CN115820650A - 一种特异性识别并结合整合素α4的核酸适体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种特异性识别并结合整合素α4的核酸适体及其应用。一方面，该核酸适体可用于诊断和评估慢性淋巴细胞白血病患者的生存和预后。另一方面，该核酸适体也可用于镰状细胞疾病阻断试剂，缓解血管闭塞疼痛，甚至降低血管闭塞疼痛的发生率。本发明方法具有以下显著优势：1)发现一种特异性识别并结合整合素α4的核酸适体；2)该核酸适体是以活细胞筛选获得，具有更强的临床运用价值和适用性；3)该核酸适体可用于诊断或者治疗与整合素α4相关的临床疾病，包括慢性淋巴细胞白血病和镰状细胞疾病等；4)核酸适体可通过化学合成、生产批次之间重复性好、成本低、易储存，为临床疾病的诊断和治疗提供了新的方法和途径。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及特异性识别并结合整合素α4的核酸适体及其在制备相关临床疾病诊断和治疗制剂中的运用。
背景技术
整合素是细胞膜上的一类跨膜异二聚体蛋白，由两个非共价结合的跨膜亚基，即α和β亚基组成。到目前为止，科学家们发现的整合素种类约有24种，由18种α亚基和8种β亚基组合构成，其主要功能是介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质(ECM)的粘附。此外，整合素由细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域三部分组成，可实时介导细胞和细胞外基质的信号转导，在细胞讯息、调节细胞的生长与发育、细胞形态以及细胞迁移中发挥着重要作用。其中整合素α4(CD49d)主要包含两种蛋白分子，分别是α4β1(VLA-4)和α4β7。而α4β1主要表达于干细胞、祖细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、自然杀伤细胞以及嗜酸性粒细胞。在生理环境中，α4β1通过与血管细胞粘附分子(VCAM-1)或纤连蛋白(Fibronectin)的相互作用，可促进白细胞迁移至炎症部位，促进机体免疫系统的炎症反应，即发挥介导免疫细胞定植、粘附于炎症或损伤部位的作用。因此，整合素α4与临床上众多疾病的发生和发展有着密切联系，成为诸多疾病诊断和治疗的潜在靶点。
镰状细胞疾病是一种遗传性的血红蛋白分子功能紊乱疾病。其主要原因是，红细胞中血红蛋白A的β链第6位谷氨酸被缬氨酸所代替，而形成异常血红蛋白S(HbS)。在低氧状态下，HbS溶解度锐减而聚集成管状﹐使红细胞扭曲成镰刀状，即发生镰变。同时伴随着红细胞功能发生异常，从而诱发一系列严重的临床症状，包括溶血、炎症以及血管闭塞等。一方面，现临床上对镰状细胞疾病有较多的诊断方法，包括血常规、血细胞涂片检查，血红蛋白电泳以及基因筛查等。但依然面临检测成本高，需要专业技术人员，灵敏度低，存在较高的假阳性和假阴性等诸多问题。而且，对于镰状细胞疾病诱发的血管闭塞疼痛(VOE)的诊断仍缺乏明确，且可定量的生物标志物，仅能依靠患者的自我陈述，这也将直接影响临床医生的用药和治疗。另一方面，基于镰状细胞疾病的发病机制和临床症状，也开发了一系列治疗药物和治疗策略，包括抑制异常血红蛋白HbS的聚合，减少镰状红细胞和溶血的羟基脲；阻断血管内皮粘附，减少溶血和血管闭塞的L-谷氨酰胺；抗感染常用药物阿莫西林、青霉素或者克拉维酸；以及缓解患者疼痛的阿片类止痛药等。但是，对于镰状细胞疾病，最有治愈希望的方法仍然是骨髓移植或者造血干细胞移植，以及正在探索的基因治疗。除此之外，其它大部分新开发的治疗药物仍在临床验证阶段，而被批准用于临床治疗且治疗效果良好的药物仍然很匮乏。
核酸适体是基于指数富集配体系统进化技术从核酸文库中筛选获得的能够特异性识别靶标的单链DNA或RNA，一般由15-60个碱基组成。此外，核酸适体分子量小、高特异性、高亲和力、识别靶标广泛，而且可以批量化学合成，成本低，稳定性强，在实际临床运用时可以大大降低生产成本，被誉为“化学家的抗体”。最重要的是，核酸适体作为一种新兴的识别配体，由于其自身的众多优势，已经在众多临床疾病的诊断和治疗中崭露头角，具有巨大的临床运用潜力。
本发明基于Cell-SELEX技术，以人红白血病细胞HEL为正筛细胞，成功筛选获得能够特异性识别并结合细胞膜表面整合素α4的核酸适体WTT-8。一方面，该核酸适体可作为识别探针，用于诊断和评估慢性淋巴细胞白血病患者的生存和预后。另一方面，该核酸适体也可作为镰状细胞疾病阻断剂，缓解血管闭塞疼痛，甚至降低血管闭塞疼痛的发生率，为与整合素α4相关临床疾病的诊断和治疗提供新策略。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种高特异性、高亲和力结合细胞膜表面整合素α4的核酸适体。本发明提供的具体实施方案如下：
所述的特异性识别并结合细胞膜表面整合素α4的核酸适体，命名为WTT-8，其序列为：5’-ATCCAGAGTGACGCAGCATGGATCCGCGGATGCAAACGCCTGTTAAGGGGACGGAACACTTGATGGACACGGTGGCTTAGT-3’，见SEQ NO.1。
进一步地，通过对所述的核酸适体WTT-8进行部分碱基删减，或者碱基替换之后，获得具有相同功能的核酸适体WTT-8d序列如下：
5’-TGGATCCGCGGATGCAAACGCCTGTTAAGGGGACGGAACACTTGA-3’，见SEQ NO.2。
更进一步地，对所述的核酸适体WTT-8和WTT-8d标记上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、或酶标记物质，可得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物。
本发明还提供了所述的核酸适体在制备慢性淋巴细胞白血病患者生存预后制剂中的应用。具体应用如下：
1).使用2mL规格的EDTA-K2抗凝管采集患者外周血2mL，室温保存；
2).将2mL外周血加入至20mL 1×ACK红细胞裂解液中，室温裂解10min。之后400g，25℃，离心5min，收白细胞(WBCs)，使用5mL DPBS(含2％ FBS)洗涤细胞一次。再使用Binding Buffer重悬细胞并计数，置于冰上备用；
3).设置样品分组，每组细胞样品为5×105WBCs，150μL体系，并分别加入Library(cy5)，WTT-8(cy5)和WTT-8d(cy5)至终浓度为200nM，而且每条核酸适体设置3组平行样品，再置于200rpm水平摇床，冰浴40min。孵育结束之后，使用Washing Buffer洗涤细胞一次，用于后续的流式分析；
4).通过流式分析样品中aptamer+细胞数量占WBCs数量的比例，以30％的aptamer+阳性细胞为阈值将CLL患者分为两个预后不同的亚组，用于评估CLL患者的预后和生存率，从而指导临床用药。
本发明还提供了所述的核酸适体在制备镰状细胞疾病患者诊断、生存预后制剂中的应用。
具体应用如下：
1).使用2mL规格的EDTA-K2抗凝管采集患者外周血2mL，室温保存(需累积采集至少100例实际临床样本)；
2).吸取100μL全血，使用5mL DPBS(含2％ FBS)洗涤细胞一次，再使用BindingBuffer重悬细胞并计数，置于冰上备用；
3).设置样品分组，每组样品为5×105细胞，150μL体系，并分别加入Library(cy5)，WTT-8(cy5)和WTT-8d(cy5)至终浓度为200nM，而且每条核酸适体设置3组平行样品，再置于200rpm水平摇床，冰浴40min。孵育结束之后，使用Washing Buffer洗涤细胞一次，用于后续的流式分析；
4).通过流式分析样品中核酸适体结合细胞的平均荧光强度(MFI)，即镰状红细胞表面CD49d的表达水平；同时与患者的临床症状和诊断结果一起建立预测模型；从而判断CD49d的表达水平是否可以作为评估镰状细胞疾病症状的最佳变量；最后，通过ROC曲线获得CD49d的表达水平的最佳阈值，用于评估和诊断镰状细胞疾病。
本发明还提供了所述的核酸适体在制备镰状细胞疾病治疗试剂中的应用；用于治疗血管闭塞疼痛。
本发明还提供了镰状细胞疾病治疗试剂，包括所述的核酸适体。
本发明相对现有技术的优势：1)提供了一种特异性识别并结合细胞膜表面整合素α4的核酸适体，并建立了基于核酸适体诊断和治疗临床上与整合素α4相关疾病的方法，具有巨大的临床应用潜力。2)利用核酸适体可以分析慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者肿瘤细胞中CD49d+细胞的含量，从而评估患者的生存和预后。3)利用核酸适体可以分析镰状细胞疾病患者体内镰状网织红细胞CD49d的表达情况，从而诊断和评估疾病的症状，指导临床用药。4)利用核酸适体作为阻断试剂，可以缓解血管闭塞疼痛，甚至降低血管闭塞疼痛的发生率，为镰状细胞疾病的治疗提供新策略。5)核酸适体具有分子量小、高特异性和亲和力、识别靶标广泛，可批量化学合成，成本低，稳定性强等诸多优势。6)为临床上其它与整合素α4相关的疾病提供了新的诊断和治疗方法，具有重要的临床意义。
附图说明
图1核酸适体WTT-8结合人红白血病细胞HEL的流式和共聚焦表征。
图1A为流式分析核酸适体WTT-8结合正筛细胞HEL情况。
图1B为共聚焦分析核酸适体WTT-8结合正筛细胞HEL情况。
图2核酸适体WTT-8序列的截短与优化以及表观解离常数(Kd)计算。
图2A为NUPACK预测核酸适体WTT-8和WTT-8d的二级结构。
图2B为流式分析核酸适体WTT-8和WTT-8d结合HEL情况。
图2C为核酸适体WTT-8和WTT-8d结合HEL的几何平均荧光强度(GMFI)统计结果。
图2D为核酸适体WTT-8和WTT-8d结合HEL细胞靶标位点情况。
图2E为核酸适体WTT-8和WTT-8d的Kd值测定。
图3核酸适体WTT-8结合HEL细胞膜蛋白分析。
图4核酸适体WTT-8富集蛋白和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。
图5Western blot分析核酸适体WTT-8富集靶蛋白样品中CD49d的含量。
图6质粒过表达和siRNA干扰实验证明核酸适体WTT-8特异性结合细胞膜表面CD49d蛋白。
图6A为Western blot分析HEK293细胞过表达CD49d情况。
图6B为流式分析HEK293细胞过表达CD49d情况。
图6C为流式分析核酸适体WTT-8与过表达CD49d的HEK293细胞的结合情况。
图6D为Western blot分析HEL细胞敲低CD49d情况。
图6E为流式分析HEL细胞敲低CD49d情况。
图6F为流式分析核酸适体WTT-8与敲低CD49d的HEL细胞的结合情况。
图7核酸适体WTT-8内化能力分析和温度对核酸适体WTT-8结合影响分析。
图7A为流式分析温度对核酸适体WTT-8结合HEL细胞的影响。
图7B为流式分析核酸适体WTT-8内化进入HEL细胞情况。
图8核酸适体WTT-8识别并结合网织红细胞分析。
图8A-B为流式分析网织红细胞CD49d表达情况。
图8C-D为流式分析核酸适体WTT-8与网织红细胞的结合情况。
图9核酸适体WTT-8、WTT-8d阻断HEL细胞与脐静脉内皮细胞粘附作用分析。
图9A-B为流式分析HUVEC细胞经TNF-α刺激后VCAM-1的表达情况。
图9C为核酸适体WTT-8、WTT-8d阻断HEL细胞与HUVEC细胞的粘附作用分析。
图10核酸适体WTT-8、WTT-8d在诊断和评估慢性淋巴细胞白血病中的运用。
图10A为流式分析Ramos细胞CD49d表达情况。
图10B为流式分析核酸适体WTT-8、WTT-8d与Ramos细胞的结合情况。
图10C为在模拟临床CLL患者30％ CD49d阳性细胞样品中，核酸适体WTT-8、WTT-8d对其中的Ramos细胞含量分析。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
本发明中所用试剂：
Streptavidin SepharoseTM(GE)、protein K(碧云天)、胰酶(Gibco)、DNase I(NEB)、细胞膜蛋白提取试剂盒(碧云天)、DPMI-1640(Gibco)、ECM培基(ScienCell)、M199培基(iCell)、胎牛血清FBS(BI)、BSA(Solarbio)、DPBS(培源)、葡萄糖(Sigma)、MgCl2·6H2O(SCR)、鲑鱼精DNA(Solarbio)、考马斯亮蓝R-250(碧云天)、甲醇(Macklin)、乙酸(Macklin)、甘氨酸(Biofroxx)、Tris(Biofroxx)、SDS(Biofroxx)、LipoMax(SUDGEN)、GeneMunt(SignaGen)、质粒pcDNA3.1-3xFlag-C-ITGA4(优宝)、Recombinant Human TNF-α(peprotech)、FITC-Mouse Anti-human CD106(BD PharmingenTM)、Integrin Alpha 4Rabbit Polyclonal antibody(proteintech)、PE anti-human CD49d Antibody(Biolegend)、Human CD45 Microbeads(Miltenyi)和Lymphoprep(STEMCELL)。
本发明中配制的试剂：
1.Washing Buffer:称取0.5082g六水氯化镁，2.25g葡萄糖，加入30mL DPBS，溶解，加入剩余的470mL DPBS中，4℃保存。
2.Binding Buffer:称取0.01g BSA，加入10mL Washing Buffer，再加入100μLtRNA(100mg/mL)，漩涡震荡，充分溶解，4℃保存。
3. 1640完全培养基：向500mL 1640培养基中加入50mL FBS和5mL P/S，4℃保存。
4. 5％ BSA：称取0.5g BSA于15mL无菌离心管，加入10mL DPBS，漩涡震荡，充分溶解，4℃保存。
5.DNA封闭液：使用1mL移液枪吸取4mL Binding Buffer于15mL无菌离心管中，再加入1mL FBS和5mg鲑鱼精DNA，漩涡震荡，充分溶解，4℃保存。
6.考马斯亮蓝染液：称取2.5g考马斯亮蓝R-250粉末，加入500mL甲醇，100mL乙酸，400mL超纯水，充分溶解后，滤纸过滤备用。
7.考染洗脱液：使用量筒量取甲醇500mL，乙酸100mL，超纯水400mL，混匀即可，现配现用。
8.电泳缓冲液(10×Tris-Gly)：称取144g甘氨酸，30.3g Tris，10g SDS并溶解于1L超纯水中，使用时稀释为1×即可。
9.转膜缓冲液：称取14.4g甘氨酸，3.03g Tris，加入800mL超纯水，充分溶解，并加入200mL甲醇，放置于4℃冰箱预冷备用。
10.10×TBS：称取48.46g Tris，160.21g NaCl，加入1600mL超纯水，充分溶解，并使用100％盐酸调节pH值至7.6，再补加超纯水至终体积为2000mL，使用时稀释成1×(500mL)，并加入0.5mL吐温-20，即为1×TBST。
本发明中所用仪器：
DxP AthenaTM流式细胞仪(Cytek)、Nikon共聚焦双光子显微镜(Nikon)、AL204电子天平(Mettler Toledo)、Centrifuge 5418R台式离心机(Eppendorf)、中晶Bio-6000平板式凝胶成像扫描仪(中晶)、伯乐垂直电泳仪(Biorad)、1300Series A2生物安全柜(ThermoScientific)、BB150 CO2 Incubator(Thermo Scientific)、脱色摇床WD-9405B(北京六一)。
实施例1：核酸适体WTT-8结合人红白血病细胞HEL的流式和共聚焦表征。
1.HEL细胞的培养和预处理：HEL培养基为1640，含10％ FBS，1％双抗，传代培养至细胞密度为80-90％，培养条件为37℃，5％ CO2。
2.使用15mL无菌离心管收集培养瓶中的HEL细胞，300g，5min，25℃离心，弃尽培基，再使用DPBS洗涤1次，5-8mL DPBS/次。300g，5min，25℃离心，弃尽上清，计数。
3.向HEL细胞样品中加入Binding Buffer，轻柔震荡混匀，重悬细胞，并设置样品分组，3.5×105细胞/样品，200μL孵育体系。之后加入FAM修饰的核酸适体WTT-8(WTT-8-FAM)至终浓度为200nM。置于冰盒中，水平摇床80rpm，孵育40-45min。
4.孵育结束之后300g，5min，25℃离心，弃尽上清。再加入200μL Washing Buffer洗涤细胞1次，之后加入400μL Washing Buffer重悬细胞，转移至流式管中进行流式分析。另一组平行样品也是加入400μL Washing Buffer重悬细胞，转移至光学皿中通过激光共聚焦显微镜观察分析。
图1的流式和共聚焦结果均表明，现筛选获得的核酸适体WTT-8能够很好地识别并结合正筛细胞HEL。
实施例2：核酸适体WTT-8序列的截短与优化以及表观解离常数(Kd)计算。
1.利用NUPACK预测核酸适体WTT-8的二级结构，并对其两端的引物序列进行适当的截短和碱基替换，使核酸适体具有更强的结合能力。这里将核酸适体WTT-8(81nt)截短成WTT-8d(45nt)，并标记FAM荧光，用于后续验证与HEL的结合能力以及核酸适体WTT-8d与WTT-8的靶标是否一致。
2.HEL细胞的培养和预处理：HEL培养基为1640，含10％ FBS，1％双抗，传代培养至细胞密度为80-90％，培养条件为37℃，5％ CO2。
3.使用15mL无菌离心管收集培养瓶中的HEL细胞，300g，5min，25℃离心，弃尽培基，再使用DPBS洗涤1次，5-8mL DPBS/次。300g，5min，25℃离心，弃尽上清，计数。
4.设置样品分组，每个样品细胞数量为3×105个，体系为200μL。
5.将准备好的细胞样品，分别用于开展6、7、8这三个实验。
6.分别向每组样品中加入核酸适体WTT-8(FAM)和WTT-8d(FAM)至终浓度为50nM，轻轻震荡混匀，置于摇床上(200rpm)，冰上避光孵育40min，每隔15min混匀细胞一次。
7.接着，分别向每组样品中加入50nM终浓度的WTT-8d(FAM)、同时加入50nM终浓度的WTT-8d(FAM)和1μM终浓度的Library(未做修饰)、以及50nM终浓度的WTT-8d(FAM)和1μM终浓度的WTT-8(未做修饰)。轻轻震荡混匀，置于摇床上(200rpm),冰上避光孵育40min，每隔15min混匀细胞一次。
8.设置样品分组，每组样品设置核酸适体WTT-8和WTT-8d的浓度梯度为0、25、50、100、150、250、400、600nM，每个浓度梯度设置3个样品。置于摇床上(200rpm),冰上避光孵育40min，每隔15min混匀细胞一次。
9.所有样品孵育结束后，300g，5min，25℃离心，弃尽上清。再加入200μL WashingBuffer洗涤细胞1次，之后加入400μL Washing Buffer重悬细胞，转移至流式管中进行流式分析。图2A为NUPACK预测的核酸适体WTT-8和WTT-8d的二级结构。图2B-C结果表明核酸适体WTT-8d仍然保持与WTT-8相当的识别和结合能力。此外，图2D结果表明WTT-8d与WTT-8之间存在竞争，即两条核酸适体应该结合于HEL细胞表面相同的靶点。最后，图2E结果表明WTT-8和WTT-8d与HEL有较高的亲和力，解离常数Kd分别为16.08±4.01nM和10.13±2.48nM。
实施例3：核酸适体WTT-8结合HEL细胞膜蛋白分析。
1.HEL细胞的培养和预处理：HEL培养基为1640，含10％ FBS，1％双抗，传代培养至细胞密度为80-90％，培养条件为37℃，5％ CO2。
2.使用15mL无菌离心管收集培养瓶中的HEL细胞，300g，5min，25℃离心，弃尽培基，再使用DPBS洗涤1次，5-8mL DPBS/次。300g，5min，25℃离心，弃尽上清，计数。
3.设置样品分组，每组样品中细胞数量为3×105个，体系为200μL。
4.其中两组样品加核酸适体WTT-8之前，分别用胰酶和蛋白酶K消化膜蛋白，至膜蛋白基本完全去除后，加入WTT-8(FAM)，终浓度为50nM，轻轻震荡混匀，置于摇床上(200rpm),冰上避光孵育40min，每隔15min混匀细胞一次。
5.孵育结束之后300g，5min，25℃离心，弃尽上清。再加入200μL Washing Buffer洗涤细胞1次，之后加入400μL Washing Buffer重悬细胞，转移至流式管中进行流式分析。
6.此外，在孵育之前未做消化处理的样品，加入核酸适体WTT-8(FAM)，终浓度为50nM，轻轻震荡混匀，置于摇床上(200rpm),冰上避光孵育40min，每隔15min混匀细胞一次。孵育结束后，加入2μL DNase I，37℃孵育15min。
7.孵育结束之后300g，5min，25℃离心，弃尽上清。再加入200μL Washing Buffer洗涤细胞1次，之后加入400μL Washing Buffer重悬细胞，转移至流式管中进行流式分析。
图3结果表明，HEL细胞经胰酶、蛋白酶K消化处理之后，核酸适体WTT-8与HEL细胞的结合均出现恢复；而且，未做消化处理的HEL细胞在与WTT-8(FAM)结合之后，加入DNase I的处理，也使得WTT-8与HEL细胞的结合出现明显的恢复。因此，WTT-8应该是结合于HEL细胞表面的膜蛋白。
实施例4：核酸适体WTT-8富集靶蛋白和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。
1.提取膜HEL细胞蛋白：将HEL细胞接种至25个大皿中，待细胞密度至80％-90％之后，全部转移至50mL离心管中，300g，5min，25℃离心，弃尽上清。再用DPBS洗涤HEL细胞两次，离心条件为300g，5min，25℃。向洗涤后的细胞沉淀中加入12mL的膜蛋白抽提液A重悬细胞，置于摇床上，200rpm，冰浴裂解15min。再将细胞样品使用液氮反复冻融细胞4次，至细胞破碎程度大于70％，700g，4℃，离心10min，收集上清液于15mL离心管中，切勿接触沉淀。接着，将上清分装到1.5mL无菌离心管中，每管约1mL，14000rpm，30min，4℃离心沉淀细胞膜碎片。离心结束后，尽可能吸弃上清，保留沉淀加入500μL膜蛋白抽提试剂B重悬细胞膜碎片，高速剧烈涡旋震荡15s，置于200rpm摇床上，冰浴裂解5-10min，重复涡旋和冰浴裂解4-5次，充分抽提膜蛋白。最后。14000rpm，4℃，离心10min，收集上清即为细胞膜蛋白溶液。
2.链霉亲和素修饰的琼脂糖凝微球的封闭：吸取600μL琼脂糖凝微球，并用Washing Buffer洗涤两次，离心条件为1200g，4min，4℃。向琼脂糖凝微球中加入3mL 5％BSA封闭液，震荡混匀，置于摇床上(200rpm),冰上孵育1h，每隔15min混匀一次。再用Washing Buffer洗涤2次，去除多余的封闭液，离心条件为1200g，4min，4℃，同时把其均分为两组，置于冰上备用。
3.细胞膜蛋白的封闭：向收集的膜蛋白样品中加入1.8mL的DNA封闭液，震荡混匀，置于摇床上(100rpm),冰上避光孵育1h。封闭完后，吸取200μL蛋白样品作为全蛋白样品组，置于4℃备用。
4.向剩余的膜蛋白样品中加入Library-biotin，使其终浓度为500nM，震荡混匀，置于摇床上(200rpm)，冰上孵育1h，每隔15min混匀一次。孵育完后，离心，1200g，4min，4℃，收集上清，用于下一步实验。
5.将收集的上清加到经预处理的琼脂糖凝胶微球中，震荡混匀，置于摇床上(200rpm)，冰上孵育1h，每隔15min混匀一次。孵育完后，离心，1200g，4min，4℃，取上清，用于下一步实验。同时，将琼脂糖凝胶微球置于冰上备用。
6.向上一步收集的上清中加入WTT-8-biotin，使其终浓度为500nM，置于摇床上(200rpm)，冰上孵育1h，每隔15min混匀一次。孵育完后，离心，1200g，4min，4℃，取上清，用于下一步实验。
7.把上一步获得的上清加到经预处理的琼脂糖凝胶微球中，震荡混匀，置于摇床上(200rpm)，冰上孵育1h，每隔15min混匀一次。孵育完后，离心，1200g，4min，4℃，取上清，-80℃保存，用于后续开展实施例6实验。
8.把步骤5和步骤7中获得琼脂糖凝胶微球样品用Washing Buffer洗涤两次，离心条件1200g，4min，4℃，尽量去除上清。
9.蛋白的变性：向洗涤后的两份琼脂糖凝胶微球中加入80μL 2×LoadingBuffer，向预留的200μL全蛋白样品中加入50μL 5×Loading Buffer，震荡混匀，100℃变性10min，冰上冷却10min。离心，4000rpm，6min，4℃，尽可能收集上清，放-80℃保存。
10.SDS-PAGE电泳：配制10％分离胶和5％浓缩胶，按照Marker、全蛋白、Library-biotin组蛋白、WTT-8-biotin组蛋白顺序上样。先以60V电压进行电泳，待溴酚蓝条带迁移至下层分离胶后，再以120V电压电泳至溴酚蓝条带迁移至底层，完成电泳。
11.考马斯亮蓝染色：取出SDS-PAGE胶，切掉上层浓缩胶，将下层分离胶转移至考马斯亮蓝染液中，置于摇床上(80rpm，室温)，过夜染色。
12.洗涤：回收考马斯亮蓝染液，用洗脱液洗涤SDS-PAGE胶，置于摇床上(80rpm，室温)，每隔15min换一次洗脱液，洗涤4次，至凝胶上的蛋白条带清晰可见。
13.成像：使用凝胶成像仪扫描SDS-PAGE凝胶，根据成像结果，寻找差异条带。
图4为Library-biotin和WTT-8-biotin所富集的膜蛋白的考马斯亮蓝染色结果，两组样品之间在70kD位置处存在明显的差异条带，此差异蛋白条带中可能存在WTT-8的靶蛋白。因此，切胶回收该位置处的差异蛋白条带用于后续的质谱分析。
实施例5：核酸适体WTT-8结合蛋白的质谱(LC-MS/MS)结果分析。
1.切胶回收差异蛋白条带：将需要使用的试剂耗材提前放至生物安全柜中，紫外灭菌30min。灭菌结束后，在生物安全柜中把library-biotin与WTT-8-biotin之间的差异蛋白条带进行切胶回收，转移至1.5mL离心管中，使用灭菌水洗涤回收的胶块，洗涤两次，吸尽灭菌水，放到4℃保存。
2.将回收的胶块样品常温运输至公司进行质谱分析。并对LC-MS/MS结果进行分析。
3.Library与WTT-8之间差异蛋白条带的LC-MS/MS结果如表1所示，主要呈现的是差异条带中相对含量前30的蛋白的相关信息，主要包括score、coverage、area、peptides、uniques以及spec等重要参数。而肽段的相对含量area能够直观地反应WTT-8和Library之间各蛋白的差异。其中，IGTA4(CD49d)在WTT-8样品组中肽段覆盖率高达61％，而且相对含量最高，比Library样品组中CD49d的含量高100倍。因此，CD49d很有可能就是核酸适体WTT-8的靶蛋白。
表1 Library与WTT-8之间差异蛋白条带的LC-MS/MS结果
实施例6：Western Blot分析核酸适体WTT-8富集蛋白样品中CD49d的含量。
1.配制SDS-PAGE胶：10％分离胶和5％浓缩胶。
2.蛋白变性：把实施例4中获得的全蛋白、Library-biotin组蛋白、WTT-8-biotin组蛋白以及经WTT-8-biotin富集后的上清蛋白100℃变性10min，冰上冷却10min。
3.电泳：按照Marker、全蛋白、Library-biotin组蛋白、WTT-8-biotin组蛋白顺序上样。先以60V电压电泳，待溴酚蓝条带迁移至下层分离胶后，再以120V电压电泳至溴酚蓝条带迁移至底层，完成电泳。
4.转膜：提前配制好转膜缓冲液，置于4℃预冷，同时准备与凝胶大小相同的PVDF膜。用翘板小心取出凝胶，并去掉上层浓缩胶，按照正极夹板、海绵、滤纸、膜、胶、滤纸、海绵、负极夹板的顺序放好，避免产生气泡。夹紧后放入转膜槽内，倒入全部的转膜缓冲液，转膜条件：300mA，90min。
5.封闭：转膜结束后，取出PVDF膜，正面朝上，加入新鲜配制的5％脱脂牛奶，放在摇床上，40rpm，室温，封闭1h。
6.剪膜：按照Marker大小，剪下70kD处CD49d蛋白所在的位置的膜。
7.与抗体孵育：加入稀释后的CD49d抗体(1:2500)，再置于摇床上，40rpm，4℃，过夜孵育。孵育完后，用TBST洗涤3次，置于摇床上，80rpm，每次10min。接着，进行二抗孵育，置于摇床上，40rpm，室温，孵育1h，孵育完后用TBST清洗3次，置于摇床上，80rpm，每次10min。
8.化学发光检测：将洗好的膜浸没于TBST中待用，配制化学发光液ECL。用镊子小心取出膜，放于滤纸上吸干水，然后放在发光盒中，加入适量的发光液，充分浸润之后用凝胶成像仪成像。
图5结果表明核酸适体WTT-8富集的蛋白样品中检测到CD49d蛋白，而且其含量远高于Library-biotin组蛋白样品；同时，经核WTT-8富集后的蛋白上清中几乎不含CD49d蛋白，也就是说核酸适体WTT-8特异性、高效率富集了HEL膜蛋白样品中的CD49d蛋白。这也在一定程度上证明了核酸适体WTT-8应该是特异性靶向CD49d蛋白。
实施例7：质粒过表达和siRNA干扰实验证明核酸适体WTT-8特异性结合细胞膜表面CD49d蛋白。
一.CD49d质粒过表达实验
1.提前24h把HEK293接种到2个六孔板中(一个用于流式检测，另一个用于WesternBlot分析)，使得第二天转染时细胞密度在80％左右。
2.转染前30min，对六孔板进行换液，做好标记：Blank、空载(Vector)(pcDNA3.1-3xFlag-C，优宝生物)、CD49d质粒(pcDNA3.1-3xFlag-C-ITGA4，优宝生物)。
3.配制转染体系：空载和CD49d质粒用量为2ng，分别加100μL无血清培基；两份4μL脂质体，分别加100μL无血清培基。同时分别静置5min。最后，将有质粒和空载的培基分别与含有脂质体的培基混合在一起，再静置20min。
4.把转染体系加到六孔板相应的孔中，置于37℃培养箱中培养。
5. 24h后，一个六孔板收集细胞做流式，另一个六孔板提蛋白开展Western Blot实验。
6.流式细胞术检测步骤：吸弃六孔板中的培养基，用DPBS洗涤2次，然后用2％EDTA室温消化5min，吹打下来转移到新的1.5mL离心管中，并做好标记，用Washing Buffer洗涤2次，计数。用Binding Buffer重悬，把Blank、空载、CD49d质粒这3组细胞设置样品分组，每个样品细胞数量3×105，体系为100μL,分别加入2.5μL CD49d(PE)抗体和核酸适体WTT-8(FAM)至终浓度为200nM。轻轻震荡混匀，置于摇床上(200rpm),冰上避光孵育40min，每隔15min混匀细胞一次。孵育结束之后300g，5min，25℃离心，弃尽上清。再加入200μL WashingBuffer洗涤细胞1次，之后加入400μL Washing Buffer重悬细胞，转移至流式管中进行流式分析。
7.Western Blot检测：提取Blank、空载、CD49d质粒3组细胞的蛋白，再按照实施例6步骤开展Western Blot实验即可。
二.CD49d siRNA干扰实验
1.提前一天把HEL细胞接种到培养瓶中，当细胞密度达到80％-90％时，用于接下来的实验。
2.在超净台中把前一天接种的HEL细胞液转移到15mL离心管中，离心300g，5min，弃上清，加入适量的无血清且不含双抗的培基重悬细胞，计数。
3.把HEL接种于24孔板中，每孔5×105个细胞，体系为800μL，放到37℃培养箱备用。
4.设置4组样品组：Blank、NC以及2条siRNA序列，每组样品设置2个平行，一个用于收集细胞做流式，另一个提蛋白做Western Blot；
siRNA1:
S:5’-GCA AGG AAG UUC CAG GUU ATT-3’；见SEQ NO.3；
AS:5’-UAA CCU GGA ACU UCC UUG CTT-3’，见SEQ NO.4；
siRNA2:
S:5’-GCU UGC UAC UUG GAC UUA UTT-3’；见SEQ NO.5；
AS:5’-AUA AGU CCA AGU AGC AAG CTT-3’，见SEQ NO.6。
5.配制转染体系：siRNA浓度为30nM，加3μL的siRNA序列于150μL无血清1640中再加入40μL 5×buffer及4μLgenmuteTM regent，混匀，静置15min。
6.静置之后，取出刚接种的24孔板，并加入相应的siRNA混合体系，轻轻混匀后，放置于水平离心机中，离心，800g，75min，37℃。
7.离心结束后，放置于37℃培养箱6h。
8.培养6h后，换新鲜的培基(含血清)，放37℃继续培养48h。
9.流式细胞术检测步骤：将24孔板中的细胞悬液分别转移至1.5mL离心管中，按照Blank、NC、siRNA1、siRNA2做好标记，用Washing Buffer洗涤2次，计数。用Binding Buffer重悬，把Blank、NC、siRNA1、siRNA2这4组细胞设置样品分组，每个样品细胞数量2×105，体系为100μL。分别加入2.5μL CD49d(PE)抗体以及核酸适体WTT-8(FAM)并使核酸适体浓度为200nM；轻轻震荡混匀，置于摇床上(200rpm),冰上避光孵育40min，每隔15min混匀细胞一次。孵育结束之后300g，5min，25℃离心，弃尽上清。再加入200μL Washing Buffer洗涤细胞1次，之后加入400μL Washing Buffer重悬细胞，转移至流式管中进行流式分析。
10.Western Blot检测：在进行上面的实验时，同时提取24孔板中另一组Blank、NC、siRNA1、siRNA2这4组细胞的蛋白，再按照实施例6开展Western Blot实验即可。
图6的流式和Western Blot结果均表明HEK293成功表达CD49d蛋白，并且过表达CD49d的HEK293细胞与核酸适体WTT-8呈现较好的结合。此外，流式和Western Blot结果也表明HEL细胞表面的CD49d蛋白成功被敲低，而且CD49d敲低的HEL细胞与核酸适体WTT-8的结合有所减弱。因此，核酸适体WTT-8特异性靶向HEL细胞表面的CD49d蛋白。
实施例8：核酸适体WTT-8内化能力分析和温度对核酸适体WTT-8结合影响分析。
1.提前将HEL细胞接种于大皿，培养至细胞密度为80％-90％时，用于开展实验。
2.把大皿中的HEL细胞转移至15mL无菌离心管中，使用Washing Buffer洗涤两次，计数。
3.设置样品分组，每个样品3×105个细胞，体系为100μL，分别开展温度对核酸适体WTT-8结合影响分析(步骤4)和核酸适体WTT-8内化能力分析(步骤5)。
4.向两组样品中加入核酸适体WTT-8，至终浓度为200nM，一组样品震荡混匀后在4℃，摇床上80rpm，避光孵育40min；另一组样品在37℃，摇床上80rpm，避光孵育40min。孵育完后300g，5min，25℃离心，弃尽上清。再加入200μL Washing Buffer洗涤细胞1次，之后加入400μL Washing Buffer重悬细胞，转移至流式管中进行流式分析。
5.向两组样品中加入核酸适体WTT-8，终浓度为200nM，样品震荡混匀后37℃，摇床上80rpm，避光孵育3h。其中一组孵育完后300g，5min，25℃离心，弃尽上清。再加入200μLWashing Buffer洗涤细胞1次，加入DNase I处理，37℃，孵育15min。孵育完后把所有样品300g，5min，25℃离心，弃尽上清。再加入200μL Washing Buffer洗涤细胞1次，之后加入400μL Washing Buffer重悬细胞，转移至流式管中进行流式分析。
图7A结果表明，即使是在37℃生理条件下，核酸适体WTT-8仍然可以稳定结合HEL细胞。图7B结果表明核酸适体WTT-8在37℃条件下孵育3h，经DNase I处理后，与HEL细胞的结合几乎完全丧失，也就是说WTT-8是结合于细胞膜表面，并未内化进入细胞。因此，WTT-8具备作为阻断试剂发挥抑制或者阻断功能的潜力。总的来说，核酸适体WTT-8有望运用于实际的生理环境，并发挥相应的阻断或者抑制功能。
实施例9：核酸适体WTT-8识别并结合网织红细胞分析。
1.网织红细胞的分离：采集新鲜胎儿脐带血，通过密度梯度离心分离去除成熟的红细胞，同时收集脐带血单个核细胞(CBMCs)。之后使用CD45 Microbeads磁分离去除CBMCs中的白细胞，剩余的细胞几乎为红系前体细胞，其中包含大量的网织红细胞。
2.流式细胞术分析网织红细胞CD49d的表达情况和核酸适体WTT-8与网织红细胞的结合情况。将分离的网织红细胞分装成每个样品4×105细胞，分别加入WTT-8(FAM)至终浓度为200nM和2.5μL CD49d(PE)，置于冰盒中，水平摇床80rpm，避光孵育40min。
3.孵育结束之后，300g，5min，25℃离心，弃尽上清。再加入200μL Washing Buffer洗涤细胞1次，之后加入400μL Washing Buffer重悬细胞，转移至流式管中进行流式分析。图8A结果表明生理条件下的网织红细胞表达CD49d蛋白；同时，图8B结果表明核酸适体WTT-8能够识别并结合生理条件下的网织红细胞。在镰状细胞疾病中，患者外周血中的镰状网织红细胞含量增加，而且CD49d的表达也上调，这将进一步促进镰状网织红细胞与血管内皮的粘附作用，导致血管闭塞症状。因此，核酸适体WTT-8可以用于分析镰状细胞疾病患者体内的镰状网织红细胞CD49d的表达情况，从而诊断和评估疾病的症状，指导临床用药。
实施例10：核酸适体WTT-8阻断HEL细胞与HUVEC(人脐静脉内皮细胞)粘附作用分析。
1.HUVEC细胞培养：培养基为ECM，包括基础培养基、5％FBS、1％内皮细胞生长因子和1％双抗。待细胞密度达到90％时，用胰酶消化，按照1：4传代，培养条件为37℃，5％ CO2。
2.提前接种HUVEC细胞，待细胞密度达到90％时，把细胞接种到24孔板中，每孔15万细胞，置于培养箱中培养。
3.待24孔板中的细胞密度达到90％时，用M199(无血清)培养基更换孔板中的培养基，进行饥饿处理6-12h。
4.饥饿处理结束后，更换培基，其中一组细胞用含有25ng/mL TNF-α的ECM培养基，另一组用不含TNF-α的ECM培养基，再继续培养6h。
5.流式细胞术检测经TNF-α刺激HUVEC细胞的VCAM-1(CD106)的表达：用0.2％EDTA溶液将孔板中的两组细胞消化下来，转移到离心管中，离心300g，5min，弃上清。再用DPBS洗涤细胞两次并计数，洗涤后用Binding Buffer重悬两组细胞，把两组细胞分装为细胞体积为100μL，细胞数量为30万。向分装后的两组细胞中加入10μL CD106-FITC，震荡混匀后，置于摇床上80rpm，冰上避光孵育40min。孵育结束后，用Washing Buffer洗涤2次，并用400μLWashing Buffer重悬细胞并转移到流式管中，流式细胞仪检测。
6.核酸适体WTT-8阻断HEL与HUVEC细胞(CD49d-VCAM-1)的粘附作用：把HUVEC细胞接种在2块12孔板中，每孔20万HUVEC细胞。共设置5组样品分组：第一组使用TNF-α刺激且不加阻断试剂、第二组使用TNF-α刺激并加入Library阻断、第三组使用TNF-α刺激并加入VCAM-1antibody阻断、第四组使用TNF-α刺激并加入核酸适体WTT-8阻断、第五组使用TNF-α刺激并加入核酸适体WTT-8d阻断，每组设置3组平行实验。其余均按照步骤3-4处理。把提前培养好的HEL细胞从培养箱中取出，转移至离心管中，300g，5min离心，弃上清。用DPBS洗涤2次并计数后，用新鲜的培养基重悬细胞，再把HEL细胞分装到5组离心管中，每管中细胞体积为1.6mL，细胞数量120万。分别把核酸适体Library、WTT-8以及WTT-8d加到相应的管中，其余两组离心管中的细胞暂时不做处理，核酸适体用量为32μL，震荡混匀后，置于摇床上80rpm，冰上避光孵育1h。与此同时，向其中一组孔板的HUVEC细胞中(3孔)各加入32μLVCAM-1antibody，避光孵育1h。孵育结束后，把12孔板HUVEC细胞取出，吸弃孔板中的培养基，把经核酸适体处理后的HEL细胞分别加到对应的HUVEC细胞中，每孔加500μL HEL细胞，另外把其中一组未经核酸适体处理的HEL细胞加到经VCAM-1-antibody处理的HUVEC细胞中，另一组未经核酸适体处理的细胞直接加到未经处理的HUVEC细胞中，每孔也是500μLHEL细胞。混匀后，置于培养箱中孵育2h。孵育结束后，把12孔板从培养箱中取出，置于摇床上，150rpm，5min。吸取各孔中的上清，计数，用于分析核酸适体和抗体的阻断功能。
图9A-B结果表明HUVEC细胞经TNF-α刺激后，VCAM-1表达水平显著提高，从而使得HEL细胞与HUVEC细胞发生粘附作用(图9C中Control样品组)。同时，图9C结果进一步表明，加入核酸适体WTT-8或WTT-8d进行阻断之后，粘附的HEL细胞数量下降至70％。其阻断效果显著高于VCAM-1antibody(Cat:551146,BD Bioscience,具备阻断CD49d与VCAM-1之间的粘附作用)。虽然核酸适体的阻断效果不是很强，但已经展现出阻断的功能。我们可能可以通过设计多价核酸适体或者共价核酸适体(修饰N-羟基琥珀酰亚胺NHS)进一步增强其阻断作用。因此，核酸适体有望作为阻断试剂，用于缓解由镰状细胞疾病引起的血管闭塞疼痛，甚至降低血管闭塞疼痛的发生率，为镰状细胞疾病的治疗提供新策略。
实施例11：核酸适体WTT-8在诊断和评估慢性淋巴细胞白血病中的运用。
1.Ramos细胞(人B淋巴细胞瘤细胞)的培养和预处理：培养基为1640，含10％ FBS，1％双抗，传代培养至细胞密度为80-90％，培养条件为37℃，5％ CO2。
2.使用15mL无菌离心管收集培养瓶中的Ramos细胞，300g，5min，25℃离心，弃尽培基，再使用DPBS洗涤1次，5-8mL DPBS/次。300g，5min，25℃离心，弃尽上清，计数。
3.向Ramos细胞样品中加入Binding Buffer，轻柔震荡混匀，重悬细胞，并设置样品分组，3×105细胞/样品，100μL孵育体系。
4.向其中两组样品中分别加入核酸适体WTT-8(FAM)和WTT-8d(FAM)，至终浓度为200nM；另一组样品中加入2.5μLCD49d(PE)，置于冰盒中，水平摇床80rpm，避光孵育40-45min。
5.孵育完后300g，5min，25℃离心，弃尽上清。再加入200μL Washing Buffer洗涤细胞1次，之后加入400μL Washing Buffer重悬细胞，转移至流式管中进行流式分析，用于表征Ramos细胞是否表达CD49d以及WTT-8、WTT-8d与Ramos细胞的结合情况。
6.此外，为进一步验证核酸适体WTT-8和WTT-8d是否可以用于诊断和评估慢性淋巴细胞白血病。这里，从医院采集健康人外周血5mL，加入40mL 1×红细胞裂解液进行裂红处理。300g，5min，25℃离心，弃尽上清，收集白细胞。同时，使用Binding Buffer洗涤细胞两遍，计数。
7.将白细胞和Ramos细胞按数量比例混合(7:3)，即70万白细胞和30万Ramos细胞混合，模拟临床CLL患者30％ CD49d阳性细胞。之后向准备好的混合细胞样品中加入Library(FAM)、WTT-8(FAM)和WTT-8d(FAM)，至终浓度为200nM，置于冰盒中，水平摇床80rpm，避光孵育40-45min。
8.孵育完后300g，5min，25℃离心，弃尽上清。再加入200μL Washing Buffer洗涤细胞1次，之后加入400μL Washing Buffer重悬细胞，转移至流式管中进行流式检测，用于分析WTT-8(FAM)和WTT-8d(FAM)是否可以特异性表征样品中的Ramos细胞。
图10A-B结果表明人B淋巴细胞瘤细胞Ramos表达CD49d蛋白，而且核酸适体WTT-8和WTT-8d能够识别并结合Ramos。图10C结果进一步表明，在模拟临床CLL患者30％ CD49d阳性细胞样品中，核酸适体WTT-8和WTT-8d均能够特异性识别，并且精确分析出其中的CD49d阳性细胞含量。因此，核酸适体WTT-8和WTT-8d可以作为诊断探针，用于分析慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者肿瘤细胞中CD49d+细胞的含量，从而评估CLL患者的生存和预后。
Claims (8)
1.一种特异性识别并结合整合素α4的核酸适体，其特征在于，所述的核酸适体序列如下：5’-ATCCAGAGTGACGCAGCATGGATCCGCGGATGCAAACGCCTGTTAAGGGGACGGAACACTTGATGGACACGGTGGCTTAGT-3’。
2.根据权利要求1所述的特异性识别并结合整合素α4的核酸适体，其特征在于，通过对该核酸适体两端的引物序列进行删减，或者碱基替换获得具有相同功能的核酸适体序列如下：
5’-TGGATCCGCGGATGCAAACGCCTGTTAAGGGGACGGAACACTTGA-3’。
3.根据权利要求1或2所述的核酸适体，其特征在于，对所述的核酸适体标记上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、或酶标记物质，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物。
4.权利要求1-3任一项所述的核酸适体在制备慢性淋巴细胞白血病患者生存预后制剂中的应用。
5.权利要求1-3任一项所述的核酸适体在制备镰状细胞疾病患者诊断制剂中的应用。
6.权利要求1-3任一项所述的核酸适体在制备镰状细胞疾病患者生存预后制剂中的应用。
7.权利要求1-3任一项所述的核酸适体在制备镰状细胞疾病治疗试剂中的应用。
8.镰状细胞疾病治疗试剂，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的核酸适体。
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