MTEA在诊断和治疗恶性肿瘤中的应用
发明领域
本发明涉及恶性肿瘤的诊断和治疗领域。特别地,本发明涉及新的恶性肿瘤标记物,多肿瘤表达抗原(Multiple Tumor Expressed Antigen,MTEA)(原名为MEA6/11)在诊断和治疗恶性肿瘤如肝癌中的应用以及诊断试剂盒或药物组合物。本发明还提供了制备MTEA蛋白作为抗原的方法。
发明背景
很多恶性肿瘤病人能产生针对自身肿瘤的免疫抗体,如黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌等(Real et al.,1988;Ben-Mahrez et al.,1990;Gallagheret al.,1991;Disis et al.,1994;Disis and Cheever,1996;Boon and Lloyd et al.,1997),在这些肿瘤中存在能产生免疫反应的肿瘤相关抗原。有证据表明,良性的脑脊膜瘤同样能够诱导病人产生免疫反应。尽管近年来早期检测和手术切除肝肿瘤显著改善了患者的生存率,但是大多数肿瘤在肿瘤进展期间即在非致命期仍无法被早期检测出。
全世界乙肝病毒携带者约3.5亿,乙型肝炎(以下简称“乙肝”)也是发病率最高的传染病之一。我国是乙肝的高发区,情况尤为严重,乙肝病毒携带者占全世界感染者总数1/3以上,约1.3亿人。在我国乙肝病毒携带者中,大约有3000万人是慢性乙肝患者。乙肝可进一步发展为肝硬化、肝癌和肝衰竭。85-90%的肝癌患者有乙肝病史,乙肝病毒的持续感染被认为是患肝癌的最主要原因,其次是丙型病毒感染。在发达国家包括欧美和日本,丙型病毒感染和酒精性肝硬化是肝癌发生的主要因素。目前,临床上建议乙肝病毒携带者,慢性乙肝和肝硬化患者每年常规进行肝癌检查。
肝癌的临床诊断和治疗是世界性难题。在全世界范围内,肝癌致死人数排在所有肿瘤中的第三位。近年来,发达国家包括北美,欧洲和日本由于丙肝病毒感染的增加,肝癌的发病率在不断提高,严重影响着国民的身体健康与经济发展(Sun and Karin,Oncogene 2008)。中国肝癌发病率比欧美高5-10倍,在男性癌症中列第3位,女性中第4位。每年发病率>150/10万,恶性程度高,治疗效果差,死亡率为100.9/10万人。占恶性肿瘤死亡率第二位。
目前肝癌临床检查,首选检测项目为血清甲胎蛋白(AFP)。目前,AFP单克隆抗体酶免法(EIA)快速测定法和电化学发光法检测最为常用,其阳性率在60%~80%之间。一般认为AFP>400μg/L时,可对原发性肝癌确定诊断,但约有15%左右原发性肝癌患者血清中AFP始终不高,故AFP不高者不能排除原发性肝癌。
甲胎蛋白作为肝癌检测标准最大的问题是假阳性率极高。甲胎蛋白数值高的患者中真正的阳性率为60%,40%是假阳性,包括各种肝病病人和孕妇都会造成数值的偏高,所以甲胎蛋白高不一定是肝癌。上海瑞金医院报告在急性黄疸型肝炎、急性无黄疸型肝炎、慢性肝炎及肝硬化各60例,测得AFP含量在25~40μg/L者分别占13.3%、11.7%、3.5%和41.7%。因此对于低水平AFP的肝病患者,特别是50~400μg/L左右者,应进行多项动态检测才能与肝癌进行鉴别。
脑脊膜瘤表达抗原6/11(Meningioma expressed antigen 6/11,MEA6/11或MGEA6/11)最初是Heckel等人用脑脊膜瘤病人的血清筛选脑脊膜瘤表达文库时发现的(Heckel,et al.,1997)。在对脑脊膜瘤表达文库的筛选中得到20多个阳性克隆,其中8个序列高度同源,其中一个具有最长的开放阅读框2412bp,即MEA6,分子量大约为110kDa。MEA11是MEA6基因的不同剪切体。分析表明14q染色体上的MEA6/11可能是具有表达活性的基因,在其他染色体上存在至少9个假基因(Comtesse et al.,2001),但以后的研究对此存在异议(Usener et al.,2003)。Usener等人在寻找皮肤T淋巴细胞瘤的肿瘤抗原的过程中也发现MEA6/11并将其命名为cTAGE-5C。Comtesse等人发现41.7%(10/24)的脑脊膜瘤病人的血清中能检测到MEA6/11的抗体。在蛋白水平上,脑脊膜瘤和神经胶质瘤样本中的MEA6/11表达量高于正常脑组织(Comtesse et al.,2002)。
MEA6是由804个氨基酸组成的蛋白,其最N端是一个潜在的大约由20个氨基酸组成的跨膜区,位于MEA6的39-59氨基酸处;中间是两个螺旋-螺旋结构域(Coiled-coil,CC),分别位于115~261氨基酸和322~496氨基酸的位置,在第一个CC结构域里还有4个7肽的亮氨酸重复序列,可能具有亮氨酸拉链的作用;MEA6的C端含有高丰度的脯氨酸,大约占22%。这些结构域提示MEA6可能参与蛋白-蛋白之间的相互作用例如与蛋白的SH3结构域或WW结构域相互作用,并可能在信号通路中发挥作用。
发明概述
本发明人发现MEA6/11蛋白能够调节NFκB及JNK信号通路和细胞生长,因而判断MEA6/11基因可能是一种新的癌基因,另外,MEA6/11可在不同肿瘤中高表达,不同肿瘤病人血清中会产生针对它的抗体,因此本发明人将其重新命名为多肿瘤表达抗原(Multiple Tumor Expressed Antigen,MTEA)。
在一个方面,本发明提供了诊断动物例如哺乳动物例如人中恶性肿瘤如肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、白血病、淋巴癌、直肠癌或卵巢癌的存在或者患病风险的方法,包括在所述动物的生物学样品如血液样品或其衍生物中检测MTEA蛋白或其同源物、MTEA的mRNA或其抗体的水平并与对照样品中MTEA蛋白或其同源物、MTEA的mRNA或其抗体的水平比较,其中检测样品中所述MTEA蛋白或其同源物、MTEA的mRNA或其抗体的水平升高是所述哺乳动物中恶性肿瘤存在或者患病风险的指征。
在一个实施方案中,所述哺乳动物是人。在一个实施方案中,所述生物学样品是血清。
在一个实施方案中,本发明使用MTEA蛋白、其同源物或其免疫原性片段检测所述生物学样品如血清中针对MTEA蛋白的抗体的水平,其中所述MTEA蛋白、其同源物或其免疫原性片段包含选自如下序列组成的组中的序列:(a)SEQ ID NO:1,(b)SEQ ID NO:2,(c)SEQ ID NO:3和(d)与(a)-(c)中的序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列相同性的序列。
在一个方面,本发明提供了MTEA蛋白、其同源物或其免疫原性片段在制备用于诊断动物例如哺乳动物中恶性肿瘤例如肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、白血病、淋巴癌、直肠癌或卵巢癌的组合物中的应用。在一个实施方案中,所述哺乳动物是人。在一个实施方案中,所述MTEA蛋白、其同源物或其免疫原性片段包含如下序列组成的组中的序列:(a)SEQ ID NO:1,(b)SEQ ID NO:2,(c)SEQ ID NO:3和(d)与(a)-(c)中的序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列相同性的序列。
在一个方面,本发明提供了用于诊断动物例如哺乳动物中恶性肿瘤例如肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、白血病、淋巴癌、直肠癌或卵巢癌的存在的试剂盒,所述试剂盒包括用于检测所述动物的生物学样品、例如血液样品例如血清或其衍生物中MTEA蛋白或其同源物、MTEA的mRNA或其抗体的水平的制剂。
在一个实施方案中,所述试剂盒包括MTEA蛋白、其同源物或其免疫原性片段,优选所述MTEA蛋白、其同源物或其免疫原性片段包含如下序列组成的组中的序列:(a)SEQ ID NO:1,(b)SEQ ID NO:2,(c)SEQID NO:3和(d)与(a)-(c)中的序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列相同性的序列。
在一个方面,本发明提供了治疗患有恶性肿瘤如肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、白血病、淋巴癌、直肠癌或卵巢癌的动物例如哺乳动物的方法,包括给所述哺乳动物施用MTEA的拮抗剂例如siRNA或针对MTEA蛋白的抗体例如单克隆抗体。在一个实施方案中,所述哺乳动物是人。在一个实施方案中,所述siRNA包含如下序列组成的组中的序列:(a)SEQ ID NO:4、(b)SEQ ID NO:5、(c)SEQ ID NO:6和(d)SEQ ID NO:7。
在一个方面,本发明提供了用于治疗哺乳动物例如人中恶性肿瘤例如肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、白血病、淋巴癌、直肠癌或卵巢癌的药物组合物,所述药物组合物包括治疗有效量的降低MTEA表达的制剂,例如siRNA或针对MTEA蛋白的抗体或其结合片段例如单克隆抗体或其结合片段。在一个实施方案中,所述siRNA干扰包含如下序列组成的组中的序列:(a)SEQ ID NO:4、(b)SEQ ID NO:5、(c)SEQ ID NO:6和(d)SEQ ID NO:7。
在一个方面,本发明提供了MTEA的拮抗剂例如siRNA或针对MTEA蛋白的抗体例如单克隆抗体在制备用于治疗恶性肿瘤如肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、白血病、淋巴癌、直肠癌或卵巢癌的药物组合物中的应用。在一个实施方案中,所述siRNA包含如下序列组成的组中的序列:(a)SEQ ID NO:4、(b)SEQ ID NO:5、(c)SEQ ID NO:6和(d)SEQID NO:7。
在一个方面,本发明提供了制备MTEA蛋白包涵体抗原的方法,所述方法包括:在宿主中表达MTEA蛋白或其同源物,裂解细胞收集沉淀,并将所述沉淀溶于5-8M尿素。在一个实施方案中,所述宿主是表达MTEA基因重组质粒转化的重组蛋白表达细菌如ROSETTA菌株。在一个实施方案中,收集沉淀之后用例如2M尿素(含1% Triton X-100)将沉淀悬起,振荡,静置,弃上清,之后用6M尿素溶解沉淀。
附图简述
图1为MTEA蛋白的结构分析。T:跨膜区,L:亮氨酸拉链结构,CC:螺旋-螺旋结构域,P:脯氨酸富集结构域。
图2为MTEA蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。
图3A:Western分析MTEA蛋白在不同的肿瘤细胞中的表达。β-肌动蛋白作为内参检测总蛋白含量。图3B:在临床肝癌组织样本中MTEA的表达水平,其中对照是邻近切片用IgG染色。
图4示出内源的MTEA与TRAF2和IKKβ相互作用。HEK293细胞(2×107)未经TNFα处理或经TNFα处理3min后用细胞裂解液裂解,分别加入1.5μg的MTEA抗体和1.5μg作为对照的IgG进行内源性免疫共沉淀,用IKKβ和TRAF2的抗体进行Western blot。同时检测细胞裂解液中TRAF2和IKKβ的表达。
图5MTEA激活NF-κB是时间和剂量依赖性的。A:MTEA激活NF-κB是时间依赖性的。将MTEA质粒(黑条)和对照质粒(白条)分别跟0.2μg的NF-κB荧光报告质粒共转进24孔板中的HEK293细胞中,同时每个孔中还转入0.04μg的pRL-TK荧光报告质粒作为内参,转染后24小时和48小时后分别检测荧光报告基因的活性,并用pRL-TK荧光水平平衡转染效率。B:MTEA活化NF-κB具有剂量效应。将1μg,2μg,和4μg的MTEA质粒(黑条)和对照质粒(白条)分别跟0.4μg的NF-κB荧光报告质粒共转进12孔板中的HEK293细胞中,同时每个孔中还转入0.08μg的pRL-TK荧光报告质粒作为内参,转染24小时后裂解细胞检测荧光报告基因的活性,并用pRL-TK荧光水平平衡转染效率。
图6MTEA增强TAB2诱导的NF-κB激活,RNA干涉MTEA对TAB2诱导的NF-κB激活没有影响。
A:MTEA增强TAB2诱导的NF-κB激活。将MTEA质粒或TAB2质粒或MTEA与TAB2的质粒混合物分别跟0.2μg的NF-κB荧光报告质粒共转进24孔板的HEK293细胞中,同时每个孔中转入0.04μg的pRL-TK荧光报告质粒作为内参,转染后24小时后检测荧光报告基因的活性,并用pRL-TK荧光水平平衡转染效率。
B:RNA干涉MTEA对TAB2诱导的NF-κB激活没有影响。将0.7μg的TAB2质粒与1.4μg的siRNA空质粒或者与1.4μg的MTEA的RNA干涉质粒siMTEA共同转染进HEK293细胞中,转染24小时后裂解细胞检测荧光报告基因的活性,用pRL-TK荧光水平平衡转染效率。
C:检测siMTEA对MTEA蛋白的干涉效率。将MTEA的RNA干涉质粒siMTEA和空载体分别转染进HEK293细胞中,24小时后裂解细胞收蛋白进行Western blot,用针对MTEA的抗体检测MTEA的表达量,并用β-actin的表达量作为内参。
图7.RNA干涉肝癌Bel-7402细胞中的MTEA降低了NF-κB的激活。将1μgMTEA的RNA干涉质粒和对照质粒分别转染进24孔板中的HEK293细胞中,24小时后裂解细胞检测荧光报告基因的活性,并用pRL-TK荧光水平平衡转染效率。
图8.肝癌病人产生针对MTEA蛋白的抗体。在293细胞中表达MTEA蛋白,蛋白样品经SDS-PAGE胶分离,转膜,然后分别用来自不同正常人(A)的对照血清和肝癌病人(B)的血清温育。所有的NC膜经striping后,用Flag抗体孵育,结果示于(C)。
图9.初步纯化的MTEA蛋白结果。表达GST融合蛋白的大肠杆菌经诱导,收菌,破碎,取沉淀,清洗杂蛋白后的包涵体经SDS-PAGE胶分离。框中标注的条带对应的是目的蛋白(60%以上),其他的条带为杂带。
图10A-I.部分纯化的MTEA蛋白包涵体作为抗原用于检测肝癌病人、肝炎病人、肝硬化病人和正常人血清中针对MTEA抗体的ELISA结果。
发明详细描述
除非特别指出,本文使用的科学和技术术语应具有本领域技术人员通常已知的含义。另外除非特别需要,则单数术语应包括复数,复数术语应包括单数。前述技术和方法通常根据本领域熟知的及在本说明书引用的参考文献所述的常规方法进行。见例如并入作参考的Sambrook et al.MolecularCloning:A Laboratory Manual(3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001))所述。本文引用的所有参考文献,包括专利、专利申请、文章、教科书等及其中引用的参考文献在此均以其全部并入本文作参考。
本发明人发现MTEA与蛋白TAB2(TAK1-associated binding protein 2)相互作用。TAB2是TAK1复合体中的一个成员,介导了TAK1的磷酸化激活。TAK1复合体的活化会激活下游的NF-κB信号通路和JNK信号通路。本发明人验证了MTEA与TAB2以及TAK1复合体其它成员之间的相互作用,同时还检测了MTEA与上游的TRAF家族蛋白和下游的IKK复合体之间的相互作用,发现MTEA可能参与NF-κB信号通路。
正常情况下细胞内的NF-κB活性受到严格的调控,一旦NF-κB活性失调就可能导致多种疾病的产生。大量的研究结果表明NF-κB通路与肿瘤细胞的发生、增殖、分化、抗凋亡,以及血管生成、侵袭和转移有密切关系,另外很多肿瘤细胞系中的NF-κB是组成性激活的。组成性的NF-κB激活能导致很多肿瘤如白血病,淋巴癌,直肠癌和卵巢癌等(Rayet,et al.,1999)。抑制肿瘤细胞的NF-κB通路可以阻断细胞周期,诱导细胞调亡。在很多肿瘤细胞中原癌基因能够激活NF-κB信号通路,如MUC1原癌基因在很多的人类肿瘤中高表达,Ahmad等人发现肿瘤细胞中高表达的MUC1能激活NF-κB信号通路(Ahmad et al.,2007)。NF-κB活化后可激活调节细胞生长、凋亡、血管形成和侵袭转移相关的基因表达,因而参与肿瘤的发生过程。
另外,本发明人还在不同的肿瘤细胞中检测了MTEA的表达,发现MTEA在恶性程度高的肿瘤细胞中表达量高于正常细胞,而通过RNA干涉降低MTEA表达则抑制细胞生长。MTEA不仅跟TAB2相互作用,在HEK293细胞中还与TAK1复合体的其它成员TAB1和TAK1相互作用。在HEK293细胞中过表达MTEA能激活NF-κB信号通路,而且这种激活是时间和剂量依赖性的。过表达的TRAF2和TAB2在HEK293细胞中都能激活NF-κB。过表达的MTEA对TRAF2诱导的NF-κB的激活没有影响,但是在TRAF2高表达的情况下用shRNA将MTEA的表达下调后,TRAF2激活NF-κB的倍数下降了一半多。过表达MTEA激活NF-κB大概2.5倍,过表达TAB2激活NF-κB大约25倍,但MTEA和TAB2共表达时NF-κB的激活倍数提高到大概70倍。但是在TAB2高表达的情况下用shRNA将干涉MTEA表达后对NF-κB的激活不产生影响。
本发明人检测了几种肿瘤细胞和正常细胞中MTEA的表达,发现MTEA在肿瘤细胞如肺癌细胞A549和乳腺癌细胞MCF7中高表达,但是在正常的HEK293细胞中表达量比较低。此外MTEA在恶性程度比较高的肝癌细胞HePG2和Bel-7402细胞中高表达,而在恶性程度低的肝癌细胞Changliver中的表达量比较低。因此MTEA可能与肝癌的发生有关。在Bel-7402细胞中转染了MTEA的shRNA干涉质粒siMTEA,发现Bel-7402生长速度明显减慢,甚至凋亡,同时检测了该细胞中的NF-κB的激活水平,结果表明将MTEA RNA干涉后Bel-7402细胞中的组成性的NF-κB激活水平下降了大约40%(图7)。
在一个方面,本发明提供了检测动物例如哺乳动物中恶性肿瘤的存在或者患病风险的方法,包括在所述动物的生物学样品、例如远离肿瘤的生物学样品、例如血液样品或其衍生物中检测MTEA蛋白或其同源物、MTEA的mRNA、或MTEA抗体的水平并与对照样品中MTEA蛋白、MTEA的mRNA或MTEA抗体的水平比较,其中检测样品中所述MTEA蛋白、MTEA的mRNA或MTEA抗体的水平升高是所述哺乳动物中恶性肿瘤存在或者患病风险的指征。
本文所述“恶性肿瘤”是指除了表现为肿瘤本身细胞的失去控制的异常繁殖,还对邻近正常组织的侵犯及经血管、淋巴管和体腔转移到身体其他部位,往往致死的肿瘤或癌症,例如包括肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、白血病、淋巴癌、直肠癌或卵巢癌。
本文所述生物学样品是来自被测动物的任意生物学样品,尤其是包括核酸或者多肽的任意样品。有利地,可以包括下列样品:血液,血浆,血小板,唾液,痰,尿液等等,更一般来说包括核酸或者多肽的任意组织、器官或者有利地生物体液。另外,生物学样品可含有衍生自细胞例如肝细胞的细胞提取物或包括其的细胞群,所述细胞优选是癌性细胞或衍生自怀疑是癌性的组织的细胞。在本发明的体外方法中用于检测的样品通常应以临床可接受的方式收集,例如以保护核酸或蛋白质的方式收集。待测样品可以是肝活检样品或切除物,血液例如血清及其它类型样品。在一个实施方案中,所述样品是源自血液的样品,如血液、血清或者血浆的样品。优选地本发明不需要组织活检,仅从血液样品就能够检测该病。可以通过任意已知技术如通过采血、通过非侵入性技术从样品采集点或者库等等获取样品。还可以预处理所述样品以增加靶分子的可接近性,如通过裂解(机械、化学、酶裂解等等)、纯化、离心、分离等等。还可以标记所述样品以便于靶分子存在的检测(荧光、放射性、发光、化学、酶标记等等)。在一个实施方案中,所述生物学样品是全血样品,即还没有经过分离步骤的血液,其任选可以被稀释。
本文所述MTEA蛋白是指包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽,MTEA同源物是指包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或者更高的同源性的氨基酸序列的多肽。两个蛋白质序列的同源性对应于两个蛋白质链中位于相同或类似位置的相同氨基酸的百分比。用BLAST算法利用BLOSUM 62阵列计算同源性百分比,该算法可在NCBI网站(National Center for Biotechnology Information;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得。优选所述同源物是功能性同源物,即其显示显著的相似性(例如在氨基酸水平大约50%序列相同性)并且如其相应蛋白质一样执行相同功能。至少大约60%,至少大约70%,至少大约80%、至少大约90%或至少大约95%序列相同性的功能性同源物是优选的功能性同源物。
本文所用术语“多肽”,“肽”和“蛋白质”可互换使用,指氨基酸残基的聚合物,其包含经肽键结合的9个或更多个氨基酸。聚合物可以是线性的,分枝的或环状的,可包含天然存在的和/或氨基酸类似物,它可被非氨基酸间断。通常,若氨基酸聚合物是长的(例如超过50个氨基酸残基),其优选称为多肽或蛋白质,但是若其是50个氨基酸长或更短,优选称为“肽”。在本文中,术语“核酸”,“核酸分子”,“多核苷酸”和“核苷酸序列”可互换使用,定义任何长度的多聚物,如聚脱氧核糖核苷酸(DNA)(例如cDNA,基因组DNA,质粒,载体,病毒基因组,分离的DNA,探针,引物和其任何混合物)或聚核糖核苷酸(RNA)分子(例如mRNA,反义RNA)或混合的聚核糖-聚脱氧核糖核苷酸。它们包含单链或双链,线性或圆形,天然或合成的多核苷酸。此外,多核苷酸可包括非-天然存在的核苷酸,例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物和可被非核苷酸组分间断。如果存在,在聚合之前或之后可进行核苷酸修饰。
用于检测MTEA蛋白或其同源物、MTEA的mRNA或其抗体的制剂可以是多肽、核酸、碳水化合物、脂质、小分子量化合物、寡核苷酸、寡肽、RNA干扰(RNAi)、反义RNA、重组蛋白质、抗体、或者其缀合物或融合蛋白。关于RNAi,可见Milhavet O,Gary DS,Mattson MP.(Pharmacol Rev.2003Dec;55(4):629-48.Review.),关于反义RNA,可见Opalinska JB,Gewirtz AM.(Sci STKE.2003Oct 28;2003(206):pe47)。
例如,为了确定疑似患有恶性肿瘤的患者中MTEA蛋白或其同源物的水平,本发明的方法可以使用结合MTEA蛋白或其同源物的配体测定来自患者的生物学样品中MTEA蛋白或其同源物的水平(浓度或绝对量),在患者的所述生物学样品中MTEA蛋白或其同源物水平升高指示所述患者中存在恶性肿瘤或者具有患病风险。
本文所述配体可以是受体靶向物质、细胞因子、激素、生长因子、受体特异性抗体以及模式识别受体(PRR)配体。在一个实施方案中,所述配体是抗体(或其抗原结合片段)。可以利用本领域技术人员已知的任意技术揭示或者分析样品中的MTEA蛋白,尤其是例如利用特异性配体,如抗体或者片段或者抗体衍生物。优选所述配体是所述蛋白的特异性抗体或者这类抗体的片段(如Fab,Fab',CDR等等)或者这类抗体的衍生物(诸如单链抗体,ScFv)。通过检测靶和配体的复合物如利用标记的配体、利用第二种标记的检测配体等等可以检测样品中靶蛋白的存在或者量。可以使用公知的免疫技术包括ELISA,RIA等等。
可以通过常规技术尤其是利用包括所述蛋白(或者其免疫原性片段)的免疫原免疫非人动物并回收抗体(多克隆)或者生成细胞(以产生单克隆抗体)产生靶蛋白的特异性抗体。用于制备多克隆或者单克隆抗体、ScFv片段以及人的或者人源化抗体的技术例如在下列文献中描述:Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,CSH Press,1988;Ward et al.,Nature 341(1989)544;Bird et al.,Science 242(1988)423;WO94/02602;US5,223,409;US5,877,293;WO93/01288。
还可以利用质谱分析相关领域的技术人员已知的技术检测蛋白质表达和/或结构的变化,这类技术一般来说被分到蛋白质组分析名下,以便检测患者血液中的特异性特征序列。
或者,本发明的方法可以使用MTEA蛋白抗原或其免疫原性片段来测定来自患者的生物学样品中针对MTEA蛋白抗体的水平(浓度或绝对量),在患者的所述生物学样品中所述针对MTEA蛋白抗体的水平升高指示所述患者中存在恶性肿瘤或者具有患病风险。在一个实施方案中,所述MTEA蛋白或其免疫原性片段包含如下序列组成的组中的序列:(a)SEQ ID NO:1,(b)SEQ ID NO:2和(c)SEQ ID NO:3和(d)与(a)-(c)中的序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列相同性的序列。
或者,本发明的方法可以使用检测MTEA的mRNA的变化的任何检测方法来测定所述生物学样品中MTEA的mRNA的水平,其中所述生物学样品中MTEA的mRNA的水平升高指示所述患者中存在恶性肿瘤或者具有患病风险。上述检测方法包括能够检测样品中核酸的各种技术,如Northern印迹,选择性杂交,使用包被寡核苷酸探针的基材例如核酸分子阵列、DNA芯片等,通过例如RT-PCR、定量PCR或者连接PCR的核酸扩增等等。这些方法可以包括使用能够选择性或者特异性检测样品中核酸靶的核酸探针或者引物。例如,本领域技术人员已知并且可以参考标准条件(Sambrook,Fritsch,Maniatis(1989)Molecular Cloning,Cold Spring Harbor LaboratoryPress)进行杂交,例如可以在高、中或者低严格性条件下进行杂交。或者,本领域技术人员可以利用已知的各种方法进行扩增,如PCR、LCR、转录介导的扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)、NASBA、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)的使用、等位基因特异性扩增、Southern印迹、单链构像分析(SSCA)、原位杂交(例如FISH)、凝胶迁移、异源双链分析等等。
本文所述“抗体”、“抗原结合片段”或“免疫原性部分”均具有本领域技术人员通常已知的含义。例如抗体的“抗原结合片段”是指通过重组DNA技术或者通过酶或化学切割完整的抗体而产生的,包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv和单链抗体(svFc)。抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体及可以是标记的抗体以及所述抗体的片段、变体或衍生物。抗体标记可以是放射性标记、荧光标记、酶标记、化学发光标记或者生物素基团标记。抗体或其片段其制备及使用是熟知的并且公开在例如Harlow,E.and Lane,D.,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1999。
本文所述“水平升高”是指通过检测上述生物学样品获得的值与参照值例如在未患恶性肿瘤例如肝癌的患者或者正常人中观察到的中间值或者平均值相比升高至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%或至少30%,例如升高5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或者100%。
在一个方面,本发明还提供了特异性检测MTEA蛋白或其同源物、MTEA的mRNA或针对MTEA蛋白抗体的制剂在制备用于诊断动物例如哺乳动物中恶性肿瘤例如肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、白血病、淋巴癌、直肠癌或卵巢癌的组合物中的应用。在一个实施方案中,所述制剂是MTEA蛋白或其同源物的配体。本文所述配体可以是受体靶向物质、细胞因子、激素、生长因子、受体特异性抗体以及模式识别受体(PRR)配体。在一个实施方案中,所述配体是抗体(或其抗原结合片段)。在一个实施方案中,所述哺乳动物是人。在配体是抗体的实例中,所述抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体及可以是标记的抗体以及所述抗体的片段、变体或衍生物,或者所述抗原结合片段是Fab、Fab'、F(ab')2、Fv和单链抗体(svFc)。在一个实施方案中,所述制剂是用于检测来自所述动物的生物学样品中针对MTEA蛋白抗体的MTEA蛋白或其免疫原性片段。在一个实施方案中,所述哺乳动物是人。在另一个实施方案中,所述MTEA蛋白、其同源物或其免疫原性片段包含如下序列组成的组中的序列:(a)SEQ ID NO:1,(b)SEQ ID NO:2,(c)SEQ ID NO:3和(d)与(a)-(c)中的序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列相同性的序列。
在一个方面,本发明还提供了用于检测动物例如哺乳动物中恶性肿瘤例如肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、白血病、淋巴癌、直肠癌或卵巢癌的存在的试剂盒,所述试剂盒包括用于检测来自所述动物的生物学样品、例如血液样品或其衍生物中MTEA蛋白或其同源物、MTEA的mRNA或其抗体的水平的制剂。所述试剂盒包括可以用于实施本发明所述方法的任意物质。在一个实施方案中,本发明的试剂盒包括特异性针对MTEA蛋白或其同源物的抗体。在一个实施方案中,本发明的试剂盒包括MTEA蛋白、其同源物或其免疫原性片段。在一个实施方案中,所述MTEA蛋白、其同源物或其免疫原性片段包含如下序列组成的组中的序列:(a)SEQ IDNO:1,(b)SEQ ID NO:2,(c)SEQ ID NO:3和(d)与(a)-(c)中的序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列相同性的序列。
在一个方面,本发明提供了治疗动物例如哺乳动物中恶性肿瘤例如肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、白血病、淋巴癌、直肠癌或卵巢癌的方法,所述方法包括给所述动物施用治疗有效量的MTEA拮抗剂从而使MTEA蛋白或其同源物和/或至少一种RNA水平降低。在一个实施方案中,所述拮抗剂是特异性针对MTEA蛋白或其同源物的抗体。
在另一个实施方案中,所述拮抗剂是双链RNA(dsRNA),例如短干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)。“至少一种RNA分子”可以是任意类型的RNA,包括但不限于mRNA,snRNA,微小RNA和tRNA。RNA干扰(RNAi)尤其可用于特异性抑制特定RNA和/或蛋白的产生。适于本发明的dsRNA分子的设计和产生在本领域技术人员的能力范围内,尤其参考Waterhouse等(1998),Smith等(2000),WO 99/32619,WO 99/53050,WO99/49029和WO 01/34815。优选的siRNA分子包括与靶mRNA的约19到23个连续核苷酸相同的核苷酸序列。“shRNA”表示一种siRNA分子,其中少于约50个核苷酸与位于相同RNA分子上的互补序列碱基配对,所述序列与互补序列被至少约4到15个核苷酸的不配对区域(在碱基互补的两个区域产生的茎结构上形成单链环)分开。存在公认的siRNA设计标准(见例如Elbashire et al.,2001;Amarzguioui et al.,2004;Reynolds et al.,2004)。详细内容可以参见数个商品供应商的站点,如Ambion,Dharmacon,GenScript和OligoEngine。一旦设计好,用于本发明方法的dsRNA可以通过本领域已知的任意方法产生,例如通过体外转录,重组,或通过合成方式。siRNA可以在体外产生,通过使用重组酶(如T7 RNA聚合酶)和DNA寡核苷酸模板,或可以在体内制备,例如在培养的细胞中。在优选的实施方案中,核酸分子是合成产生的。在一个实施方案中,所述siRNA包括选自由SEQ ID NO:4、5、6和7组成的组中的核苷酸序列。
在一个方面,本发明提供了用于治疗动物例如哺乳动物中恶性肿瘤例如肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、白血病、淋巴癌、直肠癌或卵巢癌的药物组合物,其包含治疗有效量的MTEA拮抗剂。在一个实施方案中,所述拮抗剂是特异性针对MTEA蛋白或其同源物的抗体。在另一个实施方案中,所述拮抗剂是特异性针对MTEA的siRNA。在一个实施方案中,所述siRNA包括选自由SEQ ID NO:4、5、6和7组成的组中的核苷酸序列。
在一个方面,本发明还提供了MTEA拮抗剂在制备用于治疗动物例如哺乳动物中恶性肿瘤例如肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、白血病、淋巴癌、直肠癌或卵巢癌的药物组合物中的应用。在一个实施方案中,所述拮抗剂是特异性针对MTEA蛋白或其同源物的抗体。在另一个实施方案中,所述拮抗剂是特异性针对MTEA的siRNA。在一个实施方案中,所述siRNA包括选自由SEQ ID NO:4、5、6和7组成的组中的核苷酸序列。
本发明的药物组合物包括例如适于口服、直肠、鼻、局部、腹膜和胃肠外(包括肌内、皮下或静脉内)给予的那些组合物。优选通过口服或静脉内途径给予。本发明的药物组合物包括本领域确定的任何药物剂量形式,例如包囊、丸剂、片剂、粉末、颗粒(例如珠、颗粒或晶体)、气雾剂、喷雾剂、泡沫、溶液、分散剂、酊剂、糖浆、酏剂、悬浮液、软膏和乳剂。本发明的所述药物组合物可以包含药物可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂例如包括但不限于乳糖,蔗糖,淀粉,滑石粉,硬脂酸镁,氧化镁,结晶纤维素,甲基纤维素,羧甲基纤维素,明胶,甘油,海藻酸钠,盐水和水,也可以包含添加剂,如充填剂、结合剂、增湿剂、助流剂、稳定剂、防腐剂、乳化剂及另外的溶剂或者增溶剂或者实现储存效应的物质。
在一个方面,本发明还提供了制备MTEA蛋白包涵体抗原的方法,所述方法包括:在宿主中表达MTEA蛋白或其同源物,裂解细胞收集沉淀,并将所述沉淀溶于5-8M、优选6-8M、优选6M尿素。
本文所述重组蛋白表达宿主细胞可以是本领域使用的任何真核细胞或原核细胞,例如HEK293,HEK293T,CHO,S2,E coli.细胞等。在一个实施方案中,所述宿主是表达MTEA基因重组质粒转化的重组蛋白表达细菌如ROSETTA菌株。在一个实施方案中,收集沉淀之后用例如2M尿素(含1%Triton X-100)将沉淀悬起,振荡,静置,弃上清,之后用5-8M、优选6-8M、优选6M尿素溶解沉淀。
细胞培养是本领域技术人员公知的,可参见例如J.Perbal,A PracticalGuide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984),J.Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour LaboratoryPress(1989)和F.M.Ausubel et al.(editors),Current Protocols in MolecularBiology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988),Ed Harlow andDavid Lane(editors)。裂解细胞典型地包括破裂细胞膜和/或核膜以释放其中含有的核酸和/或蛋白质。可以使用化学方法、物理方法、机械方法及其组合用于裂解细胞。本领域由教科书等可以得知用于裂解细胞的方法。
实施例
本发明通过下述实施例进一步阐明,但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定,结合本说明书和本领域一般常识,本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下,本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变,这种修改和改变也包含在本发明的范围内。
实施例1:构建表达FLAG-MTEA的表达载体
克隆基因
将人HEK293细胞系在DMEM培养基(Hyclone公司)中培养。为了克隆MTEA基因,使用Trizol reagent(购自美国Molecular Research Center公司),根据厂商提供的方案从HEK293细胞中提取总RNA。使用10ug总RNA和Superscript II Reverse-Transcription kit(Invitrogen)按照厂商推荐的方案进行逆转录和PCR,用于基因扩增的PCR引物在表1中提供。
表1
将获得的DNA片段用EcoR I和Sal I消化并插入用相同的酶限制的载体pCDNA3.1(Invitrogen)中,获得的质粒命名为pCDNA.MTEA。克隆的MTEA基因测序显示与GENE ID:4253 CTAGE5所述的MEA6/11基因序列相同,符合预期序列。
实施例2:肿瘤细胞和肿瘤组织中内源MTEA的表达
为了在蛋白水平上检测MTEA在哺乳动物细胞中的表达情况,本发明人设计了两条多肽S20309(SEQ ID NO.2:HSYQGQIISHEKKAH)和S21311(SEQ ID NO.3:NEPATEHPEPQQET),根据本领域常规免疫方法分别用所述多肽免疫兔获得兔抗MTEA蛋白的多克隆抗体(该抗体可识别人源、大鼠和小鼠的MTEA蛋白,北京奥维亚生物技术有限公司)。
为了检测上述多克隆抗体的特异性,在HEK293细胞中表达实施例1中构建的pCDNA.MTEA,HEK293细胞在转染前24小时接种于24孔板中,接种量以转染时细胞密度达到80%为准,24小时后用Vigofect(VigorousBiotechnology,Inc.)根据厂商推荐程序进行转染。每个样品设三个平行组,适量加入空载体以保持每组转染的DNA总量相等。每孔加入0.2μg NF-κB荧光报告质粒(Promega),为了平衡转染效率,同时加入0.04μg pRL-TK荧光报告质粒(Promega)作为内参。转染后24小时进行检测,用Promega公司的荧光素酶检测试剂盒检测NF-κB荧光报告基因及pRL-TK荧光报告基因的活性。转染后提取细胞蛋白,进行Western blot检测,可参见Xu Z.andGreene L.(2006)Regulation of the apoptotic JNK pathway.Methods Enzymol406:479-89。如图3C所示,所述多克隆抗体可特异性识别MTEA蛋白。
提取HEK293细胞、Changliver良性肿瘤细胞、肝癌细胞株Bel-7402、HepG2、肺癌细胞株A549和乳腺癌细胞株MCF7的蛋白,并用抗S21311抗体和抗S20309抗体进行Western blot检测,可参见Xu Z.and Greene L.(2006)Regulation of the apoptotic JNK pathway.Methods Enzymol406:479-89.
选择了几种不同的肿瘤细胞和正常的细胞来检测MTEA在不同细胞中表达量的差别,发现MTEA在正常的HEK293细胞和肝脏Changliver良性肿瘤细胞中的表达量相对较低一些,但是在恶性程度比较高的肝癌细胞株Bel-7402和HepG2中的表达量明显高,而且在检测的其他种类的肿瘤细胞中的表达量也相对较高,如肺癌细胞株A549和乳腺癌细胞株MCF7(图3A)。
本发明人对九十余例临床肝癌组织样本中MTEA的表达进行了检测。将1μg/μl的抗S21311抗体以1:50稀释,通过免疫组化检查发现MTEA在肝癌中的表达水平明显高,并且与肝癌的恶性程度密切相关(图3B),结果见下表2
|
-或+/- |
+ |
++ |
总共 |
正常组织 |
18(100%) |
|
|
18 |
肝癌I期 |
4(25%) |
9(56.2%) |
3(18.8%) |
16 |
肝癌II期 |
2(5.1%) |
21(51.3%) |
17(43.6%) |
39 |
肝癌III期 |
|
21(52.5%) |
14(47.5%) |
40 |
实施例3:MTEA与TRAF2和IKKβ的相互作用
利用HEK293细胞进行内源性蛋白的免疫共沉淀,可参见Xu Z andGreene L.(2006)Methods Enzymol 406:479-89。HEK293细胞(2×107个细胞)未经TNFα处理或经TNFα10ng/ml处理3min后用细胞裂解液裂解,分别加入1.5μg的MTEA抗体(抗S21311抗体,如上述)和1.5μg作为对照的IgG(Santa Cruz)进行内源性免疫共沉淀,用IKKβ和TRAF2的抗体(CellSignaling)进行Western印迹。同时检测细胞裂解液中TRAF2和IKKβ的表达。
结果表明内源MTEA可以与内源TRAF2和IKKβ相互作用(图4),说明MTEA在HEK293细胞中存在于TRAF和IKK复合体中,而且MTEA与TRAF2和IKKβ的相互作用与TNFα处理与否没有关系。
实施例4:过表达MTEA激活NF-κB通路
我们用荧光素酶的方法研究了MTEA是否参与NF-κB信号通路活化的调控。在HEK293细胞中表达实施例1中构建的pCDNA.MTEA,HEK293细胞在转染前24小时接种于24孔板中,接种量以转染时细胞密度达到80%为准,24小时后用Vigofect(Vigorous Biotechnology,Inc.)根据厂商推荐程序进行转染。每个样品设三个平行组,适量加入空载体以保持每组转染的DNA总量相等。每孔加入0.2μg NF-κB荧光报告质粒(Promega),为了平衡转染效率,同时加入0.04μg pRL-TK荧光报告质粒(Promega)作为内参。转染后24小时进行检测,用Promega公司的荧光素酶检测试剂盒检测NF-κB荧光报告基因及pRL-TK荧光报告基因的活性。
结果表明过表达MTEA可提高NF-κB荧光报告基因的活性,即激活NF-κB,并且这种激活是时间依赖性的,转染24小时后NF-κB激活了大约2.5倍,而48小时后NF-κB激活了将近5倍(图5A)。我们同时检测了不同剂量的MTEA质粒(1、2、4μg)对NF-κB激活的影响,发现MTEA激活NF-κB具有剂量效应,随着转染质粒量的增加,激活倍数也增加(图5B)。
实施例5:过表达MTEA对TAB2激活NF-κB信号通路的影响
我们检测了过表达的MTEA对TAB2激活NF-κB信号通路的影响。HEK293细胞在转染前24小时接种于24孔板中,接种量以转染时细胞密度达到80%为准,24小时后用Vigofect(Vigorous Biotechnology,Inc.)根据厂商推荐程序进行转染。每个样品设三个平行组,适量加入空载体以保持每组转染的DNA总量相等。每孔加入0.2μg NF-κB荧光报告质粒(Promega),为了平衡转染效率,同时加入0.04μg pRL-TK荧光报告质粒(Promega)作为内参。转染后24小时进行检测,用Promega公司的荧光素酶检测试剂盒检测NF-κB荧光报告基因及pRL-TK荧光报告基因的活性。
在HEK293细胞中过表达MTEA(质粒pCDNA.MTEA)、TAB2(质粒HA-TAB2,来自HB Shu实验室,J.Biological Chemistry 2007 282(23):16776-782)以及共表达MTEA和TAB2,然后进行荧光素酶检测(如实施例4)。
结果表明HEK293细胞中过表达的MTEA激活NF-κB大概2.5倍,过表达的TAB2激活NF-κB大约25倍,但是当把MTEA和TAB2在HEK293细胞中共表达时NF-κB的激活倍数提高到大概70倍(图6A)。
实施例6:降低MTEA表达对TAB2激活NF-κB信号通路的影响
为了检测MTEA表达水平下降以后对TAB2诱导的NF-κB活化的影响,设计了多条可干涉MTEA表达的siRNA,例如包括gctaagttaaatgcttctt(SEQID NO:4),ggtctctgtcacctccat(SEQ ID NO:5),gcaagaggcccattcttga(SEQID NO:6)和gttctaattctggtagact(SEQ ID NO:7)等。siRNA寡核苷酸由Invitrogen合成并克隆入PGC-U6-GFP(Invitrogen),并检测了其对MTEA的干涉效率,结果表明不同的siRNA与pCDNA.MTEA共转染HEK293细胞,这些siRNA干涉HEK293细胞内过表达的MTEA的效率由60-90%不等(数据未示出)。HA-TAB2真核表达质粒单独或者跟克隆了MTEA的siRNA(ggtctctgtcacctccat)的质粒共转染进HEK293细胞中,转染24小时后检测荧光素酶的活性(如实施例4)。
结果表明该siRNA能明显减低MTEA的表达(图6C)。而且MTEA蛋白被RNA干涉以后TAB2诱导的NF-κB的激活没有影响(图6B)。
实施例7:抑制MTEA降低NF-κB存活
为了检测降低MTEA的表达对于肿瘤细胞中NF-κB通路以及细胞存活的影响,测定了在Bel-7402细胞中转染RNA干涉质粒后细胞中NF-κB组成性活性。
培养Bel-7402细胞(Bel-7402细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中,37℃,5%二氧化碳培养箱培养),转染siRNA干涉质粒(siRNA序列:ggtctctgtcacctccat,实施例6)。
结果(图7A)表明在Bel-7402细胞中经RNA干涉后,NF-κB组成性活性下降大约40%,细胞生长也明显减慢(图7B)。
实施例8:绝大多数肝癌病人而非正常人产生针对MTEA蛋白的抗体。
在HEK293细胞中表达pCDNA.MTEA:HEK293细胞在转染前24小时接种于6孔板中,转染时细胞密度80%,每孔用Vigofect转染2ugpCDNA.MTEA。用300ul 2xSample buffer裂解细胞,超声破碎后跑10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳及转膜操作方法参照《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等,1999)。转膜后将膜按孔道裁开,NC膜用封闭液5%脱脂牛奶/TBST(150Mm NaCl,25mM Tris,0.15% Tween-20,pH7.4)室温温育1小时后,分别跟正常的人血清(15例)及肝癌病人(35例)的血清(1:3稀释)进行免疫反应,4℃温育4小时或过夜,用HRP偶联的抗人二抗孵育后进行显色分析。为了验证肝癌血清识别的带为MTEA蛋白,所有的NC膜经striping后,用Flag抗体孵育,得以证实。
结果(见图8)表明肝癌病人产生针对MTEA蛋白的抗体,而正常人的血清中没有检测到MTEA蛋白抗体。
实施例9:用ELISA法检测肝癌,肝炎和肝硬化病人中MTEA蛋白抗体水平
1:MTEA蛋白抗原的制备
1).将MTEA基因片段(SEQ ID NO:10)克隆到大肠杆菌表达载体pGEX2T并转化至ROSETTA菌株中以表达GST融合蛋白(参见Xu Z.andGreene L.(2006)Methods Enzymol 406:479-89,J.Sambrook et al.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press,1989)。
2).挑单克隆至5mL LB培养基中,37℃过夜培养。
3).次日早上,将过夜培养物加入到1L LB培养基中,培养至OD600为0.6-0.8区间,加入IPTG至终浓度为1mM,37℃诱导3个小时。
4).收菌。
5).将菌溶于100ml PBS中,分别加入DTT,PMSF和RNase至终浓度为1mM。冰上超声,超5秒停5秒,每次20分钟,共两次。
6).将超声后的菌液13000rpm/min离心(Hettich,D-78532)30分钟。弃上清,收集沉淀。
7).PBS洗沉淀一次。
8).用2M Urea(含1%Triton X-100)将沉淀悬起,振荡,静置5分钟,13000rpm/min离心30分钟。弃上清。
9).重复步骤8,用4M Urea将沉淀悬起,振荡,静置,离心。用6M尿素溶解沉淀。
10).跑10%SDS-PAGE胶检测包涵体纯化效果,并定浓度(1ug/uL,见图9)。
2:血清样品准备
所有病人和正常人血清来自解放军302医院(所有人均签署了知情同意书),血液经离心(1000rpm)获得血清。对得自126名肝癌病人(已临床诊断为I-III期肝癌肝癌)、28名肝炎病人(临床诊断为乙肝)、20名肝硬化病人(已临床诊断为病毒性肝硬化)和83名正常人的血清样品进行双盲ELISA研究。
3:ELISA实验
A.包被板:
1).使用50-100ul、在包被溶液(50mM Carbonate-bicarbonate pH 9.4)中的步骤1获得的MTEA蛋白(1.3ug/ml,作为抗原)包被每个孔;
2).室温保温至少2小时或4℃过夜。
B.测定:
1).用洗涤缓冲液(具有0.05%Tween的PBS)洗板一次,
2).每孔加入200ul的1X Assay Buffer
-1X Assay Buffer=1X具有0.05%Tween+1%BSA的PBS
-室温封闭板2小时,不摇动
3).吸干板
4).加入样品(100ul)
-用1X Assay Buffer或1X PBS稀释的步骤2的血清样品
5).室温保温板3小时,在摇床上摇动
6).用洗涤缓冲液洗板3次
7).加入100ul于1X Assay Buffer中1:20,000-400,000稀释的二抗(SantaCruz兔抗人)
8).室温保温板2小时,在摇床上摇动
9).用洗涤缓冲液洗孔3次
10).加入100ul的TMB底物(北京康为世纪生物科技有限公司TMB底物显色试剂盒(可溶型)(货号:CW0050))
11).室温保温样品20-25分钟
12).加入50ul的1N H2SO4
13).读数OD 450nm。
结果显示(图10),用现有的ELISA法,85%-95%肝癌病人血清中针对MTEA蛋白抗体水平高于正常人,而肝炎病人和肝硬化病人中针对MTEA蛋白抗体水平接近或低于正常人,肝癌病人血清中针对MTEA蛋白的抗体含量显著高于正常人、肝硬化病人和肝炎病人血清中的含量,表明MTEA可以作为肝癌的指征。