CN113614222A - 体外人血脑屏障 - Google Patents

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Abstract

本公开内容在一些实施方案中提供了具有体内血脑屏障(BBB)的功能性质的体外血脑屏障(iBBB)以及鉴定能够越过iBBB的化合物的方法。还描述了能够穿过iBBB的化合物和这样的化合物的治疗用途。

Description

体外人血脑屏障
政府支持
本发明是在美国国家卫生研究院授予的基金号为1-U54-HG008097-03的政府支持下完成的。美国政府享有本发明的某些权利。
相关申请
根据35 U.S.C.119(e)，本申请要求于2019年1月22日提交的美国临时专利申请U.S.S.N.62/795,520的优先权，该申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
脑中的血管内皮细胞形成高度选择性的屏障，其调节中枢神经系统和外周之间的分子交换。这种血脑屏障(BBB)对于适当的神经元功能、保护大脑免受病原体的侵害和严格调节细胞外液的组成是关键的。BBB被认为在神经变性和衰老中发挥着重要作用。大多数阿尔茨海默病(AD)患者和20-40％的非痴呆老年人经历沿着他们的脑血管的Aβ沉积，这是一种称为CAA的病症。脑血管淀粉样蛋白沉积损害BBB功能；结果，患有CAA的个体易于发生脑缺血、微出血、出血性中风、感染，这最终导致神经变性和认知缺陷。
发明概述
本公开内容至少部分基于有效模拟毛细血管环境的血脑屏障的3维(3D)模型的开发。令人惊讶的是，所述模型提供了用于评估淀粉样蛋白斑发展的准确系统，因此提供了用于鉴定和筛选有效减少淀粉样蛋白积累的化合物的有用系统。
因此，本公开内容的一个方面提供了一种体外血脑屏障(iBBB)，其包含人脑内皮细胞(BEC)血管的3维(3D)基质，由包封在3D基质中的人多能衍生的阳性内皮细胞的大的互连网络、在顶端表面上邻近BEC血管的人多能来源的周细胞和分散在整个3D基质中的人多能来源的星形胶质细胞组成，其中多个星形胶质细胞邻近BEC血管并具有进入血管周围空间的GFAP阳性突起。
在另一个方面，提供了包含3维(3D)基质的体外血脑屏障(iBBB)。iBBB具有人脑内皮细胞(BEC)血管，其由包封在3D基质中的内皮细胞的大的互连网络、在顶端表面上邻近BEC血管的周细胞(其中周细胞具有E4/E4基因型)和邻近BEC血管的星形胶质细胞(其中多个星形胶质细胞具有进入血管周围空间的阳性突起)组成。
在一些实施方案中，星形胶质细胞表达AQP4。在一些实施方案中，3D基质包含LAMA4。在一些实施方案中，BEC表达JAMA、PgP、LRP1和RAGE中的至少任何一种。在一些实施方案中，PgP和ABCG2表达在顶端表面。在一些实施方案中，在顶端表面上表达的PgP和ABCG2水平是在单独培养或与星形胶质细胞共培养的BEC上表达的PgP和ABCG2水平的2-3倍。在一些实施方案中，iBBB具有超过5,500Ohm×cm2的TEER，相对于单独培养或与星形胶质细胞共培养的BEC，表现出降低的分子渗透性和外排泵极化。在一些实施方案中，iBBB不与视黄酸一起培养。
在一些实施方案中，人多能细胞是iPSC衍生的CD144细胞。在其他实施方案中，使用5份内皮细胞比1份星形胶质细胞比1份周细胞产生iBBB。在其他实施方案中，使用约一百万个内皮细胞/ml、约200000个星形胶质细胞/ml和约200000个周细胞/ml产生iBBB。
在一些实施方案中，iBBB具有与毛细血管相似的尺寸。在一些实施方案中，iBBB长度是5至50微米。在一些实施方案中，iBBB长度是5至30微米。在一些实施方案中，iBBB的长度是10至20微米。在一些实施方案中，BEC细胞为毛细血管大小。在其他实施方案中，iBBB是3-50微米、5-45微米、5-40微米、5-35微米、5-30微米、5-25微米、5-20微米、5-15微米、5-10微米、8-50微米、8-45微米、8-40微米、8-35微米、8-30微米、8-25微米、8-20微米、8-15微米、8-10微米、10-50微米、10-45微米、10-40微米、10-35微米、10-30微米、10-25微米、10-20微米、10-15微米或10-12微米长度。
本发明的其他方面提供了一种鉴定化合物对血脑屏障的作用的方法，该方法提供如本文所述的iBBB，使iBBB的BEC血管与化合物接触，并检测相对于未与化合物接触的iBBB，化合物对iBBB的作用。
在一些实施方案中，化合物对iBBB的作用被测量为细胞外基质因子表达的变化。在一些实施方案中，化合物对iBBB的作用被测量为基因表达的变化。在一些实施方案中，化合物对iBBB的作用被测量为可溶性因子表达的变化。在一些实施方案中，化合物改变iBBB的一种或多种功能性质。在一些实施方案中，iBBB的功能性质是细胞迁移、分子渗透性或外排泵的极化。在一些实施方案中，化合物对iBBB的作用被测量为淀粉样蛋白沉积物的变化。
在其他方面，提供了一种鉴定淀粉样蛋白-β肽(Aβ)产生和/或积累的抑制剂的方法，该方法使产生Aβ的细胞与APOE4阳性周细胞因子和至少一种候选抑制剂接触并在有和没有所述候选抑制剂的情况下检测Aβ的量，其中在有所述候选抑制剂的情况下与所述细胞相关联的Aβ的量相对于在没有所述候选抑制剂的情况下与所述细胞相关联的Aβ的量的减少表明所述候选抑制剂是Aβ的抑制剂。
在一些实施方案中，APOE4阳性周细胞因子是在APOE4周细胞条件培养基中的可溶性因子。在一些实施方案中，所述可溶性因子是APOE蛋白。在一些实施方案中，APOE4阳性周细胞因子是周细胞产生的APOE蛋白。在一些实施方案中，产生Aβ的细胞表达APOE3。在一些实施方案中，产生Aβ的细胞具有APOE3/3基因型或APOE3/4基因型。在一些实施方案中，产生Aβ的细胞是APOE4阳性周细胞。在一些实施方案中，周细胞具有APOE4/4基因型。在一些实施方案中，周细胞具有APOE3/4基因型。在一些实施方案中，APOE4阳性周细胞因子是由与产生Aβ的细胞共孵育的APOE4周细胞产生的可溶性因子。在一些实施方案中，产生Aβ的细胞是星形胶质细胞或内皮细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括提供本文所述的iBBB，使iBBB的BEC血管与Aβ抑制剂接触，以及检测相对于未与Aβ抑制剂接触的iBBB，Aβ抑制剂对iBBB产生Aβ的作用。
在一些方面，提供了用于抑制受试者中淀粉样蛋白合成的方法。该方法涉及通过鉴定受试者为APOE4阳性来确定受试者是否患有淀粉样蛋白积累或处于发生淀粉样蛋白积累的风险中，如果受试者为APOE4阳性，则向受试者施用有效量的钙调磷酸酶/NFAT途径的抑制剂以抑制受试者中的淀粉样蛋白合成。在一些实施方案中，钙调磷酸酶/NFAT途径的抑制剂不是环孢菌素。
在其他方面中，提供一种通过向患有CAA或具有患有CAA风险的受试者施用有效量的钙调磷酸酶/NFAT途径的抑制剂以抑制所述受试者中淀粉样蛋白合成来抑制所述受试者中淀粉样蛋白合成(其中所述钙调磷酸酶/NFAT途径的抑制剂不是环孢菌素)的方法。
在其他方面，提供了一种通过向受试者施用有效量的C/EBP途径的抑制剂以抑制受试者中淀粉样蛋白合成来抑制受试者中淀粉样蛋白合成的方法。
在一些实施方案中，所述受试者患有CAA。在一些实施方案中，所述受试者患有阿尔茨海默病。在一些实施方案中，所述受试者未被诊断患有阿尔茨海默病。在一些实施方案中，不患有阿尔茨海默病。
在一些实施方案中，钙调磷酸酶/NFAT途径的抑制剂是小分子抑制剂。在一些实施方案中，钙调磷酸酶/NFAT途径的抑制剂是FK506。在一些实施方案中，钙调磷酸酶/NFAT途径的抑制剂是环孢菌素。
本发明的一个或多个实施方案的细节在以下描述中阐述。从以下附图和若干实施方案的详细描述以及所附权利要求书中，本发明的其他特征或优点将变得明显。
附图的简要说明
以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括以进一步展示本公开内容的某些方面，通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文呈现的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本公开的某些方面。
图1A-1O。体外人血脑屏障的解剖和物理性质的重构：1A，从iPSC形成的iBB的示意图，1B，iBBB染色内皮细胞标志物CD144，证明多细胞内皮血管的存在。比例尺，50μm。1C，培养两周后周细胞定位到内皮血管。用SM22(也称为TAGLN)标记周细胞和用紧密连接蛋白ZO-1标记BEC。比例尺，50μm。1D，用NG2标记周细胞和用CD144标记BEC。1E，培养两周后的星形胶质细胞围绕内皮血管。用GFAP标记星形胶质细胞和用CD144标记BEC。比例尺，50μm。1F，水通道蛋白4(AQP4)表达在BEC血管上(用ZO-1标记)，泛-星形胶质细胞标志物S100β。比例尺，50μm。1G，qRT-PCR测量据报导为BBB模型的预测标志物的基因的表达。所有表达标准化至泛-内皮标志物PECAM以解释BEC细胞数量的潜在差异。CLDN、RAGE、JAMA和LRP1；p＜0.0001。PgP；p＝0.0001，GLUT1；p＝0.0032。1H，qRT-PCR测量转运蛋白、粘附分子、外排泵和紧密结合(发现于BBB中)的表达。所有表达标准化至单独培养的BEC。Y轴是从iBBB中分离的BEC中的表达水平，其标准化至单独培养的BEC。X轴是与星形胶质细胞共培养的BEC，其标准化至单独培养的BEC。圆圈代表来自三个生物学重复和三个PCR重复的平均值。1I，描绘用于测量iBBB渗透性的跨孔设置的卡通图。1J，在跨孔(transwell)膜上共培养的BEC(ZO-1)、周细胞(SM22)和星形胶质细胞(S100β)的代表性图像。1K，来自HuVEC、HuVEC加周细胞(P)和星形胶质细胞(A)、仅BEC和iBBB的跨内皮电阻(TEER)测量。圆圈代表来自单个跨孔的单次测量。通过使用Bonferroni事后分析的单向方差分析分析了差异(p<0.0001)。1L，荧光标记分子(对单独BEC或iBBB)的渗透率。所有值都报告为每个分子穿过空白跨孔膜的渗透率的百分比。星号代表由多重学生t检验确定的显著性(FDR＝0.01)。1M，iBBB的BBB特性需要周细胞和星形胶质细胞的协同相互作用。定量4kDa葡聚糖的渗透性(在iBBB中)，并与具有2x周细胞、2x星形胶质细胞的BEC或具有小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的BEC进行比较。渗透率标准化至单独培养的BEC。使用Bonferroni多重比较的单向方差分析(p<0.0001)。1N，ABCG2表达在iBBB中上调。使用Bonferroni事后分析的单向方差分析(p<0.0001)。1O，Pgp的极化是通过罗丹明123传输测量的，对于BEC单层和iBBB，从顶端到基底外侧表面，反之亦然。将抑制剂处理的样品标准化至每个相应的未经抑制剂处理的样品。星号代表由多重学生t检验确定的显著性(FDR＝0.01)。
图2A-2L。APOE4增加iBBB中的Aβ积累。2A，描述了将iBBB暴露于外源性淀粉样蛋白-β的实验范例的卡通图。2B，Aβ选择性地积聚在非AD iBBB上，所述iBBB暴露于来自具有APP重复(APP1.1)的家族性AD患者的iPSC衍生神经元细胞条件下的培养基。iBBB衍生自来自一名健康的75岁女性的APOE3/3iPSC系(E3/3亲本)。6e10抗体识别Aβ1-16表位。比例尺，50μm。2C，APOE3/3亲本iPSC系被基因编辑为等基因APOE4/4，其允许产生基因相同的iBBB。当同时暴露于APP1.1条件培养基96小时时，等基因APOE4/4iBBB与亲本APOE3/3iBBB相比积累了更多的Aβ。比例尺，50μm。2D，使用相反基因编辑策略对两个等基因iBBB中的Aβ积累进行定量。箭头表示基因编辑的方向，向右的箭头表示从APOE3/3到APOE4/4的编辑，向左的箭头表示从APOE4/4到APOE3/3的编辑。Aβ阳性的总面积除以总细胞核，然后标准化至来自所有E3/3样品的平均淀粉样蛋白/细胞核，这样E3/E3的平均值设置为100％。使用ImageJ进行自动图像分析。学生t检验(p＝0.0114)。2E，APOE3/4杂合iBBB比APOE3/3iBBB积累显著更多的Aβ。如2D中所述进行定量。2F，描绘源自等基因APOE3/3和APOE4/4个体的iBBB的代表性图像表现出高水平的淀粉样蛋白积累(使用抗淀粉样蛋白抗体D54D2进行测定)。2G，等基因iBBB中淀粉样蛋白的定量(硫磺素T(p＝0.0258)和两种不同的淀粉样蛋白抗体D54D2(p＝0.0020)和12F4(p＝0.0054))。2H，在接种20nMAβ1-40 96小时后，剩余在iBBB培养基中的可溶性相对不可溶性Aβ1-40的定量(p＝0.0319)。2I，代表性三维IMARIS渲染图，描绘了APOE3/3和APOE4/4iBBB中血管淀粉样蛋白的积累。iBBB被允许成熟1个月，然后同时暴露于来自fAD APP1.1系的神经元条件培养基。使用IMARIS软件创建6e10和Vecad染色三维表面。测量了Vecad表面20μM内6e10的总面积。这被标准化至Vecad表面的总面积。比例尺，10μm。2J，使用IMARIS软件对血管(距BEC血管<20μm)(p＝0.0055)和非血管(距BEC血管>20μm)(p＝0.0062)进行定量。淀粉样蛋白面积被标准化至总血管面积(对每个图像)。2K，描绘星形胶质细胞标志物S100β阳性的非血管细胞中淀粉样蛋白积累的代表性图像。2L，定量显示每个等基因基因型的淀粉样蛋白阳性的星形胶质细胞数量。(p＝0.0003)。
图3A-3E。在iBBB中Aβ沉积增加需要周细胞。3A，描述E3/3和E4/4等基因细胞类型组合互换的代表性图像表明，周细胞中E4/4表达是AβiBBB积累增加所必需的。3B，对于组合基质的每个排列，等基因iBBB中Aβ积累的定量。3C，根据相对Aβ水平(低或高)分离每个等基因排列，表明E3/3和E4/4BEC和星形胶质细胞在两种情况下具有同等代表性，但是，周细胞不是。对于低Aβ条件，仅存在E3/3周细胞。相比之下，对于高Aβ条件，仅存在E4/4周细胞。3D，衍生自APO3/3的iBBB中Aβ积累的定量(3)，H9是APOE3/4杂合子，210是APOE3/3纯合子。3E，用来自E3/3(亲本)或E4/4(等基因)周细胞的周细胞条件培养基处理的等基因iBBB和APOE3/3iBBB中Aβ积累的定量。将培养基条件化48小时，并向iBBB添加1:1比例的新鲜培养基和20nM Aβ-FITC，持续96小时。
图4A-4L。APOE和钙调磷酸酶信号传导在APOE4周细胞中上调。4A，热图描绘了等基因APOE3/3和APOE4/4周细胞之间差异表达的基因(q＝0.01)。4B，APOE基因表达在APOE4/4周细胞中显著上调，而在E4/4星形胶质细胞中下调。来自不同RNA的qRT-PCR的表达值，然后用于RNAseq实验，星形胶质细胞(p＝0.0009)、周细胞(p<0.0001)。4C，等基因周细胞中APOE的免疫荧光染色和定量。比例尺，50μm。点是来自单个孔的四个独立图像的平均APOE荧光强度。每个基因型测量四个孔。未配对双尾t检验(p＝0.0005)。4D，APOE等基因周细胞中APOE蛋白的蛋白质印迹和定量。周细胞中两种组成型表达的蛋白质包括平滑肌肌动蛋白(SMA)和GAPDH。(p＝0.0033)。4E，qRT-PCR显示APOE基因表达在另外的等基因对(其从E4/4编辑到E3)和衍生自具有散发性AD的个体的iPSC系和H9 hESC系的三种APOE3/4杂合周细胞中也上调。箭头表示基因编辑的方向。所有值都标准化至所有APOE3/3(n＝4个)周细胞中的平均表达。显著性由单向方差分析(使用Bonferroni多重比较检验，对E3/3周细胞)确定(p<0.0001)。4F，小提琴图描绘了从APOE4携带者的死后海马体分离的周细胞中的APOE表达。使用双尾Wilcoxon秩和检验测量差异表达，考虑了检测到APOE表达的细胞。4G，描述APOE4携带者(n＝6个)和非携带者(n＝6个)的死后大脑中海马体NG2阳性周细胞中APOE蛋白表达的代表性图像和定量。对于每个基因型，鉴定了超过250个NG2阳性周细胞。未配对t检验，p＝0.0068。4H，通过基因敲除(KO)而缺失APOE的等基因iBBB显示出与E3/3iBBB相似的淀粉样蛋白积累。显著性显示为单向方差分析(使用Bonferroni多重比较检验)(p<0.0001)。4I，从APOE4周细胞条件培养基免疫清除APOE显著减少了APOE3 iBBB中的淀粉样蛋白积累。使用Bonferroni多重比较检验的单向方差分析(p<0.0001)。4J，APOE3/3和E4/4等基因对之间差异表达的转录因子(q<0.05)。据报道，突出显示的五个转录因子与APOE基因调控元件结合。4K，针对NFATc1和SM22染色的APOE等基因周细胞。NFATc1存在于细胞质和细胞核中。钙调磷酸酶对NFAT的去磷酸化导致NFAT易位到细胞核。对每个APOE3/3和APOE4/4每个细胞核的NFATc1染色的定量。对每个基因型分析了150个细胞。由学生t检验确定的显著性(p<0.0001)。4L，APOE3和APOE4敲入小鼠脑周细胞中Nfatc1表达。未配对的双尾t检验(p＝0.0041)。使用双尾Wilcoxon秩和检验测量，考虑了检测到APOE表达的细胞。
图5A-5N。钙调磷酸酶的抑制降低APOE表达并改善Aβ沉积。5A和5B，用DMSO、CsA、FK506或INCA6处理两周后，APOE在等基因(a)和杂合(b)周细胞中的表达。使用Bonferroni多重比较的单向方差分析(p<0.0001)。5C，在用钙调磷酸酶抑制剂CsA处理两周后，可溶性APOE蛋白显著降低。使用ELISA从三个分离的生物重复中进行周细胞条件培养基中的APOE浓度的定量。多重学生t检验。使用FDR及Benjamini和Hochberg方法确定了发现，Q＝1％。5D和5E，CsA处理使周细胞中NFATc1(d)和APOE(e)的表达下调。条形图是来自3个生物学重复的平均值。使用Bonferroni多重比较的单向方差分析(NFATc1，p＝0.0013；APOE，p<0.0001)。5F，热图描绘了用DMSO处理的等基因APOE3/3周细胞和用DMSO或2μM CsA处理的APOE4/4周细胞之间的差异表达的基因。使用斯皮尔曼秩相关与平均联接(Spearmann’sRank correlation with average linkage)来分级聚类来组织基因。盒概括出聚类在一起的基因。每个聚类的总基因显示在热图的右侧，所描述的值是来自3个独立生物重复的平均标准化计数。5G，用DMSO、CsA或FK506处理两周然后暴露于20nM Aβ-FITC 96小时的E4/4周细胞的代表性图像。5H，用DSMO、CsA或FK506处理的iBBB中Aβ积累的定量。用化学品预处理iBBB两周，然后暴露于20nM Aβ96小时。通过使用Bonferroni多重比较的单向方差分析确定显著性(p<0.0001)。(比例尺＝10μm)。5I，用DSMO、CsA或FK506处理的APOE3/4杂合iBBB中Aβ积累的定量。用化学品预处理iBBB两周，然后暴露于20nM Aβ96小时。通过使用Bonferroni多重比较的单向方差分析确定显著性(p<0.0001)。5J，用来自APOE4/4周细胞的条件培养基处理的iBBB中Aβ积累的定量，在培养基收获前用钙调磷酸酶抑制剂处理APOE4/4周细胞至少一周。使用Bonferroni多重比较的单向方差分析(p<0.0001)。5K，用环孢菌素A或媒介物处理的小鼠海马体中的APOE蛋白浓度。通过ELISA测量APOE。每个点代表来自一只小鼠的平均APOE浓度。未配对的双尾t检验(p＝0.0456)。5L，APOE4 KI x 5xFAD小鼠皮层周细胞中APOE免疫染色的代表性图像和定量，这些小鼠用环孢菌A或媒介物处理。未配对的双尾t检验(p＝0.0427)。5M，用CsA处理三周后血管APOE蛋白和淀粉样蛋白同时减少的代表性图像。5N，用媒介物或CsA处理6月龄的APOE4KI x 5XFAD雌性小鼠三周后海马体中血管淀粉样蛋白的代表性图像和定量。用两种独立的抗淀粉样蛋白抗体(6e10和12F4)检测和定量淀粉样蛋白。未配对的双尾t检验(6e10，p＝0.0055；12F4，p＝0.0242)。(比例尺＝25μm)。
图6A-6O。6A和6B，用CD144(VE-钙粘蛋白)、CD31(PECAM)、ZO1和GLUT1染色的iPSC衍生的脑内皮细胞。6C和6D，用GFAP、S100β和AQP4染色的iPSC衍生的星形胶质细胞。6E和6F，来自RNA测序的iPSC衍生的星形胶质细胞中基因的比较表达分析，这些基因据报道与星形胶质细胞相比在6E的成纤维细胞和6F的少突胶质细胞中差异最大地上调。6G、6H、6I，用CD13、SM22、NG2和SMA染色的iPSC衍生的周细胞。6J，与平滑肌细胞(SMC)相比，周细胞中最高差异上调基因的比较表达分析。表达表示为来自大量RNA测序的FPKM值。6K，与周细胞相比，SMC中最高差异上调基因的比较表达分析。表达表示为来自大量RNA测序的FPKM值。6L，与成纤维细胞相比，周细胞中前三个差异上调基因的表达。6M，与周细胞相比，成纤维细胞中前三个差异上调基因的表达。6N，iPSC衍生的周细胞中周细胞和间充质标记基因的表达。对于6E、6F、6J、6K、6L、6M，差异基因列表基于提供的分析，显示为与来自iPSC衍生的星形胶质细胞和周细胞的大量RNA测序的FPKM相比的平均计数。6O，转录组的全局分级聚类(23588个基因)表明iPSC衍生的周细胞与原代人脑周细胞聚类。通过斯皮尔曼秩相关与完全联接进行聚类。小鼠脑周细胞转录数据集获自GSE117083。来自GSE78271的动脉平滑肌细胞(SMC)数据集。
图7A-7J。7A，用CD144染色的内皮细胞的三维血管网络，比例尺＝200μm。7B，形成后一周，用SM22标记的周细胞均匀分散并且基本血管开始形成。两周后，内皮血管形成，周细胞已归巢到血管周围空间。7C，星形胶质细胞分散在整个iBBB培养物中。7D，在每种细胞类型中单独、成对和组合的AQP4的mRNA表达。7E，没有星形胶质细胞的iBBB对于AQP4不染色。在带有星形胶质细胞的iBBB中，AQP4沿着内皮血管密集染色。7F，LAMA4的免疫染色显示基质胶(Matrigel)不含LAMA4，但iBBB培养物将内皮血管周围的基底膜重塑为含有LAMA4。7G，与单独培养的BEC相比，来自iBBB培养物的BEC中的PLVAP mRNA表达上调。7H，在从培养基中去除VEGFA后，来自iBBB的BEC中的PLVAP mRNA表达下调。7I，以跨孔形式培养的iBBB表达高水平的BBB标志物CLDN5和ZO1。7J，通过Hoechst传输测量ABCG2的极化(BEC单层和iBBB从顶端到基底外侧表面，反之亦然)。将用ABCG2特异性抑制剂KO143处理的样品标准化至每个相应的非抑制剂处理的样品。星号代表由多重学生t检验确定的显著性(FDR＝0.01)。
图8A-8J。8A，从具有APP基因重复(APP1.1)的家族性AD患者iPSC产生的iBBB本身并不具有比非AD对照(AG09173)更高的淀粉样蛋白水平。8B，从具有在PSEN1基因中的家族性AD相关突变(M146I)的iPSC产生的iBBB本身并不具有比其非AD等基因对照更高的淀粉样蛋白水平。8C，由衍生自家族性AD患者的神经元细胞条件培养基具有显著更高的Aβ(1-42)。学生t检验(p＝0.0022)。8D，描绘衍生自APOE3/4个体的iBBB相对于衍生自APOE3/3个体的iBBB表现出高水平的Aβ积累的代表性图像。8E和8F，描绘衍生自等基因APOE3/3和APOE4/4个体的iBBB表现出使用抗淀粉样蛋白抗体硫磺素T(f)和12F4(e)测定的高水平淀粉样蛋白积累的代表性图像。8G和8H，暴露于20nM Aβ-FITC同种型1-40和1-42的等基因iBBB中Aβ积累的代表性图像和定量。Aβ阳性的总面积除以总细胞核，然后标准化至来自所有E3/3样品的平均淀粉样蛋白/细胞核，这样对于每个同种型E3/E3的平均值设置为100％。学生t检验，1-40，p＝0.0044；1-42，p>0.00001。8I和8J，等基因周细胞中标准化的淀粉样蛋白积累。
图9A-9C。9A，解构的iBBB中Aβ积累的定量。BPA3和BPA4分别表示所有E3/3和E4/4iBBB，其中B＝仅BEC，BA＝BEC和星形胶质细胞，BP＝BEC和周细胞。采用使用Bonferroni事后分析的单向方差分析(p<0.0001)进行分析。9B，与APOE3/3周细胞条件培养基相比，将APOE4/4星形胶质细胞暴露于APOE4/4周细胞条件培养基显著增加淀粉样蛋白积累。学生t检验，p<0.0001。9C，周细胞(NG2阳性细胞)和非周细胞(NG2阴性)细胞中APOE蛋白表达的定量和代表性图像。学生t检验，p<0.0001。
图10A-10H。10A和10B，GO分析(来自Toppfun)描绘了与上调(a)和下调(b)基因相关的生物过程。10C和10D，通过RNA测序测量的等基因周细胞(c)和星形胶质细胞(d)中APOE的表达，每个条件代表三个生物学重复，周细胞，q＝0.0003，星形胶质细胞，q＝0.0006。10E，小提琴图描绘了从APOE4携带者(n＝7个)的死后前额叶皮层分离的周细胞中的APOE表达与非携带者(n＝18个)的比较。使用双尾Wilcoxon秩和检验测量差异表达(p＝0.0026)，考虑了检测到APOE表达的细胞。10F，来自APOE4携带者和非携带者的死后人类前额叶皮层中APOE蛋白表达的图像和定量。未配对的双尾t检验(p＝0.023)。10G，代表性标记基因的差异图显示从人海马体分离的周细胞和内皮细胞分离成不同的细胞聚类。10H，小提琴图描绘了从APOE4携带者(n＝16个)的死后海马体中分离的内皮细胞中的APOE表达与非携带者(n＝46个)的比较。使用双尾Wilcoxon秩和检验测量差异表达，考虑了检测到APOE表达的细胞。
图11A-11L。11A，通过向iBBB培养物中添加重组APOE蛋白来增加可溶性APOE浓度增加了淀粉样蛋白的积累。使用Bonferroni事后分析的单向方差分析(p＝0.0011)K。11B和11C，描述了等基因APOE3和4周细胞中的细胞核NFATc1表达的代表性蛋白质印迹和定量。未配对学生t检验，p＝0.0254。11D，通过RNAseq测量的钙调磷酸酶催化亚基的表达。PPP3CA(q＝0.0003)；PPP3CC(q＝0.0188)。11E，通过RNAseq测量的钙调磷酸酶基因负调节因子(RCAN)的表达。RCAN2(q＝0.0003)；RCAN3(q＝0.0123)。11F，通过RNAseq测量的已知磷酸化NFAT的DYRK激酶的表达。DYRK4(q＝0.0003)。11G，周细胞中预测的NFAT反应基因VCAM1和ACTG2的表达。表达通过qRT-PCR定量并标准化E3/3细胞的平均值。显著性由使Bonferroni多重比较的单向方差分析确定(p<0.0001)。11H和11I，小提琴图描绘了从APOE4携带者(n＝16个)的死后前额叶皮层分离的周细胞中的NFATC1(h)和NFATC2(i)表达与非携带者(n＝46个)的比较。使用双尾Wilcoxon秩和检验测量差异表达，考虑了检测到APOE表达的细胞。11J和11K，小提琴图描绘了从APOE4携带者(n＝16个)的死后海马体分离的内皮细胞中的NFATC1和NFATC2表达与非携带者(n＝46个)的比较。差异表达。11L，小提琴图描绘了从APOE4携带者(n＝7个)的死后前额叶皮层分离的内皮细胞中的NFATC2表达与非携带者(n＝18个)的比较。使用双尾Wilcoxon秩和检验测量差异表达，考虑了检测到APOE表达的细胞(p＝0.035)。
图12A-12K。12A，CsA、FK506和INCA6的化学结构显示高度不同的结构。12B，使用DMSO、环孢菌素A(CsA)、FK506或INCA6两周后周细胞中PGK1、HPRT和GAPDH的表达。使用Bonferroni多重比较的单向方差分析(p<0.0001)。12C和12D，用化学品处理两周后周细胞中APOE蛋白染色的代表性免疫荧光成像。比例尺，50μm。12E，E3和E4 CsA处理的周细胞中上调和下调基因的DEG和相关GO术语。12F和12G，描述在用环孢菌素A(CsA)处理一周后APOE4KI小鼠皮层切片中APOE蛋白表达的代表性成像和定量。未配对的双尾t检验(p＝0.0009)。12H，用CsA或FK506处理1周，然后暴露于20nM Aβ48小时的APOE4KI小鼠皮层切片淀粉样蛋白的定量。使用Bonferroni多重比较的单向方差分析(p＝0.0105)。12I，从用DMSO、环孢菌素A或FK506处理的APOE4敲入小鼠的脑微血管系统分离的原代周细胞中的APOE mRNA表达。使用Bonferroni多重比较的单向方差分析(p＝0.0139)。图12J，来自用环孢菌素A或媒介物处理一周的APOE4 KI x 5xFAD小鼠的海马体周细胞中APOE免疫染色的代表性图像。12K，用媒介物或CsA处理6月龄APOE4KI x5XFAD雌性小鼠海马体中血管淀粉样蛋白的代表性图像。用两种独立的抗淀粉样蛋白抗体(6e10和12F4)检测和定量淀粉样蛋白。
图13A-13C显示了APOE4/4细胞(等基因)和APOE3/3(亲本)在BBB膜渗透性方面的基因型区别。13A是显示具有位于顶端表面上的荧光分子的iBBB的示意图。13B是显示具有穿过iBBB从顶端表面到基底外侧表面的荧光分子的iBBB的示意图。13C显示，与使用亲本APOE3/3细胞产生的iBBB相比，用等基因APOE4/4细胞制备的iBBB允许荧光分子更大的渗透性和积累。
图14A-14B显示了APOE4/4细胞(等基因)和APOE3/3(亲本)在BBB膜渗透性方面的基因型区别。14A是显示具有位于顶端表面上的荧光分子的iBBB的示意图。14B是显示与使用亲本APOE3/3细胞产生的iBBB相比，用等基因APOE4/4细胞制备的iBBB允许多种化合物更大的渗透性和积累的图。
图15A-15F显示APOE4增加iBBB膜的渗透性。15A是显示与使用亲本APOE3/3细胞产生的iBBB相比，用等基因APOE4/4细胞制备的iBBB允许在iBBB的基底外侧表面上尸胺分子更大的渗透性和积累的图。15B是显示与使用亲本APOE3/3细胞产生的iBBB相比，用等基因APOE4/4细胞制备的iBBB允许在iBBB的基底外侧表面上4kDa葡聚糖分子更大的渗透性和积累的图。15C是显示与使用亲本APOE3/3细胞产生的iBBB相比，用等基因APOE4/4细胞制备的iBBB允许在iBBB的基底外侧表面上10kDa葡聚糖分子更大的渗透性和积累的图。15D是显示与使用亲本APOE3/3细胞产生的iBBB相比，用等基因APOE4/4细胞制备的iBBB允许在iBBB的基底外侧表面上BSA分子更大的渗透性和积累的图。15E是显示与使用亲本APOE3/3细胞产生的iBBB相比，用等基因APOE4/4细胞制备的iBBB允许在iBBB的基底外侧表面上70kDa葡聚糖分子更大的渗透性和积累的图。图15F是显示与使用亲本APOE3/3细胞产生的iBBB相比，用等基因APOE4/4细胞制备的iBBB允许在iBBB的基底外侧表面上转铁蛋白分子更大的渗透性和积累的图。
图16是显示与使用亲本APOE3/3细胞产生的iBBB相比，用等基因APOE4/4细胞制备的iBBB允许在iBBB的基底外侧表面上Aβ42-FITC更大的渗透性和积累的图。
图17A-17C显示体内环孢菌素A减少皮层周细胞内和周围的APOE。17A是显示实验步骤的示意图，其中对APOE4K1 x 5xFAD小鼠每天腹膜内注射媒介物对照或10mg/kg环孢菌素A，持续3周。定量APOE蛋白和血管淀粉样蛋白。17B是显示ELISA测定产生的结果并证明环孢菌素A导致相对于媒介物产生较少APOE蛋白的图。17C是显示海马体的免疫组织化学结果并证明环孢菌素A导致相对于媒介物积累较少APOE蛋白的图像和图。
图18A-18B显示体内环孢菌素A减少海马体血管系统中和周围的APOE和血管淀粉样蛋白。18A是显示通过海马体的免疫组织化学产生的结果并证明环孢菌素A导致相对于媒介物产生较少APOE/淀粉样蛋白的图像。18B是显示海马体的免疫组织化学结果并证明环孢菌素A导致相对于媒介物积累较少血管淀粉样蛋白的图像和图。
图19A-19D显示体内环孢菌素A和FK506在体内减少海马体血管系统中和周围的APOE和血管淀粉样蛋白。19A是显示通过海马体的免疫组织化学产生的结果并证明血管淀粉样蛋白的对照水平的图像。19B是显示通过海马体的免疫组织化学产生的结果并且证明环孢菌素A(10mg/ml)导致相对于媒介物对照产生较少淀粉样蛋白的图像。19C是显示通过海马体的免疫组织化学产生的结果并且证明FK506(10mg/ml)导致相对于媒介物对照产生较少淀粉样蛋白的图像。19D是描绘在19A-19C中产生的数据的结果的图。
发明详述
已经开发了BBB的人3D体外模型(iBBB)，其具有体内BBB的许多分子和生理特征。iBBB是毛细血管系统的独特模型，其允许分析毛细血管转运和活性。现有技术的人工BBB通常是2维系统和/或具有更接近模拟较大血管的较大尺寸。本发明的iBBB提供了在现有技术装置中先前所未发现的优点。
如实施例中进一步详细描述的，iBBB已在本文中被开发和广泛研究。通过广泛的分析和表征已经建立了它与生理系统的相关性。iBBB被进一步设计并验证为神经变性模型。这是通过阐明最强遗传风险因子之一(APOE4)对脑血管淀粉样蛋白积累的机制。本文使用iBBB生成和描述的数据表明，APOE4的致病作用需要周细胞，即脑血管的平滑肌成分。随后的机械解剖精确指出APOE本身在APOE4周细胞中高度上调，并且上调是增加的淀粉样蛋白积累所需的。使用死后人脑组织，已经证实，与非携带者相比，APOE4携带者的人脑周细胞中APOE也上调。全转录谱分析进一步揭示了在E4周细胞中CaN/NFAT信号传导是高度活性的。进一步证实，CaN/NFAT信号传导的药理学抑制显著降低iBBB和小鼠体内脑中APOE表达，并挽救在APOE4iBBB中观察到的病理学淀粉样蛋白表型。这些发现对于脑淀粉样血管病(CAA)的治疗、诊断和进一步分析具有深远的意义。CAA是一种血管病形式，其中淀粉样β(Aβ)肽沉积在中枢神经系统的小到中等血管的壁和脑膜上。Aβ的累积与认知衰退相关。
NFAT/CaN信号传导在认知衰老和神经变性期间被上调。在老年大鼠中，CaN的上调导致认知表现差。尽管上调的NFAT/CaN信号传导与神经变性有关，但NFAT/CaN是否在神经变性中具有因果作用仍然未知。关于CaN和NFAT是否是治疗神经变性疾病如阿尔茨海默病(AD)的可行靶标以及谁将受益于这些治疗的不确定性已经限制了该领域中治疗策略的开发。本文所述的结果在理解系统和鉴定用于治疗与Aβ在小血管上沉积相关的疾病的治疗靶标方面提供了显著的进展。数据鉴定了细胞类型(周细胞)、可溶性因子(APOE)和调节途径(钙调磷酸酶/NFAT)，APOE4通过该途径起作用以诱发CAA病理。还证明iBBB模拟BBB渗透性的基因型相关差异。使用死后人脑组织和小鼠模型进一步验证了这些观察与人类神经生物的相关性，以证明这些细胞和分子洞察可以被转化到体内设定用于治疗干预。通过多个证据线，已显示iBBB是易处理的模型，并且提供了关于遗传变体如何影响脑血管病理的生物学洞察，从而打开了新的治疗机会。重要的是，显示了用环孢菌素A体内治疗小鼠显示脑血管淀粉样蛋白的显著减少。
因此，在一些方面，本发明是体外血脑屏障(iBBB)，其由具有排列在其中的人脑内皮细胞(BEC)、人多能来源的周细胞和人多能来源的星形胶质细胞的3维(3D)基质组成。人脑内皮细胞(BEC)形成由人多能来源的阳性内皮细胞的大的互联网络组成的血管。
血管的尺寸为毛细血管的量级。毛细血管是位于身体组织内运输血液的极小血管。毛细血管的尺寸度量为直径约5-10微米。毛细血管壁是薄的并且由内皮组成。iBBB的长度为约5至50微米的量级。在一些实施方案中，iBBB长度是5至30微米。在一些实施方案中，iBBB长度是10至20微米。在其他实施方案中，iBBB长度是3-50微米、5-45微米、5-40微米、5-35微米、5-30微米、5-25微米、5-20微米、5-15微米、5-10微米、8-50微米、8-45微米、8-40微米、8-35微米、8-30微米、8-25微米、8-20微米、8-15微米、8-10微米、10-50微米、10-45微米、10-40微米、10-35微米、10-30微米、10-25微米、10-20微米、10-15微米或10-12微米。
内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞任选地是人多能来源的细胞。例如，细胞可以是iPSC衍生的细胞，例如iPSC衍生的CD144阳性细胞。自体诱导的多能干细胞(iPSC)能够分化成三个胚层的任何细胞类型：内胚层(例如胃连接、胃肠道、肺等)、中胚层(例如肌肉、骨、血液、泌尿生殖组织等)或外胚层(例如表皮组织和神经系统组织)。术语“多能细胞”是指能够自我更新和增殖同时保持未分化状态并且在适当条件下能被诱导分化成特化细胞类型的细胞。多能细胞涵盖胚胎干细胞和其他类型的干细胞，包括胎儿、羊膜或体干细胞。示例性的人类干细胞系包括H9人类胚胎干细胞系。其他示例性干细胞系包括通过美国国家健康研究所人类胚胎干细胞登记处和Howard Hughes医学研究所HUES保藏中心获得的那些。
多能干细胞还涵盖诱导的多能干细胞，或iPSC，一种来源于非多能细胞的多能干细胞。亲代细胞的例子包括已经通过各种方法重编程以诱导多能性、未分化表型的体细胞。这种“iPS”或“iPSC”细胞可以通过诱导某些调控基因的表达或通过某些蛋白质的外源应用来产生。诱导iPS细胞的方法是本领域已知的。如本文所用，hiPSC是人类诱导多能干细胞，miPSC是鼠诱导多能干细胞。
将细胞接种在3D基质或支架材料上。基质或支架材料可以是例如水凝胶。基质可以由天然来源的生物材料形成，例如多糖、凝胶状蛋白质或ECM组分，其包含以下或其功能变体：琼脂糖；藻酸盐；壳聚糖；右旋糖酐；明胶；层粘连蛋白；胶原；透明质酸；纤维蛋白及其混合物。或者，基质可以是由基质胶、Myogel和Cartigel形成的水凝胶，或者是基质胶、Myogel和Cartigel与天然衍生的生物材料的组合或生物材料。水凝胶可以是线性或分支的亲水性聚合物的大分子，优选地其中聚合物是合成的，更优选地其中聚合物是聚(乙二醇)分子，并且最优选地其中聚(乙二醇)分子选自包括以下的组：聚(乙二醇)、聚脂族聚氨酯、聚醚聚氨酯、聚酯聚氨酯、聚乙烯共聚物、聚酰胺、聚乙烯醇、聚(环氧乙烷)、聚环氧丙烷、聚乙二醇、聚丙二醇、聚四亚甲基氧化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚(丙烯酸羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)及其混合物。
可以使用内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞的最佳混合物来产生3D基质。例如，在一些实施方案中，可以使用约5份内皮细胞比约1份星形胶质细胞比约1份周细胞来产生iBBB。在其他实施方案中，可以使用约一百万个内皮细胞/ml、约200000个星形胶质细胞/ml和约200000个周细胞/ml来产生iBBB。
3D基质的独特特征是细胞接种在基质上并自组装成BBB样结构。细胞排列成使BEC形成大的细胞互连网络，类似于毛细血管壁。周细胞排列在顶端表面上邻近BEC血管。人多能来源的星形胶质细胞分散在整个3D基质中。然而，一些细胞位于邻近BEC血管，并具有进入血管周围空间的GFAP阳性突起。
iBBB具有模拟体内BBB组织的结构特性。除了细胞在3D结构中组装的方式之外，在本文中发现的iBBB和细胞具有与体内BBB相关的结构特征，比如与体内BBB的细胞相关的特定基因的表达。例如星形胶质细胞表达AQP4，BEC可表达CLDN5、GLUT1、JAMA、PgP、LRP1和RAGE中的至少任一种。在一些实施方案中，BEC可表达PECAM、ABCG2、CDH5、CGN、SLC38A5、ABCC2、VWF和SLC7A5中的至少任一种。细胞还产生已经在基质中观察到的LAMA4。已发现PgP和ABCG2在iBBB的顶端表面上表达。在顶端表面上表达的PgP和ABCG2的水平是在单独培养或与星形胶质细胞共培养的BEC上表达的PgP和ABCG2的水平的2-3倍。这些重要的标志物证明了与体内BBB的相似性。
iBBB还具有模拟体内BBB组织的功能特性。与iBBB(模拟体内BBB)相关的功能特性包括，例如，超过5500Ohm×cm2的TEER，相对于单独培养或与星形胶质细胞共培养的BEC降低的分子渗透性和外排泵极化。跨内皮电阻(TEER)是跨内皮单层的电阻的测量，其用作渗透性的灵敏且可靠的定量指示。所有形成屏障的永生化内皮细胞系显示TEER值低于150Ohm/cm2。同样，外周内皮细胞如人脐带血管内皮细胞(HuVEC)具有相对高的渗透性，因此表现出低的TEER。与这些报道的观察一致，本文提供的数据证明当在跨孔构型中培养HuVEC时，TEER值约为100Ohm/cm2。与星形胶质细胞或周细胞共培养不增加HuVEC TEER值。单独培养的iPSC衍生的BEC具有显著更高的TEER值，平均5900Ohm/cm2。然而，单独培养的BEC的TEER值显示高度的变异性(SD＝+/-2150Ohm/cm2)。将BEC与周细胞和星形胶质细胞共培养在本文公开的iBBB中降低了TEER变异性(SD＝+/-513.9Ohm/cm2)并导致平均电阻的显著增加(8030Ohm/cm2)，表明iBBB比HuVEC或单独培养的BEC具有更低的渗透性。这些功能特性使iBBB在毛细血管大小的人工BBB中是独特的。
一些AD-风险基因在构成BBB的细胞中表达，并可直接影响Aβ的积累和清除。特别是载脂蛋白E(APOE)蛋白在BBB细胞中高度表达。在人类中，存在APOE的三种遗传多态性即ε2、ε3和ε4。APOE的ε4同种型(APOE4)是最显著的CAA和散发性AD的已知风险因子。细胞的基因型在iBBB和相关分析中起重要作用。在一些实施方案中，产生Aβ的细胞表达APOE3和/或APOE4。产生Aβ的细胞可具有APOE3/3基因型或APOE3/4基因型或APOE4/4基因型。在一些实施方案中，细胞具有APOE4/4基因型。
本文产生的数据显示周细胞在淀粉样蛋白-β肽(Aβ)的产生中起重要作用。鉴于这些发现，本发明的其他方面涉及通过将产生淀粉样蛋白-β肽(Aβ)的细胞与APOE4阳性周细胞因子和至少一种候选抑制剂接触，并在存在和不存在所述候选抑制剂的情况下检测Aβ的量来鉴定所述淀粉样蛋白-β肽(Aβ)产生和/或积累的抑制剂的方法，其中在存在所述候选抑制剂的情况下与所述细胞相关的Aβ的量相对于不存在所述候选抑制剂的情况下与所述细胞相关的Aβ的量的减少表明所述候选抑制剂是Aβ的抑制剂。APOE4阳性周细胞因子可以是在APOE4周细胞条件培养基中的可溶性因子，例如APOE蛋白。
该方法可以进一步涉及将本文所述的BEC血管与Aβ抑制剂接触，并检测相对于未与Aβ抑制剂接触的iBBB，Aβ抑制剂对iBBB产生Aβ的作用。
在一些方面，本发明涉及用于抑制受试者中淀粉样蛋白合成的方法。已经发现，可以基于基因型来鉴定具有淀粉样蛋白沉积或处于发展淀粉样蛋白沉积的风险的受试者，他们是否是APOE4阳性并且成功地用使用本文所述的测定鉴定的化合物治疗。如果受试者是APOE4阳性，则那些受试者处于发展Aβ病症例如CAA的风险中。然而，那些受试者对用钙调磷酸酶/NFAT途径的抑制剂治疗也敏感。尽管APOE4以前与患有某些Aβ疾病如阿尔茨海默病的患者有关，但该基因型以前没有被关联作为钙调磷酸酶/NFAT抑制活性的成功预测子。本领域在患病个体中关于该途径的抑制剂的工作没有在患者中显示一致的阳性结果。本发明的发现提供了在基因型和钙调磷酸酶/NFAT途径中的化合物和成功的治疗效用之间的联系。
NFAT(活化的T细胞的核因子)是转录激活因子。在其失活状态下，NFAT位于细胞质中，在那里它被磷酸化。细胞内Ca2+的增加导致钙调蛋白依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(CaN)的活化，其随后使NFAT去磷酸化，允许其易位至细胞核，在那里其促进基因激活。在一些实施方案中，NFAT抑制剂可以是钙核蛋白抑制剂和/或可以是脂溶性的。NFAT抑制剂可以选自：环孢菌素、环孢菌素衍生物、他克莫司衍生物、吡唑、吡唑衍生物、磷酸酶抑制剂、S1P受体调节剂、毒素、对乙酰氨基酚代谢物、真菌酚类化合物、冠状血管扩张剂、phenolic adeide、黄烷醇、噻唑衍生物、吡唑嘧啶衍生物、苯并噻吩衍生物、rocaglamide衍生物、二芳基三唑、巴比妥酸盐、抗精神病药(戊噻嗪类)、血清素拮抗剂、水杨酸衍生物、蜂胶或石榴衍生的酚类化合物、咪唑衍生物、吡啶衍生物、呋喃香豆素、生物碱、三萜、萜类化合物、类萜、寡核苷酸、肽、A 285222、桥氧酞钠、4-(氟甲基)苯基磷酸酯FMPP、去甲斑蝥素、酪氨酸磷酸化抑制剂、冈田酸、RCP1063、cya/cypa(亲环蛋白A)、isa247(voclosporin)/cypa、[dat-sar]3-cya、fk506/fkbp12、ascomyxin/fkbp12、pinecrolimus/FKBP12、pincrolimulis/FK67、1，5-二苯甲酰氧甲基-去甲斑蝥素、am404、btp1、btp2、dibefurin、双嘧达莫、棉酚、山奈黄酮醇、lie120、NCI3、PD144795、Roc-1、Roc-2、Roc-3、ST 1959(DLI111-it)、戊硫代巴比妥、戊巴比妥、丙烯硫喷妥钠、司可巴比妥、三氟拉嗪、托烷司琼、UR-1505、WIN 53071、咖啡酸苯乙酯、KRM-III、YM-53792、安石榴苷(punicalagin)、英波拉托林、喹诺酮类生物碱类化合物、impressic acid、齐墩果烷三萜、gomisin N、CaN457-482-AID、CaN424-521-AID、mFATc2106-121-SPREIT、VIVIT肽、R11-Vivit、ZIZIT cis-pro、INCA1、INCA6、INCA2、AKAP79330-357、RCAN1、RCAN1-4141-197-exon7、RCAN1-4143-163-CIC肽、RCAN1-495-118-SP重复肽、LxVPc 1肽、MCV1、VacA、A238L、和A238200-213。
钙调磷酸酶抑制剂可直接或间接地破坏钙调磷酸酶的活性。在一些实施方案中，钙调磷酸酶抑制剂是环孢菌素A、FK506(他克莫司)、吡美莫司或环孢菌素类似物，例如voclosporin。环孢菌素A和FK506都被临床上指定用作器官移植后的免疫抑制剂。其他钙调磷酸酶抑制剂是本领域已知的。例如，其他在US2019/0085040中公开的。
如本文所用，钙调磷酸酶/NFAT途径抑制剂是破坏NFAT途径活性的化合物。示例性钙调磷酸酶/NFAT抑制剂包括但不限于肽，例如抗体小分子化合物，以及可能破坏相互作用的其他化合物。钙调磷酸酶/NFAT抑制剂还包括直接抑制钙调磷酸酶/NFAT的一种或多种成分的小分子抑制剂，或抑制结合相互作用的其他试剂。在一些实施方案中，小分子抑制剂是环孢菌素或FK506。
本发明的钙调磷酸酶/NFAT抑制化合物可以表现出以下特征中的任一个或多个：(a)降低NFAT途径的活性；(b)预防、改善或治疗神经变性疾病的任何方面；(c)减轻突触功能障碍；(d)减少认知功能障碍；和(e)减少淀粉样蛋白-β肽(Aβ)积累。本领域技术人员可以根据本文提供的指导制备这样的抑制性化合物。
术语减少、干扰、抑制和压制是指相对于不存在抑制剂时的典型活性水平，活性水平部分或完全降低。例如，该降低可以是降低了至少20％、50％、70％、85％、90％、100％、150％、200％、300％或500％，或降低了10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍或104倍。
在其他实施方案中，本文所述的钙调磷酸酶/NFAT化合物是小分子，其可具有约100至20000道尔顿、500至15000道尔顿或1000至10000道尔顿中任一个的分子量。小分子文库是可商购的。可以使用本领域已知的任何方式施用小分子，包括吸入、腹膜内、静脉内、肌内、皮下、鞘内、心室内、口服、肠内、肠胃外、鼻内或经皮。通常，当本发明的钙调磷酸酶/NFAT抑制剂是小分子时，其以0.1至300mg/kg患者体重的比率施用，分成一至三或更多剂。对于正常体重的成年患者，可以施用每剂1mg至5g的剂量。
上述小分子可以从化合物文库中获得。所述文库可以是空间可寻址平行固相或溶液相文库。参见，例如Zuckerman等人，J.Med.Chem.37,2678-2685,1994和Lam AnticancerDrug Des.12:145,1997。合成化合物文库的方法是本领域公知的，例如DeWitt等人，PNASUSA90:6909,1993；Erb等人，PNAS USA 91:11422,1994；Zuckermann等人，J.Med.Chem.37:2678,1994；Cho等人，Science 261:1303,1993；Carrell等人，AngewChem.Int.Ed.Engl.33:2059,1994；Carell等人，Angew Chem.Int.Ed.Engl.33:2061,1994和Gallop等人，J.Med.Chem.37:1233,1994。化合物文库可以存在于溶液中(例如，HoughtenBiotechniques 13:412-421,1992)，或珠子上(Lam Nature 354:82-84,1991)，芯片上(Fodor Nature 364:555-556,1993)，细菌上(美国专利号5,223,409)，孢子上(美国专利号5,223,409)，质粒上(Cull等人，PNAS USA 89:1865-1869,1992)，或噬菌体上(Scott和Smith Science249:386-390,1990；Devlin Science 249:404,406,1990；Cwirla等人，PNASUSA 87:6378-6382,1990；Felici J Mol Biol.222:301-310,1991和美国专利号5,223,409)。
或者，本文所述的抑制剂可抑制钙调磷酸酶/NFAT途径的成分的表达。抑制表达的化合物包括，例如吗啉代寡核苷酸(morpholino oligonucleotides)、小干扰RNA(siRNA或RNAi)、反义核酸或核酶。RNA干扰(RNAi)是dsRNA指导信使RNA的同源序列特异性降解的过程。在哺乳动物细胞中，RNAi可以由小干扰RNA(siRNA)的21个核苷酸的双链体触发，而不激活宿主干扰素应答。本文公开的方法中使用的dsRNA可以是siRNA(含有两个独立且互补的RNA链)或短发夹RNA(即，形成紧密发夹结构的RNA链)，两者都可以基于靶基因的序列而设计。
任选地，如上所述的用于本文所述方法的核酸分子(例如反义核酸、小干扰RNA或微小RNA)含有非天然存在的核碱基、糖或共价核苷间键(internucleoside linkage)(主链)。这种修饰的寡核苷酸赋予期望的性质，例如增强的细胞摄取、对靶核酸的改善的亲和力和增加的体内稳定性。
钙调磷酸酶/NFAT抑制剂包括抗体及其片段。抗体(可以多种形式互换使用)是能够通过至少一个抗原识别位点特异性结合靶标(例如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等)的免疫球蛋白分子，所述抗原识别位点位于免疫球蛋白分子的可变区中。
如本文所用，术语“抗体”不仅包括完整的(即全长)多克隆或单克隆抗体，而且包括其抗原结合片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体和共价修饰的抗体。抗体包括任何类别的抗体，例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且抗体不需要是任何特定的类别。根据其重链恒定结构域的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。有五大类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几个可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
本文所述的抑制剂可以使用本领域已知的方法鉴定或表征，由此检测和/或测量钙调磷酸酶/NFAT途径中化合物的减少、改善或中和。此外，可以使用本领域已知的任何测定方法和/或使用本文描述的周细胞或iBBB测定从组合的化合物文库中筛选合适的钙调磷酸酶/NFAT抑制剂。
可将本文所述的钙调磷酸酶/NFAT抑制剂中的一种或多种与药学上可接受的载体(赋形剂)(包括缓冲剂)混合，以形成用于降低钙调磷酸酶/NFAT途径活性的药物组合物。“可接受的”是指载体必须与组合物的活性成分相容(并且优选地，能够稳定活性成分)并且对要接受治疗的受试者无害。如本文所用，药学上可接受的载体不包括水，并且不仅仅是天然存在的载体，例如水。在一些实施方案中，药学上可接受的载体是配制的缓冲剂、纳米载体、IV溶液等。
药学上可接受的赋形剂(载体)包括缓冲剂，其是本领域众所周知的。参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第20版，(2000)LippincottWilliams和Wilkins,Ed.K.E.Hoover。用于本发明的方法的药物组合物可包含冻干制剂或水溶液形式的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。(Remington:The Science andPractice of Pharmacy，第20版，(2000)Lippincott Williams和Wilkins,Ed.K.E.Hoover)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且可以包含缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，例如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM(聚山梨醇酯)、PLURONICSTM(泊洛沙姆)或聚乙二醇(PEG)。本文进一步描述了药学上可接受的赋形剂。
在一些实例中，本文所述的药物组合物包含含有钙调磷酸酶/NFAT抑制剂的脂质体，其可通过本领域已知的方法制备，例如Epstein,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688(1985)；Hwang,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030(1980)和U.S.专利号4,485,045和4,544,545。具有增加的循环时间的脂质体公开于美国专利号5,013,556中。特别有用的脂质体可以用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发法产生。脂质体通过限定孔径的滤器挤出，以得到具有所需直径的脂质体。
活性成分(例如钙调磷酸酶/NFAT抑制剂)也可以被包封在通过例如凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳液中。这些技术是本领域已知的，参见例如Remington，The Science andPractice of Pharmacy，第20版，Mack出版(2000)。
在其他实例中，本文所述的药物组合物可以配制成缓释形式。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质为成形物品的形式，例如膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和7-乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)、醋酸异丁酸蔗糖酯和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内施用的药物组合物必须是无菌的。这可以通过例如无菌滤膜过滤而容易地实现。治疗性抗体组合物通常置于具有无菌入口的容器中，例如具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
本文所述的药物组合物可以是单位剂型，例如片剂、丸剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、溶液或悬浮液或栓剂，用于口服、肠胃外或直肠施用，或通过吸入或吹入施用。
为了制备固体组合物如片剂，可以将主要活性成分与药物载体混合，例如常规的压片成分如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶，以及其他药物稀释剂如水，以形成含有本发明化合物或其无毒的药学上可接受的盐的均匀混合物的固体预制剂组合物。当提及这些预制剂组合物为均质时，是指活性成分均匀地分散在整个组合物中，使得组合物可以容易地细分成同等有效的单位剂型，例如片剂、丸剂和胶囊。然后将该固体预制剂组合物再分成上述类型的单位剂型，其含有0.1至约500mg的本发明活性成分。新组合物的片剂或丸剂可以被包衣或以其他方式复合，以提供具有延长作用的优点的剂型。例如，片剂或丸剂可以包含内部剂量和外部剂量组分，后者是前者上的包膜形式。这两种组分可被肠溶层分开，该肠溶层用于抵抗胃中的崩解并允许内部组分完整地进入十二指肠或延迟释放。多种材料可用于这样的肠溶层或包衣，这样材料包括多种聚合酸和聚合酸与诸如虫胶、鲸蜡醇和醋酸纤维素的材料的混合物。
合适的表面活性剂特别包括非离子试剂，如聚氧乙烯山梨醇(例如TWEENTM 20、40、60、80或85)和其他山梨醇(例如SPANTM 20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组合物将方便地包含0.05至5％的表面活性剂，并且可以是0.1至2.5％。应当理解，如果需要，可以加入其他成分，例如甘露醇或其他药学上可接受的运载体。
合适的乳剂可以使用市售脂肪乳剂如INTRALIPIDTM、LIPOSYNTM、INFONUTROLTM、LIPOFUNDINTM和LIPIPHYSANTM来制备。活性成分可以溶解在预混合的乳剂组合物中，或者可以溶解在油(例如大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)中，并且在与磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合后形成乳剂。应当理解，可以加入其他成分，例如甘油或葡萄糖，以调节乳液的张力。合适的乳液通常含有至多20％的油，例如5-20％。脂肪乳液可以包含0.1-1.0.im，特别是0.1-0.5.im的脂肪滴，并且具有5.5-8.0的pH。
乳剂组合物可以是通过将钙调磷酸酶/NFAT抑制剂与IntralipidTM(一种脂质乳剂)或其组分(大豆油、卵磷脂、甘油和水)混合而制备的那些。
用于吸入或吹入的药物组合物包括在药学上可接受的水性或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液，以及粉末。液体或固体组合物可以含有如上所述的合适的药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，通过口腔或鼻呼吸途径施用组合物以获得局部或全身效果。
可以通过使用气体来雾化优选无菌的药学上可接受的溶剂中的组合物。雾化溶液可以直接从雾化装置呼吸，或者雾化装置可以连接到面罩、氧帐或间歇式正压呼吸机上。溶液、悬浮液或粉末组合物可以从以适当方式递送制剂的装置施用，优选口服或经鼻施用。
为了实施本文公开的方法，可以将有效量的上述药物组合物通过合适的途径(例如，静脉内施用)施用至需要治疗的受试者(例如，人)。
通过本文所述方法治疗的受试者可以是患有、疑似患有神经变性疾病或处于神经变性疾病风险中的人类患者。神经变性疾病的实例包括但不限于CAA、MCI(轻度认知缺损)、创伤后应激障碍(PTSD)、阿尔茨海默病、记忆丧失、与阿尔茨海默病相关的注意力缺陷症状、与阿尔茨海默病相关的神经变性、混合血管起源的痴呆、变性起源的痴呆、早老性痴呆、老年性痴呆、与帕金森病相关的痴呆、血管性痴呆、进行性核上性麻痹或皮质基底变性。
待通过本文所述方法治疗的受试者可以是哺乳动物，更优选是人。哺乳动物包括但不限于农场动物、运动动物、宠物、灵长类、马、狗、猫、小鼠和大鼠。需要治疗的人类受试者可以是患有、有风险患有或怀疑患有神经变性疾病(例如MCI)的人类患者。患有神经变性疾病的受试者可通过常规医学检查来鉴定，例如临床检查、病史、实验室检测、MRI扫描、CT扫描或认知评估。怀疑患有神经变性疾病的受试者可显示病症的一种或多种症状，例如记忆丧失、精神错乱、抑郁、短期记忆变化和/或语言、交流、注意力和推理方面的损害。例如，与神经变性疾病相关的风险因素包括(a)年龄，(b)家族史，(c)遗传，(d)头部损伤，和(e)心脏病。
本文所用的“有效量”是指赋予受试者治疗效果所需的每种活性剂的量(单独或与一种或多种其他活性剂组合)。如本领域技术人员所知，有效量根据所治疗的具体病症、病症的严重程度、个体患者参数，包括年龄、身体状况、体型、性别和体重，治疗持续时间、同时治疗(如果有的话)的性质、施用的具体途径和健康从业者的知识和专业知识内的类似因素而变化。这些因素是本领域普通技术人员众所周知的，并且可以仅仅通过常规实验来解决。通常优选使用最大剂量的单个组分或其组合，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。然而，本领域普通技术人员将理解，出于医学原因、心理原因或实际上任何其他原因，患者可能坚持较低剂量或可耐受剂量。
经验考虑，例如半衰期，通常将有助于剂量的确定。例如，与人免疫系统相容的抗体，如人源化抗体或完全人抗体，可用于延长抗体的半衰期并防止抗体被宿主免疫系统攻击。施用频率可以在治疗过程中确定和调整，并且通常但不是必须基于神经变性疾病的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。或者，钙调磷酸酶/NFAT抑制剂的连续缓释制剂可能是合适的。用于实现缓释的各种制剂和装置是本领域已知的。
在一个实例中，本文所述的钙调磷酸酶/NFAT抑制剂的剂量可以在已经施用一次或多次钙调磷酸酶/NFAT抑制剂的个体中根据经验确定。个体被给予递增剂量的抑制剂。为了评估抑制剂的功效，可以跟踪神经变性疾病的指示(例如认知功能)。
通常，对于本文所述的任何肽抑制剂的施用，初始候选剂量可以是约2mg/kg。为了本公开的目的，典型的日剂量可以在约0.1μg/kg至3μg/kg至30μg/kg至300μg/kg至3mg/kg、至30mg/kg至100mg/kg或更多中的任何一个的范围内，这取决于上述因素。对于在几天或更长时间内的重复施用，根据病症，持续治疗直到出现期望的症状抑制或直到达到足够的治疗水平以减轻神经变性疾病或其症状。示例性剂量方案包括施用约2mg/kg的初始剂量，接着每周施用约1mg/kg抗体的维持剂量，或接着每隔一周施用约1mg/kg的维持剂量。然而，根据从业者希望实现的药代动力学衰减的模式，其他剂量方案可以是有用的。例如，考虑了一周施用一至四次。在一些实施方案中，可以使用范围从约3μg/mg至约2mg/kg(例如约3μg/mg、约10μg/mg、约30μg/mg、约100μg/mg、约300μg/mg、约1mg/kg和约2mg/kg)的剂量。在一些实施方案中，施用频率是每周一次、每2周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每9周一次或每10周一次；或每月一次、每2个月或每3个月一次或更长时间一次。这种治疗的进展易于通过常规技术和测定来监测。剂量方案可随时间变化。
为了本公开的目的，钙调磷酸酶/NFAT抑制剂的适当剂量将取决于所使用的特定钙调磷酸酶/NFAT抑制剂(或其组合物)、神经变性疾病的类型和严重程度、是为了预防还是治疗目的施用抑制剂、先前的治疗、患者的临床史和对抑制剂的反应、以及主治医师的判断。通常临床医生将施用钙调磷酸酶/NFAT抑制剂直到达到实现所需结果的剂量。钙调磷酸酶/NFAT抑制剂的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如受试者的生理状况、施用的目的是治疗性的还是预防性的、以及熟练的从业人员已知的其他因素。可以在预选的时间内基本上连续地施用钙调磷酸酶/NFAT抑制剂，或者可以以一系列间隔的剂量施用，例如，在发展神经变性疾病之前、期间或之后。
如本文所用，术语“治疗”是指向患有神经变性性疾病、神经变性性疾病的症状或易患神经变性性疾病的受试者应用或施用包含一种或多种活性剂的组合物，目的是治疗、治愈、缓解、减轻、改变、补救、改善、改进或影响病症、疾病症状或易患神经变性疾病的倾向。
缓解神经变性疾病包括延缓疾病的发展或进展，或降低疾病严重性。缓解疾病不一定需要治愈性结果。如本文所用，“延缓”疾病的发展是指延迟、阻碍、减缓、延缓、稳定和/或推迟疾病的进展。这种延迟可以是不同长度的时间，这取决于疾病的病史和/或所治疗的个体。“延缓”或缓解疾病发展或延缓疾病发作的方法是与不使用该方法相比，降低在给定时间范围内发展疾病的一种或多种症状的概率和/或降低在给定时间范围内症状的程度的方法。这样的比较通常基于临床研究，用足以给出统计学显著结果的许多受试者。
疾病的“发展”或“进展”是指疾病的初始表现和/或随后的进展。疾病的发展可以使用本领域众所周知的标准临床技术来检测和评估。然而，发展也指可能不可检测的进展。为了本公开的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发和发作。如本文所用，神经变性疾病的“发作”或“发生”包括初始发作和/或复发。
在一些实施方案中，将钙调磷酸酶/NFAT抑制剂以足以增强突触记忆功能至少20％(例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)的量施用于需要治疗的受试者。突触功能是指细胞(例如神经元)的突触将电信号或化学信号传递至另一细胞(例如神经元)的能力。突触功能可以通过常规的测定来测定。
根据待治疗的疾病类型或疾病部位，可以使用医学领域普通技术人员已知的常规方法将药物组合物施用于受试者。该组合物也可通过其他常规途径施用，例如口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻、口腔、阴道或通过植入的储库施用。本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。此外，其可以通过可注射的储库施用途径施用给受试者，例如使用1、3或6个月储库可注射的或可生物降解的材料和方法。
可注射组合物可以含有各种载体，例如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉桂酸异丙酯、乙醇和多元醇(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)。对于静脉内注射，水溶性抗体可以通过滴注方法施用，由此将含有抗体和生理学上可接受的赋形剂的药物制剂输注。生理学上可接受的赋形剂可以包括例如5％葡萄糖、0.9％盐水、林格氏溶液或其他合适的赋形剂。肌内制剂，例如抗体的合适的可溶性盐形式的无菌制剂，可以溶解并施用在药物赋形剂中，所述药物赋形剂例如注射用水、0.9％盐水或5％葡萄糖溶液。
治疗功效可以通过本领域众所周知的方法来评估，例如，在接受治疗的患者中监测突触功能或记忆损失。
除非另有说明，否则本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，其在本领域的技术范围内。
实施例
为了更充分地理解本文所述的发明，给出以下实施例。提供本申请中描述的实施例以说明本文提供的方法、组合物和系统，并且不应以任何方式解释为限制其范围。
材料和方法
细胞系和分化
所有hESC和hiPSC在基质胶包被的板(BD Biosciences)上在mTeSR1培养基(StemCell Technologies)中维持在无饲养细胞条件下。iPSC细胞系由Picower Institute forLearning and Memory iPSC Facility产生。CRISPR/Cas9基因组编辑如先前所述进行。本研究中使用的所有iPSC和hESC细胞系列于表2中。ESC/iPSC在60-80％汇合时用0.5mM EDTA溶液传代5分钟，并以1:6重新接种到基质胶包被的板上。
从iPSC分化BEC
BEC分化根据Qian等人，2017(Directed differentiation of humanpluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.Sci Adv3,e1701679(2017))进行了调整。通过消化酶(Accutase)将人ESC/iPSC解离成单细胞，并以35*103/cm2重新接种到基质胶包被的板上补充有10μM Y27632(Stem Cell Technologies)的mTeSR1中。在接下来的两天，每天用mTesR1培养基替换培养基。第三天，将培养基更换为DeSR1培养基(补充了0.1mM B-巯基乙醇、1X MEM-NEAA、1X青霉素-链霉素和6μM CHIR99021(R&D Systems)。在接下来的5天将培养基更换为DeSR2(含有Glutamax(LifeTechnologies)的DMEM/F12，补充了0.1mM B-巯基乙醇、1X MEM-NEAA、1X青霉素-链霉素和B-27(Invitrogen))并每天更换。在DeSR2培养5天后，将培养基更换为补充了B-27、10μM视黄酸和20ng/mL bFGF的hECSR1人内皮SFM(ThermoFisher)。然后使用消化酶分离BEC并用补充了10μM SR27632的hECSR1重新接种。然后将BEC维持在hECSR2培养基(缺乏RA+bFGF的hECSR1培养基)中。
周细胞分化方案
周细胞分化根据Patsch等人,2015(Patsch,C.等人，Generation of vascularendothelial and smooth muscle cells from humanpluripotent stem cells.Nat.CellBiol.17,994–1003(2015))和Kumar等人,2017(Kumar,A.等人，Specification andDiversification of Pericytes and Smooth Muscle Cells fromMesenchymoangioblasts.Cell Rep 19,1902–1916(2017))进行了调整。通过消化酶解将iPSC离成单细胞，并在补充了10μM Y27632的mTeSR1培养基中以40000个细胞/cm2接种到基质胶包被的平板上。在第一天，将培养基更换为N2B27培养基(1:1DMEM：F12，含有Glutamax和Neurobasal培养基(Life Technologies)，补充有B-27、N-2和青霉素-链霉素)，含有25ng/ml BMP4(Thermo Fisher PHC9531)和8μM CHIR99021。在第4和第5天，将培养基更换为补充有10ng/mL PDGF-BB(Pepprotech，100-14B)和2ng/mL Activin A(R&D Systems，338-AC-010)的N2B27。然后将周细胞维持在N2B27培养基中直至共培养。
NPC分化方案
如Chambers等人，Nat.Biotech 2009(Chambers,S.M.等人，Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts humanpluripotent stem cells into nociceptors.Nat Biotechnol 30,715–720(2012))所述，使用双重SMAD抑制和FGF2补充剂来分化NPC。
星形胶质细胞分化方案
如TCW,J等人,2017(TCW,J.等人，An Efficient Platform for AstrocyteDifferentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells.Stem Cell Reports9,600–614(2017))所述分化星形胶质细胞。用补充有bFGF(20ng/mL)的Neurobasal NPC培养基(DMEM/F12+GlutaMAX，Neurobasal培养基，N-2补充物，B-27补充物，5mL GlutaMAX，10mL NEAA，10mL青霉素-链霉素)培养。使用星形胶质细胞培养基(AM)(Sciencell，1801)诱导星形胶质细胞分化。每隔一天更换AM，当90％汇合时以1:3分离传代细胞。
iBBB渗透性研究
在从iPSC分化后，通过消化酶将BEC酶促解离5分钟。将BEC用添加了10μM Y27632的hECSR1重悬于24孔基质胶包被的跨孔聚酯膜细胞培养插入物(0.4μM孔径)(Corning，29442-082)上，密度为500000-1000000个细胞/cm2，以达到汇合单层。接种周细胞24小时后，将星形胶质细胞或MEFS以50000个细胞/cm2的密度接种在BEC的顶部。当TEER值在最小值＞1000Ohm/cm2稳定连续两天，典型地在接种后6天时，完成渗透性测定。将用异硫氰酸荧光素(Sigma，46944，FD10S，46945)、转铁蛋白(ThermoFisher T-13342)、Alexa Fluor555尸胺(ThermoFisher a30677)、BSA(ThermoFisher A34786)标记的4kDa、10kDa和70kDa与培养基混合，并产生标准曲线。将600μL新鲜培养基加入到跨孔的底部，将100μL染料和培养基加入顶部。渗透性测定在37℃进行1小时。收集来自跨孔室底部的培养基并通过酶标仪分析。对于外排转运蛋白测定，将细胞与10μM罗丹明123(ThermoFisher，R302)和Hoechst染料、5μM reversine 121或5μMKO143(Cayman Chemical 15215)在37℃预孵育一小时。
3D培养
将1×106个BEC/ml、2×105个星形胶质细胞/ml和2×105个周细胞/ml混合在一起，并包封在补充了10％FBS、10ng/ml PDGF-BB、10ng/ml VEGF和10ng/ml bFGF的基质胶中。然后将基质胶细胞溶液接种到玻璃底培养皿上。在37℃下基质胶固化40分钟，然后在补充了10ng/ml VEGFA的完全星形胶质细胞培养基(SciCell)中生长。两周后，撤去VEGFA，随后仅在星形胶质细胞培养基中培养iBBB。3D培养物在实验和分析前成熟1个月。对于成像实验，在4℃下，3D培养物用4％PFA固定过夜，洗涤并封闭24小时，然后在4℃下与一抗和二抗一起孵育过夜，随后最少洗涤48小时。
β淀粉样蛋白积累
使用神经元细胞条件培养基和20nM重组标记的Hilyte Fluor488β-淀粉样蛋白(1-40)(Anaspec，AS-60491-01)和β-淀粉样蛋白(1-42)(Anaspec，AS-60479-01)(重悬于PBS)确定淀粉样蛋白积累。从含有所有三种细胞类型的2D培养物(含有与3D实验相同的细胞比率)中测定每种细胞系的Aβ积累和实验排列。Aβ阳性的总面积除以细胞核总数，并标准化至实验对照。分析每个生物重复的至少四个图像，并且对于每个条件，采用至少三个生物重复。通过3D成像和分析证实2D定量。
免疫荧光染色和APOE免疫清除
用PBS洗涤细胞，用4％PFA(Electron Microscopy Sciences15714-S)固定15分钟。然后用PBS洗涤样品三次五分钟，接着在PBST中透化30分钟。用含有5％正常驴血清(Millipore S30)和0.05％叠氮化钠的PBST(0.1％Triton X-100)封闭细胞。一抗染色在4℃过夜进行。一抗列于表1。细胞用PBST洗涤三次5分钟，并与其二抗在室温下孵育一小时。对于免疫清除实验，通过将条件培养基与5μg抗-APOE或非特异性IgG对照抗体在4℃下孵育过夜，从周细胞条件培养基中免疫清除APOE。然后用磁性蛋白A/G珠除去抗体。
蛋白质印迹和Elisa裂解制备
用PBS洗涤细胞，然后用消化酶解离。然后使用血细胞计数器与台盼蓝对细胞计数，并标准化至总细胞数。然后用PBS洗涤细胞两次，并用RIPA缓冲液裂解。样品在4-20％预制聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad4561095)上溶解。将蛋白质转移到PVDF膜上，并用TBST(50mMTris，150mM NaCl，0.1％Tween 20)和5％牛奶在室温下封闭一小时。在4℃下在振荡培养器上用所示的一抗探查样品过夜。使用APOE ELISA试剂盒(ThermoFisher，EHAPOE)从周细胞培养基条件定量48小时的可溶性APOE。
iPSC衍生的细胞系的RNA分析
使用Trizol分离总RNA，用DNAse处理zymogen RNA-direct spin柱(在柱上处理30分钟)(在洗涤和洗脱之前)。对于RT-PCR，用iScript(BioRad)将500ng总RNA逆转录为cDNA。通过SsoFast EvaGreen Supermix(BioRad)定量表达。对于RNA测序，在使用IlluminaNeoprep stranded RNA-seq文库制备试剂盒制备文库之前，使用高级分析片段分析仪对提取的总RNA进行QC。合并文库，使用MIT Biomicro Center的Illumina HiSeq2000或NextSeq500平台进行测序。使用STAR 2.4.0RNA-seq比对器将原始fastq数据比对到人hg19组装体。覆盖编辑的APOE3/4位点的映射RNA-seq读取用于验证数据基因型。使用特征计数工具从映射的数据生成基因原始计数。还通过Cufflinks2.2与hg19参考基因注释处理映射的读数，以估计转录本丰度。使用Cuffdiff模块进行每种细胞类型的APOE3和APOE4组间的基因差异表达测试，其中调整的q值统计学显著性＜0.05。选择几何方法作为库标准化方法(用于Cuffdiff)。颜色编码的散点图用于可视化差异表达基因和其他基因的组FPKM值。
单细胞核RNA测序和人死后组织染色
分析作为宗教学目研究和快速记忆与衰老计划(https://www.synapse.org/#！Synapse:syn3219045)的一部分的人海马体单细胞核转录组学数据，用于计算鉴定和提取周细胞和内皮单细胞转录组。通过注释呈现周细胞或内皮标志物的富集表达的聚类细胞的组来鉴定推定的周细胞和内皮细胞。鉴定的细胞形成不连贯的细胞组，其不显示神经元、少突胶质细胞、少突胶质细胞祖细胞、小胶质细胞或星形胶质细胞标志物的富集。使用ACTIONet计算框架(http://compbio.mit.edu/ACTIONet/)进行细胞类型注释。总共检测614个推定的内皮细胞和4523个推定的周细胞，伴随检测到的APOE、NFATC1或NFATC2的表达，并考虑用于分析。用双侧Wilcoxon秩和检验测量APOE4相对于非携带细胞中APOE和NFAT基因的差异表达，考虑了带有检测到的基因表达的细胞。通过提取特别富集周细胞标志物表达的细胞簇，进一步分析前额皮质的snRNA-seq以鉴定推定的周细胞和内皮细胞。鉴定的细胞(N＝495个细胞)。将人死后组织染色，例外是已经包埋在石蜡中的海马体切片，因此，二甲苯脱蜡和再水合步骤在染色方案之前。
体内施用环孢菌素A。
所有实验均按照实验动物的护理和使用指南进行，并由美国国家卫生研究所和马萨诸塞州技术研究所动物护理委员会批准。5XFAD小鼠获自Jackson实验室，APOE4KI获自Taconic。5XFAD和APOE4KI小鼠杂交至少八代。Cylcosporine A在橄榄油中制备为1mg/ml，并以10mg/kg的浓度腹膜内注射到6月龄的雌性小鼠中，每天注射，持续三周。用气态异氟烷麻醉动物，并经心脏灌注冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。解剖脑并弧矢切开。冷冻一个半球，一个在4℃下在4％多聚甲醛中后固定过夜。用Leica振动切片机将固定的半球切成40μm厚。将切片在室温下封闭两小时，然后与一抗在4℃下孵育过夜，随后在PBS中洗涤五次十分钟，并与二抗和Hoechst(1:10000)在室温下孵育两小时。然后将切片在PBS中洗涤五次十分钟，然后安装用于成像。进行成像、定量和分析的研究人员对每只小鼠的实验组是不知情的，并且仅在分析后知情。
原代小鼠脑周细胞的分离
从6至8周龄APOE4敲入小鼠分离原代脑周细胞。随后将原代脑周细胞扩增至少两代，然后用2.5μM环孢菌素A或5μM FK506处理两周。通过RT-qPCR分析人APOE的基因表达，并标准化至小鼠GAPDH。
结果
实施例1：人血脑屏障的解剖和生理特性的体外重建
人BBB是由三种细胞类型相互作用形成的多细胞组织：脑内皮细胞(BEC)、平滑肌细胞和周细胞、以及星形胶质细胞。为了体外重建BBB，我们首先优化了用于将人iPSC有效分化为BEC和星形胶质细胞(具有每种细胞类型的形态学和标志物表达特征)的方案(图6a-d)。通过RNA测序，我们证实了iPSC衍生的星形胶质细胞不表达或表达低水平的基因，所述基因被鉴定为与星形胶质细胞相比在成纤维细胞(Steap4、Lum、Dpep1、Inmt和Lama1)和少突胶质细胞(S1pr5、Cldn11、Opalin和Mal)中差异上调(图6e和f)。
为了将iPSC分化为周细胞，我们通过将iPSC暴露于Wnt抑制，同时激活BMP，产生了共同的壁细胞祖细胞。然后我们将该祖细胞暴露于高水平的PDGF-BB，同时通过Activin A抑制TGF-β信号传导，已知该条件使分化相对于平滑肌细胞(SMC)偏向周细胞。与周细胞相似，这些iPSC衍生的细胞表达CD13、NG2、SMA和SM22(图1a；图6g-i)。周细胞的明确鉴定由于缺乏特定标志物而具有挑战性。因此，为了更广泛地表征iPSC衍生的周细胞的鉴定，我们对iPSC衍生的周细胞进行RNA测序，并确定据报道在周细胞中相对于平滑肌(SMC)差异上调的基因的表达。我们发现iPSC衍生的周细胞强烈表达了dTGFBI、IGF2、FXYD6、SFRP2、TMEM56、ALDH1A1、UCHL1、DCHS1、NUAK1和FAM105A，当与SMC相比，它们是周细胞中最大差异上调的基因(图6j)。相反，iPSC衍生的周细胞不表达SGCA、SUSD5和OLFR78，它们是与周细胞相比在SMC中最显著上调的基因(图6k)。同样，iPSC衍生的周细胞不表达在血管成纤维细胞中高度表达的基因(SFRP4、MOXD1和GJB6)，而与血管成纤维细胞相比，在周细胞中高度表达被报道为差异上调的基因(Impa2、Hspb7和Cnn1)(图6l和m)。我们的RNA测序也没有在iPSC衍生的周细胞中检测到常见的间充质标志物基因(SNAI、CDH1和AKAP1)的表达，而是检测到了强烈的周细胞和SMC标志物基因ACTA2、CD248、DLK1、PDGFRB和DES(图6n)。全局分级聚类揭示了人iPSC衍生的周细胞比动脉SMC、原代小鼠脑周细胞或人iPSC衍生的星形胶质细胞、小神经胶质细胞或神经元更类似于原代人脑周细胞(图6o)。总之，这些数据表明这些细胞表达周细胞标志物，而缺少在SMC、成纤维细胞和间充质细胞中高度上调的标志物基因。
BEC、周细胞和星形胶质细胞随后被包封在基质胶中(提供3D细胞外基质)。为了促进3D培养中每种细胞类型的建立和存活，首先向基质胶中补充10％胎牛血清和对每种细胞类型关键的生长因子(10ng/ml PDGF-BB和10ng/ml VEGFA)。我们推论，随着时间的推移，这些生长因子和位置线索(positional cue)会扩散，并且细胞会变得依赖于来自彼此的旁分泌信号传导(促使自组装到组织中)。实际上，在水凝胶基质中两周后，BEC组装成类似血管的相互连接的CD144阳性细胞的大的(＞5mm2)网络(图1b；图7a)。体内内皮细胞分泌PDGF-BB，募集周细胞到内皮血管周围的血管周围空间。最初，周细胞均匀地分散在整个基质胶中(图7b)。然而，两周后，周细胞重新组织以占据邻近BEC血管的位置。在iBBB中，我们观察到了排列于大和小内皮血管的SM22阳性和NG2阳性细胞，潜在地反映了小静脉到毛细血管样结构的SMC和周细胞覆盖(体内所见)(图1c和d；图7b)。相反，星形胶质细胞在整个3D培养中保持更均匀的分散。然而，许多星形胶质细胞围绕每个内皮血管并将GFAP阳性突起延伸到血管周围空间(图1e，图7c)。体内星形胶质细胞将称为“脚板”(“end feet”)的突起延伸到脑血管系统上，在那里它们表达如调节水的水通道蛋白4(AQP4)的运输分子和穿过BBB的其他分子。在缺乏星形胶质细胞的培养物(单独的BEC、单独的周细胞或BEC+周细胞)中，我们通过qRT-PCR或免疫细胞化学没有检测到AQP4 mRNA或蛋白质的表达(图7d和e)。相反，含有所有三种细胞类型的3D共培养物强烈表达AQP4 mRNA，内皮血管沿S100β和表达AQP4的GFAP阳性星形胶质细胞排列(图1f；图7D和7e)。在脑中，周细胞、星形胶质细胞和BEC分泌细胞外基质，产生围绕BBB的基底膜。在体内，BEC分泌层粘连蛋白α4(LAMA4)，它与内皮细胞排列。通过免疫染色，我们发现LAMA4不是天然存在于基质胶中(图7f)。然而，在培养1个月后，我们发现iBBB内皮血管周围的LAMA4免疫反应性(图7f)。这表明iBBB培养物重塑细胞外基质以获得在体内BBB中发现的基底膜蛋白。总之，这些观察结果提示BEC、周细胞和星形胶质细胞的3D共培养产生具有与BBB一致的解剖学性质的血管结构。
移植研究已经证明BBB不是内皮细胞的固有功能，而是通过与周细胞和星形胶质细胞的协同相互作用而被赋予。体内BEC上调紧密连接蛋白、细胞粘附分子和溶质转运蛋白，它们产生限制流体、化学品和毒素的细胞旁扩散的专门屏障。例如，CLDN5、JAMA、PgP、LRP1、RAGE和GLUT1编码在BEC上表达的紧密连接蛋白、转运蛋白和受体，并且对于BBB的功能是关键的，其已经用作BBB形成的生物标志物。为了检查在我们的体外BBB模型中BEC与星形胶质细胞和周细胞的相互作用是否导致这些和其他BBB基因的表达升高，我们通过单独培养的BEC、与星形胶质细胞或周细胞一起、以及包括星形胶质细胞和周细胞的iBBB的qRT-PCR进行了转录谱分析。我们发现BBB预测性生物标志物CLDN5、JAMA、PgP、LRP1、RAGE和GLUT1的RNA表达在来自iBBB的BEC中显著高于单独培养的BEC和与星形胶质细胞或周细胞共培养的BEC，除了当星形胶质细胞与BEC共培养时上调到与iBBB类似水平的CLDN5(图1g)。此外，与单独的BEC或与星形胶质细胞共培养的BEC相比，在iBBB模型中许多其他溶质转运蛋白、紧密连接组分和细胞粘附分子(包括PECAM、ABCG2、CDH5、CGN、SLC38A5、ABCC2、VWF和SLC7A5)选择性上调了(图1h)。这些基因在BBB中高度表达，它们的协同作用被认为赋予了BBB独特的屏障性质。我们确实观察到PLVAP的高表达，PLVAP是一种已知由VEGFA诱导的血管生成内皮的标志物。我们发现PLVAP的表达不受周细胞或星形胶质细胞存在的影响，但在从培养基中除去VEGFA后显著降低(图7g和h)。这些观察结果提示iBBB中的BEC能够响应可溶性信号如VEGFA。为了使VEGFA的作用最小化，我们随后仅在iBBB形成的前两周在含有VEGFA的培养基中培养iBBB。总之，我们的结果证明iPSC衍生的BEC、周细胞和星形胶质细胞的共培养产生了具有体内观察到的BBB的基本解剖学和分子性质的多细胞组织。
BBB是一种高选择性膜，其限制大多数分子进入中枢神经系统。为了检查iBBB是否表现出BBB的功能性质的增加，我们通过首先在渗透膜上产生汇合的BEC单层，随后在顶部周细胞上成层，然后在星形胶质细胞上成层，建立了跨孔系统(图1i和j)。在跨孔构型中，BEC高度表达与BBB结合的紧密连接蛋白ZO-1和CLDN5(图7i)。跨内皮电阻(TEER)是横跨内皮单层的电阻的测量，其用作渗透性的灵敏且可靠的定量指示。所有形成屏障的永生化内皮细胞系显示TEER值低于150Ohm/cm。同样，外周内皮细胞如人脐带血管内皮细胞(HuVEC)具有相对高的渗透性，因此表现出低的TEER。与这些报道的观察结果一致，当我们在我们的跨孔构型中培养HuVEC时，我们观察到约100Ohm/cm2的TEER值(图1k)。HuVEC TEER值没有通过与星形胶质细胞或周细胞共培养而增加。如前所述，单独培养的iPSC衍生的BEC具有显著更高的TEER值，平均为5900Ohm/cm2(图1k)。然而，单独培养的BEC的TEER值显示高度的变异性(SD＝+/-2150Ohm)。将BEC与周细胞和星形胶质细胞共培养降低了TEER变异性(SD＝+/-513.9Ohm)，并且导致平均电阻的显著增加(8030Ohm/cm2)，表明iBBB比HuVEC或单独培养的BEC具有更低的渗透性(图1k)。
为了更全面地评价iBBB的屏障性质，我们比较了分子量范围为0.1至80kDa的分子的细胞旁渗透性。对于范围在0.1至10kDa之间的分子，我们观察到iBBB的细胞旁渗透性与单独的BEC相比降低约50％(图1l)。与单独的BEC相比，具有70和80kDa的较高分子量的分子穿过iBBB的效率低得多，具有70和90％的降低(图1l)。为了排除iBBB渗透性降低仅仅是细胞附加层的结果的可能性，我们将双倍正常数量的仅周细胞、仅星形胶质细胞或非相关细胞类型、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的细胞铺在BEC上。单独与BEC培养的星形胶质细胞、周细胞和MEF都不能导致渗透性的降低，而在iBBB中共培养星形胶质细胞和周细胞导致渗透性的显著降低(图1m)。这表明iBBB渗透性的降低需要星形胶质细胞和周细胞的协同存在，而不仅仅是物理分层额外细胞的作用。结合分子谱分析和TEER值，这确定iBBB中星形胶质细胞、周细胞和脑内皮细胞的协同相互作用赋予与生理BBB一致的分子和功能性质。
BBB中的内皮细胞表达选择性存在于顶端表面的外排泵。外排泵的表达和极化是BBB阻止小分子和亲脂性分子进入脑的重要机制。分子谱分析鉴定了与单独的BEC或与星形胶质细胞共培养的BEC相比，iBBB中两种常见的外排泵p-糖蛋白(Pgp)和ABCG2分别被上调2倍和3倍以上(图1g和n)。为了确定Pgp在iBBB的顶端表面上是否极化，我们测量了在Pgp特异性抑制剂reversine 121存在和不存在下罗丹明123从顶端表面到基底外侧的排出，反之亦然。Pgp的抑制显著地增加了罗丹明123从顶端表面到基底外侧的渗透性，但不增加从基底外侧到顶表面的渗透性(图1o)。这表明Pgp大部分位于iBBB的顶端膜(图1o)。与极化的内皮一致，用特定ABCG2抑制剂KO143抑制ABCG2也强烈增加了Hoechst 33258和ABCG2底物的顶端至基底外侧转运(图7j)。总之，这些结果证明iBBB具有高TEER、降低的分子渗透性和外排泵的极化，这些都是体内BBB的关键功能特性。在体内人BBB和iBBB之间可能存在差异；然而，如下面所证明的，iBBB可以提供对人BBB生物学的疾病相关的洞察，其可以被用于减少体内疾病病理。
实施例2：APOE4增加iBBB中Aβ的积累
大多数(＞90％)阿尔茨海默病患者和20-40％未痴呆的老年人表现出沿他们的脑血管的淀粉样沉积物，这种状况被称为CAA。CAA损害BBB功能，促进脑缺血、出血，并加速认知衰退。因此，我们寻求检查在我们的iBBB模型中的淀粉样蛋白积累，首先测试来源于对照或家族性AD(fAD)患者谱系的iBBB是否固有地积累淀粉样蛋白。与iBBB细胞类型产生的低水平的Aβ一致，我们没有在来自具有双份编码淀粉样前体蛋白的APP基因的患者的fADiBBB和PSEN1M146I突变的单独的等基因对及其校正的非AD对照中检测到淀粉样蛋白的明显积累(图8a和b)。相反，神经元高度表达APP并且是人脑中淀粉样蛋白的最重要来源。因此，我们接着利用来自对照和fAD神经元培养物的富含Aβ的条件培养基，其由具有双份APP基因的iPSC系产生。首先，我们使iBBB形成并成熟超过1个月，随后将其暴露于通过fAD神经元细胞条件化的培养基(我们通过ELISA证实其含有升高水平的Aβ1-42)(图2a；图8c)。暴露于非AD神经细胞条件化的培养基96小时的iBBB表现出最小的Aβ积累(图2b)。相反，暴露于fAD神经培养基96小时的iBBB具有显著更多的淀粉样蛋白积累，表明iBBB可以模拟体内观察到的BBB淀粉样蛋白沉积。
在衰老过程中，人脑中的Aβ水平自然升高。影响Aβ沉积和清除的遗传多态性被认为偶发地促成了与AD和CAA相关的病理。在人类中，有三种APOE的遗传多态性，即2、3和4。临床和小鼠研究都发现APOE4是已知最显著的CAA和散发性AD的危险因子。然而，潜在机制大部分是未知的。为了检测iBBB中Aβ积累是否受APOE基因型影响，我们从以前报道的同种型APOE3/3(E3/3)和APOE4/4(E4/4)iPSC中产生iBBB。当我们将iBBB暴露于具有升高的Aβ同种型E4/4的条件培养基时，与亲本E3/3iBBB相比，iBBB始终显示显著更多的6e10阳性淀粉样蛋白积累(图2c)。我们接着检查了将iPSC从E4/4个体遗传修饰为E3/3是否可以拯救淀粉样蛋白表型。我们再次观察到，E4/4iBBB在原始等基因对和具有相反编辑策略的第二等基因对的另外克隆中显示显著更多的6e10阳性淀粉样蛋白积累(E4/4-风险至E3/3-非风险)，表明在E4/4iBBB中增加的淀粉样蛋白沉积不太可能是克隆变异或遗传编辑的结果(图2d)。APOE3/4(E3/4)杂合子人也具有增加的CAA和AD发病率。因此，我们接着检查了由E3/4杂合子产生的iBBB与E3/3iBBB相比是否显示淀粉样蛋白沉积增加。与临床观察一致，从三个不同的E3/4杂合个体产生的iBBB比从E3/3个体产生的iBBB显示显著更多的淀粉样蛋白积累(图2e；图8d)。
我们用另外四种方法定量了iBBB Aβ的积累。首先，使用两种另外的抗体D54D2(检测Aβ的几种聚集的同种型，例如Aβ1-37、Aβ1-38、Aβ1-39、Aβ1-40和Aβ1-42)和12F4(检测Aβ1-42寡聚体)，我们进一步证实了与APOE3 iBBB相比，在APOE4 iBBB中淀粉样蛋白积累升高(图2f和g以及图8e)，我们还发现，暴露于fAD条件培养基的APOE4iBBB表现出显著更高的染色，所述染色是用结合原纤维淀粉样蛋白的化学染料硫磺素T(ThT)进行的(图8f)。此外，直接暴露于20nM荧光标记的Aβ肽(20nM 1-40/1-42)96小时的E4 iBBB显示更高水平的Aβ积累，表明表型是E4 iBBB固有的，而不是需要条件培养基中的因子的次级反应(图8g)。我们独立地测试了合成的Aβ1-40和1-42同种型，发现它们在单独测试时在E4 iBBB中都表现出显著更多的淀粉样蛋白(图9h)。我们还发现，与APOE3 iBBB相比，在APOE4 iBBB中增加的淀粉样蛋白积累对应于在APOE4 iBBB培养基中可溶性单体Aβ的减少，进一步提示APOE4 iBBB比APOE3iBBB积累更多的淀粉样蛋白(图2h)。总之，这些数据表明，与临床研究类似，APOE4 iBBB与同种型APOE3 iBBB相比积累更多的淀粉样蛋白。
接下来，我们测定了APOE4 iBBB中增加的淀粉样蛋白积累的空间分布。当单独在2D中培养时，APOE4周细胞和BEC比它们的APOE3对应物积累了更多的荧光标记的Aβ(图8i和j)。使用高分辨率IMARIS图像分析，我们通过距VE-钙粘蛋白-阳性血管中心小于20μm的6e10阳性免疫反应性(定义为“血管淀粉样蛋白”)和距血管中心大于20μm的6e10阳性免疫反应性(定义为“非血管淀粉样蛋白”)定量了淀粉样蛋白(图2i)。与APOE4 BEC和周细胞在2D中积累更多淀粉样蛋白一致，我们发现与APOE3/3iBBB相比，在APOE4iBBB的BEC血管上和周围有显著更多的6e10阳性淀粉样信号(图2i和j)。有趣的是，在APOE4 iBBB中，围绕各血管的实质空间中非血管淀粉样蛋白也增加(图2j)。这种非血管淀粉样蛋白显现细胞围绕细胞核(对星形胶质细胞标志物GFAP和S100β阳性)(图2k)。我们在APOE4 iBBB中发现大约36.8％的星形胶质细胞含有淀粉样蛋白，而显著更少(16.8％)的APOE3星形胶质细胞含有淀粉样蛋白(图2l)。总之，这些结果证明iBBB可以模拟在CAA和AD中观察到的淀粉样蛋白积累的方面和对这些病理的常见遗传易感性。
实施例3：周细胞是iBBB中增加的Aβ沉积所需要的
观察到的Aβ沉积的增加可能需要在BBB中存在的所有或仅一些细胞类型中APOE4表达。精确定位负责的细胞将允许随后的研究以解剖和靶向潜在的机制。因此，为了确定增加的Aβ沉积的细胞来源，我们通过从来自同种型iPSC的E3/3和E4/4的八种可能排列产生iBBB进行了组合实验。我们首先使iBBB成熟1个月，然后将它们暴露于20nM合成的FITC-标记的Aβ96小时，并定量在每个排列中的总Aβ-FITC积累。如前所观察到的，所有E4/4iBBB比所有E3/3iBBB显示显著更多的淀粉样蛋白沉积(图3a和b)。为了分析组合效应，我们首先基于它们是否表现出与全部E3/3iBBB(低Aβ)或全部E4/4iBBB(高Aβ)统计学相似(p＜0.05)的低Aβ来分离每种iBBB排列，然后寻找两种条件之间的细胞共性(图3c)。低和高Aβ条件都同等地含有来自E3/3和E4/4基因型的星形胶质细胞和BEC(图3c)。然而，引人注目的是，所有低Aβ条件仅含有E3/3周细胞，而所有表现出高Aβ积累的iBBB仅含有E4/4周细胞(图3b-c)。这强烈表明E4/4周细胞对于在E4 iBBB中观察到的增加的淀粉样蛋白表型是必需的。我们进一步证实，用源自不同E3/3个体(210)的周细胞仅替换E4/4周细胞导致iBBB淀粉样蛋白沉积显著减少，而不管BEC或星形胶质细胞的基因型是什么(图3d)。为了检查周细胞中E4的一个拷贝是否足以引起淀粉样蛋白沉积增加，我们用E3/4杂合BEC、星形胶质细胞和周细胞(来源于APOE3/4杂合的H9人胚胎干细胞系的)进行了组合实验(图3d)。同样，用E3/4星形胶质细胞或BEC取代E3/3星形胶质细胞或BEC没有显著增加iBBB淀粉样蛋白积累(图3d)。然而，如在E4/4纯合周细胞中观察到的，用杂合E3/4周细胞替代E3/3周细胞将iBBB淀粉样蛋白积累增加至与在所有E3/4iBBB中观察到的相似水平(图3d)。这表明APOE4杂合和纯合周细胞单独足以增加iBBB中淀粉样蛋白积累(图3d)。为了进一步证实APOE4周细胞足以增加血管淀粉样蛋白积累，我们将iBBB解构成单独的BEC、与周细胞一起的BEC或与星形胶质细胞一起的BEC(来自每种基因型)。单独的E4/4BEC或与星形胶质细胞一起的BEC没有重现观察到的表型。然而，与周细胞一起的E4/4BEC导致淀粉样蛋白积累的显著增加(图9a)。类似地，我们将E3/3iBBB暴露于由E3/3或E4/4周细胞条件化的培养基，然后向所有条件加入20nM Aβ-FITC。这表明E4/4周细胞条件培养基足以增加E3/3iBBB的淀粉样蛋白积累(图3E)。我们还发现，用APOE4周细胞条件培养基处理APOE4星形胶质细胞显著增加星形胶质细胞淀粉样蛋白积累(图9b)。总之，这些结果证明APOE4在周细胞中的表达通过未知的可溶性因子促进iBBB中增加的Aβ沉积。周细胞和平滑肌细胞在小鼠脑中表达高水平的APOE(图9c)，并且在APOE4个体中周细胞变性加速。最近，发现周细胞收缩毛细血管并诱导响应Aβ的缺氧。在疾病发病机理期间，遗传多态性如何影响周细胞知之甚少。
实施例4：APOE和钙调磷酸酶信号传导在APOE4周细胞中上调
为了进一步检查周细胞和APOE4如何联合促进淀粉样蛋白沉积增加，我们接下来进行了同种型iPSC衍生的APOE3/3和APOE4/4周细胞的全局转录谱分析。以前，我们发现在同种型E3/3和E4/4细胞之间数百至数千个基因差异表达，包括iPSC(150个基因)、神经元(443个基因)、星形胶质细胞(1325个基因)和小胶质细胞样细胞(1458个基因)(从相同iPSC系产生)。我们发现在同种型周细胞之间多得多的基因(4286个)差异表达(DEG；q＜0.05)，2303个基因显著上调而1983个基因下调(在E4/4周细胞中)(图4a)。基因本体分析表明，在APOE4周细胞中，涉及蛋白质靶向膜和内质网的生物过程被上调，而有丝分裂和细胞周期进程被下调(图10a和b)。以前，我们观察到在E4/4星形胶质细胞中APOE的表达被下调。与先前在小鼠中的报道相似，我们基于来自RNA测序的星形胶质细胞和周细胞APOE FPKM值的相对比较发现人iPSC衍生的周细胞高度表达APOE(图10c)。然而，与星形胶质细胞形成鲜明对比的是，周细胞表现出在E4/4周细胞中APOE的强上调，而遗传上相同的E4/4星形胶质细胞表现出反向表达谱，与E3/3相比，APOE水平降低(图10d)。我们通过从独立于RNAseq样品的样品中收集的RNA的qRT-PCR证实了在周细胞和星形胶质细胞中APOE分别的差异上调和下调(图4b)。我们通过免疫荧光成像和蛋白质印迹(图4c和d)发现，在E4/4周细胞中增加的APOE基因表达转化为蛋白质的增加。APOE基因表达在来自我们的互易等基因对的E4/4周细胞中也被上调，表明该作用不太可能是遗传编辑或克隆变异的人为产物(图4e)。此外，来自多个APOE3/4杂合个体的周细胞始终表达比E3/3周细胞(包括从未编辑的iPSC产生的E3/3周细胞)高的APOE mRNA(图4e)。
为了证实在人脑中这些发现的相关性，我们进行了单细胞核RNA测序(snRNAseq)来评估APOE在周细胞和内皮细胞中的表达，其来自我们最近发表的人前额皮层BA10区域的单细胞转录组学研究，该研究使用了单细胞核RNA-seq。我们发现周细胞的转录簇与内皮细胞的转录簇部分重叠。为了简化我们的分析，我们将两个细胞群作为单个周细胞/内皮簇进行处理。我们发现，与非携带者(n＝18个个体)相比，来自APOE4-携带者(n＝7个个体)的皮层周细胞/内皮细胞显示显著更高的APOE mRNA表达(图10e)。除了scRNAseq之外，我们还进行了免疫组织化学来特异性地检查APOE在人脑周细胞中的表达。在人前额皮质中，我们发现来自APOE4携带者(n＝4个个体)的NG2阳性周细胞中APOE蛋白表达与非携带者(n＝4个个体)相比显著升高(图10f)。为了进一步评估APOE是否在来自其他脑区的体内APOE4周细胞中升高，我们分析了APOE4携带者(n＝16个个体)和非携带者(n＝46个个体)的海马体的snRNAseq数据。来自海马体数据集的大量细胞使得能够基于标志物基因表达清楚地分离内皮细胞和周细胞(图10g)。与前额皮质类似，我们发现APOE在APOE4携带者海马体周细胞中的表达与非携带者相比明显更高(图4f)，而在内皮细胞中，APOE4携带者与非携带者之间的APOE表达没有显著差异(图10h)。为了进一步验证该观察结果，我们使用免疫组织化学从APOE4携带者和非携带者的不同队列分析了人海马体周细胞中APOE的表达。与snRNAseq类似，我们观察到在NG2阳性周细胞中APOE4携带者(n＝6个个体)比非携带者(n＝6个个体)显示显著更高的APOE免疫反应性(图4g)。总之，这些结果与以下概念一致，即来自APOE4携带者的人脑周细胞比来自非携带者的周细胞跨多个脑区表达更高的APOE。
APOE是一种结合Aβ的可溶性蛋白，促进其与细胞和细胞外环境的相互作用。小鼠敲除研究已经证明APOE是CAA病理学所需的，并且APOE3和APOE4的单倍不足性减少敲入小鼠中的大脑淀粉样蛋白积累。因此，在E4周细胞中观察到的APOE表达增加可促进在APOE4iBBB和人携带者中观察到的淀粉样蛋白的增加的种子形成和沉积。为了研究这种情况，我们使用CRISPR/Cas9编辑产生了同种型APOE缺陷iPSC系。然后我们产生了同种型iBBB，其是E3/3、E4/4或APOE缺陷(敲除，KO)。同样E4/4iBBB与E3/3相比显示了更高水平的淀粉样蛋白积累，相反，APOE缺陷iBBB具有与E3/3iBBB相似的降低水平的荧光Aβ积累(图4h)。为了测试APOE是否是增加的淀粉样蛋白积累直接需要的，我们首先从周细胞条件培养基中免疫清除APOE，然后将APOE3 iBBB暴露于APOE清除或对照培养基(非特异性IgG或无清除)。随后将这些培养物暴露于荧光标记的Aβ96小时。从APOE4/4周细胞条件培养基免疫清除APOE导致与非清除或非特异性IgG清除对照相比Aβ积累的显著降低(图4i)。这表明升高的APOE浓度增加了淀粉样蛋白沉积。为了进一步检验该假设，我们接着使用重组人APOE蛋白将APOE3iBBB培养基中的APOE浓度提高至大约在APOE4 iBBB培养基中观察到的水平(200ng/ml)，随后将这些iBBB暴露于荧光标记的Aβ96小时。我们发现，无论是E3或E4，增加APOE浓度足以将APOE3/3iBBB中的Aβ积累增加至APOE4中与之相似的水平(图11A)。这证明APOE蛋白丰度与淀粉样蛋白积累直接相关。因此，考虑到周细胞是APOE的丰富来源，我们假设减少APOE4周细胞中的APOE蛋白可以导致淀粉样蛋白积累减少。
接下来，我们寻求鉴定在周细胞中APOE基因型差异表达的调控途径。特别地，我们对可能介导在E4周细中APOE的上调的潜在DNA结合蛋白感兴趣。因此，我们首先鉴定了在同种型E3/3和E4/4周细胞之间差异表达的所有转录因子。在E4/4中，与同种型E3/3周细胞相比，127个转录因子差异上调，101个下调(q＜0.05)(图4j)。为了精准确定能够调控APOE表达的转录因子，我们接下来评估任何差异表达的转录因子中的任何是否已被报导能结合APOE基因调控元件。在E4/4周细胞中NFAT和C/EBP的上调提示在E4/4周细胞中NFAT或C/EBP表达的增加可有助于APOE表达增加。我们发现NFAT信号传导的上调特别令人感兴趣，因为NFAT、其上游效应子钙调磷酸酶和钙信号传导的失调已经在衰老、AD和认知衰退中被观察到。然而，这些观察背后的机制细节是有限的。
我们通过免疫染色和蛋白质印迹证实E4周细胞含有明显更高的细胞质和细胞核NFATc1蛋白(图4k；图11b和c)。此外，在E4/4周细胞中，编码CaN、PPP3CA和PPP3 CC催化亚基的基因显著上调(分别为49.8％和26.5％)(图11d)。相反，钙调磷酸酶的负调节子RCAN2和RCAN3(磷酸化并抑制CaN磷酸酶活性的激酶)在E4/4周细胞中下调(分别为约-23.7％和-27.7％)(图11e)。类似地，在APOE4/4iPSC衍生的周细胞中，我们观察到DYRK4(一种磷酸化NFAT促进其胞质保留的激酶)显著下调(-38.9％)(图11f)。通过RNA测序，我们没有观察到DYRK 1-3的显著变化(图11f)。总之，这些结果表明E4/4周细胞表现出与升高的CaN/NFAT信号传导一致的细胞内分子的双向改变，产生能够积极促进NFAT介导的转录的环境。为了检验这一点，我们通过qRT-PCR检查了报告为NFAT应答的基因在E4周细胞中是否上调。一致地，在E4同型和杂合周细胞中，ACTG2和VCAM1均显著上调(图11g)。
为了检查NFAT是否在体内APOE4周细胞中被上调，我们首先检查了Nfatc1在小鼠中的表达，其中鼠APOE编码区用人APOE3或APOE4编码区遗传替换。使用免疫组织化学比较Ng2阳性周细胞中的APOE表达，我们发现APOE4敲入小鼠(APOE4KI)在脑血管Ng2阳性周细胞中显示出比APOE3敲入(APOE3KI)小鼠高约86％的Nfatc1蛋白染色(图4l)。类似地，人海马体的snRNA-seq转录组学分析揭示，相对于非携带者(n＝46个个体)，在APOE4携带者(n＝16个个体)的周细胞中，NFATc1和NFATc2显著更高(图11h和i)，而在内皮细胞中，NFATc1或NFATc2都不差异表达(图11j和k)。在前额皮质中，我们还通过snRNAseq观察到在来自APOE4携带者的人皮质周细胞/内皮细胞中NFATc2 mRNA的显著上调(图11l)。总之，体外和体内的多条证据提示在E4周细胞中NFAT/CaN信号传导途径的几个组分被改变，这可促进APOE的表达并导致APOE4介导的淀粉样蛋白积累。
实施例5：钙调磷酸酶(CaN)的抑制降低APOE表达和改善Aβ沉积
为了确定E4/4周细胞中钙调磷酸酶途径的失调是否有助于APOE表达上调，我们开始使用已建立的CaN抑制剂环孢菌素A(CsA)(2μM)、FK506(5μM)和INCA6(5μM)来抑制钙调磷酸酶信号传导(图12a)。在用三种抑制剂中的每一种独立地进行CaN抑制作用两周后，如通过qRT-PCR所测量的，APOE4/4周细胞中APOE表达显著降低(图5a)。钙调磷酸酶抑制也倾向于降低APOE3/3周细胞中的APOE基因表达，然而，考虑到APOE的较低表达，该趋势更温和(图5a)。CaN的抑制没有显著降低组成型表达的蛋白质，例如PGK1、HPRT和GAPDH，表明APOE下调不是细胞死亡或全局转录抑制的结果(图12b)。为了检查CaN的抑制是否也降低了E3/4杂合周细胞中APOE的表达，我们处理了来自三个E3/4个体和两个另外的E3/3对照个体的周细胞。与纯合E4/4周细胞相似，当用三种CaN抑制剂中的每一种处理时，E3/4杂合周细胞表现出APOE表达的显著降低(图5b)。除了APOE基因表达外，CaN的抑制还降低了细胞内APOE蛋白，这是通过免疫荧光在E4/4纯合系和E3/4杂合系中测定的(图12c和12d)。同样，当通过ELISA测量时，CsA也显著降低培养的周细胞培养基中存在的可溶性APOE蛋白的浓度(图5c)。这些结果一起证实，E4周细胞中CaN的化学抑制导致APOE基因表达和APOE蛋白的减少。
为了获得当CaN被抑制时在E4周细胞中发生的另外的变化的无偏倚的评估，我们对用DMSO处理的E3/3周细胞和用DMSO或2μMCsA处理的同种型E4/4周细胞进行了全局转录谱分析。在CsA处理的周细胞中，NFATc1的表达被显著下调至在E3/3DMSO处理的周细胞中观察到的相当的水平(图5d)。如所预测的，由CsA导致的NFATc1下调与在E4周细胞中APOE的表达降低相关联，与图4b中呈现的qRT-PCR数据一致(图5e)。与用DMSO处理的E3/3周细胞相比，用DMSO处理的E4/4周细胞显示超过4000个差异表达的基因(图5f)。相反，用CsA处理的E4/4周细胞显示的转录谱更接近E3/3周细胞(图5f)。CsA导致860个基因的上调，其表现出与E3/3DMSO处理的周细胞相似的表达水平(图5f)。基因本体(GO)分析表明，这些基因参与RNA加工(GO：0006396、GO：0016071和GO：0034660)和与肽合成相关的过程(GO：0043604和GO：0043043)(图11e)。2783个基因对CsA应答显示中度的上调，达到E3/3和E4/4周细胞之间的中间表达水平。GO分析将这些基因分类为涉及细胞内蛋白运输和定位(GO：0006886，GO：0015031，和GO：0034613)、细胞分解代谢过程和大分子定位(GO：0044248和GO：0070727)(图12e)。有趣的是，由CsA所致在E4/4周细胞中下调的基因显示与E3/3周细胞更适度的相似性(图5f)。CsA处理导致1881个基因下调至E3和E4周细胞之间的表达水平(图5f)。对这些基因的GO分析表明，它们参与GTP酶活性和神经管闭合(GO：0043087，GO：0051056，GO：0043547，GO：0007264，GO：0001843)。总之，用CsA处理E4周细胞导致与E3/3周细胞相似的增加的转录，斯皮尔曼秩相关性分析证明，尽管DMSO处理的E4/4周细胞显示与E3周细胞的全局转录谱相似性(0.889)，CsA处理增加了相似性至0.937。这表明在E4周细胞中CaN的药理学抑制广泛地赋予转录变化，导致与E3周细胞的相似性增加。在T细胞中，CaN/NFAT与炎症反应和炎症反应基因(包括白介素和肿瘤坏死因子)的上调有关。虽然我们观察到E4周细胞中CaN/NFAT信号传导升高，但我们没有观察到经典炎症基因的显著上调，提示CaN/NFAT应答可能是细胞类型特异性的。
APOE是在体内和在我们iBBB中高水平淀粉样蛋白沉积所需的(图4h和i；图10g)。因此，APOE蛋白的减少可能也减少淀粉样蛋白沉积。为了验证该假设，我们用CsA或FK506处理两个同种型iBBB对两周，随后加入20nM Aβ1-40-/42-FITC96小时。与该假设一致，CsA和FK506处理均导致与其同种型APOE3/3对照相比，两种独立的APOE4/4iBBB中淀粉样蛋白积累的显著降低(图5g和h)。我们发现CaN抑制减少淀粉样蛋白积累的能力也发生在APOE3/4杂合iBBB中(图5i)。
之前，我们观察到由E4/4周细胞条件化的培养基足以增加E3/3iBBB的淀粉样蛋白积累(图3e)。由于E4/4周细胞条件培养基引起的淀粉样蛋白沉积增加可能是由于可溶性APOE增加。因此，我们假设用CaN抑制剂处理E4/4周细胞将减少可溶性APOE，从而导致iBBB淀粉样蛋白积累的减少。实际上，我们观察到，尽管来自用DMSO处理的E4/4周细胞的条件培养基引起E3/3iBBB中淀粉样蛋白沉积的显著增加，但是从用CsA、FK506或INCA6处理的E4/4周细胞获得的培养基导致淀粉样蛋白积累的显著降低(图5j)。为了进一步扩展这一观察，我们从ApoE4KI小鼠制备了皮层切片培养物，随后用DMSO、CsA或FK506处理它们1周。然后我们向培养物中再添加20nM Aβ1-40-/42-FITC另外48小时，之后我们定量了每种条件下Aβ-FITC的积累。我们发现，与DMSO对照相比，CsA和FK506都降低了APOE4KI皮层切片培养物中APOE蛋白丰度和AβFITC的积累(图12f-h)。
就iBBB膜的渗透性方面评估了APOE4/4细胞(同种型)和APOE3/3(亲本)之间的基因型差异。结果示于图13-16。图13的示意图显示了iBBB，荧光分子位于顶端表面，然后其可穿过iBBB从顶端表面至基底侧面(图13B)。结果示于图13C，表明用等基因APOE4/4细胞制备的iBBB比用亲本APOE3/3细胞产生的iBBB允许更大的渗透性和荧光分子的积累。
还进行了一项研究，其显示用等基因APOE4/4细胞制备的iBBB比使用亲本APOE3/3细胞产生的iBBB允许更多的渗透性和多种化合物的积累(在图14A中示意性地显示iBBB，荧光分子位于顶端表面)。数据以总结的形式示于图14B中。图15A-15F是一系列图，其显示了每个测试化合物(尸胺(15A)、4kDa葡聚糖(15B)、10kDa葡聚糖(15C)、BSA(15D)、70kDa葡聚糖(15E)和转铁蛋白(15E)的全部数据集。图16是显示用等基因APOE4/4细胞制备的iBBB比使用亲本APOE3/3细胞产生的iBBB允许更大的渗透性和Aβ42-FITC在iBBB的基底外侧表面上的积累的图。
总之，我们的结果证明APOE4周细胞中CaN/NFAT信号传导的失调通过上调人周细胞中APOE表达导致淀粉样蛋白积累增加，并且该表型通过CaN信号传导的药理学抑制而改善。为了进一步检查这一发现，我们首先从APOE4KI小鼠分离脑微血管，随后通过在周细胞选择培养基中培养3周选择周细胞，产生几乎均质的周细胞培养物。然后我们用DMSO、CsA或FK506处理这些APOE4KI原代脑周细胞培养物两周。与iPSC衍生的人周细胞相似，从APOE4KI小鼠分离的原代小鼠脑周细胞响应CsA和FK506而下调APOE mRNA表达(图12i)。
接下来，为了检查这种生物学观点是否可以应用于体内以减少疾病病理学，我们使用了6月龄的APOE4 KI小鼠与5XFAD AD小鼠模型杂交(APO4KI×5XFAD)，并通过腹膜内注射用CsA(10mg/kg)处理它们三周。CsA处理导致通过ELISA测量的海马体中APOE浓度的显著降低(图5k)。免疫组织化学显示，与对照小鼠相比，在用CsA处理的APOE4KI x 5XFAD小鼠的皮质和海马体周细胞中和周围，APOE蛋白表达也降低(图5l；图12j)。6e10和APOE的共染色显示，降低的APOE与较低水平的6e10阳性血管淀粉样蛋白同时发生(图5m)。因此，我们用识别Aβ寡聚体的不同肽序列的两种单独的抗体(6e10和12F4)定量了血管淀粉样蛋白。我们发现与用载体处理的小鼠相比，用CsA处理的小鼠在海马体中具有显著降低的血管淀粉样蛋白(70.6％+/-18.4(6e10)和47.8％+/-4.1(12F4))(图5n和图12k)。这些结果证明CaN/NFAT抑制可以在体内降低周细胞APOE水平和血管淀粉样蛋白。
环孢菌素A被证明在体内降低APOE和淀粉样蛋白产生/积累(图17A-C、图18A-B和图19A-19C)。每天对APOE4K1x 5xFAD小鼠腹膜内注射载体对照或10mg/kg环孢菌素A，持续3周，并定量APOE蛋白和血管淀粉样蛋白(示意性呈现于图17A中)。数据示于图17B-C。图17B示出了一张图表，其显示ELISA测试产生的结果，并证明环孢菌素A相对于载体导致较少的APOE蛋白产生。图17C是图像和图表，其显示海马体免疫组织化学的结果，并证明在皮质周细胞中和皮质周细胞周围环孢菌素A相对于载体导致APOE蛋白较少积累。
在体内环孢菌素A减少了海马体血管系统中和周围的APOE和血管淀粉样蛋白。图18A是显示海马体的免疫组织化学法产生的结果的图像，并证明环孢菌素A相对于载体导致产生较少的APOE/淀粉样蛋白。图18B是图像和图表，其显示海马体免疫组织化学的结果，并证明环孢菌素A相对于载体导致较少的血管淀粉样蛋白积累。在图19A-19D中，显示了在体内环孢菌素A和FK506减少了海马体血管系统中和周围的APOE和血管淀粉样蛋白。在图19C中，图像显示海马体的免疫组织化学法产生的结果，并证明FK506(10mg/ml)相对于载体对照导致产生较少的淀粉样蛋白。
表1.本研究中使用的抗体。
Figure BDA0003269159540000541
Figure BDA0003269159540000551
表2.用于研究的多能细胞系。
Figure BDA0003269159540000561
其他实施方案
本发明进一步体现在以下一个或多个段落的实施方案中。
段1.包含3维(3D)基质的体外血脑屏障(iBBB)，其包含
人脑内皮细胞(BEC)血管，其由包封在3D基质中的人多能来源的阳性内皮细胞的大的互连网络组成，
在顶端表面上邻近BEC血管的人多能来源的周细胞，和
分散在整个3D基质中的人多能来源的星形胶质细胞，其中多个星形胶质细胞邻近BEC血管并具有进入血管周围空间的GFAP阳性突起。
段2.包含3维(3D)基质的体外血脑屏障(iBBB)，其包含
人脑内皮细胞(BEC)血管，其由包封在3D基质中的内皮细胞的大的互连网络组成，
在顶端表面上邻近BEC血管的周细胞，其中所述周细胞具有E4/E4基因型，和
邻近BEC血管的星形胶质细胞，其中多个星形胶质细胞具有进入血管周围空间的阳性突起。
段3.上述段中任一段的iBBB，其中所述星形胶质细胞表达AQP4。
段4.上述段中任一段的iBBB，其中所述3D基质包含LAMA4。
段5.上述段中任一段的iBBB，其中所述BEC表达JAMA、PgP、LRP1和RAGE中的至少任一种。
段6.上述段中任一段的iBBB，其中PgP和ABCG2在顶端表面上表达。
段7.上述段中任一段的iBBB，其中在顶端表面上表达的PgP和ABCG2的水平是在单独培养或与星形胶质细胞共培养的BEC上表达的PgP和ABCG2的水平的2-3倍。
段8.上述段中任一段的iBBB，其中所述iBBB具有超过5500ohm×cm2的TEER，相对于单独培养或与星形胶质细胞共培养的BEC，表现出降低的分子渗透性和外排泵极化。
段9.上述段中任一段的iBBB，其中所述iBBB不与视黄酸一起培养。
段10.上述段中任一段的iBBB，其中所述人多能细胞是iPSC-衍生的CD144细胞。
段11.上述段中任一段的iBBB，其中所述iBBB是使用5份内皮细胞比1份星形胶质细胞比1份周细胞产生的。
段12.上述段中任一段的iBBB，其中所述iBBB是使用约1百万个内皮细胞/ml、约200000个星形胶质细胞/ml和约200000个周细胞/ml产生的。
段13.上述段中任一段的iBBB，其中所述iBBB的长度是5至50微米。
段14.上述段中任一段的iBBB，其中所述iBBB的长度是5至30微米。
段15.上述段中任一段的iBBB，其中所述iBBB的长度是10至20微米。
段16.上述段中的任一段的iBBB，其中所述BEC血管为毛细血管大小。
段17.一种用于鉴定化合物对血脑屏障的作用的方法，包括：
提供上述段中任一段的iBBB，使所述iBBB的BEC血管与化合物接触，并检测所述化合物相对于未与所述化合物接触的iBBB对所述iBBB的作用。
段18.上述段中任一段的方法，其中所述化合物对iBBB的作用被测量为胞外基质因子的表达的变化。
段19.上述段中任一段的方法，其中所述化合物对iBBB的作用被测量为基因表达的变化。
段20.上述段中任一段的方法，其中所述化合物对iBBB的作用被测量为可溶性因子表达的变化。
段21.上述段中任一段的方法，其中所述化合物改变iBBB的一种或多种功能性质。
段22.上述段中任一段的方法，其中iBBB的功能性质是细胞迁移、分子渗透性或外排泵的极化。
段23.上述段中任一段的方法，其中所述化合物对iBBB的作用被测量为淀粉样蛋白沉积物的变化。
段24.一种鉴定淀粉样-β肽(Aβ)产生和/或积累的抑制剂的方法，包括：
使产生Aβ的细胞与APOE4阳性周细胞因子和至少一种候选抑制剂接触，并在存在和不存在所述候选抑制剂的情况下检测Aβ的量，其中在存在所述候选抑制剂的情况下与所述细胞相关的Aβ的量相对于在不存在所述候选抑制剂的情况下与所述细胞相关的Aβ的量的减少表明所述候选抑制剂是Aβ的抑制剂。
段25.上述段中任一段的方法，其中所述APOE4阳性周细胞因子是在APOE4周细胞条件培养基中的可溶性因子。
段26.上述段中任一项的方法，其中所述可溶性因子是APOE蛋白。
段27.上述段中任一项的方法，其中所述APOE4阳性周细胞因子是由周细胞产生的APOE蛋白。
段28.上述段中任一段的方法，其中所述产生Aβ的细胞表达APOE3。
段29.上述段中任一段的方法，其中所述产生Aβ的细胞具有APOE3/3基因型或APOE3/4基因型。
段30.上述段中任一段的方法，其中所述产生Aβ的细胞是APOE4阳性周细胞。
段31.上述段中任一段的方法，其中所述周细胞具有APOE4/4基因型。
段32.上述段中任一段的方法，其中所述周细胞具有APOE3/4基因型。
段33.上述段中任一段的方法，其中所述APOE4阳性周细胞因子是由与所述产生Aβ的细胞共孵育的APOE4周细胞产生的可溶性因子。
段34.上述段中任一段的方法，其中所述产生Aβ的细胞是星形胶质细胞或内皮细胞。
段35.上述段中任一段的方法，进一步包括提供上述段中任一段的iBBB，使所述iBBB的BEC血管与所述Aβ抑制剂接触，并检测所述Aβ抑制剂相对于未与所述Aβ抑制剂接触的iBBB对iBBB产生Aβ的作用。
段36.一种抑制受试者中淀粉样蛋白合成的方法，包括
通过鉴定受试者为APOE4阳性来确定受试者是否患有淀粉样蛋白积累或处于发生淀粉样蛋白积累的风险中，
如果所述受试者为APOE4阳性，则向所述受试者施用有效量的钙调磷酸酶/NFAT途径的抑制剂以抑制所述受试者中淀粉样蛋白合成，其中所述钙调磷酸酶/NFAT途径的抑制剂不是环孢菌素。
段37.一种抑制受试者中淀粉样蛋白合成的方法，包括
向患有CAA或具有患有CAA的风险的受试者施用有效量的钙调磷酸酶/NFAT途径的抑制剂以抑制所述受试者中淀粉样蛋白合成，其中所述钙调磷酸酶/NFAT途径的抑制剂不是环孢菌素。
段38.一种抑制受试者中淀粉样蛋白合成的方法，包括
向受试者施用有效量的C/EBP途径的抑制剂以抑制所述受试者中淀粉样蛋白合成。
段39.上述段中任一段的方法，其中所述受试者患有阿尔茨海默病。
段40.上述段中任一段的方法，其中所述受试者患有CAA。
段41.上述段中任一段的方法，其中所述受试者未被诊断患有阿尔茨海默病。
段42.上述段中任一段的方法，其中受试者未患有阿尔茨海默病。
段43.上述段中任一段的方法，其中所述钙调磷酸酶/NFAT途径的抑制剂是小分子抑制剂。
段44.上述段中任一段的方法，其中所述钙调磷酸酶/NFAT途径是抑制剂是FK506。
本说明书中公开的所有特征可以以任何组合方式组合。本说明书中公开的每个特征可以由用于相同、等同或类似目的替代特征来代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是一系列一般性的等同或类似特征的示例。从以上描述中，本领域技术人员可以容易地确定本公开的基本特征，并且在不偏离本公开的精神和范围的情况下，可以对本公开进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，其他实施方案也在权利要求书内。
等同物和范围
本领域技术人员将认识到或能够通过不超过常规实验而确定本文所述的本公开的具体实施方案的许多等同方案。本公开的范围不旨在被限制于以上描述，而是如所附权利要求书中所阐述的。在权利要求书中，除非相反地指出或从上下文中明显看出，否则诸如“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”的冠词可以表示一个或多于一个。如果一个、多于一个或所有组成员都存在于、用于给定的产物或方法或与给定的产物或方法相关，则包括在组的一个或多个成员之间的“或”的权利要求或说明书被视为满足，除非相反地指出或从上下文中明显看出。本公开包括其中组的正好一个成员存在于、用于给定产品或方法中或与给定产品或方法相关的实施方案。本公开包括其中多于一个或所有组成员存在于、用于给定产品或方法中或与给定产品或方法相关的实施方案。
此外，本公开涵盖了所有变型、组合和排列，其中来自一项或多项所列权利要求的一个或多个限定、要素、条款和描述性术语被引入另一项权利要求。例如，任何从属于另一项权利要求的权利要求都可以被修改，以包括在从属于同一项权利要求的任何其他权利要求中的一个或多个限定。在要素以列表形式(例如以马库什组格式)呈现的情况下，要素的每一子集也公开了，且可从所述组中移除任何要素。应当理解，一般而言，在本公开或本公开的方面被称为包括特定要素和/或特征的情况下，本公开的某些实施方案或本公开的方面由这样的要素和/或特征组成或基本上由这样的要素和/或特征组成。为了简单起见，这些实施方案没有具体地在本文的范围内阐述。还应注意，术语“包含/括”和“含有”旨在是开放的，并且允许包括另外的要素或步骤。在给出范围的情况下，包括端点。此外，除非另外指明或从上下文和本领域普通技术人员的理解中显而易见，否则表示为范围的值可在本公开的不同实施方案中采用所述范围内的任何具体值或子范围，直至范围下限的十分之一单位，除非上下文另外清楚地指明。
本申请涉及各种授权专利、公开的专利申请、期刊文章和其他出版物，所有这些文献通过引用并入本文。如果有任何并入的参考文献与本说明书之间的冲突，以本说明书为准。此外，落入现有技术范围内的本公开的任何特定实施方案可以明确地从任何一项或多项权利要求中排除。因为这样的实施方案被认为是本领域普通技术人员已知的，所以即使在此没有明确地阐述排除，也可以排除这些实施方案。出于任何原因，本公开的任何特定实施分方案可以从任何权利要求中排除，而不管是否与现有技术的存在相关。
本领域技术人员将认识到或能够通过不超过常规实验而确定本文所述的具体实施方案的许多等同方案。本文所述的本发明实施分方案的范围不旨在限于以上描述，而是如所附权利要求书中所陈述。本领域普通技术人员将理解，在不背离如所附权利要求中限定的本公开的精神或范围的情况下，可以对本描述进行各种改变和修改。

Claims (34)

1.包含3维(3D)基质的体外血脑屏障(iBBB)，其包含
人脑内皮细胞(BEC)血管，其由包封在3D基质中的人多能来源的阳性内皮细胞的大的互连网络组成，
在顶端表面上邻近BEC血管的人多能来源的周细胞，和
分散在整个3D基质中的人多能来源的星形胶质细胞，其中多个星形胶质细胞邻近BEC血管并具有进入血管周围空间的GFAP阳性突起。
2.权利要求1的iBBB，其中所述星形胶质细胞表达AQP4。
3.权利要求1-2中任一项的iBBB，其中所述3D基质包含LAMA4。
4.权利要求1-3中任一项的iBBB，其中所述BEC表达JAMA、PgP、LRP1和RAGE中的至少任一种。
5.权利要求1-4中任一项的iBBB，其中PgP和ABCG2在顶端表面上表达。
6.权利要求5的iBBB，其中在所述顶表面上表达的PgP和ABCG2的水平是在单独培养或与星形胶质细胞共培养的BEC上表达的PgP和ABCG2的水平的2-3倍。
7.权利要求1-6中任一项的iBBB，其中所述iBBB具有超过5500Ohm×cm2的TEER，相对于单独培养或与星形胶质细胞共培养的BEC，表现出降低的分子渗透性和外排泵极化。
8.权利要求1-7中任一项的iBBB，其中所述iBBB不与视黄酸一起培养。
9.权利要求1-8中任一项的iBBB，其中所述人多能细胞是iPSC衍生的CD144细胞。
10.权利要求1-9中任一项的iBBB，其中所述iBBB是使用5份内皮细胞比1份星形胶质细胞比1份周细胞产生的。
11.权利要求1-9中任一项的iBBB，其中所述iBBB是使用约1百万个内皮细胞/ml、约200000个星形胶质细胞/ml和约200000个周细胞/ml产生的。
12.权利要求1-11中任一项的iBBB，其中所述iBBB的长度是5至50微米。
13.权利要求1-11中任一项的iBBB，其中所述iBBB的长度是5至30微米。
14.权利要求1-11中任一项的iBBB，其中所述iBBB的长度是10至20微米。
15.权利要求1-11中任一项的iBBB，其中所述BEC细胞为毛细血管大小。
16.鉴定淀粉样蛋白-β肽(Aβ)产生和/或积累的抑制剂的方法，包括：
使产生Aβ的细胞与APOE4阳性周细胞因子和至少一种候选抑制剂接触，并在存在和不存在所述候选抑制剂的情况下检测Aβ的量，其中在存在所述候选抑制剂的情况下与所述细胞相关的Aβ的量相对于在不存在所述候选抑制剂的情况下与所述细胞相关的Aβ的量的减少表明所述候选抑制剂是Aβ的抑制剂。
17.权利要求16的方法，其中所述APOE4阳性周细胞因子是在APOE4周细胞条件培养基中的可溶性因子。
18.权利要求17的方法，其中所述可溶性因子是APOE蛋白。
19.权利要求16的方法，其中所述APOE4阳性周细胞因子是由周细胞产生的APOE蛋白。
20.权利要求16的方法，其中所述产生Aβ的细胞表达APOE3。
21.权利要求20的方法，其中所述产生Aβ的细胞具有APOE3/3基因型或APOE3/4基因型。
22.权利要求16的方法，其中所述产生Aβ的细胞是APOE4阳性周细胞。
23.权利要求18或权利要求22的方法，其中所述周细胞具有APOE4/4基因型。
24.权利要求18或权利要求22的方法，其中所述周细胞具有APOE3/4基因型。
25.权利要求16的方法，其中所述APOE4阳性周细胞因子是由与所述产生Aβ的细胞共孵育的APOE4周细胞产生的可溶性因子。
26.权利要求25的方法，其中所述产生Aβ的细胞是星形胶质细胞或内皮细胞。
27.权利要求16-26中任一项的方法，还包括提供权利要求1-15中任一项的iBBB，使所述iBBB的BEC血管与所述Aβ抑制剂接触，并检测所述Aβ抑制剂相对于未与所述Aβ抑制剂接触的iBBB对iBBB产生Aβ的作用。
28.抑制受试者中淀粉样蛋白合成的方法，包括
通过鉴定受试者为APOE4阳性来确定受试者是否患有淀粉样蛋白积累或处于发生淀粉样蛋白积累的风险中，
如果所述受试者为APOE4阳性，则向所述受试者施用有效量的钙调磷酸酶/NFAT途径的抑制剂以抑制所述受试者中淀粉样蛋白合成，其中所述钙调磷酸酶/NFAT途径的抑制剂不是环孢菌素。
29.权利要求28的方法，其中所述受试者患有阿尔茨海默病。
30.权利要求28的方法，其中所述受试者患有CAA。
31.权利要求28的方法，其中所述受试者未被诊断患有阿尔茨海默病。
32.权利要求28的方法，其中所述受试者未患有阿尔茨海默病。
33.权利要求28至32中任一项的方法，其中所述钙调磷酸酶/NFAT途径的抑制剂是小分子抑制剂。
34.权利要求28至33中任一项的方法，其中所述钙调磷酸酶/NFAT途径的抑制剂是FK506。
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