JP2022523051A - Ｉｎ Ｖｉｔｒｏのヒト血液脳関門 - Google Patents

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Abstract

本開示は、いくつかの態様において、in vivoのＢＢＢの機能的特性を有するin vitroの血液脳関門（ｉＢＢＢ）、ならびにｉＢＢＢを横断することができる化合物を同定する方法を提供する。ｉＢＢＢを横断することができる化合物およびかかる化合物の治療的使用もまた、記載される。

Description

政府の支援
本発明は、国立衛生研究所により付与された助成金番号1-U54-HG008097-03下において、政府の支援下によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
関連出願
本願は、２０１９年１月２２日に出願された米国仮特許出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６２／７９５，５２０に対する３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）下における優先権を主張し、当該仮出願は、その全体において本明細書において参考として援用される。
背景
脳における血管内皮細胞は、神経系と末梢との間で分子の交換を調節する高度に選択的なバリアを形成する。この血液脳関門（ＢＢＢ）は、正しい神経の機能のために重要であり、脳を病原体から保護し、細胞外液の組成を堅く制御している。ＢＢＢは、神経変性および加齢において顕著な役割を果たすと考えられている。ほとんどのアルツハイマー病（ＡＤ）患者および２０～４０％の非認知症の高齢者は、ＣＡＡとして知られる状態である、その脳血管に沿ったＡβの沈着を経験する。脳血管アミロイド沈着は、ＢＢＢの機能を損なう；結果として、ＣＡＡを有する個体は、脳虚血、微小出血、出血性卒中、感染症に罹患し易く、これらは、最終的に、神経変性および失認をもたらす。
要旨
本開示は、少なくとも部分的に、毛細血管の環境を効果的に模倣する血液脳関門の三次元（３Ｄ）モデルの開発に基づく。驚くべきことに、当該モデルは、アミロイドプラークの発生を評価するための正確な系を提供し、それにより、アミロイド蓄積を軽減することにおいて有効な化合物を同定およびスクリーニングするための有用な系を提供する。
したがって、本開示の一側面は、
３Ｄマトリックス中にカプセル化されたヒト多能性細胞由来陽性内皮細胞の大きな相互接続されたネットワーク、
頂端膜側においてＢＥＣ血管に近接するヒト多能性細胞由来周皮細胞、および
３Ｄマトリックス全体に分散したヒト多能性細胞由来星状膠細胞、ここで、複数の星状膠細胞が、ＢＥＣ血管に近接し、血管周囲腔中にＧＦＡＰ陽性突起を有する、
から構成される、ヒト脳内皮細胞（ＢＥＣ）血管の三次元（３Ｄ）マトリックスを含む、in vitroの血液脳関門（ｉＢＢＢ）を提供する。
別の側面において、三次元（３Ｄ）マトリックスを含む、in vitroの血液脳関門（ｉＢＢＢ）が提供される。ｉＢＢＢは、
３Ｄマトリックス中にカプセル化された内皮細胞の大きな相互接続されたネットワーク、
頂端膜側においてＢＥＣ血管に近接する周皮細胞、ここで、周皮細胞は、Ｅ４／Ｅ４遺伝子型を有する、および
ＢＥＣ血管に近接する星状膠細胞、ここで、複数の星状膠細胞は、血管周囲腔中に正の突起を有する、
から構成される、ヒト脳内皮細胞（ＢＥＣ）血管を有する。
いくつかの態様において、星状膠細胞は、ＡＱＰ４を発現する。いくつかの態様において、３Ｄマトリックスは、ＬＡＭＡ４を含む。いくつかの態様において、ＢＥＣは、ＪＡＭＡ、ＰｇＰ、ＬＲＰ１およびＲＡＧＥのうちの少なくともいずれか１つを発現する。いくつかの態様において、ＰｇＰおよびＡＢＣＧ２は、頂端膜側において発現される。いくつかの態様において、頂端膜側において発現されるＰｇＰおよびＡＢＣＧ２のレベルは、単独で培養されたかまたは星状膠細胞と共培養されたＢＥＣにおいて発現されるＰｇＰおよびＡＢＣＧ２のレベルよりも、２～３倍大きい。いくつかの態様において、ｉＢＢＢは、５，５００Ｏｈｍ×ｃｍ２を超えるＴＥＥＲを有し、単独で培養されたかまたは星状膠細胞と共培養されたＢＥＣと比較して、排出ポンプの分子透過性および極性化の低下を示す。いくつかの態様において、ｉＢＢＢは、レチノイン酸と共に培養されない。
いくつかの態様において、ヒト多能性細胞は、ｉＰＳＣ由来ＣＤ１４４細胞である。他の態様において、ｉＢＢＢは、５部の内皮細胞：１部の星状膠細胞：１部の周皮細胞を用いて作製される。さらに他の態様において、ｉＢＢＢは、１ｍｌあたり約１，０００，０００個の内皮細胞、１ｍｌあたり約２００，０００個の星状膠細胞、および１ｍｌあたり約２００，０００個の周皮細胞を用いて作製される。
いくつかの態様において、ｉＢＢＢは、毛細血管と類似のサイズを有する。いくつかの態様において、ｉＢＢＢは、長さ５～５０ミクロンである。いくつかの態様において、ｉＢＢＢは、長さ５～３０ミクロンである。いくつかの態様において、ｉＢＢＢは、長さ１０～２０ミクロンである。いくつかの態様において、ＢＥＣ血管は、毛細血管サイズである。他の態様において、ｉＢＢＢは、長さ３～５０ミクロン、５～４５ミクロン、５～４０ミクロン、５～３５ミクロン、５～３０ミクロン、５～２５ミクロン、５～２０ミクロン、５～１５ミクロン、５～１０ミクロン、８～５０ミクロン、８～４５ミクロン、８～４０ミクロン、８～３５ミクロン、８～３０ミクロン、８～２５ミクロン、８～２０ミクロン、８～１５ミクロン、８～１０ミクロン、１０～５０ミクロン、１０～４５ミクロン、１０～４０ミクロン、１０～３５ミクロン、１０～３０ミクロン、１０～２５ミクロン、１０～２０ミクロン、１０～１５ミクロン、または１０～１２ミクロンである。
本明細書において記載されるようなｉＢＢＢを提供すること、ｉＢＢＢのＢＥＣ血管を化合物と接触させること、および当該化合物と接触させられていないｉＢＢＢと比較して、ｉＢＢＢに対する化合物の効果を検出することにより、血液脳関門に対する化合物の効果を同定するための方法が、本発明の他の側面において提供される。
いくつかの態様において、ｉＢＢＢに対する化合物の効果は、細胞外マトリックス因子の発現の変化として測定される。いくつかの態様において、ｉＢＢＢに対する化合物の効果は、遺伝子の発現の変化として測定される。いくつかの態様において、ｉＢＢＢに対する化合物の効果は、可溶性因子の発現の変化として測定される。いくつかの態様において、化合物は、ｉＢＢＢの１つ以上の機能的特性を変更する。いくつかの態様において、ｉＢＢＢの機能的特性は、細胞遊走、排出ポンプの分子透過性または極性化である。いくつかの態様において、ｉＢＢＢに対する化合物の効果は、アミロイド沈着の変化として測定される。
他の側面において、Ａβ産生細胞を、ＡＰＯＥ４陽性周皮細胞因子および少なくとも１つの候補阻害剤と接触させること、ならびに候補阻害剤の存在下および不在下におけるＡβの量を検出すること、により、アミロイド－βペプチド（Ａβ）の産生および／または蓄積の阻害剤を同定するための方法が提供され、ここで、候補阻害剤の不在下における細胞と関連するＡβの量と比較した、候補阻害剤の存在下における細胞と関連するＡβの量の低下は、候補阻害剤がＡβの阻害剤であることを示す。
いくつかの態様において、ＡＰＯＥ４陽性周皮細胞因子は、ＡＰＯＥ４周皮細胞条件培地中の可溶性因子である。いくつかの態様において、可溶性因子は、ＡＰＯＥタンパク質である。いくつかの態様において、ＡＰＯＥ４陽性周皮細胞因子は、周皮細胞により産生されるＡＰＯＥタンパク質である。いくつかの態様において、Ａβ産生細胞は、ＡＰＯＥ３を発現した。いくつかの態様において、Ａβ産生細胞は、ＡＰＯＥ３／３遺伝子型またはＡＰＯＥ３／４遺伝子型を有する。いくつかの態様において、Ａβ産生細胞は、ＡＰＯＥ４陽性周皮細胞である。いくつかの態様において、周皮細胞は、ＡＰＯＥ４／４遺伝子型を有する。いくつかの態様において、周皮細胞は、ＡＰＯＥ３／４遺伝子型を有する。いくつかの態様において、ＡＰＯＥ４陽性周皮細胞因子は、Ａβ産生細胞と共培養されたＡＰＯＥ４周皮細胞により産生された可溶性因子である。いくつかの態様において、Ａβ産生細胞は、星状膠細胞または内皮細胞である。いくつかの態様において、方法は、本明細書において記載されるようなｉＢＢＢを提供すること、ｉＢＢＢのＢＥＣ血管をＡβの阻害剤と接触させること、およびｉＢＢＢによるＡβの産生に対するＡβの阻害剤の効果を、Ａβの阻害剤と接触させられていないｉＢＢＢと比較して検出すること、をさらに含む。
いくつかの側面において、対象においてアミロイド合成を阻害するための方法が提供される。該方法は、対象をＡＰＯＥ４陽性として同定することにより、対象がアミロイド蓄積を有するか、またはアミロイド蓄積を発症するリスクがあるか否かを決定すること、対象がＡＰＯＥ４陽性である場合、対象に、カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路の阻害剤を、対象においてアミロイド合成を阻害するための有効量において投与することを含む。いくつかの態様において、カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路の阻害剤は、シクロスポリンではない。
他の側面において、ＣＡＡを有するか、またはＣＡＡを有するリスクがある対象に、カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路の阻害剤を、対象においてアミロイド合成を阻害するための有効量において投与することにより、対象においてアミロイド合成を阻害するための方法が提供され、ここで、カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路の阻害剤は、シクロスポリンではない。
他の側面において、Ｃ／ＥＢＰ経路の阻害剤を、対象においてアミロイド合成を阻害するための有効量において、対象に投与することにより、対象においてアミロイド合成を阻害するための方法が提供される。
いくつかの態様において、対象は、ＣＡＡを有する。いくつかの態様において、対象は、アルツハイマー病を有する。いくつかの態様において、対象は、アルツハイマー病を診断されていない。いくつかの態様においては、アルツハイマー病を有しない。
いくつかの態様において、カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路の阻害剤は、小分子阻害剤である。いくつかの態様において、カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路の阻害剤は、ＦＫ５０６である。いくつかの態様において、カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路の阻害剤は、シクロスポリンである。
本発明の１つ以上の態様の詳細を、以下の説明において記載する。本発明の他の特徴および利点は、以下の図面およびいくつかの態様の詳細な説明から、また添付の請求の範囲からも、明らかであろう。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本明細書において提示される具体的な態様の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面のうちの１つ以上を参照することによってより良好に理解され得る本開示のある側面をさらに示すために含められる。
図１Ａ～１Ｏ．in vitroでのヒト血液脳関門（ｉＢＢＢ）の解剖学的および生理学的特性の再構成。１Ａ、ｉＰＳＣからのｉＢＢＢ形成の模式図。１Ｂ、内皮細胞マーカーＣＤ１４４について染色されたｉＢＢＢは、多細胞の内皮血管の存在を示している。スケールバー、５０μｍ。１Ｃ、周皮細胞は、培養中で２週間後には内皮血管に局在する。周皮細胞をＳＭ２２（別名ＴＡＧＬＮ）で標識し、ＢＥＣをタイトジャンクションタンパク質ＺＯ－１で標識する。スケールバー、５０μｍ。１Ｄ、周皮細胞をＮＧ２で、ＢＥＣをＣＤ１４４で標識する。１Ｅ、星状膠細胞は、培養中で２週間後には内皮血管を取り囲んだ。星状膠細胞をＧＦＡＰで標識し、ＢＥＣをＣＤ１４４で標識する。スケールバー、５０μｍ。１Ｆ、アクアポリン４（ＡＱＰ４）は、ＺＯ－１、汎用星状膠細胞マーカーＳ１００βで標識したＢＥＣ血管において発現した。スケールバー、５０μｍ。 図１Ａ～１Ｏ．in vitroでのヒト血液脳関門（ｉＢＢＢ）の解剖学的および生理学的特性の再構成。１Ｇ、ＢＢＢモデルの予測マーカーであると報告されている遺伝子の発現を測定するｑＲＴ－ＰＣＲ。ＢＥＣ細胞数における潜在的差異を説明するために、全ての発現を汎用内皮マーカーであるＰＥＣＡＭに対して正規化する。ＣＬＤＮ、ＲＡＧＥ、ＪＡＭＡ、およびＬＲＰ１；ｐ＜０．０００１。ＰｇＰ；ｐ＝０．０００１、ＧＬＵＴ１；ｐ＝０．００３２。 図１Ａ～１Ｏ．in vitroでのヒト血液脳関門（ｉＢＢＢ）の解剖学的および生理学的特性の再構成。１Ｈ、ＢＢＢにおいて見出されるトランスポーター、接着分子、および排出ポンプおよびタイトジャンクションの発現を測定するｑＲＴ－ＰＣＲ。全ての発現レベルをＢＥＣ単独に対して正規化する。Ｙ軸は、ｉＢＢＢから単離されたＢＥＣにおける発現レベルを、単独で培養されたＢＥＣに対して正規化したものである。Ｘ軸は、星状膠細胞と共培養されたＢＥＣを、単独で培養されたＢＥＣに対して正規化したものである。円は、３回の生物学的複製および３回のＰＣＲの複製からの平均値を表す。１Ｉ、ｉＢＢＢ透過性を測定するためのトランスウェルの設定を表す模式図。１Ｊ、トランスウェルメンブレン上で共培養されたＢＥＣ（ＺＯ－１）、周皮細胞（ＳＭ２２）および星状膠細胞（Ｓ１００β）の代表的な画像。 図１Ａ～１Ｏ．in vitroでのヒト血液脳関門（ｉＢＢＢ）の解剖学的および生理学的特性の再構成。１Ｋ、ＨｕＶＥＣ、ＨｕＶＥＣプラス周皮細胞（Ｐ）および星状膠細胞（Ａ）、ＢＥＣのみ、およびｉＢＢＢからの経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）測定。円は、個々のトランスウェルからの１回の測定を表す。ボンフェローニ事後分析による一方向ＡＮＯＶＡにより差異を分析した（ｐ＜０．０００１）。１Ｌ、ＢＥＣ単独またはｉＢＢＢについて蛍光標識された分子の透過性。全ての値を、ブランクのトランスウェルメンブレンを通る各々の分子の透過性のパーセンテージとして報告する。星は、多重スチューデントｔ検定により決定される有意性を表す（ＦＤＲ＝０．０１）。１Ｍ、ｉＢＢＢのＢＢＢ特性は、周皮細胞と星状膠細胞との協調的相互作用を必要とする。４ｋＤａのデキストランの透過性を、ｉＢＢＢにおいて定量し、２×周皮細胞、２×星状膠細胞と一緒のＢＥＣ、またはマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）と一緒のＢＥＣと比較した。透過性を、ＢＥＣ単独に対して正規化する。ボンフェローニ多重比較による一方向ＡＮＯＶＡ（ｐ＜０．０００１）。 図１Ａ～１Ｏ．in vitroでのヒト血液脳関門（ｉＢＢＢ）の解剖学的および生理学的特性の再構成。１Ｎ、ＡＢＣＧ２発現は、ｉＢＢＢにおいて上方調節される。ボンフェローニ事後分析による一方向ＡＮＯＶＡ（ｐ＜０．０００１）。１Ｏ、Ｐｇｐの極性化を、ＢＥＣ単層およびｉＢＢＢの両方について、頂端膜側から基底膜側へ、およびその逆の、ローダミン１２３の輸送により測定した。阻害剤処置された試料を、各々の対応する阻害剤で処置されていない試料に対して正規化した。星は、多重スチューデントｔ検定により決定される有意性を表す（ＦＤＲ＝０．０１）。
図２Ａ～２Ｌ．ＡＰＯＥ４は、ｉＢＢＢにおいてＡβ蓄積を増大させる。２Ａ、ｉＢＢＢを外因性アミロイド－β２Ｂに暴露させるための実験パラダイムを表す模式図であって、Ａβは、ＡＰＰ重複（ＡＰＰ１．１）を有する家族性ＡＤ患者からのｉＰＳＣ由来神経細胞により条件付けされた培地に暴露された非ＡＤのｉＢＢＢにおいて、選択的に蓄積する。健康な７５歳の女性からのＡＰＯＥ３／３のｉＰＳＣ株（Ｅ３／３親）に由来するｉＢＢＢ。６ｅ１０抗体は、Ａβ１－１６エピトープを認識する。スケールバー、５０μｍ。２Ｃ、ＡＰＯＥ３／３親のｉＰＳＣ株を、アイソジェニックなＡＰＯＥ４／４へと遺伝子編集し、遺伝的に同一なｉＢＢＢの作製を可能にした。アイソジェニックなＡＰＯＥ４／４のｉＢＢＢは、親ＡＰＯＥ３／３のｉＢＢＢと比較して、ＡＰＰ１．１条件培地に同時に９６時間にわたり暴露した場合に、より多くのＡβを蓄積した。スケールバー、５０μｍ。 図２Ａ～２Ｌ．ＡＰＯＥ４は、ｉＢＢＢにおいてＡβ蓄積を増大させる。２Ｄ、レシプロカルな遺伝子編集戦略による２つのアイソジェニックなｉＢＢＢにおけるＡβ蓄積の定量。矢印は、遺伝子編集の方向を示し、ここで、右向き矢印はＡＰＯＥ３／３からＡＰＯＥ４／４への編集を示し、左向き矢印はＡＰＯＥ４／４からＡＰＯＥ３／３への編集を示す。Ａβについて陽性の総面積を、総核数で除算し、次いで、Ｅ３／Ｅ３の平均が１００％となるように、全てのＥ３／３試料からの平均アミロイド／核に対して正規化した。ＩｍａｇｅＪにより自動画像分析を行った。スチューデントｔ検定（ｐ＝０．０１１４）。２Ｅ、ＡＰＯＥ３／４のヘテロ接合性ｉＢＢＢは、ＡＰＯＥ３／３のｉＢＢＢよりも著しく多くのＡβを蓄積する。定量は、２Ｄにおいて記載されるように行った。２Ｆ、アイソジェニックなＡＰＯＥ３／３およびＡＰＯＥ４／４個体に由来するｉＢＢＢは、抗アミロイド抗体Ｄ５４Ｄ２により、高いレベルのアミロイド蓄積アッセイを示すことを表す、代表的な画像。 図２Ａ～２Ｌ．ＡＰＯＥ４は、ｉＢＢＢにおいてＡβ蓄積を増大させる。２Ｇ、アイソジェニックなｉＢＢＢにおけるアミロイドの、チオフラビンＴ（ｐ＝０．０２５８）、ならびに２つの異なるアミロイド抗体Ｄ５４Ｄ２（ｐ＝０．００２０）および１２Ｆ４（ｐ＝０．００５４）についての定量。２Ｈ、２０ｎＭのＡβ１－４０との播種の９６時間後のｉＢＢＢ培養培地中の残留物における、可溶性とそれに対する不溶性のＡβ１－４０の定量（ｐ＝０．０３１９）。２Ｉ、ＡＰＯＥ３／３およびＡＰＯＥ４／４のｉＢＢＢにおける血管アミロイド蓄積を表す代表的三次元IMARISレンダリング。ｉＢＢＢを、１か月間にわたり成熟させ、次いで、ｆＡＤ ＡＰＰ１．１株からのニューロンの条件培地に同時に暴露した。IMARISソフトウェアを用いて、６ｅ１０およびＶｅｃａｄ染色の三次元表面を作製した。２０μＭのＶｅｃａｄ表面中の６ｅ１０の総面積を測定した。これを、Ｖｅｃａｄ表面の総面積に対して正規化した。スケールバー、１０μｍ。 図２Ａ－２Ｌ．ＡＰＯＥ４は、ｉＢＢＢにおいてＡβ蓄積を増大させる。２Ｊ、IMARISソフトウェアを用いた血管（ＢＥＣ血管から＜２０μｍ）（ｐ＝０．００５５）および非血管（ＢＥＣ血管から＞２０μｍ）（ｐ＝０．００６２）の定量。各々の画像について、アミロイド面積を、総血管面積に対して正規化した。２Ｋ、星状膠細胞マーカーＳ１００βについて陽性の非血管細胞におけるアミロイド蓄積を表す代表的な画像。スケールバー、μｍ。２Ｌ、各々のアイソジェニックな遺伝子型について、アミロイドについて陽性の星状膠の数を示す定量（ｐ＝０．０００３）。
図３Ａ～３Ｅ．周皮細胞は、ｉＢＢＢにおけるＡβ沈着の増大のために必要とされる。３Ａ、Ｅ３／３およびＥ４／４のアイソジェニックな細胞型の組み合わせの交換により、周皮細胞におけるＥ４／４発現がＡβのｉＢＢＢ蓄積の増大のために必要とされることが明らかとなることを表す代表的な画像。 図３Ａ～３Ｅ．周皮細胞は、ｉＢＢＢにおけるＡβ沈着の増大のために必要とされる。３Ｂ、組み合わせのマトリックスの各々の順列についての、アイソジェニックなｉＢＢＢにおけるＡβ蓄積の定量。３Ｃ、相対的なＡβレベル（低いまたは高い）に基づいて各々のアイソジェニックな順列を分離することにより、Ｅ３／３およびＥ４／４のＢＥＣならびに星状膠細胞は、２つの条件の間で同等に表されるが、周皮細胞はそうではないことが明らかとなる。低いＡβ条件については、Ｅ３／３周皮細胞のみが存在する。対照的に、高いＡβ条件については、Ｅ４／４周皮細胞のみが存在する。 図３Ａ～３Ｅ．周皮細胞は、ｉＢＢＢにおけるＡβ沈着の増大のために必要とされる。３Ｄ、ＡＰＯ３／３（３）に由来するｉＢＢＢにおけるＡβ蓄積の定量、Ｈ９はＡＰＯＥ３／４ヘテロ接合性であり、２１０はＡＰＯＥ３／３ホモ接合性である。３Ｅ、アイソジェニックなｉＢＢＢ、およびＥ３／３（親）またはＥ４／４（アイソジェニック）の周皮細胞のいずれかからの周皮細胞条件培地により処置されたＡＰＯＥ３／３のｉＢＢＢにおける、Ａβ蓄積の定量。培地は、４８時間にわたり条件付けされ、ｉＢＢＢを、１：１の比のフレッシュな培地と２０ｎＭのＡβ－ＦＩＴＣと共に９６時間にわたり添加した。
図４Ａ～４Ｌ．ＡＰＯＥおよびカルシニューリンシグナル伝達は、ＡＰＯＥ４周皮細胞において上方調節される。４Ａ、アイソジェニックなＡＰＯＥ３／３およびＡＰＯＥ４／４周皮細胞の間で差次的に発現される遺伝子を表すヒートマップ（ｑ＝０．０１）。４Ｂ、ＡＰＯＥ遺伝子発現は、ＡＰＯＥ４／４周皮細胞において著しく上方調節されるが、一方、Ｅ４／４星状膠細胞においてはそれは下方調節される。ＲＮＡｓｅｑ実験のために用いられたものとは異なるＲＮＡからのｑＲＴ－ＰＣＲからの発現値。星状膠細胞（ｐ＝０．０００９）、周皮細胞（ｐ＜０．０００１）。４Ｃ、アイソジェニックな周皮細胞におけるＡＰＯＥの免疫蛍光染色および定量。スケールバー、５０μｍ。点は、単一のウェルからの４枚の独立した画像からの平均ＡＰＯＥ蛍光強度である。各々の遺伝子型について、４個のウェルを測定した。独立両側ｔ検定（ｐ＝０．０００５）。４Ｄ、ＡＰＯＥがアイソジェニックな周皮細胞におけるＡＰＯＥタンパク質についてのウェスタンブロットおよび定量。周皮細胞における２つの構成的に発現されるタンパク質である平滑筋アクチン（ＳＭＡ）およびＧＡＰＤＨを含めた（ｐ＝０．００３３）。４Ｅ、Ｅ４／４からＥ３／３へと編集されたさらなるアイソジェニックペアならびに孤発性ＡＤを有する個体に由来するｉＰＳＣ株およびＨ９ ｈＥＳＣ株からの３つのＡＰＯＥ３／４ヘテロ接合性周皮細胞において、ＡＰＯＥ遺伝子発現もまた上方調節されることを示すｑＲＴ－ＰＣＲ。矢印は、遺伝子編集の方向を示した。全ての値を、全ＡＰＯＥ３／３（ｎ＝４）周皮細胞における平均発現に対して正規化する。有意性は、Ｅ３／３周皮細胞に対するボンフェローニ多重比較検定による一方向ＡＮＯＶＡ（ｐ＜０．０００１）により決定される。 図４Ａ～４Ｌ．ＡＰＯＥおよびカルシニューリンシグナル伝達は、ＡＰＯＥ４周皮細胞において上方調節される。４Ｆ、ＡＰＯＥ４キャリアの死後の海馬から単離された周皮細胞におけるＡＰＯＥ発現を表すバイオリンプロット。両側ウィルコクソン順位和検定を用いて、差次的な発現を測定し、ＡＰＯＥの発現が検出された細胞を考慮した。４Ｇ、ＡＰＯＥ４キャリア（ｎ＝６）および非キャリア（ｎ＝６）からの死後脳における海馬ＮＧ２陽性周皮細胞におけるＡＰＯＥタンパク質の発現を表す代表的な画像および定量。各々の遺伝子型について、２５０個より多くのＮＧ２陽性周皮細胞を同定した。独立ｔ検定、ｐ＝０．００６８。４Ｈ、遺伝子ノックアウト（ＫＯ）によりＡＰＯＥを欠損するアイソジェニックなｉＢＢＢは、Ｅ３／３のｉＢＢＢと類似のアミロイド蓄積を提示する。有意性は、ボンフェローニ多重比較検定による一方向ＡＮＯＶＡ（ｐ＜０．０００１）として提示される。４Ｉ、ＡＰＯＥ４周皮細胞条件培地からのＡＰＯＥを免疫枯渇させることにより、ＡＰＯＥ３のｉＢＢＢにおけるアミロイド蓄積が著しく減少する。ボンフェローニ多重比較検定による一方向ＡＮＯＶＡ（ｐ＜０．０００１）。 図４Ａ～４Ｌ．ＡＰＯＥおよびカルシニューリンシグナル伝達は、ＡＰＯＥ４周皮細胞において上方調節される。４Ｊ、ＡＰＯＥ３／３およびＥ４／４のアイソジェニックペアの間で差次的に発現される転写因子（ｑ＜０．０５）。強調された５つの転写因子は、ＡＰＯＥ遺伝子制御エレメントに結合することが報告されている。４Ｋ、ＮＦＡＴｃ１およびＳＭ２２について染色されたＡＰＯＥアイソジェニック周皮細胞。ＮＦＡＴｃ１は、細胞質および核の両方において存在する。カルシニューリンによるＮＦＡＴの脱リン酸化は、ＮＦＡＴの核への転位をもたらす。各々のＡＰＯＥ３／３およびＡＰＯＥ４／４についての核ごとのＮＦＡＴｃ１染色の定量。各々の遺伝子型について、１５０個の細胞を分析した。有意性は、スチューデントｔ検定により決定された（ｐ＜０．０００１）。４Ｌ、Ｎｆａｔｃ１発現。独立両側ｔ検定（ｐ＝０．００４１）。両側ウィルコクソン順位和検定を用いて測定し、ＡＰＯＥの発現が検出された細胞を考慮した。
図５Ａ～５Ｎ．カルシニューリンの阻害は、ＡＰＯＥ発現を低下させ、Ａβ沈着を回復させる。５Ａおよび５Ｂ、ＤＭＳＯ、ＣｓＡ、ＦＫ５０６またはＩＮＣＡ６による２週間の処置の後の、アイソジェニック（ａ）およびヘテロ接合性（ｂ）の周皮細胞におけるＡＰＯＥの発現。ボンフェローニ多重比較による一方向ＡＮＯＶＡ（ｐ＜０．０００１）。 図５Ａ～５Ｎ．カルシニューリンの阻害は、ＡＰＯＥ発現を低下させ、Ａβ沈着を回復させる。５Ｃ、可溶性ＡＰＯＥタンパク質は、カルシニューリン阻害剤ＣｓＡによる２週間の処置の後で、著しく減少する。周皮細胞条件培地中のＡＰＯＥ濃度を、ＥＬＩＳＡを用いて３回の個別の生物学的複製から定量した。多重スチューデントｔ検定。発見は、ＤＲ法を用いて、ベンジャミーニ・．ホッホベルクにより、Ｑ＝１％により決定した。５Ｄおよび５Ｅ、ＮＦＡＴｃ１（ｄ）およびＡＰＯＥ（ｅ）の発現は、周皮細胞においてＣｓＡ処置により下方調節される。バーは、３回の生物学的複製からの平均値である。ボンフェローニ多重比較による一方向ＡＮＯＶＡ（ＮＦＡＴｃ１、ｐ＝０．００１３；ＡＰＯＥ、ｐ＜０．０００１）。 図５Ａ～５Ｎ．カルシニューリンの阻害は、ＡＰＯＥ発現を低下させ、Ａβ沈着を回復させる。５Ｆ、ＤＭＳＯで処置されたアイソジェニックなＡＰＯＥ３／３周皮細胞とＤＭＳＯまたは２μＭのＣｓＡで処置されたＡＰＯＥ４／４周皮細胞との間で差次的に発現される遺伝子を表すヒートマップ。スピアマンの順位相関を用いる階層的クラスタリングにより組織化された遺伝子、および平均連鎖。ボックスは、まとまった遺伝子のクラスター化を概説する。各々のクラスターについての合計の遺伝子を、ヒートマップの右側に提示し、表された値は、３回の独立した生物学的複製からの平均の正規化されたカウントである。５Ｇ、ＤＭＳＯ、ＣｓＡまたはＦＫ５０６で２週間にわたり処置され、次いで２０ｎＭのＡβ－ＦＩＴＣに９６時間にわたり暴露されたＥ４／４周皮細胞の代表的な画像。５Ｈ、ＤＳＭＯ、ＣｓＡまたはＦＫ５０６で処置されたｉＢＢＢにおけるＡβ蓄積の定量。ｉＢＢＢを、化学物質で２週間にわたり前処置し、次いで、２０ｎＭのＡβに９６時間にわたり暴露した。有意性は、ボンフェローニ多重比較による一方向ＡＮＯＶＡを介して決定した（ｐ＜０．０００１）（スケールバー＝１０μｍ）。 図５Ａ～５Ｎ．カルシニューリンの阻害は、ＡＰＯＥ発現を低下させ、Ａβ沈着を回復させる。５Ｉ、ＤＳＭＯ、ＣｓＡまたはＦＫ５０６により処置されたＡＰＯＥ３／４ヘテロ接合性ｉＢＢＢにおけるＡβ蓄積の定量。ｉＢＢＢを、化学物質で２週間にわたり前処置し、次いで、２０ｎＭのＡβに９６時間にわたり暴露した。有意性は、ボンフェローニ多重比較による一方向ＡＮＯＶＡを介して決定した（ｐ＜０．０００１）。５Ｊ、培地の回収の前に少なくとも１週間にわたりカルシニューリン阻害剤で処置されたＡＰＯＥ４／４周皮細胞からの条件培地で処置されたｉＢＢＢにおけるＡβ蓄積の定量。ボンフェローニ多重比較による一方向ＡＮＯＶＡ（ｐ＜０．０００１）。５Ｋ、シクロスポリンＡまたはビヒクルのいずれかで処置されたマウスの海馬におけるＡＰＯＥタンパク質濃度。ＡＰＯＥは、ＥＬＩＳＡにより測定した。各々の点は、１個体のマウスから平均ＡＰＯＥ濃度を表す。独立両側ｔ検定（ｐ＝０．０４５６）。 図５Ａ～５Ｎ．カルシニューリンの阻害は、ＡＰＯＥ発現を低下させ、Ａβ沈着を回復させる。５Ｌ、シクロスポリンＡまたはビヒクルで処置されたＡＰＯＥ４ ＫＩ×５ｘＦＡＤマウスからの、代表的な画像および皮質の周皮細胞におけるＡＰＯＥについての免疫染色の定量。独立両側ｔ検定（ｐ＝０．０４２７）。５Ｍ、ＣｓＡでの３週間の処置の後での血管ＡＰＯＥタンパク質およびアミロイドの同時の減少の代表的な画像。５Ｎ、ビヒクルまたはＣｓＡのいずれかによる３週間にわたる処置の後での６か月齢ＡＰＯＥ４ＫＩ×５ＸＦＡＤメスマウスの海馬における、代表的な画像および血管アミロイドの定量。アミロイドを検出し、２つの独立した抗アミロイド抗体（６ｅ１０および１２Ｆ４）により定量した。独立両側ｔ検定（６ｅ１０、ｐ＝０．００５５；１２Ｆ４、ｐ＝０．０２４２）（スケールバー＝２５μｍ）。
６Ａおよび６Ｂ、ＣＤ１４４（ＶＥ－カドヘリン）、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ）、ＺＯ１およびＧＬＵＴ１で染色されたｉＰＳＣ由来脳内皮細胞。６Ｃおよび６Ｄ、ＧＦＡＰ、Ｓ１００βおよびＡＱＰ４で染色されたｉＰＳＣ由来星状膠細胞。 ６Ｅおよび６Ｆ．ｉＰＳＣ由来星状膠細胞において差次的に上方調節されることが報告されている遺伝子で上位のものの、ＲＮＡ配列決定から比較発現分析。星状膠細胞と比較した場合、６Ｅ、線維芽細胞、および６Ｆ、乏突起膠細胞、６Ｇ、６Ｈ、６Ｉ．ＣＤ１３、ＳＭ２２、ＮＧ２およびＳＭＡで染色されたｉＰＳＣ由来周皮細胞。 ６Ｊ．周皮細胞において、平滑筋細胞（ＳＭＣ）と比較して、差次的に上方調節される遺伝子で上位のものの比較発現分析。発現は、バルクＲＮＡ配列決定からのＦＰＫＭ値として表される。６Ｋ、ＳＭＣにおいて、周皮細胞と比較して、差次的に上方調節される遺伝子で上位のものの比較発現分析。発現は、バルクＲＮＡ配列決定からのＦＰＫＭ値として表される。６Ｌ、周皮細胞において、線維芽細胞と比較して、上位３つの差次的に上方調節される遺伝子の発現。６Ｍ、線維芽細胞において、周皮細胞と比較して、上位３つの差次的に上方調節される遺伝子の発現。 ６Ｎ、ｉＰＳＣ由来周皮細胞における周皮細胞および間葉系のマーカー遺伝子の発現。６Ｅ、６Ｆ、６Ｊ、６Ｋ、６Ｌ、６Ｍについて、差次的な遺伝子のリストは、ｉＰＳＣ由来の星状膠細胞および周皮細胞のバルクＲＮＡ配列決定からのＦＰＫＭと比較した、平均カウントとして示される提供される分析に基づく。６Ｏ、トランスクリプトームの網羅的な階層的クラスタリング（２３，５８８個の遺伝子）は、ｉＰＳＣ由来周皮細胞は、初代ヒト脳周皮細胞とクラスター化することを示す。クラスター化は、完全連鎖によるスペルマン順位相関により行った。マウス脳周皮細胞転写データセットはＧＳＥ１１７０８３から、動脈の平滑筋細胞（ＳＭＣ）のデータセットはＧＳＥ７８２７１から得た。
７Ａ、ＣＤ１４４で染色された内皮細胞の三次元血管ネットワーク。スケールバー＝２００μｍ。７Ｂ、形成の１週間後、ＳＭ２２で標識された周皮細胞が均一に分散され、未発達の血管が形成し始める。２週間後。内皮血管が形成され、周皮細胞が血管周囲腔にホーミングされた。７Ｃ、星状膠細胞は、ｉＢＢＢ培養物全体にわたり分散される。 ７Ｄ、対での、および組み合わせての、各々の細胞型単独におけるＡＱＰ４のｍＲＮＡ発現。７Ｅ、星状膠細胞を含まないｉＢＢＢは、ＡＱＰ４について染色されない。星状膠細胞を含むｉＢＢＢにおいて、ＡＱＰ４は内皮血管に沿って高密度で染色される。 ７Ｆ、ＬＡＭＡ４についての免疫染色は、マトリゲルがＬＡＭＡ４を含まないことを示すが、しかし、ｉＢＢＢ培養物は、内皮血管を囲む基底膜を、ＬＡＭＡ４を含むようにリモデリングする。７Ｇ、ＰＬＶＡＰ ｍＲＮＡ発現は、ｉＢＢＢ培養物からのＢＥＣにおいて、単独で培養されたＢＥＣと比較して、上方調節される。７Ｈ、ＰＬＶＡＰ ｍＲＮＡ発現は、ｉＢＢＢからのＢＥＣにおいて、培養培地からのＶＥＧＦＡの除去により下方調節される。７Ｉ、トランスウェル形式において培養されたｉＢＢＢは、高レベルのＢＢＢマーカーＣＬＤＮ５およびＺＯ１を発現する。７Ｊ、ＡＢＣＧ２の極性化を、ＢＥＣ単層およびｉＢＢＢの両方について、頂端膜側から基底膜側へ、およびその逆のヘキスト輸送により測定した。ＡＢＣＧ２特異的阻害剤ＫＯ１４３で処置された試料を、各々の対応する非阻害剤で処置された試料に対して正規化した。星は、多重スチューデントｔ検定により決定される有意性を表す（ＦＤＲ＝０．０１）。
８Ａ、ＡＰＰ遺伝子の複製（ＡＰＰ１．１）を有する家族性ＡＤ患者のｉＰＳＣから作製されたｉＢＢＢは、本質的には、非ＡＤ対照（ＡＧ０９１７３）より高いアミロイドレベルを有しない。８Ｂ、ＰＳＥＮ１遺伝子における家族性ＡＤ関連変異（Ｍ１４６Ｉ）を有するｉＰＳＣから作製されたｉＢＢＢは、本質的には、その非ＡＤアイソジェニック対照より高いアミロイドレベルを有しない。８Ｃ、家族性ＡＤ患者に由来する神経細胞により条件付けされた培地は、著しく高いＡβ（１－４２）を有する。スチューデントｔ検定（ｐ＝０．００２２）。８Ｄ、ＡＰＯＥ３／４個体に由来するｉＢＢＢが、ＡＰＯＥ３／３個体から作製されたｉＢＢＢと比較して高レベルのＡβ蓄積を示すことを表す代表的な画像。 ８Ｅおよび８Ｆ、アイソジェニックなＡＰＯＥ３／３およびＡＰＯＥ４／４個体に由来するｉＢＢＢは、抗アミロイド抗体チオフラビンＴ（ｆ）および１２Ｆ４（ｅ）により、高レベルのアミロイド蓄積を示すアッセイを表す代表的な画像。８Ｇおよび８Ｈ、１－４０および１－４２アイソフォームについて、２０ｎＭのＡβ－ＦＩＴＣに暴露されたアイソジェニックｉＢＢＢにおける、代表的な画像およびＡβ蓄積の定量。Ａβについて陽性の総面積を総核数で除算し、次いで、各々のアイソフォームについてＥ３／Ｅ３の平均が１００％となるように、全Ｅ３／３試料からの平均アミロイド／核に対して正規化した。スチューデントｔ検定、１－４０：ｐ＝０．００４４；１－４２：ｐ＞０．００００１。８Ｉおよび８Ｊ、アイソジェニックな周皮細胞における正規化されたアミロイド蓄積。
９Ａ、分解されたｉＢＢＢにおけるＡβ蓄積の定量。ＢＰＡ３およびＢＰＡ４は、全てのＥ３／３およびＥ４／４のｉＢＢＢを示し、それぞれここで、Ｂ＝ＢＥＣのみ、ＢＡ＝ＢＥＣおよび星状膠細胞、ならびにＢＰ＝ＢＥＣおよび周皮細胞。分析は、ボンフェローニ事後分析による一方向ＡＮＯＶＡ（ｐ＜０．０００１）により行った。９Ｂ、ＡＰＯＥ４／４星状膠細胞をＡＰＯＥ４／４周皮細胞条件培地に暴露することは、ＡＰＯＥ３／３周皮細胞条件培地と比較して、アミロイド蓄積を著しく増大させる。スチューデントｔ検定、ｐ＜０．０００１。９Ｃ、周皮細胞（ＮＧ２陽性細胞）および非周皮細胞（ＮＧ２陰性）の細胞におけるＡＰＯＥタンパク質発現の定量および代表的画像。スチューデントｔ検定、ｐ＜０．０００１。
１０Ａおよび１０Ｂ、上方調節された（ａ）および下方調節された（ｂ）遺伝子と関連する生物学的プロセスを表すＧＯ分析（Toppfunから）。 １０Ｃおよび１０Ｄ、アイソジェニック周皮細胞（ｃ）および星状膠細胞（ｄ）における、ＲＮＡ配列決定により測定されたＡＰＯＥの発現。各々の条件は、３つの生物学的複製の周皮細胞を表す、ｑ＝０．０００３、星状膠細胞、ｑ＝０．０００６。１０Ｅ、ＡＰＯＥ４キャリア（ｎ＝７）の死後の前頭前皮質から単離された周皮細胞におけるＡＰＯＥ発現を、非キャリア（ｎ＝１８）と比較して表す、バイオリンプロット。両側ウィルコクソン順位和検定を用いて差次的発現を測定し、ＡＰＯＥの発現が検出された細胞を考慮した（ｐ＝０．００２６）。１０Ｆ、ＡＰＯＥ４キャリアおよび非キャリアからの死後のヒト前頭前皮質における画像およびＡＰＯＥタンパク質発現の定量。独立両側ｔ検定（ｐ＝０．０２３）。 １０Ｇ、ヒト海馬から単離された周皮細胞および内皮細胞が区別し得る細胞のクラスターに分離されたことを示す、代表的マーカー遺伝子の差次的プロット。１０Ｈ、ＡＰＯＥ４キャリア（ｎ＝１６）の死後の海馬から単離された内皮細胞におけるＡＰＯＥ発現を、非キャリア（ｎ＝４６）と比較して表す、バイオリンプロット。両側ウィルコクソン順位和検定を用いて差次的発現を測定し、ＡＰＯＥの発現が検出された細胞を考慮した。
１１Ａ、ｉＢＢＢ培養物への組み換えＡＰＯＥタンパク質の添加を通して可溶性ＡＰＯＥの濃度を増大させることは、アミロイド蓄積を増大させる。ボンフェローニ事後分析による一方向ＡＮＯＶＡ（ｐ＝０．００１１）Ｋ。１１Ｂおよび１１Ｃ、アイソジェニックなＡＰＯＥ３および４の周皮細胞における核ＮＦＡＴｃ１発現を表す代表的ウェスタンブロットおよび定量。独立スチューデントｔ検定、ｐ＝０．０２５４。１１Ｄ、ＲＮＡｓｅｑにより測定されたカルシニューリン触媒サブユニットの発現。ＰＰＰ３ＣＡ（ｑ＝０．０００３）；ＰＰＰ３ＣＣ（ｑ＝０．０１８８）。 １１Ｅ、ＲＮＡｓｅｑにより測定された負のカルシニューリン遺伝子調節因子（ＲＣＡＮ）の発現。ＲＣＡＮ２（ｑ＝０．０００３）；ＲＣＡＮ３（ｑ＝０．０１２３）。１１Ｆ、ＲＮＡｓｅｑにより測定された、ＮＦＡＴをリン酸化することが知られているＤＹＲＫキナーゼの発現。ＤＹＲＫ４（ｑ＝０．０００３）。１１Ｇ、周皮細胞における予測されたＮＦＡＴ応答遺伝子。ＶＣＡＭ１およびＡＣＴＧ２の発現。発現は、ｑＲＴ－ＰＣＲにより定量され、Ｅ３／３細胞の平均に対して正規化される。有意性は、ボンフェローニ多重比較による一方向ＡＮＯＶＡ（ｐ＜０．０００１）により決定される。 １１Ｈおよび１１Ｉ、ＡＰＯＥ４キャリア（ｎ＝１６）の死後の前頭前皮質から単離された周皮細胞におけるＮＦＡＴＣ１（ｈ）およびＮＦＡＴＣ２（ｉ）の発現を、非キャリア（ｎ＝４６）と比較して表すバイオリンプロット。両側ウィルコクソン順位和検定を用いて差次的発現を測定し、ＡＰＯＥの発現が検出された細胞を考慮した。１１Ｊおよび１１Ｋ、ＡＰＯＥ４キャリア（ｎ＝１６）および非キャリア（ｎ＝４６）の死後の海馬から単離された内皮細胞におけるＮＦＡＴＣ１およびＮＦＡＴＣ２の発現を表すバイオリンプロット。差次的発現。１１Ｌ、ＡＰＯＥ４キャリア（ｎ＝７）の死後の前頭前皮質から単離された内皮細胞におけるＮＦＡＴＣ２の発現を、非キャリア（ｎ＝１８）と比較して表すバイオリンプロット。両側ウィルコクソン順位和検定を用いて差次的発現を測定し、ＡＰＯＥの発現が検出された細胞を考慮した（ｐ＝０．０３５）。
１２Ａ、高度に非類似の構造を示すＣｓＡ、ＦＫ５０６およびＩＮＣＡ６の化学構造。 １２Ｂ、ＤＭＳＯ、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、ＦＫ５０６またはＩＮＣＡ６と共に２週間置いた後の周皮細胞におけるＰＧＫ１、ＨＰＲＴおよびＧＡＰＤＨの発現。ボンフェローニ多重比較による一方向ＡＮＯＶＡ（ｐ＜０．０００１）。 １２Ｃおよび１２Ｄ、化学物質による２週間の処置の後の周皮細胞におけるＡＰＯＥタンパク質染色の代表的免疫蛍光イメージング。スケールバー、５０μｍ。 １２Ｅ、Ｅ３およびＥ４のＣｓＡ処置された周皮細胞において上方調節および下方調節された遺伝子についてのＤＥＧおよび関連するＧＯ用語。 １２Ｆおよび１２Ｇ．シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）による１週間にわたる処置の後でのＡＰＯＥ４ＫＩマウス皮質切片におけるＡＰＯＥタンパク質発現を表す、代表的なイメージングおよび定量。独立両側ｔ検定（ｐ＝０．０００９）。１２Ｈ、ＣｓＡまたはＦＫ５０６により１週間にわたり処置され、次いで２０ｎＭのＡβに４８時間にわたり暴露されたＡＰＯＥ４ＫＩマウス皮質切片におけるアミロイドの定量。ボンフェローニ多重比較による一方向ＡＮＯＶＡ（ｐ＝０．０１０５）。１２Ｉ、ＤＭＳＯ、シクロスポリンＡまたはＦＫ５０６で処置されたＡＰＯＥ４ノックインマウスの脳微小血管系から単離された初代周皮細胞におけるＡＰＯＥ ｍＲＮＡ発現。ボンフェローニ多重比較による一方向ＡＮＯＶＡ（ｐ＝０．０１３９）。１２Ｊ、シクロスポリンＡまたはビヒクルで１週間にわたり処置されたＡＰＯＥ４ ＫＩ×５ｘＦＡＤマウスからの海馬周皮細胞における、ＡＰＯＥについての免疫染色の代表的な画像。１２Ｋ、６か月齢のＡＰＯＥ４ＫＩ×５ＸＦＡＤメスマウスの、ビヒクルまたはＣｓＡのいずれかによる処置の後での、海馬における血管アミロイドの代表的な画像。アミロイドを検出し、２つの独立した抗アミロイド抗体（６ｅ１０および１２Ｆ４）により定量した。
図１３Ａ～１３Ｃは、ＢＢＢ膜の透過性における、ＡＰＯＥ４／４細胞（アイソジェニック）とＡＰＯＥ３／３（親）との間の遺伝子型の区別を示す。１３Ａは、頂端膜側上に位置する蛍光分子を有するｉＢＢＢを示す模式図である。１３Ｂは、ｉＢＢＢを頂端膜側から基底膜側へ移行している蛍光分子を有するｉＢＢＢを示す模式図である。１３Ｃは、アイソジェニックなＡＰＯＥ４／４細胞により調製されたｉＢＢＢが、親ＡＰＯＥ３／３細胞を用いて作製されたｉＢＢＢよりも高い蛍光分子の透過性および蓄積を可能にすることを示す。
図１４Ａ～１４Ｂは、ＢＢＢ膜の透過性における、ＡＰＯＥ４／４細胞（アイソジェニック）とＡＰＯＥ３／３（親）との間の遺伝子型の区別を示す。１４Ａは、頂端膜側に位置する蛍光分子を有するｉＢＢＢを示す模式図である。１４Ｂは、アイソジェニックなＡＰＯＥ４／４細胞により調製されたｉＢＢＢが、親ＡＰＯＥ３／３細胞を用いて作製されたｉＢＢＢよりも高い複数の化合物透過性および蓄積を可能にすることを示すグラフである。
図１５Ａ～１５Ｆは、ＡＰＯＥ４がｉＢＢＢ膜の透過性を増大させることを示す。１５Ａは、アイソジェニックなＡＰＯＥ４／４細胞により調製されたｉＢＢＢが、ｉＢＢＢの基底膜側において、親ＡＰＯＥ３／３細胞を用いて作製されたｉＢＢＢよりも高いカダベリン分子の透過性および蓄積を可能にすることを示すグラフである。１５Ｂは、アイソジェニックなＡＰＯＥ４／４細胞により調製されたｉＢＢＢが、ｉＢＢＢの基底膜側において、親ＡＰＯＥ３／３細胞を用いて作製されたｉＢＢＢよりも高い４ｋＤａのデキストラン分子の透過性および蓄積を可能にすることを示すグラフである。１５Ｃは、アイソジェニックなＡＰＯＥ４／４細胞により調製されたｉＢＢＢが、ｉＢＢＢの基底膜側において、親ＡＰＯＥ３／３細胞を用いて作製されたｉＢＢＢよりも高い１０ｋＤａのデキストラン分子の透過性および蓄積を可能にすることを示すグラフである。１５Ｄは、アイソジェニックなＡＰＯＥ４／４細胞により調製されたｉＢＢＢが、ｉＢＢＢの基底膜側において、親ＡＰＯＥ３／３細胞を用いて作製されたｉＢＢＢよりも高いＢＳＡ分子の透過性および蓄積を可能にすることを示すグラフである。１５Ｅは、アイソジェニックなＡＰＯＥ４／４細胞により調製されたｉＢＢＢが、ｉＢＢＢの基底膜側において、親ＡＰＯＥ３／３細胞を用いて作製されたｉＢＢＢよりも高い７０ｋＤａのデキストラン分子の透過性および蓄積を可能にすることを示すグラフである。１５Ｆは、アイソジェニックなＡＰＯＥ４／４細胞により調製されたｉＢＢＢが、ｉＢＢＢの基底膜側において、親ＡＰＯＥ３／３細胞を用いて作製されたｉＢＢＢよりも高いトランスフェリン分子の透過性および蓄積を可能にすることを示すグラフである。
図１６は、アイソジェニックなＡＰＯＥ４／４細胞により調製されたｉＢＢＢが、ｉＢＢＢの基底膜側において、親ＡＰＯＥ３／３細胞を用いて作製されたｉＢＢＢよりも高いＡβ４２－ＦＩＴＣの透過性および蓄積を可能にすることを示すグラフである。
図１７Ａ～１７Ｃは、in vivoで、シクロスポリンＡが、皮質周皮細胞およびその周辺においてＡＰＯＥを減少させることを示す。１７Ａは、ＡＰＯＥ４Ｋ１×５ｘＦＡＤマウスに、ビヒクル対照または１０ｍｇ／ｋｇのシクロスポリンＡを腹腔内で毎日３週間にわたり注射する実験ステップを示す模式図である。ＡＰＯＥタンパク質および血管アミロイドを定量する。１７Ｂは、ＥＬＩＳＡアッセイにより得られた結果を示すグラフであり、これは、シクロスポリンＡが、ビヒクルと比較してＡＰＯＥタンパク質の産生の低下をもたらすことを示す。１７Ｃは、海馬の免疫組織化学の結果を示す画像およびグラフであって、シクロスポリンＡが、ビヒクルと比較してより少ないＡＰＯＥタンパク質の蓄積をもたらすことを示している。
図１８Ａ～１８Ｂは、in vivoで、海馬の脈管構造およびその周辺において、シクロスポリンＡがＡＰＯＥおよび血管アミロイドを減少させることを示す。１８Ａは、海馬の免疫組織化学により得られた結果を示す画像であり、シクロスポリンＡが、ビヒクルと比較してより少ないＡＰＯＥ／アミロイドタンパク質の産生をもたらすことを示している。１８Ｂは、海馬の免疫組織化学の結果を示す画像およびグラフであって、シクロスポリンＡが、ビヒクルと比較してより少ない血管アミロイドタンパク質の蓄積をもたらすことを示している。
図１９Ａ～１９Ｄは、in vivoで、海馬の脈管構造およびその周辺において、シクロスポリンＡおよびＦＫ５０６が、ＡＰＯＥおよび血管アミロイドをin vivoで減少させることを示す。１９Ａは、海馬の免疫組織化学により得られた結果を示す画像であり、血管アミロイドタンパク質の対照のレベルを示している。１９Ｂは、海馬の免疫組織化学により得られた結果を示す画像であり、シクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）が、ヒクル対照と比較してより少ないアミロイドタンパク質の産生をもたらすことを示している。１９Ｃは、海馬の免疫組織化学により得られた結果を示す画像であり、ＦＫ５０６（１０ｍｇ／ｍｌ）が、ヒクル対照と比較してより少ないアミロイドタンパク質の産生をもたらすことを示している。１９Ｄは、１９Ａ～１９Ｃにおいて得られたデータの結果を表すグラフである。
詳細な説明
in vivoのＢＢＢの多くの分子的および生理学的特性を再現するヒト３Ｄ in vitroのＢＢＢのモデル（ｉＢＢＢ）を開発した。ｉＢＢＢは、毛細血管の輸送および活性の分析を可能にする、毛細血管系のユニークなモデルである。先行技術の人工ＢＢＢは、典型的には、二次元の系であるか、および／またはより大きな血管をより緊密に模倣するより大きなサイズのものであった。本発明のｉＢＢＢは、先行技術のデバイスにおいては先には見出されない利点を提供する。
例においてより詳細に記載されるとおり、本明細書において、ｉＢＢＢを開発し、詳細に研究した。その生理学的な系への関連性を、詳細な分析および特徴づけを通して確立した。ｉＢＢＢを、神経変性モデルとしてさらに設計して検証した。これは、脳血管アミロイド蓄積についての最も強力な遺伝的リスク因子の１つ（ＡＰＯＥ４）の根底にある機構の解明を通じるものであった。本明細書においてｉＢＢＢを用いて作製され記載されるデータは、脳の脈管構造の平滑筋成分である周皮細胞が、ＡＰＯＥ４の病原性効果のために必要とされることを明らかにした。その後の機構の精査は、ＡＰＯＥそれ自体が、ＡＰＯＥ４周皮細胞において高度に上方調節されること、および、アミロイド蓄積の増大のために上方調節が必要とされることを特定した。死後のヒト脳組織を用いて、ＡＰＯＥがまた、ＡＰＯＥ４キャリアのヒト脳周皮細胞において非キャリアと比較して上方調節されることを確認した。網羅的な転写プロファイリングは、さらに、Ｅ４周皮細胞におけるＣａＮ／ＮＦＡＴシグナル伝達が高度に活性であることを明らかにした。さらに、ＣａＮ／ＮＦＡＴシグナル伝達の薬理学的阻害が、ｉＢＢＢにおける、およびin vivoでマウス脳におけるＡＰＯＥ発現を顕著に低下させ、ＡＰＯＥ４ ｉＢＢＢにおいて観察される病原性のアミロイド表現型をレスキューすることを示した。これらの知見は、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）の処置、診断、および更なる分析のために、深い意義を有する。ＣＡＡは、神経系および髄膜の小さい血管から中程度の血管の壁においてアミロイドベータ（Ａβ）ペプチドが沈着する血管障害の一形態である。Ａβの蓄積は、認知機能低下と関連する。
ＮＦＡＴ／ＣａＮシグナル伝達は、認知的加齢および神経変性の間に上方調節される。高齢のラットにおいて、ＣａＮの上方調節は、認知能力の低下をもたらす。神経変性において上方調節されたＮＦＡＴ／ＣａＮシグナル伝達の相関にもかかわらず、ＮＦＡＴ／ＣａＮが神経変性において原因的役割を有するか否かはなお不明である。ＣａＮおよびＮＦＡＴがアルツハイマー病（ＡＤ）などの神経変性疾患の処置のための実行可能な標的であるか否か、およびこれらの処置により利益を得るのは誰であるかを取り巻く不確実さは、この領域における治療戦略の開発を限定してきた。本明細書において記載される結果は、この系を理解し、小血管上へのＡβ沈着に関連する疾患の処置のための治療標的を同定することにおける著しい進歩を提供する。データにより、ＡＰＯＥ４がＣＡＡの病態に罹患しやすくなるように作用する細胞型（周皮細胞）、可溶性因子（ＡＰＯＥ）および調節経路（カルシニューリン／ＮＦＡＴ）が同定される。また、ｉＢＢＢが遺伝子型に関連するＢＢＢ透過性の差異をモデル化することを示した。これらの観察のヒト神経生物学への関連性を、死後のヒト脳組織およびマウスモデルを用いてさらに検証し、これらの細胞的および分子的見識を、治療的介入のためのin vivoでのセッティングの形に移すことができることを示した。複数の系統のエビデンスを通して、ｉＢＢＢが、扱いやすいモデルであり、遺伝子バリアントがどのようにして脳血管の病態学に影響を及ぼし得るかについての生物学的な見識を提供し、それにより新たな治療の機会を開くことを示した。重要なことに、in vivoでのシクロスポリンＡによるマウスの処置、脳血管アミロイドの著しい減少を示すことを示した。
したがって、いくつかの側面において、本発明は、ヒト脳内皮細胞（ＢＥＣ）、ヒト多能性細胞由来周皮細胞およびヒト多能性細胞由来星状膠細胞がその中に配置された三次元（３Ｄ）マトリックスから構成される、in vitroの血液脳関門（ｉＢＢＢ）である。ヒト脳内皮細胞（ＢＥＣ）は、ヒト多能性細胞由来陽性内皮細胞の大きな相互接続されたネットワークから構成される血管を形成する。
血管は、毛細血管の桁のサイズを有する。毛細血管は、身体の組織中に位置する非常に小さな血管であって、血液を輸送するものである。毛細血管は、直径が約５～１０ミクロンのサイズである。毛細血管は、薄く、内皮から構成される。ｉＢＢＢは、長さ約５～５０ミクロンの桁である。いくつかの態様において、ｉＢＢＢは、長さ５～３０ミクロンである。いくつかの態様において、ｉＢＢＢは、長さ１０～２０ミクロンである。他の態様において、ｉＢＢＢは、長さ３～５０ミクロン、５～４５ミクロン、５～４０ミクロン、５～３５ミクロン、５～３０ミクロン、５～２５ミクロン、５～２０ミクロン、５～１５ミクロン、５～１０ミクロン、８～５０ミクロン、８～４５ミクロン、８～４０ミクロン、８～３５ミクロン、８～３０ミクロン、８～２５ミクロン、８～２０ミクロン、８～１５ミクロン、８～１０ミクロン、１０～５０ミクロン、１０～４５ミクロン、１０～４０ミクロン、１０～３５ミクロン、１０～３０ミクロン、１０～２５ミクロン、１０～２０ミクロン、１０～１５ミクロン、または１０～１２ミクロンである。
内皮細胞、周皮細胞、および星状膠細胞は、任意に、ヒト多能性細胞由来細胞である。例えば、細胞は、ｉＰＳＣ由来ＣＤ１４４陽性細胞などのｉＰＳＣ由来細胞であってよい。自家誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、三胚葉のうちの任意の細胞型：内胚葉（例えば、胃壁、胃腸管、肺など）、中胚葉（例えば、筋肉、骨、血液、泌尿生殖器組織など）または外胚葉（例えば、上皮性組織および神経系組織）に分化することができる。用語「多能性細胞」とは、未分化状態を保ちつつ自己再生および増殖することができる細胞であって、正しい条件下において、特化した細胞型に分化するように誘導することができるものを指す。多能性細胞は、胚性幹細胞および他の型の幹細胞を包含し、これは、胎生幹細胞、羊水幹細胞、または体性幹細胞を含む。例示的なヒト幹細胞株として、Ｈ９ヒト胚性幹細胞株が挙げられる。さらなる例示的な幹細胞株として、国立衛生研究所ヒト胚性幹細胞登録（Human Embryonic Stem Cell Registry）およびハワード・ヒューズ医学研究所ＨＵＥＳコレクションを通して利用可能となるものが挙げられる。
多能性幹細胞はまた、非多能性細胞から誘導される多能性幹細胞の型である誘導多能性幹細胞、またはｉＰＳＣを包含する。親細胞の例として、多様な手段により多能性の未分化の表現型を誘導するように再プログラムされた体細胞が挙げられる。かかる「ｉＰＳ」または「ｉＰＳＣ」細胞は、特定の調節遺伝子の発現を誘導することにより、または特定のタンパク質の外因的な適用により、作製することができる。ｉＰＳ細胞の誘導のための方法は、当該分野において公知である。本明細書において用いられる場合、ｈｉＰＳＣはヒト誘導多能性幹細胞であり、ｍｉＰＳＣは、マウス誘導多能性幹細胞である。
細胞を、３Ｄマトリックスまたは足場材料上に播種する。マトリックスまたは足場材料は、例えば、ハイドロゲルであってよい。マトリックスは、以下のものまたはそれらの機能的バリアントを含む、多糖、ゼラチン質タンパク質、またはＥＣＭ構成成分などの、天然に誘導される生体材料から形成されてもよい：アガロース；アルギナート；キトサン；デキストラン；ゼラチン；ラミニン；コラーゲン；ヒアルロナン；フィブリンおよびこれらの混合物。あるいは、マトリックスは、マトリゲル、ミオゲル（Myogel）およびカルチゲル（Cartigel）、またはマトリゲル、ミオゲルおよびカルチゲルの組み合わせ、ならびに天然に誘導される生体材料から形成されるハイドロゲルであってもよい。ハイドロゲルは、直鎖状または分枝状の親水性ポリマーの巨大分子であってもよく、ここでポリマーは、合成のものであり、より好ましくはここでポリマーは、ポリ（エチレングリコール）分子であり、最も好ましくはここでポリ（エチレングリコール）分子は、ポリ（エチレングリコール）、ポリ脂肪族ポリウレタン、ポリエーテルポリウレタン、ポリエステルポリウレタン、ポリエチレンコポリマー、ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリ（エチレンオキシド）、ポリプロピレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリテトラメチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリ（ヒドロキシエチルアクリラート）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリラート）およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。
３Ｄマトリックスは、内皮細胞、周皮細胞、および星状膠細胞の最適な混合物を用いて作製してよい。例えば、いくつかの態様において、ｉＢＢＢは、約５部の内皮細胞：約１部の星状膠細胞：約１部の周皮細胞を用いて作製してもよい。他の態様において、ｉＢＢＢは、１ｍｌあたり約１，０００，０００個の内皮細胞、１ｍｌあたり約２００，０００個の星状膠細胞、および１ｍｌあたり約２００，０００個の周皮細胞を用いて作製してもよい。
３Ｄマトリックスのユニークな特徴は、細胞がマトリックス上に播種されて、ＢＢＢ様構造に自己組織化されることである。細胞は、それら自体を、ＢＥＣが、毛細血管壁に類似した大きな相互接続された細胞のネットワークを形成するように配置する。周皮細胞は、頂端膜側においてＢＥＣ血管に近接して配置される。ヒト多能性細胞由来星状膠細胞は、３Ｄマトリックス全体を通して分散される。しかし、星状膠細胞のうちの一部は、ＢＥＣ血管の近位に位置し、血管周囲腔中にＧＦＡＰ陽性突起を有する。
ｉＢＢＢは、in vivoでのＢＢＢ組織を模倣する構造的特性を有する。細胞が３Ｄ構造を組織する様式に加えて、ｉＢＢＢおよびその中で見出される細胞は、in vivoでＢＢＢ中の細胞に関連する特定の遺伝子の発現などの、in vivoでのＢＢＢに付随する構造的特性を有する。例えば、星状膠細胞はＡＱＰ４を発現し、ＢＥＣは、ＣＬＤＮ５、ＧＬＵＴ１、ＪＡＭＡ、ＰｇＰ、ＬＲＰ１およびＲＡＧＥのうちの少なくともいずれか１つを発現してもよい。いくつかの態様において、ＢＥＣは、ＰＥＣＡＭ、ＡＢＣＧ２、ＣＤＨ５、ＣＧＮ、ＳＬＣ３８Ａ５、ＡＢＣＣ２、ＶＷＦおよびＳＬＣ７Ａ５のうちの少なくともいずれか１つを発現してもよい。細胞はまた、マトリックス中で観察されてきたＬＡＭＡ４を産生する。ＰｇＰおよびＡＢＣＧ２は、ｉＢＢＢの頂端膜側において発現されることが見出されている。頂端膜側において発現されるＰｇＰおよびＡＢＣＧ２のレベルは、単独で培養されたかまたは星状膠細胞と共培養されたＢＥＣにおいて発現されるＰｇＰおよびＡＢＣＧ２のレベルよりも、２～３倍大きい。これらの重要なマーカーは、in vivoでのＢＢＢとの類似性を示す。
ｉＢＢＢはまた、in vivoでのＢＢＢ組織を模倣する機能的特性を有する。ｉＢＢＢに関連する機能的特性（in vivoでのＢＢＢを模倣するもの）として、例えば、５，５００Ｏｈｍ×ｃｍ２を超えるＴＥＥＲ、単独で培養されたかまたは星状膠細胞と共培養されたＢＥＣと比較した排出ポンプの分子透過性および極性化の低下、が挙げられる。経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）は、内皮単層を横切る電気抵抗の尺度であって、好感度かつ信頼性の高い透過性の定量的指標として用いられるものである。関門を形成する全ての不死化内皮細胞株は、１５０Ｏｈｍｓ／ｃｍ２未満のＴＥＥＲ値を示す。同様に、ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨｕＶＥＣ）などの末梢の内皮細胞は、相対的に高い透過性を有し、したがって低いＴＥＥＲを示す。これらの報告された観察と一致して、本明細書において提示されるデータは、ＨｕＶＥＣをトランスウェルの立体配置において培養した場合に、約１００Ｏｈｍｓ／ｃｍ２のＴＥＥＲ値を示す。ＨｕＶＥＣのＴＥＥＲ値は、星状膠細胞または周皮細胞と共培養することによっては増大されなかった。単独で培養されたｉＰＳＣ由来ＢＥＣは、平均５９００Ｏｈｍｓ／ｃｍ２の著しく高いＴＥＥＲ値を有した。しかし、単独で培養されたＢＥＣについてのＴＥＥＲ値は、高い程度の変動性を示した（ＳＤ＝＋／－２１５０Ｏｈｍｓ／ｃｍ２）。本明細書において開示されるｉＢＢＢにおいてＢＥＣを周皮細胞および星状膠細胞と共培養することにより、ＴＥＥＲの変動性は低下し（ＳＤ＝＋／－５１３．９Ｏｈｍｓ／ｃｍ２）、平均抵抗の著しい増加がもたらされた（８０３０Ｏｈｍｓ／ｃｍ２）。このことは、ｉＢＢＢがＨｕＶＥＣまたは単独で培養されたＢＥＣより透過性が低いことを示唆している。これらの機能的特性は、ｉＢＢＢを、毛細血管サイズの人工ＢＢＢの中でもユニークなものとする。
いくつかのＡＤリスク遺伝子は、ＢＢＢを構成する細胞において発現され、Ａβの蓄積およびクリアランスに直接的に影響を及ぼし得る。特に、アポリポプロテインＥ（ＡＰＯＥ）タンパク質は、ＢＢＢの細胞において高度に発現される。ヒトにおいては、３つのＡＰＯＥの遺伝子多型、ε２、ε３およびε４が存在する。ＡＰＯＥのε４アイソフォーム（ＡＰＯＥ４）は、ＣＡＡおよび孤発性ＡＤについての最も顕著に知られるリスク因子である。細胞の遺伝子型は、ｉＢＢＢおよび関連するアッセイにおいて重要な役割を果たす。いくつかの態様において、Ａβ産生細胞は、ＡＰＯＥ３および／またはＡＰＯＥ４を発現した。Ａβ産生細胞は、ＡＰＯＥ３／３遺伝子型またはＡＰＯＥ３／４遺伝子型またはＡＰＯＥ４／４遺伝子型を有していてよい。いくつかの態様において、細胞は、ＡＰＯＥ４／４遺伝子型を有する。
ここで作製されたデータは、アミロイド－βペプチド（Ａβ）の産生において周皮細胞が重要な役割を果たすことを明らかにした。これらの知見を考慮して、本発明の他の側面は、Ａβ産生細胞を、ＡＰＯＥ４陽性周皮細胞因子および少なくとも１つの候補阻害剤と接触させること、ならびに候補阻害剤の存在下および不在下におけるＡβの量を検出することにより、アミロイド－βペプチド（Ａβ）の産生および／または蓄積の阻害剤を同定する方法に関し、ここで、候補阻害剤の不在下における細胞と関連するＡβの量と比較した、候補阻害剤の存在下における細胞と関連するＡβの量の低下は、候補阻害剤がＡβの阻害剤であることを示す。ＡＰＯＥ４陽性周皮細胞因子は、ＡＰＯＥタンパク質などのＡＰＯＥ４周皮細胞条件培地中の可溶性因子であってよい。
発明は、本明細書において記載されるＢＥＣ血管をＡβの阻害剤と接触させること、およびｉＢＢＢによるＡβの産生に対するＡβの阻害剤の効果を、Ａβの阻害剤と接触させられていないｉＢＢＢと比較して検出すること、をさらに含んでもよい。
本発明は、いくつかの側面において、対象においてアミロイド合成を阻害するための方法に関する。アミロイド蓄積を有するか、これを発症するリスクがある対象は、彼らがＡＰＯＥ４陽性であるか否か遺伝子型に基づいて同定することができ、本明細書において記載されるアッセイを用いて同定される化合物により、首尾よく処置することができることが見出された。対象がＡＰＯＥ４陽性である場合、それらの対象は、ＣＡＡなどのＡβ障害を発症するリスクがある。しかし、それらの対象は、カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路の阻害剤による処置に対して感受性でもある。ＡＰＯＥ４は、先に、アルツハイマーなどのいくつかのＡβ障害を有する患者に関連付けられている一方で、この遺伝子型は、先には、カルシニューリン／ＮＦＡＴ阻害活性の効果的な予測因子としては関連付けられていない。疾患を有する個体においてこの経路の阻害剤を考察する先行する研究は、患者において一貫した正の結果を示していない。本発明の知見は、カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路における遺伝子型と化合物の効果的な治療上の有用性との間の関連を提供した。
ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞核内因子）は、転写活性化因子である。その不活性な状態において、ＮＦＡＴは細胞質に存在し、そこでリン酸化される。細胞内Ｃａ２＋の増加は、カルモジュリン依存的ホスファターゼであるカルシニューリン（ＣａＮ）の活性化をもたらし、これが続いてＮＦＡＴを脱リン酸化し、その核への転位を可能にする。ＮＦＡＴは、核において、遺伝子活性化を促進する。いくつかの態様において、ＮＦＡＴ阻害剤は、カルシニューリン阻害剤であってよく、および／または脂溶性であってよい。ＮＦＡＴ阻害剤は、以下から選択してもよい：シクロスポリン、シクロスポリン誘導体、タクロリムス誘導体、ピラゾール、ピラゾール誘導体、ホスファターゼ阻害剤、Ｓ１Ｐ受容体調節因子、トキシン、パラセタモール代謝物、真菌のフェノール性化合物、冠血管拡張薬、フェノール性アミド（phenolic adeide）、フラボノール、チアゾール誘導体、ピラゾロピリミジン誘導体、ベンゾチオフェン誘導体、ロカグラミド（rocaglamide）誘導体、ジアリールチアゾール、バルビツール酸塩、統合失調症治療薬（フェノチアジン）、セロトニンアンタゴニスト、サリチル酸誘導体、プロポリスまたはザクロ由来のフェノール性化合物、イミダゾール誘導体、ピリジニウム誘導体、フラノクマリン、アルカロイド、トリテルペノイド、テルペノイド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、A 285222、エンドタール、４－（フルオロメチル）フェニルホスファートＦＭＰＰ、ノルカンタリジン（norcantharidin）、チロホスチン、オカダ酸、RCP1063、cya／cypa（シクロフィリンＡ）、isa247（ボクロスポリン）／cypa、[dat-sar]3-cya、fk506／fkbp12、アスコマイシン／fkbp12、ピメクロリムス／FKBP12、１，５－ジベンゾイルオキシメチル－ノルカンタリジン、am404、btp1、btp2、ジベフリン（dibefurin）、ジピリダモール、ゴシポール、ケンフェロール、lie 120、NCI3、PD 144795、Roc-1、Roc-2、Roc-3、ST 1959（DLI111-it）、チオペンタール、ペントバルビタール、チアミラール、セコバルビタール、トリフロペラジン、トロピセトロン、UR-1505、WIN 53071、コーヒー酸フェニルエチルエステル、KRM-III、YM-53792、プニカラギン（punicalagin）、インペラトリン、キノロンアルカロイド化合物、インプレス酸（impressic acid）、オレアナントリテルペノイド、ゴシミンＮ、CaN457-482-AID、CaN424-521-AID、mFATc2106-121-SPREIT、VIVITペプチド、R11-Vivit、ZIZIT cis-pro、INCA1、INCA6、INCA2、AKAP79330-357、RCAN1、RCAN1-4141-197-エクソン７、RCAN1-4143-163-CICペプチド、RCAN1-495-118-SPリピートペプチド、LxVPc 1ペプチド、MCV1、VacA、A238L、およびA238200-213。
カルシニューリン阻害剤は、カルシニューリンの活性を直接的または間接的に妨害し得る。いくつかの態様において、カルシニューリン阻害剤は、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６（タクロリムス）、ピメクロリムス、またはボクロスポリンなどのシクロスポリンアナログである。シクロスポリンＡおよびＦＫ５０６は、いずれも免疫抑制剤として臓器移植の後で臨床で処方される。他のカルシニューリン阻害剤は、当該分野において公知である。例えば、他のものは、ＵＳ２０１９／００８５０４０において開示される。
カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路阻害剤は、本明細書において用いられる場合、ＮＦＡＴ経路の活性を妨害する化合物である。例示的なカルシニューリン／ＮＦＡＴ阻害剤として、これらに限定されないが、抗体小分子化合物などのペプチド、および相互作用を妨害し得る他の化合物が挙げられる。カルシニューリン／ＮＦＡＴ阻害剤はまた、カルシニューリン／ＮＦＡＴの１つ以上の構成成分を直接的に阻害する小分子阻害剤、または結合相互作用を阻害する他の剤を含む。いくつかの態様において、小分子阻害剤は、シクロスポリンまたはＦＫ５０６である。
本発明のカルシニューリン／ＮＦＡＴ阻害性化合物は、以下の特徴のうちのいずれか１つ以上を示してよい：（ａ）ＮＦＡＴ経路の活性を低下させる；（ｂ）神経変性疾患の任意の側面を予防するか、これを緩解させるかまたはこれを処置する；（ｃ）シナプス機能不全を軽減する；（ｄ）認知機能不全を軽減する；および（ｅ）アミロイド－βペプチド（Ａβ）蓄積を減少させる。当業者は、本明細書において提供されるガイダンスを用いて、かかる阻害性化合物を調製することができる。
低下させる、干渉する、阻害する、および抑制するとは、活性レベルを、阻害剤の不在の場合に典型的な活性レベルと比較して部分的にまたは完全に減少させることを指す。例えば、減少は、少なくとも２０％、５０％、７０％、８５％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％または５００％、または１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、または１０４倍のものであってよい。
他の態様において、本明細書において記載されるカルシニューリン／ＮＦＡＴ化合物は、小分子であり、これは、約１００～２０，０００ダルトン、５００～１５，０００ダルトン、または１０００～１０，０００ダルトンのうちのいずれかの分子量を有していてもよい。小分子のライブラリは、市販されている。小分子は、当該分野において公知の任意の手段を用いて投与することができ、これは、吸入、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、くも膜下腔内、脳室内、経口、経腸、非経口、鼻内、または経皮によるものを含む。一般に、本発明によるカルシニューリン／ＮＦＡＴ阻害剤が小分子である場合、それは、患者の体重１ｋｇあたり０．１～３００ｍｇの割合で、１～３回以上の用量に分けて投与されるであろう。通常の体重の成人の患者について、１用量あたり１ｍｇ～５ｇの範囲の用量を投与することができる。
前述の小分子は、化合物ライブラリから得ることができる。ライブラリは、空間的にアドレス可能な平行の固相または溶液相ライブラリであってよい。例えば、Zuckermann et al. J. Med .Chem. 37, 2678-2685, 1994; and Lam Anticancer Drug Des. 12:145, 1997を参照。化合物ライブラリの合成のための方法は、当該分野において、例えば以下において周知である：DeWitt et al. PNAS USA 90:6909, 1993；Erb et al. PNAS USA 91:11422, 1994；Zuckermann et al. J. Med. Chem. 37:2678, 1994；Cho et al. Science 261:1303, 1993；Carrell et al. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059, 1994；Carell et al. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061, 1994；およびGallop et al. J. Med. Chem. 37:1233, 1994。化合物のライブラリは、溶液中で（例えば、Houghten Biotechniques 13:412-421, 1992）、またはビーズ（Lam Nature 354:82-84, 1991）、チップ（Fodor Nature 364:555-556, 1993）、細菌（U.S. Patent No. 5,223,409）、胞子（米国特許第5,223,409号）、プラスミド（Cull et al. PNAS USA 89:1865-1869, 1992）、またはファージ（Scott and Smith Science 249:386-390, 1990; Devlin Science 249:404-406, 1990；Cwirla et al. PNAS USA 87:6378-6382, 1990；Felici J. Mol. Biol. 222:301-310, 1991；および米国特許第5,223,409号）上で提示してもよい。
あるいは、本明細書において記載される阻害剤は、カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路の構成成分の発現を阻害してもよい。発現を阻害する化合物として、例えば、モルホリノオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ）、アンチセンス核酸、またはリボザイムが挙げられる。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ｄｓＲＮＡが、相同配列特異的なメッセンジャーＲＮＡの分解を指揮するプロセスである。哺乳動物細胞において、ＲＮＡｉは、宿主のインターフェロン応答を活性化することなく、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の２１ヌクレオチドの二重鎖により惹起され得る。本明細書において開示される方法において用いられるｄｓＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（２つの別個かつ相補的なＲＮＡ鎖を含む）またはショートヘアピンＲＮＡ（すなわち、タイトヘアピン構造を形成するＲＮＡ鎖）であってよく、これらはいずれも、標的遺伝子の配列に基づいて設計することができる。
任意に、上記のような本明細書において記載される方法において用いられるべき核酸分子（例えば、アンチセンス核酸、低分子干渉ＲＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡ）は、天然に存在しない核酸塩基、糖、または共有結合性のヌクレオシド間結合（骨格）を含む。かかる修飾オリゴヌクレオチドは、細胞の取り込み、標的核酸への親和性の改善、およびin vivoでの安定性の増大などの望ましい特性を付与する。
カルシニューリン／ＮＦＡＴ阻害剤は、抗体およびそのフラグメントを含む。抗体（複数形において交換可能に用いられる）とは、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を通して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に対して特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。
本明細書において用いられる場合、用語「抗体」は、完全な（すなわち、全長の）ポリクローナルまたはモノクローナル抗体のみならず、またその抗原結合フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、単鎖（ｓｃＦｖ）、それらの変異体、抗体の部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ダイアボディー、直鎖状抗体、単鎖抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体)、および任意の他の修飾された免疫グロブリン分子の立体配置であって、必要とされる特異性の抗原認識部位を含むもの（抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント、および共有結合により修飾された抗体を含む）をも包含する。抗体は、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＡもしくはＩｇＭ（またはこれらのサブクラス）などの任意のクラスの抗体を含み、抗体は、いずれかの特定のクラスのものである必要はない。抗体の、その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てることができる。５つの主要なクラス；ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの免疫グロブリンが存在し、これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの様々なクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと称される。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体構造は、周知である。
本明細書において記載される阻害剤は、カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路における化合物の減少、回復または中和が検出および／または測定される当該分野において公知の方法を用いて、同定するかまたは特徴づけることができる。さらに、当該分野において公知のアッセイ方法のいずれかを用いて、および／または本明細書において記載される周皮細胞またはｉＢＢＢアッセイを用いて、コンビナトリアルケミストリーライブラリから、好適なカルシニューリン／ＮＦＡＴ阻害剤をスクリーニングしてもよい。
本明細書において記載されるカルシニューリン／ＮＦＡＴ阻害剤のうちの１つ以上を、バッファーを含む薬学的に許容し得るキャリア（賦形剤）と混合して、カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路の活性を低下させることにおける使用のための医薬組成物を形成することができる。「受入可能」とは、キャリアが、組成物の活性成分と適合性でなければならず（および好ましくは、活性成分を安定化させることができ）、処置されるべき対象にとって有害であってはならないことを意味する。本明細書において用いられる場合、薬学的に許容し得るキャリアは、水を含まず、水などの天然に存在するキャリアを超えるものである。いくつかの態様において、薬学的に許容し得るキャリアは、処方されたバッファー、ナノキャリア、ＩＶ溶液などである。
バッファーを含む薬学的に許容し得る賦形剤（キャリア）は、当該分野において周知である。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第２０版（2000）Lippincott WilliamsおよびWilkins編、K. E. Hooverを参照。本方法において用いられるべき医薬組成物は、薬学的に許容し得るキャリア、賦形剤または安定化剤を、凍結乾燥処方物または水溶液の形態において含むことができる（Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第２０版（2000）Lippincott WilliamsおよびWilkins編、K. E. Hoover）。許容し得るキャリア、賦形剤または安定化剤は、用いられる投与量および濃度において、レシピエントにとって非毒性であり、以下を含んでもよい：リン酸、クエン酸および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、およびグルコース、マンノースもしくはデキストランを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成性の対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；および／またはTWEEN（商標）（ポリソルベート）、PLURONICS（商標）（ポロキサマー）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤。薬学的に許容し得る賦形剤は、さらに本明細書において記載される。
いくつかの例において、本明細書において記載される医薬組成物は、カルシニューリン／ＮＦＡＴ阻害剤を含有するリポソームを含み、これは、Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985)；Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)；およびU.S. Pat. Nos. 4,485,045 and 4,544,545などにおいて記載される当該分野において公知の方法により調製することができる。循環時間が延長されたリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６において開示される。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）を含む脂質組成物による逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは、既定の孔サイズのフィルターを通して抽出され、所望される直径のリポソームを生じる。
活性成分（例えば、カルシニューリン／ＮＦＡＴ阻害剤）はまた、マイクロカプセル中に封入されていてもよく、マイクロカプセルは、例えば、コアセルベーション技術により、または界面重合により、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン－マイクロカプセルおよびポリ－（メチルメタクリラート）マイクロカプセルにより、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）において、またはマクロエマルション中で、調製される。かかる技術は、当該分野において公知である。例えば、Remington, The Science and Practice of Pharmacy、第２０版、Mack Publishing（2000）を参照。
他の例において、本明細書において記載される医薬組成物は、持続放出形式において処方することができる。持続放出調製物の好適な例として、抗体を含む固体の疎水性ポリマーの半透過性のマトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形された物品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例として、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリラート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ－グルタミン酸と７エチル－Ｌ－グルタミン酸とのコポリマー、非分解性のエチレン－ビニル酢酸、LUPRON DEPOT（商標）（乳酸－グリコール酸コポリマーおよび酢酸リュープロリドから構成される注射可能なマイクロスフェア）などの分解性の乳酸－グリコール酸コポリマー、酢酸イソ酪酸スクロース、およびポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
in vivoでの投与のために用いられるべき医薬組成物は、無菌でなければならない。これは、例えば無菌ろ過膜を通したろ過により、容易に達成される。治療用抗体組成物は、一般に、無菌のアクセスポートを有する容器、例えば静脈内用液バッグ、または皮下注射針により穿通可能なストッパーを有するバイアル中に入れられる。
本明細書において記載される医薬組成物は、経口、非経口もしくは直腸投与、または吸入（inhalation）もしくは気体注入（insufflation）による投与のための、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、顆粒、溶液もしくは懸濁液、または坐剤などの単位投与形態におけるものであってもよい。
錠剤などの固体の組成物を調製するために、主な活性成分を、医薬用キャリア、例えば、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはガムなどの通常の打錠成分、および他の医薬用希釈剤、例えば水と混合して、本発明の化合物またはその非毒性の薬学的に許容し得る塩の均一な混合物を含む固体の前処方組成物を形成することができる。これらの前処方組成物を均一として言及する場合、活性成分が、組成物全体にわたり均等に分散しており、したがって、組成物は、錠剤、丸剤およびカプセルなどの同等に有効な単位投与形態へと容易に部分分割することができることが意図される。この固体の前処方組成物を、次いで、０．１～約５００ｍｇの本発明の活性成分を含む、上記の型の単位投与形態へと部分分割する。新規組成物の錠剤または丸剤を、コーティングするか、別段に調合して、長期の作用の利点を提供する投与形態を提供することができる。例えば、錠剤または丸剤は、内側の投与量構成成分および外側の投与量構成成分を、後者が前者を覆うエンベロープの形態で含むことができる。２つの構成成分は、胃における消化を耐えて内側の構成成分を完全な状態で十二指腸へと通過させるか、またはこれを遅れて放出させるために役立つ腸溶層により分離されていてよい。かかる腸溶層またはコーティングのために、多様な材料を用いることができ、かかる材料は、多数のポリマー性の酸、およびポリマー性の酸とシェラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースなどの材料との混合物を含む。
好適な界面活性剤として、特に、非イオン性の剤、例えばポリオキシエチレンソルビタン（例えば、TWEEN（商標）20、40、60、80または85）および他のソルビタン（例えば、SPAN（商標）20、40、60、80または85）が挙げられる。界面活性剤を含む組成物は、便利に、０．０５～５％の界面活性剤を含み、これは０．１～２．５％であってもよい。必要な場合には、他の材料、例えば、マンニトールまたは他の薬学的に許容し得るビヒクルもまた添加してもよいことが理解されるであろう。
INTRALIPID（商標）、LIPOSYN（商標）、INFONUTROL（商標）、LIPOFUNDIN（商標）およびLIPIPHYSAN（商標）などの市販の脂質エマルションを用いて、好適なエマルションを調製してもよい。活性成分を、予め混合されたエマルション組成物中で溶解しても、あるいは、それを、油脂（例えばダイズ油、ベニバナ油、綿実油、ゴマ油、トウモロコシ油またはアーモンド油）中で溶解して、リン脂質（例えば、卵のリン脂質、ダイズリン脂質またはダイズレシチン）および水と混合することにより、エマルションを形成してもよい。エマルションの浸透圧を調整するために、例えばグリセロールまたはグルコースなどの他の材料を添加してもよいことが、理解されるであろう。好適なエマルションは、典型的には、２０％までの油脂、例えば５～２０％を含むであろう。脂質エマルションは、０．１～１．０．ｉｍ、特に０．１～０．５．ｉｍの脂肪の液滴を含んでもよく、５．５～８．０の範囲のｐＨを有してもよい。
エマルション組成物は、カルシニューリン／ＮＦＡＴ阻害剤をIntralipid（商標）（脂質エマルション）またはその構成成分（ダイズ油、卵リン脂質、グリセロールおよび水）と混合することにより調製されるものであってもよい。
吸入もしくは気体注入のための医薬組成物として、薬学的に許容し得る水性もしくは有機の溶媒中の溶液もしくは懸濁液、またはこれらの混合物、および粉末が挙げられる。液体または固体の組成物は、上で記載されるような好適な薬学的に許容し得る賦形剤を含んでもよい。いくつかの態様において、組成物は、局所または全身性の効果のために、経口または経鼻の呼吸経路により投与される。
好ましくは無菌の薬学的に許容し得る溶媒中の組成物は、気体の使用により噴霧してもよい。噴霧された溶液は、噴霧用デバイスから直接的に呼吸されてもよく、または、噴霧用デバイスは、フェイスマスク、テントもしくは間欠的陽圧呼吸機械に接続されていてもよい。溶液、懸濁液または粉末の組成物は、好ましくは経口または経鼻で、処方物を適切な様式において送達するデバイスから、投与してもよい。
本明細書において開示される方法を実施するために、上記の医薬組成物の有効量を、処置を必要とする対象（例えばヒト）に、好適な経路（例えば静脈内投与）を介して投与することができる。
本明細書において記載される方法により処置されるべき対象は、神経変性疾患を有するか、これを有することが疑われるか、またはこれについてのリスクがあるヒト患者であってよい。神経変性疾患の例として、これらに限定されないが、ＣＡＡ、ＭＣＩ（軽度認知障害）、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、アルツハイマー病、記憶喪失、アルツハイマー病に関連する注意欠陥症状、アルツハイマー病に関連する神経変性、混合型血管由来の認知症、変性由来の認知症、初老期認知症、老年認知症、パーキンソン病に関連する認知症、血管性認知症、進行性進行性核上性麻痺または皮質基底変性（cortex basal degeneration）が挙げられる。
本明細書において記載される方法により処置されるべき対象は、哺乳動物、より好ましくはヒトであってよい。哺乳動物として、これらに限定されないが、農場の動物、スポーツ用の動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウスおよびラットが挙げられる。処置を必要とするヒト対象は、神経変性疾患（例えばＭＣＩ）を有するか、これについてのリスクがあるか、またはこれを有することが疑われるヒト患者であってよい。神経変性疾患を有する対象は、慣用的な医学検査、例えば、臨床検査、病歴、研究室での検査、ＭＲＩスキャン、ＣＴスキャンまたは認知判定により同定することができる。神経変性疾患を有することが疑われる対象は、当該障害の１つ以上の症状、例えば、記憶喪失、錯乱、抑うつ、短期の記憶の変化、ならびに／または言語、コミュニケーション、集中および論理的思考の機能障害を示し得る。神経変性疾患についてのリスクがある対象は、その障害についてのリスク因子のうちの１つ以上を有する対象であってよい。例えば、神経変性疾患に関連するリスク因子として、（ａ）年齢、（ｂ）家族歴、（ｃ）遺伝、（ｄ）頭部傷害、および（ｅ）心臓疾患が挙げられる。
「有効量」とは、本明細書において用いられる場合、単独で、または１つ以上の他の活性剤と組み合わせて、対象に対して治療的効果を付与するために必要とされる、各々の活性剤の量を指す。有効量は、当業者には認識されるであろうとおり、処置されている特定の状態、当該状態の重篤度、個々の患者のパラメーター（年齢、身体条件、サイズ、性別および体重を含む）、処置の期間、併用治療（もしあれば）の性質、投与の具体的な経路、および健康管理者の知識および専門知識の範囲内の同様の要因に依存して、変化する。これらの要因は、当業者には周知であり、慣用的な実験のみを用いて取り組むことができる。一般に、個々の構成成分またはそれらの組み合わせの最大用量、すなわち、健全な医学的判断に従った最も高い安全用量が用いられることが好ましい。しかし、患者は、医学的理由、心理学的理由または実質的にあらゆる他の理由により、より低い用量または耐容可能な用量を主張する場合があることは、当業者には理解されるであろう。
半減期などの経験的考慮は、一般的に、投与量の決定に寄与するであろう。例えば、抗体の半減期を延長するため、および抗体が宿主の免疫系により攻撃されることを予防するために、ヒト化抗体または完全ヒト抗体などのヒトの免疫系と適合性である抗体を用いてもよい。投与の頻度は、治療の系かにわたり決定および調整してもよく、一般に、必ずしもではないが、神経変性疾患の処置および／または抑制および／または寛解および／または遅延に基づく。あるいは、カルシニューリン／ＮＦＡＴ阻害剤の持続的継続放出用処方物が適切である場合がある。持続放出を達成するための多様な処方物およびデバイスが、当該分野において公知である。
一例において、本明細書において記載されるようなカルシニューリン／ＮＦＡＴ阻害剤の投与量は、カルシニューリン／ＮＦＡＴ阻害剤の１回以上の投与を受けた個体において、経験的に決定してもよい。個体は、増加的な投与量の阻害剤を投与される。阻害剤の効力を評価するために、神経変性疾患の指標（認知機能など）を追跡することができる。
一般に、本明細書において記載されるペプチド阻害剤のうちのいずれかの投与のために、初期の候補投与量は、約２ｍｇ／ｋｇであってよい。本開示の目的のために、典型的な一日当たりの投与量は、上述の要因に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ～３μｇ／ｋｇ～３０μｇ／ｋｇ～３００μｇ／ｋｇ～３ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇのいずれかの範囲、またはそれより多くであってよい。数日間またはそれより長い間にわたる繰り返し投与のために、状態に依存して、処置は、所望される症状の抑制が起こるまで、または神経変性疾患またはその症状を緩和するために十分な治療レベルが達成されるまで、持続される。例示的な投与レジメンは、約２ｍｇ／ｋｇの初期用量において投与し、その後、毎週の約１ｍｇ／ｋｇの抗体の維持用量、または２週間に１回の約１ｍｇ／ｋｇの維持用量において投与することを含む。しかし、医師が達成することを望む薬物動態学的減衰のパターンに依存して、他の投与量レジメンも有用であってよい。例えば、１週間に１～４回の投与が企図される。いくつかの態様において、約３μｇ／ｍｇ～約２ｍｇ／ｋｇ（約３μｇ／ｍｇ、約１０μｇ／ｍｇ、約３０μｇ／ｍｇ、約１００μｇ／ｍｇ、約３００μｇ／ｍｇ、約１ｍｇ／ｋｇおよび約２ｍｇ／ｋｇなど）の範囲の用量を用いてもよい。いくつかの態様において、投与頻度は、１週間に１回、２週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、６週間に１回、７週間に１回、８週間に１回、９週間に１回、もしくは１０週間に１回；または１か月に１回、２か月に１回、もしくは３か月もしくはそれより長い期間に１回である。この治療の進行は、従来の技術およびアッセイにより、容易にモニタリングされる。用量レジメンは、経時的に変化してもよい。
本開示の目的のために、カルシニューリン／ＮＦＡＴ阻害剤の適切な投与量は、使用される特定のカルシニューリン／ＮＦＡＴ阻害剤（またはその組成物）、神経変性疾患の型および重篤度、阻害剤が予防的目的のために投与されるのか治療的目的のために投与されるのか、先の治療、患者の臨床歴および阻害剤に対する応答、および主治医の慎重さに依存するであろう。典型的には、臨床家は、投与量が所望される結果を達成するものに達するまで、カルシニューリン／ＮＦＡＴ阻害剤を投与するであろう。カルシニューリン／ＮＦＡＴ阻害剤の投与は、例えばレシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療的なものであるのか予防的なものであるのか、および熟練の医師にとって公知の他の要因に依存して、連続的であっても間欠的であってもよい。カルシニューリン／ＮＦＡＴ阻害剤の投与は、予め選択された期間にわたり本質的に連続的であってもよく、または一連の間隔を空けた用量におけるもの、例えば神経変性疾患を発症する前、これを発症している間、またはこれを発症した後であってよい。
本明細書において用いられる場合、用語「処置する」とは、障害、疾患の症状、または神経変性疾患への素因を、治癒させる（cure）か、治癒させる（heal）か、緩和するか、軽減するか、変更するか、治療する（remedy）か、寛解させるか、改善するか、またはこれに影響を及ぼすことを目的とした、神経変性疾患、神経変性疾患の症状または神経変性疾患への素因を有する対象への、１つ以上の活性剤を含む組成物の適用または投与を指す。
神経変性疾患を緩和することとは、疾患の発症（development）または進行を遅延させること、または疾患の重篤度を低下させることを含む。神経変性疾患を緩和することは、必ずしも、治癒的結果を必要としない。そこにおいて用いられる場合、疾患の発症を「遅延させる」とは、疾患の進行を延期させる（defer）か、妨害するか、遅延させる（slow）か、、遅延させる（retard）か、安定化するか、および／または延期させる（postpone）ことを意味する。この遅延は、疾患の病歴および／または処置されている個体に依存して、時間の長さを変化させることであってもよい。疾患の発症を「遅延させる」かもしくは緩和する、または疾患の発病（onset）を遅延させる方法は、当該方法を用いなかった場合と比較して、所与の時間枠において疾患の１つ以上の症状を発症する可能性を減少させ、所与の時間枠において症状の程度を軽減する方法である。かかる比較は、典型的には、統計学的に有意な結果を提供するために十分に多数の対象を用いる臨床研究に基づく。
疾患の「発症」または「進行」とは、疾患の初発性の徴候および／または後に続く進行を意味する。疾患の発症は、検出可能であってよく、当該分野において周知の標準的な臨床技術を用いて評価することができる。しかし、発症はまた、検出不可能であり得る進行をも指す。本開示の目的のために、発症または進行は、症状の生物学的経過を指す。「発症」は、発生（occurrence）、再発および発病を含む。本明細書において用いられる場合、神経変性疾患の「発病」または「発生」は、初発性の発病および／または再発を含む。
いくつかの態様において、カルシニューリン／ＮＦＡＴ阻害剤は、処置を必要とする対象に、シナプスの記憶機能を、少なくとも２０％（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより高く）増強するために十分な量で投与される。シナプスの機能とは、細胞（例えばニューロン）が別の細胞（例えばニューロン）に電気的または化学的シグナルを渡す能力を指す。 シナプスの機能は、従来のアッセイにより決定することができる。
対象に医薬組成物を投与するために、処置されるべき疾患の型または疾患の部位に依存して、医学の分野の当業者に公知の従来の方法を用いることができる。この組成物はまた、他の従来の経路を介して投与することができ、例えば、経口で、非経口で、吸入スプレーにより、局所的に、直腸で、経鼻で、頬側で、膣で、または移植されたリザーバを介して、投与することができる。用語「非経口」とは、本明細書において用いられる場合、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑膜内、胸骨内、クモ膜下内、病巣内、および頭蓋内の注射または注入技術を含む。加えて、それは、注射可能なデポー経路の投与を介して、例えば１、３または６か月のデポー型の注射可能なまたは生分解性の材料または方法を用いて、対象に投与することができる。
注射可能な組成物は、植物油、ジメチルアセタミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、およびポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）などの多様なキャリアを含んでもよい。静脈内注射のために、抗体および生理学的に許容し得る賦形剤を含む医薬処方物が注入される点滴法により、水溶性の抗体を投与することができる。生理学的に許容し得る賦形剤は、例えば、５％デキストロース、０．９％食塩水、リンガー溶液または他の好適な賦形剤を含んでもよい。筋肉内用調製物、例えば抗体の好適な可溶性の塩形態の無菌処方物は、注射用水、０．９％食塩水または５％グルコース溶液などの医薬用賦形剤中で溶解させて投与することができる。
処置の効力は、当該分野において周知の方法、例えば処置に供された患者におけるシナプスの機能または記憶喪失をモニタリングすることにより評価することができる。
本発明の実施は、別段に示されない限り、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術を使用し、これらは、当該分野における技術の範囲内である。
例
本明細書において記載される本発明がより完全に理解され得るために、以下の例を記載する。本願において記載される例は、本明細書において提供される方法、組成物および系を説明するために提供され、決してそれらの範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
材料および方法
細胞株および分化
全てのｈＥＳＣおよびｈｉＰＳＣは、マトリゲルコートプレート（BD Biosciences）において、ｍＴｅＳＲ１培地（Stem Cell Technologies）中で、フィーダーフリー条件下において維持した。ｉＰＳＣ株は、Picower Institute for Learning and MemoryのｉＰＳＣ施設により、作製された。先に記載されるとおり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集を行った。本研究において用いられた全てのｉＰＳＣおよびｈＥＳＣ株を、表２において列記する。ＥＳＣ／ｉＰＳＣを、０．５ｍＭのＥＤＴＡ溶液を用いて６０～８０％コンフルエンスにおいて５分間にわたり継代培養し、１：６でマトリゲルコートプレート上に再播種した。
ｉＰＳＣからのＢＥＣ分化
ＢＥＣ分化は、Qian et al., 2017（Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Sci Adv 3, e1701679 (2017)）から改変して用いた。ヒトＥＳＣ／ｉＰＳＣを、Accutaseを介してシングルセルに解離させて、１０μＭのＹ２７６３２（Stem Cell Technologies）を補充したｍＴｅＳＲ１中でマトリゲルコートプレート上に３５＊１０３／ｃｍ２で再播種した。次の２日間にわたり、培地を毎日ｍＴｅｓＲ１培地で交換した。３日目に、培地を、ＤｅＳＲ１培地（０．１ｍＭのＢ－メルカプトエタノール、１×ＭＥＭ－ＮＥＡＡ、１×ペニシリン－ストレプトマイシンおよび６μＭのＣＨＩＲ９９０２１（R&D Systems）を補充した、Glutamaxを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Life Technologies））に変更した。続く５日間、培地を、ＤｅＳＲ２（０．１ｍＭのＢ－メルカプトエタノール、１×ＭＥＭ－ＮＥＡＡ、１×ペニシリン－ストレプトマイシンおよびＢ－２７（Invitrogen）を補充した、Glutamaxを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Life Technologies））に変更し、毎日変えた。５日間のＤｅＳＲ２の後で、培地を、Ｂ－２７、１０μＭのレチノイン酸および２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを補充したｈＥＣＳＲ１ヒト内皮ＳＦＭ（ThermoFisher）に変更した。ＢＥＣを、次いで、Accutaseを用いて分割し、１０μＭのＹ２７６３２を補充したｈＥＣＳＲ１で再播種した。ＢＥＣを、次いで、ｈＥＣＳＲ２培地（ＲＡ＋ｂＦＧＦを含まないｈＥＣＳＲ１培地）を通して維持した。
周皮細胞分化プロトコル
周皮細胞の分化は、Patsch et al., 2015（Patsch, C. et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from humanpluripotent stem cells. Nat. Cell Biol. 17, 994-1003 (2015)）およびKumar et al., 2017（Kumar, A. et al. Specification and Diversification of Pericytes and Smooth Muscle Cells from Mesenchymoangioblasts. Cell Rep 19, 1902-1916 (2017)）から改変して用いた。ｉＰＳＣを、Accutaseを介してシングルセルに解離させて、１０μＭのＹ２７６３２を補充したｍＴｅＳＲ１培地中で、４０，０００細胞／ｃｍ２で、マトリゲルコートプレート上に再播種した。第１日において、培地を、Ｂ－２７、Ｎ－２およびペニシリン－ストレプトマイシン）を２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４（Thermo Fisher PHC9531）および８μＭのＣＨＩＲ９９０２１と共に補充したＮ２Ｂ２７培地（Glutamaxを含む１：１のＤＭＥＭ：Ｆ１２およびNeurobasal培地（Life Technologies）に変更した。第４日および第５日において、培地を、１０ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦ－ＢＢ（Pepprotech、100-14B）および２ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（R&D Systems、338-AC-010）を補充したＮ２Ｂ２７に変更した。周皮細胞を、次いで、共培養するまでＮ２Ｂ２７培地中で維持した。
ＮＰＣ分化プロトコル
ＮＰＣを、Chambers et al., Nat. Biotech 2009（Chambers, S. M. et al. Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nat Biotechnol 30, 715-720 (2012)）において記載されるとおり、ＳＭＡＤの阻害およびＦＧＦ２の補充を併用して分化させた。
星状細胞分化プロトコル
星状膠細胞は、TCW, J et al., 2017（TCW, J. et al. An Efficient Platform for Astrocyte Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports 9, 600-614 (2017)）において記載されるとおりに分化させた。ＮＰＣは、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）を補充したNeurobasal NPC培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋GlutaMAX、Neurobasal培地、Ｎ－２サプリメント、Ｂ－２７サプリメント、５ｍＬのGlutaMAX、１０ｍＬのＮＥＡＡ、１０ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン）で培養した。星状膠細胞培地（ＡＭ）（Sciencell、1801）を用いて、星状膠細胞の分化を誘導させた。ＡＭを、一日おきに変え、細胞を継代して、９０％コンフルエントになったら１：３で分割した。
ｉＢＢＢ透過性研究
ＢＥＣを、ｉＰＳＣからの分化の後、Accutaseにより５分間にわたり酵素的に解離させた。ＢＥＣを、１０μＭのＹ２７６３２を補充したｈＥＣＳＲ１で、２４ウェルのマトリゲルコートされたトランスウェルポリエステルメンブレン細胞培養インサート（０．４μｍ孔サイズ）（Corning、29442-082）上で、５００，０００～１，０００，０００細胞／ｃｍ２の密度で再懸濁し、コンフルエントな単層に達した。周皮細胞を播種した２４時間後に、ＢＥＣの上に、星状膠細胞またはＭＥＦＳを５０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。ＴＥＥＲ値が、最小値＞１０００Ｏｈｍｓ／ｃｍ２で、播種後連続２日間、典型的には６日間にわたりプラトーに達した場合に、透過性アッセイを完了した。フルオレセインイソシアネートで標識された４ｋＤａ、１０ｋＤａおよび７０ｋＤａ（Sigma, 46944、FD10S、46945）、トランスフェリン（ThermoFisher T-13342）、Alexa Fluor 555カダベリン（ThermoFisher a30677）、ＢＳＡ（ThermoFisher A34786）を、培地と混合し、標準曲線を作製した。６００μＬのフレッシュな培地をトランスウェルの底に、１００μＬの色素および培地を最上部に添加した。３７℃で１時間にわたり透過性アッセイを行った。トランスウェルチャンバーの底から培地を回収し、プレートリーダーを介して分析した。流出トランスポーターアッセイのために、細胞を、１０μＭのローダミン１２３（ThermoFisher、R302）およびヘキスト色素、５μＭのリバーシン１２１、または５μＭのＫＯ１４３（Cayman Chemical 15215）と共に、１時間３７℃でプレインキュベートした。
３Ｄ培養
１×１０６／ｍｌのＢＥＣ、および２×１０５／ｍｌの星状膠細胞、および２×１０５／ｍｌの周皮細胞を一緒に混合して、1０％のＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＢＢ、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、および１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを補充したマトリゲル中でカプセル化した。マトリゲル細胞溶液を、次いで、ガラス底の培養ディッシュ上に播種した。マトリゲルを４０分間にわたり３７℃で固化させ、次いで、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＡを補充した完全星状膠細胞培地（SciCell）中で増殖させた。２週間後、ＶＥＧＦＡを取り除き、ｉＢＢＢを、その後、星状膠細胞培地のみの中で培養した。３Ｄ培養物を、実験および分析の前に、１か月間にわたり成熟させた。イメージング実験のために、３Ｄ培養物を、４％ＰＦＡで終夜４℃で固定し、各々２４時間にわたり洗浄およびブロッキングを行い、次いで、一次抗体および二次抗体と共に、各々終夜４℃でインキュベートし、その後、少なくとも４８時間洗浄した。
アミロイドベータ蓄積
アミロイド蓄積は、ＰＢＳ中で再懸濁された、神経細胞条件培地および２０ｎＭの組み換え標識Hilyte fluor 488β－アミロイド（１－４０）（Anaspec、AS-60491-01）およびβ－アミロイド（１－４２）（Anaspec、AS-60479-01）の両方を用いて決定した。各々の細胞株および実験的順列についてのＡβ蓄積を、３つ全ての細胞型を３Ｄ実験と同じ細胞比において含む２Ｄ培養物から決定した。Ａβについて陽性の総面積を、核の総数で除算し、実験対照に対して正規化した。各々の生物学的複製について、少なくとも４つの画像を分析し、各々の条件について、少なくとも３回の生物学的複製を使用した。２Ｄの定量を、３Ｄのイメージングおよび分析により実証した。
免疫蛍光染色およびＡＰＯＥ免疫枯渇
細胞をＰＢＳで洗浄し、１５分間にわたり４％のＰＦＡ（Electron Microscopy Sciences 15714-S）で固定した。試料を、次いで、ＰＢＳで５分間にわたり３回洗浄し、その後、ＰＢＳＴ中で３０分間にわたり透過処理した。細胞を、５％の正常ロバ血清（Millipore S30）および０．０５％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳＴ（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）中でブロッキングした。一次抗体染色は、終夜４℃で行った。一次抗体を、表１において列記する。細胞を、ＰＢＳＴで５分間にわたり３回洗浄し、それらの二次抗体と共に室温１時間インキュベートした。免疫枯渇実験のために、条件培地を、５μｇの抗ＡＰＯＥまたは非特異的なＩｇＧ対照抗体と共に、終夜４℃でインキュベートすることにより、周皮細胞条件培地からＡＰＯＥを免疫枯渇させた。、次いで、磁気タンパク質Ａ／Ｇビーズで、抗体を取り除いた。
ウェスタンブロットおよびＥｌｉｓａ溶解の調製
細胞を、ＰＢＳで洗浄し、次いでAccutaseを用いて解離させた。細胞を、次いで血球計数器およびトリパンブルーを用いてカウントし、総細胞数に対して正規化した。細胞を、次いで、ＰＢＳで２回洗浄し、ＲＩＰＡバッファーで溶解した。試料を、４～２０％のプレキャストポリアクリルアミドゲル（Bio-Rad 4561095）上で分離させた。タンパク質をＰＶＤＦメンブレン上に移し、ＴＢＳＴ（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のTween 20）および５％のミルクで、１時間にわたり室温でブロッキングした。試料を、示される一次抗体と共に、振盪インキュベーター上で終夜４℃でプロービングした。APOE ELISAキット（ThermoFisher、EHAPOE）を用いて、周皮細胞により４８時間にわたり条件付けされた培地から、可溶性ＡＰＯＥを定量した。
ｉＰＳＣ由来細胞株のＲＮＡ分析
トリゾールおよびチモーゲンRNA-directスピンカラムを用いて総ＲＮＡを単離し、カラム上でＤＮＡｓｅにより３０分間処置し、その後洗浄および溶出を行った。ＲＴ－ＰＣＲのために、５００ｎｇの総ＲＮＡを、iScript（BioRad）によりｃＤＮＡへと逆転写した。SsoFast EvaGreen supermix（BioRad）により、発現を定量した。ＲＮＡの配列決定のために、抽出した総ＲＮＡを、Advanced Analytical-fragment Analyzerを用いてＱＣに供し、その後、Illumina Neoprep stranded ライブラリ調製キットを用いてライブラリを調製した。ライブラリを、MIT Biomicro CenterにおいてIllumina HiSeq2000またはNextSeq500プラットフォームを用いて、配列決定のためにプールした。未処理のfastqデータを、STAR 2.4.0 RNA-seqアライナーを用いて、ヒトｈｇ１９アセンブリーとアラインメントした。編集されたＡＰＯＥ３／４部位をカバーするマッピングしたRNA-seqの読み値を用いて、データの遺伝子型を検証した。feature Countsツールを用いて、マッピングしたデータから遺伝子の粗カウントを作製した。マッピングした読み値はまた、Cufflinks2.2により、ｈｇ１９参照遺伝子のアノテーションで処理し、転写物のアバンダンスを概算した。Cuffdiffモジュールを用いて、各々の細胞型のＡＰＯＥ３およびＡＰＯＥ４群の間の遺伝子差次的発現試験を行い、調整されたｑ値＜０．０５を統計学的有意性とした。Cuffdiffのためのライブラリの正規化方法として、幾何学的方法を選択した。色分けされたスキャッタープロットを用いて、差次的に発現される遺伝子および他の遺伝子についての群のＦＰＫＭ値を可視化した。
単一核ＲＮＡ（single-nucleus RNA）の配列決定およびヒトの死後組織の染色
Religious Orders Study and Rush Memory and Aging Project（https://www.synapse.org/#!Synapse:syn3219045）の一部としてプロファイリングされたヒト海馬単一核トランスクリプトームのデータを、コンピューターによる周皮細胞および内皮のシングルセルトランスクリプトームの同定および抽出のために分析した。周皮細胞または内皮細胞のいずれかのマーカーの濃縮した発現を提示する細胞がクラスター化している群をアノテーションすることにより、推定周皮細胞および内皮細胞を同定した。同定された細胞は、神経細胞、乏突起膠細胞、乏突起膠細胞の前駆体、ミクログリアまたは星状膠細胞のマーカーの濃縮を示さない、バラバラの細胞群を形成した。ACTIONetコンピューターフレームワーク（http://compbio.mit.edu/ACTIONet/）を用いて、細胞型のアノテーションを行った。ＡＰＯＥ、ＮＦＡＴＣ１またはＮＦＡＴＣ２のいずれかの発現が検出された合計で６１４個の推定の内皮細胞および４，５２３個の推定の周皮細胞を検出し、分析のために考慮した。両側ウィルコクソン順位和検定を用いて、ＡＰＯＥ４とそれに対する非キャリア細胞における、ＡＰＯＥおよびＮＦＡＴの遺伝子についての差次的発現を測定し、遺伝子について発現が検出された細胞を考慮した。前頭前皮質のsnRNA-seqを、推定の周皮細胞および内皮細胞を同定するために、周皮細胞マーカーの発現が特に濃縮された細胞のクラスターを抽出することにより、さらに分析した。同定された細胞（ｎ＝４９５細胞）。海馬切片はパラフィン中に包埋したために、染色プロトコルに先立ってキシレン脱パラフィンおよび再水和のステップを行ったことを例外として、ヒト死後組織を染色した。
シクロスポリンＡのin vivoでの投与
全ての実験は、マサチューセッツ工科大学において、Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに従って行い、National Institute of Health and the Committee on Animal Careにより承認された。５ＸＦＡＤマウスはJackson Laboratoryから得、APOE4KIはTaconicから得た。５ＸＦＡＤおよびＡＰＯＥ４ＫＩマウスを少なくとも８世代にわたり交雑した。シクロスポリンＡは、オリーブ油中１ｍｇ／ｍｌで調製し、１０ｍｇ／ｋｇの濃度で、６か月齢のメスマウスに、毎日、３週間にわたり腹腔内注射した。動物を、気体イソフルランで麻酔し、氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で経心的に灌流した。脳を解剖により切除し、矢状に分割した。一方の半球を冷凍し、一方は、４％のパラホルムアルデヒド中で４℃で終夜、後固定（post-fixed）した。固定された半球を、Leicaのビブラトームを用いて４０μＭの厚みで薄切した。切片は、２時間にわたり室温でブロッキングし、次いで、一次抗体と共に終夜４℃でインキュベートし、その後、ＰＢＳ中で１０分間にわたり５回洗浄し、二次抗体およびヘキスト（１：１００００）と共に、２時間にわたり室温でインキュベートした。切片を、次いで、ＰＢＳ中で１０分間にわたり５回洗浄し、次いで、マウントしてイメージングした。イメージング、定量および分析を行う研究者には、各々のマウスの実験群について伏せられており、分析の後に初めて明らかにした。
初代マウス脳周皮細胞の単離
初代脳周皮細胞を、６～８週齢のＡＰＯＥ４ノックインマウスから単離した。初代脳周皮細胞は、その後、少なくとも２回の継代について増殖させ、次いで、２．５μＭのシクロスポリンＡまたは５μＭのＦＫ５０６で２週間にわたり処置した。ヒトＡＰＯＥについてのＲＴ－ｑＰＣＲにより、遺伝子発現を分析し、マウスＧＡＰＤＨに対して正規化した。
結果
例１：in vitroでのヒト血液脳関門の解剖学的および生理学的特性の再構成
ヒトＢＢＢは、３つの細胞型：脳内皮細胞（ＢＥＣ）、平滑筋細胞および周皮細胞、および星状膠細胞の相互作用を通して形成される、多細胞の組織である。ＢＢＢをin vitroで構築するために、本発明者らは、ヒトｉＰＳＣをＢＥＣおよび星状膠細胞に効率的に分化させるためのプロトコルを、各々の細胞型に特徴的な形態学およびマーカー発現により最適化した（図６ａ～ｄ）。ＲＮＡ配列決定を通して、本発明者らは、ｉＰＳＣ由来星状膠細胞が、線維芽細胞（Ｓｔｅａｐ４、Ｌｕｍ、Ｄｐｅｐ１、ＩｎｍｔおよびＬａｍａ１）および乏突起膠細胞（Ｓ１ｐｒ５、Ｃｌｄｎ１１、ＯｐａｌｉｎおよびＭａｌ）において、星状膠細胞と比較して差次的に上方調節されることが同定される遺伝子を、全く発現しないか、または低いレベルで発現することを検証した（図６ｅおよびｆ）。
ｉＰＳＣを周皮細胞に分化させるために、ｉＰＳＣをＷｎｔ阻害に暴露しつつ、同時にＢＭＰを活性化することにより、一般的な壁細胞前駆体を作製した。本発明者らは、次いで、この前駆体を高レベルのＰＤＧＦ－ＢＢに暴露しつつ、アクチビンＡを介してＴＧＦ－βシグナル伝達を阻害した。これは、分化を平滑筋細胞（ＳＭＣ）に対して周皮細胞に偏らせることが知られている条件である。周皮細胞と同様、これらのｉＰＳＣ由来細胞は、ＣＤ１３、ＮＧ２、ＳＭＡおよびＳＭ２２を発現した（図１ａ；図６ｇ～ｉ）。周皮細胞の決定的な同定は、特異的なマーカーの不在に起因して挑戦的である。したがって、ｉＰＳＣ由来周皮細胞をより詳細に特徴づけし、同定するために、本発明者らは、ｉＰＳＣ由来周皮細胞のＲＮＡ配列決定を行い、周皮細胞において、平滑筋（ＳＭＣ）と比較して、差次的に上方調節されることが報告される遺伝子の発現を決定した。本発明者らは、ｉＰＳＣ由来周皮細胞が、ＴＧＦＢＩ、ＩＧＦ２、ＦＸＹＤ６、ＳＦＲＰ２、ＴＭＥＭ５６、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＵＣＨＬ１、ＤＣＨＳ１、ＮＵＡＫ１、およびＦＡＭ１０５Ａを強力に発現することを見出し、これらは、ＳＭＣと比較した場合に、周皮細胞において差次的に上方調節される遺伝子で上位のもののうちに入る（図６ｊ）。対照的に、ｉＰＳＣ由来周皮細胞は、ＳＧＣＡ、ＳＵＳＤ５およびＯＬＦＲ７８を発現しなかった。これらは、ＳＭＣにおいて、周皮細胞と比較して、最も著しく上方調節される遺伝子である（図６ｋ）。同様に、ｉＰＳＣ由来周皮細胞は、血管線維芽細胞において高度に発現される遺伝子（ＳＦＲＰ４、ＭＯＸＤ１およびＧＪＢ６）を発現しなかったが、代わりに、血管線維芽細胞と比較した場合に、周皮細胞において差次的に上方調節されることが報告されている遺伝子（Ｉｍｐａ２、Ｈｓｐｂ７およびＣｎｎ１）を、高度に発現した（図６ｌおよびｍ）。本発明者らのＲＮＡ配列決定はまた、ｉＰＳＣ由来周皮細胞において、一般的な間葉系マーカー遺伝子（ＳＮＡＩ、ＣＤＨ１およびＡＫＡＰ１）の発現を検出しなかったが、代わりに、周皮細胞およびＳＭＣのマーカー遺伝子であるＡＣＴＡ２、ＣＤ２４８、ＤＬＫ１、ＰＤＧＦＲＢおよびＤＥＳを強力に検出した（図６ｎ）。網羅的な階層的クラスタリングにより、ヒトｉＰＳＣ由来周皮細胞は、動脈のＳＭＣ、初代マウス脳周皮細胞またはヒトｉＰＳＣ由来星状膠細胞、ミクログリア、またはニューロンよりも、初代ヒト脳周皮細胞に類似することが明らかとなった（図６ｏ）。まとめると、このデータは、これらの細胞は、周皮細胞マーカーを発現するが、一方で、ＳＭＣ、線維芽細胞および間葉系細胞において高度に上方調節される遺伝子についてのマーカーを欠失することを示す。
ＢＥＣ、周皮細胞、および星状膠細胞は、その後、マトリゲル中でカプセル化し、３Ｄ細胞外マトリックスを提供した。３Ｄ培養における各々の細胞型の確立および生存を促進するために、マトリゲルに、初めに、１０％のウシ胎仔血清および細胞型の各々にとって重要な増殖因子（１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＢＢおよび１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＡ）を補充した。本発明者らは、これらの増殖因子および位置情報（positional cue）は経時的に拡散し、細胞は、互いからのパラクリンシグナル伝達に依存し、組織中に自己組織化して沈殿するようになるであろうと考えた。実際に、ハイドロゲルマトリックス中で２週間の後、ＢＥＣは、血管に類似する相互接続されたＣＤ１４４陽性細胞の大きな（＞５ｍｍ２）ネットワークへと集合した（図１ｂ；図７ａ）。in vivoで、内皮細胞は、ＰＤＧＦ－ＢＢを分泌し、内皮血管を取り囲む血管周囲腔に周皮細胞を動員する。初めに、周皮細胞を、マトリゲル全体に均等に分散させた（図７ｂ）。しかし、２週間後、周皮細胞は、ＢＥＣ血管の近位の位置を占めるように再組織化した。ｉＢＢＢにおいて、本発明者らは、ＳＭ２２陽性およびＮＧ２陽性の細胞が、大きな、および小さな内皮血管を裏打ちしていることを観察し、これは、in vivoで観察される細静脈から毛細血管様構造へのＳＭＣおよび周皮細胞の被覆を潜在的に反映する（図１ｃおよびｄ；図７ｂ）。対照的に、星状膠細胞は、３Ｄ培養物全体にわたり、より均等に分散したままであった。しかし、多数の星状膠細胞は、各々の内皮血管を取り囲み、ＧＦＡＰ陽性突起を血管周囲腔中に伸長する（図１ｅ、図７ｃ）。in vivoで、星状膠細胞は、「エンドフィート」として知られる突起を脳の脈管構造上に伸長し、ここで、それらは、ＢＢＢを横断する水および他の分子の輸送を調節するアクアポリン４（ＡＱＰ４）などの輸送分子を発現する。星状膠細胞を欠失する培養物（ＢＥＣ単独、周皮細胞単独、またはＢＥＣ＋周皮細胞）において、本発明者らは、ｑＲＴ－ＰＣＲまたは免疫細胞化学により、ＡＱＰ４のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を検出しなかった（図７ｄおよびｅ）。対照的に、３つ全ての細胞型を含む３Ｄ共培養は、ＡＱＰ４のｍＲＮＡを強力に発現し、内皮血管は、ＡＱＰ４を発現するＳ１００βおよびＧＦＡＰ陽性の星状膠細胞で裏打ちされていた（図１ｆ；図７ｄおよび７ｅ）。脳において、周皮細胞、星状膠細胞およびＢＥＣは、細胞外マトリックスを分泌し、ＢＢＢを取り囲む基底膜を作る。in vivoで、ＢＥＣはラミニンα４（ＬＡＭＡ４）を分泌し、これは、内皮細胞を裏打ちする。免疫染色を通して、本発明者らは、ＬＡＭＡ４は、マトリゲルにおいて天然には存在しないことを見出した（図７ｆ）。しかし、培養中１か月間の後で、本発明者らは、ｉＢＢＢの内皮血管を取り囲むＬＡＭＡ４の免疫反応性を見出した（図７ｆ）。このことは、ｉＢＢＢ培養物が、細胞外マトリックスを、in vivoでＢＢＢにおいて見出される基底膜タンパク質を獲得するようにリモデリングすることを示唆する。まとめると、これらの観察は、ＢＥＣ、周皮細胞および星状膠細胞の３Ｄ共培養は、ＢＢＢと一致する解剖学的特性を有する血管構造を生じることを示唆する。
移植研究は、ＢＢＢは、内皮細胞の固有の機能ではなく、むしろ周皮細胞および星状膠細胞との協調的相互作用を通して付与されるものであることを示した。in vivoでＢＥＣは、細胞の接着分子であるタイトジャンクションタンパク質、ならびに、液体、化学物質およびトキシンの傍細胞拡散を制限する特化したバリアを作り出す溶質トランスポーターを上方調節する。例えば、ＣＬＤＮ５、ＪＡＭＡ、ＰｇＰ、ＬＲＰ１、ＲＡＧＥおよびＧＬＵＴ１は、ＢＥＣ上で発現し、ＢＢＢの機能にとって重要であって、ＢＢＢ形成についてのバイオマーカーとして用いられてきた、タイトジャンクションタンパク質、トランスポーターおよび受容体をコードする。本発明者らのin vitroのＢＢＢモデルにおけるＢＥＣと星状膠細胞および周皮細胞との相互作用がこれらのおよび他のＢＢＢ遺伝子の発現の上昇をもたらすか否かを検討するために、本発明者らは、単独で培養されたかまたは星状膠細胞もしくは周皮細胞と共に培養されたＢＥＣ、および星状膠細胞および周皮細胞を含むｉＢＢＢのｑＲＴ－ＰＣＲによる、転写プロファイリングを行った。本発明者らは、ＢＢＢ予測的バイオマーカーＣＬＤＮ５、ＪＡＭＡ、ＰｇＰ、ＬＲＰ１、ＲＡＧＥおよびＧＬＵＴ１のＲＮＡ発現が、星状膠細胞をＢＥＣと共培養した場合にｉＢＢＢと類似のレベルまで上方調節されたＣＬＤＮ５を例外として、ｉＢＢＢからのＢＥＣにおいて、単独で培養されたＢＥＣおよび星状膠細胞または周皮細胞と共培養されたＢＥＣからのものよりも著しく高かったことを見出した（図１ｇ）。加えて、ＰＥＣＡＭ、ＡＢＣＧ２、ＣＤＨ５、ＣＧＮ、ＳＬＣ３８Ａ５、ＡＢＣＣ２、ＶＷＦおよびＳＬＣ７Ａ５を含む多数の他の溶質トランスポーター、タイトジャンクション構成成分および細胞接着分子が、ｉＢＢＢモデルにおいて、ＢＥＣ単独または星状膠細胞と共培養されたＢＥＣと比較して、選択的に上方調節された（図１ｈ）。これらの遺伝子は、ＢＢＢにおいて高度に発現され、それらの協調的作用は、ＢＢＢにそのユニークなバリア特性を付与すると考えられる。本発明者らは、ＶＥＧＦＡにより誘導されることが知られている内皮の血管新生のマーカーであるＰＬＶＡＰの高発現を観察した。本発明者らは、ＰＬＶＡＰの発現は、周皮細胞または星状膠細胞の存在によっては影響を受けないが、培養培地からのＶＥＧＦＡの除去により著しく減少することを見出した（図７ｇおよびｈ）。これらの観察は、ｉＢＢＢ中のＢＥＣは、ＶＥＧＦＡなどの可溶性のキューに対して応答することができることを示唆する。ＶＥＧＦＡの効果を最小限にするために、本発明者らは、その後、ｉＢＢＢ形成の最初の２週間、ｉＢＢＢを、ＶＥＧＦＡを含有する培地のみで培養した。まとめると、本発明者らの結果は、ｉＰＳＣ由来ＢＥＣ、周皮細胞、および星状膠細胞の共培養は、in vivoで観察されるＢＢＢの基礎的な解剖学的および分子的特性を有する多細胞の組織を生じることを示す。
ＢＢＢは、ほとんどの分子の神経系への通過を制限する高度に選択的な膜である。ｉＢＢＢがＢＢＢの増大した機能的特性を示すか否かを検討するために、本発明者らは、初めに透過膜上にコンフルエントなＢＥＣの単層を作製し、その後、最上部に周皮細胞、次いで星状膠細胞の層を作ることにより、トランスウェル系を確立した（図１ｉおよびｊ）。トランスウェルの立体配置において、ＢＥＣは、タイトジャンクションタンパク質であるＺＯ－１、およびＢＢＢと関連するＣＬＤＮ５を高度に発現した（図７ｉ）。経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）は、内皮単層を横断する電気抵抗の尺度であって、高感度かつ信頼性のある定量的な透過性の指標として用いられるものである。バリアを形成する全ての不死化内皮細胞株は、１５０Ｏｈｍｓ／ｃｍ未満のＴＥＥＲ値を示す。同様に、ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨｕＶＥＣ）などの末梢の内皮細胞は、比較的高い透過性を有し、したがって低いＴＥＥＲを示す。これらの報告された観察と一致して、本発明者らは、ＨｕＶＥＣを本発明者らのトランスウェル立体配置において培養した際に、約１００Ｏｈｍｓ／ｃｍ２のＴＥＥＲ値を観察した（図１ｋ）。ＨｕＶＥＣのＴＥＥＲ値は、星状膠細胞または周皮細胞と共培養することにより増大しなかった。先に報告されるとおり、単独で培養されたｉＰＳＣ由来ＢＥＣは、５９００Ｏｈｍｓ／ｃｍ２の平均を有する著しく高いＴＥＥＲ値を有した（図１ｋ）。しかし、単独で培養されたＢＥＣについてのＴＥＥＲ値は、高度な変動性を示した（ＳＤ＝＋／－２１５０Ｏｈｍｓ）。ＢＥＣを周皮細胞および星状膠細胞と共培養することにより、ＴＥＥＲの変動性は減少し（ＳＤ＝＋／－５１３．９Ｏｈｍｓ）、平均抵抗の著しい増大（８０３０Ｏｈｍｓ／ｃｍ２）がもたらされた。このことは、ｉＢＢＢは、ＨｕＶＥＣ、または単独で培養されたＢＥＣよりも透過性が低いことを示唆している（図１ｋ）。
ｉＢＢＢのバリア特性をより完全に評価するために、本発明者らは、０．１～８０ｋＤａの範囲の分子量を有する分子の傍細胞透過性を比較した。０．１～１０ｋＤａの範囲の分子について、本発明者らは、ＢＥＣ単独と比較して、ｉＢＢＢの約５０％の傍細胞透過性の減少を観察した（図１ｌ）。７０および８０ｋＤａのより高い分子量を有する分子は、ＢＥＣ単独と比較して、はるかに低い効率（７０および９０％の低下）でｉＢＢＢを横断した（図１ｌ）。ｉＢＢＢの透過性の低下が、単にさらなる細胞の層の結果であるという可能性を除外するために、本発明者らは、ＢＥＣの上に、通常の数の二倍の周皮細胞のみ、星状膠細胞のみ、または無関係な細胞型であるマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を重ねた。単独で、またはＢＥＣと共に培養された星状膠細胞、周皮細胞またはＭＥＦのいずれも、透過性の低下をもたらさなかったが、一方、ｉＢＢＢ中での星状膠細胞および周皮細胞の共培養は、透過性の著しい低下をもたらした（図１ｍ）。このことは、ｉＢＢＢの低下した透過性は、星状膠細胞および周皮細胞の両方の協調的存在を必要とし、単に物理的にさらなる細胞を重ねたことの効果ではないことを示す。分子プロファイリングおよびＴＥＥＲ値と一致して、このことは、ｉＢＢＢにおける星状膠細胞、周皮細胞および脳内皮細胞の協調的相互作用が、生理学的ＢＢＢと一致する分子的および機能的特性を付与することを確立する。
ＢＢＢにおける内皮細胞は、頂端膜側において選択的に存在する排出ポンプを発現する。排出ポンプの発現および極性化は、ＢＢＢが、小さい親油性分子が脳に侵入することを防ぐ、重要な機構である。分子プロファイリングは、２つの一般的な排出ポンプｐ－糖タンパク質（Ｐｇｐ）およびＡＢＣＧ２が、ｉＢＢＢにおいて、ＢＥＣ単独または星状膠細胞と共培養されたＢＥＣと比較して、それぞれ２倍および３倍より高く上方調節されることを同定した（図１ｇおよびｎ）。ＰｇｐがｉＢＢＢの頂端膜側において極性化されるか否かを決定するために、本発明者らは、Ｐｇｐ特異的阻害剤であるリバーシン１２１の存在下および不在下において、頂端膜側から基底膜側への、およびその逆のローダミン１２３の流出を測定した。Ｐｇｐの阻害は、頂端膜側から基底膜側へのローダミン１２３の透過性を劇的に増大させたが、基底膜側から頂端膜側へについてはそうではなかった（図１ｏ）。このことは、Ｐｇｐが主にｉＢＢＢの頂端膜に局在することを示唆する（図１ｏ）。極性化した内皮と一致して、特異的ＡＢＣＧ２阻害剤であるＫＯ１４３によるＡＢＣＧ２の阻害もまた、ＡＢＣＧ２の基質であるヘキスト３３２５８の頂端膜側から基底膜側への輸送を強力に増大させた（図７ｊ）。まとめると、これらの結果は、ｉＢＢＢが、高いＴＥＥＲ、低下した分子透過性、および排出ポンプの極性化を有することを示し、これらはすべて、in vivoでのＢＢＢの重要な機能的特性である。in vivoでのヒトＢＢＢとｉＢＢＢとの間の相違は残る可能性がある；しかし、本発明者らが以下に示すように、ｉＢＢＢは、ヒトＢＢＢの生物学への疾患に関連する見識を提供し、これは、in vivoで疾患の病態を減少することに影響を及ぼし得る。
例２：ＡＰＯＥ４はｉＢＢＢにおけるＡβ蓄積を増大させる
ほとんど（＞９０％）のアルツハイマー病患者および非認知症の高齢者のうちの２０～４０％が、その脳の脈管構造に沿ってＣＡＡとして知られる状態であるアミロイド沈着を示す。ＣＡＡは、ＢＢＢの機能を損ない、脳虚血、出血を促進し、認知能力低下を加速させる。したがって、本発明者らは、本発明者らのｉＢＢＢモデルにおけるアミロイド蓄積を検討することを試み、初めに、対照または家族性ＡＤ（ｆＡＤ）患者の株に由来するｉＢＢＢが、内因的にアミロイドを蓄積するか否かを試験した。ｉＢＢＢ細胞型により低レベルのＡβが産生されたことと一致して、本発明者らは、アミロイド前駆体タンパク質をコードするＡＰＰ遺伝子の重複を有する患者に由来するｆＡＤ ｉＢＢＢ、ＰＳＥＮ１Ｍ１４６Ｉ変異を有する別個のアイソジェニックペア、およびその補正された非ＡＤ対照において、認識可能なアミロイドの蓄積を検出しなかった（図８ａおよびｂ）。対照的に、ニューロンは、高度にＡＰＰを発現し、ヒト脳において最も顕著なアミロイドのソースである。したがって、本発明者らは、次に、対照、およびＡＰＰ遺伝子の重複を有するｉＰＳＣ株から作製したｆＡＤニューロンの培養物からの、Ａβリッチな条件培地を利用した。初めに、本発明者らは、１か月間かけてｉＢＢＢを形成および成熟させ、その後、それを、高いレベルのＡβ１－４２を含むことをＥＬＩＳＡにより確認した本発明者らが確認したｆＡＤ神経細胞により条件付けされた培地に暴露した（図２ａ；図８ｃ）。非ＡＤ神経細胞により条件付けされた培地に９６時間にわたり暴露されたｉＢＢＢは、最小限のＡβ蓄積を示した（図２ｂ）。対照的に、ｆＡＤ神経培地に９６時間にわたり暴露されたｉＢＢＢは、著しくより多くのアミロイド蓄積を有し、このことは、ｉＢＢＢが、in vivoで観察されるＢＢＢアミロイド沈着をモデル化することができることを示唆している。
加齢の間、Ａβレベルは、ヒト脳において自然に上昇する。Ａβの沈着およびクリアランスに影響を及ぼす遺伝子多型は、ＡＤおよびＣＡＡと関連する病害を孤発的に誘発すると考えられる。ヒトにおいては、ＡＰＯＥ２、３および４の３つの遺伝子多型が存在する。臨床およびマウスの両方の研究は、ＡＰＯＥ４が、ＣＡＡおよび孤発性ＡＤについての最も顕著な既知のリスク因子であることを見出している。しかし、その根底にある機構は、ほぼ未知である。Ａβ蓄積が、ＡＰＯＥの遺伝子型により影響を受けるか否かをｉＢＢＢにおいて検討するために、本発明者らは、先に報告されたアイソジェニックなＡＰＯＥ３／３（Ｅ３／３）およびＡＰＯＥ４／４（Ｅ４／４）のｉＰＳＣからｉＢＢＢを作製した。本発明者らは、ｉＢＢＢを上昇したＡβを有する条件培地に暴露した。アイソジェニックなＥ４／４ ｉＢＢＢは、一貫して、親Ｅ３／３ ｉＢＢＢと比較して、著しくより多くの６ｅ１０陽性のアミロイド蓄積を示した（図２ｃ）。本発明者らは、次に、ｉＰＳＣをＥ４／４個体からＥ３／３に遺伝子改変することによりアミロイド表現型をレスキューし得るか否かを検討した。本発明者らは、再び、Ｅ４／４ ｉＢＢＢが、オリジナルのアイソジェニックペアのさらなるクローン、および逆の編集戦略による第２のアイソジェニックペア（Ｅ４／４－リスクに対してＥ３／３－非リスク）において、著しくより多くの６ｅ１０陽性アミロイド蓄積を示すことを観察した。このことは、Ｅ４／４ ｉＢＢＢにおける増大したアミロイド沈着は、遺伝子編集のクローンのバリエーションの結果である可能性は低いことを示唆している（図２ｄ）。ＡＰＯＥ３／４（Ｅ３／４）ヘテロ接合性のヒトはまた増大したＣＡＡおよびＡＤの発生率を有する。したがって、本発明者らは、次に、Ｅ３／４ヘテロ接合体から作製されたｉＢＢＢが、Ｅ３／３ ｉＢＢＢと比較して、アミロイド沈着を示すか否かを検討した。臨床的観察と一致して、３つの異なるＥ３／４ヘテロ接合性個体から作製したｉＢＢＢは、Ｅ３／３個体から作製したｉＢＢＢよりも著しく多くのアミロイド蓄積を示した（図２ｅ；図８ｄ）。
本発明者らは、４つのさらなる方法により、ｉＢＢＢＡβ蓄積を定量した。初めに、２つのさらなる抗体Ｄ５４Ｄ２（Ａβ１－３７、Ａβ１－３８、Ａβ１－３９、Ａβ１－４０およびＡβ１－４２などの、いくつかの凝集したＡβのアイソフォームを検出する）、および１２Ｆ４（Ａβ１－４２オリゴマーを検出する）を用いて、本発明者らは、アミロイド蓄積が、ＡＰＯＥ４ ｉＢＢＢにおいて、ＡＰＯＥ３ ｉＢＢＢと比較して上昇することをさらに検証した（図２ｆおよびｇならびに図８ｅ）。本発明者らはまた、ｆＡＤ条件培地に暴露されたＡＰＯＥ４ ｉＢＢＢが、原線維アミロイドに結合する化学色素チオフラビンＴ（ＴｈＴ）により、著しくより高い染色を示すことを見出した（図８ｆ）。さらに、２０ｎＭの蛍光標識されたＡβペプチド（２０ｎＭの１－４０／１－４２）に９６時間にわたり直接暴露されたＥ４ ｉＢＢＢは、より高いレベルのＡβ蓄積を示した。このことは、当該表現型が、条件培地における二次応答要求因子というよりもむしろ、Ｅ４ ｉＢＢＢに固有であることを示唆している（図８ｇ）。本発明者らは、合成のＡβ１－４０および１－４２のアイソフォームを独立して試験し、それらが、Ｅ４ ｉＢＢＢにおいて、単独で試験された場合に、著しくより多くのアミロイドを示すことを見出した（図９ｈ）。本発明者らはまた、ＡＰＯＥ４ ｉＢＢＢにおける増大したアミロイド蓄積は、ＡＰＯＥ３ ｉＢＢＢと比較した、ＡＰＯＥ４ ｉＢＢＢ培養培地における可溶性単量体Ａβの減少に対応することを見出した。このことは、さらに、ＡＰＯＥ４ ｉＢＢＢが、ＡＰＯＥ３ ｉＢＢＢより多くのアミロイドを蓄積することを示唆している（図２ｈ）。まとめると、これらのデータは、臨床研究と類似して、ＡＰＯＥ４ ｉＢＢＢは、アイソジェニックなＡＰＯＥ３ ｉＢＢＢと比較して、より多くのアミロイドを蓄積することを示す。
次に、本発明者らは、ＡＰＯＥ４ ｉＢＢＢにおける増大したアミロイド蓄積の空間分布を決定した。２Ｄにおいて単独で培養された場合、ＡＰＯＥ４周皮細胞およびＢＥＣはいずれも、それらのＡＰＯＥ３カウンターパートより多くの蛍光標識されたＡβを蓄積した（図８ｉおよびｊ）。高解像度IMARIS画像分析を用いて、本発明者らは、「血管アミロイド」として定義されるＶＥ－カドヘリン陽性血管の中心からの２０μｍよりも小さい６ｅ１０陽性免疫反応性、および「非血管アミロイド」として定義される血管の中心からの２０μｍより大きな６ｅ１０陽性免疫反応性を介して、アミロイドを定量した（図２ｉ）。２Ｄにおいてより多くのアミロイドを蓄積するＡＰＯＥ４ ＢＥＣおよび周皮細胞と一致して、本発明者らは、ＡＰＯＥ４ ｉＢＢＢのＢＥＣ血管上およびその周囲に、ＡＰＯＥ３／３ ｉＢＢＢと比較して、著しくより多くの６ｅ１０陽性アミロイドシグナルを見出した（図２ｉおよびｊ）。興味深いことに、非血管アミロイドはまた、ＡＰＯＥ４ ｉＢＢＢにおいて各々の血管を取り囲む実質空間において増大した（図２ｊ）。この非血管アミロイドは、星状膠細胞マーカーであるＧＦＡＰおよびＳ１００βについて陽性の核を取り囲む細胞のものであると考えられる（図２ｋ）。本発明者らは、ＡＰＯＥ４ ｉＢＢＢにおいて、星状膠細胞のうちの約３６．８％はアミロイドを含むが、ＡＰＯＥ３星状膠細胞のうちでは、著しくより少ないもの（１６．８％）がアミロイドを含むことを見出した（図２ｌ）。まとめると、これらの結果は、ｉＢＢＢは、ＣＡＡおよびＡＤならびにこれらの病態についての一般的な遺伝的素因において観察されるアミロイド蓄積の側面をモデル化することができることを示す。
例３：周皮細胞はｉＢＢＢにおける増大したＡβ沈着のために必要とされる
観察されたＡβ沈着の増大は、ＢＢＢ中に存在する細胞型のうちの全てまたは一部のみにおいて、ＰＯＥ４の発現を必要とし得る。原因細胞を特定することにより、根底にある機構を精査してこれを標的とするその後の研究が可能となるであろう。したがって、増大したＡβ沈着の細胞起源を決定するために、本発明者らは、アイソジェニックなｉＰＳＣからのＥ３／３およびＥ４／４の８つの可能な順列からｉＢＢＢを作製することにより、組み合わせ実験を行った。本発明者らは、初めに、ｉＢＢＢを１か月間にわたり成熟させ、次いで、２０ｎＭの合成ＦＩＴＣ標識Ａβに９６時間にわたり暴露し、各々の順列における総Ａβ－ＦＩＴＣ蓄積を定量した。先に観察されるとおり、全てのＥ４／４ ｉＢＢＢは、全てのＥ３／３ ｉＢＢＢより著しく多くのアミロイド沈着を示した（図３ａおよびｂ）。組み合わせの効果を分析するために、本発明者らは、初めに、全Ｅ３／３ ｉＢＢＢ（低Ａβ）または全Ｅ４／４ ｉＢＢＢ（高Ａβ）に対して統計学的に類似（ｐ＜０．０５）する低いＡβを示すか否かに基づいて、ｉＢＢＢ順列の各々を分離し、次いで、２つの条件の間の細胞共有性を求めた（図３ｃ）。低および高Ａβの両方の条件が、同等に、Ｅ３／３およびＥ４／４遺伝子型の両方から星状膠細胞およびＢＥＣを含んだ（図３ｃ）。しかし、著しいことに、低Ａβ条件の全ては、Ｅ３／３周皮細胞のみを含み、一方、高Ａβ蓄積を示した全てのｉＢＢＢは、Ｅ４／４周皮細胞のみを含んだ（図３ｂ～ｃ）。このことは、Ｅ４ ｉＢＢＢにおいて観察される増大したアミロイド表現型のためにＥ４／４周皮細胞が必要であることを強力に示唆する。本発明者らは、Ｅ４／４周皮細胞のみを異なるＥ３／３個体（２１０）に由来する周皮細胞で置き換えることが、ＢＥＣまたは星状膠細胞の遺伝子型にかかわらずｉＢＢＢアミロイド沈着の著しい減少をもたらすことをさらに確認した（図３ｄ）。周皮細胞中の１コピーのＥ４がアミロイド沈着の増大を引き起こすために十分であるか否かを検討するために、本発明者らは、ＡＰＯＥ３／４ヘテロ接合性であるＨ９ヒト胚性幹細胞株に由来するＥ３／４ヘテロ接合性のＢＥＣ、星状膠細胞および周皮細胞により、組み合わせ実験を行った（図３ｄ）。やはり、Ｅ３／３の星状膠細胞またはＢＥＣをＥ３／４の星状膠細胞またはＢＥＣで置換することは、ｉＢＢＢのアミロイド蓄積を著しくは増大させなかった（図３ｄ）。しかし、Ｅ４／４ホモ接合性周皮細胞により観察されるとおり、Ｅ３／３周皮細胞をヘテロ接合性Ｅ３／４周皮細胞で置き換えることは、ｉＢＢＢアミロイド蓄積を、全てのＥ３／４ ｉＢＢＢにおいて観察されたものと類似のレベルまで増大させた（図３ｄ）。このことは、ＡＰＯＥ４ヘテロ接合性およびホモ接合性の周皮細胞はいずれも単独で、ｉＢＢＢにおけるアミロイド蓄積を増大させるために十分であることを示す（図３ｄ）。ＡＰＯＥ４周皮細胞は、血管アミロイド蓄積を増大させるために十分であることをさらに確認するために、本発明者らは、ｉＢＢＢを、各々の遺伝子型から、ＢＥＣ単独、ＢＥＣおよび周皮細胞、またはＢＥＣおよび星状膠細胞に分解した。Ｅ４／４ ＢＥＣ単独またはＢＥＣおよび星状膠細胞は、観察された表現型を再現しなかった。しかし、Ｅ４／４ ＢＥＣおよび周皮細胞は、アミロイド蓄積の著しい増大をもたらした（図９ａ）。同様に、本発明者らは、Ｅ３／３ ｉＢＢＢを、Ｅ３／３またはＥ４／４周皮細胞のいずれかにより条件付けされた培地に暴露し、次いで、２０ｎＭのＡβ－ＦＩＴＣを全ての条件に加えた。このことにより、Ｅ４／４周皮細胞条件培地は、Ｅ３／３ ｉＢＢＢのアミロイド蓄積を増大させるために十分であることが明らかとなった（図３ｅ）。本発明者らはまた、ＡＰＯＥ４星状膠細胞をＡＰＯＥ４周皮細胞条件培地で処置することは、星状膠細胞のアミロイド蓄積を著しく増大させることを見出した（図９ｂ）。まとめると、これらの結果は、周皮細胞におけるＡＰＯＥ４の発現は、未知の可溶性因子を介して、ｉＢＢＢにおけるＡβ沈着の増大を促進することを示す。周皮細胞および平滑筋細胞は、マウス脳において高レベルのＡＰＯＥを発現し（図９ｃ）、周皮細胞の変性は、ＡＰＯＥ４個体において加速される。最近になって、周皮細胞は、Ａβに応答して毛細血管を狭窄し、低酸素症を誘導することが見出された。疾患の病態の間に遺伝子多型がどのように周皮細胞に影響を及ぼすのかについては、あまり理解されていない。
例４：ＡＰＯＥおよびカルシニューリンシグナル伝達はＡＰＯＥ４周皮細胞において上方調節される
周皮細胞およびＡＰＯＥ４がどのようにして一緒にアミロイド沈着の増大を促進するかをさらに検討するために、本発明者らは、次に、アイソジェニックなｉＰＳＣ由来のＡＰＯＥ３／３およびＡＰＯＥ４／４周皮細胞の網羅的な転写プロファイリングを行った。先に、本発明者らは、数百から数千の遺伝子が、同じｉＰＳＣ株から作製されたｉＰＳＣ（１５０遺伝子）、ニューロン（４４３遺伝子）、星状膠細胞（１３２５遺伝子）、およびミクログリア様細胞（１４５８遺伝子）を含む、アイソジェニックなＥ３／３およびＥ４／４細胞の間で差次的に発現されることを見出した。本発明者らは、はるかにより多くの数の遺伝子（４２８６）が、アイソジェニックな周皮細胞の間で差次的に発現され（ＤＥＧ；ｑ＜０．０５）、ここでＥ４／４周皮細胞において２，３０３個の遺伝子が著しく上方調節され、１，９８３個の遺伝子が下方調節されることを見出した（図４ａ）。遺伝子のオントロジー分析は、ＡＰＯＥ４周皮細胞において、膜および小胞体へのタンパク質のターゲティングに関与する生物学的プロセスは上方調節されるが、一方で、融資分裂および細胞周期の進行は下方調節されることを示唆した（図１０ａおよびｂ）。先に、本発明者らは、Ｅ４／４星状膠細胞におけるＡＰＯＥの発現が下方調節されることを観察した。マウスにおける先の報告と同様に、本発明者らは、ＲＮＡ配列決定からの星状膠細胞および周皮細胞のＡＰＯＥのＦＰＫＭ値の相対的比較に基づいて、ヒトｉＰＳＣ由来周皮細胞は、ＡＰＯＥを高度に発現することを見出した（図１０ｃ）。しかし、星状膠細胞とは著しく対照的に、周皮細胞は、Ｅ４／４周皮細胞において強力なＡＰＯＥの上方調節を示し、一方で、遺伝的に同一のＥ４／４星状膠細胞は、Ｅ３／３と比較して、より低いレベルのＡＰＯＥによる逆の発現プロフィールを示した（図１０ｄ）。本発明者らは、RNAseqの試料とは独立して試料から採取されたＲＮＡのｑＲＴ－ＰＣＲを介して、周皮細胞および星状膠細胞において、それぞれ、差次的なＡＰＯＥの上方調節および下方調節を確認した（図４ｂ）。本発明者らは、免疫蛍光イメージングおよびウェスタンブロッティングを介して、Ｅ４／４周皮細胞におけるＡＰＯＥ遺伝子発現の増大は、タンパク質の増大に読み換えられることを見出した（図４ｃおよびｄ）。ＡＰＯＥ遺伝子発現はまた、本発明者らのレシプロカルなアイソジェニックペアからのＥ４／４周皮細胞において上方調節され、このことは、効果が、遺伝子編集のアーチファクトまたはクローンのバリエーションである可能性は低いことを示唆している（図４ｅ）。さらに、複数のＡＰＯＥ３／４ヘテロ接合性個体からの周皮細胞は、一貫して、編集されていないｉＰＳＣから作製されたＥ３／３周皮細胞を含むＥ３／３周皮細胞より高いＡＰＯＥのｍＲＮＡを発現した（図４ｅ）。
これらの知見のヒト脳における関連性を確認するために、本発明者らは、本発明者らの最近公開された単一核RNA-seqを用いるヒト前頭前皮質のＢＡ１０領域のシングルセルトランスクリプトーム研究から、単一核ＲＮＡ配列決定（snRNAseq）を使用して、周皮細胞および内皮細胞におけるＡＰＯＥの発現を評価した。本発明者らは、周皮細胞の転写クラスターは、内皮細胞のものと部分的に重複することを見出した。本発明者らの分析を単純化するために、本発明者らは、２つの細胞集団を単一の周皮細胞／内皮クラスターとして扱った。本発明者らは、ＡＰＯＥ４キャリア（ｎ＝７個体）からの皮質周皮細胞／内皮細胞は、非キャリア（ｎ＝１８個体）と比較して著しく高いＡＰＯＥ ｍＲＮＡ発現を示すことを見出した（図１０ｅ）。scRNAseqに加えて、本発明者らは、免疫組織化学法を行って、ヒト脳周皮細胞におけるＡＰＯＥの発現を特異的に検討した。ヒト前頭前皮質において、本発明者らは、ＡＰＯＥ４キャリア（ｎ＝４個体）からのＮＧ２陽性周皮細胞におけるＡＰＯＥタンパク質の発現は、非キャリア（ｎ＝４個体）と比較して著しく上昇したことを見出した（図１０ｆ）。ＡＰＯＥがin vivoで他の脳領域からのＡＰＯＥ４周皮細胞において上昇するか否かをさらに評価するために、本発明者らは、ＡＰＯＥ４キャリア（ｎ＝１６個体）および非キャリア（ｎ＝４６個体）の海馬のsnRNAseqのデータを分析した。海馬データセットからの多数の細胞は、マーカー遺伝子の発現に基づいて、内皮細胞と周皮細胞との明確な分離を可能にした（図１０ｇ）。前頭前皮質と同様に、本発明者らは、ＡＰＯＥ４キャリアからの海馬周皮細胞におけるＡＰＯＥの発現は、非キャリアと比較して、著しく高かったが（図４ｆ）、一方で、内皮細胞においては、ＡＰＯＥ４キャリアと非キャリアとの間でＡＰＯＥ発現の著しい差異は存在しなかった（図１０ｈ）ことを見出した。この観察をさらに検証するために、本発明者らは、ＡＰＯＥ４キャリアおよび非キャリアの異なるコホートからの免疫組織化学を用いてヒト海馬周皮細胞におけるＡＰＯＥ発現を分析した。snRNAseqと同様に、本発明者らは、ＡＰＯＥ４キャリア（ｎ＝６個体）が、ＮＧ２陽性周皮細胞において、非キャリア（ｎ＝６個体）よりも著しく高いＡＰＯＥ免疫反応性を示すことを観察した（図４ｇ）。まとめると、これらの結果は、in vivoでのＡＰＯＥ４キャリアからのヒト脳周皮細胞が、複数の脳領域にわたる非キャリアからの周皮細胞よりも高いＡＰＯＥを発現するという考えと一致する。
ＡＰＯＥは、Ａβに結合して、細胞および細胞外環境とのその相互作用を促進する可溶性タンパク質である。マウスのノックアウト研究は、ＡＰＯＥがＣＡＡの病態のために必要とされること、ならびにＡＰＯＥ３およびＡＰＯＥ４のハプロ不全がノックインマウスにおける脳アミロイド蓄積を減少させることを示している。したがって、Ｅ４周皮細胞において観察される増大したＡＰＯＥの発現は、ＡＰＯＥ４ ｉＢＢＢおよびヒトキャリアにおいて観察されるアミロイドの播種および沈着の増大を促進し得る。このシナリオを探索するために、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集を用いて、アイソジェニックＡＰＯＥ欠損ｉＰＳＣ株を作製した。本発明者らは、次いで、Ｅ３／３、Ｅ４／４であるか、またはＡＰＯＥが欠損した（ノックアウト、ＫＯ）のアイソジェニックｉＢＢＢを作製した。やはり、Ｅ４／４ ｉＢＢＢは、Ｅ３／３と比較して、より高いレベルのアミロイド蓄積を示した。対照的に、ＡＰＯＥ欠損ｉＢＢＢは、蛍光Ａβ蓄積のレベルを、Ｅ３／３ ｉＢＢＢと類似するレベルまで低下させた（図４ｈ）。ＡＰＯＥがアミロイド蓄積の増大のために直接的に必要とされるか否かを試験するために、本発明者らは、初めに、周皮細胞条件培地からのＡＰＯＥを免疫枯渇させ、次いで、ＡＰＯＥ３ ｉＢＢＢをＡＰＯＥ枯渇培地または対照培地に暴露した（非特異的ＩｇＧまたは枯渇なし）。これらの培養物を、その後、蛍光標識されたＡβに９６時間にわたり暴露した。ＡＰＯＥ４／４周皮細胞条件培地からのＡＰＯＥの免疫枯渇は、非枯渇または非特異的ＩｇＧ枯渇対照と比較して、Ａβの蓄積の著しい低下を引き起こした（図４ｉ）。このことは、ＡＰＯＥ濃度の上昇がアミロイド沈着を増大させることを示唆する。この理論をさらに検討するために、本発明者らは、次に、組み換えヒトＡＰＯＥタンパク質を用いて、ＡＰＯＥ３ ｉＢＢＢ培養培地におけるＡＰＯＥの濃度を、ほぼＡＰＯＥ４ ｉＢＢＢ培養培地（２００ｎｇ／ｍｌ）において観察されるレベルまで増大させ、その後、これらのｉＢＢＢを蛍光標識されたＡβに９６時間にわたり暴露した。本発明者らは、ＡＰＯＥ濃度を増大させることは、Ｅ３であるかＥ４であるかにかかわらず、ＡＰＯＥ３／３ ｉＢＢＢにおけるＡβ蓄積を、ＡＰＯＥ４におけるレベルと類似のレベルまで増大させるために十分であることを見出した（図１１ａ）。このことは、ＡＰＯＥタンパク質の豊富さがアミロイド蓄積と直接的に相関することを示す。したがって、周皮細胞がＡＰＯＥの豊富なソースであることを前提として、本発明者らは、ＡＰＯＥ４周皮細胞においてＡＰＯＥタンパク質を減少させることは、アミロイド蓄積の低下をもたらし得るという仮説を立てた。
次に、本発明者らは、周皮細胞におけるＡＰＯＥ遺伝子型の差次的発現の根底にある調節経路を同定することを求めた。特に、本発明者らは、Ｅ４周皮細胞におけるＡＰＯＥの上方調節を調節し得る、潜在的なＤＮＡ結合タンパク質に関心があった。したがって、本発明者らは、初めに、アイソジェニックなＥ３／３およびＥ４／４周皮細胞の間で差次的に発現される全ての転写因子を同定した。Ｅ４／４において、アイソジェニックＥ３／３周皮細胞と比較して、１２７個の転写因子は差次的に上方調節され、１０１個は下方調節された（ｑ＜０．０５による）（図４ｊ）。ＡＰＯＥ発現を調節することができる転写因子を特定するために、本発明者らは、次に、差次的に発現される転写因子のうちのいずれかが、ＡＰＯＥ遺伝子の制御エレメントに結合することが報告されているか否かを評価した。Ｅ４／４周皮細胞におけるＮＦＡＴおよびＣ／ＥＢＰの上方調節は、Ｅ４／４周皮細胞におけるＮＦＡＴまたはＣ／ＥＢＰのいずれかの発現の増大が、ＡＰＯＥの発現の増大に寄与し得ることを示唆する。本発明者らは、ＮＦＡＴシグナル伝達の上方調節が特に興味深いものであることを見出した。なぜならば、加齢、ＡＤおよび認知能力低下の間に、ＮＦＡＴ、その上流のエフェクターであるカルシニューリン、およびカルシウムシグナル伝達の調節不全が観察されたからである。しかし、これらの観察の根底にある機構の詳細は、限定されている。
本発明者らは、Ｅ４周皮細胞は、著しくより高い細胞質および核のＮＦＡＴｃ１タンパク質を含むことを、免疫染色およびウェスタンブロッティングにより確認した（図４ｋ；図１１ｂおよびｃ）。さらに、ＣａＮ、ＰＰＰ３ＣＡおよびＰＰＰ３ＣＣの触媒サブユニットをコードする遺伝子は、Ｅ４／４周皮細胞において著しく上方調節された（それぞれ４９．８％および２６．５％）（図１１ｄ）。対照的に、負のカルシニューリンの調節因子であるＲＣＡＮ２、およびＣａＮホスファターゼをリン酸化してその活性を阻害するキナーゼであるＲＣＡＮ３は、Ｅ４／４周皮細胞において下方調節された（それぞれ、－２３．７％および－２７．７％）（図１１ｅ）。同様に、ＡＰＯＥ４／４のｉＰＳＣ由来周皮細胞において、本発明者らは、ＮＦＡＴをリン酸化してその細胞質での滞留を促進するキナーゼであるＤＹＲＫ４が、著しく下方調節されたことを観察した（－３８．９％）（図１１ｆ）。本発明者らは、ＲＮＡ配列決定により、ＤＹＲＫ１～３において著しい変化を観察しなかった（図１１ｆ）。まとめると、これらの結果は、ＮＦＡＴにより媒介される転写を能動的に促進し得る環境を生じるＣａＮ／ＮＦＡＴシグナル伝達の上昇と一致して、Ｅ４／４周皮細胞が細胞内分子の双方向的変化を示すことを示す。このことを試験するために、本発明者らは、周皮細胞においてＮＦＡＴ応答性であると報告される遺伝子が、Ｅ４周皮細胞において上方調節されるか否かを、ｑＲＴ－ＰＣＲにより検討した。一貫して、ＡＣＴＧ２およびＶＣＡＭ１はいずれも、Ｅ４のホモおよびヘテロ接合性の周皮細胞の両方にわたり著しく上方調節された（図１１ｇ）。
ＮＦＡＴがＡＰＯＥ４周皮細胞においてin vivoで上方調節されるか否かを検討するために、本発明者らは、初めに、マウスＡＰＯＥのコード領域がヒトＡＰＯＥ３またはＡＰＯＥ４のコード領域で遺伝的に置き換えられたマウスにおけるＮｆａｔｃ１の発現を試験した。免疫組織化学を用いてＮｇ２陽性周皮細胞におけるＡＰＯＥ発現を比較することにより、本発明者らは、ＡＰＯＥ４ノックインマウス（ＡＰＯＥ４ＫＩ）が、脳血管Ｎｇ２陽性周皮細胞において、ＡＰＯＥ３ノックイン（ＡＰＯＥ３ＫＩ）マウスと比較して、約８６％高いＮｆａｔｃ１タンパク質の染色を示すことを見出した（図４ｌ）。同様に、ヒト海馬のsnRNA-seqトランスクリプトーム分析により、ＮＦＡＴｃ１およびＮＦＡＴｃ２はいずれも、ＡＰＯＥ４キャリア（ｎ＝１６個体）からの周皮細胞において、非キャリア（ｎ＝４６個体）と比較して著しく高く（図１１ｈおよびｉ）、一方で、ＮＦＡＴｃ１またはＮＦＡＴｃ２のいずれも、内皮細胞においては差次的に発現されないこと（図１１ｊおよびｋ）が明らかとなった。前頭前皮質において、本発明者らはまた、snRNAseqを介して、ＡＰＯＥ４キャリアからのヒト皮質周皮細胞／内皮細胞におけるＮＦＡＴｃ２のｍＲＮＡの著しい上方調節を観察した（図１１ｌ）。まとめると、in vitroの複数の株およびin vivoでのエビデンスは、ＮＦＡＴ／ＣａＮシグナル伝達経路のいくつかの構成成分がＥ４周皮細胞において改変され、これが、ＡＰＯＥの発現を促進して、ＡＰＯＥ４により媒介されるアミロイド蓄積をもたらし得ることを示唆する。
例５：カルシニューリンの阻害（ＣａＮ）はＡＰＯＥ発現を低下させＡβ沈着を回復させる
Ｅ４／４周皮細胞におけるカルシニューリン経路の調節不全が、上方調節されたＡＰＯＥの発現に寄与するか否かを決定するために、本発明者らは、よく確立されたＣａＮ阻害剤であるシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）（２μＭ）、ＦＫ５０６（５μＭ）、およびＩＮＣＡ６（５μＭ）を用いて、カルシニューリンシグナル伝達を阻害することを試みた（図１２ａ）。独立して３つの阻害剤の各々による２週間のＣａＮ阻害の後、ＡＰＯＥ発現は、ＡＰＯＥ４／４周皮細胞において著しく低下したことが、ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定された（図５ａ）。カルシニューリン阻害はまた、ＡＰＯＥ３／３周皮細胞におけるＡＰＯＥ遺伝子発現を低下させる傾向があったが、ＡＰＯＥの発現がより低いことを考慮すると、その傾向は、より控えめであった（図５ａ）。ＣａＮの阻害は、ＰＧＫ１、ＨＰＲＴおよびＧＡＰＤＨなどの構成的に発現されるタンパク質を著しくは減少させなかった。このことは、ＡＰＯＥ下方調節は、細胞死または全体的な転写抑制の結果ではないことを示唆している（図１２ｂ）。ＣａＮの阻害がまた、Ｅ３／４ヘテロ接合性周皮細胞においてＡＰＯＥの発現をも低下させるか否かを検討するために、３つのＥ３／４個体および２つのさらなるＥ３／３対照個体に由来する周皮細胞を処置した。ホモ接合性Ｅ４／４周皮細胞と同様に、Ｅ３／４ヘテロ接合性周皮細胞は、３つのＣａＮ阻害剤の各々で処置された場合に、ＡＰＯＥの発現の著しい低下を示した（図５ｂ）。ＡＰＯＥ遺伝子発現に加えて、ＣａＮの阻害はまた、免疫蛍光により測定される細胞内ＡＰＯＥタンパク質を、Ｅ４／４ホモ接合性およびＥ３／４ヘテロ接合性の株の両方において減少させた（図１２ｃおよび１２ｄ）。同様に、ＣｓＡはまた、ＥＬＩＳＡにより測定された場合、培養された周皮細胞の培地中に存在する可溶性ＡＰＯＥタンパク質の濃度を著しく低下させた（図５ｃ）。まとめると、これらの結果は、Ｅ４周皮細胞におけるＣａＮの化学的阻害が、ＡＰＯＥ遺伝子発現およびＡＰＯＥタンパク質の両方の減少をもたらすことを確立する。
Ｅ４周皮細胞においてＣａＮが阻害される際に起こるさらなる変化の偏りない評価を得るために、本発明者らは、ＤＭＳＯにより処置されたＥ３／３周皮細胞およびＤＭＳＯまたは２μＭのＣｓＡのいずれかにより処置されたアイソジェニックＥ４／４周皮細胞の網羅的な転写プロファイリングを行った。ＣｓＡ処置された周皮細胞において、ＮＦＡＴｃ１の発現は、Ｅ３／３ ＤＭＳＯ処置された周皮細胞において観察されるものに匹敵するレベルまで、著しく下方調節された（図５ｄ）。予測されるとおり、ＣｓＡによるＮＦＡＴｃ１の下方調節は、Ｅ４周皮細胞におけるＡＰＯＥの発現の低下と相関し、これは、図４ｂにおいて提示されるｑＲＴ－ＰＣＲデータと一致した（図５ｅ）。ＤＭＳＯで処置されたＥ４／４周皮細胞は、ＤＭＳＯで処置されたＥ３／３周皮細胞と比較して、４，０００個を超える差次的に発現される遺伝子を示した（図５ｆ）。対照的に、ＣｓＡで処置されたＥ４／４周皮細胞は、Ｅ３／３周皮細胞により近い転写プロフィールを示した（図５ｆ）。ＣｓＡは、Ｅ３／３ ＤＭＳＯ処置された周皮細胞と類似の発現レベルを示す８６０個の遺伝子の上方調節をもたらした（図５ｆ）。遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析は、これらの遺伝子がＲＮＡプロセッシング（ＧＯ：０００６３９６、ＧＯ：００１６０７１およびＧＯ：００３４６６０）、およびペプチド合成に関連するプロセス（ＧＯ：００４３６０４およびＧＯ：００４３０４３）に関与することを示唆する（図１１ｅ）。２，７８３個の遺伝子は、Ｅ３／３周皮細胞とＥ４／４周皮細胞との間の中間の発現レベルに達するＣｓＡに応答して、中程度の上方調節を示した。ＧＯ分析は、これらの遺伝子を、細胞内タンパク質の輸送および局在（ＧＯ：０００６８８６、ＧＯ：００１５０３１およびＧＯ：００３４６１３）、細胞の代謝プロセスおよび巨大分子の局在（ＧＯ：００４４２４８およびＧＯ：００７０７２７）に関与するものとして分類した（図１２ｅ）。興味深いことに、Ｅ４／４周皮細胞においてＣｓＡにより下方調節された遺伝子は、Ｅ３／３周皮細胞に対して、より中程度の類似性を示した（図５ｆ）。ＣｓＡ処置は、１８８１個の遺伝子の、Ｅ３周皮細胞とＥ４周皮細胞との間の発現レベルまでの下方調節をもたらした（図５ｆ）。これらの遺伝子のＧＯ分析は、ＧＴＰａｓｅの活性および神経管閉鎖への関与を示唆する（ＧＯ：００４３０８７、ＧＯ：００５１０５６、ＧＯ：００４３５４７、ＧＯ：０００７２６４、ＧＯ：０００１８４３）。全体的に、ＣｓＡによるＥ４周皮細胞の処置は、スピアマンの順位相関分析により、Ｅ３／３周皮細胞に対する転写の増大の類似性をもたらした。このことは、ＤＭＳＯ処置されたＥ４／４周皮細胞は、Ｅ３周皮細胞との０．８８９の網羅的な転写プロフィールの類似性を示し、一方で、ＣｓＡ処置は、その類似性を０．９３７まで増大させることを示している。このことは、Ｅ４周皮細胞におけるＣａＮの薬理学的阻害は、転写に広く変化をもたらし、Ｅ３周皮細胞との類似性の増大をもたらすことを示唆する。Ｔ細胞において、ＣａＮ／ＮＦＡＴは、炎症性応答ならびにインターロイキンおよび腫瘍壊死因子を含む炎症性応答遺伝子の上方調節に関連する。本発明者らは、Ｅ４周皮細胞においてＣａＮ／ＮＦＡＴシグナル伝達の上昇を観察したが、一方で、本発明者らは、古典的な炎症性遺伝子の著しい上方調節を観察しなかった。このことは、ＣａＮ／ＮＦＡＴ応答が、細胞型特異的である可能性が高いことを示している。
ＡＰＯＥは、in vivoでの、および本発明者らのｉＢＢＢにおける、高レベルのアミロイド沈着のために必要とされる（図４ｈおよびｉ；図１０ｇ）。したがって、ＡＰＯＥタンパク質の減少はまた、アミロイド沈着を減少させ得る。この仮説を試験するために、本発明者らは、ｉＢＢＢの２つのアイソジェニックペアを、ＣｓＡまたはＦＫ５０６で２週間にわたり処置し、その後、２０ｎＭのＡβ１－４０－／４２－ＦＩＴＣを９６時間にわたり添加した。この仮説と一致して、ＣｓＡおよびＦＫ５０６の処置はいずれも、２つの独立したＡＰＯＥ４／４ ｉＢＢＢにおいて、それらのアイソジェニックなＡＰＯＥ３／３対照と比較して、アミロイド蓄積の著しい減少をもたらした（図５ｇおよびｈ）。本発明者らは、ＣａＮ阻害がアミロイドの蓄積を減少させる能力はまた、ＡＰＯＥ３／４ヘテロ接合性ｉＢＢＢにも起こることを見出した（図５ｉ）。
先に、本発明者らは、Ｅ４／４周皮細胞により条件付けされた培地は、Ｅ３／３ ｉＢＢＢのアミロイド蓄積を増大させるために十分であることを観察した（図３ｅ）。Ｅ４／４周皮細胞条件培地に起因して増大したアミロイド沈着は、増大した可溶性ＡＰＯＥに起因する可能性が高い。したがって、本発明者らは、ＣａＮ阻害剤によるＥ４／４周皮細胞の処置は、可溶性ＡＰＯＥを減少させ、それによりｉＢＢＢアミロイド蓄積の減少をもたらすであろうという仮説を立てた。実際に、本発明者らは、ＤＭＳＯで処置されたＥ４／４周皮細胞からの条件培地は、Ｅ３／３ ｉＢＢＢにおいてアミロイド沈着の著しい減少を引き起こし、一方で、ＣｓＡ、ＦＫ５０６またはＩＮＣＡ６で処置されたＥ４／４周皮細胞から採取した培地は、アミロイド蓄積の著しい減少をもたらすことを観察した（図５ｊ）。この観察をさらに拡張するために、本発明者らは、ＡｐｏＥ４ＫＩマウスから皮質切片培養物を調製し、その後、ＤＭＳＯ、ＣｓＡまたはＦＫ５０６のいずれかで１週間にわたり処置した。本発明者らは、次いで、２０ｎＭのＡβ１－４０－／４２－ＦＩＴＣを培養物にさらなる４８時間にわたり添加し、その後、本発明者らは、各々の条件についてＡβ－ＦＩＴＣの蓄積を定量した。本発明者らは、ＤＭＳＯ対照と比較して、ＣｓＡおよびＦＫ５０６はいずれも、ＡＰＯＥ４ＫＩ皮質切片培養物におけるＡＰＯＥタンパク質の量およびＡβ ＦＩＴＣの蓄積を減少させることを見出した（図１２ｆ～ｈ）。
ＡＰＯＥ４／４細胞（アイソジェニック）とＡＰＯＥ３／３（親）との間の遺伝子型の区別を、ｉＢＢＢ膜の透過性に関して評価した。結果を、図１３～１６において示す。図１３Ａは、蛍光分子を有するｉＢＢＢが頂端膜側に位置し、これが次いで、ｉＢＢＢを通しての頂端膜側から基底膜側への移行を可能にすることを示す模式図を表す（図１３Ｂ）。結果を図１３Ｃにおいて示し、これは、アイソジェニックなＡＰＯＥ４／４細胞により調製されたｉＢＢＢは、親ＡＰＯＥ３／３細胞を用いて作製されたｉＢＢＢよりも高い蛍光分子の透過性および蓄積を可能にすることを示している。
アイソジェニックなＡＰＯＥ４／４細胞により調製されたｉＢＢＢは、親ＡＰＯＥ３／３細胞を用いて作製されたｉＢＢＢ（図１４Ａにおいて頂端膜側に位置する蛍光分子を有するｉＢＢＢとして模式的に示される）よりも高い複数の化合物の透過性および蓄積を可能にすることを示す研究もまた行った。データを図１４Ｂにおいて要約の形態において示す。図１５Ａ～１５Ｆは、各々の試験された化合物（カダベリン（１５Ａ）、４ｋＤａデキストラン（１５Ｂ）、１０ｋＤａデキストラン（１５Ｃ）、ＢＳＡ（１５Ｄ）、７０ｋＤａデキストラン（１５Ｅ）、およびトランスフェリン（１５Ｅ））についての完全なデータセットを示す一連のグラフである。図１６は、アイソジェニックなＡＰＯＥ４／４細胞により調製されたｉＢＢＢは、ｉＢＢＢの基底膜側において、親ＡＰＯＥ３／３細胞を用いて作製されたｉＢＢＢよりも高いＡβ４２－ＦＩＴＣの透過性および蓄積を可能にすることを示すグラフである。
まとめると、本発明者らの結果は、ＡＰＯＥ４周皮細胞におけるＣａＮ／ＮＦＡＴシグナル伝達の調節不全が、ヒト周皮細胞におけるＡＰＯＥ発現の上方調節を通してアミロイド蓄積の増大をもたらすこと、および、この表現型が、ＣａＮシグナル伝達の薬理学的阻害を通して回復されることを示す。この知見をさらに検討するために、本発明者らは、初めに、ＡＰＯＥ４ＫＩマウスから脳微小血管系を単離し、その後、周皮細胞選択培地において３週間にわたり培養してほぼ同種の周皮細胞培養物をもたらすことにより、周皮細胞について選択した。本発明者らは、次いで、これらのＡＰＯＥ４ＫＩ初代脳周皮細胞培養物を２週間にわたりＤＭＳＯ、ＣｓＡまたはＦＫ５０６で処置した。ｉＰＳＣ由来ヒト周皮細胞と同様に、ＡＰＯＥ４ＫＩマウスから単離された初代マウス脳周皮細胞は、ＣｓＡおよびＦＫ５０６に応答して、ＡＰＯＥ ｍＲＮＡ発現を下方調節した（図１２ｉ）。
次に、この生物学的見識が、in vivoで疾患の病態を減少させるために適用し得るか否かを検討するために、本発明者らは、６か月齢の５ＸＦＡＤ ＡＤマウスモデルと交差させたＡＰＯＥ４ ＫＩマウス（ＡＰＯ４ＫＩ×５ＸＦＡＤ）を使用し、それらをＣｓＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）で３週間にわたり腹腔内注射を介して処置した。ＣｓＡ処置は、海馬においてＡＰＯＥ濃度の著しい低下をもたらすことがＥＬＩＳＡにより測定された（図５ｋ）。免疫組織化学により、ＡＰＯＥタンパク質発現はまた、ＣｓＡで処置されたＡＰＯＥ４ＫＩ×５ＸＦＡＤマウスの皮質および海馬周皮細胞およびその周囲においても、対照マウスと比較して低下したことが明らかとなった（図５ｌ；図１２ｊ）。６ｅ１０およびＡＰＯＥについての共染色は、ＡＰＯＥの減少は、より低いレベルの６ｅ１０陽性血管アミロイドと同時に起こることを示した（図５ｍ）。したがって、本発明者らは、異なるＡβオリゴマーのペプチド配列を認識する２つの別々の抗体（６ｅ１０および１２Ｆ４）により、血管アミロイドを定量した。本発明者らは、ＣｓＡ処置されたマウスが、海馬において、ビヒクル処置されたマウスと比較して、７０．６％＋／－１８．４（６ｅ１０）および４７．８％＋／－４．１（１２Ｆ４）の、血管アミロイドの著しい減少を有したことを見出した（図５ｎおよび図１２ｋ）。これらの結果は、ＣａＮ／ＮＦＡＴ阻害は、in vivoで周皮細胞のＡＰＯＥレベルおよび血管アミロイドを減少させ得ることを示す。
シクロスポリンＡは、in vivoでＡＰＯＥおよびアミロイドタンパク質の産生／蓄積を減少させることが示された（図１７Ａ～Ｃ、図１８Ａ～Ｂおよび図１９Ａ～１９Ｃ）。ＡＰＯＥ４Ｋ１×５ｘＦＡＤマウスに、ビヒクル対照または１０ｍｇ／ｋｇのシクロスポリンＡを、腹腔内で３週間にわたり注射し、ＡＰＯＥタンパク質および血管アミロイドを定量した（図１７Ａにおいて模式的に表される）。データを、図１７Ｂ～Ｃにおいて示す。ＥＬＩＳＡアッセイにより作製された結果を示し、シクロスポリンＡは、ビヒクルと比較して、より少ないＡＰＯＥタンパク質の産生をもたらすことを示すグラフを、図１７Ｂにおいて示す。図１７Ｃは、海馬の免疫組織化学の結果を示す画像およびグラフであって、シクロスポリンＡが、皮質周皮細胞およびその周囲において、ビヒクルと比較してより少ないＡＰＯＥタンパク質の蓄積をもたらすことを示している。
in vivoで、シクロスポリンＡは、海馬の脈管構造およびその周辺において、ＡＰＯＥおよび血管アミロイドを減少させる。図１８Ａは、海馬の免疫組織化学により得られた結果を示す画像であり、シクロスポリンＡが、ビヒクルと比較してより少ないＡＰＯＥ／アミロイドタンパク質の産生をもたらすことを示している。図１８Ｂは、海馬の免疫組織化学の結果を示す画像およびグラフであって、シクロスポリンＡが、ビヒクルと比較してより少ない血管アミロイドタンパク質の蓄積をもたらすことを示している。図１９Ａ～１９Ｄにおいて、in vivoで、シクロスポリンＡおよびＦＫ５０６が、in vivoで海馬の脈管構造およびその周辺において、ＡＰＯＥおよび血管アミロイドを減少させることが示される。図１９Ｃにおいて、画像は、海馬の免疫組織化学により得られた結果を示し、ＦＫ５０６（１０ｍｇ／ｍｌ）が、ビヒクル対照と比較してより少ないアミロイドタンパク質の産生をもたらすことを示している。
表１．研究において用いられた抗体。
Figure 2022523051000002
表２．研究において用いられた多能性細胞株。
Figure 2022523051000003
他の態様
本発明は、以下のパラグラフの態様のうちの１つ以上において、さらに表される。
パラグラフ１． 三次元（３Ｄ）マトリックスを含むin vitroの血液脳関門（ｉＢＢＢ）であって、
３Ｄマトリックス中にカプセル化されたヒト多能性細胞由来陽性内皮細胞の大きな相互接続されたネットワークで構成されるヒト脳内皮細胞（ＢＥＣ）血管、
頂端膜側においてＢＥＣ血管に近接するヒト多能性細胞由来周皮細胞、および
３Ｄマトリックス全体に分散したヒト多能性細胞由来星状膠細胞、ここで、複数の星状膠細胞が、ＢＥＣ血管に近接し、血管周囲腔中にＧＦＡＰ陽性突起を有する、
を含む、前記in vitroの血液脳関門（ｉＢＢＢ）。
パラグラフ２． 三次元（３Ｄ）マトリックスを含むin vitroの血液脳関門（ｉＢＢＢ）であって、
３Ｄマトリックス中にカプセル化された内皮細胞の大きな相互接続されたネットワークから構成されるヒト脳内皮細胞（ＢＥＣ）血管、
頂端膜側においてＢＥＣ血管に近接する周皮細胞、ここで、周皮細胞は、Ｅ４／Ｅ４遺伝子型を有する、および、
ＢＥＣ血管に近接する星状膠細胞、ここで、複数の星状膠細胞は、血管周囲腔中に正の突起を有する、
を含む、前記in vitroの血液脳関門（ｉＢＢＢ）。
パラグラフ３． 星状膠細胞は、ＡＱＰ４を発現する、上のパラグラフのうちのいずれかのｉＢＢＢ。
パラグラフ４． ３Ｄマトリックスは、ＬＡＭＡ４を含む、上のパラグラフのうちのいずれかのｉＢＢＢ。
パラグラフ５． ＢＥＣは、ＪＡＭＡ、ＰｇＰ、ＬＲＰ１およびＲＡＧＥのうちの少なくともいずれか１つを発現する、上のパラグラフのうちのいずれかのｉＢＢＢ。
パラグラフ６． ＰｇＰおよびＡＢＣＧ２が、頂端膜側において発現される、上のパラグラフのうちのいずれかのｉＢＢＢ。
パラグラフ７． 頂端膜側において発現されるＰｇＰおよびＡＢＣＧ２のレベルが、単独で培養されたかまたは星状膠細胞と共培養されたＢＥＣにおいて発現されるＰｇＰおよびＡＢＣＧ２のレベルよりも２～３倍大きい、上のパラグラフのうちのいずれかのｉＢＢＢ。
パラグラフ８． ｉＢＢＢが、５，５００Ｏｈｍ×ｃｍ２を超えるＴＥＥＲを有し、単独で培養されたかまたは星状膠細胞と共培養されたＢＥＣと比較して排出ポンプの分子透過性および極性化の低下を示す、上のパラグラフのうちのいずれかのｉＢＢＢ。
パラグラフ９． ｉＢＢＢが、レチノイン酸と共に培養されない、上のパラグラフのうちのいずれかのｉＢＢＢ。
パラグラフ１０． ヒト多能性細胞が、ｉＰＳＣ由来ＣＤ１４４細胞である、上のパラグラフのうちのいずれかのｉＢＢＢ。
パラグラフ１１． ｉＢＢＢが、５部の内皮細胞：１部の星状膠細胞：１部の周皮細胞を用いて作製される、上のパラグラフのうちのいずれかのｉＢＢＢ。
パラグラフ１２． ｉＢＢＢが、１ｍｌあたり約１，０００，０００個の内皮細胞、１ｍｌあたり約２００，０００個の星状膠細胞、および１ｍｌあたり約２００，０００個の周皮細胞を用いて作製される、上のパラグラフのうちのいずれかのｉＢＢＢ。
パラグラフ１３． ｉＢＢＢが、長さ５～５０ミクロンである、上のパラグラフのうちのいずれかのｉＢＢＢ。
パラグラフ１４． ｉＢＢＢが、長さ５～３０ミクロンである、上のパラグラフのうちのいずれかのｉＢＢＢ。
パラグラフ１５． ｉＢＢＢが、長さ１０～２０ミクロンである、上のパラグラフのうちのいずれかのｉＢＢＢ。
パラグラフ１６． ＢＥＣ血管が、毛細血管サイズである、上のパラグラフのうちのいずれかのｉＢＢＢ。
パラグラフ１７． 血液脳関門に対する化合物の項かを同定するための方法であって、
上のパラグラフのうちのいずれかのｉＢＢＢを提供すること、
ｉＢＢＢのＢＥＣ血管を化合物と接触させること、および
ｉＢＢＢに対する化合物の効果を、化合物と接触させられていないｉＢＢＢと比較して検出すること
を含む、前記方法。
パラグラフ１８． ｉＢＢＢに対する化合物の効果が、細胞外マトリックス因子の発現の変化として測定される、上のパラグラフのうちのいずれかの方法。
パラグラフ１９． ｉＢＢＢに対する化合物の効果が、遺伝子の発現の変化として測定される、上のパラグラフのうちのいずれかの方法。
パラグラフ２０． ｉＢＢＢに対する化合物の効果が、可溶性因子の発現の変化として測定される、上のパラグラフのうちのいずれかの方法。
パラグラフ２１． 化合物が、ｉＢＢＢの１つ以上の機能的特性を変更する、上のパラグラフのうちのいずれかの方法。
パラグラフ２２． ｉＢＢＢの機能的特性が、細胞遊走、排出ポンプの分子透過性または極性化である、上のパラグラフのうちのいずれかの方法。
パラグラフ２３． ｉＢＢＢに対する化合物の効果が、アミロイド沈着の変化として測定される、上のパラグラフのうちのいずれかの方法。
パラグラフ２４． アミロイド－βペプチド（Ａβ）の産生および／または蓄積の阻害剤を同定するための方法であって：
Ａβ産生細胞を、ＡＰＯＥ４陽性周皮細胞因子および少なくとも１つの候補阻害剤と接触させること、ならびに、
候補阻害剤の存在下および不在下におけるＡβの量を検出すること、
を含み、ここで、候補阻害剤の不在下における細胞と関連するＡβの量と比較した、候補阻害剤の存在下における細胞と関連するＡβの量の低下は、候補阻害剤がＡβの阻害剤であることを示す、
前記方法。
パラグラフ２５． ＡＰＯＥ４陽性周皮細胞因子が、ＡＰＯＥ４周皮細胞条件培地中の可溶性因子である、上のパラグラフのうちのいずれかの方法。
パラグラフ２６． 可溶性因子が、ＡＰＯＥタンパク質である、上のパラグラフのうちのいずれかの方法。
パラグラフ２７． ＡＰＯＥ４陽性周皮細胞因子が、周皮細胞により産生されるＡＰＯＥタンパク質である、上のパラグラフのうちのいずれかの方法。
パラグラフ２８． Ａβ産生細胞が、ＡＰＯＥ３を発現した、上のパラグラフのうちのいずれかの方法。
パラグラフ２９． Ａβ産生細胞が、ＡＰＯＥ３／３遺伝子型またはＡＰＯＥ３／４遺伝子型を有する、上のパラグラフのうちのいずれかの方法。
パラグラフ３０． Ａβ産生細胞が、ＡＰＯＥ４陽性周皮細胞である、上のパラグラフのうちのいずれかの方法。
パラグラフ３１． 周皮細胞が、ＡＰＯＥ４／４遺伝子型を有する、上のパラグラフのうちのいずれかの方法。
パラグラフ３２． 周皮細胞が、ＡＰＯＥ３／４遺伝子型を有する、上のパラグラフのうちのいずれかの方法。
パラグラフ３３． ＡＰＯＥ４陽性周皮細胞因子が、Ａβ産生細胞と共培養されたＡＰＯＥ４周皮細胞により産生された可溶性因子である、上のパラグラフのうちのいずれかの方法。
パラグラフ３４． Ａβ産生細胞が、星状膠細胞または内皮細胞である、上のパラグラフのうちのいずれかの方法。
パラグラフ３５． 上のパラグラフのうちのいずれかのｉＢＢＢを提供すること、ｉＢＢＢのＢＥＣ血管をＡβの阻害剤と接触させること、およびｉＢＢＢによるＡβの産生に対するＡβの阻害剤の効果を、Ａβの阻害剤と接触させられていないｉＢＢＢと比較して検出すること、をさらに含む、上のパラグラフのうちのいずれかの方法。
パラグラフ３６． 対象においてアミロイド合成を阻害するための方法であって、
対象をＡＰＯＥ４陽性として同定することにより、対象がアミロイド蓄積を有するか、またはアミロイド蓄積を発症するリスクがあるか否かを決定すること、
対象がＡＰＯＥ４陽性である場合、対象に、カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路の阻害剤を、対象においてアミロイド合成を阻害するための有効量において投与すること、
を含み、ここで、カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路の阻害剤は、シクロスポリンではない、
前記方法。
パラグラフ３７． 対象においてアミロイド合成を阻害するための方法であって、ＣＡＡを有するか、またはＣＡＡを有するリスクがある対象に、カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路の阻害剤を、対象においてアミロイド合成を阻害するための有効量において投与することを含み、ここで、カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路の阻害剤は、シクロスポリンではない、前記方法。
パラグラフ３８． 対象においてアミロイド合成を阻害するための方法であって、Ｃ／ＥＢＰ経路の阻害剤を、対象においてアミロイド合成を阻害するための有効量において、対象に投与することを含む、前記方法。
パラグラフ３９． 対象が、アルツハイマー病を有する、上のパラグラフのうちのいずれかの方法。
パラグラフ４０． 対象が、ＣＡＡを有する、上のパラグラフのうちのいずれかの方法。
パラグラフ４１． 対象が、アルツハイマー病を診断されていない、上のパラグラフのうちのいずれかの方法。
パラグラフ４２． 対象が、アルツハイマー病を有しない、上のパラグラフのうちのいずれかの方法。
パラグラフ４３． カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路の阻害剤は、小分子阻害剤である、上のパラグラフのうちのいずれかの方法。
パラグラフ４４． カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路の阻害剤は、ＦＫ５０６である、上のパラグラフのうちのいずれかの方法。
本明細書において開示される特徴の全ては、任意の組み合わせにおいて組み合わせてもよい。本明細書において開示される各々の特徴は、同じ、同等、または類似の目的に働く代替的な特徴により置き換えてもよい。したがって、別段に明示的に記述されない限り、開示される各々の特徴は、一般的な一連の同等または類似の特徴の単なる例である。上の記載から、当業者は、本開示の本質的な特徴を容易に確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、本開示を、多様な用途および条件に適応させるために、その多様な変更および修飾を行うことができる。したがって、他の態様もまた、請求の範囲の範囲内である。
均等物および範囲
当業者は、本明細書において記載される本開示の特定の態様に対する多くの均等物を認識するか、または慣用的な実験のみを用いてこれを確認することができるであろう。本開示の範囲は、上の記載に限定されることを意図されず、むしろ、添付される請求の範囲において記載されるとおりである。請求の範囲において、「a」、「an」、および「the」などの冠詞は、逆であることが示されるか、文脈から別段に明らかでない限り、１または１より多くを意味してよい。群の１つ以上のメンバーの間に「or」を含む請求の範囲または記載は、逆であることが示されるか、文脈から別段に明らかでない限り、群のメンバーのうちの１つ、１つより多く、または全てが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、これにおいて使用されるか、またはこれに対して別段に関連がある場合に、満たされたとみなされる。本開示は、群の正確に１つのメンバーが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、これにおいて使用されるか、またはこれに対して別段に関連がある態様を含む。本開示は、群のメンバーのうちの１つより多くまたは全てが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、これにおいて使用されるか、またはこれに対して別段に関連がある態様を含む。
さらに、本開示は、列記される請求項の１つ以上からの１つ以上の限定、要素、節および説明的用語が、別の請求項に導入される、全てのバリエーション、組み合わせおよび順列を包含する。例えば、別の請求項に従属する任意の請求項は、同じ基礎請求項に従属する任意の他の請求項において見出される１つ以上の限定を含むように修飾することができる。要素が、例えばマーカッシュ群形式において、リストとして提示される場合には、当該要素の各々のサブグループもまた開示され、任意の要素を、群から取り除くことができる。一般に、本開示または本開示の側面が、特定の要素および／または特徴を含むものとして言及される場合、本開示または本開示の側面のある態様は、かかる要素および／または特徴からなるか、またはこれから本質的になることが、理解されるべきである。単純化を目的として、これらの態様は、本明細書において文言としては具体的には記載されていない。また、用語「含むこと（comprising）」および「含むこと（containing）」とは、オープンであることを意図され、さらなる要素またはステップの包含を可能にすることが注目される。範囲が示される場合、エンドポイントが含まれる。さらに、別段に示されるか、文脈および当業者の理解から別段に明らかでない限り、範囲として表される値は、本開示の異なる態様において、記述された範囲内の特定の値または部分範囲を、文脈が明らかに別段に示さない限り、当該範囲の下限の単位の１０分の１まで、想定することができる。
本願は、多様な発行された特許、公開された特許出願、学術文献、および他の刊行物を参照し、これらの全ては、本明細書において参考として援用される。援用された参考文献と本明細書との間に矛盾が存在する場合、本明細書が支配すべきである。加えて、本開示の任意の特定の態様であって先行技術に該当するものは、請求項のうちの任意の１つ以上から明示的に除外してもよい。かかる態様は、当業者に公知であるものとみなされるので、それらは、除外が本明細書において明示的に記載されない場合であっても、除外することができる。本開示の任意の特定の態様は、任意の請求項から、任意の理由のために、先行技術の存在に関係するか否かにかかわらず、除外することができる。
当業者は、本明細書において記載される特定の態様に対する多くの均等物を認識するか、または慣用的な実験のみを用いてこれを確認することができるであろう。本明細書において記載される本態様の範囲は、上の説明に限定されることを意図されず、むしろ、添付される請求の範囲において記載されるとおりである。当業者は、以下の請求の範囲において定義されるとおりの本開示の精神または範囲から逸脱することなく、この記載に対する多様な変更または修飾を行ってもよいことを理解するであろう。

Claims (34)

  1. 三次元（３Ｄ）マトリックスを含むin vitroの血液脳関門（ｉＢＢＢ）であって、
    ３Ｄマトリックス中にカプセル化されたヒト多能性細胞由来陽性内皮細胞の大きな相互接続されたネットワークにより構成される、ヒト脳内皮細胞（ＢＥＣ）血管、
    頂端膜側においてＢＥＣ血管に近接するヒト多能性細胞由来周皮細胞、および
    ３Ｄマトリックス全体に分散したヒト多能性細胞由来星状膠細胞、ここで、複数の星状膠細胞は、ＢＥＣ血管に近接し、血管周囲腔中にＧＦＡＰ陽性突起を有する
    を含む、前記in vitroの血液脳関門（ｉＢＢＢ）。
  2. 星状膠細胞が、ＡＱＰ４を発現する、請求項１に記載のｉＢＢＢ。
  3. ３Ｄマトリックスが、ＬＡＭＡ４を含む、請求項１または２に記載のｉＢＢＢ。
  4. ＢＥＣが、ＪＡＭＡ、ＰｇＰ、ＬＲＰ１およびＲＡＧＥのうちの少なくともいずれか１つを発現する、請求項１～３のいずれか一項に記載のｉＢＢＢ。
  5. ＰｇＰおよびＡＢＣＧ２が、頂端膜側において発現される、請求項１～４のいずれか一項に記載のｉＢＢＢ。
  6. 頂端膜側において発現されるＰｇＰおよびＡＢＣＧ２のレベルが、単独で培養されたかまたは星状膠細胞と共培養されたＢＥＣにおいて発現されるＰｇＰおよびＡＢＣＧ２のレベルよりも２～３倍大きい、請求項５に記載のｉＢＢＢ。
  7. ｉＢＢＢが、５，５００Ｏｈｍ×ｃｍ２を超えるＴＥＥＲを有し、単独で培養されたかまたは星状膠細胞と共培養されたＢＥＣと比較して排出ポンプの分子透過性および極性化の低下を示す、請求項１～６のいずれか一項に記載のｉＢＢＢ。
  8. ｉＢＢＢが、レチノイン酸と共に培養されない、請求項１～７のいずれか一項に記載のｉＢＢＢ。
  9. ヒト多能性細胞が、ｉＰＳＣ由来ＣＤ１４４細胞である、請求項１～８のいずれか一項に記載のｉＢＢＢ。
  10. ｉＢＢＢが、５部の内皮細胞：１部の星状膠細胞：１部の周皮細胞を用いて作製される、請求項１～９のいずれか一項に記載のｉＢＢＢ。
  11. ｉＢＢＢが、１ｍｌあたり約１，０００，０００個の内皮細胞、１ｍｌあたり約２００，０００個の星状膠細胞、および１ｍｌあたり約２００，０００個の周皮細胞を用いて作製される、請求項１～９のいずれか一項に記載のｉＢＢＢ。
  12. ｉＢＢＢが、長さ５～５０ミクロンである、請求項１～１１のいずれか一項に記載のｉＢＢＢ。
  13. ｉＢＢＢが、長さ５～３０ミクロンである、請求項１～１１のいずれか一項に記載のｉＢＢＢ。
  14. ｉＢＢＢが、長さ１０～２０ミクロンである、請求項１～１１のいずれか一項に記載のｉＢＢＢ。
  15. ＢＥＣ血管が、毛細血管サイズである、請求項１～１１のいずれか一項に記載のｉＢＢＢ。
  16. アミロイド－βペプチド（Ａβ）の産生および／または蓄積の阻害剤を同定するための方法であって：
    Ａβ産生細胞を、ＡＰＯＥ４陽性周皮細胞因子および少なくとも１つの候補阻害剤と接触させること、ならびに、候補阻害剤の存在下および不在下におけるＡβの量を検出すること、ここで、候補阻害剤の不在下における細胞と関連するＡβの量と比較した、候補阻害剤の存在下における細胞と関連するＡβの量の低下は、候補阻害剤がＡβの阻害剤であることを示す、
    を含む、前記方法。
  17. ＡＰＯＥ４陽性周皮細胞因子が、ＡＰＯＥ４周皮細胞条件培地中の可溶性因子である、請求項１６に記載の方法。
  18. 可溶性因子が、ＡＰＯＥタンパク質である、請求項１７に記載の方法。
  19. ＡＰＯＥ４陽性周皮細胞因子が、周皮細胞により産生されるＡＰＯＥタンパク質である、請求項１６に記載の方法。
  20. Ａβ産生細胞が、ＡＰＯＥ３を発現した、請求項１６に記載の方法。
  21. Ａβ産生細胞が、ＡＰＯＥ３／３遺伝子型またはＡＰＯＥ３／４遺伝子型を有する、請求項２０に記載の方法。
  22. Ａβ産生細胞が、ＡＰＯＥ４陽性周皮細胞である、請求項１６に記載の方法。
  23. 周皮細胞が、ＡＰＯＥ４／４遺伝子型を有する、請求項１８または請求項２２に記載の方法。
  24. 周皮細胞が、ＡＰＯＥ３／４遺伝子型を有する、請求項１８または請求項２２に記載の方法。
  25. ＡＰＯＥ４陽性周皮細胞因子が、Ａβ産生細胞と共培養されたＡＰＯＥ４周皮細胞により産生された可溶性因子である、請求項１６に記載の方法。
  26. Ａβ産生細胞が、星状膠細胞または内皮細胞である、請求項２５に記載の方法。
  27. 請求項１～１５のいずれか一項に記載のｉＢＢＢを提供すること、ｉＢＢＢのＢＥＣ血管をＡβの阻害剤と接触させること、およびｉＢＢＢによるＡβの産生に対するＡβの阻害剤の効果を、Ａβの阻害剤と接触させられていないｉＢＢＢと比較して検出すること、をさらに含む、請求項１６～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 対象においてアミロイド合成を阻害するための方法であって、
    対象をＡＰＯＥ４陽性として同定することにより、対象がアミロイド蓄積を有するか、またはアミロイド蓄積を発症するリスクがあるか否かを決定すること、
    対象がＡＰＯＥ４陽性である場合、対象に、カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路の阻害剤を、対象においてアミロイド合成を阻害するための有効量において投与すること、ここで、カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路の阻害剤は、シクロスポリンではない、
    を含む、前記方法。
  29. 対象が、アルツハイマー病を有する、請求項２８に記載の方法。
  30. 対象が、ＣＡＡを有する、請求項２８に記載の方法。
  31. 対象が、アルツハイマー病を診断されていない、請求項２８に記載の方法。
  32. 対象が、アルツハイマー病を有しない、請求項２８に記載の方法。
  33. カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路の阻害剤が、小分子阻害剤である、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路の阻害剤が、ＦＫ５０６である、請求項２８～３３のいずれか一項に記載の方法。
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