KR20140074118A - CD49d 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 CD49d 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 CD49d 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품, 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법, 및 CD49d의 발현 수준을 측정하여 암을 진단하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 CD49d는 유방암과 같은 암의 치료 타겟으로 적절하기 때문에, CD49d를 억제함으로써 암을 예방 또는 치료할 수 있는 약제를 개발하는 데에 응용할 수 있으며, 암 진단 마커로서의 가치 또한 가지고 있어 암의 연구 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

CD49d 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating cancer comprising CD49d inhibitor}

본 발명은 CD49d 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 CD49d 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품, 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법, 및 CD49d의 발현 수준을 측정하여 암을 진단하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.

암은 전 세계적으로 가장 많은 사망자를 내는 질병 중 하나로서, 발생 연령이 점차 낮아지며 평균수명의 연장에 따라 암 발생률은 더욱 증가할 것으로 전망하고 있다. 미국 암 협회(ACS; American Cancer Society) 자료에 의하면 2007년 한 해 세계적으로 새롭게 암 진단을 받은 환자는 1,200만 명 이상이며 사망자는 760만 명으로 매일 약 2만 명씩 암으로 사망한 것으로 분석되었다.

종양 형성 세포(TICs, tumor-initiating cells)라고도 불리는 암 줄기세포(cancer stem cell)는 암 조직에서 드물게 존재하는 세포로서, 자기복제(self-renewal)가 가능하고 어떠한 세포 및 조직으로 분화가 가능한 만능세포이다. 암 줄기세포는 적당한 환경에서 분화하고 증식하여 새로운 암 조직으로 성장할 수 있고, 환경이 좋지 않을 경우 암 줄기세포는 다른 곳으로 이동하여 새로운 암 조직을 형성할 수 있다. 이들 암 줄기세포는 대부분 약에 대한 저항성이 크며, 방사선 조사에 대해서도 저항성이 크다. 따라서 암의 치료방법에 있어서 암 줄기세포의 효과적인 억제는 암의 치료법에서 중요한 치료법 중에 하나로 꼽을 수 있다. 이에 따라, 암 줄기세포 또는 종양 형성 세포에 대한 연구를 통하여 암의 치료 효과를 확인하려는 시도가 계속되고 있다.

한편, 나탈리주맙(natalizumab)은 인간화된 마우스 유래의 단일클론항체로서 세포부착분자인 인테그린 α4(integrin α4)를 타겟으로 한다. 2004년 미국 FDA로부터 의약품 승인을 얻었으며, 크론병이나 다발성 경화증과 같은 자가면역 질환, 염증 질환에 관한 효과적인 치료제로 시판되고 있는 약제이다. 그러나, 상기 나탈리주맙의 암 치료 용도로 아직까지 승인된 약제는 없다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 유방암에서 종양 형성 세포에 대한 연구를 계속하던 중, 인테그린 마커 중 하나인 CD49d가 과발현된 세포가 현저하게 높은 종양 형성 능력을 가짐을 확인하고, 이를 암의 치료 타겟으로 사용할 수 있다는 가능성을 발견하고, CD49d를 억제할 경우 암의 치료 효과를 가짐을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 CD49d 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 CD49d 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CD49d 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CD49d의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 암 마커 CD49d를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 CD49d 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "CD49d"는 인테그린 알파 4(integrin α4)라고도 불리며, VLA-4(Very Late Antigen-4) 수용체의 알파 4 서브유닛을 구성하는 요소이다. 상기 CD49d는 인테그린 이성복합체(heterodimeric complex)의 알파 서브유닛으로, 막 관통 단백질(transmembrane protein)이다. 상기 인테그린은 세포 증식, 이동 등 다양한 기능을 가지고 있다고 알려져 있는데, 본 발명에서는 상기 CD49d가 암, 바람직하게는 유방암의 치료 타겟으로서 기능할 수 있다는 신규한 용도를 밝힌 데에 기술적 특징이 있다. 본 발명의 CD49d의 서열 정보는 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나 그 예로 NCBI GenBank Accession No. NM_000885일 수 있으며, 바람직하게는 CD49d 단백질은 서열번호 1로 구성된 아미노산 서열을 가질 수 있으며, CD49d mRNA는 서열번호 2로 구성된 염기서열을 가질 수 있으며, 그의 CDS 서열은 서열번호 3으로 구성된 염기서열을 가질 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 원발성 유방 육종(PBSs, primary breast sarcomas)으로부터 종양 형성 세포의 특징인 자기복제 및 증식, 분화능력 등을 가지는 NDY-1 구형세포(NDY-1 sphere)를 분리하여 부착성 세포와의 비교를 통해 CD49d와 같은 인테그린 마커의 발현을 확인하였으며, 다른 인테그린 마커와 비교할 때 CD49d를 과발현하는 세포에서 그렇지 않은 세포보다 현저하게 종양 형성 능력이 높음을 확인함으로써, CD49d가 유방암 치료 타겟으로 적합함을 확인하였다.

추가적으로, CD49d를 과발현하고 있는 세포가 현저하게 종양 형성 능력이 높음을 세포 수준에서뿐만 아니라 마우스 동물모델의 이식실험에서도 확인하였다. 구체적으로, CD49d를 과발현하는 세포는 200개의 세포만을 주입하더라도 종양을 형성하는 반면, CD49d를 적게 발현하는 세포는 1,000개 이상의 세포를 주입하고 3개월이 지나도 종양이 형성되지 않음을 확인함으로써 CD49d의 발현이 종양 형성에 중요한 인자로 작용하기 때문에 유방암의 치료 타겟이 될 수 있음을 확인하였다(도 0 등). 또한, CD49d를 과발현하고 있는 세포가 항암제인 독소루비신에 저항성을 나타내는 것을 확인함으로써 CD49d를 억제하는 경우 항암제 내성 또한 감소시킬 수 있음을 확인하여 치료 타겟으로서의 유용성을 재차 확인하였다(도 0).

따라서, 본 발명에서는 CD49d를 억제하는 물질, 즉 CD49d 억제제를 이용하여 유방암과 같은 암의 예방, 개선 또는 치료 효과를 달성할 수 있다. 상기 암의 예방, 개선 또는 치료 효과는 암(종양)의 형성 억제에 의하여 달성될 수 있다.

본 발명에서 용어 "CD49d 억제제"는 CD49d의 발현 또는 활성을 감소시키는 제제를 모두 통칭하는 의미로 사용되며, 구체적으로는 CD49d에 직접적으로 작용하거나 그의 리간드에 간접적으로 작용하는 등의 방식으로, CD49d의 발현을 전사 수준에서 감소시키거나 그 활성을 방해함으로써, CD49d의 발현 수준 또는 그 활성을 감소시키는 모든 제제를 포함할 수 있다.

상기 CD49d의 억제제는 CD49d를 표적으로 하여 CD49d의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 화합물, 핵산, 펩타이드, 바이러스 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터 등 그 형태에 제한 없이 사용 가능하다. 상기 CD49d 억제제는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 CD49d mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드, CD49d 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있으며, 보다 바람직하게 상기 CD49d mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드는 CD49d에 특이적인 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 앱타머(aptamer) 또는 siRNA가 될 수 있다. 상기 CD49d를 억제하는 물질의 예로서, HDAC(histone deacetylase)의 억제제, p38 MAPK (mitogen-activated protein kinase)의 억제제(예컨대, SB203580), 또는 보르테조밉(Bortezomib) 등을 들 수 있다. 상기 보르테조밉(Bortezomib)은 프로 Millennium Pharmaceuticals 사에서 개발한 의약품으로, 벨케이드(Velcade)라는 상품명으로 시판되고 있는 약제로서, 프로테오좀(Proteasome) 저해제이며, 다발성 골수종 등의 치료제로 알려져 있다. 한편, 상기 CD49d 단백질의 활성을 억제하는 항체는 보다 바람직하게는 나탈리주맙(natalizumab)일 수 있다.

본 발명에서 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 CD49d mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 이는 상기 CD49d mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 6 내지 100 염기, 바람직하게는 8 내지 60 염기, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하는 한가지 예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 다중클로닝부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 상기 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 이용될 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 디자인은 CD49d의 염기서열을 참조하여 당업계에 공지된 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.

본 발명에서 용어, "앱타머(aptamer)"는 단일가닥 올리고 뉴클레오티드로서, 20~60 뉴클레오티드 정도의 크기이며, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가지며, 항원-항체 반응처럼 특정 물질과 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 또한 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다. 바람직하게 상기 앱타머는 CD49d에 결합하여 CD49d의 활성을 저해하는 역할을 할 수 있다. 이와 같은 앱타머는 CD49d의 서열로부터 당업자가 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다.

본 발명에서 용어, "siRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운(knockdown) 방법 또는 유전자치료 방법으로 사용된다. 상기 siRNA는 이중가닥의 RNA가 다이서에 의해 절단되어 생성되는 21-25 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각으로 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제할 수 있다. 본 발명의 목적상 CD49d에 특이적으로 작용하여 CD49d 분자를 절단하여 RNA 간섭(RNAi, RNA interference) 현상을 유도함으로써, 상기 CD49d를 억제할 수 있다. siRNA는 화학적으로 또는 효소학적으로 합성될 수 있다. siRNA의 제조방법으로는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법, 시험관 내(in vitro) 전사를 이용한 siRNA의 합성법, 시험관 내(in vitro) 전사에 의해 합성된 긴 이중-가닥 RNA를 효소를 이용하여 절단하는 방법, shRNA 발현 플라스미드나 바이러스성 벡터의 세포내 전달을 통한 발현법 및 PCR(polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트(cassette)의 세포 내 전달을 통한 발현법 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "항체"는 생체의 면역계에서 혈액이나 림프를 순환하면서 외부 물질인 항원이 침입한 경우 이에 반응하는 물질을 말하며, 림프조직에서 형성되는 글로불린계 단백질로 면역글로불린이라고도 불린다. 항체는 B세포가 생산해서 체액으로 흘려보내는 단백질로 항원과 특이적으로 결합하며, 하나의 항체 분자에는 두 개의 중사슬(heavy chain)과 두 개의 경사슬(light chain)이 있으며, 각각의 중사슬과 경사슬은 그의 N-터미널 말단에 가변영역을 갖고 있다. 각각의 가변영역은 3개의 상보성 결정부위(Complementarity determining region: CDR)와 4개의 구조형성부위(framework regions: FRs)로 구성되는데, 상보성 결정 부위들은 항체의 항원 결합 특이성을 결정하고, 가변영역의 구조형성 부위들로 유지되는 비교적 짧은 펩티드 서열로 존재한다. 본 발명의 목적상 상기 항체는 CD49d와 결합하여 CD49d의 활성을 억제할 수 있는 항체일 수 있으며, 그 예로 나탈리주맙(natalizumab)을 들 수 있다.

본 발명에서 용어, "나탈리주맙(natalizumab)"은 Elan 사와 Biogen 사가 협력하여 개발한 α4 인테그린 단일클론 항체로서, 면역세포의 부착, 이동, 활성에 관련된 세포표면 당단백군인 인테그린에 특이적으로 결합하는데, 혈관 내피를 통과하는 백혈구의 이동에 관여하며, 실질(parenchyma) 내의 세포 활성 및 생존에 기여한다. 특히, 혈관세포 부착 분자-1(VCAM-1)에 결합하는 α4β1 인테그린은 크론병 환자의 장을 포함한 수많은 만성 염증 부위의 혈관 내피에서 많이 발현되는데, 이와 같이 기존에 나탈리주맙은 크론병 및 다발성 경화증과 같은 자가면역 질환의 치료제로서 널리 알려져 있으며, Tysabri라는 상표명으로도 시판되고 있는 약제이다. 본 발명에서는 상기 나탈리주맙의 신규한 용도인 유방암과 같은 암의 치료 용도를 밝혔다. 상기 나탈리주맙은 시판되고 있는 약제이기 때문에 안정성 측면에서도 별다른 문제 또는 부작용 없이 사용이 가능하다는 장점이 있다.

본 발명에서 용어 "암"은 세포의 사멸 조절과 관련된 질병으로서, 정상적인 아팝토시스 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 질병을 일컫는다. 이러한 비정상적 과다 증식 세포들은, 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고, 체내의 정상적인 구조를 파괴하거나 변형시키게 되는데, 이러한 상태를 암이라고 한다. 일반적으로 종양 (tumor)이라 하면 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자란 덩어리를 의미하며, 양성 종양(benign tumor)과 악성 종양(malignant tumor)으로 구분할 수 있다. 악성 종양은 양성 종양에 비해 성장속도가 매우 빠르고, 주변 조직에 침윤하면서 전이(metastasis)가 일어나 생명을 위협하게 된다. 이러한 악성 종양을 통상적으로 '암(cancer)'이라 하며, 암의 종류로는 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 중프종, 식도암, 취암, 대장암, 간암, 위암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 대장암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 및 피부암을 포함하나, 상기 예들에 의해 암의 종류가 한정되는 것은 아니다. 상기 암은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 고형암이 적합할 수 있으며, 보다 바람직하게는 유방암일 수 있다.

본 발명에서 용어, "치료"는 치료하고자 하는 개개인 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위해 임상적으로 개입하는 것을 지칭하고, 이는 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키며, 전이를 예방하고, 질병 진행 속도를 감소시키며, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키며, 차도시키거나 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 바람직하게 본 발명에서는 CD49d를 억제하는 물질을 포함하는 조성물의 투여로 암의 경과를 호전시키는 모든 행위를 포함한다. 또한, "예방"은 본 발명에 따른 CD49d를 억제하는 물질을 포함하는 조성물의 투여로 상기 암의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 CD49d 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, "개체"는 본 발명의 암 질환을 보유하거나 또는 발병한, 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 약학적 조성물을 개체에 투여함으로써, 유방암을 비롯한 암을 완화 또는 치료할 수 있다. 상기 완화는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 암 질환이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.

상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 말하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 목적 또는 필요에 따라 당업계에서 사용되는 통상적인 방법, 투여 경로, 투여량에 따라 적절하게 개체에 투여될 수 있다. 투여 경로의 예로는 경구, 비경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있으며, 비경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 또한 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 약학적 조성물의 양 및 투여 횟수는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

본 발명에서의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 용도에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 혈관 투과성 증가를 억제 또는 완화하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 CD49d 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다. 상기 건강기능식품은 바람직하게는 암 형성 억제에 의하여 달성될 수 있으며, 이에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 조성물을 건강기능식품의 첨가물로 사용할 경우, 상기 CD49d 억제제를 그대로 첨가하거나 다른 건강식품 또는 그 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 조성물을 첨가할 수 있는 건강기능식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함할 수 있으며, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료의 형태로 사용될 경우에는 통상의 음료와 같이 여러 가지 감미제, 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 CD49d의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암 진단용 조성물을 제공한다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 분리된 생물학적 시료로부터 CD49d 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 발현 수준을 정상 대조구 시료의 CD49d 발현 수준과 비교하는 단계; 및 (c) 상기 생물학적 시료의 CD49 발현 수준이 정상 대조구 시료의 CD49 발현 수준보다 높을 경우 암으로 판정하는 단계를 포함하는, 암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 암 마커 CD49d를 검출하는 방법을 제공할 수 있다. 상기 암 마커 CD49d를 검출하는 방법을 통하여 암 진단에 필요한 정보를 제공함으로써, 암을 진단할 수 있다.

본 발명에서 용어, "진단"은 생물학적 시료 또는 조직 샘플에서 본 발명의 CD49d의 존재 또는 부재를 측정함으로써, 암 질환의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 또한, "마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 암 세포 또는 암 질환을 가진 개체를 정상세포 또는 정상 개체와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 암을 가진 세포 또는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산 (예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자들을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 암 진단 마커는 정상 세포 또는 조직의 세포에 비하여, 암 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 CD49d이다.

본 발명에서 "mRNA 발현 수준 측정"이란 암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 암 마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅 (Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 "단백질 발현수준 측정"이란 암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 암 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블럿, ELISA (enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩 (protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 본 발명의 CD49d의 mRNA에 대한 프라이머 (primer) 쌍, 프로브 (probe), 또는 안티센스 뉴클레오티드 (anti-sense nucleotide)일 수 있으며, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 당업자가 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 뉴클레오티드 서열을 용이하게 디자인할 수 있다. 또한, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체이다.

본 발명에서는 CD49d의 암 진단 마커로서의 가능성을 확인함으로써, CD49d의 수준을 측정하여 유방암을 비롯한 암을 진단할 수 있는 효과를 확인하였다.

본 발명의 CD49d는 유방암과 같은 암의 치료 타겟으로 적절하기 때문에, CD49d를 억제함으로써 암을 예방 또는 치료할 수 있는 약제를 개발하는 데에 응용할 수 있으며, 암 진단 마커로서의 가치 또한 가지고 있어 암의 연구 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 유방암 환자의 조직으로부터 분리된 NDY-1 구형세포의 자가 복제 능력 및 세포 표면 마커를 확인한 결과이다. 도 1의 A는 하나의 NDY-1 구형세포로부터 14일간 실시예 1의 배양조건을 유지한 결과의 세포사진이고, B는 유세포 분석기를 이용하여 중간엽 줄기 세포 마커인 CD44, CD71, CD90 및 CD105, 그리고 다양한 세포 표면 표지자인 integrins, E-cadherin, EpCAM, CD24, CD133 및 CD54를 분석한 결과이다. 비어있는 분포도는 컨트롤이며, 회색의 분포도는 해당 마커에 표지된 경우이다.
도 2는 NDY-1 구형세포로부터 만들어진 부착성 세포와 구형세포의 CD49a, CD49d 및 CD49f의 발현을 확인한 결과이다. 도 2의 A는 구형세포와 부착성 세포의 형태를 현미경으로 관찰한 사진이며, B는 각각 비부착성 배양 및 부착성 배양 14일 후, 유세포 분석기를 이용한 CD49a, CD49d 및 CD49f의 마커 발현을 확인한 결과이다. 도 2의 C는 NDY-1 구형세포가 14일간 부착성 세포의 형태로 변해 갈 때, 각각 CD49a, CD49d 및 CD49f의 마커 발현 변화량을 배양 일수에 따라 유세포 분석기로 확인한 결과이고, D는 형광 활성 유세포 분리기로 CD49a, CD49d 및 CD49f의 마커를 가지는 구형세포 분리 후 분리된 구형세포의 세포형성능력을 확인한 결과이다. 도 2의 E 및 F는 NDY-1 구형세포 및 부착성 세포의 CD49d mRNA 및 단백질 발현량을 역전사-PCR 및 웨스턴블롯팅을 수행하여 확인한 결과이다.
도 3은 CD49d^{+/ high} 구형세포의 시험관 내와 생체 내 특성을 확인한 결과이다. 도 3의 A는 CD49d 마커로 분리되지 않은 NDY-1 구형세포와 각각 CD49d가 많이 발현되거나 CD49d가 적게 발현되는 NDY-1 구형세포를 7일간 배양하여 증식능력(cell viabiity)을 측정한 결과이며, B는 CD49d가 많이 발현되거나 CD49d가 적게 발현되는 NDY-1 구형세포의 구형세포 형성(sphere formation) 능력을 확인한 현미경 사진이고, C는 형광 활성 유세포 분리기를 이용하여 각각 CD49d^{+/ high} 세포와 CD49d^{-/ low} 세포 분획으로 분리된 세포를 마우스 유선 지방층에 이종이식한 뒤 생성된 CD49d^{+/ high} 세포 종양 조직의 CD49d 마커를 조사한 결과이다.
도 4는 NDY-1 구형세포, 부착성 세포 및 CD49d^{+/ high} 세포의 이종이식 후 생성 된 종양조직의 조직학적 표현형 결과이다. 도 4의 윗부분은 H&E 염색결과를 나타내고, 아래쪽은 각각 CD49d, 비멘틴(vimentin), 사이토케라틴5/6(CK5/6)의 발현 여부를 면역조직화학법으로 확인한 결과이다.
도 5는 CD49d^{+/ high} 및 CD49d^{-/ low} 세포 분획의 독소루비신 저항성 결과이다. 도 5의 A는 각각의 세포에 10 nM의 독소루비신 처리 후 세포증식능력(cell viability)를 측정한 결과이며, B는 같은 실험에서 각각 세포의 구형세포 형성(sphere formation) 능력을 확인한 결과이다.

이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 인간 유방암 표본으로부터 구형세포( sphere )의 분리와 시험관 내( in vitro ) 증식 실험

일차 유방암 조직표본은 유방암 환자의 절제 수술을 통해 얻었다. 유방암 조직 중 95% 이상 종양조직을 포함하고 5% 미만의 평변세포를 포함하는 표본을 선별하여 준비하였다. 공지된 방법으로 유방암 조직으로부터 단일 세포를 부유화하여 준비하였다. 구체적으로, 단일세포 부양액을 얻기 위해 조직을 작은 조각으로 분리하고, 멸균된 외과용 메스로 잘게 다진 후, 완벽한 분해를 위해서 콜라게네이즈 I(collagenase I, Sigma, St. Louis, MO)과 함께 37 ℃에서 1-2시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 40-㎛ 나일론 체(nylon mesh, BD, Bedford, MA)에서 거르고, 무혈청 DMEM 배지와 F12 배지가 3:1로 섞인 배지에 20 ng/ml epidermal growth factor (EGF; Invitrogen, Carlsbad, CA), 20 ng/ml basic fibroblast growth factor (bFGF; Millipore, Temecula, CA), 10 ng/ml leukemia inhibitory factor (LIF, Millipore), B27 supplement (Invitrogen)와 antibiotic-antimycotic (Invitrogen)를 첨가 후 이 배지에 1 ml 당 1000개의 세포가 포함되도록 배양접시에 배양하였다. 세포는 비부착성 구형세포의 구획(nonadherent spherical clusters)이 형성되는 조건에서 성장하였다. 배양액은 3-4일 마다 바꿔주었고, 일주일마다 계대배양하였다.

실시예 2: 구형세포( sphere ) 형성 분석과 구형세포의 부착성 형태의 평가

일차적으로 형성된 구형세포는 0.25% Trypsin-EDTA 용액(Invitrogen)과의 처리로 분리하였고, 200 ㎕의 구형세포 배양배지가 들어있는 비접착성(ultra low attachment culture dish, BD) 96 웰(well) 배양접시에 웰당 100개의 세포가 포함되도록 배양하였다. 3일에 한번, 웰당 20 ㎕의 배양배지를 더해주었다. 배양 7일 후 각각의 웰에서 구형세포 개수를 확인하였다. 구형세포로부터 유래된 부착성 세포를 형성하기 위해서, 성장인자가 결여된 상태에서 10%의 혈청이 포함된 DMEM 배지에 부유화하고 IV형 콜라겐(Sigma)으로 코팅되어 있는 배양접시에서 2주간 배양하였다.

실시예 3: 유세포 분석( flow cytometry )과 형광 활성 유세포 분리( FACS , fluorscense-activated cell sorting )를 이용한 세포 분리

구형세포를 형성한 세포 또는 단일층을 형성한 세포를 Trypsin-EDTA 용액으로 분리하였다. 부유된 세포는 원심분리기로 모은 후, 0.1% 소혈청알부민(BSA)과 0.05% 아지드화 나트륨(sodium azide)이 포함된 유세포 분석기 완충액인 PBS 용액으로 세척하였다. 5 X 10⁵개의 세포는 형광단이 공유결합된 단일클론항체를 이용하여 공지된 방법에 따라 30분간 어두운 곳에서 염색하였다.

항-인간 CD49b, CD49c, CD49d, CD49f, CD29a 그리고 CD29a 항체들은 Serotec Laboratories (Oxford, UK) 사로부터 구매하여 사용하였다. 인간 CD24, CD44, CD54, CD90, CD49a, CD49e, CD49f 그리고 CD71에 대한 항체는 PharMingen (Biosciences, San Jose, CA) 사로부터, CD133과 CD324 항체는 Militenyi(Bergisch Gladbach, German)사와 R&D systems(Minneapolis, MN) 사로부터 각각 구입하여 사용하였다.

염색이 끝난 후, 세포는 3 ml의 유세포 분석기 완충액으로 세척하고 동일 완충액에 재부유하였다. 백그라운드 염색은 마우스 유래 형광단-아이소타입 항체와 세포를 배양하여 수행하였다. 유세포 분석은 FACSCalibur 유세포 분석기에서 5000번 분석하여 수행하였다. 형광단-활성화된 세포의 분리를 위해서 FITC가 표지된 CD49d 항체로 세포를 염색하고, 표지된 단일세포는 0.5% BSA가 포함된 PBS 완충액에 부유한 후, FACSAria 유세포 분석기를 이용하여 분리하였다. 분리된 세포 군집은 90% 이상 CD49d에 대해 양성이다. 세포 생존력은 7-amino-actinomycin D (7AAD, BD) 염색법으로 확인하였다.

실시예 4: 역전사 - PCR ( RT - PCR ) 분석

RNA는 구형세포와 부착성 세포로부터 RNA mini kit(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 분리되었고, MMLV 역전사 효소(MMLV Reverse transcriptase, Invitrogen)로 반응하였다. 얻어진 cDNA는 rTaq 폴리머라제(Takara, 일본)를 이용하여, 28 사이클 반응을 표 1에 기재된 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 증폭된 산물은 β-actin 로딩 컨트롤과 함께 2% 아가로즈 젤 전기영동으로 확인하였다.

유전자	방향	프라이머 서열	서열번호
β-actin	정방향	CACTGTGTTGGCGTACAGGT	4
	역방향	TCATCACCATTGGCAATGAG	5
CD49d	정방향	GAGTGCAATGCAGACCTTGA	6
	역방향	GCCAGCCTTCCACATAACAT	7

실시예 5: 웨스턴 블롯팅 ( western blotting ) 분석

세포는 PBS 완충액으로 두번 세척하고, 전체 세포 균질액(cell lysate)은 용균액[20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na3VO4, 1 mM dithiothreitol, 10 μg/ml leupeptin, 10 μg/ml aprotinin, 1 mM PMSF]를 이용하여 준비하였다. 단백질 농도는 Bio-Rad Protein Assay kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 Bradford assay를 통해 측정하였다. 같은 양의 세포 균질액은 10% SDS-PAGE를 이용하여 단백질을 분리하였다. 단백질 밴드는 Hybond-ECL 니트로셀룰로오스 멤브레인(Amersham Bioscience, Buckinghamshire, UK)에 전기적인 방법으로 이전하였다. 앞의 블롯은 블로킹 용액(5% non-fat dry milk in TBS-T (TBS containing 0.05% Tween-20))에서 1시간 동안 반응시키고, CD49d 마우스 단일클론 항체 및 β-actin 마우스 단일클론 면역글로불린 G 항체(Sigma)와 4 ℃에서 충분히 반응시켰다. 앞의 블롯을 TBS-T (TBS containing 0.05% Tween-20)에서 3번 세척하고, 퍼옥시다아제-결합된 토끼 유래의 항-마우스 면역글로불린 G (1:5000 희석, Jackson ImmunoResearch) 또는 퍼옥시다아제-결합된 마우스 유래의 항-토끼 면역글로불린 G와 함께 실온에서 1시간 반응시켰다. TBS-T에서 5분간 세 번 세척이 끝난 후, 면역복합체들은 화학발광법(enhanced chemiluminescence, Amersham Biosciences)으로 가시화하였다.

실시예 6: 세포증식 및 항암화학요법에 대한 민감성 평가

세포증식 분석을 위해, CD49d^{+/ high}, CD49d^{-/ low} 및 분리되지 않은 세포를 100 ㎕의 구형세포 형성 배지가 담겨있는 비부착성 96 웰 배양접시에 웰당 100개의 세포가 들어가도록 주입하였다. 7일 후, 세포 생존능력(cell viability)은 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit(Promega, Madison, WI)를 이용하여 측정하였다. 추가적으로, 세포독성을 검증하기 위하여, 분리되지 않거나 분리된 CD49d^{+/ high}, CD49d^{-/ low} 세포를 상기에서와 같이 비부착성 96 웰 배양접시로 주입하고, 10 nM의 독소루비신(doxorubicin, sigma)을 72시간 동안 처리한 후, CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit로 세포 생존능력을 확인하였다.

실시예 7: 생체 내( in vivo ) 이종조직이식 실험

5 내지 7주된 NOD/SCID 마우스(Jackson laboratory, Bar Harbor, ME)를 서울대학교 병원 동물윤리위원회의 표준화된 사육방법으로 유지하였다. 쥐에 17β-에스트라디올 펠렛 (Innovative Research of America, Sarasota, FL, USA)을 세포 주입 하루 전에 복강에 접종하였다. 부착성 성장을 하는 세포, 구형세포(10⁶, 10⁵, 10⁴, 10³, 2 × 10², 1 × 10² 개의 세포), CD49d^{+/ high} 및 CD49d^{-/ low}-분리된 세포(10⁴, 10³, 5 × 10², 2 × 10² 개의 세포)를 Matrigel (BD Pharmingen) 과 같은 비율로 섞어서 6 내지 8주된 암컷 NOD/SCID 마우스의 서혜부 유선 지방층(inguinal mammary fat pads)에 주입하였다. 상기 마우스를 눈으로 확인하고 촉진하여 암이 나타날 때까지 2주 동안 확인하였다. 암의 직경이 1 cm가 되거나 이식한지 2, 3개월 지난 후, H&E 염색을 위하여 마우스를 희생하여 조직을 얻은 후 즉시 고정하였다.

실시예 8: H&E 염색법과 면역조직화학법( Immunohistochemistry )

조직 표본은 10% 포르말린 용액에서 24시간 동안 고정하고, 파라핀 블록에 담아 고정하고, 4 ㎛ 두께로 절단하였다. 다음, 잘려진 표본은 슬라이드에 올리고 H&E 염색하였다. 면역조직화학법을 수행하기 위하여, 파라핀 절단면은 탈 파라핀화하였고, 연속적으로 수화하였다. 시트레이트 완충액(Dako, pH 6.0)과 함께 고주파 항원 노출과정(microwave antigen retrieval) 수행 후, 세포 내부 퍼옥시다아제의 활성을 막기 위해 3% 과산화수소로 처리하였다. 슬라이드는 CD49d(Abcam, Cambridge, MA) 및 vimentin(Calbiochem, San Diego, CA) 항체와 함께 상온에서 1시간 동안 반응시켰고, Envision-HRP (Dako, Glostrup, Denmark) 반응하였다. 이 반응은 3,3'-diaminobenzidine(DAB) 기질인 chromogen(DakoCytomation)을 첨가해주며 수행하였고, 헤마톡실린(hematoxylin) 대비 염색 후, 탈수화, 그리고 Histomount과 함께 커버를 덮어주었다. 영상은 Leica 현미경(CH-9435 Heerbrugg)과 Leica Application Suite을 이용하여 가시화하였다.

실험예 1: 인간 유방암으로부터 유래된 살코마스피어( sarcomasphere , NDY -1 sphere)의 확립

종양 형성 세포(TICs, tumor-initiating cells)의 증식과 분리를 위해서, 실시예 1의 방법으로, 구형세포를 유지하기 위해 최적화된 비부착성 배양 환경에서 유방암 육종 조직으로부터 분리된 세포를 배양하였다. 이들 세포는 시험관 내(in vitro)에서 1년간 구형세포로 확장해나갔고, 확립된 구형의 세포주는 NDY-1 구형세포로 명명하였다.

시험관 내(in vitro) 자가 복제(self-renewal) 능력을 측정하기 위해, 일차 구형세포는 효소적인 방법을 통해 단일세포 부유화되었고, 96 웰 배양접시에 웰당 1개의 세포가 들어가도록 하였다. 이들 각각의 세포들은 1-2주 뒤에 대략 수백 ㎛로 크기가 증가하였고 이차 구형세포를 형성하였다(도 1의 A). 이러한 결과를 통해 NDY-1 구형세포가 자가 복제 능력을 가짐을 확인할 수 있었다.

다음으로, NYD-1 구형세포에서 발현되는 세포표면 마커를 분석하였다. NYD-1 구형세포는 암 육종으로부터 유래되었으며, 중간엽 조직(mesenchymal tissue)에서 나타나는 육종으로 95% 이상 구성되었다. 상피세포 및 중간엽줄기세포(MSC, mesenchymal stem cell) 마커들의 발현 정도를 측정한 결과, NDY-1 구형세포는 E-cadherin 및 EpCAM와 같은 상피세포 마커는 발현하지 않으나, CD44(hyaluronic acid receptor), CD71(trans-ferrin receptor), CD90(Thy-1) 및 CD105(endoglin)와 같은 중간엽줄기세포 마커는 강하게 발현하고 있음을 확인하였다(도 1의 B). 면역형광법(Immunofluorescence) 실험으로 NDY-1 구형세포의 비멘틴(vimentin) 발현을 추가적으로 확인하였다.

다음으로, 유세포 분석기를 통하여 NDY-1 구형세포를 분석한 결과, 다양한 암에서 흔히 발견되는 줄기세포 마커인 CD133(prominin-1), 및 CD24(single chain sialoglycoprotein)에 대해서는 음성을 나타내나, CD54(ICAM)에 대해서는 양성을 나타내는 것을 확인하였다. 연관된 마커들을 사용하여 구형세포 안에는 다른 종류의 세포가 없는 것을 확인하였다. 기질 육종(stromal sarcoma)은 상피세포의 특징은 결여되어 있고, 다만 악성 중간엽 세포의 구성을 기본으로 하는 것으로 알려져 있기 때문에, 종합적으로 판단할 때 NDY-1 구형세포는 비 상피 세포인 중간엽 세포로부터 유래되었음을 확인할 수 있었고, 살코마스피어(sarcomashpere)임을 확인할 수 있었다.

최근 인테그린의 암화(tumorigenesis)와의 관련성이 알려지고 있으며, CD49f 및 CD29a(각각, 인테그린 α6 및 β1)는 마우스 유방 줄기세포의 마커로 사용되는 것으로 알려져 있다. 그에 따라, 실시예 3의 유세포 분석법을 이용하여 인테그린 발현 스크린을 한 결과, NDY-1 구형세포가 CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f 및 CD29a(각각, 인테그린 α1, α2, α3, α4, α5, α6 및 β1)를 높게 발현하였지만, CD29d(인테그린 β4)는 그렇지 않은 것을 확인하였다(도 1의 B).

상기와 같은 다양한 확인을 통하여, 유방암 육종 조직으로부터 분리된 NDY-1 구형세포가 종양 형성 세포로서의 특징을 가지는 살코마스피어임을 확인하고 이하 NDY-1 구형세포와 부착성 세포 간의 차이점을 분석하였다.

실험예 2: NDY -1 구형세포 및 부착성 세포의 생물학적 차이점 분석

종양 형성 세포(TICs)의 증식을 위해 실시예 1의 비부착성 배양 모델을 사용한 반면, 부착성 세포 분화는 실시예 2에 기술되어진 바대로 수행하였다. NDY-1 구형세포와 부착성 세포의 생물학적 차이를 분석하기 위하여, 구형세포로부터 만들어진 부유세포들은 콜라겐 코팅된 배양 접시에 배양하였고, 그 결과 긴 모양의 뻗은 형태를 가지는 세포로 변화하였다(도 2의 A).

비교 유세포 분석법을 수행한 결과, 부착성 세포는 구형세포와 비교하여 조양 형성능력이 감소된 것을 확인하였으며, CD71 및 CD105의 마커 발현도 감소하는 것으로 나타났다. 추가적으로 부착성 세포에서는 Bcl-2 및 Bcl-xL와 같은 항-세포사멸(anti-apotosis) 단백질의 발현 또한 감소되는 것을 확인하였다. 또한, 부착성 세포는 구형세포와 비교하여 CD49a, CD49d 및 CD49f와 같은 인테그린 마커의 발현도 급격히 감소하는 것을 확인하였다(도 2의 B). 도 2에 나타난 바와 같이, 부착 배양을 2주간 진행한 경우, CD49a, CD49d 및 CD49f 마커의 발현은 각각 71%에서 1%로, 75%에서 16%로, 90%에서 51%로 감소하였다(도 2의 C).

이러한 결과를 종합하면 유방암 육종으로부터 유래한 구형세포가 부착성 세포로 배양, 분화되면서 종양 형성 능력을 잃는다는 것을 확인할 수 있으며, CD49a, CD49d 및 CD49f와 같은 인테그린 마커의 발현 또한 감소한다는 점으로 미루어 유방암과 상기 인테그린 마커와의 상관관계를 확인할 수 있다.

추가적으로, 구형세포와 부착세포의 생체 내(in vivo) 암화(tumorigensis) 능력 비교를 위하여, 실시예 7의 방법으로 NOD/SCID 마우스의 유선지방층에 다양한 농도의 세포를 이식하였다. 표 2에 나타난 바와 같이, NDY-1 구형세포는 마우스당 100개의 세포를 이식해도 암의 형성이 나타나는 반면, 부착성 세포는 10,000개 이상의 세포를 주입하여도 암을 형성하지 못하였다(표 2). 이는 NDY-1 구형세포가 종양 형성 세포(TICs, tumor-initiating cell)이며, 부착성 배양 조건을 통해 분화하면 종양 형성 세포로서의 능력을 잃는다는 것을 뒷받침해준다.

상기에서 확인한 세 가지 인테그린 마커, CD49a, CD49d 및 CD49f가 비부착성 세포 증식과 종양 형성능력의 유지에 중요한 역할을 한다는 상관관계의 확인 하에, 형광 활성 유세포 분석기(FACS)를 이용하여 CD49a, CD49d 및 CD49f 마커에 대한 양성 및 음성으로 구분하고 종양 형성을 분석하였다. 그 결과, 세 가지 인테그린 모두에서 양성으로 구분된 세포에서 종양 형성 능력이 높음을 확인하였으며, 그 중에서도 특히 CD49d^{+/ high} 세포에서 CD49d^{-/ low} 에 비하여 현저하게 종양 형성 능력이 높음을 확인하였다(도 2의 D). 이러한 결과를 토대로 CD49d가 종양 형성과의 상관관계가 매우 높다는 것을 확인함으로써, 유방암의 치료 타겟으로서 적합함을 예측할 수 있었으며, 이에 따라 이하의 실험에서 CD49d에 초점을 맞추었다.

실험예 3: NDY -1 구형세포로부터 분리된 CD49d ^{+/ high} 세포의 시험관 내( in vitro) 특성 분석

부착성 NDY-1 구형세포의 CD49d의 발현 감소를 측정하기 위하여, 실시예 4의 RT-PCR 및 실시예 5의 면역블로팅을 이용하여 CD49d의 mRNA 발현량 및 단백질 발현량을 측정하였다. 그 결과, 부착성 NDY-1 세포에서 CD49d의 mRNA 발현량과 단백질 발현량이 감소되었음을 확인하였다(도 2의 E 및 F).

다음으로, NDY-1 구형세포를 CD49d^{+/ high} 및 CD49d^{-/ low} 구형세포 분획으로 분리하여 비교하였다. 세포 생존 능력(cell viability) 분석에서, CD49d^{-/ low} 구형세포 분획에 비하여 CD49d^{+/ high} 구형세포는 현저히 증가된 세포 증식을 보여주는 것을 확인하였다(도 3의 A).

추가적으로, CD49d^{+/ high} 및 CD49d^{-/ low} 세포 분획의 구형세포 형성 능력을 비교한 결과, CD49d^{+/ high} 세포 분획이 CD49d^{-/ low} 세포 분획에 비해 더 높은 구형세포 형성 능력을 보여주었다. 즉, CD49d^{+/ high} 세포 분획은 비부착성 배양조건에서 효과적으로 구형세포를 형성했으며, 2차, 3차의 구형세포를 만들어 내었지만, CD49d^{-/ low} 세포 분획은 그렇지 않았다(도 3의 B). 이러한 결과를 통해, CD49d^{+/ high} 세포 분획이 자기복제가 가능한 종양 형성 세포임을 확인할 수 있으며, 따라서 상기 CD49d가 종양 형성을 방해할 수 있는 치료 타겟으로서 가치가 있음을 다시 한번 확인할 수 있었다.

실험예 4: CD49d ^{+/ high} 세포 및 CD49d ^{-/ low} 세포의 생체 내( in vivo ) 특성 분석

NOD/SCID 마우스에 CD49d^{+/ high} 및 CD49d^{-/ low} 세포를 이종이식한 후, 이들 세포 분획의 종양 형성능력을 확인하였다. 각각의 CD49d^{+/ high} 세포 및 CD49d^{-/ low} 세포는 마우스 내에서 90% 이상의 충분한 생존률을 가지는 것을 확인하였다(도 3의 C).

NOD/SCID 마우스에 CD49d^{+/ high} 및 CD49d^{-/ low} 세포를 다양한 농도로 이종이식하여 종양형성능력을 비교해본 결과, 200개의 CD49d^{+/ high} 세포의 경우 200개의 세포만을 주입하더라도 종양을 형성하는 반면, CD49d^{-/ low} 세포의 경우 1,000개 이상의 세포를 주입하고 3개월이 지나도 종양이 잘 형성되지 않았다. 이러한 결과는 NDY-1 구형세포로부터 분리된 세포 중에서 CD49d^{+/ high} 세포 분획이 종양 형성 세포(TICs)임을 확인해 준다(표 3).

CD49d^{+/ high} 세포 분획에서 이종이식되어 생성된 암 조직이 NDY-1 구형세포와 같은 특징을 유지하는지 알아보기 위하여, 형성된 이종종양조직의 세포에 대하여 유세포 분석기를 사용하여 CD49d 발현 분석을 하였다. 이 때, H2K(mouse histocompatibility class I) 마커를 이용하여, 마우스로부터 유입된 세포를 제거하였다. CD49d^{+/ high} 세포 분획에서 이종이식되어 생성된 종양 조직은 NDY-1 구형세포 CD49d의 발현 마커 분석 결과와 유사한 결과를 나타내었다(도 3의 C). 이를 통해, CD49d^+/high 세포 분획이 NDY-1 구형세포가 종양 형성 능력을 가지도록 하는 세포임을 확인할 수 있었다.

한편, 이종이식조직에 대한 H&E 염색을 통한 조직학적 분석에서, CD49d^{+/ high} 세포 분획 유래의 종양은 대체적으로 NDY-1 구형세포 유래의 종양과 유사한 형태를 나타내었다. 또한, 면역염색법 실험에서는 모든 종류의 종양이 비멘틴을 강하게 발현하고 사이토케라틴 5/6에 음성인 반면, CD49d 마커에 대해서는 부착성 세포가 유래의 종양에서는 낮은 발현을 보인다는 것을 확인하였다(도 4).

실험예 5: CD49d ^{+/ high} 세포의 독소루비신 저항성 평가

종양 형성 세포의 일부는 항암화학요법에 저항성을 가지는 것으로 알려져 있다. CD49d^{+/ high} 및 CD49d^{-/ low} 세포 분획을 10 nM의 독소루비신을 처리하여 3일 동안 배양 후 세포생존능력을 평가한 결과, CD49d^{+/ high} 세포 분획은 CD49d^{-/ low} 세포 분획보다 6배 이상 독소루비신에 대한 저항성을 보여주었다(도 5의 A). 또한, 독소루비신 처리한 CD49d^{+/ high} 및 CD49d^{-/ low} 세포 분획의 스피어 형성 크기를 분석한 결과, CD49d^+/high 세포분획에서는 100 ㎛ 이상의 크기를 가지는 구형세포가 52% 정도였지만, CD49d^{-/ low} 세포분획은 100 ㎛ 이상의 구형세포를 형성하지 못하였다(도 5의 B). 이러한 결과를 통해 종양 형성 세포(TICs)인 CD49d^{+/ high} 세포분획이 항암제에 저항성을 가짐을 확인할 수 있었다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Composition for preventing or treating cancer comprising CD49d inhibitor <130> PA120994KR <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1032 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Trp Glu Ala Arg Arg Glu Pro Gly Pro Arg Arg Ala Ala Val 1 5 10 15 Arg Glu Thr Val Met Leu Leu Leu Cys Leu Gly Val Pro Thr Gly Arg 20 25 30 Pro Tyr Asn Val Asp Thr Glu Ser Ala Leu Leu Tyr Gln Gly Pro His 35 40 45 Asn Thr Leu Phe Gly Tyr Ser Val Val Leu His Ser His Gly Ala Asn 50 55 60 Arg Trp Leu Leu Val Gly Ala Pro Thr Ala Asn Trp Leu Ala Asn Ala 65 70 75 80 Ser Val Ile Asn Pro Gly Ala Ile Tyr Arg Cys Arg Ile Gly Lys Asn 85 90 95 Pro Gly Gln Thr Cys Glu Gln Leu Gln Leu Gly Ser Pro Asn Gly Glu 100 105 110 Pro Cys Gly Lys Thr Cys Leu Glu Glu Arg Asp Asn Gln Trp Leu Gly 115 120 125 Val Thr Leu Ser Arg Gln Pro Gly Glu Asn Gly Ser Ile Val Thr Cys 130 135 140 Gly His Arg Trp Lys Asn Ile Phe Tyr Ile Lys Asn Glu Asn Lys Leu 145 150 155 160 Pro Thr Gly Gly Cys Tyr Gly Val Pro Pro Asp Leu Arg Thr Glu Leu 165 170 175 Ser Lys Arg Ile Ala Pro Cys Tyr Gln Asp Tyr Val Lys Lys Phe Gly 180 185 190 Glu Asn Phe Ala Ser Cys Gln Ala Gly Ile Ser Ser Phe Tyr Thr Lys 195 200 205 Asp Leu Ile Val Met Gly Ala Pro Gly Ser Ser Tyr Trp Thr Gly Ser 210 215 220 Leu Phe Val Tyr Asn Ile Thr Thr Asn Lys Tyr Lys Ala Phe Leu Asp 225 230 235 240 Lys Gln Asn Gln Val Lys Phe Gly Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Val Gly 245 250 255 Ala Gly His Phe Arg Ser Gln His Thr Thr Glu Val Val Gly Gly Ala 260 265 270 Pro Gln His Glu Gln Ile Gly Lys Ala Tyr Ile Phe Ser Ile Asp Glu 275 280 285 Lys Glu Leu Asn Ile Leu His Glu Met Lys Gly Lys Lys Leu Gly Ser 290 295 300 Tyr Phe Gly Ala Ser Val Cys Ala Val Asp Leu Asn Ala Asp Gly Phe 305 310 315 320 Ser Asp Leu Leu Val Gly Ala Pro Met Gln Ser Thr Ile Arg Glu Glu 325 330 335 Gly Arg Val Phe Val Tyr Ile Asn Ser Gly Ser Gly Ala Val Met Asn 340 345 350 Ala Met Glu Thr Asn Leu Val Gly Ser Asp Lys Tyr Ala Ala Arg Phe 355 360 365 Gly Glu Ser Ile Val Asn Leu Gly Asp Ile Asp Asn Asp Gly Phe Glu 370 375 380 Asp Val Ala Ile Gly Ala Pro Gln Glu Asp Asp Leu Gln Gly Ala Ile 385 390 395 400 Tyr Ile Tyr Asn Gly Arg Ala Asp Gly Ile Ser Ser Thr Phe Ser Gln 405 410 415 Arg Ile Glu Gly Leu Gln Ile Ser Lys Ser Leu Ser Met Phe Gly Gln 420 425 430 Ser Ile Ser Gly Gln Ile Asp Ala Asp Asn Asn Gly Tyr Val Asp Val 435 440 445 Ala Val Gly Ala Phe Arg Ser Asp Ser Ala Val Leu Leu Arg Thr Arg 450 455 460 Pro Val Val Ile Val Asp Ala Ser Leu Ser His Pro Glu Ser Val Asn 465 470 475 480 Arg Thr Lys Phe Asp Cys Val Glu Asn Gly Trp Pro Ser Val Cys Ile 485 490 495 Asp Leu Thr Leu Cys Phe Ser Tyr Lys Gly Lys Glu Val Pro Gly Tyr 500 505 510 Ile Val Leu Phe Tyr Asn Met Ser Leu Asp Val Asn Arg Lys Ala Glu 515 520 525 Ser Pro Pro Arg Phe Tyr Phe Ser Ser Asn Gly Thr Ser Asp Val Ile 530 535 540 Thr Gly Ser Ile Gln Val Ser Ser Arg Glu Ala Asn Cys Arg Thr His 545 550 555 560 Gln Ala Phe Met Arg Lys Asp Val Arg Asp Ile Leu Thr Pro Ile Gln 565 570 575 Ile Glu Ala Ala Tyr His Leu Gly Pro His Val Ile 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Glu Thr Cys 785 790 795 800 Met Val Glu Lys Met Asn Leu Thr Phe His Val Ile Asn Thr Gly Asn 805 810 815 Ser Met Ala Pro Asn Val Ser Val Glu Ile Met Val Pro Asn Ser Phe 820 825 830 Ser Pro Gln Thr Asp Lys Leu Phe Asn Ile Leu Asp Val Gln Thr Thr 835 840 845 Thr Gly Glu Cys His Phe Glu Asn Tyr Gln Arg Val Cys Ala Leu Glu 850 855 860 Gln Gln Lys Ser Ala Met Gln Thr Leu Lys Gly Ile Val Arg Phe Leu 865 870 875 880 Ser Lys Thr Asp Lys Arg Leu Leu Tyr Cys Ile Lys Ala Asp Pro His 885 890 895 Cys Leu Asn Phe Leu Cys Asn Phe Gly Lys Met Glu Ser Gly Lys Glu 900 905 910 Ala Ser Val His Ile Gln Leu Glu Gly Arg Pro Ser Ile Leu Glu Met 915 920 925 Asp Glu Thr Ser Ala Leu Lys Phe Glu Ile Arg Ala Thr Gly Phe Pro 930 935 940 Glu Pro Asn Pro Arg Val Ile Glu Leu Asn Lys Asp Glu Asn Val Ala 945 950 955 960 His Val Leu Leu Glu Gly Leu His His Gln Arg Pro Lys Arg Tyr Phe 965 970 975 Thr Ile Val Ile Ile Ser Ser Ser Leu Leu Leu Gly Leu Ile Val Leu 980 985 990 Leu Leu Ile Ser Tyr Val Met Trp Lys Ala Gly Phe Phe 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tcttccccgt tggccaaccg tcgcatcccg tgcaactttg 720 gggtagtggc cgtttagtgt tgaatgttcc ccaccgagag cgcatggctt gggaagcgag 780 gcgcgaaccc ggcccccgaa gggccgccgt ccgggagacg gtgatgctgt tgctgtgcct 840 gggggtcccg accggccgcc cctacaacgt ggacactgag agcgcgctgc tttaccaggg 900 cccccacaac acgctgttcg gctactcggt cgtgctgcac agccacgggg cgaaccgatg 960 gctcctagtg ggtgcgccca ctgccaactg gctcgccaac gcttcagtga tcaatcccgg 1020 ggcgatttac agatgcagga tcggaaagaa tcccggccag acgtgcgaac agctccagct 1080 gggtagccct aatggagaac cttgtggaaa gacttgtttg gaagagagag acaatcagtg 1140 gttgggggtc acactttcca gacagccagg agaaaatgga tccatcgtga cttgtgggca 1200 tagatggaaa aatatatttt acataaagaa tgaaaataag ctccccactg gtggttgcta 1260 tggagtgccc cctgatttac gaacagaact gagtaaaaga atagctccgt gttatcaaga 1320 ttatgtgaaa aaatttggag aaaattttgc atcatgtcaa gctggaatat ccagttttta 1380 cacaaaggat ttaattgtga tgggggcccc aggatcatct tactggactg gctctctttt 1440 tgtctacaat ataactacaa ataaatacaa ggctttttta gacaaacaaa atcaagtaaa 1500 atttggaagt tatttaggat attcagtcgg agctggtcat tttcggagcc agcatactac 1560 cgaagtagtc ggaggagctc ctcaacatga gcagattggt aaggcatata tattcagcat 1620 tgatgaaaaa gaactaaata tcttacatga aatgaaaggt aaaaagcttg gatcgtactt 1680 tggagcttct gtctgtgctg tggacctcaa tgcagatggc ttctcagatc tgctcgtggg 1740 agcacccatg cagagcacca tcagagagga aggaagagtg tttgtgtaca tcaactctgg 1800 ctcgggagca gtaatgaatg caatggaaac aaacctcgtt ggaagtgaca aatatgctgc 1860 aagatttggg gaatctatag ttaatcttgg cgacattgac aatgatggct ttgaagatgt 1920 tgctatcgga gctccacaag aagatgactt gcaaggtgct atttatattt acaatggccg 1980 tgcagatggg atctcgtcaa ccttctcaca gagaattgaa ggacttcaga tcagcaaatc 2040 gttaagtatg tttggacagt ctatatcagg acaaattgat gcagataata atggctatgt 2100 agatgtagca gttggtgctt ttcggtctga ttctgctgtc ttgctaagga caagacctgt 2160 agtaattgtt gacgcttctt taagccaccc tgagtcagta aatagaacga aatttgactg 2220 tgttgaaaat ggatggcctt ctgtgtgcat agatctaaca ctttgtttct catataaggg 2280 caaggaagtt ccaggttaca ttgttttgtt ttataacatg agtttggatg tgaacagaaa 2340 ggcagagtct ccaccaagat tctatttctc ttctaatgga acttctgacg tgattacagg 2400 aagcatacag gtgtccagca gagaagctaa ctgtagaaca catcaagcat ttatgcggaa 2460 agatgtgcgg gacatcctca ccccaattca gattgaagct gcttaccacc ttggtcctca 2520 tgtcatcagt aaacgaagta cagaggaatt cccaccactt cagccaattc ttcagcagaa 2580 gaaagaaaaa gacataatga aaaaaacaat aaactttgca aggttttgtg cccatgaaaa 2640 ttgttctgct gatttacagg tttctgcaaa gattgggttt ttgaagcccc atgaaaataa 2700 aacatatctt gctgttggga gtatgaagac attgatgttg aatgtgtcct tgtttaatgc 2760 tggagatgat gcatatgaaa cgactctaca tgtcaaacta cccgtgggtc tttatttcat 2820 taagatttta gagctggaag agaagcaaat aaactgtgaa gtcacagata actctggcgt 2880 ggtacaactt gactgcagta ttggctatat atatgtagat catctctcaa ggatagatat 2940 tagctttctc ctggatgtga gctcactcag cagagcggaa gaggacctca gtatcacagt 3000 gcatgctacc tgtgaaaatg aagaggaaat ggacaatcta aagcacagca gagtgactgt 3060 agcaatacct ttaaaatatg aggttaagct gactgttcat gggtttgtaa acccaacttc 3120 atttgtgtat ggatcaaatg atgaaaatga gcctgaaacg tgcatggtgg agaaaatgaa 3180 cttaactttc catgttatca acactggcaa tagtatggct cccaatgtta gtgtggaaat 3240 aatggtacca aattctttta gcccccaaac tgataagctg ttcaacattt tggatgtcca 3300 gactactact ggagaatgcc actttgaaaa ttatcaaaga gtgtgtgcat tagagcagca 3360 aaagagtgca atgcagacct tgaaaggcat agtccggttc ttgtccaaga ctgataagag 3420 gctattgtac tgcataaaag ctgatccaca ttgtttaaat ttcttgtgta attttgggaa 3480 aatggaaagt ggaaaagaag ccagtgttca tatccaactg gaaggccggc catccatttt 3540 agaaatggat gagacttcag cactcaagtt tgaaataaga gcaacaggtt ttccagagcc 3600 aaatccaaga gtaattgaac taaacaagga tgagaatgtt gcgcatgttc tactggaagg 3660 actacatcat caaagaccca aacgttattt caccatagtg attatttcaa gtagcttgct 3720 acttggactt attgtacttc tgttgatctc atatgttatg tggaaggctg gcttctttaa 3780 aagacaatac aaatctatcc tacaagaaga aaacagaaga gacagttgga gttatatcaa 3840 cagtaaaagc aatgatgatt aaggacttct ttcaaattga gagaatggaa aacagactca 3900 ggttgtagta aagaaattta aaagacactg tttacaagaa aaaatgaatt ttgtttggac 3960 ttcttttact catgatcttg tgacatatta tgtcttcatg caaggggaaa atctcagcaa 4020 tgattactct ttgagataga agaactgcaa aggtaataat acagccaaag ataatctctc 4080 agcttttaaa tgggtagaga aacactaaag cattcaattt attcaagaaa agtaagccct 4140 tgaagatatc ttgaaatgaa agtataactg agttaaatta tactggagaa gtcttagact 4200 tgaaatacta cttaccatat gtgcttgcct cagtaaaatg aaccccactg ggtgggcaga 4260 ggttcatttc aaatacatct ttgatacttg ttcaaaatat gttctttaaa aatataattt 4320 tttagagagc tgttcccaaa ttttctaacg agtggaccat tatcacttta aagcccttta 4380 tttataatac atttcctacg ggctgtgttc caacaaccat tttttttcag cagactatga 4440 atattatagt attataggcc aaactggcaa acttcagact gaacatgtac actggtttga 4500 gcttagtgaa attacttctg gataattatt tttttataat tatggatttc accatctttc 4560 tttctgtata tatacatgtg tttttatgta ggtatatatt taccattctt cctatctatt 4620 cttcctataa cacaccttta tcaagcatac ccaggagtaa tcttcaaatc ttttgttata 4680 ttctgaaaca aaagattgtg agtgttgcac tttacctgat acacgctgat ttagaaaata 4740 cagaaaccat acctcactaa taactttaaa atcaaagctg tgcaaagact agggggccta 4800 tacttcatat gtattatgta ctatgtaaaa tattgactat cacacaacta tttccttgga 4860 tgtaattctt tgttaccctt tacaagtata agtgttacct tacatggaaa cgaagaaaca 4920 aaattcataa atttaaattc ataaatttag ctgaaagata ctgattcaat ttgtatacag 4980 tgaatataaa tgagacgaca gcaaaatttt catgaaatgt aaaatatttt tatagtttgt 5040 tcatactata tgaggttcta ttttaaatga ctttctggat tttaaaaaat ttctttaaat 5100 acaatcattt ttgtaatatt tattttatgc ttatgatcta gataattgca gaatatcatt 5160 ttatctgact ctgccttcat aagagagctg tggccgaatt ttgaacatct gttataggga 5220 gtgatcaaat tagaaggcaa tgtggaaaaa caattctggg aaagatttct ttatatgaag 5280 tccctgccac tagccagcca tcctaattga tgaaagttat ctgttcacag gcctgcagtg 5340 atggtgagga atgttctgag atttgcgaag gcatttgagt agtgaaatgt aagcacaaaa 5400 cctcctgaac ccagagtgtg tatacacagg aataaacttt atgacattta tgtattttta 5460 aaaaactttg tatcgttata aaaaggctag tcattctttc aggagaacat ctaggatcat 5520 agatgaaaaa tcaagccccg atttagaact gtcttctcca ggatggtctc taaggaaatt 5580 tacatttggt tctttcctac tcagaactac tcagaaacaa ctatatattt caggttatct 5640 gagcacagtg aaagcagagt actatggttg tccaacacag gcctctcaga tacaagggga 5700 acacaattac atattgggct agattttgcc cagttcaaaa tagtatttgt tatcaactta 5760 ctttgttact tgtatcatga attttaaaac cctaccactt taagaagaca gggatgggtt 5820 attctttttt ggcaggtagg ctatataact atgtgatttt gaaatttaac tgctctggat 5880 tagggagcag tgaatcaagg cagacttatg aaatctgtat tatatttgta acagaatata 5940 ggaaatttaa cataattgat gagctcaaat cctgaaaaat gaaagaatcc aaattatttc 6000 agaattatct aggttaaata ttgatgtatt atgatggttg caaagttttt ttgtgtgtcc 6060 aataaacaca ttgtaaaaaa aa 6082 <210> 3 <211> 3099 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atggcttggg aagcgaggcg cgaacccggc ccccgaaggg ccgccgtccg ggagacggtg 60 atgctgttgc tgtgcctggg ggtcccgacc ggccgcccct acaacgtgga cactgagagc 120 gcgctgcttt accagggccc ccacaacacg ctgttcggct actcggtcgt gctgcacagc 180 cacggggcga accgatggct cctagtgggt gcgcccactg ccaactggct cgccaacgct 240 tcagtgatca atcccggggc gatttacaga tgcaggatcg gaaagaatcc cggccagacg 300 tgcgaacagc tccagctggg tagccctaat ggagaacctt gtggaaagac ttgtttggaa 360 gagagagaca atcagtggtt gggggtcaca ctttccagac agccaggaga aaatggatcc 420 atcgtgactt gtgggcatag atggaaaaat atattttaca taaagaatga aaataagctc 480 cccactggtg gttgctatgg agtgccccct gatttacgaa cagaactgag taaaagaata 540 gctccgtgtt atcaagatta tgtgaaaaaa tttggagaaa attttgcatc atgtcaagct 600 ggaatatcca gtttttacac aaaggattta attgtgatgg gggccccagg atcatcttac 660 tggactggct ctctttttgt ctacaatata actacaaata aatacaaggc ttttttagac 720 aaacaaaatc aagtaaaatt tggaagttat ttaggatatt cagtcggagc tggtcatttt 780 cggagccagc atactaccga agtagtcgga ggagctcctc aacatgagca gattggtaag 840 gcatatatat tcagcattga tgaaaaagaa ctaaatatct tacatgaaat gaaaggtaaa 900 aagcttggat cgtactttgg agcttctgtc tgtgctgtgg acctcaatgc agatggcttc 960 tcagatctgc tcgtgggagc acccatgcag agcaccatca gagaggaagg aagagtgttt 1020 gtgtacatca actctggctc gggagcagta atgaatgcaa tggaaacaaa cctcgttgga 1080 agtgacaaat atgctgcaag atttggggaa tctatagtta atcttggcga cattgacaat 1140 gatggctttg aagatgttgc tatcggagct ccacaagaag atgacttgca aggtgctatt 1200 tatatttaca atggccgtgc agatgggatc tcgtcaacct tctcacagag aattgaagga 1260 cttcagatca gcaaatcgtt aagtatgttt ggacagtcta tatcaggaca aattgatgca 1320 gataataatg gctatgtaga tgtagcagtt ggtgcttttc ggtctgattc tgctgtcttg 1380 ctaaggacaa gacctgtagt aattgttgac gcttctttaa gccaccctga gtcagtaaat 1440 agaacgaaat ttgactgtgt tgaaaatgga tggccttctg tgtgcataga tctaacactt 1500 tgtttctcat ataagggcaa ggaagttcca ggttacattg ttttgtttta taacatgagt 1560 ttggatgtga acagaaaggc agagtctcca ccaagattct atttctcttc taatggaact 1620 tctgacgtga ttacaggaag catacaggtg tccagcagag aagctaactg tagaacacat 1680 caagcattta tgcggaaaga tgtgcgggac atcctcaccc caattcagat tgaagctgct 1740 taccaccttg gtcctcatgt catcagtaaa cgaagtacag aggaattccc accacttcag 1800 ccaattcttc agcagaagaa agaaaaagac ataatgaaaa aaacaataaa ctttgcaagg 1860 ttttgtgccc atgaaaattg ttctgctgat ttacaggttt ctgcaaagat tgggtttttg 1920 aagccccatg aaaataaaac atatcttgct gttgggagta tgaagacatt gatgttgaat 1980 gtgtccttgt ttaatgctgg agatgatgca tatgaaacga ctctacatgt caaactaccc 2040 gtgggtcttt atttcattaa gattttagag ctggaagaga agcaaataaa ctgtgaagtc 2100 acagataact ctggcgtggt acaacttgac tgcagtattg 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tgatctcata tgttatgtgg 3000 aaggctggct tctttaaaag acaatacaaa tctatcctac aagaagaaaa cagaagagac 3060 agttggagtt atatcaacag taaaagcaat gatgattaa 3099 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin forward primer <400> 4 cactgtgttg gcgtacaggt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin reverse primer <400> 5 tcatcaccat tggcaatgag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD49d forward primer <400> 6 gagtgcaatg cagaccttga 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD49d reverse primer <400> 7 gccagccttc cacataacat 20

Claims (10)

1. CD49d 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 CD49d 억제제는 CD49d mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드, 또는 CD49d 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것인 조성물.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 CD49d mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드는 CD49d에 특이적인 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 앱타머(aptamer) 또는 siRNA인 것인 조성물.
   
4. 제2항에 있어서, 상기 CD49d 단백질의 활성을 억제하는 항체는 나탈리주맙(natalizumab)인 것인 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 암의 예방 또는 치료는 암 형성 억제에 의하여 달성되는 것인 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 암은 유방암인 것인 조성물.
   
7. CD49d 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법.
   
8. CD49d 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
   
9. CD49d의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암 진단용 조성물.
   
10. (a) 분리된 생물학적 시료로부터 CD49d 발현 수준을 측정하는 단계;
    (b) 상기 발현 수준을 정상 대조구 시료의 CD49d 발현 수준과 비교하는 단계; 및
    (c) 상기 생물학적 시료의 CD49 발현 수준이 정상 대조구 시료의 CD49 발현 수준보다 높을 경우 암으로 판정하는 단계를 포함하는, 암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 암 마커 CD49d를 검출하는 방법.
    

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