KR20210047196A - 연자육 또는 연자방 추출물을 포함하는 방사선 내성 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

MAP4K4, ACSL4 및 모에신 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는 방사선 내성 암 치료용 약학적 조성물이 개시된다.

Description

연자육 또는 연자방 추출물을 포함하는 방사선 내성 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating radiation-resistant cancer comprising lotus root or lotus extract}

본 발명은 연자육 또는 연자방 추출물을 포함하는 방사선 내성 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

암 치료에 주로 사용되고 있는 방법으로는 외과적 수술, 화학 요법, 방사선 요법 등이 있다. 이 중 방사선 치료는 조사부위에 효과가 있는 국소요법으로서 두경부암, 후두암, 자궁경부암, 유방암, 대장암 등에 시행되고 있다. 방사선 치료의 효과는 암의 성질, 환자, 및 기타 치료와 조합에 따라 달라질 수 있으며 방사선 치료시 반응이 좋지 않거나, 초기 반응이 좋더라도 재발하는 경우가 빈번하다.

따라서 환자별로 방사선 치료의 감수성 차이가 존재하므로 이를 확인하고 적절한 치료제를 선택해야 하지만, 방사선 치료를 실시하기 전에는 방사선에 대한 내성을 나타내는지 예측하기가 어려운 실정이다.

연자육 및 연자방은 설사, 심신 불안 증세 등을 치료하기 위한 약제로 사용되는 것으로 알려져 있으나(출처: 식품의약품안전처 생약종합정보), 방사선 내성 암에 대한 치료 효과는 알려진 바가 없다.

대한민국 공개공보 제10-2017-0129620호(2017.11.27)

일 구체예에 따르면, MAP4K4, ACSL4 및 모에신 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 포함하는 방사선 내성 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

일 구체예에 따르면, 연자육 또는 연자방 추출물을 포함하는 방사선 내성 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

일 양상은 MAP4K4, ACSL4, 및 모에신 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는 방사선 내성 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어"방사선 내성"은 방사선 조사에 의해 받는 영향이 일반적인 암에 대한 것보다 적으며, 방사선에 노출시 세포 복구 또는 증식에 변화가 적은 상태를 의미한다. 방사선은 X-선, 자외선, 알파 입자, 또는 감마선을 포함하는 전자기 방사선일 수 있다.

본 발명에서 용어 "그레이(Gy)"는 생물학 조직 1kg에서 1J을 방출하는 방사선의 양을 의미한다.

본 발명에서 용어 "바이오마커"는 암세포 또는 암 질환을 가진 개체를 방사선 저항성 세포 또는 개체로 구분하여 진단할 수 있는 물질로서, 정상 암세포에 비하여 방사선 저항성을 가진 암세포 또는 개체에서 증가하는 폴리펩티드, 단백질, 또는 핵산(mRNA 등) 등과 같은 유기 생체 분자들을 포함한다.

본 발명자는 인간 유방암 세포에 방사선을 지속적으로 조사하여 방사선 내성을 갖는 암세포를 분리하고 유전자 발현을 측정한 결과, 일반 암세포보다 MAP4K4, ACSL4 및 모에신 유전자의 발현이 현저히 증가하는 점을 확인하였으며, 이들 유전자의 발현을 억제하는 경우 방사선 내성 특이적인 세포 사멸효과가 있음을 확인하였으므로 MAP4K4, ACSL4 및 모에신 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 포함하는 조성물은 방사선 내성 암 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

상기 MAP4K4 유전자는 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 4로서 세포의 이동, 증식, 및 접착을 포함하는 광범위한 생리학적 과정에 관여하는 것으로 알려져 있고, 일반적인 세포보다 암에서 상향 조절되는 것으로 알려져 있다. 그러나 일반적인 암세포와 방사선 내성 암에서의 발현량 차이 및 방사선 치료에 대한 내성과의 관련성에 대해서는 알려진 바가 없다.

상기 ACSL4 유전자는 long chain fatty acid CoA ligase 4를 암호화하는 유전자로서, 방사선 치료에 대한 내성과의 관련성은 보고된 바가 없다.

상기 모에신(Moesin)은 MSN 유전자에 의해 암호화되는 단백질로서, ERM(Ezrin-radixin-moesin) 패밀리 단백질로 분류되며 액틴 세포 골격을 원형질막에 연결하는 것으로 알려져 있다. 상기 모에신 유전자는 MSN 유전자일 수 있다. 상기 모에신의 발현과 방사선 치료에 대한 내성과의 관련성은 보고된 바가 없다.

상기 MAP4K4 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 상기 MAP4K4 단백질은 서열번호 4의 펩타이드 서열로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있으며, 상기 ACSL4 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 상기 ACSL4 단백질은 서열번호 5의 펩타이드 서열로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있으며, 상기 Moesin 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 상기 Moesin 단백질은 서열번호 6의 펩타이드 서열로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 서열번호 1 내지 4는 하기 표 1에 개시되어 있다.

서열 번호	종류	서열정보
1	MAP4K4유전자	ATGGCGAACGACTCCCCTGCAAAAAGTCTGGTGGACATCGACCTCTCCTCCCTGCGGGATCCTGCTGGGATTTTTGAGCTGGTGGAAGTGGTTGGAAATGGCACCTATGGACAAGTCTATAAGGGTCGACATGTTAAAACGGGTCAGTTGGCAGCCATCAAAGTTATGGATGTCACTGAGGATGAAGAGGAAGAAATCAAACTGGAGATAAATATGCTAAAGAAATACTCTCATCACAGAAACATTGCAACATATTATGGTGCTTTCATCAAAAAGAGCCCTCCAGGACATGATGACCAACTCTGGCTTGTTATGGAGTTCTGTGGGGCTGGGTCCATTACAGACCTTGTGAAGAACACCAAAGGGAACACACTCAAAGAAGACTGGATCGCTTACATCTCCAGAGAAATCCTGAGGGGACTGGCACATCTTCACATTCATCATGTGATTCACCGGGATATCAAGGGCCAGAATGTGTTGCTGACTGAGAATGCAGAGGTGAAACTTGTTGACTTTGGTGTGAGTGCTCAGCTGGACAGGACTGTGGGGCGGAGAAATACGTTCATAGGCACTCCCTACTGGATGGCTCCTGAGGTCATCGCCTGTGATGAGAACCCAGATGCCACCTATGATTACAGAAGTGATCTTTGGTCTTGTGGCATTACAGCCATTGAGATGGCAGAAGGTGCTCCCCCTCTCTGTGACATGCATCCAATGAGAGCACTGTTTCTCATTCCCAGAAACCCTCCTCCCCGGCTGAAGTCAAAAAAATGGTCGAAGAAGTTTTTTAGTTTTATAGAAGGGTGCCTGGTGAAGAATTACATGCAGCGGCCCTCTACAGAGCAGCTTTTGAAACATCCTTTTATAAGGGATCAGCCAAATGAAAGGCAAGTTAGAATCCAGCTTAAGGATCATATAGATCGTACCAGGAAGAAGAGAGGCGAGAAAGATGAAACTGAGTATGAGTACAGTGGGAGTGAGGAAGAAGAGGAGGAAGTGCCTGAACAGGAAGGAGAGCCAAGTTCCATTGTGAACGTGCCTGGTGAGTCTACTCTTCGCCGAGATTTCCTGAGACTGCAGCAGGAGAACAAGGAACGTTCCGAGGCTCTTCGGAGACAACAGTTACTACAGGAGCAACAGCTCCGGGAGCAGGAAGAATATAAAAGGCAACTGCTGGCAGAGAGACAGAAGCGGATTGAGCAGCAGAAAGAACAGAGGCGACGGCTAGAAGAGCAACAAAGGAGAGAGCGGGAAGCTAGAAGGCAGCAGGAACGTGAACAGCGAAGGAGAGAACAAGAAGAAAAGAGGCGTCTAGAGGAGTTGGAGAGAAGGCGCAAAGAAGAAGAGGAGAGGAGACGGGCAGAAGAAGAAAAGAGGAGAGTTGAAAGAGAACAGGAGTATATCAGGCGACAGCTAGAAGAGGAGCAGCGGCACTTGGAAGTCCTTCAGCAGCAGCTGCTCCAGGAGCAGGCCATGTTACTGCATGACCATAGGAGGCCGCACCCGCAGCACTCGCAGCAGCCGCCACCACCGCAGCAGGAAAGGAGCAAGCCAAGCTTCCATGCTCCCGAGCCCAAAGCCCACTACGAGCCTGCTGACCGAGCGCGAGAGGTTCCTGTGAGAACAACATCTCGCTCCCCTGTTCTGTCCCGTCGAGATTCCCCACTGCAGGGCAGTGGGCAGCAGAATAGCCAGGCAGGACAGAGAAACTCCACCAGTATTGAGCCCAGGCTTCTGTGGGAGAGAGTGGAGAAGCTGGTGCCCAGACCTGGCAGTGGCAGCTCCTCAGGGTCCAGCAACTCAGGATCCCAGCCCGGGTCTCACCCTGGGTCTCAGAGTGGCTCCGGGGAACGCTTCAGAGTGAGATCATCATCCAAGTCTGAAGGCTCTCCATCTCAGCGCCTGGAAAATGCAGTGAAAAAACCTGAAGATAAAAAGGAAGTTTTCAGACCCCTCAAGCCTGCTGGCGAAGTGGATCTGACCGCACTGGCCAAAGAGCTTCGAGCAGTGGAAGATGTACGGCCACCTCACAAAGTAACGGACTACTCCTCATCCAGTGAGGAGTCGGGGACGACGGATGAGGAGGACGACGATGTGGAGCAGGAAGGGGCTGACGAGTCCACCTCAGGACCAGAGGACACCAGAGCAGCGTCATCTCTGAATTTGAGCAATGGTGAAACGGAATCTGTGAAAACCATGATTGTCCATGATGATGTAGAAAGTGAGCCGGCCATGACCCCATCCAAGGAGGGCACTCTAATCGTCCGCCAGACTCAGTCCGCTAGTAGCACACTCCAGAAACACAAATCTTCCTCCTCCTTTACACCTTTTATAGACCCCAGATTACTACAGATTTCTCCATCTAGCGGAACAACAGTGACATCTGTGGTGGGATTTTCCTGTGATGGGATGAGACCAGAAGCCATAAGGCAAGATCCTACCCGGAAAGGCTCAGTGGTCAATGTGAATCCTACCAACACTAGGCCACAGAGTGACACCCCGGAGATTCGTAAATACAAGAAGAGGTTTAACTCTGAGATTCTGTGTGCTGCCTTATGGGGAGTGAATTTGCTAGTGGGTACAGAGAGTGGCCTGATGCTGCTGGACAGAAGTGGCCAAGGGAAGGTCTATCCTCTTATCAACCGAAGACGATTTCAACAAATGGACGTACTTGAGGGCTTGAATGTCTTGGTGACAATATCTGGCAAAAAGGATAAGTTACGTGTCTACTATTTGTCCTGGTTAAGAAATAAAATACTTCACAATGATCCAGAAGTTGAGAAGAAGCAGGGATGGACAACCGTAGGGGATTTGGAAGGATGTGTACATTATAAAGTTGTAAAATATGAAAGAATCAAATTTCTGGTGATTGCTTTGAAGAGTTCTGTGGAAGTCTATGCGTGGGCACCAAAGCCATATCACAAATTTATGGCCTTTAAGTCATTTGGAGAATTGGTACATAAGCCATTACTGGTGGATCTCACTGTTGAGGAAGGCCAGAGGTTGAAAGTGATCTATGGATCCTGTGCTGGATTCCATGCTGTTGATGTGGATTCAGGATCAGTCTATGACATTTATCTACCAACACATGTAAGAAAGAACCCACACTCTATGATCCAGTGTAGCATCAAACCCCATGCAATCATCATCCTCCCCAATACAGATGGAATGGAGCTTCTGGTGTGCTATGAAGATGAGGGGGTTTATGTAAACACATATGGAAGGATCACCAAGGATGTAGTTCTACAGTGGGGAGAGATGCCTACATCAGTAGCATATATTCGATCCAATCAGACAATGGGCTGGGGAGAGAAGGCCATAGAGATCCGATCTGTGGAAACTGGTCACTTGGATGGTGTGTTCATGCACAAAAGGGCTCAAAGACTAAAATTCTTGTGTGAACGCAATGACAAGGTGTTCTTTGCCTCTGTTCGGTCTGGTGGCAGCAGTCAGGTTTATTTCATGACCTTAGGCAGGACTTCTCTTCTGAGCTGGTAG
2	ACSL4유전자	ATGAAACTTAAGCTAAATGTGCTCACCATTATTTTGCTGCCTGTCCACTTGTTAATAACAATATACAGTGCCCTTATATTTATTCCATGGTATTTTCTTACCAATGCCAAGAAGAAAAACGCTATGGCAAAGAGAATAAAAGCTAAGCCCACTTCAGACAAACCTGGAAGTCCATATCGCTCTGTCACACACTTCGACTCACTAGCTGTAATAGACATCCCTGGAGCAGATACTCTGGATAAATTATTTGACCATGCTGTATCCAAGTTTGGGAAGAAGGACAGCCTTGGGACCAGGGAAATCCTAAGTGAAGAAAATGAAATGCAGCCAAATGGAAAAGTTTTTAAGAAGTTAATTCTTGGGAATTATAAATGGATGAACTATCTTGAAGTGAATCGCAGAGTGAATAACTTTGGTAGTGGACTCACTGCACTGGGACTAAAACCAAAGAACACCATTGCCATCTTCTGTGAGACCAGGGCCGAATGGATGATTGCAGCACAGACCTGCTTTAAGTACAACTTTCCTCTTGTGACTTTATATGCCACACTTGGCAAAGAAGCAGTAGTTCATGGGCTAAATGAATCTGAGGCTTCCTATCTGATTACCAGTGTTGAACTTCTGGAAAGTAAACTTAAGACTGCATTGTTAGATATCAGTTGTGTTAAACATATCATTTATGTGGACAATAAGGCTATCAATAAAGCAGAGTACCCTGAAGGATTTGAGATTCACAGCATGCAATCAGTAGAAGAGTTGGGATCTAACCCAGAAAACTTGGGCATTCCTCCAAGTAGACCAACGCCTTCAGACATGGCCATTGTTATGTATACTAGTGGTTCTACTGGCCGACCTAAGGGAGTGATGATGCATCATAGCAATTTGATAGCTGGAATGACAGGCCAGTGTGAAAGAATACCTGGACTGGGACCGAAGGACACATATATTGGCTACTTGCCTTTGGCTCATGTGCTAGAACTGACAGCAGAGATATCTTGCTTTACCTATGGCTGCAGGATTGGATATTCTTCTCCGCTTACACTCTCTGACCAGTCCAGCAAAATTAAAAAAGGAAGCAAAGGAGACTGTACTGTACTGAAGCCCACACTTATGGCTGCTGTTCCGGAAATCATGGATAGAATTTATAAGAATGTTATGAGCAAAGTCCAAGAGATGAATTATATTCAGAAAACTCTGTTCAAGATAGGGTATGATTACAAATTGGAACAGATCAAAAAGGGATATGATGCACCTCTTTGCAATCTGTTACTGTTTAAAAAGGTCAAGGCCCTGCTGGGAGGGAATGTCCGCATGATGCTGTCTGGAGGGGCCCCGCTATCTCCTCAGACACACCGATTCATGAATGTCTGCTTCTGCTGCCCAATTGGCCAGGGTTATGGACTGACAGAATCATGTGGTGCTGGGACAGTTACTGAAGTAACTGACTATACTACTGGCAGAGTTGGAGCACCTCTTATTTGCTGTGAAATTAAGCTAAAAGACTGGCAAGAAGGCGGTTATACAATTAATGACAAGCCAAACCCCAGAGGTGAAATCGTAATTGGTGGACAGAACATCTCCATGGGATATTTTAAAAATGAAGAGAAAACAGCAGAAGATTATTCTGTGGATGAAAATGGACAAAGGTGGTTTTGCACTGGTGATATTGGAGAATTCCATCCCGATGGATGTTTACAGATTATAGATCGTAAGAAAGATCTAGTGAAGTTACAAGCAGGAGAGTATGTATCTCTTGGGAAAGTAGAAGCTGCACTGAAGAATTGTCCACTTATTGACAACATCTGTGCTTTTGCCAAAAGTGATCAGTCCTATGTGATCAGTTTTGTGGTTCCTAACCAGAAAAGGTTGACACTTTTGGCACAACAGAAAGGGGTAGAAGGAACTTGGGTTGATATCTGCAATAATCCTGCTATGGAAGCTGAAATACTGAAAGAAATTCGAGAAGCTGCAAATGCCATGAAATTGGAGCGATTTGAAATTCCAATCAAGGTTCGATTAAGCCCAGAGCCATGGACCCCTGAAACTGGTTTGGTAACTGATGCTTTCAAACTGAAAAGGAAGGAGCTGAGGAACCATTACCTCAAAGACATTGAACGAATGTATGGGGGCAAATAA
3	Moesin유전자	ATGCCCAAAACGATCAGTGTGCGTGTGACCACCATGGATGCAGAGCTGGAGTTTGCCATCCAGCCCAACACCACCGGGAAGCAGCTATTTGACCAGGTGGTGAAAACTATTGGCTTGAGGGAAGTTTGGTTCTTTGGTCTGCAGTACCAGGACACTAAAGGTTTCTCCACCTGGCTGAAACTCAATAAGAAGGTGACTGCCCAGGATGTGCGGAAGGAAAGCCCCCTGCTCTTTAAGTTCCGTGCCAAGTTCTACCCTGAGGATGTGTCCGAGGAATTGATTCAGGACATCACTCAGCGCCTGTTCTTTCTGCAAGTGAAAGAGGGCATTCTCAATGATGATATTTACTGCCCGCCTGAGACCGCTGTGCTGCTGGCCTCGTATGCTGTCCAGTCTAAGTATGGCGACTTCAATAAGGAAGTGCATAAGTCTGGCTACCTGGCCGGAGACAAGTTGCTCCCGCAGAGAGTCCTGGAACAGCACAAACTCAACAAGGACCAGTGGGAGGAGCGGATCCAGGTGTGGCATGAGGAACACCGTGGCATGCTCAGGGAGGATGCTGTCCTGGAATATCTGAAGATTGCTCAAGATCTGGAGATGTATGGTGTGAACTACTTCAGCATCAAGAACAAGAAAGGCTCAGAGCTGTGGCTGGGGGTGGATGCCCTGGGTCTCAACATCTATGAGCAGAATGACAGACTAACTCCCAAGATAGGCTTCCCCTGGAGTGAAATCAGGAACATCTCTTTCAATGATAAGAAATTTGTCATCAAGCCCATTGACAAAAAAGCCCCGGACTTCGTCTTCTATGCTCCCCGGCTGCGGATTAACAAGCGGATCTTGGCCTTGTGCATGGGGAACCATGAACTATACATGCGCCGTCGCAAGCCTGATACCATTGAGGTGCAGCAGATGAAGGCACAGGCCCGGGAGGAGAAGCACCAGAAGCAGATGGAGCGTGCTATGCTGGAAAATGAGAAGAAGAAGCGTGAAATGGCAGAGAAGGAGAAAGAGAAGATTGAACGGGAGAAGGAGGAGCTGATGGAGAGGCTGAAGCAGATCGAGGAACAGACTAAGAAGGCTCAGCAAGAACTGGAAGAACAGACCCGTAGGGCTCTGGAACTTGAGCAGGAACGGAAGCGTGCCCAGAGCGAGGCTGAAAAGCTGGCCAAGGAGCGTCAAGAAGCTGAAGAGGCCAAGGAGGCCTTGCTGCAGGCCTCCCGGGACCAGAAAAAGACTCAGGAACAGCTGGCCTTGGAAATGGCAGAGCTGACAGCTCGAATCTCCCAGCTGGAGATGGCCCGACAGAAGAAGGAGAGTGAGGCTGTGGAGTGGCAGCAGAAGGCCCAGATGGTACAGGAAGACTTGGAGAAGACCCGTGCTGAGCTGAAGACTGCCATGAGTACACCTCATGTGGCAGAGCCTGCTGAGAATGAGCAGGATGAGCAGGATGAGAATGGGGCAGAGGCTAGTGCTGACCTACGGGCTGATGCTATGGCCAAGGACCGCAGTGAGGAGGAACGTACCACTGAGGCAGAGAAGAATGAGCGTGTGCAGAAGCACCTGAAGGCCCTCACTTCGGAGCTGGCCAATGCCAGAGATGAGTCCAAGAAGACTGCCAATGACATGATCCATGCTGAGAACATGCGACTGGGCCGAGACAAATACAAGACCCTGCGCCAGATCCGGCAGGGCAACACCAAGCAGCGCATTGACGAATTTGAGTCTATGTAA
4	MAP4K4단백질	MANDSPAKSLVDIDLSSLRDPAGIFELVEVVGNGTYGQVYKGRHVKTGQLAAIKVMDVTEDEEEEIKLEINMLKKYSHHRNIATYYGAFIKKSPPGHDDQLWLVMEFCGAGSITDLVKNTKGNTLKEDWIAYISREILRGLAHLHIHHVIHRDIKGQNVLLTENAEVKLVDFGVSAQLDRTVGRRNTFIGTPYWMAPEVIACDENPDATYDYRSDLWSCGITAIEMAEGAPPLCDMHPMRALFLIPRNPPPRLKSKKWSKKFFSFIEGCLVKNYMQRPSTEQLLKHPFIRDQPNERQVRIQLKDHIDRTRKKRGEKDETEYEYSGSEEEEEEVPEQEGEPSSIVNVPGESTLRRDFLRLQQENKERSEALRRQQLLQEQQLREQEEYKRQLLAERQKRIEQQKEQRRRLEEQQRREREARRQQEREQRRREQEEKRRLEELERRRKEEEERRRAEEEKRRVEREQEYIRRQLEEEQRHLEVLQQQLLQEQAMLLHDHRRPHPQHSQQPPPPQQERSKPSFHAPEPKAHYEPADRAREVPVRTTSRSPVLSRRDSPLQGSGQQNSQAGQRNSTSIEPRLLWERVEKLVPRPGSGSSSGSSNSGSQPGSHPGSQSGSGERFRVRSSSKSEGSPSQRLENAVKKPEDKKEVFRPLKPAGEVDLTALAKELRAVEDVRPPHKVTDYSSSSEESGTTDEEDDDVEQEGADESTSGPEDTRAASSLNLSNGETESVKTMIVHDDVESEPAMTPSKEGTLIVRQTQSASSTLQKHKSSSSFTPFIDPRLLQISPSSGTTVTSVVGFSCDGMRPEAIRQDPTRKGSVVNVNPTNTRPQSDTPEIRKYKKRFNSEILCAALWGVNLLVGTESGLMLLDRSGQGKVYPLINRRRFQQMDVLEGLNVLVTISGKKDKLRVYYLSWLRNKILHNDPEVEKKQGWTTVGDLEGCVHYKVVKYERIKFLVIALKSSVEVYAWAPKPYHKFMAFKSFGELVHKPLLVDLTVEEGQRLKVIYGSCAGFHAVDVDSGSVYDIYLPTHVRKNPHSMIQCSIKPHAIIILPNTDGMELLVCYEDEGVYVNTYGRITKDVVLQWGEMPTSVAYIRSNQTMGWGEKAIEIRSVETGHLDGVFMHKRAQRLKFLCERNDKVFFASVRSGGSSQVYFMTLGRTSLLSW
5	ACSL4 단백질	MKLKLNVLTIILLPVHLLITIYSALIFIPWYFLTNAKKKNAMAKRIKAKPTSDKPGSPYRSVTHFDSLAVIDIPGADTLDKLFDHAVSKFGKKDSLGTREILSEENEMQPNGKVFKKLILGNYKWMNYLEVNRRVNNFGSGLTALGLKPKNTIAIFCETRAEWMIAAQTCFKYNFPLVTLYATLGKEAVVHGLNESEASYLITSVELLESKLKTALLDISCVKHIIYVDNKAINKAEYPEGFEIHSMQSVEELGSNPENLGIPPSRPTPSDMAIVMYTSGSTGRPKGVMMHHSNLIAGMTGQCERIPGLGPKDTYIGYLPLAHVLELTAEISCFTYGCRIGYSSPLTLSDQSSKIKKGSKGDCTVLKPTLMAAVPEIMDRIYKNVMSKVQEMNYIQKTLFKIGYDYKLEQIKKGYDAPLCNLLLFKKVKALLGGNVRMMLSGGAPLSPQTHRFMNVCFCCPIGQGYGLTESCGAGTVTEVTDYTTGRVGAPLICCEIKLKDWQEGGYTINDKPNPRGEIVIGGQNISMGYFKNEEKTAEDYSVDENGQRWFCTGDIGEFHPDGCLQIIDRKKDLVKLQAGEYVSLGKVEAALKNCPLIDNICAFAKSDQSYVISFVVPNQKRLTLLAQQKGVEGTWVDICNNPAMEAEILKEIREAANAMKLERFEIPIKVRLSPEPWTPETGLVTDAFKLKRKELRNHYLKDIERMYGGK
6	Moesin단백질	MPKTISVRVTTMDAELEFAIQPNTTGKQLFDQVVKTIGLREVWFFGLQYQDTKGFSTWLKLNKKVTAQDVRKESPLLFKFRAKFYPEDVSEELIQDITQRLFFLQVKEGILNDDIYCPPETAVLLASYAVQSKYGDFNKEVHKSGYLAGDKLLPQRVLEQHKLNKDQWEERIQVWHEEHRGMLREDAVLEYLKIAQDLEMYGVNYFSIKNKKGSELWLGVDALGLNIYEQNDRLTPKIGFPWSEIRNISFNDKKFVIKPIDKKAPDFVFYAPRLRINKRILALCMGNHELYMRRRKPDTIEVQQMKAQAREEKHQKQMERAMLENEKKKREMAEKEKEKIEREKEELMERLKQIEEQTKKAQQELEEQTRRALELEQERKRAQSEAEKLAKERQEAEEAKEALLQASRDQKKTQEQLALEMAELTARISQLEMARQKKESEAVEWQQKAQMVQEDLEKTRAELKTAMSTPHVAEPAENEQDEQDENGAEASADLRADAMAKDRSEEERTTEAEKNERVQKHLKALTSELANARDESKKTANDMIHAENMRLGRDKYKTLRQIRQGNTKQRIDEFESM

상기 발현은 mRNA 발현 또는 단백질 발현을 의미하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 제제는 연자육 또는 연자방 추출물일 수 있다.

상기 연자육(Nelumbinis Semen)은 연꽃(Nelumbo nucifera Gaertner)의 잘익은 씨앗으로, 타원형 또는 구형에 가깝고 길이는 12 내지 18mm, 지름은 8 내지 14mm이다. 바깥면은 단단하고 짙은 회갈색으로 가느다란 세로무늬와 비교적 넓은 맥문이 있으며 냄새가 거의 없고 맛은 달다. 상기 연자방은 연방으로도 부르며 연꽃의 씨방을 말린 것으로서 연자육을 제외한 것을 의미한다. 본 발명자는 연자육 또는 연자방의 에탄올 추출물이 방사선 내성 암에서 증가하는 MAP4K4, ACSL4, 및 Moesin의 발현을 억제함으로서 방사선 내성 암 특이적인 세포 사멸 효과가 있음을 확인하였다.

연자육 추출물 또는 연자방 추출물은 당업자에게 알려진 방법을 이용하여 준비할 수 있으며, 시중에서 구입한 제품을 사용할 수도 있다.

상기 연자육 또는 연자방 추출물의 용매는 물, 에탄올, 메탄올, 프로판올과 같은 극성 용매 또는 헥산, 에테르 등의 비극성 용매를 가하여 실온에서 침적 추출하거나 가온 추출한 것일 수 있으며, 바람직하게는 에탄올을 용매로 하여 상온 추출한 것일 수 있다. 상온 추출은 연자육 또는 연자방을 1 내지 4일, 또는 3일간 20 내지 30℃에서 용매에 침지시켜 추출하는 것일 수 있다.

상기 연자육 또는 연자방 추출물의 용매는 연자육의 4 내지 6배, 또는 5배 부피의 에탄올을 사용하여 추출한 것일 수 있으며, 에탄올은 30% 에탄올, 60% 에탄올, 또는 100% 에탄올일 수 있으며, 바람직하게는 70% 에탄올일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 암은 MAP4K4, ACSL4 및 모에신 발현 차이에 의해 구별할 수 있는 암이라면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 두경부암, 후두암, 인두암, 폐암, 뇌암, 유방암, 또는 대장암일 수 있으며, 바람직하게는 유방암일 수 있다. 상기 유방암 세포는 Her2 과발현 유방암, 또는 호르몬 수용체 양성 유방암 세포일 수 있으며, 상기 호르몬 수용체 양성은 에스트로겐 또는 프로게스테론 수용체의 발현인 것일 수 있다.

상기 방사선 내성 암은 MAP4K4, ACSL4, 및 모에신 유전자의 발현이 SK-BR-3 또는 MCF-7 암세포의 발현량보다 증가한 것일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 붕해제로는 전분글리콜산나트륨, 크로스포비돈, 크로스카멜로스나트륨, 알긴산, 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 카르복시 메틸셀룰로오스 나트륨, 키토산, 구아검, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 폴라크릴린 칼륨 등이 있다.

상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨, 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용가능한 첨가제는 상기 약학적 조성물에 대해 0.1~90 중량부 포함되는 것이 바람직하다.

경구투여를 위한 고형제제에는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연질캅셀제, 환 등이 포함된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 에어로졸 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제로는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사제제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용 약학적 조성물을 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 경구 투여제의 경우 일반적으로 성인에게 1일에 체중 1 kg당 본 발명의 조성물을 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.

다른 양상은, MAP4K4, ACSL4 및 모에신 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 포함하는 방사선 내성 암 개선용 건강기능식품을 제공한다.

상기 MAP4K4, ACSL4, 및 모에신에 대한 설명은 상술한 내용과 동일하다.

상기 제제는 연자육 또는 연자방 추출물일 수 있다. 연자육 또는 연자방 및 이들의 추출물에 대한 설명은 상술한 내용과 동일하다.

상기 암 및 방사선 내성 암에 대한 내용은 상술한 내용과 동일하다.

상기 건강 기능 식품은 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 위생)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강 기능 식품의 형태 및 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 건강 기능 식품의 형태는 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등일 수 있고, 건강 기능 식품의 종류는 버터, 요구르트, 치즈를 포함한 유제품, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 유산균 제제, 발효유, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있다.

본 발명의 건강 기능 식품은 통상의 건강 기능 식품과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성감미제 등을 사용할 수 있다.

상기한 것 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

일 구체예에 따른 방사선 내성 암 치료용 약학적 조성물은 방사선 내성 암에서 과발현되는 MAP4K4, ACSL4, 및 모에신 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현을 억제하는 제제를 포함함으로써 방사선 내성 암을 선택적으로 사멸시킬 수 있으므로 방사선 내성 암 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

일 구체예에 따른 방사선 내성 암 개선용 건강기능식품은 방사선 내성 암에서 과발현되는 MAP4K4, ACSL4, 및 모에신 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현을 억제하는 제제를 포함함으로써 방사선 내성 암을 선택적으로 사멸시킬 수 있으므로 방사선 내성 암 개선 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 유방암 세포 SK-BR-3 및 MCF-7로부터 방사선 내성 유방암 세포인 SR 및 MR을 구축하는 과정을 도시한 것이다.
도 2는 방사선 내성 암세포주인 SR 및 MR이 일반 암세포주인 SK-BR-3 및 MCF-7 보다 방사선 조사 후 조직 생존율이 높음을 확인한 결과이다.
도 3은 방사선 내성 암세포주인 SR이 표적치료제(트라스트주맙과 라파티닙) 및 일반항암제(독소루비신)에 대해 내성이 있음을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 방사선 내성 암세포주인 SR에서 MAP4K4, ACSL4, 및 Moesin 유전자의 발현이 증가함을 cDNA 마이크로어레이 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 5는 방사선 내성 암세포주인 SR 및 MR에서 MAP4K4, ACSL4, 및 Moesin mRNA의 발현이 증가함을 확인한 결과이다.
도 6은 방사선 내성 암세포주인 SR 및 MR에서 MAP4K4, ACSL4 및 Moesin 단백질의 발현이 증가함을 확인한 결과이다.
도 7의 A는 방사선 내성 암세포 SR에서 ACSL1, ACSL3, ACSL4, ACSL5, 및 ACSL6 중에서 ACSL4 유전자의 발현이 특이적으로 증가함을 확인한 결과이며, 도 7의 B는 방사선 내성 암세포 SR 및 MR에서 ACSL 이성체 중 ACSL4 단백질의 발현만 특이적으로 증가함을 확인한 결과이다.
도 8은 수용성 연자육 추출물이 방사선 내성 암세포인 SR에 대해 세포 독성이 없음을 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명의 실시예에 따른 연자육의 70% 에탄올 추출물을 제조하는 과정을 도시한 것이다.
도 10은 연자육의 70% 에탄올 추출물이 방사선 내성 암세포 SR 및 MR에 대해 선택적으로 높은 세포사멸효과를 나타냄을 확인한 결과이다.
도 11은 방사선 내성 암세포 SR 및 MR에서 증가한 MAP4K4, ACSL4, 및 Moesin 발현이 연자육 70% 에탄올 추출물에 의해 효과적으로 억제됨을 확인한 결과이다.
도 12는 본 발명의 실시예에 따른 연자방의 70% 에탄올 추출물을 제조하는 과정을 도시한 것이다.
도 13의 A는 연자방 70% 에탄올 추출물이 방사선 내성 암세포(SR)에 대해 선택적으로 높은 세포사멸효과를 나타냄을 확인한 결과이며, 도 13의 B는 연자방 70% 에탄올 추출물이 방사선 내성 암세포(SR)에서 증가한 MAP4K4, ACSL4, 및 Moesin 단백질의 발현을 억제함을 확인한 결과이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 방사선 내성 종양모델 구축

SK-BR-3 및 MCF-7 암세포주를 준비하였다. SK-BR-3은 Her2 과발현 subtype의 인간 유방암 세포이며, MCF-7은 호르몬 수용체 양성 subtype의 인간 유방암 세포이다.

SK-BR-3 및 MCF-7 암세포주에 (a) 2 내지 5 Gy의 방사선을 주 2회 반복 조사하였으며 (b) 총 4 내지 10 Gy의 방사선이 조사된 암세포를 총 6주간 계대배양 하였다. 상기 (a) 단계 및 (b) 단계를 6회 내지 10 회 반복함으로써 방사선 내성 암세포를 확립하였다. 방사선 저항성 유무를 판단하기 위해 집락 형성능 분석(colony forming assay)를 시행하여 저항성 획득 여부를 판단하였다. 상기 각 일반 유방암 세포 SK-BR-3 및 MCF-7로부터 확립된 각각의 방사선 내성 인간 유방암 세포를 SR 및 MR로 명명하였다(도 1 참조).

실시예 2: SR 및 MR 세포의 방사선 내성 획득 확인

SR 및 MR 세포의 방사선 내성 획득 여부를 조사하기 위해 집락 형성능 분석을 실시하여 일반 유방암 세포(이하 일반 암세포) SK-BR-3 및 MCF-7과 조직 생존율(survival fraction)을 비교 평가하였다. 먼저 300 내지 900개의 세포를 10% fetal bovine serum이 포함된 DMEM(이하 10% FBS DMEM)에 현탁한 후 6 well plate에 plating 하였다. 24시간 동안 배양한 다음 각각 0, 2, 4 Gy로 방사선을 조사한 후 37도, 5% CO₂가 유지되는 배양기에서 10 내지 30일 동안 배양하였다. 형성된 집락을 10% formalin으로 15분 동안 고정한 다음 0.01% crystal violet으로 염색한 후 counting 하여 조직 생존율을 산출하였다.

도 2의 A 및 B에 나타낸 바와 같이, 방사선 내성 암세포인 SR 및 MR의 조직 생존율이 SR-BR-3 및 MCF-7보다 높은 것으로 확인되었으며, SR 및 MR 모두 방사선에 대한 저항성을 획득하였음을 확인하였다.

실시예 3: 방사선 내성 암세포의 항암제에 대한 내성 획득 확인

임상에서 유방암 치료제로 사용 중인 HER2 표적 치료제 트라스트주맙(trastuzumab), EGFR/HER2 이중표적 치료제 라파티닙(lapatinib), 및 일반 항암제 독소루비신(doxorubicin)의 방사선 내성 암세포에 대한 항암 효과를 확인하였다. 각 항암제를 일반 암세포 (SK-BR-3) 및 방사선 내성 암세포(SR)에 72시간 동안 처리한 후 MTT assay를 실시하였다.

구체적으로, 일반 암세포 SK-BR-3 (5,000개/well)와 방사선 내성 암세포 SR (2,000개/well)를 10% FBS DMEM배지에 현탁한 후 96-well plate에 seeding하고 24시간 배양하였다. 그 후 다양한 농도의 trastuzumab (3, 6, 12.5, 25, 50 μg/mL), lapatinib (0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5 μM) 또는 doxorubicin (0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6 μM)을 처리한 다음 3일(약 72 시간) 동안 배양하였다. 배양이 끝난 세포에 MTT 시약을 첨가하고 4시간 동안 배양 한 다음 570nm에서 흡광값을 측정하여 일반 암세포와 방사선 내성 암세포의 생존율을 비교 분석하였다

도 3의 A 및 B에 나타낸 바와 같이, 표적치료제인 트라스트주맙과 라파티닙에 의한 세포 생존율은 일반 암세포인 SK-BR-3 보다 방사선 내성 암세포인 SR에서 월등히 높게 나타나는 것으로 나타났다. 뿐만 아니라 일반 항암제인 독소루비신에 의한 세포 생존율 또한 일반 암세포 보다 방사선 내성 암세포에서 높은 것으로 나타났다(도 3의 C). 이러한 결과는 방사선 내성 암세포가 방사선 내성뿐만 아니라 표적 치료제 (trastuzumab 및 lapatinib)와 일반 항암제(doxorubicin)에 대한 내성 또한 획득하였음을 보여주고 있다.

특히, 상기 결과는 방사선 내성 유방암의 효율적 치료를 위하여 방사선 내성을 유도하는 핵심 인자 즉, 방사선 내성 인자를 발굴하여 이를 표적으로 하는 새로운 치료 전략을 개발할 필요가 있음을 보여주고 있다.

실시예 4: 방사선 내성 암세포에서 MAP4K4, ACSL4 및 Moesin 유전자 발현 증가 확인

방사선 내성 암세포(SR)에서 방사선 내성 획득에 따른 유전자의 발현 변화를 분석하기 위해서 cDNA microarray를 실시하였다. 먼저, easy-BLUE total RNA extraction kit (iNtRON Biotechnology, Sungnam, Korea)를 이용하여 각 세포로부터 total RNA를 추출한 다음 (주)디앤피바이오택 (Daegu, Korea)에 cDNA microarray 분석을 의뢰하여 유전자의 발현 변화를 비교 분석하였다.

분석 결과, 일반 암세포 (SK-BR-3)와 방사선 내성 암세포(SR) 사이에서는 약 2,000개의 유전자의 발현에 변화가 있음을 확인하였다, 특히 도 4에 나타낸 바와 같이, SR 세포주는 SK-BR-3 세포주보다 MAP4K4 유전자의 발현이 6배 이상, ACSL4 유전자의 발현이 5배 이상, Moesin 유전자는 4.6배 이상 증가하였음을 확인하였다.

실시예 5: 방사선 내성 암세포에서 MAP4K4, ACSL4 및 Moesin mRNA 발현 증가 확인

일반 암세포(SK-BR-3와 MCF-7)와 방사선 내성 암세포 (SR과 MR)에서 MAP4K4, ACSL4, 및 Moesin의 mRNA의 발현을 비교 분석하기 위해서 realtime PCR을 수행하였다. 먼저, 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 total RNA 추출한 다음 reverse-transcriptase를 이용하여 cDNA를 제조하였다. 제조한 cDNA를 주형으로 하여 MAP4K4 프라이머 (Forward 5'-GAGAGGCTCCAGAGGCAGTTGCA-3', Reverse 5'-CCACCTCTCGCGCTCGGTCAG-3'), ACSL4 프라이머 (Forward 5'-GGGAAGAAGGACAGCCTTGGG-3', Reverse 5'-TCGGCCCTGGTCTCACAGAA-3'), Moesin 프라이머 (Forward 5'-GCTGTGGAGTGGCAGCAGAA-3', Reverse 5'-CGTTCCTCCTCACTGCGGTC-3')와 18s rRNA 프라이머(Forward 5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3', Reverse 5'-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3')를 이용하여 변성단계(95℃, 10초), 어닐링단계(60℃, 20초) 및 연장단계(72℃, 20초)를 1 cycle로 하여 45 cycles를 실시하여 realtime PCR을 시행한 후 방사선 내성 암세포와 일반 암세포에서 나타난 ACSL4와 Moesin mRNA의 발현을 비교 분석하였다. 프라이머 및 서열목록 정보는 하기 표 2에 기재되어 있다.

서열목록	서열정보	서열
7	MAP4K4 정방향 프라이머	5'-GAGAGGCTCCAGAGGCAGTTGCA-3'
8	MAP4K4 역방향 프라이머	5'-CCACCTCTCGCGCTCGGTCAG-3'
9	ACSL4 정방향 프라이머	5'-GGGAAGAAGGACAGCCTTGGG-3'
10	ACSL4 역방향 프라이머	5'-TCGGCCCTGGTCTCACAGAA-3
11	Moesin 정방향 프라이머	5'-GCTGTGGAGTGGCAGCAGAA-3'
12	Moesin 역방향 프라이머	5'-CGTTCCTCCTCACTGCGGTC-3'
13	18s rRNA 정방향 프라이머	5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3'
14	18s rRNA 역방향 프라이머	5'-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3'

도 5의 A, B, 및 C에 나타낸 바와 같이, 방사선 내성 암세포(SR과 MR)가 일반 암세포(SK-BR-3, MCF-7)보다 MAP4K4, ACSL4, 및 Moesin mRNA의 발현이 월등이 높음을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 방사선 내성 암세포에서 MAP4K4, ACSL4, 및 Moesin 단백질의 발현 증가 확인

일반 암세포(SK-BR-3와 MCF-7)와 방사선 내성 암세포 (SR과 MR)에서 MAP4K4, ACSL4, 및 Moesin 단백질의 발현을 분석하기 위해서 western blot assay를 수행하였다. Protease inhibitor와 phosphatase inhibitor를 1:100의 비율로 혼합한 RIPA lysis buffer를 세포에 넣고 상온에서 5분 동안 반응시킨 후 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 획득한 상층액을 단백질 샘플로 사용하였다.

각 단백질 샘플은 BSA (Bovine serum와albumin)로 단백질 정량을 하고, 동일한 양의 단백질을 8%의 SDS-PAGE (Sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리한 후 PVDF (polyvinylidene fluoride) 막으로 옮겨서 ACSL4 또는 Moesin antibody를 사용하여 발현변화를 분석하였다. 단백질의 loading control로는 β-actin을 사용하였다. 2차 항체(Secondary antibody)는 horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-rabbit IgG 또는 HRP-conjugated anti-mouse IgG를 사용하였고, 단백질 밴드는 ECL (Enhanced chemiluminescence) solution으로 발색한 후 LAS-4000 (Fujifilm, Tokyo, Japan)으로 확인하였다.

도 6의 A, B, 및 C에 나타낸 바와 같이, 일반 암세포(SK-BR-3와 MCF-7)에서는 MAP4K4, ACSL4, 및 Moesin 단백질의 발현이 나타나지 않는 반면, 방사선 내성 암세포인 SR과 MR에서는 뚜렷하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7: 방사선 내성 암세포에서 5가지 ACSL 이성체 중 ACSL 4의 단독 발현 증가 확인

7-1. 방사선 내성 암세포에서 ACSL 4 유전자의 단독 발현 증가 확인

상기 실시예 4와 동일한 방법으로 cDNA microarray 분석을 실시 한 후 ACSL1, ACSL3, ACSL4, ACSL5, 및 ACSL6의 발현을 분석하였다.

도 7의 A에서 나타낸 바와 같이, ACSL1, ACSL3, ACSL5, 및 ACSL6의 유전자발현은 방사선 내성 세포 SR에서 일반 암세포(SK-BR-3) 보다 감소하거나 2 배 이하의 낮은 수준으로 증가하는 것으로 나타났다. 반면 ACSL4의 경우, 방사선 내성 암세포인 SR에서 일반 암세포 보다 발현이 5.5배 증가하는 것으로 나타났다.

7-2. 방사선 내성 암세포에서 ACSL4 단백질의 단독 발현 증가 확인

상기 실시예 6과 동일한 방법으로 준비한 단백질 샘플을 이용하여 ACSL1, ACSL3, ACSL4, 및 ACSL5의 발현을 분석하였다.

도 7의 B에 나타낸 바와 같이, 방사선 내성 암세포인 SR과 MR은 4가지 이성체 ACSL1, ACSL3, ACSL4, 및 ACSL5 중에서 ACSL4의 단백질만 특이적으로 발현이 증가함을 알 수 있다. 따라서 실시예 7-1 및 실시예 7-2의 결과를 바탕으로 방사선 내성 암세포에서 ACSL 4만 특이적으로 발현이 증가함을 알 수 있다.

실시예 8: 수용성 연자육의 방사선 내성 암세포에 대한 무독성 확인

본 실험에 사용된 수용성 연자육 추출물은 시중에서 고형차 식품유형으로 판매되고 있는 연자육 제품을 구매하여 실험에 사용하였다. 방사선 내성 암세포에 대한 수용성 연자육 추출물의 선택적 세포사멸효과를 분석하기 위해서 일반 암세포(SK-BR-3 및 MCF-7)와 방사선 내성 암세포 (SR 및 MR)에 다양한 농도의 수용성 연자육 추출물을 처리한 후 SRB (Sulfohodamin B) assay를 실시하였다.

실시예 3과 동일한 방법으로 세포를 seeding한 후 24시간 동안 배양하였다. 그 후 1, 5, 10, 50, 100, 및 200 μg/mL의 수용성 연자육 추출물을 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 상층액을 버리고 10% (w/v) TCA (Trichloroacetic acid) 용액을 100 μL 넣고 4℃에서 한 시간 동안 배양한 후 천천히 흐르는 수돗물을 이용하여 4회 세척하였다. Plate를 상온에 방치하여 물기를 모두 건조시킨 후 0.4% (w/v) SRB 용액 100 μL를 넣고 상온에서 30분 동안 반응 시킨 후 1% (v/v) acetic acid 용액을 이용하여 세포단백질에 결합하지 않은 여분의 SRB를 제거하였다. 상온에 방치하여 plate를 완전히 건조 시킨 후 200 μL의 10 mM Tris base 용액 (pH 10.5)를 넣어 세포단백질에 결합한 SRB를 용해시킨 후 510 nm에서 흡광값을 측정하여 세포의 생존율을 산출 하여 비교 분석하였다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 수용성 연자육 추출물은 일반 암세포 뿐만 아니라 방사선 내성 암세포에 대한 세포 독성이 없는 것으로 나타났다.

실시예 9: 70% 에탄올 연자육 추출물 제조

도 9를 참조하여 제조방법을 설명한다. 연자육은 경상북도 경산에서 재배된 것을 구입하여 사용하였다. 70% 에탄올을 이용한 연자육 추출물을 제조하기 위해 연자육 20g에 5배 부피의 70% 에탄올(100 mL)을 넣고 3일간 상온에서 추출하였다. 동일한 방법으로 2회 반복 추출하여 추출액을 분리한 다음 여과하고 회전 감압 농축기를 이용하여 고형이 될 때까지 농축하였다. 추출물은 DMSO (Dimethyl sulfoxide)에 고농도로 녹인 다음 -80℃에 보관하며 실험에 사용하였다.

실시예 10: 연자육 70% 에탄올 추출물의 방사선 내성 암세포에 대한 선택적 세포 사멸 및 MAP4K4, ACSL 4, 및 Moesin의 발현 억제효과 확인

10-1. 연자육 70% 에탄올 추출물의 방사선 내성 암세포에 대한 선택적 세포사멸효과 분석

연자육 70% 에탄올 추출물의 방사선 내성 암세포에 대한 선택적 세포사멸효과를 분석하기 위해서 일반 암세포(SK-BR-3 및 MCF-7)와 방사선 내성 암세포(SR 및 MR)에 다양한 농도의 연자육 70% 에탄올 추출물을 처리한 후 SRB (Sulfohodamin B) assay를 실시하였다.

상기 실시예 8과 동일한 방법으로 세포를 seeding한 후 24시간 동안 배양하였다. 그 후 20∼120 μg/mL 또는 10∼200 μg/mL의 연자육 70% 에탄올 추출물을 처리하고 24 또는 48시간 동안 배양한 후 세포 고정, SRB 염색 후 510nm에서 흡광값 측정을 하여 세포의 생존율을 산출하여 비교 분석하였다.

도 10의 A 및 B에 나타낸 바와 같이, 연자육 70% 에탄올 추출물은 방사선 내성 암세포인 SR 및 MR에 대해 농도 의존적으로 높은 선택적 세포 사멸 효과를 나타냄을 알 수 있다.

10-2. 연자육 70% 에탄올 추출물의 방사선 내성 암세포에서 증가된 MAP4K4, ACSL4, 및 Moesin 단백질에 대한 발현 억제 효과 분석

연자육 70% 에탄올 추출물을 처리한 방사선 내성 암세포에서 MAP4K4, ACSL4, 및 Moesin 단백질의 발현 변화를 분석하기 위해 western blot assay를 실시하였다. 방사선 내성 암세포(SR 및 MR)에 10, 25, 50 및 100 μg/mL 또는 20, 40, 80, 120 μg/mL의 연자육 70% 에탄올 추출물을 24시간 동안 처리한 후 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 단백질 샘플을 준비하여 실험에 사용하였다.

도 11의 A 및 B에 나타낸 바와 같이, 연자육 70% 에탄올 추출물의 처리 농도에 의존적으로 MAP4K4, ACSL4, 및 Moesin 단백질의 발현이 효과적으로 저해됨을 알 수 있다. 이는 연자육 70% 에탄올 추출물의 방사선 내성 암세포인 SR과 MR에 대한 선택적 세포사멸 효과는 MAP4K4, ACSL4, 및 Moesin의 발현 억제에 의한 것임을 보여는 결과이다.

실시예 11: 연자방 70% 에탄올 추출물의 조제

도 12를 참조하여 연자방 추출물 제조방법을 설명한다. 연자방은 경상북도 경산에서 재배된 것을 구입하여 사용하였다. 70% 에탄올을 이용한 연자방 추출물을 제조하기 위해 연자방 214.3 g에 5배 부피의 70% 에탄올(1,100 mL)을 넣고 3일간 상온에서 추출하였다. 동일한 방법으로 2회 반복 추출하여 추출액을 분리한 다음 여과하고 회전 감압 농축기를 이용하여 고형이 될 때까지 농축하였고 잔류 수분은 동결건조기를 이용하여 제거하였다. 추출물은 DMSO에 고농도로 녹인 다음 -80℃에 보관하며 실험에 사용하였다.

실시예 12: 연자방 70% 에탄올 추출물에 의한 방사선 내성 암세포의 선택적 세포 사멸 및 MAP4K4, ACSL4, 및 Moesin의 발현 억제효과 확인

12-1. 방사선 내성 암세포에 대한 연자방 70% 에탄올 추출물의 선택적 세포사멸효과 분석

연자방 70% 에탄올 추출물의 방사선 내성 암세포에 대한 선택적 세포사멸효과를 분석하기 위해서 일반 암세포(SK-BR-3) 및 방사선 내성 암세포 (SR)에 다양한 농도의 연자방 70% 에탄올 추출물을 처리한 후 SRB assay를 실시하였다.

상기 실시예 8과 동일한 방법으로 세포를 seeding한 후 24시간 동안 배양하였다. 그 후 5, 7.5, 10, 20, 30, 40, 및 50 μg/mL 의 연자방 70% 에탄올 추출물을 48시간 동안 처리한 후 세포 고정, SRB 염색 후 510nm에서 흡광값 측정을 하여 세포의 생존율을 산출하여 비교 분석하였다.

도 13의 A에 나타낸 바와 같이, 연자방 70% 에탄올 추출물의 농도에 의존적으로 방사선 내성 암세포인 SR에 선택적으로 높은 세포 사멸 효과를 나타냄을 알 수 있다.

12-2. 방사선 내성 암세포에서 증가된 MAP4K4, ACSL4, 및 Moesin 단백질 발현에 대한 연자방 70% 에탄올 추출물의 발현 억제 효과 분석

연자방 70% 에탄올 추출물을 처리한 방사선 내성 암세포에서 MAP4K4, ACSL4, 및, Moesin 단백질의 발현 변화를 분석하기 위해 western blot assay를 실시하였다. 방사선 내성 암세포(SR)에 5, 10, 20, 및 30 μg/mL의 연자방 70% 에탄올 추출물을 24시간 동안 처리한 후 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 단백질 샘플을 준비하여 실험에 사용하였다.

도 13의 B에 나타낸 바와 같이, MAP4K4, ACSL4, 및 Moesin 단백질의 발현은 연자방 70% 에탄올 추출물의 처리 농도에 의존적으로 발현이 저해됨을 알 수 있다. 이는 방사선 내성 암세포인 SR에 대한 연자방 70% 에탄올 추출물의 선택적 세포사멸 효과는 MAP4K4, ACSL4, 및 Moesin의 발현 억제에 의한 것임을 보여는 결과이다.

<110> Dongguk University Gyeongju Campus Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating radiation-resistant cancer comprising lotus root or lotus extract <130> PN190309 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 3498 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAP4K4 gene <400> 1 atggcgaacg actcccctgc aaaaagtctg gtggacatcg acctctcctc cctgcgggat 60 cctgctggga tttttgagct ggtggaagtg gttggaaatg gcacctatgg acaagtctat 120 aagggtcgac atgttaaaac gggtcagttg gcagccatca aagttatgga tgtcactgag 180 gatgaagagg aagaaatcaa actggagata aatatgctaa agaaatactc tcatcacaga 240 aacattgcaa catattatgg tgctttcatc aaaaagagcc ctccaggaca tgatgaccaa 300 ctctggcttg ttatggagtt ctgtggggct gggtccatta cagaccttgt gaagaacacc 360 aaagggaaca cactcaaaga agactggatc gcttacatct ccagagaaat cctgagggga 420 ctggcacatc ttcacattca tcatgtgatt caccgggata tcaagggcca gaatgtgttg 480 ctgactgaga atgcagaggt gaaacttgtt gactttggtg tgagtgctca gctggacagg 540 actgtggggc ggagaaatac gttcataggc actccctact ggatggctcc tgaggtcatc 600 gcctgtgatg agaacccaga tgccacctat gattacagaa gtgatctttg gtcttgtggc 660 attacagcca ttgagatggc agaaggtgct ccccctctct gtgacatgca tccaatgaga 720 gcactgtttc tcattcccag aaaccctcct ccccggctga agtcaaaaaa atggtcgaag 780 aagtttttta gttttataga agggtgcctg gtgaagaatt acatgcagcg gccctctaca 840 gagcagcttt tgaaacatcc ttttataagg gatcagccaa atgaaaggca agttagaatc 900 cagcttaagg atcatataga tcgtaccagg aagaagagag gcgagaaaga tgaaactgag 960 tatgagtaca gtgggagtga ggaagaagag gaggaagtgc ctgaacagga aggagagcca 1020 agttccattg tgaacgtgcc tggtgagtct actcttcgcc gagatttcct gagactgcag 1080 caggagaaca aggaacgttc cgaggctctt cggagacaac agttactaca ggagcaacag 1140 ctccgggagc aggaagaata taaaaggcaa ctgctggcag agagacagaa gcggattgag 1200 cagcagaaag aacagaggcg acggctagaa gagcaacaaa ggagagagcg ggaagctaga 1260 aggcagcagg aacgtgaaca gcgaaggaga gaacaagaag aaaagaggcg tctagaggag 1320 ttggagagaa ggcgcaaaga agaagaggag aggagacggg cagaagaaga aaagaggaga 1380 gttgaaagag aacaggagta tatcaggcga cagctagaag aggagcagcg gcacttggaa 1440 gtccttcagc agcagctgct ccaggagcag gccatgttac tgcatgacca taggaggccg 1500 cacccgcagc actcgcagca gccgccacca ccgcagcagg aaaggagcaa gccaagcttc 1560 catgctcccg agcccaaagc ccactacgag cctgctgacc gagcgcgaga ggttcctgtg 1620 agaacaacat ctcgctcccc tgttctgtcc cgtcgagatt ccccactgca gggcagtggg 1680 cagcagaata gccaggcagg acagagaaac tccaccagta ttgagcccag gcttctgtgg 1740 gagagagtgg agaagctggt gcccagacct ggcagtggca gctcctcagg gtccagcaac 1800 tcaggatccc agcccgggtc tcaccctggg tctcagagtg gctccgggga acgcttcaga 1860 gtgagatcat catccaagtc tgaaggctct ccatctcagc gcctggaaaa tgcagtgaaa 1920 aaacctgaag ataaaaagga agttttcaga cccctcaagc ctgctggcga agtggatctg 1980 accgcactgg ccaaagagct tcgagcagtg gaagatgtac ggccacctca caaagtaacg 2040 gactactcct catccagtga ggagtcgggg acgacggatg aggaggacga cgatgtggag 2100 caggaagggg ctgacgagtc cacctcagga ccagaggaca ccagagcagc gtcatctctg 2160 aatttgagca atggtgaaac ggaatctgtg aaaaccatga ttgtccatga tgatgtagaa 2220 agtgagccgg ccatgacccc atccaaggag ggcactctaa 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acccacactc tatgatccag 3120 tgtagcatca aaccccatgc aatcatcatc ctccccaata cagatggaat ggagcttctg 3180 gtgtgctatg aagatgaggg ggtttatgta aacacatatg gaaggatcac caaggatgta 3240 gttctacagt ggggagagat gcctacatca gtagcatata ttcgatccaa tcagacaatg 3300 ggctggggag agaaggccat agagatccga tctgtggaaa ctggtcactt ggatggtgtg 3360 ttcatgcaca aaagggctca aagactaaaa ttcttgtgtg aacgcaatga caaggtgttc 3420 tttgcctctg ttcggtctgg tggcagcagt caggtttatt tcatgacctt aggcaggact 3480 tctcttctga gctggtag 3498 <210> 2 <211> 2136 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACSL4 gene <400> 2 atgaaactta agctaaatgt gctcaccatt attttgctgc ctgtccactt gttaataaca 60 atatacagtg cccttatatt tattccatgg tattttctta ccaatgccaa gaagaaaaac 120 gctatggcaa agagaataaa agctaagccc acttcagaca aacctggaag tccatatcgc 180 tctgtcacac acttcgactc actagctgta atagacatcc ctggagcaga tactctggat 240 aaattatttg accatgctgt atccaagttt gggaagaagg acagccttgg gaccagggaa 300 atcctaagtg aagaaaatga aatgcagcca aatggaaaag tttttaagaa gttaattctt 360 gggaattata 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taactcccaa gataggcttc 720 ccctggagtg aaatcaggaa catctctttc aatgataaga aatttgtcat caagcccatt 780 gacaaaaaag ccccggactt cgtcttctat gctccccggc tgcggattaa caagcggatc 840 ttggccttgt gcatggggaa ccatgaacta tacatgcgcc gtcgcaagcc tgataccatt 900 gaggtgcagc agatgaaggc acaggcccgg gaggagaagc accagaagca gatggagcgt 960 gctatgctgg aaaatgagaa gaagaagcgt gaaatggcag agaaggagaa agagaagatt 1020 gaacgggaga aggaggagct gatggagagg ctgaagcaga tcgaggaaca gactaagaag 1080 gctcagcaag aactggaaga acagacccgt agggctctgg aacttgagca ggaacggaag 1140 cgtgcccaga gcgaggctga aaagctggcc aaggagcgtc aagaagctga agaggccaag 1200 gaggccttgc tgcaggcctc ccgggaccag aaaaagactc aggaacagct ggccttggaa 1260 atggcagagc tgacagctcg aatctcccag ctggagatgg cccgacagaa gaaggagagt 1320 gaggctgtgg agtggcagca gaaggcccag atggtacagg aagacttgga gaagacccgt 1380 gctgagctga agactgccat gagtacacct catgtggcag agcctgctga gaatgagcag 1440 gatgagcagg atgagaatgg ggcagaggct agtgctgacc tacgggctga tgctatggcc 1500 aaggaccgca gtgaggagga acgtaccact gaggcagaga agaatgagcg 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Leu Asn 100 105 110 Asp Asp Ile Tyr Cys Pro Pro Glu Thr Ala Val Leu Leu Ala Ser Tyr 115 120 125 Ala Val Gln Ser Lys Tyr Gly Asp Phe Asn Lys Glu Val His Lys Ser 130 135 140 Gly Tyr Leu Ala Gly Asp Lys Leu Leu Pro Gln Arg Val Leu Glu Gln 145 150 155 160 His Lys Leu Asn Lys Asp Gln Trp Glu Glu Arg Ile Gln Val Trp His 165 170 175 Glu Glu His Arg Gly Met Leu Arg Glu Asp Ala Val Leu Glu Tyr Leu 180 185 190 Lys Ile Ala Gln Asp Leu Glu Met Tyr Gly Val Asn Tyr Phe Ser Ile 195 200 205 Lys Asn Lys Lys Gly Ser Glu Leu Trp Leu Gly Val Asp Ala Leu Gly 210 215 220 Leu Asn Ile Tyr Glu Gln Asn Asp Arg Leu Thr Pro Lys Ile Gly Phe 225 230 235 240 Pro Trp Ser Glu Ile Arg Asn Ile Ser Phe Asn Asp Lys Lys Phe Val 245 250 255 Ile Lys Pro Ile Asp Lys Lys Ala Pro Asp Phe Val Phe Tyr Ala Pro 260 265 270 Arg Leu Arg Ile Asn Lys Arg Ile Leu Ala Leu Cys Met Gly Asn His 275 280 285 Glu Leu Tyr Met Arg Arg Arg Lys Pro Asp Thr Ile Glu Val Gln Gln 290 295 300 Met Lys Ala Gln Ala Arg Glu Glu Lys His Gln Lys Gln Met Glu 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Sequence <220> <223> 18s rRNA FW Primer <400> 13 gtaacccgtt gaaccccatt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18s rRNA BW Primer <400> 14 ccatccaatc ggtagtagcg 20

Claims (7)

1. MAP4K4, ACSL4 및 모에신 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는,
   방사선 내성 암 치료용 약학적 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 제제는 연자육 또는 연자방 추출물인,
   방사선 내성 암 치료용 약학적 조성물.
3. 제 2 항에 있어서,
   상기 추출물은 알코올 추출한 것인,
   방사선 내성 암 치료용 약학적 조성물.
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 암은 유방암인,
   방사선 내성 암 치료용 약학적 조성물.
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 방사선 내성 암은 MAP4K4, ACSL4, 및 모에신 유전자의 발현이 SK-BR-3 또는 MCF-7 암세포의 발현량보다 증가한 것인,
   방사선 내성 암 치료용 약학적 조성물.
6. MAP4K4, ACSL4 및 모에신 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 포함하는,
   방사선 내성 암 개선용 건강기능식품.
7. 제 6 항에 있어서,
   상기 제제는 연자육 또는 연자방 추출물인,
   방사선 내성 암 개선용 건강기능식품.
   
   

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