KR20120062299A - 평활근－２２α 를 이용한 항암제 또는 감마선에 의한 세포 노화 유도 방법 - Google Patents
평활근－２２α 를 이용한 항암제 또는 감마선에 의한 세포 노화 유도 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 평활근-22α(smooth muscle-22α, SM22α)를 이용한 항암제 또는 감마선에 의한 세포 노화 유도 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 간암 세포주에서 MMS(methyl methanesulfonate)의 처리에 의해 증가하는 SM22α가 암세포의 성장을 저해하고, 메탈로티오네인(metallothionein) 1G(MT-1G)의 발현을 증진시키며,세포노화 유도에 관여하는 p16INK4a/pRB 신호기작을 조절하여 세포 성장을 억제할 뿐 아니라, 저선량의 감마선 조사나 소량의 독소루비신(doxorubicin)이 첨가될 경우 세포 노화를 유도하는 효과가 있음을 확인하였으므로, 상기 SM22α 단백질, 또는 SM22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 암 예방 및 치료용 조성물, 항암 보조용 조성물, 또는 건강식품의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 평활근-22α(smooth muscle-22α, SM22α)를 이용한 항암제 또는 감마선에 의한 세포 노화 유도 방법에 관한 것이다.
세포복제의 노화(replicative cellular senescence)는 비가역적이며 영구적으로 세포주기를 지연 또는 정지시키는 과정이며, 외인성 또는 내인성 요인의 스트레스 및 손상에 대응하는 세포의 반응으로 인식되며, 베타-갈락토시다제(β-galactosidase)와 같은 유전자 발현의 변형된 패턴을 나타낸다[J. Campisi, F. d’Adda di Fagagna, Cellular senescence: when bad things happen to good cells, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8 (2007):729-740]. 이러한 과정은 텔로미어(telomere)-의존적 기작, 온코진(oncogene)-유도 기작 그리고 ROS 유도 기작에 의해 매개되는 것으로 알려져 있다[H. Zhang, Molecular signaling and genetic pathway of senescence: its role in tumorigenesis and aging, J. Cell. Physiol. 210 (2007):567-574; M. Ozturk, A. Arslan-Ergul, S. Bagislar, S. Senturk, H. Yuzugullu, Senescence and immortality in hepatocellular carcinoma, Cancer Lett. 286 (2009):103-113]. 세포 노화는 조직의 재생 및 신생(tissue renewal)등에 치명적이기 때문에 생명체에 해로운 효과를 유발할 수도 있지만(tissue aging) 세포분열이 왕성한 종양세포에서는 영구적인 세포 성장 억제(tumor suppressor)를 유발하기 때문에 이로울 수도 있다(anti- tumorigenesis). 세포 노화가 세포분열의 수를 제한하는 메커니즘으로 오랫동안 알려져 왔기 때문에, 노화를 빠르게 유도하는 것은 불멸(immortal)로 정의되는 암세포의 치료에 가능성 있는 중요한 전략으로 간주되고 있다.
따라서 항암 치료방법으로써 세포 노화 유도 방법에 대해서 서로 다른 암세포주를 이용한 수많은 연구들은 유전적인 측면뿐만 아니라 화학적 그리고 생물학적 치료에 의한 세포복제 노화 억제에 대한 증거를 제시해왔다[C.A. Schmitt, J.S. Fridman, M. Yang, S. Lee, E. Baranov, R.M. Hoffmann, S.W. Lowe, A senescence program controlled by p53 and p16ink4acontribute to the outcome of cancer therapy. Cell 109 (2002):335-346; C.A. Schmitt, Cellular senescence and cancer treatment, Biochim. Biophys. Acta 1775 (2007):5-20; J. Ewald, J. Desotelle, M. Almassi, D. Jarrard, Drug- induced senescence bystander proliferation in prostate cancer cells in vitro and in vivo, Br. J. Cancer 98 (2007):1244-1249; J. Zhu, D. Woods, M. Mcmahon, J.M. Bishop, Senescence of human fibroblast induced by oncogene Raf, Oncogene 12 (1998):2997-3007].
평활근-22α(smooth muscle-22α, SM22α)는 액틴 결합 단백질의 일종이며 정상적으로 성숙한 척추동물의 평활근 조직에 풍부하게 발현된다[W. Nishida, Y. Kitam, K. Hiwada, cDNA cloning and mRNA expression of calponin and SM22α in rat aorta smooth muscle cells, Gene 130 (1993):297-302]. 이 단백질의 발현은 배발생 과정 동안 평활근 분화의 초기 마커 중 하나인 것으로 알려져 있다[L. Li, J.M. Miano, P. Cserjesi, E.N. Olson, SM22α, a marker of adult smooth muscle, is expressed in multiple myogenic lineages during embryogenesis, Circ. Res. 78 (1996):188-195]. SM22α는 또한 다양한 세포에서 서로 다르게 발현된다. 이 단백질은 수많은 암세포주에서 발현량이 현저히 감소되어 있고, 이러한 저발현은 형질전환을 개시하는 초기 민감 마커로써 작용하는 것으로 보인다. 인간의 SM22α 유전자는 세포복제 노화에서 변화되는 유전자들을 확인하기 위한 연구를 수행하는 과정에서 처음 클로닝되었고, 이 유전자의 과발현은 노화의 마커로써 잘 알려져왔다[E.S. Gonos, A. Derventzi, M. Kveiborg, G. Agiostratidou, M. Kassem, B.F. Clark, P.S. Jat, S.I. Rattan, Cloning and identification of genes that associate with mammalian replicative senescence, Exp. Cell. Res. 240(1)(1998):66-74].
본 발명자들의 이전 연구에서, 폴리아민(polyamine) 합성과 연관된 특정 유전자들의 발현 또는 티오레독신(thioredoxin) 유전자를 과발현시켰을 경우, 세포 노화와 동시에 SM22α의 세포 내 발현량이 증가되는 것을 발견하였다[J.S. Kim, T.R Kim, K.C Kim, C. Choe, H.W. Chung, E.W. Cho, I.G. Kim, S-Adenosylmethionine decarboxylase partially regulates cell growth of HL-60 cells by controlling the intracellular ROS level: early senescence and sensitization to γ-radiation, Archives Biochem. Biophys. 456(2006)58-70; H.S. Byun, E.W. Cho, J.S. Kim, M.S. Moon, J.J. Yum, K.C. Kim, I.G. Kim, Thioredoxin overexpression in HT-1080 cells induced cellular senescence and sensitization to γ-radiation, FEBS Lett. 579 (2005):4055-4062]. 비록 SM22α의 생리적 역할은 아직 명확하지 않지만, 그 잠재적 기능은 그 몇 가지 다른 이름으로 연구되어 밝혀졌다[J.M. Almendral, J.F. Santar, J. Perera, M. Zerial, R. Bravo, Expression, cloning and cDNA sequence of a fibroblast serum-regulated gene encoding a putative actin-associated protein (p27), Exp. Cell Res. 181 (1989):518-530; C. Shapland, J.J. Hsuan, N.F. Totty, D. Lawson, Purification and properties of transgelin: a transformation and shape change sensitive actin-gelling protein, J. Cell Biol. 121 (1993):1065-1073; P.R. Kemp, J.K. Osbourn, D.J. Grainger, J.C. Metcalfe, Cloning and analysis of the promoter region of the rat SM22α gene, Biochem. J. 310(Pt 3) (1995):1037-1043]: transgelin, SM22α, WS3-10, mouse p27. 현재까지 Ca2 +-독립적으로 평활근 수축과 연관, 섬유육종에서 조직 전이의 억제(MMP-9 suppression), 예정된 세포 사멸 유도, 전립선암에서 안드로겐 수용체 전이활성의 억제 등이 SM22α의 잠재적인 생물학적 기능으로 제시되어 왔다[R.R. Nair, J. Solway, D.D. Boyd, Expression cloning identifies transgelin (SM22α) as a novel repressor of 92-kDa type IV collagenase (MMP-9) expression, J. Biol. Chem. 281 (2006):26424-26436; H.D. Je, U.D. Sohn, SM22α is required for agonist-induced regulation of contractility: evidence from SM22α knockout mice, Mol. Cells 23 (2007):175-181; Z. Yang, Y.J. Chang, H. Miyamoto, J. Ni, Y.J. Niu, Z.D. Chen, Transgelin functions as a suppressor via inhibition of ARA54- enhanced androgen receptor transactivation and prostate cancer cell growth, Mol. Endocrinol. 21(2007):343-358; Z.W. Zhang, Z.M. Yang, Y.C. Zheng, Z.D. Chen, Transgelin induces apoptosis of human prostate LNCap cells through its interaction with p53, Asian J. Androl. 12(2010): 186- 195].
본 발명자들은 간암 세포주에서 MMS(methyl methanesulfonate)의 처리에 의해 세포의 노화가 촉진되고 평활근-22α(SM22α) 단백질의 발현이 증가함을 확인하고, SM22α 단백질과 암세포 노화와의 관련성을 연구하였다. 구체적으로, SM22α 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하고, 이를 간암 세포주에 형질도입하여 제작된 SM22α 과발현 세포주를 이용하여 SM22α의 기능을 분석한 결과, SM22α가 암세포의 성장을 저해하고, 메탈로티오네인(metallothionein) 1G(MT-1G)의 발현을 증진시키며, 세포노화 유도에 관여하는 p16INK4a/pRB 신호기작을 조절하여 세포 성장을 억제할 뿐 아니라, 저선량의 감마선 조사나 소량의 독소루비신(doxorubicin)이 첨가될 경우 세포 노화를 유도하는 효과가 있음을 확인함으로써, SM22α 단백질, 또는 SM22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 암의 예방 및 치료용 조성물, 항암 보조용 조성물, 또는 건강식품의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 평활근-22α(smooth muscle-22α, SM22α) 단백질, 또는 평활근-22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물, 항암 보조용 약학적 조성물, 또는 암 예방 및 개선용 건강식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 평활근-22α 단백질, 또는 평활근-22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를, 항암제 또는 감마선과 함께 세포 또는 조직에 처리하는 단계를 포함하는 세포 노화 촉진 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 평활근-22α(smooth muscle-22α, SM22α) 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 평활근-22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 평활근-22α 단백질을 유효성분으로 함유하는 항암 보조용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 평활근-22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 항암 보조용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 평활근-22α 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 평활근-22α 단백질, 또는 평활근-22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 항암제와 함께 세포 또는 조직에 처리하는 단계를 포함하는 세포 노화 촉진 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 평활근-22α 단백질, 또는 평활근-22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 감마선과 함께 세포 또는 조직에 처리하는 단계를 포함하는 세포 노화 촉진 방법을 제공한다.
본 발명의 평활근-22α(smooth muscle-22α, SM22α) 단백질은 암세포의 성장을 효과적으로 저해하고, 독소루비신의 처리 또는 감마선 조사를 병행할 경우 암세포의 노화를 촉진시켜 비가역적인 세포 사멸을 유도하므로, 상기 평활근-22α 단백질, 또는 평활근-22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 암 예방 및 치료용 조성물, 항암 보조용 조성물, 또는 개선용 건강식품의 유효한 성분으로 사용할 수 있으며, 이를 통해 항암제 또는 고선량 방사선에 의한 정상 세포 손상 등의 부작용을 효과적으로 줄여 항암치료의 효율을 높일 수 있다.
도 1은 간암 세포주 HepG2 세포에 도입되는 SM22α 유전자를 포함하는 벡터를 제조하기 위한 발현 벡터 및 프라이머 서열을 나타낸 그림이다:
여기에서 기재된 서열은 서열번호 2로 기재되는 SM22α 유전자 서열을 나타낸다.
도 2는 간암 세포주 HepG2 세포에 도입되는 MT-1G 유전자를 포함하는 벡터를 제조하기 위한 발현 벡터 및 프라이머 서열을 나타낸 그림이다:
여기에서 기재된 서열은 서열번호 15로 기재되는 MT-1G 유전자 서열을 나타낸다.
도 3은 간암 세포주에서 MMS 처리에 의한 세포 노화 유도 효과를 베타-갈락토시다제(β-galactosidase) 염색법으로 확인한 결과이다.
도 4는 간암 세포주에서 MMS 처리에 의한 SM22α 단백질의 발현 변화를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 5는 SM22α 유전자가 형질도입된 간암 세포주에서 SM22α 단백질의 발현 양상을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 6은 SM22α 발현 간암 세포주에서 세포 성장 저해 효과를 집락 형성 분석법으로 확인한 결과이다.
도 7은 SM22α 발현 간암 세포주에서 독소루비신 처리에 의한 세포 노화 효과를 베타-갈락토시다제(β-galactosidase) 염색법으로 확인한 결과이다.
도 8은 SM22α 발현 간암 세포주에서 감마선 조사에 의한 세포 노화 효과를 베타-갈락토시다제(β-galactosidase) 염색법으로 확인한 결과이다.
도 9는 SM22α 발현 간암 세포주에서 p16 및 pRB의 발현 양상을 웨스턴 블롯 및 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 10은 SM22α 발현 억제에 의한 p16 및 pRB의 발현 양상을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다.
도 11은 SM22α 발현 간암 세포주에서 MT-1G의 발현양의 변화를 RT-PCR을 수행하여 확인한 결과이다.
도 12는 MT-1G 발현 간암 세포주에서 p16 및 pRB의 발현 양상을 웨스턴 블랏 및 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 13은 MT-1G 발현 간암 세포주에서 세포 성장 저해 효과를 집락 형성 분석법으로 확인한 결과이다.
도 14는 MT-1G 발현 간암 세포주에서 독소루비신 처리에 의한 세포 노화 효과를 베타-갈락토시다제(β-galactosidase) 염색법으로 확인한 결과이다.
여기에서 기재된 서열은 서열번호 2로 기재되는 SM22α 유전자 서열을 나타낸다.
도 2는 간암 세포주 HepG2 세포에 도입되는 MT-1G 유전자를 포함하는 벡터를 제조하기 위한 발현 벡터 및 프라이머 서열을 나타낸 그림이다:
여기에서 기재된 서열은 서열번호 15로 기재되는 MT-1G 유전자 서열을 나타낸다.
도 3은 간암 세포주에서 MMS 처리에 의한 세포 노화 유도 효과를 베타-갈락토시다제(β-galactosidase) 염색법으로 확인한 결과이다.
도 4는 간암 세포주에서 MMS 처리에 의한 SM22α 단백질의 발현 변화를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 5는 SM22α 유전자가 형질도입된 간암 세포주에서 SM22α 단백질의 발현 양상을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 6은 SM22α 발현 간암 세포주에서 세포 성장 저해 효과를 집락 형성 분석법으로 확인한 결과이다.
도 7은 SM22α 발현 간암 세포주에서 독소루비신 처리에 의한 세포 노화 효과를 베타-갈락토시다제(β-galactosidase) 염색법으로 확인한 결과이다.
도 8은 SM22α 발현 간암 세포주에서 감마선 조사에 의한 세포 노화 효과를 베타-갈락토시다제(β-galactosidase) 염색법으로 확인한 결과이다.
도 9는 SM22α 발현 간암 세포주에서 p16 및 pRB의 발현 양상을 웨스턴 블롯 및 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 10은 SM22α 발현 억제에 의한 p16 및 pRB의 발현 양상을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다.
도 11은 SM22α 발현 간암 세포주에서 MT-1G의 발현양의 변화를 RT-PCR을 수행하여 확인한 결과이다.
도 12는 MT-1G 발현 간암 세포주에서 p16 및 pRB의 발현 양상을 웨스턴 블랏 및 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 13은 MT-1G 발현 간암 세포주에서 세포 성장 저해 효과를 집락 형성 분석법으로 확인한 결과이다.
도 14는 MT-1G 발현 간암 세포주에서 독소루비신 처리에 의한 세포 노화 효과를 베타-갈락토시다제(β-galactosidase) 염색법으로 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 평활근-22α(smooth muscle-22α, SM22α) 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 평활근-22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 SM22α 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 SM22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 인체 또는 동물세포에서 발현되는 선형 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스성 발현벡터를 포함하는 벡터 또는 재조합 레트로바이러스(retrovirus) 벡터, 재조합 아데노 바이러스(adenovirus) 벡터, 재조합 아데노 부속 이러스(adeno-associated virus, AAV) 벡터, 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 벡터 또는 재조합 렌티바이러스(lentivirus) 벡터를 포함하는 재조합 바이러스 벡터인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고, pCDNA3.1, pSecTag-LK68, pLXSN-LK68, rAAV-LK68 및 pAAV-LK68로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않고, pCDNA3.1 벡터인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 SM22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 세포에 도입된 형태로 사용될 수 있다.
상기 SM22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포는 조혈 줄기세포 (hematopoietic stem cells), 수지상 세포(dendritic cells), 자가이식 종양세포(autologous tumor cells) 및 정착 종양세포(established tumor cells)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 암은 간암, 위암, 유방암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 대장암, 폐암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골육종 및 중추신경계 종양으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하며, 간암인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 간암 세포주에서 MMS(methyl methanesulfonate)의 처리에 의해 증가하는 SM22α가 암세포의 성장을 저해하고, 메탈로티오네인(metallothionein) 1G(MT-1G)의 발현을 증진시키며, 세포노화 유도에 관여하는 p16INK4a/pRB 신호기작을 조절하여 세포 성장을 억제할 뿐 아니라, 저선량의 감마선 조사나 소량의 독소루비신(doxorubicin)이 첨가될 경우 세포 노화를 유도하는 효과를 나타내므로, 본 발명의 SM22α 단백질, 또는 SM22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 암 예방 및 치료용 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%를 포함한다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 10 ㎎/㎖이며, 바람직하게는 0.0001 ~ 5 ㎎/㎖이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 SM22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 경우 0.05 내지 500 mg을 함유하는 것이 바람직하고, 0.1 내지 300 mg을 함유하는 것이 더욱 바람직하며, SM22α 단백질을 암호화는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스의 경우, 103~1012 IU(10 내지 1010 PFU)를 함유하는 것이 바람직하고, 105 내지 1010 IU를 함유하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 SM22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포의 경우, 103 내지 108 개를 함유하는 것이 바람직하고, 104 내지 107개를 함유하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 SM22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 조성물의 유효 용량은 체중 1㎏당 벡터의 경우에는 0.05 내지 12.5㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 107 내지 1011 바이러스 입자(105 내지 109 IU)/㎏, 세포의 경우에는 103 내지 106 세포/㎏이고, 바람직하게는 벡터의 경우에는 0.1 내지 10㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 108 내지 1010 입자(106 내지 108 IU)/㎏, 세포의 경우에는 102 내지 105 세포/㎏이며, 하루 2 내지 3회 투여될 수 있다. 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 신경 질환의 발병 정도에 따라 변할 수 있다.
또한, 본 발명은 평활근-22α 단백질을 유효성분으로 함유하는 항암 보조용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 평활근-22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 항암 보조용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 SM22α 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 SM22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 인체 또는 동물세포에서 발현되는 선형 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스성 발현벡터를 포함하는 벡터 또는 재조합 레트로바이러스(retrovirus) 벡터, 재조합 아데노 바이러스(adenovirus) 벡터, 재조합 아데노 부속 이러스(adeno-associated virus, AAV) 벡터, 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 벡터 또는 재조합 렌티바이러스(lentivirus) 벡터를 포함하는 재조합 바이러스 벡터인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고, pCDNA3.1, pSecTag-LK68, pLXSN-LK68, rAAV-LK68 및 pAAV-LK68로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않고, pCDNA3.1 벡터인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 SM22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 세포에 도입된 형태로 사용될 수 있다.
상기 SM22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포는 조혈 줄기세포 (hematopoietic stem cells), 수지상 세포(dendritic cells), 자가이식 종양세포(autologous tumor cells) 및 정착 종양세포(established tumor cells)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 암은 간암, 위암, 유방암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 대장암, 폐암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골육종 및 중추신경계 종양으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하며, 간암인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 항암 보조용 약학적 조성물은 항암제 또는 감마선 처리를 통한 항암 치료에 이용되는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않고, 일반적으로 항암치료에 사용하는 항(抗)종양성 항생 물질은 모두 사용가능하다.
상기 감마선은 0.01 내지 0.2 Gy의 선량으로 조사되는 것이 바람직하고, 0.05 내지 0.1 Gy의 선량으로 조사되는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 간암 세포주에서 MMS(methyl methanesulfonate)의 처리에 의해 증가하는 SM22α가 암세포의 성장을 저해하고, 메탈로티오네인(metallothionein) 1G(MT-1G)의 발현을 증진시키며, 세포노화 유도에 관여하는 p16INK4a/pRB 신호기작을 조절하여 세포 성장을 억제할 뿐 아니라, 저선량의 감마선 조사나 소량의 독소루비신(doxorubicin)이 첨가될 경우 세포 노화를 유도하는 효과를 나타내므로, 본 발명의 SM22α 단백질, 또는 SM22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 항암제 또는 감마선과 병행 처리할 수 있는 항암 보조용 약학적 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 평활근-22α 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
상기 SM22α 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 암은 간암, 위암, 유방암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 대장암, 폐암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골육종 및 중추신경계 종양으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하며, 간암인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 간암 세포주에서 MMS(methyl methanesulfonate)의 처리에 의해 증가하는 SM22α가 암세포의 성장을 저해하고, 메탈로티오네인(metallothionein) 1G(MT-1G)의 발현을 증진시키며, 세포노화 유도에 관여하는 p16INK4a/pRB 신호기작을 조절하여 세포 성장을 억제할 뿐 아니라, 저선량의 감마선 조사나 소량의 독소루비신(doxorubicin)이 첨가될 경우 세포 노화를 유도하는 효과를 나타내므로, 본 발명의 SM22α 단백질은 암 예방 및 개선용 건강식품에 유용하게 사용할 수 있다.
SM22α 단백질을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 유제품, 음료, 껌, 차, 비타민 단일제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
이때, 식품 또는 음료 중의 상기 SM22α 단백질의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 평활근-22α 단백질을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로오스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 SM22α 단백질은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 SM22α 단백질은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 SM22α 단백질 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 평활근-22α 단백질, 또는 평활근-22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 항암제와 함께 세포 또는 조직에 처리하는 단계를 포함하는 세포 노화 촉진 방법을 제공한다.
상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않고, 일반적으로 항암치료에 사용하는 항(抗)종양성 항생 물질은 모두 사용가능하다.
상기 SM22α 단백질, 또는 SM22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 항암제와 함께 처리시 동시에 또는 순차적으로 처리하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 세포는 간암 세포, 위암 세포, 유방암 세포, 결장암 세포, 골암 세포, 췌장암 세포, 두부 세포 또는 경부 암 세포, 자궁암 세포, 대장암 세포, 폐암 세포, 난소암 세포, 직장암 세포, 식도암 세포, 소장암 세포, 항문부근암 세포, 나팔관암종 세포, 자궁내막암종 세포, 자궁경부암종 세포, 질암종 세포, 음문암종 세포, 호지킨병 세포, 전립선암 세포, 방광암 세포, 신장암 세포, 수뇨관암 세포, 신장세포암종 세포, 신장골반암종 세포, 골육종 세포 및 중추신경계 종양 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하며, 간암 세포인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 간암 세포주에서 MMS(methyl methanesulfonate)의 처리에 의해 증가하는 SM22α가 암세포의 성장을 저해하고, 메탈로티오네인(metallothionein) 1G(MT-1G)의 발현을 증진시키며, 세포노화 유도에 관여하는 p16INK4a/pRB 신호기작을 조절하여 세포 성장을 억제할 뿐 아니라, 저선량의 감마선 조사나 소량의 독소루비신(doxorubicin)이 첨가될 경우 세포 노화를 유도하는 효과를 나타내므로, 본 발명의 SM22α 단백질, 또는 SM22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 항암제 처리에 의한 세포 노화 촉진 방법에 유용하게 사용될 수 있다.
아울러, 본 발명은 평활근-22α 단백질, 또는 평활근-22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 감마선과 함께 세포 또는 조직에 처리하는 단계를 포함하는 세포 노화 촉진 방법을 제공한다.
상기 감마선은 0.01 내지 0.2 Gy의 선량으로 조사되는 것이 바람직하고, 0.05 내지 0.1 Gy의 선량으로 조사되는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 SM22α 단백질, 또는 SM22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 감마선과 함께 처리시 동시에 또는 순차적으로 처리하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 세포는 간암 세포, 위암 세포, 유방암 세포, 결장암 세포, 골암 세포, 췌장암 세포, 두부 세포 또는 경부 암 세포, 자궁암 세포, 대장암 세포, 폐암 세포, 난소암 세포, 직장암 세포, 식도암 세포, 소장암 세포, 항문부근암 세포, 나팔관암종 세포, 자궁내막암종 세포, 자궁경부암종 세포, 질암종 세포, 음문암종 세포, 호지킨병 세포, 전립선암 세포, 방광암 세포, 신장암 세포, 수뇨관암 세포, 신장세포암종 세포, 신장골반암종 세포, 골육종 세포 및 중추신경계 종양 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하며, 간암 세포인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 간암 세포주에서 MMS(methyl methanesulfonate)의 처리에 의해 증가하는 SM22α가 암세포의 성장을 저해하고, 메탈로티오네인(metallothionein) 1G(MT-1G)의 발현을 증진시키며, 세포노화 유도에 관여하는 p16INK4a/pRB 신호기작을 조절하여 세포 성장을 억제할 뿐 아니라, 저선량의 감마선 조사나 소량의 독소루비신(doxorubicin)이 첨가될 경우 세포 노화를 유도하는 효과를 나타내므로, 본 발명의 SM22α 단백질, 또는 SM22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 감마선 조사에 의한 암세포 노화 촉진 방법에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1> 유전자 과발현 간암세포주의 제작
<1-1>
SM22
α및
Metallothionein
1G 유전자 포함 재조합 벡터의 제작
간암 세포주 내 SM22α 및 메탈로티오네인(metallothionein) 1G(MT-1G) 단백질을 발현시키기 위해, SM22α 및 메탈로티오네인(metallothionein) 1G(MT-1G) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제작하였다.
구체적으로, 간암 세포주 HepG2(ATCC no. HB-8065)로부터 High Pure RNA 분리 키트(Roche, Germany)를 이용하여 전체 RNA를 추출하였다. 이후, 전체 RNA 1 ㎍을 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche, Germany)를 이용하여 55℃에서 30분, 85℃에서 5분간 반응하여 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)을 수행하여, cDNA를 합성하고 수득하였다.
상기 얻어진 cDNA를 주형으로 하여, 5'-말단에 HindⅢ 제한효소 인식서열과 3'-말단에 BamHI 제한효소 인식서열을 포함하도록 제작된 서열번호 3(5'-AGCTTAAGCTTGACATGGCCAACAAG-3') 및 서열번호 4(5'-GCGGATCCTCTCCGCTCTAACTG-3')의 프라이머쌍을 이용하여 94℃에서 5분으로 전처리(pre-denature)시킨 후, 94℃에서 1분으로 변성(denaturation), 59℃에서 45초간 어닐링(annealing), 72℃에서 45초간 신장(elongation)을 수행하는 조건으로 45회 반복한 다음, 72℃에서 5분 동안 최종 신장(post-elongation)을 수행하여, 636bp의 SM22α 유전자를 수득하였다.
또한, 상기 cDNA를 주형으로 하여, 5'-말단에 HindⅢ 제한효소 인식서열과 3'-말단에 EcoRI 제한효소 인식서열을 포함하도록 제작된 서열번호 5(5'-ACTCCAAGCTTCACGTGCACCCA-3') 및 서열번호 6(5'-CTGAATTCACTTGGGAGCAGGGC-3')의 프라이머쌍을 이용하여 94℃에서 4분으로 전처리(pre-denature)시킨 후, 94℃에서 1분으로 변성(denaturation), 58.1℃에서 1분간 어닐링(annealing), 72℃에서 1분간 신장(elongation)을 수행하는 조건으로 25회 반복한 다음, 72℃에서 5분 동안 최종 신장(post-elongation)을 수행하여 294bp의 메탈로티오네인(metallothionein) 1G 유전자를 수득하였다.
상기 얻어진 SM22α 및 메탈로티오네인(metallothionein) 1G(MT-1G) PCR 산물과 pcDNA3.1(invitrogen, USA)을 HindIII/BamHI 및 HindⅢ/ EcoRⅠ 제한효소로 각각 처리한 후, 혼합하여 리가아제(ligase)로 연결함으로써 SM22α 유전자를 포함하는 pcDNA3.1/SM22α 벡터 및 메탈로티오네인(metallothionein) 1G(MT-1G) 유전자를 포함하는 pcDNA3.1/metallothionein 1G 벡터를 제작하였다(도 1 및 2).
<1-2>
SM22
α와
Metallothionein
1G 유전자 과발현용 간암세포주의 제작
대조군 벡터(E-pcDNA) 및 SM22α 재조합 벡터(pcDNA3.1/SM22α) 및 메탈로티오네인 1G(MT-1G) 재조합 벡터(pcDNA3.1/metallothionein 1G)가 형질 도입된 간암 세포주를 제작하였다.
구체적으로, 인간 간암세포주인 HepG2 세포를 100 units/㎖ 페니실린(SIGMA, USA), 10% 우태아 혈청(Hyclone, USA)을 포함한 DMEM 배지에서 5 X 106 세포/5 ㎖로 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. E-pcDNA(Invitrogen Life Technologies) 벡터, pcDNA3.1/SM22α 벡터 및 pcDNA3.1/metallothionein 1G 벡터 4 ㎍을 1 × 106 HepG2 세포에 리포펙타민(Lipofectamine) 2000(invitrogen, USA)을 이용해 형질 도입하였고, 500 ㎍/㎖ G418을 첨가한 DMEM 배지에서 배양함으로써 유전자가 형질전환된 세포들을 선별하였다. 이 후 96 웰에 1 웰당 1개의 세포 비율로 분주한 뒤, 500 ㎍/㎖ G418로 선별된 클론들을 24 웰로 옮기고, 6 웰, 6 cm 디쉬(dish), 10cm 디쉬(dish) 순서로 살아남은 클론 세포수를 늘여가면서 최종적으로 SM22α 및 메탈로티오네인 1G를 가장 많이 발현하는 클론을 선별하였다. E-pcDNA 벡터를 도입한 세포주도 500 ㎍/㎖ G418 배지에서 배양하였다.
<
실험예
1> 간암 세포주에서
MMS
(
methyl
methanesulfonate
) 처리에 의한 세포 노화 유도 확인
MMS(methyl methanesulfonate)처리에 대한 간암 세포주의 세포 노화 유도 효과를 확인하기 위하여, HepG2세포에 MMS를 농도별로 처리한 후, 베타-갈락토시다제(β-galactosidase) 염색법을 수행하여 세포 노화 상태를 확인하였다.
구체적으로, 간암 세포주 HepG2(p53 wild type)를 6-웰 플레이트에 총 8 X 105세포/2 ㎖의 농도로 분주한 뒤, MMS를 각각 0.01, 0.1, 1 μM의 농도로 24시간 동안 처리하였다. 이후, 세포를 PBS로 2회 세척한 후, 2% 포름알데하이드(formaldehyde)와 0.25% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)가 포함된 PBS로 상온에서 15 분간 세포 상태를 고정(fixation)시켰다. 그 다음, 세포를 다시 PBS로 3회 세척한 뒤, 신선하게 준비된 β-gal 염색 용액(5 mM potassium ferrocyanide, 5 mM potassium ferricyanide, 2 mM MgCl2, 150 mM NaCl이 포함된 40 mM citric acid phosphate buffer (pH 6.0) : dimethylformamide에 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside(X-gal)을 녹인 용액 = 20 : 1)을 넣고 37 ℃에서 16 시간이상 반응시키고, 염색된 세포를 광학 현미경(Leica, Germany)를 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 간암 세포주에 MMS를 처리하였을 때, 농도 의존적으로 세포 노화가 진행되는 것을 확인하였다(도 3).
<
실험예
2> 간암 세포주에서
MMS
(
methyl
methanesulfonate
) 처리에 의한
SM22
α 발현 변화 확인
간암 세포주에서 MMS 처리에 의한 SM22α의 발현 변화를 확인하기 위하여, HepG2세포에 MMS를 농도별로 처리한 후, 웨스턴 블롯을 수행하였다.
구체적으로, 간암 세포주 HepG2(p53 wild type)를 6-웰 플레이트에 총 8 X 105세포/2 ㎖의 농도로 분주한 뒤, MMS를 각각 0.01, 0.1, 1, 10 μM의 농도로 24시간 동안 처리하였다. 이후, 1×107 세포를 수거하여 PBS로 2회 씻어준 후 단백질 분해효소 저해제 칵테일(protease inhibitor cocktail, 2mM AEBSF, 1mM EDTA, 130μM Bestatin, 1μM leupeptin, 14μM E-64, 0.3μM Aprotinin)과 포스파타제 저해제(phosphatase inhibitor, Roche)를 포함한 RIPA 완충용액으로 부유한 세포를, 얼음에 20분 방치하였다가 빠르게 볼텍싱(vortexing)하는 과정을 연속하여 3회 반복하였다. 얻어진 세포 파쇄액을 12000 rpm, 4℃에 20분 동안 원심분리하고, 상층액을 수거한 뒤, 다시 12000 rpm, 4℃에 20분 동안 원심분리하여 깨끗한 상층액만을 수거하였다. 단백질을 라우리 방법(Lowry method)으로 정량한 뒤 7.5~12% 아크릴아마이드 겔(acrylamide gel)로 분리하여 PVDF 멤브레인에 옮겼다. 단백질이 옮겨진 멤브레인에 SM22α에 결합하는 1차 항체(anti-SM22alpha, abcam)를 붙인 후 2차 항체[페록시다아제(peroxidase)가 표지되어 있는 IgG에 대한 항체](anti-goat IgG HRP-linked 항체, SIGMA)를 붙인 다음, ECL 검출용 키트(detection kit)로 검출하였다. 각 분석시료별 단백질량의 보정을 위하여 액틴(actin)의 발현양을 확인하는 실험을 동시에 수행하였다.
그 결과, 간암 세포주에 MMS를 처리하였을 때, SM22α의 발현양이 증가되는 것을 확인하였다(도 4).
이를 통해, 간암 세포주에 MMS를 처리하였을 때, SM22α의 발현양이 증가하고, 세포 노화가 유도됨을 확인하였다.
<
실험예
3>
SM22
α 유전자가 형질도입된 간암 세포주에서
SM22
α 단백질의 발현 양상 확인
상기 <실시예 1>에서 제조된 SM22α 유전자 형질도입 간암 세포주에서 SM22α 단백질의 발현 양상을 확인하기 위하여, 선별한 형질 도입 세포주에서 SM22α 단백질의 발현 양상을 상기 <실험예 2>에 기재된 웨스턴 블롯(western blot) 방법으로 확인하였다.
그 결과, SM22α를 과발현시킨 세포들은 HepG2 세포 또는 대조군 세포에 비해 SM22α 단백질의 발현양이 현저히 증가됨을 확인하였다(도 5).
<
실험예
4>
SM22
α 발현 간암 세포주의 세포 성장 저해 효과 확인
SM22α 유전자 형질도입에 의한 간암 세포주의 세포 성장 변화를 확인하기 위하여, SM22α를 과발현시킨 HepG2 세포의 성장을 집락 형성 분석법(colony forming assay)을 통해 확인하였다.
구체적으로, 6 웰 플레이트에 104개 세포를 각각 분주하고, 약 2?3주 후 콜로니를 형성한 세포들을 크리스탈 바이올렛 시약으로 10분 동안 염색하였다. 이후, 수차례 PBS로 세척하고, 현미경으로 관찰하여 각 플레이트에 생성된 세포 수를 대조군과 상대적으로 비교하여 나타내었다.
그 결과, SM22α의 발현된 세포주는 대조군에 비해 현저하게 콜리니의 형성이 줄고, 세포 성장이 저해되는 것을 확인하였다(도 6).
<
실험예
5>
SM22
α 발현 간암 세포주에서 독소루비신 처리에 의한 세포 노화 효과 확인
SM22α 발현 간암 세포주에서 독소루비신 처리에 의한 세포 노화 효과를 확인하기 위하여, 대조군으로 E-pcDNA(V.O) 벡터가 형질도입된 HepG2 세포주 및 SM22α가 형질도입된 HepG2(SM22α(+)S4, S6)세포에 독소루비신(doxorubicin)을 0.01 및 0.05 ug/ml의 농도로 처리한 다음, 세포노화 상태를 상기 <실험예 1>에 기재된 β-갈락토시다제(galactosidase) 염색법을 수행하였다.
그 결과, 독소루비신(doxorubicin)을 처리하지 않은 경우, SM22α 발현 HepG2 세포들은 세포 노화 현상이 거의 나타나지 않은 반면, 독소루비신(doxorubicin)을 처리한 경우, E-pcDNA(V.O)벡터를 형질도입한 대조군 HepG2 세포와 비교하여 SM22α 발현 HepG2 세포들에서 독소루비신(doxorubicin)의 농도에 의존적으로 세포노화가 두드러지게 유도되는 것을 확인하였다(도 7).
<
실험예
6>
SM22
α 발현 간암 세포주에서 감마선 조사에 의한 세포 노화 효과 확인
SM22α 발현 간암 세포주에서 감마선 조사에 의한 세포 노화 효과를 확인하기 위하여, 대조군으로 E-pcDNA(V.O) 벡터가 형질도입된 HepG2 세포주 및 SM22α가 형질도입된 HepG2(SM22α(+)S4, S6)세포에 감마선을 0.05 및 0.1 Gy로 조사한 다음, 세포노화 상태를 상기 <실험예 1>에 기재된 β-갈락토시다제(galactosidase) 염색법을 수행하였다.
그 결과, 감마선을 조사하지 않은 경우, SM22α 발현 HepG2 세포들은 세포 노화 현상이 거의 나타나지 않은 반면, 감마선을 조사한 경우, E-pcDNA(V.O)벡터를 형질도입한 대조군 HepG2 세포와 비교하여 SM22α 발현 HepG2 세포들에서 감마선 조사선량에 의존적으로 세포노화가 두드러지게 유도되는 것을 확인하였다(도 8).
<
실험예
7>
SM22
α 발현 간암 세포주에서
p16
및
pRB
의 발현 양상 확인
SM22α가 세포 성장을 억제하고 저선량의 감마선 조사나 소량의 독성물질이 추가될 경우 세포노화를 유도하는 현상이, 세포 성장 억제와 세포노화 유도에 일차적으로 관여하는 p53/p21WAF1 / Cip1와 p16INK4a/pRB 신호기작과 연관되는지 확인하기 위하여 SM22α 발현 간암 세포 내에서 그 발현량을 상기 <실험예 2>에 기재된 웨스턴 블롯 및 RT-PCR을 수행하여 확인하였다.
구체적으로, RT-PCR은 하기의 방법에 의해 수행되었다. 우선, 세포들을 수거하여 PBS(phosphate buffered saline)로 세척한 후 High Pure RNA Isolation Kit(Roche, Germany)를 이용하여 전체 RNA를 추출한 뒤, Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche, Germany)를 이용하여 전체 RNA 1㎍을 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction) 반응시켰으며, 55℃에서 30분, 85℃에서 5분간 반응하여 cDNA를 합성함으로써 수득하였다. 상기 방법으로 합성된 cDNA 1㎕를 10× 완충액(MgCl2), 2.5mM dNTPs, 10× MgCl2, Taq DNA 중합효소와, SM22α 프라이머(정방향: 5'-TTGGATCCGACATGGCCAACAAG-3'(서열번호 7)/역방향: 5'-GCCCTAAGCTTTCTAACTGATGATCT-3'(서열번호 8)) 또는 β-actin 프라이머(정방향:5'-CATCCTCACCCTGAAGTACCC-3'(서열번호 9)/역방향: 5'-AGCCTGGATAGCAACGTACATG-3'(서열번호 10)) 또는 MT1G 프라이머(정방향: 5'-ACTCCAAGCTTCACGTGCACCCA-3'(서열번호 11)/ 역방향:5'-CTGAATTCACTTGGGAGCAGGGC-3'(서열번호 12)) 또는 p16 프라이머(정방향:5'-ATGGAGCCGGCGGCGGGGAGC-3'(서열번호 13)/ 역방향:5'-TCAATCGGGGATGTCTGAGGGACCTTCCG-3'(서열번호 14))와 같이 제작된 프라이머를 10 pM을 섞어서 하기 조건에서 PCR을 수행하였다. SM22α는 94℃에서 5분, 94℃에서 30초간 변성, 59℃(MT1G의 경우 58.1℃, p16의 경우 58℃)에서 30초간 어닐링, 72℃에서 45초간 신장의 조건으로 28회 반복한 다음, 72℃에서 5분 동안 최후 신장을 수행하였다. 이후, 상기 반응결과의 PCR 산물은 1% 아가로우스 겔 상에서 전기영동한 다음 EtBr 용액으로 염색하여 확인하였다.
그 결과, SM22α가 발현된 HepG2 세포(S4, S6)에서 가장 일반적인 단계인 p53 활성화(인산화)는 유의성있게 증가되지 않았고, p53 의존적으로 활성화되는 p21WAF1/Cip1 역시 차이가 없었다. 하지만, p53 활성화와는 독립적인 pRB 기작과 연결된 싸이클린(cyclin) 의존적인 키나제(kinase)인 p16INK4a의 발현은 RNA 및 단백질 수준에서 모두 SM22α의 과발현에 의하여 두드러지게 증가되는 것을 확인하였다(도 9).
아울러, HepG2세포에서 pRB의 serine 608, 780과 807/811잔기의 인산화가 상당히 증가되어 있음을 확인하였으며, SM22α가 과발현된 HepG2세포(S4, S6)에서는 이들의 인산화가 두드러지게 감소되어 있음을 확인하였다(도 9).
이러한 결과를 통해, SM22α에 의한 p16INK4a/pRB 활성화가 부분적으로 세포 노화 촉진과 밀접한 연관이 있음을 알 수 있다.
<
실험예
8>
SM22
α 발현 억제에 의한
p16
및
pRB
발현 양상 확인
SM22α 발현 억제에 의한 p16및 pRB 발현 양상을 확인하기 위하여, SM22α를 과발현시킨 세포주 S6에서 SM22α의 siRNA를 사용하여 이 유전자의 발현을 억제시킨 후, SM22α유전자 발현정도에 따른 p16 및 pRB의 발현 양상을 상기 <실험예 2>에 기재된 웨스턴 블럿을 수행하였다.
그 결과, 상기 <실시예 7>에서 나타낸 바와 반대로, SM22α의 발현이 억제된 세포에서는 p16INK4a이 감소하고 pRB의 인산화가 활성화되어 나타남을 확인하였다(도 10).
이를 통해, SM22α의 발현이 p16INK4a/pRB 활성화에 직접적인 영향을 나타냄을 확인하였다.
<
실험예
9>
SM22
α 발현 간암 세포주에서
MT
-1G 발현 양상 확인
SM22α 발현 간암 세포주에서 MT-1G의 발현 양상을 확인하기 위하여, SM22α가 과발현된 HepG2세포(S4, S6)에서 MT-1G의 발현량의 변화를 상기 <실험예 7>에 기재된 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 수행하여 확인하였다. 각 분석시료별 RNA량의 보정을 위하여 액틴(actin)의 발현양을 확인하는 과정을 동시에 수행하였다.
그 결과, SM22α를 발현하는 간암 세포주에서 MT-1G의 발현양이 현저하게 증가함을 확인하였다(도 11).
<
실험예
10>
MT
-1G 유전자 발현에 따른
p16
및
pRB
의 발현 양상 확인
간암 세포주에서 MT-1G 유전자 발현에 따른 p16 및 pRB의 발현 양상을 확인 하기 위하여, MT-1G 발현 간암 세포주에서 p16 및 이의 인산화에 관련된 단백질을 인지할 수 있는 항체를 이용한 웨스턴 블랏 및 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 수행하였다.
그 결과, MT-1G가 과발현된 HepG2에서 p16INK4a이 증가되고 pRB의 인산화가 억제되는 것을 확인하였다(도 12).
<
실험예
11>
MT
-1G 발현 세포주에서 세포 성장 저해 효과 확인
MT-1G 유전자 형질도입에 의한 간암 세포주의 세포 성장 변화를 확인하기 위하여, MT-1G를 과발현시킨 HepG2 세포의 성장을 상기 <실험예 4>에 기재된 집락 형성 분석법(colony forming assay)을 통해 확인하였다.
그 결과, MT-1G의 발현을 증가시키면 대조군에 비해 현저하게 콜로니(colony)의 형성이 줄고, 세포 성장이 저해됨을 확인하였다(도 13).
<
실험예
12>
MT
-1G 발현 세포주에서 독소루비신 처리에 의한 세포 노화 효과 확인
MT-1G 발현 간암 세포주에서 독소루비신 처리에 의한 세포 노화 효과를 확인하기 위하여, 대조군으로 E-pcDNA(V.O) 벡터가 형질도입된 HepG2 세포주 및 MT-1G가 형질도입된 HepG2 세포에 독소루비신(doxorubicin)을 0.05 ug/ml의 농도로 처리한 다음, 세포노화 상태를 상기 <실험예 1>에 기재된 β-갈락토시다제(galactosidase) 염색법을 수행하였다.
그 결과, 독소루비신(doxorubicin)을 처리하지 않은 경우, MT-1G 발현 HepG2 세포들은 세포 노화 현상이 거의 나타나지 않은 반면, 독소루비신(doxorubicin)을 처리한 경우, E-pcDNA(V.O)벡터를 형질도입한 대조군 HepG2 세포와 비교하여 MT-1G 발현 HepG2 세포에서 독소루비신(doxorubicin)에 의해 세포 노화가 두드러지게 유도되는 것을 확인하였다(도 14).
<
제조예
1> 약학적 제제의 제조
<1-1>
산제의
제조
본 발명의 SM22α 단백질 200 ㎎
유당 100 ㎎
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<1-2> 정제의 제조
본 발명의 SM22α 단백질 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<1-3> 캡슐제의 제조
본 발명의 SM22α 단백질 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<1-4> 환의 제조
본 발명의 SM22α 단백질 100 ㎎
유당 150 ㎎
글리세린 100 ㎎
자일리톨 50 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.
<1-5> 과립의 제조
본 발명의 SM22α 단백질 150 ㎎
대두 추출물 50 ㎎
포도당 200 ㎎
전분 600 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.
<
제조예
2> 식품의 제조
<2-1> 밀가루 식품의 제조
본 발명의 SM22α 단백질 0.5 ~ 5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하였다.
<2-2>
스프
및 육즙(
gravies
)의 제조
본 발명의 SM22α 단백질 0.1 ~ 5.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.
<2-3> 그라운드
비프(ground beef)의
제조
본 발명의 SM22α 단백질 10 중량부를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.
<2-4> 유제품(
dairy
products
)의 제조
본 발명의 SM22α 단백질 5 ~ 10 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
<2-5>
선식의
제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
본 발명의 SM22α 단백질을 진공 농축기에서 감압농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.
상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 [화학식 1]의 화합물을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.
곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),
종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),
본 발명의 SM22α 단백질(3 중량부),
영지(0.5 중량부),
지황(0.5 중량부)
<
제조예
3> 음료의 제조
<3-1>
건강음료의
제조
액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 본 발명의 SM22α 단백질 1 g을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 제조하였다.
<3-2> 야채 주스의 제조
본 발명의 SM22α 단백질 1 g을 토마토 또는 당근 주스 1,000 ㎖에 가하여 야채 주스를 제조하였다.
<3-3> 과일 주스의 제조
본 발명의 SM22α 단백질 1 g을 사과 또는 포도 주스 1,000 ㎖ 에 가하여 과일 주스를 제조하였다.
상기에서 보는 바와 같이, 본 발명의 평활근-22α(smooth muscle-22α, SM22α) 단백질, 또는 평활근-22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 암 예방 및 치료용 조성물, 항암 보조용 조성물, 또는 개선용 건강식품의 유효한 성분으로 사용할 수 있다.
<110> Korea Atomic Energy Research Institute
<120> Method for inducing cell senescence by anticancer agent or
r-radiation using smooth muscle-22 alpha
<130> 10p-08-63
<160> 15
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 201
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ala Asn Lys Gly Pro Ser Tyr Gly Met Ser Arg Glu Val Gln Ser
1 5 10 15
Lys Ile Glu Lys Lys Tyr Asp Glu Glu Leu Glu Glu Arg Leu Val Glu
20 25 30
Trp Ile Ile Val Gln Cys Gly Pro Asp Val Gly Arg Pro Asp Arg Gly
35 40 45
Arg Leu Gly Phe Gln Val Trp Leu Lys Asn Gly Val Ile Leu Ser Lys
50 55 60
Leu Val Asn Ser Leu Tyr Pro Asp Gly Ser Lys Pro Val Lys Val Pro
65 70 75 80
Glu Asn Pro Pro Ser Met Val Phe Lys Gln Met Glu Gln Val Ala Gln
85 90 95
Phe Leu Lys Ala Ala Glu Asp Tyr Gly Val Ile Lys Thr Asp Met Phe
100 105 110
Gln Thr Val Asp Leu Phe Glu Gly Lys Asp Met Ala Ala Val Gln Arg
115 120 125
Thr Leu Met Ala Leu Gly Ser Leu Ala Val Thr Lys Asn Asp Gly His
130 135 140
Tyr Arg Gly Asp Pro Asn Trp Phe Met Lys Lys Ala Gln Glu His Lys
145 150 155 160
Arg Glu Phe Thr Glu Ser Gln Leu Gln Glu Gly Lys His Val Ile Gly
165 170 175
Leu Gln Met Gly Ser Asn Arg Gly Ala Ser Gln Ala Gly Met Thr Gly
180 185 190
Tyr Gly Arg Pro Arg Gln Ile Ile Ser
195 200
<210> 2
<211> 636
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
agctttcccc agacatggcc aacaagggtc cttcctatgg catgagccgc gaagtgcagt 60
ccaaaatcga gaagaagtat gacgaggagc tggaggagcg gctggtggag tggatcatag 120
tgcagtgtgg ccctgatgtg ggccgcccag accgtgggcg cttgggcttc caggtctggc 180
tgaagaatgg cgtgattctg agcaagctgg tgaacagcct gtaccctgat ggctccaagc 240
cggtgaaggt gcccgagaac ccaccctcca tggtcttcaa gcagatggag caggtggctc 300
agttcctgaa ggcggctgag gactatgggg tcatcaagac tgacatgttc cagactgttg 360
acctctttga aggcaaagac atggcagcag tgcagaggac cctgatggct ttgggcagct 420
tggcagtgac caagaatgat gggcactacc gtggagatcc caactggttt atgaagaaag 480
cgcaggagca taagagggaa ttcacagaga gccagctgca ggagggaaag catgtcattg 540
gccttcagat gggcagcaac agaggggcct cccaggccgg catgacaggc tacggacgac 600
ctcggcagat catcagttag agcggagagg gctagc 636
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM22-alpha HindIII primer
<400> 3
agcttaagct tgacatggcc aacaag 26
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM22-alpha BamHI primer
<400> 4
gcggatcctc tccgctctaa ctg 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MT-1G HindIII primer
<400> 5
actccaagct tcacgtgcac cca 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MT-1G EcoRI primer
<400> 6
ctgaattcac ttgggagcag ggc 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM22 alpha forward primer
<400> 7
ttggatccga catggccaac aag 23
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM22 alpha reverse primer
<400> 8
gccctaagct ttctaactga tgatct 26
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta-actin forward primer
<400> 9
catcctcacc ctgaagtacc c 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta-actin reverse primer
<400> 10
agcctggata gcaacgtaca tg 22
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MT-1G forward primer
<400> 11
actccaagct tcacgtgcac cca 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MT-1G reverse primer
<400> 12
ctgaattcac ttgggagcag ggc 23
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p16 forward primer
<400> 13
atggagccgg cggcggggag c 21
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p16 reverse primer
<400> 14
tcaatcgggg atgtctgagg gaccttccg 29
<210> 15
<211> 294
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
actccgcctt ccacgtgcac ccactgcctc ttcccttctc gcttgggaac tctagtctcg 60
cctcgggttg caatggaccc caactgctcc tgtgccgctg caggtgtctc ctgcacctgc 120
gccagctcct gcaagtgcaa agagtgcaaa tgcacctcct gcaagaagag ctgctgctcc 180
tgctgccctg tgggctgtgc caagtgtgcc cagggctgca tctgcaaagg ggcatcggag 240
aagtgcagct gctgcgcctg atgtcgggac agccctgctc ccaagtacaa atag 294
Claims (12)
- 평활근-22α(smooth muscle-22α, SM22α) 단백질, 또는 평활근-22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 평활근-22α 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 벡터는 pcDNA3.1인 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 암은 간암인 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 평활근-22α 단백질, 또는 평활근-22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 항암 보조용 약학적 조성물.
- 제 5항에 있어서, 상기 암은 간암인 것을 특징으로 하는 항암 보조용 약학적 조성물.
- 평활근-22α 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 개선용 건강식품.
- 평활근-22α 단백질, 또는 평활근-22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 항암제와 함께 세포 또는 조직에 처리하는 단계를 포함하는 세포 노화 촉진 방법.
- 제 8항에 있어서, 상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin)인 것을 특징으로 하는 세포 노화 촉진 방법.
- 평활근-22α 단백질, 또는 평활근-22α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 감마선과 함께 세포 또는 조직에 처리하는 단계를 포함하는 세포 노화 촉진 방법.
- 제 10항에 있어서, 상기 감마선은 0.05 내지 0.1 Gy의 선량으로 조사되는 것을 특징으로 하는 세포 노화 촉진 방법.
- 제 8항 또는 10항에 있어서, 상기 세포는 간암 세포인 것을 특징으로 하는 세포 노화 촉진 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020100123505A KR20120062299A (ko) | 2010-12-06 | 2010-12-06 | 평활근－２２α 를 이용한 항암제 또는 감마선에 의한 세포 노화 유도 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020100123505A KR20120062299A (ko) | 2010-12-06 | 2010-12-06 | 평활근－２２α 를 이용한 항암제 또는 감마선에 의한 세포 노화 유도 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20120062299A true KR20120062299A (ko) | 2012-06-14 |
Family
ID=46683278
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020100123505A KR20120062299A (ko) | 2010-12-06 | 2010-12-06 | 평활근－２２α 를 이용한 항암제 또는 감마선에 의한 세포 노화 유도 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20120062299A (ko) |
-
2010
- 2010-12-06 KR KR1020100123505A patent/KR20120062299A/ko not_active Application Discontinuation
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|---|---|---|---|
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