を処置するために投与される、請求項１０９に記載の方法。
ＴＡＲＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）の機能性の減退に関連する疾患もしくは状態を処置するか、または前記疾患もしくは前記状態の可能性を低減させることを必要とする対象の神経細胞における、前記疾患もしくは前記状態を処置するか、または前記疾患もしくは前記状態の可能性を低減させる方法であって、
ＳＴＭＮ２タンパク質のレベルの低減を補正する多量体オリゴヌクレオチドに前記神経細胞を接触させることを含み、前記多量体オリゴヌクレオチドが、配列番号３７～８５からなる群から選択される２つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、前記方法。
前記多量体オリゴヌクレオチドが、配列番号３７～７４からなる群から選択される２つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項１１２に記載の方法。
ＳＴＭＮ２タンパク質のレベルの低減を補正するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、
潜在性エクソン内の非構造化領域を標的とするように設計されている、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド。
前記潜在性エクソン内の前記非構造化領域が、潜在性スプライス部位と早期ポリアデニル化部位との間に位置する、請求項１１４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
対象におけるＳＴＭＮ２またはＥＬＡＶＬ３タンパク質のレベルの変化を検出する方法であって、
前記対象から試料を得ることと；
前記ＳＴＭＮ２またはＥＬＡＶＬ３タンパク質のレベルが変化しているか否かを検出することと、を含む、前記方法。
前記対象が、筋萎縮性側索硬化症を有する、請求項１１６に記載の方法。
前記対象が、外傷性脳損傷を有する、請求項１１６に記載の方法。
前記ＳＴＭＮ２またはＥＬＡＶＬ３のレベルが変化しているか否かを検出することが、参照試料と比較して前記ＳＴＭＮ２またはＥＬＡＶＬ３のレベルが低下しているか否かを判定することを含む、請求項１１６～１１８のいずれか１項に記載の方法。
前記ＳＴＭＮ２またはＥＬＡＶＬ３のレベルが変化しているか否かを検出することが、ＥＬＩＳＡを使用することを含む、請求項１１３～１１９のいずれか１項に記載の方法。
前記試料が、生体液試料である、請求項１１３～１２０のいずれか１項に記載の方法。