WO2017118458A1 - α6-INTEGRIN BINDENDES DNA-APTAMER - Google Patents

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WO2017118458A1
WO2017118458A1 PCT/DE2017/200000 DE2017200000W WO2017118458A1 WO 2017118458 A1 WO2017118458 A1 WO 2017118458A1 DE 2017200000 W DE2017200000 W DE 2017200000W WO 2017118458 A1 WO2017118458 A1 WO 2017118458A1
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WO
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dna aptamer
integrin
sequence
nucleotides
seq
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PCT/DE2017/200000
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Udo Schumacher
Tobias Lange
Daniel Wicklein
Ulrich Hahn
Katharina Redder
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Universität Hamburg
Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers

Definitions

  • the invention relates to a DNA aptamer which specifically binds a6 integrin.
  • Integrins constitute a family of cell adhesion receptors found in cell membranes of animal cells that mediate cell-to-cell and extracellular matrix (ECM) binding and also play a role in signaling between cells and their environment (see, for example, Takada et al, Genome Biology 2007, 8: 215, doi: 10.1186 / gb- 2007-8-5-215). These are transmembrane heterodimeric glycoproteins of an alpha and a beta subunit, for example, different alpha and beta subunits are known in humans, of which different integrins
  • the extracellular protein domain of integrins has a binding site for proteins with or without RGD recognition motif.
  • the a6ß4 integrin belongs to the group of laminin-binding integrins. It leads the
  • US 2007/0104716 A1 describes methods for reducing the amount of active a6 ⁇ 4 integrin in tissue.
  • WO 2014/03733 Al describes inhibitors against an a6 integrin / E-cadherin complex.
  • Aptamers are short synthetic single-stranded DNA or RNA oligonucleotides capable of high affinity specific binding to target molecules, such as proteins. Their antibody-like binding properties make aptamers attractive for use as potential drugs (see, for example, Osborne et al., (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1, 5-9, Meyer, C, et al., 201 1, Journal of Nucleic Acids , Doi: 10.4061 / 2011/904750; Keefe, AD, et al., 2010, Nat Rev Drug Discov., 9: 537-50, doi: 10.1038 / nrd3141; Kanwar et al., 2011, Crit Rev Biochem Mol. Biol. 46: 459 -477, doi: 10.3109 / 10409238.2011.614592). Aptamers are low in antibody with high specificity and affinity as well as chemical stability
  • aptamers may be selected by a method termed SELEX (Evolutionary Evolutionary Ligations by Exponential Enrichment) (Ellington and Szostak (1990), Nature 346, 818-822, Gopinath (2007), Anal. Bioanal Chem 387, 171-182, WO 91/19813). Aptamers that specifically bind a6 integrins are not previously known in the art.
  • the object of the present invention is to provide such an agent.
  • the invention provides a DNA aptamer which specifically binds a a6 integrin and
  • Nucleotides 22-57 according to SEQ ID NO: 1, or c) a sequence of at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 99.5% identity to a sequence having nucleotides 22-57 according to SEQ ID NO: 1, or d) comprises a sequence according to a), b) or c) with at least one modified nucleotide.
  • the DNA aptamer of the invention is affine and specific for a6 integrin (s), and can be used in diseases where inhibition or inhibition of the interaction between laminin and a6 integrin may be beneficial.
  • a6 integrin s
  • the DNA aptamer according to the invention is also simple and inexpensive to produce, well preserved and storable.
  • sequence according to SEQ ID NO: 1 comprises 77 nucleotides, wherein the nucleotides 22-57 are here also referred to as "randomized area", “randomized part” or "randomized
  • Partial sequences of 21 nucleotides at the 5 'end (nt 1-21) and 20 nucleotides (nt 58-77) at the 3' end of the sequence according to SEQ ID NO: 1 are constant (invariable) and flanking also in the case of aptamers known from the prior art (see EP 2876163 A1) a randomized sequence section.
  • the DNA aptamer according to the invention can also be used, for example, to generate integrin (a) or cells or exosomes (see Hoshino et al, 2015, Tumor exosome integrins determine Organotropia metastasis, Nature 527, 329-335, doi: 10.1038 /firm5756 ) to present, display, detect, and / or isolate the a6 integrin (s).
  • the DNA aptamer can be immobilized, for example, by known techniques and used in this immobilized form as a binder, for example for a column chromatography.
  • the aptamer according to the invention can be multimerized by means of a coupling system known to those skilled in the art, for example of the avidin-biotin or biotin-streptavidin system, and optionally bound to nanoparticles, for example quantum dots ("quantum dots", QD) or other techniques known to those skilled in the art, the DNA aptamer of the invention may also be used for imaging purposes.
  • a coupling system known to those skilled in the art, for example of the avidin-biotin or biotin-streptavidin system
  • nanoparticles for example quantum dots ("quantum dots", QD) or other techniques known to those skilled in the art
  • QD quantum dots
  • DNA aptamer is here understood to mean an isolated or synthetic single-stranded DNA (ssDNA) which specifically binds a target molecule, eg a protein
  • DNA aptamer ssDNA oligonucleotides (single-stranded oligonucleotides) with not more than 150, preferably not more than 130, not more than 110, not more than 100, not more than 90, not more than 80, not more than 70, not more than 60, not more than 50, not more than 40, not more than 30, not more than 20, not more than 15 or not more than 10 nucleotides.
  • ssDNA oligonucleotides are understood to mean 15-100 nucleotides.
  • nucleotide in particular the basic building blocks of nucleic acids, ie organic molecules consisting of a sugar residue, usually a pentose, eg deoxyribose or ribose, an organic base (nucleobase) and phosphoric acid
  • nucleobases adenine (A), cytosine (C), guanine (G) and thymine (T) occur regularly in deoxyribonucleic acid (DNA), while in Ribonucleic acid (RNA) instead of the thymine, the base uracil (U) is present.
  • the phosphoric acid is usually present in RNA and DNA as a monophosphate
  • Linking of nucleotides with each other usually takes place via a phosphodiester bond between the 5'-C atom of a pentose and the 3'-C atom of an adjacent one
  • nucleotide ie nucleotides in which the phosphoric acid has been replaced by phosphorothioate, phosphorodithioate or phosphoroselenoate original nucleotide is modified.
  • modified nucleotides are 2'-deoxy, 2'-halide (e.g., 2'-F), 2'-amino, 2'-0-methyl nucleotides, or 2'-methoxyethyl nucleotides, i.
  • Nucleotides having hydrogen at the 2'-C atom of the sugar moiety instead of an OH group, a halide (e.g., fluorine), an amino, O-methyl, or methoxyethyl group.
  • a halide e.g., fluorine
  • an amino, O-methyl, or methoxyethyl group e.g., amino, O-methyl, or methoxyethyl group.
  • the term also includes nucleotides attached to the
  • the feature according to which the DNA aptamer "comprises a sequence according to a), b) or c) with at least one modified nucleotide” means that the DNA aptamer comprises a sequence which was originally one of the features described in features a), b
  • at least one of the nucleotides is present in modified form, for example in the form of a 2'-F nucleotide
  • the formulation that "at least one nucleotide” has been modified or is present in modified form includes modifications at one or more nucleotides, which need not be the same modification, but may be different modifications, such as a 2'-F modification on a nucleotide, a 2'-deoxy modification on a second nucleotide and a 2 '-0- methyl modification on a third nucleotide.
  • nucleotide or amino acid sequences in relation to a percentage, eg "x% identity" refers to a comparison of two sequences, each comparing a position in one sequence with the corresponding position in the other sequence, and means an identity of the nucleotides or amino acids of the two compared sequences in x% of the positions compared, and it may be necessary to take account of sequence gaps in order to achieve the best possible alination of the comparison sequences in each case the same nucleotide or the same
  • sequence with at least x% identity to a sequence with the nucleotides yz here means that a sequence is used in the sequence comparison, which consists of the nucleotides from position y to position z of the referenced sequence, for example from the nucleotides of Positions 22-57.
  • a6 integrin refers to a preferably human integrin having an a6 subunit (also referred to as "CD49") as part of the ⁇ heterodimer. Integrin "thus has the structure ⁇ , where n can be 1 or 4, for example. Examples of known a6 integrins are a6 ⁇ 1 and ⁇ 6 ⁇ 4. For sequence information on the a6 subunit see eg GenBank accession number for the human preprotein: isoform a NP 001073286.1, isoform b
  • a6 ⁇ 4 integrin is understood to mean an a6 integrin whose alpha subunit is an integrin ⁇ 6 subunit and whose beta subunit is an integrin ⁇ 4 subunit
  • the integrin ⁇ 4 subunit is encoded by the gene ITGB4 on human integrin ⁇ 4 see, for example, SwissProt P16144 and GenBank accession number CAB61345.1.
  • E-selectin refers to a cell adhesion molecule, also referred to as SELE, CD62E, ELAM, ELAM1, ESEL, or LECAM2 (GenBank accession number for the human E-selectin). Precursors: NM 000450 (mRNA) and NP_000441 (protein)).
  • P-selectin has the meaning known in the art and refers to a cell adhesion molecule also referred to as SELP, CD62, CD62P, FLJ45155, GMP140, GRMP, PADGEM or PSEL (GenBank accession number for human P-selectin precursor: NM 003005 (mRNA) and NP_002996 (protein)).
  • a DNA aptamer or DNA aptamer fragment understood that with a (preferably human) a6 integrin, preferably a6ß4 integrin, a dissociation constant (Kd) of at most 7 ⁇ 10 6 M (mol / 1), preferably at most 5 ⁇ 10 6 M, preferably at most 3 ⁇ 10 6 M, preferably at most 2 ⁇ 10 6 M, preferably at most 10 6 M, at most 8 ⁇ 10 7 M, maximum 5 ⁇ 10 7 M, a maximum of 3 ⁇ 10 7 M, a maximum of 10 7 M, a maximum of 8 ⁇ 10 8 M, a maximum of 5 ⁇ 10 8 M or a maximum of 3 ⁇ 10 -8 M.
  • Kd dissociation constant
  • a6- Integrin-specifically binding DNA aptamer or DNA aptamer fragment understood a DNA aptamer or DNA aptamer fragment having a dissociation constant of at most 1000 nM (nmol / 1), preferably at most 500 nM, more preferably at most 250 nM, at most 200 nM and particularly preferably at most 150 nM.
  • Kd values can, for example, with the aid of radioactive filter binding studies using a "one site - specific-binding" - model and with the aid of the GraphPad ® Prism program (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA 92037 USA) are determined (see, eg, Meyer, C, Eydeler, K., Magbanua, E., Zivkovic, T., Piganeau, N., Lorenzen, I., Grötzinger, J., Mayer, G., Rose-John, S. & Hahn, U.
  • a fragment of a (human) a6-integrin-specifically binding DNA aptamer is here understood to mean only a (human) a6-integrin, preferably a6ß4-integrin, specifically binding fragment of a DNA aptamer
  • the fragment originates exclusively from the randomized sequence segment of the DNA - aptamers.
  • DNA aptamer or DNA aptamer fragment understood that with human E-selectin or P-selectin dissociation constant (Kd) of a maximum 7 ⁇ 10 6 M (mol / 1), preferably at most 5 ⁇ 10 6 M, preferably at most 3 ⁇ 10 6 M, preferably at most 2 ⁇ 10 6 M, preferably at most 10 6 M, at most 8 ⁇ 10 7 M, at most 5 ⁇ 10 7 M, a maximum of 3 ⁇ 10 7 M, a maximum of 10 "7 M, a maximum of 8 ⁇ 10 8 M, a maximum of 5 ⁇ 10 8 M or a maximum of 3 ⁇ 10 " 8 M.
  • Kd human E-selectin or P-selectin dissociation constant
  • a human E-selectin or P-selectin-specifically binding DNA aptamer or DNA aptamer fragment is understood as meaning a DNA aptamer or DNA aptamer fragment which has a dissociation constant of at most 1000 nM (nmol / l), preferably at most 500 nM, more preferably at most 250 nM, at most 200 nM, at most 150 nM, at most 120 nM, at most 110 nM and particularly preferably at most 100 nM.
  • K i values for example by means of radioactive filter binding studies using a "one site - specific-binding" model and with the aid of the GraphPad Prism ® program (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA 92037 USA) are determined (see, eg, Meyer, C, Eydeler, K., Magbanua, E., Zivkovic, T., Piganeau, N., Lorenzen, I., Grötzinger, J., Mayer, G., Rose-John, S. & Hahn, U. (2012) Interleukin-6 receptor-specific RNA aptamers for cargo delivery into target cells RNA Biology 9, 67-80, doi:
  • Kj values refers to averages.
  • a fragment of a human E-selectin or P-selectin specific binding DNA Aptamers is here only understood as a human E-selectin or P-selectin specific binding fragment of a DNA aptamer.
  • the fragment is derived exclusively from the randomized portion of the DNA aptamer.
  • the DNA aptamer specifically binds ⁇ 6 ⁇ 4 integrin, most preferably human ⁇ 6 ⁇ 4 integrin.
  • the DNA aptamer according to the invention has or comprises a sequence according to SEQ ID NO: 1.
  • the formulation that the DNA aptamer has a sequence means that the DNA aptamer consists of the sequence, ie on the 3 '- and 5' end no further nucleotides are present.
  • One or more, possibly also all bases of the nucleotides of the DNA aptamer or of the DNA aptamer fragment can be modified. This can be beneficial to
  • the DNA aptamer according to the invention can also be coupled with other compounds, for example cholesterol or polyethylene glycol (PEG), or else be multimerized in order, for example, to increase the bioavailability or the affinity, to reduce the degradation or excretion.
  • PEG polyethylene glycol
  • a 3'-3'-dT cap deoxythymidine
  • the DNA aptamer is PEGylated.
  • PEGylated means that the DNA aptamer is chemically linked (conjugated) to a polyethylene glycol (PEG) polymer, for example at the 5'-end (see, for example, US Pat. No.
  • 7,809,331 Bl or am It may be, for example, a linear PEG polymer of 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa or 40 kDa Branched PEG polymers may also be used PEGylation processes and suitable PEG polymers are known to the person skilled in the art (see, for example, US Pat WO 2005084412 A2, US Pat. No. 7803931 B1).
  • the DNA aptamer according to the invention can also be used in combination with one or more human E-selectin and / or P-selectin-specific DNA aptamer or a fragment thereof.
  • E-selectin and / or P-selectin binding DNA aptamers particularly preferably the use together with the there described DNA aptamers SDA1 and SDA2 whose Sequences are shown here in SEQ ID NO: 2 and 3, or human E-selectin and / or P-selectin specific binding fragments thereof.
  • the sequences according to SEQ ID NO: 2 and 3 each comprise 91
  • nucleotides wherein each identical (invariable) partial sequences of 21 nucleotides at the 5 'end (nt 1-21) and of 20 nucleotides at the 3' end (72-91) one randomized
  • Flanking sequence section of 50 nt (nt 22-71, underlined):
  • SDA1 SEQ ID NO: 2
  • SDA2 (SEQ ID NO: 3):
  • the invention also provides an isolated or synthetic
  • Nucleic acid ready comprising or consisting of an oligomer of a DNA aptamer according to the invention.
  • the DNA aptamer according to the invention can thus also be oligomerized, i. as oligomer of the DNA aptamer according to the invention.
  • An oligomer of a DNA aptamer (DNA aptamer oligomer) is understood here to mean a nucleic acid which is composed of at least two recurring DNA aptamer units (repeat units, monomers).
  • the monomer may be the complete aptamer including one or both of the invariable edge regions, the complete randomized portion of the aptamer, or a6 integrin, preferably a6 ⁇ 4 integrin, binding fragments of the aptamer, preferably fragments of the randomized portion.
  • Nucleic acid may also be a mixed oligomer, ie composed of two or more non-identical repeating units, for example different fragments of the Aptamers according to the invention or at least one indicated in SEQ ID NO: l DNA aptamer and a fragment thereof.
  • the repeating units do not have to follow each other directly, but may also be separated by one or more nucleotides.
  • the DNA aptamer oligomer is composed of two, three, four, five, six, seven, eight, nine or ten repeating units. Such a DNA
  • Aptamer oligomer may be advantageously immobilized on, for example, human serum albumin.
  • a DNA aptamer mixed oligomer according to the invention may contain, in addition to one or more monomers of the a6 integrin-binding DNA aptamer or DNA aptamer fragment according to the invention, one or more monomers of an E- and / or P-selectin-binding DNA aptamer or DNA Aptamerfragments include, wherein it is preferably one of the described in EP 2876163 AI E-selectin and / or P-selectin binding DNA aptamers SDA1 (see SEQ ID NO: 2) or SDA2 (see SEQ ID NO: 3) , or E-selectin and / or P-selectin binding fragments thereof, more preferably their randomized part, or an E-selectin and / or P-selectin binding fragment thereof.
  • the at least one monomer of an E- and / or P-selectin-binding DNA aptamer may also have a sequence of 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 , 24, 25, 30, 40, 45 or 50 consecutive nucleotides of nucleotides 22-71 of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, or a sequence of at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 99.5% identity to a sequence comprising nucleotides 22-71 according to SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • the sequence may also include one or more modified nucleotides.
  • the DNA aptamer or DNA aptamer oligomer according to the invention can advantageously be used as a medicament, preferably against inflammation and / or cancer and / or for promoting regenerative processes such as tissue regeneration.
  • the DNA aptamer or DNA aptamer oligomer in a manner known to the skilled person in a
  • a composition formulated in a suitable administration form is used in a pharmaceutically effective amount, ie an amount which has a detectable effect on the treated condition.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a DNA aptamer or DNA aptamer oligomer of the invention.
  • the aptamer or aptamer oligomer is contained in a pharmaceutically effective amount in the drug.
  • the pharmaceutical composition moreover preferably comprises suitable carrier material, excipients and the like.
  • the drug may also contain one or more other active ingredients.
  • the active ingredients can also be coupled to the DNA aptamer or aptamer oligomer, ie, bound covalently or noncovalently.
  • Suitable formulations and dosage forms are known to those skilled in the art or may be routinely prepared according to the prior art.
  • Aptamers or aptamer oligomers according to the invention can, for example, also be bound to nanoparticles which are loaded with other active substances, thereby allowing a targeted delivery of the active compounds.
  • IDA abbreviated a6 integrin-inhibiting DNA aptamer
  • the 36 nucleotides (nt 22-57) randomized sequence region is characterized by
  • the aptamer has a dissociation constant on PC-3 cells (human prostate carcinoma cells, University Hospital Hamburg-Eppendorf) of 137 ⁇ 22 nM and inhibits the
  • an electrophoretic mobility shift assay showed the binding of the aptamer to the human integrins ra6 ⁇ 4 (recombinant human integrin a6 ⁇ 4, XI isoform, R & D Systems GmbH, 65205 Wiesbaden-Nordenstadt, Germany, catalog number: 5497-A6, Rev 10/12/2015) and ra6 ⁇ 1 (recombinant human integrin a6 ⁇ 1, R & D Systems GmbH, 65205 Wiesbaden-Nordenstadt, Germany, catalog number: 7809-A6, Rev.
  • the aptamer of the invention binds to both human and murine a6 integrins.
  • confocal laser scanning microscopy showed that the aptamer is internalized into the cells.
  • DNA aptamer DNA aptamer

Abstract

Die Erfindung betrifft ein DNA-Aptamer, das α6-Integrin spezifisch bindet. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Mittel bereit zu stellen,mit deren Hilfe beispielsweise eine Krebserkrankung vorteilhaft behandelt, insbesondere das Tumorzellwachstum und/oder die Metastasierung vermindert werden kann. Hierzu stellt die Erfindung in einem Aspekt ein DNA- Aptamer bereit, das ein α6-Integrin spezifisch bindet und a) eine Sequenz mit den Nukleotiden 22–57 gemäß SEQ ID NO: 1, oder b) eine Sequenz mit mindestens 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 oder 36 aufeinander folgenden Nukleotiden der Nukleotide 22–57 gemäß SEQ ID NO: 1, oder c) eine Sequenzmit mindestens 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 99,5% Identität zu einer Sequenz mit den Nukleotiden 22–57 gemäß SEQ ID NO: 1, oder d) eine Sequenz gemäß a), b) oder c) mit mindestens einem modifizierten Nukleotid umfasst.

Description

a6-INTEGRIN BINDENDES DNA-APTAMER
Die Erfindung betrifft ein DNA-Aptamer, das a6-Integrin spezifisch bindet. Integrine bilden eine Familie von Zelladhäsionsrezeptoren, die in Zellmembranen tierischer Zellen vorkommen und die Bindung von Zellen untereinander sowie mit der extrazellulären Matrix (ECM) vermitteln, und auch eine Rolle bei der Signalübermittlung zwischen Zellen und deren Umgebung spielen (s. z.B. Takada et al, Genome Biology 2007, 8:215, doi:10.1186/gb- 2007-8-5-215). Es handelt sich um transmembranäre heterodimere Glykoproteine aus einer Alpha- und einer Beta-Untereinheit, wobei beispielsweise beim Menschen verschiedene Alpha- und Beta-Untereinheiten bekannt sind, aus denen sich unterschiedliche Integrine
zusammensetzen. Die extrazelluläre Proteindomäne von Integrinen weist eine Bindungsstelle für Proteine mit oder auch ohne RGD-Erkennungsmotiv auf. Das a6ß4-Integrin gehört zur Gruppe der Laminin-bindenden Integrine. Dabei führt die
Bindung des Integrins an Laminin zur Ausbildung von Hemidesmosomen und somit zu einer festen Bindung der Zelle an seine Umgebung. Krebszellen, die das a6ß4-Integrin ebenfalls präsentieren, nutzen durch Lamininbindung ausgelöste Signalwege, die sonst z.B. in der Wundheilung eine Rolle spielen, zur Förderung des Tumorzellwachstums und zur
Metastasierung. Dabei führt eine höhere Präsentation des Integrins auf Krebszellen oft zu einer schlechteren Prognose des Patienten (s. Tagliabue El, Ghirelli C, Squicciarini P, Aiello P, Colnaghi MI, Menard S. (1998), Prognostic value of alpha 6 beta 4 integrin expression in breast carcinomas is affected by laminin production from tumor cells, Clin Cancer Res. 4:407-10; Stewart RL, O'Connor KL (2015), Clinical significance of the integrin a6ß4 in human malignancies, Lab Invest. 95:976-86, doi: 10.1038/labinvest.2015.82. Epub 2015 Jun 29).
Deshalb ist die Inhibition der Interaktion zwischen Laminin und dem a6ß4-Integrin von hohem therapeutischem Interesse.
Die US 2007/0104716 AI beschreibt Verfahren zur Verringerung der Menge an aktivem a6ß4- Integrin in Gewebe. Hierzu sollen beispielsweise Antikörper, Laminin-5 -Analoga oder kleine a6ß4-Integrin-bindende Moleküle dienen. Die WO 2014/03733 AI beschreibt Inhibitoren gegen einen a6-Integrin/E-Cadherin-Komplex.
Aptamere sind kurze synthetische einzelsträngige DNA- oder RNA-Oligonukleotide mit der Fähigkeit zur hochaffinen spezifischen Bindung an Zielmoleküle, beispielsweise Proteine. Ihre antikörperähnlichen Bindungseigenschaften machen Aptamere für den Einsatz als potenzielle Arzneimittel attraktiv (s. z.B. Osborne et al. (1997), Curr. Opin. Chem. Biol. 1, 5-9; Meyer, C, et al. 201 1, Journal of Nucleic Acids, doi: 10.4061/2011/904750; Keefe, A.D., et al. 2010, Nat Rev Drug Discov. 9: 537-50, doi: 10.1038/nrd3141 ; Kanwar et al. 2011, Crit Rev Biochem Mol Biol. 46: 459-477, doi: 10.3109/10409238.2011.614592). Gegenüber Antikörpern weisen Aptamere bei hoher Spezifität und Affinität sowie chemischer Stabilität eine niedrige
Immunogenität auf. Aptamere können zum Beispiel mit Hilfe eines Verfahrens selektiert werden, das als SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) bezeichnet wird (Ellington und Szostak (1990), Nature 346, 818-822; Gopinath (2007), Anal. Bioanal. Chem. 387, 171-182; WO 91/19813). Aptamere, die a6-Integrine spezifisch binden, sind im Stand der Technik bislang nicht bekannt.
Nach wie vor besteht ein Bedarf an Mitteln, mit deren Hilfe insbesondere eine Krebserkrankung vorteilhaft behandelt, insbesondere das Tumorzellwachstum und/oder die Metastasierung vermindert werden kann. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein solches Mittel bereitzustellen.
Gelöst wird die Aufgabe durch die Gegenstände des Anspruchs 1 und der weiteren
nebengeordneten Ansprüche. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den
Unteransprüchen angegeben.
In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung ein DNA-Aptamer bereit, das ein a6-Integrin spezifisch bindet und
a) eine Sequenz mit den Nukleotiden 22-57 gemäß SEQ ID NO: 1, oder
b) eine Sequenz mit mindestens 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 oder 36 aufeinander folgenden Nukleotiden der
Nukleotide 22-57 gemäß SEQ ID NO: 1, oder c) eine Sequenz mit mindestens 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 99,5%o Identität zu einer Sequenz mit den Nukleotiden 22-57 gemäß SEQ ID NO: 1, oder d) eine Sequenz gemäß a), b) oder c) mit mindestens einem modifizierten Nukleotid umfasst.
Das erfindungsgemäße DNA-Aptamer ist affin und spezifisch für a6-Integrin(e), und kann bei Erkrankungen eingesetzt werden, bei denen eine Hemmung oder Behinderung der Interaktion zwischen Laminin und a6-Integrin vorteilhaft sein kann. Beispielsweise kann das
erfindungsgemäße Aptamer bei Krebserkrankungen eingesetzt werden, um das
Tumorwachstum und/oder die Metastasierung zu hemmen oder zu vermindern. Das erfindungsgemäße DNA-Aptamer ist darüber hinaus einfach und kostengünstig herzustellen, gut haltbar und lagerungsfähig.
Die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 umfasst 77 Nukleotide, wobei die Nukleotide 22-57 hier auch als„randomisierter Bereich",„randomisierter Teil" oder„randomisierter
Sequenzabschnitt" bezeichnet werden. Teilsequenzen von 21 Nukleotiden am 5 '-Ende (nt 1- 21) und von 20 Nukleotiden (nt 58-77) am 3'-Ende der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 sind konstant (invariabel) und flankieren auch bei aus dem Stand der Technik bekannten Aptameren (s. EP 2876163 AI) einen randomisierten Sequenzabschnitt.
Das erfindungsgemäße DNA-Aptamer kann beispielsweise auch verwendet werden, um a6- Integrin(e) oder Zellen oder Exosomen (s. Hoshino et al, 2015, Tumour exosome integrins determine Organotropie metastasis, Nature 527, 329-335, doi: 10.1038/naturel5756), die a6- Integrin(e) präsentieren, darzustellen, nachzuweisen und/oder zu isolieren. Hierzu kann das DNA-Aptamer beispielsweise mittels bekannter Techniken immobilisiert und in dieser immobilisierten Form als Bindemittel, beispielsweise für eine Säulenchromatographie, verwendet werden. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Aptamer mittels eines dem Fachmann bekannten Kopplungssystems, z.B. des Avidin-Biotin- oder Biotin- Streptavidin- Systems, multimerisiert und gegebenenfalls an Nanopartikel, z.B. so genannte Quantenpunkte („Quantum Dots", QD), gebunden werden. Mittels geeigneter Fluoreszenzmarkierung oder anderer dem Fachmann bekannter Techniken kann das erfindungsgemäße DNA-Aptamer auch zu Bildgebungszwecken eingesetzt werden. Unter einem„DNA-Aptamer" wird hier eine isolierte oder synthetische Einzelstrang-DNA (ssDNA) verstanden, die ein Zielmolekül, z.B. ein Protein, spezifisch bindet. Insbesondere werden unter dem Begriff„DNA-Aptamer" ssDNA-Oligonukleotide (Einzelstrang- Oligonukleotide) mit höchstens 150, vorzugsweise höchstens 130, höchstens 110, höchstens 100, höchstens 90, höchstens 80, höchstens 70, höchstens 60, höchstens 50, höchstens 40, höchstens 30, höchstens 20, höchstens 15 oder höchstens 10 Nukleotiden verstanden.
Insbesondere werden unter dem Begriff ssDNA-Oligonukleotide mit 15-100 Nukleotiden verstanden.
Unter einem„Nukleotid" werden hier insbesondere die Grundbausteine von Nukleinsäuren, d.h. organische Moleküle verstanden, die aus einem Zuckerrest, in der Regel einer Pentose, z.B. Desoxyribose oder Ribose, einer organischen Base (Nukleobase) und Phosphorsäure bestehen. Die Phosphorsäure ist mit dem Zucker regelmäßig über eine Esterbindung, der Zucker mit der Nukleobase über eine N-glykosidische Bindung verbunden. In Desoxyribonukleinsäure (DNA) kommen regelmäßig die Nukleobasen Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) und Thymin (T) vor, während in Ribonukleinsäure (RNA) anstelle des Thymins die Base Uracil (U) vertreten ist. Die Phosphorsäure liegt in RNA und DNA in der Regel als Monophosphat vor. Die
Verknüpfung von Nukleotiden untereinander erfolgt meistens über eine Phosphordiester- bindung zwischen dem 5'-C-Atom einer Pentose und dem 3'-C-Atom einer benachbarten
Pentose. Phosphorthioat- oder Phosphorselenoat-Nukleotide sind aber auch von dem Begriff „Nukleotid" umfasst, d.h. Nukleotide, bei denen die Phosphorsäure durch z.B. Phosphorthioat, Phosphordithioat oder Phosphorselenoat ersetzt ist. Unter einem„modifizierten Nukleotid" wird hier ein Nukleotid verstanden, das chemisch gegenüber dem ursprünglichen Nukleotid modifiziert ist. Beispiele für modifizierte Nukleotide sind 2'-Desoxy-, 2'-Halogenid- (z.B. 2'-F-), 2'-Amino-, 2'-0-Methyl-Nukleotide oder 2'- Methoxyethyl-Nukleotide, d.h. Nukleotide, die am 2'-C-Atom der Zuckerkomponente anstelle einer OH-Gruppe Wasserstoff, ein Halogenid (z.B. Fluor), eine Amino-, O-Methyl- oder Methoxyethyl-Gruppe aufweisen. Der Begriff umfasst aber auch Nukleotide, die an der
Basenkomponente modifiziert sind. Das Merkmal, wonach das DNA-Aptamer„eine Sequenz gemäß a), b) oder c) mit mindestens einem modifizierten Nukleotid" umfasst, bedeutet, dass das DNA-Aptamer eine Sequenz umfasst, die ursprünglich einer der in den Merkmalen a), b) oder c) genannten Sequenzen entspricht, wobei jedoch mindestens eines der Nukleotide in modifizierter Form vorliegt, z.B. in Form eines 2'-F-Nukleotids. Die Formulierung, dass„mindestens ein Nukleotid" modifiziert wurde bzw. in modifizierter Form vorliegt, schließt Modifikationen an einem oder mehreren Nukleotiden ein, wobei es sich nicht jeweils um dieselbe Modifikation handeln muss, sondern unterschiedliche Modifikationen vorliegen können, beispielsweise eine 2'-F-Modifikation an einem Nukleotid, eine 2'-Desoxy-Modifikation an einem zweiten Nukleotid und eine 2'-0- Methyl- Modifikation an einem dritten Nukleotid.
Die Angabe einer Identität von Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen in Zusammenhang mit einer Prozentangabe, z.B.„x% Identität", bezieht sich auf einen Vergleich zweier Sequenzen, wobei jeweils eine Position in der einen Sequenz mit der entsprechenden Position in der anderen Sequenz verglichen wird, und bedeutet eine Identität der Nukleotide oder Aminosäuren der beiden verglichenen Sequenzen in x% der verglichenen Positionen. Dabei kann es gegebenenfalls erforderlich sein, Sequenzlücken zu berücksichtigen, um eine möglichst gute Alinierung der Vergleichssequenzen herzustellen. Identität heißt demnach, dass beim Vergleich zweier Sequenzen an äquivalenten Stellen jeweils dasselbe Nukleotid bzw. dieselbe
Aminosäure steht. Der Grad der Ähnlichkeit oder Identität zweier Sequenzen kann
beispielsweise mit Hilfe des Computerprogramms BLAST (S.F. Altschul et al. (1990), Basic Local Alignment search tool, J.Mol. Biol. 215: 403-410; s. z.B.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) unter Verwendung von Standardparametern ermittelt werden, wobei dem Fachmann geläufig ist, welches Programm für die jeweilige Sequenz geeignet ist (z.B. BLASTn für Nukleotid-, BLASTp für Aminosäuresequenzen).
Die Formulierung„Sequenz mit mindestens x% Identität zu einer Sequenz mit den Nukleotiden y-z" bedeutet hier, dass beim Sequenzvergleich eine Sequenz eingesetzt wird, die aus den Nukleotiden von Position y bis Position z der in Bezug genommenen Sequenz besteht, z.B. aus den Nukleotiden der Positionen 22-57. Der Begriff„a6-Integrin" hat hier die im Stand der Technik bekannte Bedeutung und bezieht sich auf ein vorzugsweise humanes Integrin, das eine a6-Untereinheit (auch als„CD49 ' bezeichnet) als Bestandteil des αβ-Heterodimers aufweist. Ein„a6-Integrin" weist somit die Struktur αββη auf, wobei n beispielsweise 1 oder 4 sein kann. Beispiele für bekannte a6- Integrine sind a6ßl und a6ß4. Für Sequenzinformationen zur a6-Untereinheit s. z.B. GenBank- Zugriffsnummer für das humane Präprotein: Isoform a NP 001073286.1 , Isoform b
NP 000201.2. S. auch SwissProt P23229. Humanes Integrin-a6 wird vom Gen ITGA6 kodiert.
Unter einem„a6ß4-Integrin" wird ein a6-Integrin verstanden, dessen alpha-Untereinheit eine Integrin-a6-Untereinheit und dessen beta-Untereinheit eine Integrin- ß4-Untereinheit ist. Die Integrin-ß4-Untereinheit wird vom Gen ITGB4 kodiert. Sequenzinformationen zu humanem Integrin-ß4 s. z.B. SwissProt P16144 und GenBank-Zugriffsnummer CAB61345.1.
Der Begriff„E-Selektin" hat hier die im Stand der Technik bekannte Bedeutung und bezieht sich auf ein Zelladhäsionsmolekül, das auch als SELE, CD62E, ELAM, ELAM1 , ESEL oder LECAM2 bezeichnet wird (GenBank-Zugriffsnummer für den humanen E-Selektin-Präkursor: NM 000450 (mRNA) und NP_000441 (Protein)).
Der Begriff„P-Selektin" hat die im Stand der Technik bekannte Bedeutung und bezieht sich auf ein Zelladhäsionsmolekül, das auch als, SELP, CD62, CD62P, FLJ45155, GMP140, GRMP, PADGEM oder PSEL bezeichnet wird (GenBank-Zugriffsnummer für den menschlichen P- Selektin-Präkursor: NM 003005 (mRNA) and NP_002996 (Protein)).
Unter einem a6-Integrin spezifisch bindenden DNA-Aptamer oder einem Fragment davon wird hier ein DNA-Aptamer oder DNA-Aptamer-Fragment verstanden, das mit einem (vorzugsweise humanem) a6-Integrin, vorzugsweise a6ß4-Integrin, eine Dissoziationskonstante (Kd) von maximal 7·10 6 M (mol/1), bevorzugt maximal 5 · 10 6 M, bevorzugt maximal 3 · 10 6 M, bevorzugt maximal 2·10 6 M, bevorzugt maximal 10 6 M, maximal 8·10 7 M, maximal 5 · 10 7 M, maximal 3 · 10 7 M, maximal 10 7 M, maximal 8· 10 8 M, maximal 5 · 10 8 M oder maximal 3·10"8 M aufweist. Insbesondere wird unter einem (humanes) a6-Integrin spezifisch bindenden DNA-Aptamer oder DNA-Aptamer-Fragment ein DNA-Aptamer oder DNA-Aptamer- Fragment verstanden, das eine Dissoziationskonstante von maximal 1000 nM (nmol/1), vorzugsweise maximal 500 nM, weiter bevorzugt maximal 250 nM, maximal 200 nM und besonders bevorzugt maximal 150 nM aufweist. Kd- Werte können beispielsweise mit Hilfe von radioaktiven Filterbindungsstudien unter Verwendung eines„One site - specific-binding"- Modells und unter Zuhilfenahme des Programms GraphPad® Prism (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA 92037 USA) ermittelt werden (s. z. B. Meyer, C, Eydeler, K., Magbanua, E., Zivkovic, T., Piganeau, N., Lorenzen, I., Grötzinger, J., Mayer, G., Rose- John, S. & Hahn, U. (2012) Interleukin-6 receptor specific RNA aptamers for cargo delivery into target cells. RNA Biology 9, 67-80, doi: 10.4161/rna.9.1.18062). Die obigen Angaben zu Kj- Werten beziehen sich auf Mittelwerte. Unter einem Fragment eines (humanes) a6-Integrin spezifisch bindenden DNA- Aptamers wird hier nur ein ebenfalls (humanes) a6-Integrin, vorzugsweise a6ß4-Integrin, spezifisch bindendes Fragment eines DNA- Aptamers verstanden. Vorzugsweise stammt das Fragment ausschließlich aus dem randomisierten Sequenzabschnitt des DNA- Aptamers.
Unter einem humanes E-Selektin oder P-Selektin spezifisch bindenden DNA-Aptamer oder einem Fragment davon wird hier ein DNA-Aptamer oder DNA-Aptamer-Fragment verstanden, das mit humanem E-Selektin oder P-Selektin eine Dissoziationskonstante (Kd) von maximal 7·10 6 M (mol/1), bevorzugt maximal 5 · 10 6 M, bevorzugt maximal 3 · 10 6 M, bevorzugt maximal 2·10 6 M, bevorzugt maximal 10 6 M, maximal 8·10 7 M, maximal 5 · 10 7 M, maximal 3 · 10 7 M, maximal 10"7 M, maximal 8· 10 8 M, maximal 5 · 10 8 M oder maximal 3·10"8 M aufweist. Insbesondere wird unter einem humanes E-Selektin oder P-Selektin spezifisch bindenden DNA-Aptamer oder DNA-Aptamer-Fragment ein DNA-Aptamer oder DNA-Aptamer-Fragment verstanden, das eine Dissoziationskonstante von maximal 1000 nM (nmol/1), vorzugsweise maximal 500 nM, weiter bevorzugt maximal 250 nM, maximal 200 nM, maximal 150 nM, maximal 120 nM, maximal 110 nM und besonders bevorzugt maximal 100 nM aufweist. Kj- Werte können beispielsweise mit Hilfe von radioaktiven Filterbindungsstudien unter Verwendung eines„One site - specific-binding"-Modells und unter Zuhilfenahme des Programms GraphPad® Prism (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA 92037 USA) ermittelt werden (s. z. B. Meyer, C, Eydeler, K., Magbanua, E., Zivkovic, T., Piganeau, N., Lorenzen, I., Grötzinger, J., Mayer, G., Rose- John, S. & Hahn, U. (2012) Interleukin-6 receptor specific RNA aptamers for cargo delivery into target cells. RNA Biology 9, 67-80, doi:
10.4161/rna.9.1.18062). Die obigen Angaben zu Kj- Werten beziehen sich auf Mittelwerte. Unter einem Fragment eines humanes E-Selektin oder P-Selektin spezifisch bindenden DNA- Aptamers wird hier nur ein ebenfalls humanes E-Selektin oder P-Selektin spezifisch bindendes Fragment eines DNA-Aptamers verstanden. Vorzugsweise stammt das Fragment ausschließlich aus dem randomisierten Teil des DNA-Aptamers. In einer bevorzugten Ausführungsform bindet das DNA-Aptamer spezifisch a6ß4-Integrin, besonders bevorzugt humanes a6ß4-Integrin.
In einer bevorzugten Ausführungsform hat oder umfasst das erfindungsgemäße DNA-Aptamer eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1. Die Formulierung, dass das DNA-Aptamer eine Sequenz „hat", bedeutet, dass das DNA-Aptamer aus der Sequenz besteht, d.h. am 3'- und 5 '-Ende keine weiteren Nukleotide vorhanden sind.
Eine oder mehrere, gegebenenfalls auch alle Basen der Nukleotide des DNA-Aptamers oder des DNA-Aptamer-Fragments können modifiziert sein. Dies kann vorteilhaft sein, um
beispielsweise die Empfindlichkeit gegenüber Nukleasen in vivo zu verringern, die Aufnahme in die Zelle zu verbessern oder eine schnelle renale Resorption zu verhindern. Die Vornahme entsprechender Modifikationen liegt im Bereich des Fachkönnens des Durchschnittsfachmanns.
Das erfindungsgemäße DNA-Aptamer kann auch mit anderen Verbindungen, z.B. Cholesterol oder Polyethylenglykol (PEG), gekoppelt oder auch multimerisiert werden, um beispielsweise die Bioverfügbarkeit oder die Affinität zu erhöhen, den Abbau oder die Ausscheidung zu vermindern. Zum Schutz vor dem Angriff von Exonukleasen kann beispielsweise am 3 '-Ende eine 3'-3 '-dT-Kappe (dT = Desoxythymidin) vorgesehen sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das DNA-Aptamer PEGyliert.„PEGyliert" bedeutet, dass das DNA-Aptamer mit einem Polyethylenglycol(PEG)-Polymer chemisch verbunden (konjugiert) ist, beispielsweise am 5'-Ende (s. z.B. US 7803931 Bl) oder am 3'-Ende. Es kann sich beispielsweise um ein lineares PEG-Polymer von 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa oder 40 kDa handeln. Auch verzweigte PEG-Polymere können eingesetzt werden. PEGylierungsverfahren und geeignete PEG-Polymere sind dem Fachmann bekannt (s. z.B. WO 2005084412 A2, US 7803931 Bl). Das erfindungsgemäße DNA-Aptamer kann auch in Kombination mit einem oder mehreren humanes E-Selektin und/oder P-Selektin spezifisch bindenden DNA-Aptamer oder einem Fragment davon eingesetzt werden. Bevorzugt ist der Einsatz zusammen mit den in der EP 2876163 AI (Anmeldetag 21.11.2014) beschriebenen E-Selektin und/oder P-Selektin bindenden DNA-Aptameren, besonders bevorzugt der Einsatz zusammen mit den dort beschriebenen DNA-Aptameren SDA1 und SDA2, deren Sequenzen hier in den SEQ ID NO: 2 und 3 wiedergegeben sind, oder humanes E-Selektin und/oder P-Selektin spezifisch bindenden Fragmenten davon. Die Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 2 und 3 umfassen jeweils 91
Nukleotide, wobei jeweils identische (invariable) Teilsequenzen von 21 Nukleotiden am 5'- Ende (nt 1-21) und von 20 Nukleotiden am 3 '-Ende (72-91) einen randomisierten
Sequenzabschnitt von 50 nt (nt 22-71, unterstrichen) flankieren:
SDA1 (SEQ ID NO: 2):
GCCTGTTGTGAGCCTCCTAACCGCGAATTCGTGTCACTAAACACCGATAGTTTCGAT TGTCTTTGGTTCATCATGCTTATTCTTGTCTCCC
SDA2 (SEQ ID NO: 3):
GCCTGTTGTGAGCCTCCTAACGATTTGGATTTGGGGTGGAGGGTATGGTTTGTGCTG
GCGTTCTCATTTCCCATGCTTATTCTTGTCTCCC
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung auch eine isolierte oder synthetische
Nukleinsäure bereit, umfassend oder bestehend aus einem Oligomer eines erfindungsgemäßen DNA-Aptamers. Das erfindungsgemäße DNA-Aptamer kann somit auch oligomerisiert, d.h. als Oligomer des erfindungsgemäßen DNA-Aptamers, vorliegen. Unter einem Oligomer eines DNA-Aptamers (DNA-Aptamer-Oligomer) wird hier eine Nukleinsäure verstanden, die aus mindestens zwei wiederholt auftretenden DNA-Aptamer-Einheiten (Wiederholungseinheiten, Monomeren) zusammengesetzt ist. Bei dem Monomer kann es sich um das vollständige Aptamer einschließlich eines oder beider invariabler Randbereiche, um den vollständigen randomisierten Teil des Aptamers oder um a6-Integrin, vorzugsweise a6ß4-Integrin, bindende Fragmente des Aptamers, vorzugsweise Fragmente des randomisierten Teils, handeln. Die
Nukleinsäure kann auch ein Mischoligomer sein, d.h. aus zwei oder mehreren nicht identischen Wiederholungseinheiten zusammengesetzt sein, beispielsweise verschiedenen Fragmenten des erfindungsgemäßen Aptamers oder mindestens einem in SEQ ID NO: l angegebenen DNA- Aptamer und einem Fragment davon. Die Wiederholungseinheiten müssen nicht unmittelbar aufeinander folgen, sondern können auch durch ein oder mehrere Nukleotide voneinander getrennt sein. Vorzugsweise ist das DNA- Aptamer-Oligomer aus zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun oder zehn Wiederholungseinheiten zusammengesetzt. Ein solches DNA-
Aptamer-Oligomer kann vorteilhaft beispielsweise auf Humanserumalbumin immobilisiert sein.
Ein erfindungsgemäßes DNA-Aptamer-Mischoligomer kann neben einem oder mehreren Monomeren des erfindungsgemäßen a6-Integrin bindenden DNA- Aptamers oder DNA- Aptamer-Fragments auch ein oder mehrere Monomere eines E- und/oder P-Selektin-bindenden DNA- Aptamers oder DNA-Aptamerfragments umfassen, wobei es sich vorzugsweise um eines der in der EP 2876163 AI beschriebenen E-Selektin und/oder P-Selektin bindenden DNA- Aptamere SDA1 (s. SEQ ID NO: 2) oder SDA2 (s. SEQ ID NO: 3), oder E-Selektin und/oder P-Selektin bindende Fragmente davon, besonders bevorzugt um deren randomisierten Teil, oder einem E-Selektin und/oder P-Selektin bindenden Fragment davon, handelt. Das mindestens eine Monomere eines E- und/oder P-Selektin-bindenden DNA- Aptamers kann auch eine Sequenz mit 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 45 oder 50 aufeinander folgenden Nukleotiden der Nukleotide 22-71 gemäß SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3, oder eine Sequenz mit mindestens 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 99,5% Identität zu einer Sequenz mit den Nukleotiden 22-71 gemäß SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 umfassen. Die Sequenz kann auch ein oder mehrere modifizierte Nukleotide umfassen.
Das erfindungsgemäße DNA-Aptamer oder DNA- Aptamer-Oligomer kann vorteilhaft als Arzneimittel, vorzugsweise gegen Entzündungen und/oder Krebs und/oder zur Förderung regenerativer Prozesse wie der Geweberegeneration, verwendet werden. Hierzu kann das DNA- Aptamer oder DNA- Aptamer-Oligomer in für den Fachmann bekannter Weise in einer
Zusammensetzung enthalten sein, die in einer geeigneten Verabreichungsform formuliert wird. Das DNA-Aptamer oder DNA- Aptamer-Oligomer wird dabei in einer pharmazeutisch wirksamen Menge verwendet, d.h. einer Menge, die eine nachweisbare Wirkung auf den behandelten Zustand ausübt. In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel bereit, das ein erfindungsgemäßes DNA-Aptamer oder DNA-Aptamer-Oligomer umfasst. Das Aptamer oder Aptamer-Oligomer ist dabei in einer pharmazeutisch wirksamen Menge in dem Arzneimittel enthalten. Das Arzneimittel umfasst darüber hinaus bevorzugt geeignetes Trägermaterial, Exzipientien und dergleichen. Gegebenenfalls kann das Arzneimittel auch einen oder mehrere weitere Wirkstoffe enthalten. Die Wirkstoffe können dabei auch an das DNA-Aptamer oder Aptamer-Oligomer gekoppelt, d.h. kovalent oder nicht-kovalent gebunden sein. Geeignete Formulierungen und Darreichungsformen sind dem Fachmann bekannt oder können auf routinemäßige Weise gemäß dem Stand der Technik hergestellt werden. Die
erfindungsgemäßen Aptamere oder Aptamer-Oligomere können beispielsweise auch an Nanopartikel gebunden werden, die mit anderen Wirkstoffen beladen sind, wodurch eine gezielte Zufuhr der Wirkstoffe ermöglicht wird.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen rein zu
Veranschaulichungszwecken näher erläutert.
Beispiele
Das erfindungsgemäße DNA-Aptamer, im Folgenden IDA (abgekürzt für a6-Integrin inhibierendes DNA-Aptamer) genannt, weist folgende Sequenz auf:
IDA (SEQ ID NO: 1):
GCCTGTTGTGAGCCTCCTAACCGTGCGTATTCGTACTGGAACTGATATCGATGTCCC CATGCTTATTCTTGTCTCCC
Der 36 Nukleotide (nt 22-57) umfassende randomisierte Sequenzbereich ist durch
Unterstreichung gekennzeichnet.
Das Aptamer weist eine Dissoziationskonstante an PC-3 -Zellen (humane Prostata-Karzinom- Zellen, Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf) von 137 ± 22 nM auf und inhibiert die
Interaktion zwischen a6ß4 Integrin tragenden PC-3-Zellen und Laminin-332 mit einem IC-50- Wert von 149 nM, d.h. mit einer mittleren inhibitorischen Konzentration von 149 nM. Die Spezifität des Aptamers konnte durch eine reduzierte Bindung an PC-3-Integrin-ß4- knockdown-Zellen (Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf) verifiziert werden. Des
Weiteren zeigte ein Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) die Bindung des Aptamers an die humanen Integrine ra6ß4 (rekombinantes Human-Integrin a6ß4, Xl-Isoform, R&D Systems GmbH, 65205 Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland, Katalog-Nummer: 5497-A6, Rev. 10/12/2015) und ra6ßl (rekombinantes Human-Integrin a6ßl, R&D Systems GmbH, 65205 Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland, Katalog-Nummer: 7809-A6, Rev. 10/12/2015) sowie an das murine ra6ß4 Integrin (rekombinantes Maus-Integrin a6ß4, R&D Systems GmbH, 65205 Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland, Katalog-Nummer: 8067-A6, Rev. 10/12/2015). Es konnte keine Bindung an das entsprechende ra4ßl Integrin festgestellt werden. Somit bindet das erfindungsgemäße Aptamer sowohl an humane als auch an murine a6-Integrine. Zudem konnte mittels konfokaler Laser Scanning Mikroskopie gezeigt werden, dass das Aptamer in die Zellen internalisiert wird. Sequenzprotokoll - freier Text und Übersetzung englischer Ausdrücke
Artificial Sequence = Künstliche Sequenz
DNA aptamer = DNA- Aptamer

Claims

Patentansprüche
1. DNA-Aptamer, das ein a6-Integrin spezifisch bindet und
a) eine Sequenz mit den Nukleotiden 22-57 gemäß SEQ ID NO: 1, oder
b) eine Sequenz mit mindestens 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 oder 36 aufeinander folgenden Nukleotiden der Nukleotide 22-57 gemäß SEQ ID NO: 1, oder
c) eine Sequenz mit mindestens 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 99,5%o Identität zu einer Sequenz mit den Nukleotiden 22-57 gemäß SEQ ID NO: 1, oder
d) eine Sequenz gemäß a), b) oder c) mit mindestens einem modifizierten Nukleotid umfasst.
2. DNA-Aptamer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-Aptamer
humanes a6ß4-Integrin spezifisch bindet.
3. DNA-Aptamer nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-Aptamer eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 hat oder umfasst.
4. DNA-Aptamer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine modifizierte Nukleotid ein 2'-Desoxy, 2'-Halogenid-, 2'-Amino-, 2'- O-Methyl- oder 2'-Methoxyethyl-Nukleotid ist.
5. DNA-Aptamer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-Aptamer PEGyliert ist.
6. Nukleinsäure, umfassend oder bestehend aus einem Oligomer eines DNA-Aptamers nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
7. Nukleinsäure nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligomer zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun oder zehn Wiederholungseinheiten aufweist.
8. Nukleinsäure nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligomer ein Mischoligomer aus mindestens zwei verschiedenen Wiederholungseinheiten ist.
9. Nukleinsäure nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Mischoligomer
mindesten eine Wiederholungseinheit eines DNA-Aptamers nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und mindestens eine Wiederholungseinheit eines E-Selektin und/oder P-Selektin spezifisch bindenden DNA-Aptamers gemäß SEQ ID NO: 2 oder 3, oder eines E-Selektin und/oder P-Selektin spezifisch bindenden Fragments davon, umfasst.
10. DNA-Aptamer nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 6 bis 9 zur Verwendung als Medikament.
11. DNA-Aptamer nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 6 bis 9 zur Verwendung als Medikament gegen Entzündung und/oder Krebs und/oder zur Förderung der Geweberegeneration.
12. Arzneimittel, umfassend ein DNA-Aptamer nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 6 bis 9.
13. Verwendung eines DNA-Aptamers nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder einer
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 6 bis 9 zum Nachweis und/oder zur Darstellung und/oder zur Isolierung von a6-Integrin, vorzugsweise a6ß4-Integrin, oder von Zellen, die ein a6-Integrin, vorzugsweise a6ß4-Integrin, präsentieren.
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