JP7221050B2 - Ｐｌｒｇ１（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ １）抑制剤を含む癌治療用組成物 - Google Patents
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Description
本発明は、ＰＬＲＧ１（pleiotropic regulator 1）抑制剤を有効成分として含む癌の予防又は治療用薬学組成物、前記組成物を個体に投与するステップを含む癌の治療方法、ＰＬＲＧ１の発現レベルを測定する製剤を含む癌診断用組成物、並びにＰＬＲＧ１の発現レベルを測定するステップを含む癌診断のための情報を提供する方法及び癌の予防又は治療用製剤のスクリーニング方法に関する。
癌は、正常細胞に比べて細胞成長を調節することが困難であり、近接する組織に侵入することがあり、時には転移するという特性を有する。癌は基本的に組織の成長調節に関する疾病であり、正常細胞が癌細胞に形質転換されると細胞成長と分裂を調節する遺伝子の発現が変化する（非特許文献１）。
抗癌治療は、物理的に腫瘍組織を除去するか、放射線照射や抗癌剤投与により癌遺伝子（oncogene）をはじめとする抗アポトーシス分子（anti-apoptotic molecule）、テロメラーゼ（telomerase）、成長因子受容体遺伝子（growth factor receptor gene）、シグナリング分子（signaling molecule）などのように癌細胞の生存に必要な遺伝子の発現を阻害するか、アポトーシスを誘導する方式で行われる（非特許文献２）。しかし、このような治療過程において癌細胞のみならず正常細胞も影響を受け、副作用が現れるという問題がある。
Croce., The New England Journal of Medicine, 358(5): 502-511, 2008
Knudson AG, Nature reviews. Cancer 1(2): 157-162, 2001
本発明者らは、副作用を起こすことなく癌細胞特異的にアポトーシスを誘導する製剤を開発すべく鋭意努力した結果、ＰＬＲＧ１（pleiotropic regulator 1）が正常細胞よりも癌細胞において過剰発現するので、それを抑制すると癌細胞特異的にアポトーシスを誘導できることを確認し、本発明を完成するに至った。
本発明は、ＰＬＲＧ１（pleiotropic regulator 1）抑制剤を有効成分として含む、癌の予防又は治療用薬学組成物を提供することを目的とする。
また、本発明は、ＰＬＲＧ１（pleiotropic regulator 1）抑制剤を有効成分として含む薬学組成物を個体に投与するステップを含む、癌の治療方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、ＰＬＲＧ１（pleiotropic regulator 1）の発現レベルを測定する製剤を含む、癌診断用組成物を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、（ａ）分離された生物学的試料のＰＬＲＧ１（pleiotropic regulator 1）発現レベルを測定するステップと、（ｂ）前記発現レベルを正常対照群試料のＰＬＲＧ１発現レベルと比較するステップと、（ｃ）前記生物学的試料のＰＬＲＧ１発現レベルが正常対照群のＰＬＲＧ１発現レベルより高ければ癌であると判定するステップとを含む、癌診断のための情報を提供する方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、（ａ）対照群である癌が発病した実験動物の試料のＰＬＲＧ１（pleiotropic regulator 1）発現レベルを測定するステップと、（ｂ）前記実験動物の癌を治療できるものと予想される候補物質を投与するステップと、（ｃ）実験群である前記候補物質が投与された実験動物の試料のＰＬＲＧ１発現レベルを測定するステップと、（ｄ）対照群で測定されたＰＬＲＧ１発現レベルを実験群で測定されたものと比較し、対照群で測定されたものよりも実験群で測定されたもののほうが低いレベルであれば癌の発病を防止する予防用製剤又は癌を治療する治療用製剤として前記候補物質を用いることができるものと判定するステップとを含む、癌の予防又は治療用製剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、（ａ）ＰＬＲＧ１（pleiotropic regulator 1）を発現する分離された癌細胞を癌治療候補物質で処理するステップと、（ｂ）前記候補物質で処理された分離された癌細胞のＰＬＲＧ１発現レベルを測定するステップと、（ｃ）前記（ｂ）ステップで測定されたＰＬＲＧ１発現レベルが候補物質で処理されていない分離された癌細胞に比べて低いレベルであれば癌の発病を防止する予防用製剤又は癌を治療する治療用製剤として前記候補物質を用いることができるものと判定するステップとを含む、癌の予防又は治療用製剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、ＰＬＲＧ１遺伝子配列に基づいてＰＬＲＧ１の転写又は翻訳を抑制するか、ＰＬＲＧ１タンパク質の活性を抑制する抗癌候補物質を設計するステップを含む、癌の予防又は治療用製剤候補物質の探索方法を提供することを目的とする。
ＰＬＲＧ１（pleiotropic regulator 1）は癌細胞において過剰発現するので、その発現を抑制すると癌細胞特異的にアポトーシスを誘導することができる。よって、本発明のＰＬＲＧ１抑制剤は、副作用を起こさない抗癌剤として優れた効果があり、またＰＬＲＧ１発現レベルを測定することにより癌診断や抗癌剤スクリーニングなどに活用することができる。
前記目的を達成するために、本発明の一態様は、ＰＬＲＧ１（pleiotropic regulator 1）抑制剤を有効成分として含む、癌の予防又は治療用薬学組成物を提供する。
本発明における「ＰＬＲＧ１（pleiotropic regulator 1）」とは、ＣＤＣ５Ｌ（cell division cycle 5-like）複合体の１つの構成タンパク質であり、前記ＣＤＣ５Ｌ複合体はスプライソソーム（spliceosome）の一部としてｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシングに関与する。ＰＬＲＧ１は選択的スプライシング（alternative splicing）位置を決定するのに核心的な役割を果たし、発生段階に関して一部報告されているが、ＰＬＲＧ１と癌との相関関係は報告されていない。
本発明の具体的な一実施例においては、腫瘍組織及び癌細胞株においてＰＬＲＧ１の発現が正常組織及び正常細胞株に比べて多く発現することを見出すことにより（図１）、ＰＬＲＧ１が癌治療ターゲットに適合することを確認した。
本発明における「ＰＬＲＧ１抑制剤」とは、ＰＬＲＧ１の発現又は活性を減少させる製剤を一括するものであり、具体的には、ＰＬＲＧ１に直接作用したり、そのリガンドに間接的に作用するなどの方式で、ＰＬＲＧ１の発現を転写レベルで減少させるか、その活性を妨害することにより、ＰＬＲＧ１の発現レベル又はその活性を減少させるあらゆる製剤が含まれる。
前記ＰＬＲＧ１抑制剤は、ＰＬＲＧ１を標的にしてＰＬＲＧ１の発現又は活性を抑制する化合物、核酸、ペプチド、ウイルス、前記核酸を含むベクターなど、その形態に制限されることなく用いることができる。前記ＰＬＲＧ１抑制剤は、具体的にはＰＬＲＧ１ｍＲＮＡの発現を抑制するオリゴヌクレオチド、又はＰＬＲＧ１タンパク質の活性を抑制する抗体もしくはその抗原結合断片であってもよく、より具体的には、前記ＰＬＲＧ１ｍＲＮＡの発現を抑制するオリゴヌクレオチドは、ＰＬＲＧ１ｍＲＮＡに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー（aptamer）、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡであってもよく、さらに具体的には、前記ｓｉＲＮＡは、配列番号１１～配列番号２０のいずれかのオリゴヌクレオチド及びその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドの二重鎖からなるものであってもよく、前記ｓｈＲＮＡは、配列番号２１又は２２のオリゴヌクレオチド配列を有するものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
本発明における「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、特定ｍＲＮＡの配列に相補的な核酸配列を含有するＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの誘導体であり、ｍＲＮＡ内の相補的な配列に結合してｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害する作用を有する。アンチセンスオリゴヌクレオチド配列とは、前記ＰＬＲＧ１ｍＲＮＡに相補的であり、かつ前記ｍＲＮＡに結合するＤＮＡ又はＲＮＡ配列を意味する。これは、前記ＰＬＲＧ１ｍＲＮＡの翻訳、細胞質内への転位（translocation）、成熟（maturation）又はその他あらゆる全体的な生物学的機能に対する必須の活性を阻害し得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、６～１００塩基、好ましくは８～６０塩基、より好ましくは１０～４０塩基である。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常の方法によりインビトロで合成して生体内に投与することもでき、生体内でアンチセンスオリゴヌクレオチドが合成されるようにすることもできる。インビトロでアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成する例としては、ＲＮＡポリメラーゼＩを用いることが挙げられる。生体内でアンチセンスＲＮＡが合成されるようにする例としては、多重クローニング部位（ＭＣＳ）の起源が逆であるベクターを用いてアンチセンスＲＮＡが転写されるようにすることが挙げられる。前記アンチセンスＲＮＡは、配列内に翻訳終止コドンが存在するようにしてペプチド配列に翻訳されないようにすることが好ましい。本発明に用いることのできるアンチセンスオリゴヌクレオチドのデザインは、ＰＬＲＧ１の塩基配列を参照して当業界で公知の方法により容易に作製することができる。
本発明における「アプタマー（aptamer）」とは、一本鎖オリゴヌクレオチドであり、２０～６０ヌクレオチド程度のサイズであり、所定の標的分子に対する結合活性を有する核酸分子を意味する。配列によって様々な３次元構造を有し、抗原抗体反応のように特定物質との親和力が高い。アプタマーは、所定の標的分子に結合することにより、所定の標的分子の活性を阻害し得る。本発明のアプタマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾された（modified）核酸又はそれらの混合物であってもよく、また直鎖状又は環状の形態であってもよい。前記アプタマーは、ＰＬＲＧ１に結合することによりＰＬＲＧ１の活性を阻害する役割を果たすことが好ましい。このようなアプタマーは、ＰＬＲＧ１の配列から当業者が公知の方法により作製することができる。
本発明における「ｓｉＲＮＡ」及び「ｓｈＲＮＡ」とは、ＲＮＡ妨害又は遺伝子サイレンシング（silencing）を媒介する核酸分子であり、標的遺伝子の発現を抑制することができるので、効率的な遺伝子ノックダウン（knockdown）法又は遺伝子治療法として用いられる。ｓｈＲＮＡは一本鎖のオリゴヌクレオチド内で相補的な配列間の結合によりヘアピン（hairpin）構造を形成したものであり、生体内における前記ｓｈＲＮＡはダイサー（dicer）により切断されることにより２１～２５ヌクレオチドのサイズの小さなＲＮＡ断片であって二重鎖のオリゴヌクレオチドであるｓｉＲＮＡとなり、相補的な配列を有するｍＲＮＡに特異的に結合することにより発現を抑制することができる。よって、ｓｈＲＮＡとｓｉＲＮＡのいずれの手段を用いるかは当業者の選択により決定されるものであり、これらが標的とするｍＲＮＡ配列が同じ場合は同等の発現減少効果を期待することができる。本発明の目的上、ＰＬＲＧ１に特異的に作用してＰＬＲＧ１ｍＲＮＡ分子を切断し、ＲＮＡ干渉（RNAi, RNA interference）現象を誘導することにより、前記ＰＬＲＧ１を抑制することができる。ｓｉＲＮＡは化学的又は酵素学的に合成し得る。ｓｉＲＮＡの作製方法は、特に限定されるものではなく、当業界で公知の方法を用いることができる。例えば、ｓｉＲＮＡを直接化学的に合成する方法、インビトロ（in vitro）転写を用いたｓｉＲＮＡの合成法、インビトロ（in vitro）転写により合成された長い二重鎖ＲＮＡを酵素で切断する方法、ｓｈＲＮＡ発現プラスミドやウイルス性ベクターの細胞内伝達による発現法、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）誘導ｓｉＲＮＡ発現カセット（cassette）の細胞内伝達による発現法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
特に、本発明のＰＬＲＧ１に対するｓｉＲＮＡは、配列番号１１～配列番号２０のいずれかのオリゴヌクレオチド及びその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドの二重鎖からなるものであってもよいが、これらに限定されるものではない。また、前記ｓｈＲＮＡは、配列番号２１又は配列番号２２のオリゴヌクレオチド配列を有するものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
本発明における「抗体」とは、生体の免疫系において血液やリンパを循環しながら外部物質である抗原が侵入するとそれに反応する物質を意味し、リンパ組織で形成されるグロブリン系タンパク質であり、免疫グロブリンともいう。抗体は、Ｂ細胞が生産して体液に流し込むタンパク質であり、抗原と特異的に結合し、１つの抗体分子には２つの重鎖（heavy chain）と２つの軽鎖（light chain）があり、重鎖及び軽鎖のそれぞれはそのＮ末端に可変領域を有する。各可変領域は３つの相補性決定領域（Complementarity determining region: CDR）と４つのフレームワーク領域（framework regions: FRs）とから構成されるが、相補性決定領域は抗体の抗原結合特異性を決定し、可変領域のフレームワーク領域で維持される比較的短いペプチド配列として存在する。本発明の目的上、前記抗体は、ＰＬＲＧ１と結合することによりＰＬＲＧ１の活性を抑制する抗体であってもよい。
本発明における「癌」とは、アポトーシス調節に関する疾病であり、正常なアポトーシスバランスが崩れて細胞が過剰増殖することにより生じる疾病を意味する。これら異常な過剰増殖細胞は、場合によっては周囲組織や臓器に侵入して塊を形成し、体内の正常な構造の破壊や変形をもたらすが、このような状態を癌という。一般に、腫瘍（tumor）とは、身体組織の自律的かつ過剰な成長により異常に成長した塊を意味し、良性腫瘍（benign tumor）と悪性腫瘍（malignant tumor）に分けられる。悪性腫瘍は、良性腫瘍に比べて成長速度が非常に速く、周囲組織に浸潤して転移（metastasis）を起こすと生命を脅かす。このような悪性腫瘍を通常「癌（cancer）」といい、癌の種類としては、脳脊髄腫瘍、脳腫瘍、頭頸部癌、肺癌、乳癌、胸腺腫、中皮腫、食道癌、膵癌、大腸癌、肝癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸癌、生殖細胞腫、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、リンパ腫、急性白血病、慢性白血病、多発性骨髄腫、肉腫、悪性黒色腫及び皮膚癌が挙げられるが、前記例に本発明の癌の種類が限定されるものではない。また、本発明における癌は、ＰＬＲＧ１が正常組織より過剰発現した癌であるが、これに限定されるものではない。
前記癌の予防又は治療は、癌細胞特異的アポトーシス（apoptosis）により達成されるものであってもよい。前記アポトーシスとは、細胞の死に方の一種であり、物理的に細胞が破壊されるネクローシス（necrosis）とは区別され、プログラム細胞死（programmed cell death）ともいい、ＤＮＡが損傷した細胞や不要となった細胞が自ら死滅する過程を意味する。
本発明の具体的な一実施例においては、ＰＬＲＧ１に対するｓｉＲＮＡで細胞を処理してＰＬＲＧ１の発現を減少させた場合、癌細胞株においては単一クローン成長が減少して細胞増殖が抑制されるが、正常細胞株においては細胞増殖に影響を及ぼさないことを確認した（図３）。また、ＰＬＲＧ１に対するｓｉＲＮＡで処理した細胞に対してＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ単独又はＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ及びＰＩで染色し、その結果から、ＰＬＲＧ１の減少により癌細胞特異的にアポトーシスが起こることが原因であることを確認した（図４及び図５）。さらに、このようなＰＬＲＧ１減少による癌細胞特異的効果は正常細胞である間葉系幹細胞やテロメラーゼ活性が誘導された細胞においても現れないことを確認することにより（図６及び図７）、ＰＬＲＧ１抑制は非常に厳格に癌細胞特異的にアポトーシスを誘導できることを確認した。さらに、ＩＰＴＧ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ－ｓｈ－ＰＬＲＧ１システムを用いて、前記結果が生体内でも同様に現れることをマウス動物モデルにおいて確認した（図１１）。これは、ＰＬＲＧ１抑制剤が抗癌剤として用いられると、正常細胞には影響を及ぼさず、副作用を起こすことなく癌細胞特異的にアポトーシスを誘導できることを示唆するものである。
本発明における「治療」とは、治療する個体又は細胞の自然過程を変更するために臨床的に介入することを意味し、臨床病理状態の進行中に行われてもよく、それを予防するために行われてもよい。目的とする治療効果には、疾病の発生や再発を予防すること、症状を緩和すること、疾病に伴うあらゆる直接又は間接的な病理学的結果を低減すること、転移を予防すること、疾病の進行速度を減少させること、疾病状態を軽減又は一時的に緩和すること、快方に向かわせること、予後を改善することが含まれる。本発明においては、ＰＬＲＧ１を抑制する物質を含む組成物の投与により癌の経過を好転させるあらゆる行為が含まれることが好ましい。また、「予防」とは、本発明によるＰＬＲＧ１を抑制する物質を含む組成物の投与により前記癌の発病を抑制又は遅延させるあらゆる行為を意味する。
本発明の薬学組成物は、薬学組成物の製造に通常用いられる適切な担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含んでもよい。薬学的に許容される担体を含む組成物は、経口又は非経口の様々な剤形であってもよい。製剤化する場合は、通常用いる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調製される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、これらの固形製剤は、少なくとも１つの化合物に少なくとも１つの賦形剤、例えばデンプン、炭酸カルシウム、スクロース（sucrose）又はラクトース（lactose）、ゼラチンなどを混合して調製される。また、通常の賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤も用いられる。経口用液体製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが挙げられ、通常用いられる通常の希釈剤である水、液体パラフィン以外にも種々の賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが用いられる。非経口投与用製剤としては、滅菌水溶液剤、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥剤、坐剤が挙げられる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（propylene glycol）、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物性油、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどが用いられる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（witepsol）、マクロゴール、ツイーン（tween）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが用いられる。
また、本発明の薬学組成物は、これらに限定されるものではないが、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌水溶液剤、非水性溶剤、凍結乾燥剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれかの剤形を有してもよい。
本発明の他の態様は、ＰＬＲＧ１（pleiotropic regulator 1）抑制剤を有効成分として含む薬学組成物を個体に投与するステップを含む、癌の治療方法を提供する。
本発明における「個体」とは、本発明における癌疾患を保有しているか、発症したヒトを含むあらゆる動物を意味する。本発明の薬学組成物を個体に投与することにより、肝癌をはじめとする癌を緩和又は治療することができる。前記緩和とは、本発明による組成物の投与により癌疾患を好転又は有利に変化させるあらゆる行為を意味する。
前記本発明の薬学組成物は、薬学的に有効な量で投与する。
本発明における「投与」とは、任意の適切な方法で対象に本発明の薬学組成物を導入することを意味し、投与経路は、標的組織に送達できるものであれば経口又は非経口の様々な経路で投与することができる。
前記薬学組成物は、標的又は必要に応じて当業界で用いられる通常の方法、投与経路、投与量により適切に個体に投与することができる。投与経路の例としては、経口、非経口、皮下、腹腔内、肺内及び鼻腔内投与が挙げられ、非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が挙げられる。また、当業界で公知の方法により適切な投与量及び投与回数が選択されてもよく、実際に投与される本発明の薬学組成物の量及び投与回数は、治療する症状の種類、投与経路、性別、健康状態、食餌、個体の年齢及び体重、疾患の重症度などの様々な因子により適宜決定されてもよい。
本発明における「薬学的に有効な量」とは、医学的用途に適用できる合理的な利益／リスク比で血管透過性の増加を抑制又は緩和するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、個体の種類及び重症度、年齢、性別、薬物の活性、薬物に対する感受性、投与期間、投与経路及び排出率、治療期間、同時に用いられる薬物が含まれる要素、並びにその他医学分野で公知の要素により決定されてもよい。本発明の組成物は、単独で又は他の治療剤と併用して投与してもよく、従来の治療剤と順次又は同時に投与してもよい。また、単一又は多重投与してもよい。前記要素を全て考慮して副作用なく最小限の量で最大限の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者により容易に決定されてもよい。
本発明のさらに他の態様は、ＰＬＲＧ１（pleiotropic regulator 1）の発現レベルを測定する製剤を含む、癌診断用組成物を提供する。
本発明のさらに他の態様は、（ａ）分離された生物学的試料のＰＬＲＧ１（pleiotropic regulator 1）発現レベルを測定するステップと、（ｂ）前記発現レベルを正常対照群試料のＰＬＲＧ１発現レベルと比較するステップと、（ｃ）前記生物学的試料のＰＬＲＧ１発現レベルが正常対照群のＰＬＲＧ１発現レベルより高ければ癌であると判定するステップとを含む、癌診断のための情報を提供する方法を提供する。本発明によれば、癌マーカーＰＬＲＧ１を検出することにより、癌診断に必要な情報を提供し、癌を診断することができる。
本発明における「診断」とは、生物学的試料又は組織サンプルにおいて本発明のＰＬＲＧ１の存在又は不在を測定することにより、癌疾患の存在又は特徴を確認することを意味する。また、「マーカー又は診断マーカー（diagnosis marker）」とは、癌細胞又は癌疾患を有する個体を正常細胞又は正常個体と区分して診断できる物質であり、正常細胞に比べて癌を有する細胞又は個体において増加又は減少を示す、ポリペプチド、タンパク質又は核酸（例えば、ｍＲＮＡなど）、脂質、糖脂質、糖タンパク質又は糖（単糖類、二糖類、オリゴ糖類など）などの有機生体分子が含まれる。本発明の目的上、本発明の癌診断マーカーは、正常細胞又は組織の細胞に比べて、癌細胞において特異的に高いレベルの発現を示すＰＬＲＧ１である。
本発明において、ＰＬＲＧ１発現レベルを測定するとは、ＰＬＲＧ１のｍＲＮＡ発現レベル測定を行うか、ＰＬＲＧ１のタンパク質発現レベル測定を行うことであってもよい。
前記「ｍＲＮＡ発現レベル測定」とは、癌を診断するために生物学的試料において癌マーカー遺伝子のｍＲＮＡの存否と発現の程度を確認する過程であり、ｍＲＮＡの量を測定することにより行うことができる。そのための分析方法としては、ＲＴ－ＰＣＲ、競合的ＲＴ－ＰＣＲ（competitive RT-PCR）、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（real-time RT-PCR）、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（RPA; RNase protection assay）、ノーザンブロッティング（Northern blotting）、ＤＮＡチップなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
前記「タンパク質発現レベル測定」とは、癌を診断するために生物学的試料において癌マーカー遺伝子から発現したタンパク質の存否と発現の程度を確認する過程であり、前記遺伝子のタンパク質に対して特異的に結合する抗体を用いてタンパク質の量を確認することにより行う。そのための分析方法としては、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（enzyme linked immunosorbent assay）、放射免疫測定（RIA: Radioimmunoassay）、放射免疫拡散法（radioimmunodiffusion）、オクタロニー（Ouchterlony）免疫拡散法、ロケット（rocket）免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈降法（Immunoprecipitation assay）、補体固定分析法（complement fixation assay）、ＦＡＣＳ、プロテインチップ（protein chip）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
一例として、前記ｍＲＮＡレベルを測定する製剤は、本発明のＰＬＲＧ１のｍＲＮＡに対するプライマー（primer）対、プローブ（probe）又はアンチセンスヌクレオチド（anti-sense nucleotide）であってもよく、本発明のＰＬＲＧ１のポリヌクレオチド配列により当業者がプライマー、プローブ又はアンチセンスヌクレオチド配列を容易にデザインすることができる。他の例として、前記タンパク質レベルを測定する製剤は抗体であってもよい。
本発明においては、ＰＬＲＧ１の癌診断マーカーとしての可能性を確認し、ＰＬＲＧ１のレベルを測定することにより肝癌をはじめとする癌を診断できるという効果を確認した。
本発明のさらに他の態様は、（ａ）対照群である癌が発病した実験動物の試料のＰＬＲＧ１（pleiotropic regulator 1）発現レベルを測定するステップと、（ｂ）前記実験動物の癌を治療できるものと予想される候補物質を投与するステップと、（ｃ）実験群である前記候補物質が投与された実験動物の試料のＰＬＲＧ１発現レベルを測定するステップと、（ｄ）対照群で測定されたＰＬＲＧ１発現レベルを実験群で測定されたものと比較し、対照群で測定されたものよりも実験群で測定されたもののほうが低いレベルであれば癌の発病を防止する予防用製剤又は癌を治療する治療用製剤として前記候補物質を用いることができるものと判定するステップとを含む、癌の予防又は治療用製剤のスクリーニング方法を提供する。
本発明のさらに他の態様は、（ａ）ＰＬＲＧ１（pleiotropic regulator 1）を発現する分離された癌細胞を癌治療候補物質で処理するステップと、（ｂ）前記候補物質で処理された分離された癌細胞のＰＬＲＧ１発現レベルを測定するステップと、（ｃ）前記（ｂ）ステップで測定されたＰＬＲＧ１発現レベルが候補物質で処理されていない分離された癌細胞に比べて低いレベルであれば癌の発病を防止する予防用製剤又は癌を治療する治療用製剤として前記候補物質を用いることができるものと判定するステップとを含む、癌の予防又は治療用製剤であるスクリーニング方法を提供する。
癌を予防又は治療できる候補物質の不在下で細胞における本発明の前記遺伝子の発現レベル又は前記遺伝子がコードするタンパク質のレベルを測定し、また、前記候補物質の存在下で本発明の前記遺伝子の発現レベル又は前記遺伝子がコードするタンパク質のレベルを測定して両者を比較し、前記候補物質の存在下での本発明の前記遺伝子の発現レベル又は前記遺伝子がコードするタンパク質のレベルを前記候補物質の不在下でのレベルより減少させる物質が癌の予防又は治療用製剤であろうと予測することができる。
前記スクリーニング方法は、インビボ（in vivo）又はインビトロ（in vitro）で行われるが、特にこれらに限定されるものではない。候補物質は、公知の物質又は新規物質であり、例えば植物抽出物又はケミカルライブラリー（chemical library）により大規模にスクリーニングを行うことができる。よって、ＰＬＲＧ１の発現又は活性を抑制することにより癌細胞特異的アポトーシスを誘導することのできる癌の予防又は治療用製剤を見出すことができる。
本発明のさらに他の態様は、ＰＬＲＧ１（pleiotropic regulator 1）遺伝子配列に基づいてＰＬＲＧ１の転写又は翻訳を抑制するか、ＰＬＲＧ１タンパク質の活性を抑制する抗癌候補物質を設計するステップを含む、癌の予防又は治療用製剤候補物質の探索方法を提供する。
前述したように、本発明においては、ＰＬＲＧ１の発現を抑制すると癌細胞特異的に増殖が抑制されてアポトーシスが起こることをインビトロ及びインビボで多方面から確認した。すなわち、本発明においては、ＰＬＲＧ１の抑制が癌細胞特異的な抗癌効果を有することを最初に解明した。従って、当業者であれば、本発明によりＰＬＲＧ１の転写又は翻訳を抑制するか、ＰＬＲＧ１タンパク質の活性を抑制する物質が抗癌活性を有することを認知することができる。よって、本発明の実施例においてその効果を確認したＰＬＲＧ１に対するｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは単に前記技術的思想を立証した例示とみなすべきであり、当業者であれば、当該技術分野で公知の様々な方法によりＰＬＲＧ１遺伝子配列情報に基づいてＰＬＲＧ１の発現や活性などを抑制する癌の予防又は治療用製剤候補物質を設計することができる。それに関する具体的な例として、ＰＬＲＧ１遺伝子配列に基づいてそれを抑制するｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを作製することができ、ＰＬＲＧ１遺伝子から翻訳されるタンパク質の構造に基づいてそれを抑制する化合物をコンピュータプログラムなどにより予測することができる。前記探索方法により選択された候補物質は、インビトロ又はインビボスクリーニングにより有効物質の選択に活用することができる。
以下、本発明の理解を容易にするために実施例を挙げて詳細に説明する。しかし、本発明による実施例は様々な他の形態に変形することができ、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものと解釈されてはならない。本発明の実施例は、当該技術分野における通常の知識を有する者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
プライマー及びｓｉＲＮＡ配列
遺伝子の発現を測定するために用いたＲＴ－ＰＣＲ及びｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲプライマーは次の通りである。
［ＲＴ－ＰＣＲ］
ＰＬＲＧ１ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：ＡＣＣＧＴＣＣＡＣ ＡＧＣＣＴＡＣＡＧＣＧＡ（配列番号１）
ＰＬＲＧ１ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：ＡＣＴＡＴＣＡＣＧＣＣＣＣＧＣＡＣＡＧＴ（配列番号２）
ＧＡＰＤＨ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：ＧＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＡＣＣＴＧＡＣＣＴ（配列番号３）
ＧＡＰＤＨ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：ＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＡＡＡＴＴＣＧＴＴＧ（配列番号４）
β－ａｃｔｉｎ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：ＧＧＡＣＴＴＣＧＡＧＣＡＡＧＡＧＡＴＧＧ（配列番号５）
β－ａｃｔｉｎ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：ＡＧＣＡＣＴＧＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＣＡＧ（配列番号６）
［Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ］
ＰＬＲＧ１ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：ＣＴＴＡＡＡＧＡＧＡＡＧＧＧＴＣＣＴＣＡＧ（配列番号７）
ＰＬＲＧ１ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：ＧＧＴＣＣＴＧＧＴＧＧＧＴＡＴＧＧＡＴＧＴ（配列番号８）
β－ａｃｔｉｎ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：ＧＣＡＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡ（配列番号９）
β－ａｃｔｉｎ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：ＴＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＴＡＧＣＡＡＣ（配列番号１０）
遺伝子の発現を測定するために用いたＲＴ－ＰＣＲ及びｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲプライマーは次の通りである。
［ＲＴ－ＰＣＲ］
ＰＬＲＧ１ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：ＡＣＣＧＴＣＣＡＣ ＡＧＣＣＴＡＣＡＧＣＧＡ（配列番号１）
ＰＬＲＧ１ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：ＡＣＴＡＴＣＡＣＧＣＣＣＣＧＣＡＣＡＧＴ（配列番号２）
ＧＡＰＤＨ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：ＧＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＡＣＣＴＧＡＣＣＴ（配列番号３）
ＧＡＰＤＨ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：ＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＡＡＡＴＴＣＧＴＴＧ（配列番号４）
β－ａｃｔｉｎ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：ＧＧＡＣＴＴＣＧＡＧＣＡＡＧＡＧＡＴＧＧ（配列番号５）
β－ａｃｔｉｎ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：ＡＧＣＡＣＴＧＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＣＡＧ（配列番号６）
［Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ］
ＰＬＲＧ１ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：ＣＴＴＡＡＡＧＡＧＡＡＧＧＧＴＣＣＴＣＡＧ（配列番号７）
ＰＬＲＧ１ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：ＧＧＴＣＣＴＧＧＴＧＧＧＴＡＴＧＧＡＴＧＴ（配列番号８）
β－ａｃｔｉｎ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：ＧＣＡＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡ（配列番号９）
β－ａｃｔｉｎ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：ＴＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＴＡＧＣＡＡＣ（配列番号１０）
ＰＬＲＧ１発現を抑制するために用いたｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは次の通りである。
ｓｉＰＬＲＧ１＃１：ｕｃｃｇｇｕｃａｕａａｕｇｃｕａｕｕａｕｕ（配列番号１１）
ｓｉＰＬＲＧ１＃２：ａｇｃｃａｕｇａｕａｃｕａｃａａｕｕｃｇａ（配列番号１２）
ｓｉＰＬＲＧ１＃３：ｃｇａｇｇａｇｇｕａｃａｇａａａｃａｕｕｃｕｇｕａ（配列番号１３）
ｓｉＰＬＲＧ１＃４：ａａａｇａｇａａｇｇｇｕｃｃｕｃａｇａａｕｇｃａａ（配列番号１４）
ｓｉＰＬＲＧ１＃５：ｃａｇａａｃｕａｕａａａｇａｕｃｕｇｇｇａｃｕｕｇ（配列番号１５）
ｓｉＰＬＲＧ１＃６：ｕｃｃａｇｕｃａｇｃｕｇｇａａａｃｃａｇａａａｕｕ（配列番号１６）
ｓｉＰＬＲＧ１＃７：ｃｃｃａｕｇａｃａｕｇｕｕｕｇｕａｇｃｕｇａｕａａ（配列番号１７）
ｓｉＰＬＲＧ１＃８：ｃｃａａｇａａｃｕｃｕｇｃａｃｕｇａｕｇｇｃｕａａ（配列番号１８）
ｓｉＰＬＲＧ１＃９：ａｃｃｇｕｇｇａａａｃｕｃｕａｃａｇｇｇｕｕａｕｃ（配列番号１９）
ｓｉＰＬＲＧ１＃１０：ａａｇｃｕｇａｕａａａａｃｃａｕｕａａａｇｕａｕａ（配列番号２０）
ｓｈＰＬＲＧ１＃１：ＣＣＡＴＧＡＴＡＣＴＡＣＡＡＴＴＣＧＡＴＴ（配列番号２１）
ｓｈＰＬＲＧ１＃２：ＧＡＣＴＴＧＧＣＴＡＧＴＧＧＣＡＡＡＴＴＡ（配列番号２２）
ｓｉＰＬＲＧ１＃１：ｕｃｃｇｇｕｃａｕａａｕｇｃｕａｕｕａｕｕ（配列番号１１）
ｓｉＰＬＲＧ１＃２：ａｇｃｃａｕｇａｕａｃｕａｃａａｕｕｃｇａ（配列番号１２）
ｓｉＰＬＲＧ１＃３：ｃｇａｇｇａｇｇｕａｃａｇａａａｃａｕｕｃｕｇｕａ（配列番号１３）
ｓｉＰＬＲＧ１＃４：ａａａｇａｇａａｇｇｇｕｃｃｕｃａｇａａｕｇｃａａ（配列番号１４）
ｓｉＰＬＲＧ１＃５：ｃａｇａａｃｕａｕａａａｇａｕｃｕｇｇｇａｃｕｕｇ（配列番号１５）
ｓｉＰＬＲＧ１＃６：ｕｃｃａｇｕｃａｇｃｕｇｇａａａｃｃａｇａａａｕｕ（配列番号１６）
ｓｉＰＬＲＧ１＃７：ｃｃｃａｕｇａｃａｕｇｕｕｕｇｕａｇｃｕｇａｕａａ（配列番号１７）
ｓｉＰＬＲＧ１＃８：ｃｃａａｇａａｃｕｃｕｇｃａｃｕｇａｕｇｇｃｕａａ（配列番号１８）
ｓｉＰＬＲＧ１＃９：ａｃｃｇｕｇｇａａａｃｕｃｕａｃａｇｇｇｕｕａｕｃ（配列番号１９）
ｓｉＰＬＲＧ１＃１０：ａａｇｃｕｇａｕａａａａｃｃａｕｕａａａｇｕａｕａ（配列番号２０）
ｓｈＰＬＲＧ１＃１：ＣＣＡＴＧＡＴＡＣＴＡＣＡＡＴＴＣＧＡＴＴ（配列番号２１）
ｓｈＰＬＲＧ１＃２：ＧＡＣＴＴＧＧＣＴＡＧＴＧＧＣＡＡＡＴＴＡ（配列番号２２）
癌細胞、正常細胞及び間葉系幹細胞の培養
ＡＴＣＣから購入したヒト肝癌細胞株であるＨｕｈ７とＳＮＵ４７５細胞は１０％ＦＢＳ（fetal bovine serum）を含有するＲＰＭＩ培地で培養した。他のヒト肝癌細胞株であるＨｅｐ３ＢとＨｅｐＧ２細胞は１０％ＦＢＳを含有するＭＥＭ培地で培養した。正常細胞であるＨＤＦ、ＩＭＲ９０、ＷＩ３８、ＢＪ及びＢＪ－Ｔ細胞は１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地で培養した。Ｌｏｎｚａから購入したヒト間葉系幹細胞（human mesenchymal stem cell）はＭＳＣＧＭ（human Mesenchymal Stem Cell Growth BulletKitTM Medium）で培養した。
ＡＴＣＣから購入したヒト肝癌細胞株であるＨｕｈ７とＳＮＵ４７５細胞は１０％ＦＢＳ（fetal bovine serum）を含有するＲＰＭＩ培地で培養した。他のヒト肝癌細胞株であるＨｅｐ３ＢとＨｅｐＧ２細胞は１０％ＦＢＳを含有するＭＥＭ培地で培養した。正常細胞であるＨＤＦ、ＩＭＲ９０、ＷＩ３８、ＢＪ及びＢＪ－Ｔ細胞は１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地で培養した。Ｌｏｎｚａから購入したヒト間葉系幹細胞（human mesenchymal stem cell）はＭＳＣＧＭ（human Mesenchymal Stem Cell Growth BulletKitTM Medium）で培養した。
ＲＮＡ分離及びＲＴ－ＰＣＲ
Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いてＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ濃度はＮＤ－１０００ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（NanoDrop Technologies, Inc. Wilmington, DE, USA）を用いて測定した。また、ｉＳｃｒｉｐｔＴＭ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いて（Biorad）ｃＤＮＡ（complementary DNA）を合成し、Ｍａｘｉｍｅ ＰＣＲ ＰｒｅＭｉｘ ｋｉｔ（Intron Biotechnology）を用いてＲＴ－ＰＣＲ（reverse transcriptase-polymerase chain reaction）を行った。
Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いてＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ濃度はＮＤ－１０００ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（NanoDrop Technologies, Inc. Wilmington, DE, USA）を用いて測定した。また、ｉＳｃｒｉｐｔＴＭ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いて（Biorad）ｃＤＮＡ（complementary DNA）を合成し、Ｍａｘｉｍｅ ＰＣＲ ＰｒｅＭｉｘ ｋｉｔ（Intron Biotechnology）を用いてＲＴ－ＰＣＲ（reverse transcriptase-polymerase chain reaction）を行った。
タンパク質分離及びウェスタンブロット（western blot）
肝癌患者組織及びその周囲組織から溶解緩衝液（lysis buffer）を用いてタンパク質を抽出し、ＰＬＲＧ１（pleiotropic regulator 1）抗体（SIGMA）とＧＡＰＤＨ抗体（Santacruz）を用いてウェスタンブロットによりタンパク質発現量を測定した。各細胞株に対しても前記と同様にウェスタンブロットを行った。対照群としてβ－ａｃｔｉｎ抗体（Santacruz）を用いた。
肝癌患者組織及びその周囲組織から溶解緩衝液（lysis buffer）を用いてタンパク質を抽出し、ＰＬＲＧ１（pleiotropic regulator 1）抗体（SIGMA）とＧＡＰＤＨ抗体（Santacruz）を用いてウェスタンブロットによりタンパク質発現量を測定した。各細胞株に対しても前記と同様にウェスタンブロットを行った。対照群としてβ－ａｃｔｉｎ抗体（Santacruz）を用いた。
ＰＬＲＧ１抑制剤を用いた単一クローン成長（clonal growth）抑制の測定
本発明者らは、ＰＬＲＧ１発現を抑制するための抑制剤として、代表的にはＰＬＲＧ１に対するｓｉＲＮＡを用いた。よって、ｓｉＰＬＲＧ１＃１～ｓｉＰＬＲＧ＃１０はＱｉａｇｅｎから購入し、Ｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｉＲＮＡはＭｂｉｏｔｅｃｈから購入して用いた。各細胞を６０ｍｍ培養皿に接種し、その後Ｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｉＲＮＡと２種類のＰＬＲＧ１－ｓｉＲＮＡをそれぞれ導入した。２４時間後に１，０００個の細胞を計算して再び接種し、１０日経過後にクリスタルバイオレット（crystal violet）で細胞を染色した。染色されたコロニーを計算して単一クローン成長を定量化した。
本発明者らは、ＰＬＲＧ１発現を抑制するための抑制剤として、代表的にはＰＬＲＧ１に対するｓｉＲＮＡを用いた。よって、ｓｉＰＬＲＧ１＃１～ｓｉＰＬＲＧ＃１０はＱｉａｇｅｎから購入し、Ｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｉＲＮＡはＭｂｉｏｔｅｃｈから購入して用いた。各細胞を６０ｍｍ培養皿に接種し、その後Ｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｉＲＮＡと２種類のＰＬＲＧ１－ｓｉＲＮＡをそれぞれ導入した。２４時間後に１，０００個の細胞を計算して再び接種し、１０日経過後にクリスタルバイオレット（crystal violet）で細胞を染色した。染色されたコロニーを計算して単一クローン成長を定量化した。
ＰＬＲＧ１抑制剤を用いた細胞成長抑制
各細胞を２４ウェル培養皿に接種し、その後Ｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｉＲＮＡと２種類のＰＬＲＧ１－ｓｉＲＮＡをそれぞれ導入した。５日経過後にクリスタルバイオレットで細胞を染色し、氷酢酸で溶解してＯ．Ｄ５９５ｎｍで吸光度を測定した。各実験は３回繰り返し実験を行った。Ｈｕｈ７細胞株は２４、４８、７２、９６、１２０時間後に細胞成長を測定した。
各細胞を２４ウェル培養皿に接種し、その後Ｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｉＲＮＡと２種類のＰＬＲＧ１－ｓｉＲＮＡをそれぞれ導入した。５日経過後にクリスタルバイオレットで細胞を染色し、氷酢酸で溶解してＯ．Ｄ５９５ｎｍで吸光度を測定した。各実験は３回繰り返し実験を行った。Ｈｕｈ７細胞株は２４、４８、７２、９６、１２０時間後に細胞成長を測定した。
ＰＬＲＧ１抑制剤を用いたアポトーシス（apoptosis）誘導
各細胞を６０ｍｍ培養皿に接種し、その後Ｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｉＲＮＡとＰＬＲＧ１－ｓｉＲＮＡでそれぞれ処理した。７２時間後に細胞を全て回収し、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣを添加して１５分間染色し、フローサイトメトリーを用いてアポトーシスの程度を測定した。
各細胞を６０ｍｍ培養皿に接種し、その後Ｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｉＲＮＡとＰＬＲＧ１－ｓｉＲＮＡでそれぞれ処理した。７２時間後に細胞を全て回収し、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣを添加して１５分間染色し、フローサイトメトリーを用いてアポトーシスの程度を測定した。
二重染色の場合は、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣとＰＩ（propidium iodide）を同時に添加して１５分間染色し、フローサイトメトリーを用いてアポトーシスの程度を測定した。
実験例１．肝癌組織及び肝癌細胞株のＰＬＲＧ１（pleiotropic regulator 1）発現レベルの確認
非腫瘍性の周囲肝組織と肝癌組織に存在するＰＬＲＧ１のｍＲＮＡ量をそれぞれＲＴ－ＰＣＲ法により測定した結果、非腫瘍性の周囲肝組織と比較して、肝癌組織においてＰＬＲＧ１のｍＲＮＡが過剰発現していることを確認した（図１）。ウェスタンブロット法によりタンパク質量を測定した場合も、肝癌組織においてＰＬＲＧ１の発現が大きく増加していた（図１のＡ）。
非腫瘍性の周囲肝組織と肝癌組織に存在するＰＬＲＧ１のｍＲＮＡ量をそれぞれＲＴ－ＰＣＲ法により測定した結果、非腫瘍性の周囲肝組織と比較して、肝癌組織においてＰＬＲＧ１のｍＲＮＡが過剰発現していることを確認した（図１）。ウェスタンブロット法によりタンパク質量を測定した場合も、肝癌組織においてＰＬＲＧ１の発現が大きく増加していた（図１のＡ）。
細胞株を用いた実験においても、癌細胞株のＰＬＲＧ１発現量が正常細胞株の発現量より多いことを確認した（図１のＢ）。
実験例２．癌細胞株におけるＰＬＲＧ１発現抑制による単一クローン成長（clonal growth）抑制の確認
実験例１の結果から、ＰＬＲＧ１が癌成長などの癌の進行（progression）に関与するものと推定され、それを確認するためにＰＬＲＧ１発現を抑制した場合に癌細胞の単一クローン成長に及ぼす影響を測定した。
実験例１の結果から、ＰＬＲＧ１が癌成長などの癌の進行（progression）に関与するものと推定され、それを確認するためにＰＬＲＧ１発現を抑制した場合に癌細胞の単一クローン成長に及ぼす影響を測定した。
その結果、ＰＬＲＧ１－ｓｉＲＮＡで癌細胞株ＳＮＵ４７５を処理してＰＬＲＧ１発現を減少させると、Ｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｉＲＮＡで処理した対照群と比較してコロニー形成が著しく抑制されることを確認した（図２のＡ）。このようなＰＬＲＧ１発現抑制による癌細胞のコロニー形成抑制は、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７癌細胞株においても同様に観察された（図２のＢ、Ｃ及びＤ）。また、ＰＬＲＧ１発現減少による単一クローン成長抑制は、２種類の異なるＰＬＲＧ１－ｓｉＲＮＡ（♯１，♯２）を用いた実験において同様に観察された。前記結果から、ＰＬＲＧ１発現減少は様々な癌細胞において単一クローン成長を抑制することが分かる。
実験例３．正常細胞株におけるＰＬＲＧ１の発現抑制効果の確認
ＰＬＲＧ１発現抑制が正常細胞株の成長にも影響を及ぼすか否かを確認するために、ＰＬＲＧ１－ｓｉＲＮＡで処理し、その後癌細胞株と正常細胞株の成長を測定、比較した。クリスタルバイオレット（crystal violet）染色法で細胞成長を測定した結果、癌細胞株であるＨｕｈ７の場合、コロニー形成実験で示したように、ＰＬＲＧ１発現抑制により細胞成長が起こらず（図３のＡ）、むしろ減少した（図３のＢ）。しかし、実験に用いたＨＤＦ、ＩＭＲ９０、ＷＩ３８及びＢＪ正常細胞株の場合、Ｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｉＲＮＡで処理した対照群と比較して、ＰＬＲＧ１発現抑制による細胞成長減少現象が観察されなかった（図３のＡ，ｐ＞０．０５）。前記結果から、ＰＬＲＧ１発現減少による細胞成長抑制は癌細胞特異的なものであることが分かる。
ＰＬＲＧ１発現抑制が正常細胞株の成長にも影響を及ぼすか否かを確認するために、ＰＬＲＧ１－ｓｉＲＮＡで処理し、その後癌細胞株と正常細胞株の成長を測定、比較した。クリスタルバイオレット（crystal violet）染色法で細胞成長を測定した結果、癌細胞株であるＨｕｈ７の場合、コロニー形成実験で示したように、ＰＬＲＧ１発現抑制により細胞成長が起こらず（図３のＡ）、むしろ減少した（図３のＢ）。しかし、実験に用いたＨＤＦ、ＩＭＲ９０、ＷＩ３８及びＢＪ正常細胞株の場合、Ｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｉＲＮＡで処理した対照群と比較して、ＰＬＲＧ１発現抑制による細胞成長減少現象が観察されなかった（図３のＡ，ｐ＞０．０５）。前記結果から、ＰＬＲＧ１発現減少による細胞成長抑制は癌細胞特異的なものであることが分かる。
実験例４．ＰＬＲＧ１発現抑制によるアポトーシス（apoptosis）の確認
実験例２で確認したＰＬＲＧ１発現抑制による細胞成長抑制が細胞死（cell death）に関連するか否かを確認するために、アポトーシスマーカー（apoptosis marker）であるＡｎｎｅｘｉｎ－Ｖで染色した細胞を測定した。Ｈｕｈ７とＳＮＵ４７５癌細胞株の場合、Ｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｉＲＮＡで処理した細胞株と比較して、ＰＬＲＧ１－ｓｉＲＮＡで処理するとＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色強度が大きく増加したが、正常細胞株であるＢＪ細胞の場合、対照群との差はなかった（図４のＡ及びＢ）。
実験例２で確認したＰＬＲＧ１発現抑制による細胞成長抑制が細胞死（cell death）に関連するか否かを確認するために、アポトーシスマーカー（apoptosis marker）であるＡｎｎｅｘｉｎ－Ｖで染色した細胞を測定した。Ｈｕｈ７とＳＮＵ４７５癌細胞株の場合、Ｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｉＲＮＡで処理した細胞株と比較して、ＰＬＲＧ１－ｓｉＲＮＡで処理するとＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色強度が大きく増加したが、正常細胞株であるＢＪ細胞の場合、対照群との差はなかった（図４のＡ及びＢ）。
より正確な分析のために、Ａｎｎｅｘｉｎ ＶとＰＩで二重染色し、染色した細胞の変化をＦＡＣＳで分析した。癌細胞株であるＳＮＵ４７５、Ｈｕｈ７はＰＬＲＧ１－ｓｉＲＮＡ処理によりＰＩとＡｎｎｅｘｉｎ Ｖで同時に染色（late apoptosis marker）された細胞の数が大きく増加したが、正常細胞株であるＢＪ、ＨＤＦ及びＷＩ３８においては変化がほとんど観察されなかった（図５）。よって、ＰＬＲＧ１発現抑制は癌細胞特異的に後期アポトーシス（late apoptosis）を誘導することが分かる。
実験例５．間葉系幹細胞におけるＰＬＲＧ１抑制効果の確認
ＰＬＲＧ１は癌細胞又は組織において過剰発現し、発現を抑制すると正常細胞には影響がなく、癌細胞特異的にアポトーシスを誘導することから、ＰＬＲＧ１が癌細胞に特異的に必要な成長因子であることが分かる。このような結果を補強するために、細胞分裂が速い間葉系幹細胞を用いてＰＬＲＧ１の影響を測定した。
ＰＬＲＧ１は癌細胞又は組織において過剰発現し、発現を抑制すると正常細胞には影響がなく、癌細胞特異的にアポトーシスを誘導することから、ＰＬＲＧ１が癌細胞に特異的に必要な成長因子であることが分かる。このような結果を補強するために、細胞分裂が速い間葉系幹細胞を用いてＰＬＲＧ１の影響を測定した。
その結果、他の正常細胞と同様に、間葉系幹細胞においてもＰＬＲＧ１の発現減少による細胞成長抑制は観察されなかった（図６）。具体的には、顕微鏡観察による細胞形態（cell morphology）（図６のＡ）だけでなく、クリスタルバイオレット染色による細胞成長（図６のＢ）実験においてもＰＬＲＧ１発現減少による変化が観察されなかった。
一方、間葉系幹細胞をはじめとする幹細胞は、癌細胞と同様にテロメラーゼ（telomerase）が活性化している。間葉系幹細胞においてＰＬＲＧ１発現減少の影響が観察されなかったので、それをより明確にするために、テロメラーゼの過剰発現が誘導された正常細胞を用いてＰＬＲＧ１発現減少の影響を測定した。
その結果、テロメラーゼ発現がないＢＪ細胞とテロメラーゼ発現が誘導されたＢＪ－Ｔ細胞の両方において、ＰＬＲＧ１発現抑制により細胞成長が影響を受けないことを確認した（図７のＡ及びＢ）。これは、テロメラーゼ発現に関係なく、癌細胞ではない正常細胞においてはＰＬＲＧ１発現抑制による影響がないことを意味するものである。
実験例６．様々なＰＬＲＧ１－ｓｉＲＮＡの癌細胞成長抑制効果の確認
ＰＬＲＧ１抑制による抗癌効果をより明確に確認するために、さらにＰＬＲＧ１遺伝子を標的とする１０種のｓｉＲＮＡを異なる配列で作製した（図８ａ）。また、各ｓｉＲＮＡをＨｕｈ７とＳＮＵ４７５に形質転換して細胞成長及びＰＬＲＧ１発現に及ぼす影響を測定した。
ＰＬＲＧ１抑制による抗癌効果をより明確に確認するために、さらにＰＬＲＧ１遺伝子を標的とする１０種のｓｉＲＮＡを異なる配列で作製した（図８ａ）。また、各ｓｉＲＮＡをＨｕｈ７とＳＮＵ４７５に形質転換して細胞成長及びＰＬＲＧ１発現に及ぼす影響を測定した。
その結果、前述した２つの細胞株において１０種のｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＬＲＧ１＃1～ｓｉＲＬＲＧ１♯１０）は全てＰＬＲＧ１発現を抑制し、それに伴って生存するコロニー数も大きく減少させることを確認した（図８ｂ）。よって、ＰＬＲＧ１－ｓｉＲＮＡ効能は特定塩基配列をターゲッティングするｓｉＲＮＡに限定されないことが分かる。前記結果は、ＰＬＲＧ１遺伝子の発現が抑制されるものであれば、その方法に関係なく癌細胞特異的に細胞成長を抑制することを示唆するものである。
実験例７．様々な癌細胞株におけるＰＬＲＧ１抑制効果の確認
前記ＰＬＲＧ１抑制による癌細胞アポトーシス現象が肝癌などの特定癌に限定されるものであるか、そうでなければ由来組織に関係なくあらゆる癌細胞に汎用的に適用される現象であるかを確認するために様々な癌細胞株を用いてさらに実験を行った。
前記ＰＬＲＧ１抑制による癌細胞アポトーシス現象が肝癌などの特定癌に限定されるものであるか、そうでなければ由来組織に関係なくあらゆる癌細胞に汎用的に適用される現象であるかを確認するために様々な癌細胞株を用いてさらに実験を行った。
その結果、実験に用いた肺癌細胞（Ａ５４９，Ｈ４６０）、乳癌細胞（ＭＤＡ２３１）、子宮頸癌細胞（Ｈｅｌａ，ＳｉＨａ）、骨肉腫（ＳａＯＳ２，Ｕ２ＯＳ）、脳の癌細胞（ＬＮ２２９）、大腸癌細胞（ＨＣＴ１１６，ＳＷ４８０）の全てにおいて、ＰＬＲＧ１の発現を抑制すると生存するコロニー数が大きく減少することを確認した（図９）。よって、ＰＬＲＧ１発現抑制による癌細胞アポトーシスは、特定癌に限定されるものではなく、広範囲にあらゆる癌に適用される現象であることが分かる。
実験例８．ＩＰＴＧ－誘導（inducible）ｓｈ－ＰＬＲＧ１システムの作製及びそれによる癌細胞成長抑制効果の確認
ＰＬＲＧ１欠乏による癌細胞成長抑制現象をさらに明確に解明するために、本発明者らは、ＩＰＴＧ－誘導（inducible）ｓｈ－ＰＬＲＧ１によるＰＬＲＧ１発現調節システムを作製した。ヒトＰＬＲＧ１（ＮＭ＿００２６６９）に対するｓｈＲＮＡを導入したＣｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅレンチベクターをシグマから購入した（図１０のＡ）。Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅレンチベクターシステムで検証されたｓｈＰＬＲＧ１＃１とｓｈＰＬＲＧ１＃２の塩基配列をｉｎｄｕｃｉｂｌｅレンチベクターシステムに導入するためにオリゴを合成した。ｓｈＰＬＲＧ１＃１とｓｈＰＬＲＧ１＃２を対象にプライマーをアニーリングし、その後合成されたＰＣＲ産物をＫｐｎＩ－ＥｃｏＲＩで切断してＬＫＯ－３Ｘ Ｉｎｄｕｃｕｂｌｅベクターにクローニングした。オリゴのシーケンス情報は次の通りである。
ｓｈＰＬＲＧ１＃１－Ｆ（ＫｐｎＩ）：ＣｇａＧｇｔａＣＣＧＧＣＣＡＴＧＡＴＡＣＴＡＣＡＡＴＴＣＧＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＣＧＡＡＴＴＧＴＡＧＴＡＴＣＡＴＧＧＴＴＴＴＴａｇａａｔｔｃＣＧ（配列番号２３）
ｓｈＰＬＲＧ１＃１－Ｒ（ＥｃｏＲＩ）：ＣＧｇａａｔｔｃｔＡＡＡＡＡＣＣＡＴＧＡＴＡＣＴＡＣＡＡＴＴＣＧＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＣＧＡＡＴＴＧＴＡＧＴＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＧｔａｃＣｔｃｇ（配列番号２４）
ｓｈＰＬＲＧ１＃２－Ｆ（ＫｐｎＩ）：ＣｇａＧｇｔａＣＣＧＧＧＡＣＴＴＧＧＣＴＡＧＴＧＧＣＡＡＡＴＴＡＣＴＣＧＡＧＴＡＡＴＴＴＧＣＣＡＣＴＡＧＣＣＡＡＧＴＣＴＴＴＴＴＴＧａａｔｔｃＣＧ（配列番号２５）
ｓｈＰＬＲＧ１＃２－Ｒ（ＥｃｏＲＩ）：ＣＧｇａａｔｔＣＡＡＡＡＡＡＧＡＣＴＴＧＧＣＴＡＧＴＧＧＣＡＡＡＴＴＡＣＴＣＧＡＧＴＡＡＴＴＴＧＣＣＡＣＴＡＧＣＣＡＡＧＴＣＣＣＧＧｔａｃＣｔｃｇ（配列番号２６）
ＰＬＲＧ１欠乏による癌細胞成長抑制現象をさらに明確に解明するために、本発明者らは、ＩＰＴＧ－誘導（inducible）ｓｈ－ＰＬＲＧ１によるＰＬＲＧ１発現調節システムを作製した。ヒトＰＬＲＧ１（ＮＭ＿００２６６９）に対するｓｈＲＮＡを導入したＣｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅレンチベクターをシグマから購入した（図１０のＡ）。Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅレンチベクターシステムで検証されたｓｈＰＬＲＧ１＃１とｓｈＰＬＲＧ１＃２の塩基配列をｉｎｄｕｃｉｂｌｅレンチベクターシステムに導入するためにオリゴを合成した。ｓｈＰＬＲＧ１＃１とｓｈＰＬＲＧ１＃２を対象にプライマーをアニーリングし、その後合成されたＰＣＲ産物をＫｐｎＩ－ＥｃｏＲＩで切断してＬＫＯ－３Ｘ Ｉｎｄｕｃｕｂｌｅベクターにクローニングした。オリゴのシーケンス情報は次の通りである。
ｓｈＰＬＲＧ１＃１－Ｆ（ＫｐｎＩ）：ＣｇａＧｇｔａＣＣＧＧＣＣＡＴＧＡＴＡＣＴＡＣＡＡＴＴＣＧＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＣＧＡＡＴＴＧＴＡＧＴＡＴＣＡＴＧＧＴＴＴＴＴａｇａａｔｔｃＣＧ（配列番号２３）
ｓｈＰＬＲＧ１＃１－Ｒ（ＥｃｏＲＩ）：ＣＧｇａａｔｔｃｔＡＡＡＡＡＣＣＡＴＧＡＴＡＣＴＡＣＡＡＴＴＣＧＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＣＧＡＡＴＴＧＴＡＧＴＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＧｔａｃＣｔｃｇ（配列番号２４）
ｓｈＰＬＲＧ１＃２－Ｆ（ＫｐｎＩ）：ＣｇａＧｇｔａＣＣＧＧＧＡＣＴＴＧＧＣＴＡＧＴＧＧＣＡＡＡＴＴＡＣＴＣＧＡＧＴＡＡＴＴＴＧＣＣＡＣＴＡＧＣＣＡＡＧＴＣＴＴＴＴＴＴＧａａｔｔｃＣＧ（配列番号２５）
ｓｈＰＬＲＧ１＃２－Ｒ（ＥｃｏＲＩ）：ＣＧｇａａｔｔＣＡＡＡＡＡＡＧＡＣＴＴＧＧＣＴＡＧＴＧＧＣＡＡＡＴＴＡＣＴＣＧＡＧＴＡＡＴＴＴＧＣＣＡＣＴＡＧＣＣＡＡＧＴＣＣＣＧＧｔａｃＣｔｃｇ（配列番号２６）
クローニングが完了したレンチベクターを対象にウイルスを合成し、その後肝癌細胞株Ｈｕｈ７、ＳＮＵ４７５と正常細胞株ＢＪに感染させた。その後、７日間細胞を維持した結果、正常細胞はアポトーシスに影響を受けないのに対して、肝癌細胞株はｓｈ－ＲＮＡターゲットシーケンスｓｈ－ＰＬＲＧ１＃１、ｓｈ－ＰＬＲＧ１＃２によりアポトーシスが誘導された（図１０のＢ）。２種のＩｎｄｕｃｉｂｌｅレンチベクター、すなわちｓｈ－ＰＬＲＧ１＃１、ｓｈ－ＰＬＲＧ１＃２を対象にウイルスを合成し、その後肝癌細胞株Ｈｕｈ７、ＳＮＵ４７５と正常細胞株ＢＪに２日間感染させ、５日間ｐｕｒｏｍｙｃｉｎで感染細胞を選択した。その後、１０日間１ｍＭＩＰＴＧ処理下で細胞を維持した結果、正常細胞はアポトーシスに影響を受けないのに対して、肝癌細胞株はｓｈ－ＲＮＡターゲットシーケンス＃１、＃２によりアポトーシスが誘導されることを確認した（図１０のＣ）。ｓｈ－ＲＮＡターゲットシーケンス＃１、＃２による肝癌細胞株のアポトーシスを他のセットの実験で確認したが、そこではＰＬＲＧ１タンパク質発現がｓｈ－対照群シーケンスと比較して大きく減少した（図１０のＤ）。
実験例９．ＩＰＴＧ－誘導（inducible）ｓｈ－ＰＬＲＧ１システムを用いた動物モデルにおけるＰＬＲＧ１抑制効果の確認
ＩＰＴＧ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｓｈ－ＰＬＲＧ１＃１又は＃２を導入したＨｕｈ７細胞（各３×１０６個）をそれぞれヌードマウスの右大腿部に注入し、ｓｈ－対照群ベクターを導入したＨｕｈ７細胞をヌードマウスの左大腿部に注入した。次に、前記マウスにＩＰＴＧを含有する水又はＩＰＴＧを含有しない水を供給して２７日間飼育し、その後各マウスにおける腫瘍形成の有無を確認した。
ＩＰＴＧ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｓｈ－ＰＬＲＧ１＃１又は＃２を導入したＨｕｈ７細胞（各３×１０６個）をそれぞれヌードマウスの右大腿部に注入し、ｓｈ－対照群ベクターを導入したＨｕｈ７細胞をヌードマウスの左大腿部に注入した。次に、前記マウスにＩＰＴＧを含有する水又はＩＰＴＧを含有しない水を供給して２７日間飼育し、その後各マウスにおける腫瘍形成の有無を確認した。
その結果、ＩＰＴＧを含有する水を飲ませて飼育したマウスの場合、注入したＨｕｈ７細胞（すなわち、ｓｈ－ＰＬＲＧ１＃１又は＃２が導入された細胞）の腫瘍が形成されたが、所定期間が経過すると成長減少と共に結局は腫瘍が消滅することを確認した。しかし、ＩＰＴＧを含有しない水を飲ませて飼育したマウスの場合、腫瘍組織のサイズが大きくなり続けることを確認した。また、ｓｈ－対照群を有するＨｕｈ７細胞を注入した場合、ＩＰＴＧの有無に関係なく成長が持続した（図１１）。
前記結果をまとめると、ＰＬＲＧ１発現抑制は間葉系幹細胞などの正常細胞には影響がなく、癌細胞特異的にアポトーシスを誘導できることが分かる。よって、ＰＬＲＧ１発現を抑制する製剤を用いて抗癌剤として用いることができ、またＰＬＲＧ１発現レベルを測定することにより癌診断や抗癌剤スクリーニングなどに活用できるものと期待される。
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態を含むものであると解釈すべきである。
Claims (8)
- ＰＬＲＧ１（pleiotropic regulator 1）抑制剤を有効成分として含む、癌の予防又は治療用薬学組成物であって、
前記ＰＬＲＧ１抑制剤は、ＰＬＲＧ１ｍＲＮＡに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡである、
組成物。 - 前記ｓｉＲＮＡは、配列番号１１～配列番号２０のいずれかのオリゴヌクレオチド及びその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドの二重鎖からなる、請求項１に記載の組成物。
- 前記ｓｈＲＮＡは、配列番号２１又は２２のオリゴヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の組成物。
- 前記癌の予防又は治療は、癌細胞特異的アポトーシス（apoptosis）、細胞死（cell death）、又は細胞増殖抑制により達成される、請求項１に記載の組成物。
- 前記癌は、脳腫瘍、頭頸部癌、肺癌、乳癌、骨癌、胸腺腫、中皮腫、食道癌、膵癌、大腸癌、肝癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、リンパ腫、急性白血病、慢性白血病、多発性骨髄腫、肉腫、悪性黒色腫及び皮膚癌である、請求項１に記載の組成物。
- （ａ）対照群である癌が発病した実験動物の試料のＰＬＲＧ１（pleiotropic regulator 1）発現レベル又は活性を測定するステップと、
（ｂ）前記実験動物の癌を治療できるものと予想される候補物質を投与するステップと、
（ｃ）実験群である前記候補物質が投与された実験動物の試料のＰＬＲＧ１発現レベル又は活性を測定するステップと、
（ｄ）対照群で測定されたＰＬＲＧ１発現レベル又は活性を実験群で測定されたものと比較し、対照群で測定されたものよりも実験群で測定されたもののほうが低いレベルであれば癌の発病を防止する予防用製剤又は癌を治療する治療用製剤として前記候補物質を用いることができるものと判定するステップとを含む、
癌の予防又は治療用製剤のスクリーニング方法。 - （ａ）ＰＬＲＧ１（pleiotropic regulator 1）を発現する分離された癌細胞を癌治療候補物質で処理するステップと、
（ｂ）前記候補物質で処理された分離された癌細胞のＰＬＲＧ１発現レベル又は活性を測定するステップと、
（ｃ）前記（ｂ）ステップで測定されたＰＬＲＧ１発現レベル又は活性が候補物質で処理されていない分離された癌細胞に比べて低いレベルであれば癌の発病を防止する予防用製剤又は癌を治療する治療用製剤として前記候補物質を用いることができるものと判定するステップとを含む、
癌の予防又は治療用製剤のスクリーニング方法。 - ＰＬＲＧ１（pleiotropic regulator 1）遺伝子配列に基づいてＰＬＲＧ１の発現を抑制する抗癌候補物質を設計するステップを含み、発現を抑制する抗癌候補物質の設計は、ＰＬＲＧ１の転写又は翻訳レベルの測定による、癌の予防又は治療用製剤候補物質の探索方法。
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