WO2024063523A1 - 방광암의 항암제 내성 진단용 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

방광암의 항암제 내성 진단용 바이오마커 및 이의 용도 Download PDF

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WO2024063523A1
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임선희
문정연
정미소
양기은
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동아대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to biomarkers for diagnosing anticancer drug resistance in bladder cancer and their uses.
  • Bladder cancer is one of the most prevalent genitourinary tumors worldwide, with approximately 573,000 new cases reported. Approximately 80% of bladder cancer patients are diagnosed with superficial bladder cancer, which has a high 5-year survival rate, and the remaining 20% are diagnosed with invasive bladder cancer. Although surgical procedures have been used for bladder cancer, patients with superficial bladder cancer often experience recurrence, and approximately 20% of these patients progress to invasive bladder cancer. Chemotherapy is one of the promising treatments that improves the survival rate of patients with bladder cancer. Gemcitabine is a deoxycytidine analog that requires active cell membrane transport and exhibits anticancer effects against various types of solid cancer, such as bladder cancer.
  • the difluorinated prodrug undergoes mono-, di-, and tri-phosphorylation before binding to DNA, resulting in masked chain termination.
  • the response rate in patients with invasive bladder cancer to gemcitabine treatment has been shown to be limited to efficacy of less than 40%, with only a small number of patients receiving potential benefit.
  • the purpose of the present invention is to provide a composition for diagnosing anticancer drug resistance and a method for providing information for diagnosing anticancer drug resistance, including an agent that can predict anticancer drug resistance and prognosis of bladder cancer patients.
  • the object of the present invention is GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 and
  • the aim is to provide a biomarker for diagnosis, metastasis or prognosis prediction of cancer containing a gene selected from the group consisting of NT5E.
  • Another object of the present invention is GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 and
  • a biomarker composition for diagnosing, metastasizing, or predicting prognosis of cancer including an agent that measures the expression level of a gene selected from the group consisting of NT5E.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing, metastasizing, or predicting prognosis of cancer containing the above composition.
  • Another object of the present invention is to isolate a biological sample from an individual
  • GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1 were detected from the isolated biological sample. , measuring the expression level of genes selected from the group consisting of TGFB3, NOG, SMAD9, and NT5E; and
  • It provides a method of providing information for diagnosing, metastasizing, or predicting prognosis of cancer, including comparing the expression level of the gene with a reference value of a control group.
  • Another object of the present invention is to isolate a biological sample from an individual
  • Comparing the expression level of the gene with a reference value of a control group providing a screening method for an anticancer agent comprising a.
  • Another object of the present invention is GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 and NT5E, to provide a biomarker for diagnosis, metastasis, or prognosis prediction of cancer with anticancer drug resistance, including a gene selected from the group consisting of NT5E.
  • Another object of the present invention is GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 and NT5E, to provide a biomarker composition for diagnosing, metastasizing, or predicting prognosis of cancer with anticancer drug resistance, including an agent for measuring the expression level of a gene selected from the group consisting of NT5E.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing, metastasizing, or predicting prognosis of cancer with anticancer drug resistance, comprising the above composition.
  • Another object of the present invention is to isolate a biological sample from an individual
  • GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1 were detected from the isolated biological sample. , measuring the expression level of genes selected from the group consisting of TGFB3, NOG, SMAD9, and NT5E; and
  • It provides a method of providing information for diagnosis, metastasis, or prognosis prediction of cancer with anticancer drug resistance, including the step of comparing the expression level of the gene with the reference value of the control group.
  • Another object of the present invention is to isolate a biological sample from an individual
  • To provide a method of screening for a treatment for cancer having anticancer drug resistance comprising comparing the expression level of the gene with a reference value of a control group.
  • the present invention GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3 , NOG, SMAD9, and NT5E provide biomarkers for diagnosis, metastasis, or prognosis of cancer, including genes selected from the group consisting of.
  • the present invention provides GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 and NT5E
  • a biomarker composition for diagnosing, metastasizing, or predicting prognosis of cancer, including an agent for measuring the expression level of a gene selected from the group consisting of.
  • the present invention provides a kit for diagnosing, metastasizing, or predicting prognosis of cancer, comprising the above composition.
  • the present invention includes the steps of isolating a biological sample from an individual;
  • GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1 were detected from the isolated biological sample. , measuring the expression level of genes selected from the group consisting of TGFB3, NOG, SMAD9, and NT5E; and
  • It provides a method of providing information for diagnosing, metastasizing, or predicting prognosis of cancer, including comparing the expression level of the gene with a reference value of a control group.
  • the present invention includes the steps of isolating a biological sample from an individual;
  • Comparing the expression level of the gene with a reference value of a control group providing a screening method for an anticancer agent comprising a.
  • the present invention provides GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 and NT5E
  • a biomarker for diagnosis, metastasis, or prognosis prediction of cancer with anticancer drug resistance including a gene selected from the group consisting of.
  • the present invention provides GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 and NT5E
  • a biomarker composition for diagnosing, metastasizing, or predicting prognosis of cancer with anticancer drug resistance, including an agent for measuring the expression level of a gene selected from the group consisting of.
  • the present invention provides a kit for diagnosing, metastasizing, or predicting prognosis of cancer with anticancer drug resistance, comprising the composition above.
  • the present invention includes the steps of isolating a biological sample from an individual;
  • GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1 were detected from the isolated biological sample. , measuring the expression level of genes selected from the group consisting of TGFB3, NOG, SMAD9, and NT5E; and
  • It provides a method of providing information for diagnosis, metastasis, or prognosis prediction of cancer with anticancer drug resistance, including the step of comparing the expression level of the gene with the reference value of the control group.
  • the present invention includes the steps of isolating a biological sample from an individual;
  • Comparing the expression level of the gene with a reference value of a control group providing a method for screening a therapeutic agent for cancer having anticancer drug resistance, including a step.
  • the present invention covers 23 genes: GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9. and NT5E were confirmed to be differentially expressed, and the expression of the above 23 genes was confirmed to be related to the prognosis and survival rate of bladder cancer patients, so the above genes could be used as biomarkers for diagnosing, metastasizing, or predicting prognosis of anticancer drug-resistant bladder cancer. It was confirmed that it exists.
  • bladder cancer cell line acquired resistance As the bladder cancer cell line acquired anticancer drug resistance, it was confirmed that the above 23 genes were differentially expressed.
  • anticancer drug-resistant bladder cancer cell lines were administered to mice, it was confirmed that tumor proliferation and metastatic ability increased, and the expression of the above gene was also confirmed to be increased in mouse tumors, making it effective in diagnosing, metastasizing, or predicting prognosis of cancer and anticancer drugs. It is also effective in diagnosing resistant cancer, so it can be usefully used in related industries.
  • Figure 1 is a diagram illustrating the establishment of a molecularly evolved cell line from T24 bladder cancer cells and verification of anticancer drug resistance.
  • b A diagram showing four groups (#1 to 4) of molecular evolution cell lines from T24-P0 cells. GRC1-P3, GRC1-P7, and GRC1-P15 cells were tested for molecular evolution using gemcitabine. Cells treated 7 and 15 times are shown.
  • This diagram shows the morphology of cell colonies in the establishment stage.
  • h This is a diagram showing the cell invasion and migration abilities calculated by counting the number of cells per field ( ⁇ 400) by confirming the transwell invasion and migration assay abilities detected in GRC cells and T24-P0 cells.
  • Figure 2 shows that the metastatic ability of GRC cells in organ-on-chip is promoted as anticancer drug resistance increases.
  • EMT-related genes (MMP-1, MMP-2, MMP-9, VIM, SNAIL, SLUG, ZEB1, ZEB2, TWIST, NCAD, SDC1, SDC2, and ECAD) in T24-P0 and GRC1-P15 cells.
  • EMT-related genes MMP-1, MMP-2, MMP-9, VIM, SNAIL, SLUG, ZEB1, ZEB2, TWIST, NCAD, SDC1, SDC2, and ECAD
  • T24-P0 and GRC1-P15 cells The mRNA levels and protein levels of MMP-1, MMP-2, MMP-9, NCAD, VIM, SNAIL, ECAD, and GAPDH are shown.
  • Figure 3 shows the results of discovering and confirming gene expression of drug resistance by RNA-sequencing profiling.
  • RNA-sequencing profiling process DEGs; Differentially Expressed Genes, TCGA; The Cancer Genome Atlas.
  • Figure 4 is a result showing DEG-related pathways according to GO analysis results showing changes in the path of molecular evolution of GRC cells.
  • a A heat map showing the expression levels of representative pathways and related genes in the RNA-sequencing data change path.
  • the left panel shows a heatmap of 23 gene features associated with gemcitabine resistance in GRC1 cell line
  • the middle panel shows the sensitivity and specificity of 23 gene features for predicting response to gemcitabine treatment in TCGA. This is the ROC curve.
  • d This is a diagram showing the heatmap and clinical information of the TCGA cohort classified according to chemical resistance score.
  • Left panel shows objective response rate to gemcitabine treatment stratified into two groups
  • middle panel shows stratification by chemical resistance score via Kaplan-Meier curves for two groups in the TCGA cohort
  • right panel shows the objective response rate to gemcitabine treatment stratified by chemical resistance score.
  • This diagram shows the distribution of stratified TCGA subtypes.
  • f Indicates the chemical resistance score according to TCGA subtype.
  • Figure 5 is a diagram analyzing a cohort for cisplatin and doxorubicin resistance in the GRC1 cell line.
  • the left panel shows the drug sensitivity curve by MTT analysis after treating the GRC1 cell line with cisplatin and doxorubicin at different concentrations for 72 hours, and the right panel shows the heatmap, drug response, and overall results of the TCGA cohort classified according to chemical resistance score. It is a way that represents survival.
  • b ROC curve showing the sensitivity and specificity of the chemical resistance score for predicting complete response to cisplatin, carboplatin, and doxorubicin.
  • c A diagram stratifying the objective response rates for cisplatin, carboplatin, and doxorubicin into two groups.
  • d Kaplan-Meier curve showing stratification by chemical resistance score in the TCGA cohort.
  • Figure 6 is a diagram showing gene expression patterns and survival analysis for NMIBC patients in the UROMOL cohort based on chemical resistance score.
  • a This is a diagram showing the ROC curve of the sensitivity and specificity of 23 gene features for predicting the progression of NMIBC patients in the UROMOL cohort.
  • Figure 7 is a diagram showing that GRC cells promote tumor growth and metastasis in vivo .
  • the left panel shows the experimental schedule and shows the experiments conducted during the experimental period
  • the right panel shows the body weight of the mouse group injected with GRC1-P3, GRC1-P7, and GRC1-P15 cells and the tumor tissue removed by surgery. This is a size image.
  • the left panel is H&E histology images of lung tissue sections obtained from T24-P0, GRC1-P3, GRC1-P7, and GRC1-P15
  • the right panel is H&E histology images from T24-P0, GRC1-P3, GRC1-P7, and GRC1.
  • This is a diagram quantifying the number of metastatic lung nodules formed after tail vein injection of P15 cells.
  • the present invention consists of GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 and NT5E Provides a biomarker for diagnosis, metastasis, or prognosis prediction of cancer containing a gene selected from the group.
  • the term "diagnosis” used refers to determining the susceptibility of an object to a specific disease or disorder, determining whether an object currently has a specific disease or condition, a specific disease or Determining the prognosis of a diseased subject (e.g., identifying a pre-metastatic or metastatic cancer state, determining the stage of the cancer, or determining the responsiveness of the cancer to treatment), or therametrics (e.g., and monitoring the condition of the subject to provide information about treatment efficacy.
  • the biomarker may regulate anticancer drug resistance of cancer.
  • the anticancer agent may be an anticancer agent used for anticancer treatment, for example, gemcitabine, cisplatin, carboplatin, doxorubicin, It may be mitomycin C, etc., but is not limited thereto.
  • the anticancer agent may be used to treat bladder cancer, but is not limited thereto.
  • the cancer is bladder cancer, breast cancer, glioblastoma, prostate cancer, cerebrospinal tumor, head and neck cancer, lung cancer, thymoma, mesothelioma, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, liver cancer, pancreatic cancer, biliary tract cancer, and kidney cancer.
  • testicular cancer, germ cell tumor, ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, lymphoma, acute leukemia, chronic leukemia, multiple myeloma, sarcoma, malignant melanoma, and skin cancer and preferably bladder cancer.
  • bladder cancer not limited.
  • the anticancer drug resistance of the cancer may increase if the expression of the biomarker increases compared to the baseline value of the control group.
  • the expression of the biomarker increases compared to the baseline value of the control group, the growth, invasion, or migration of cancer cells may increase.
  • the clinical prognosis of cancer may be poor, and the poor prognosis may be due to the cancer response rate.
  • the anticancer drug resistance of cancer cells may be increasing.
  • the present invention provides GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 and NT5E
  • a biomarker composition for diagnosing, metastasizing, or predicting prognosis of cancer, including an agent for measuring the expression level of a gene selected from the group consisting of.
  • the agent used in the method for confirming the expression level of the miRNA or fragment thereof refers to the agent used in the method for confirming the expression of the corresponding miRNA or fragment thereof contained in the sample, for example, RT-PCR, competitive Targets used in methods such as competitive RT-PCR (RTPCR), real-time RT-PCR, RNase protection assay (RPA), Northern blotting, and gene chip analysis. It may be a primer, probe, or antibody that can specifically bind to a gene, but is not particularly limited thereto.
  • primer used in the present invention refers to a nucleic acid sequence having a short free 3' hydroxyl group that can form a base pair with a complementary template and serves as a starting point for copying the template strand. It refers to a short nucleic acid sequence that functions as a point. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization (i.e., DNA polymerase or reverse transcriptase) in an appropriate buffer and temperature.
  • probe refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA that is as short as a few bases or as long as several hundreds of bases and can form a specific binding to a gene or mRNA, and is called an oligonucleotide. It can be manufactured in the form of a probe, single stranded DNA probe, double stranded DNA probe, RNA probe, etc., and can be labeled for easier detection.
  • Agents that can measure the expression level of the protein include antibodies, aptamers, oligopeptides, or PNA (peptide nucleic acids) that specifically bind to the gene, or have a complementary sequence specific to the gene encoding the protein. It may include primers or probes, but is not limited thereto.
  • an agent for measuring the expression term of the gene includes a primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; Primer pair of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4; Primer pair of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6; Primer pair of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8; Primer pair of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10; Primer pair of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12; Primer pair of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14; Primer pair of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16; Primer pair of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18; Primer pair of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20; Primer pair of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22; Primer pair of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24; Primer pair of SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26;
  • the present invention provides a kit for diagnosing, metastasizing, or predicting prognosis of cancer, comprising the above composition.
  • the present invention includes the steps of isolating a biological sample from an individual;
  • GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1 were detected from the isolated biological sample. , measuring the expression level of genes selected from the group consisting of TGFB3, NOG, SMAD9, and NT5E; and
  • It provides a method of providing information for diagnosing, metastasizing, or predicting prognosis of cancer, including comparing the expression level of the gene with a reference value of a control group.
  • the normal control group may be, but is not limited to, a normal patient control group.
  • the expression level of the gene may be measured by measuring the expression level of the gene's miRNA or protein encoded by the gene, using reverse transcriptase polymerase reaction (RT-PCR), competitive reverse transcriptase polymerase reaction (competitive RT-PCR), real-time It may be measured by real time quantitative RTPCR, RNase protection method, Northern blotting, or gene chip, but is not limited thereto.
  • RT-PCR reverse transcriptase polymerase reaction
  • competitive RT-PCR competitive reverse transcriptase polymerase reaction
  • real-time It may be measured by real time quantitative RTPCR, RNase protection method, Northern blotting, or gene chip, but is not limited thereto.
  • the expression of the gene increases compared to the baseline value of the control group, it may be determined that the response rate of the cancer decreases, and it may be determined that the anticancer drug resistance of the cancer increases. It may be determined that the growth, invasion, or migration of cancer cells increases.
  • the sample may include samples such as tissue, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, or urine, and may be, for example, blood or tissue, but is not limited thereto.
  • the present invention includes the steps of isolating a biological sample from an individual;
  • Comparing the expression level of the gene with a reference value of a control group providing a screening method for an anticancer agent comprising a.
  • the expression of the gene is low compared to the reference value of the control group, it may be determined that there is an anticancer effect.
  • the anticancer effect may be an increase in the response rate of cancer, a decrease in the growth, invasion, or migration of cancer cells, and anticancer drug resistance of cancer cells. This may be decreasing.
  • the present invention provides GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 and NT5E
  • a biomarker for diagnosis, metastasis, or prognosis prediction of cancer with anticancer drug resistance including a gene selected from the group consisting of.
  • the present invention provides GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 and NT5E
  • a biomarker composition for diagnosing, metastasizing, or predicting prognosis of cancer with anticancer drug resistance, including an agent for measuring the expression level of a gene selected from the group consisting of.
  • the present invention provides a kit for diagnosing, metastasizing, or predicting prognosis of cancer with anticancer drug resistance, comprising the composition above.
  • the present invention includes the steps of isolating a biological sample from an individual;
  • GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1 were detected from the isolated biological sample. , measuring the expression level of genes selected from the group consisting of TGFB3, NOG, SMAD9, and NT5E; and
  • It provides a method of providing information for diagnosis, metastasis, or prognosis prediction of cancer with anticancer drug resistance, including the step of comparing the expression level of the gene with the reference value of the control group.
  • the present invention includes the steps of isolating a biological sample from an individual;
  • Comparing the expression level of the gene with a reference value of a control group providing a method for screening a treatment for cancer having anticancer drug resistance, including a step.
  • T24, 5637, UC3, UC5, and UC14 were purchased from American Type Culture Collection (ATCC), and RT4 cell line was purchased from Korean Cell Line Bank (KCLB).
  • T24, UC3, UC5, UC14, and RT4 cell lines were cultured in DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium), and the 5637 cell line was cultured in 10% FBS (Capricorn Scientific GmbH, Ebsdorferground, Germany) and 1% penicillin/streptomycin (Capricorn Scientific GmbH, Ebsdorfergrund, Germany). Germany) was cultured in RPMI 1640 supplemented. All cell lines were cultured at 37°C and 5% CO 2 conditions.
  • RNA was extracted using the RNeasy Mini Kit (#74316, Qiagen, CA, USA). Specifically, for RNA quantification and comparison of RNA quantification, the extracted RNA was electrophoresed in a 6% formaldehyde gel and then confirmed by ethidium bromide (EtBr) staining. Library construction for whole transcriptome sequencing was performed using a kit, and the isolated total RNA was used for reverse transcription using a poly (dT) primer using PrimeScript TM (TakaraBio, Otsu, Japan).
  • dT poly (dT) primer using PrimeScript TM (TakaraBio, Otsu, Japan).
  • cells were inoculated into a 6-well plate at a concentration of 1 x 10 3 cells and cultured for 7 days until colonies were formed in each well. Afterwards, the colonies were fixed with 4% formaldehyde for 10 minutes and stained with 0.1% crystal violet solution for 1 hour. The number of stained colonies was counted using Image J software (NIH; National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).
  • transwell assay was used to confirm cell invasion and migration in a Boyden chamber. Specifically, cells were inoculated at a cell concentration of 4 ⁇ 10 4 into a matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) coated chamber and cultured for 24 hours. Then, to analyze cell invasion and migration in conditioned medium (CM), cells were inoculated in CM and fresh medium at a 1:1 ratio for 24 hours, and invasion or migration ability was confirmed.
  • CM conditioned medium
  • microfluidic device microfluidic device
  • a microfluidic device for 3D cell culture was designed using AutoCAD software (Autodesk, USA).
  • a Si master mold was manufactured using a photolithography technique. Specifically, Poly-dimethylsiloxane (PDMS) (Sylgard 184, Dow Corning, USA) pre-polymer mixed with a curing agent was poured onto the Si master to a thickness of approximately 5-6 mm and cured at 80°C for 2 hours. Afterwards, the cured PDMS layer was separated and cut into individual devices, and inlet and outlet holes were drilled at the beginning of the microchannel.
  • PDMS Poly-dimethylsiloxane
  • the PDMS layer was sterilized by autoclave, and the channel of the PDMS layer was sealed by plasma-activated bonding on a sterilized cover glass (24 mm ⁇ 24 mm). After bonding, the hydrophilic channel surface was coated with 1 mg/ml poly-D-lysinehydrobromide (PDL) (Sigma-Aldrich, MO, USA) for 4 hours to improve collagen adhesion to the channel surface and washed three times with distilled water. . The fabricated microfluidic device was completely dried in an oven at 80°C.
  • PDL poly-D-lysinehydrobromide
  • type I collagen (Corning, USA) solution (2 mg/ml) was prepared as previously described [Chung S. et al., Adv. Mater. 21(47):4863-4867; Jeong K. et al., Lab Chip 2020;(20):548-557]. Afterwards, the central channel of the microfluidic device was filled with collagen solution, and the device was reacted in an incubator at 37°C for 30 minutes. To increase cell attachment to the gelled device surface, a diluted collagen solution (35 ⁇ g/ml in PBS) was introduced into the media channel. After reacting for 30 minutes in a 5% CO 2 incubator, the channel was washed with fresh medium.
  • a suspension (1 ⁇ 10 6 cells/ml) of bladder cancer cells in each condition (T24-P0, GRC1-P3, GRC1-P7, and GRC1-P15) was introduced into the medium channel and cultured for cell attachment. After 4 hours of culture, a suspension of HUVECs (1 ⁇ 10 6 cells/ml) was also introduced into the other side of the medium channel. Medium for bladder cancer and HUVECs was supplied to each channel, and co-cultured in the microfluidic device with medium replaced every day.
  • bladder cancer cells invading the gel toward HUVEC cells were confirmed in the microfluidic device during 5 days of co-culture.
  • Cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 20 minutes at room temperature and reacted with 0.1% Triton X-100 for 20 minutes.
  • actin filaments and nuclei were stained with phalloidin-594 (1:400, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and Hoechst 33342 (1:2000, Thermo Fisher Scientific, USA), respectively.
  • images of the visualized bladder cancer invasion were obtained using Image
  • the maximum invasion distance, invasion area, and number of invaded cancer cells were quantitatively analyzed using J software.
  • the ratio of fluorescent pixels was calculated in the ROI image, and the total number of cells invading the gel was counted in three different devices in each ROI.
  • the maximum migration distance of cells is also Image This was confirmed using ROI images using J software.
  • Cytotoxicity was performed using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT).
  • T24-P0, GRC1-P3, GRC1-P7, and GRC1-P15 cells 1,000 cells/well were seeded in 96-well plates and cultured until approximately 60 to 70% confluency before starting experimental treatment. Afterwards, the dose-response curve of gemcitabine was drawn and IC 50 was calculated using non-linear (curve fit) regression algorithms and GraphPad Prism9 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
  • NTC1 nitrocellulose
  • MMP-1 sc-137044, 1:2000, Santa Cruz Biotech., Dallas, TX
  • MMP-2 #4022, 1:2000, Cell signaling, Danvers, MA, USA
  • MMP-9 #3852, 1:4000, Cell signaling, Danvers, MA, USA
  • NCAD #4061 , 1:2000, Cell signaling, Danvers, MA, USA
  • ECAD #3195, 1:2000, Cell signaling, Danvers, MA, USA
  • VIM #sc-6260, 1:2000, Santa Cruz Biotech, Dallas , TX, USA
  • SNAIL #sc-271977, 1:5000, Santa Cruz Biotech, Dallas, TX, USA
  • HRP horseradish peroxidase
  • IgG anti-mouse immunoglobulin G
  • TMA tissue microarray
  • H&E hematoxylin and eosin
  • tumor tissue was identified.
  • IHC immunohistochemistry
  • the primary STC1 and Ki67 antibodies (#sc-23900, Santa Cruz Biotech., Dallas, TX, USA) used were rabbit monoclonal IgG (#ab229477, Abcam, Cambridge, MA, USA), and rabbit IgG was used as a negative isotype. It was used as a type control. TMA slides were incubated with primary antibodies overnight at 4°C and treated with biotinylated secondary antibodies. Afterwards, Vectastain Elite ABC Reagent (#PK-6100, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) was added at room temperature for 30 minutes, and 3, 3'-diaminobenzidine (DAB, #D4293, Sigma-Aldrich, St.
  • DAB 3'-diaminobenzidine
  • bladder cancer bladder cancer
  • anticancer drug-resistant bladder cancer cell lines were characterized. Specifically, an in vitro model was used to confirm the molecular differences that change as cells gradually acquire resistance to the anticancer drug gemcitabine.
  • Bladder cancer cell line T24 (T24-P0, P0) was classified into four groups, each treated with gemcitabine, and passaged 15 times under the same conditions to obtain gemcitabine-resistant bladder cancer cell lines (GRC) across 15 phases.
  • Figure 1a Gemcitabine-resistant bladder cancer cell lines obtained from each group were classified as GRC1-P15, GRC2-P15, GRC3-P15, and GRC4-P15 ( Figure 1b).
  • the gene expression profile data of the GRC1 cell line was analyzed for changes at four time points using RNA sequencing. 1,869 differentially expressed genes were selected by counts per million and standard deviation (CPM > 1 and S.D > 1) ( Figure 3a), and their distribution in the two-dimensional space projected by principal component analysis (PCA) in the GRC1 cell line was A clear separation between time points was confirmed. In particular, there was a 73.1% difference in distribution between P0 and P15, and a significant difference was confirmed between early P3 and intermediate P7 ( Figure 3b). Based on functional analysis, genes with important biological characteristics representative of the GRC1 cell line were selected ( Figures 3c and 4a).
  • the GRC1 cell line had up-regulated genes related to endoplasmic reticulum (ER) stress, such as lysosomal (LAMP1, LAMP2, NEU1) and unfolded protein response (HSPA5, HSP90B1, DDIT3) ( Figure 4a), and at late P15.
  • ER endoplasmic reticulum
  • RAS signaling pathway ABL1, ABL2, RAC3, GNGT1, PLA2G6, and ATF2
  • MAPK signaling pathway CACNA2D1, CACNA2D2, FOS, JUN, JUND, GNG4, NGF, RRAS, MYC, MAP4K4, and STC1
  • EMT-related genes VIM, ZEB1, ZEB2, SNAI1, MMP1, MMP2, MMP3, FOXD1, and FOXC2
  • TGF- ⁇ pathway TGFB1, TGFB3, NOG, and SMAD9
  • TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9, NT5E related to the acquisition of Tabine resistance were selected and named a gene signature set, and it was confirmed that there were differences in the expression levels of the genes compared to other phases.
  • mice increased from day 21 (Figure 7b), and as shown in Figure 7a, compared to T24-P0 cells, GRC1-P3, GRC1-P7, and GRC1-P15 cells gradually decreased the tumor size of mice. It was confirmed that it increased.
  • GRC1 cells induced more proliferation and tumor growth than T24 GRC cells ( Figure 7b). From the above results, it was confirmed that GRC cells promote bladder cancer tumor growth.
  • T24-P0, GRC1-P3, GRC1-P7, and GRC1-P15 cells were injected into the tail vein of 5-6 week old BALB/C nude mice ( Figure 7a), body weight was checked weekly. It was confirmed that intravenously injected GRC cells formed more lung nodules in stages than T24-P0 cells ( Figure 7c), and the size of lung nodules confirmed as a result of H&E staining of lung tissue was smaller than that of GRC cells compared to T24-P0 cells. A significant increase was confirmed in the group ( Figure 7c).
  • the present invention covers 23 genes: GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG , differential expression of SMAD9 and NT5E were confirmed, and the expression of the above 23 genes was confirmed to be related to the prognosis and survival rate of bladder cancer patients, and the above genes were used as biomarkers for diagnosing anticancer drug-resistant bladder cancer, metastasis, or predicting prognosis. It was confirmed that it can be used.
  • bladder cancer cell line acquired resistance tumor invasion and migration ability increased, and anticancer drug resistance increased.
  • bladder cancer cell line acquired anticancer drug resistance the above 23 genes were confirmed to be differentially expressed.
  • anticancer drug-resistant bladder cancer cell lines were administered to mice, it was confirmed that tumor proliferation and metastatic ability increased, and the expression of the above gene was also confirmed to be increased in mouse tumors, making it effective in diagnosing, metastasizing, or predicting prognosis of cancer and anticancer drugs. It was confirmed that it was effective in diagnosing resistant cancer.

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Abstract

본 발명은 23개의 유전자인 GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E의 차별 발현을 확인하였으며, 상기 23개의 유전자의 발현이 방광암 환자의 예후 및 생존율과 관련성이 있는 것을 확인하여, 상기의 유전자를 이용한 항암제 내성 방광암 진단, 전이 또는 예후 예측용 바이오마커로 이용할 수 있음을 확인하였다. 또한, 방광암 세포주가 내성을 획득하면서 종양 침윤 및 이동 능이 증가하고, 항암제 저항성이 증가하는 것을 확인하였으며, 방광암 세포주가 항암제 내성을 획득함에 따라, 상기 23개의 유전자가 차별 발현되는 것을 확인하였다. 또한, 항암제 내성 방광암 세포주를 마우스에 투여하면, 종양 증식 및 전이능이 증가하는 것을 확인하였으며, 마우스 종양에서도 상기 유전자의 발현이 증가되는 것을 확인하였는 바, 암의 진단, 전이 또는 예후 예측에 효과적이고 항암제 내성암을 진단하는 효과도 우수한 바, 관련 산업에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

방광암의 항암제 내성 진단용 바이오마커 및 이의 용도
본 발명은 방광암의 항암제 내성 진단용 바이오마커와 그 용도에 관한 것이다.
방광암은 전 세계적으로 가장 널리 퍼진 비뇨생식기 종양 중 하나로 약 573,000건의 새로운 사례가 보고되었다. 방광암 환자의 약 80%는 5년 생존율이 높은 표재성 방광암 진단을 받고 나머지 20%는 침윤성 방광암으로 진단받는다. 방광암에서는 외과적 수술이 활용되었지만 표재성 방광암 환자는 흔히 재발을 경험하며 이 중 약 20%가 침윤성 방광암으로 진행하게 된다. 화학 요법은 방광암 환자의 생존율을 향상시키는 유망한 치료법 중 하나이다. 젬시타빈은 활성 세포막 수송을 필요로 하는 데옥시시티딘 유사체로서 방광암과 같은 다양한 유형의 고형암에 대한 항암 효과를 나타낸다. 일단 세포 내부에 들어가면, 이불소화된 전구약물은 DNA에 결합되기 전에 모노, 디, 트리 인산화를 거쳐 차폐된 사슬 종결을 일으킨다. 그러나 젬시타빈 치료에 대한 침윤성 방광암 환자의 반응률은 40% 미만의 효능으로 제한되는 것으로 나타났으며 소수의 환자만이 잠재적인 이점을 가지고 있다.
많은 보고서에서 다양한 암에서 젬시타빈 내성과 관련된 마커를 발견하였다. 암의 이질성을 고려할 때, 약물 유출 경로 및 DNA 손상 반응과 관련된 유전자의 높은 발현은 단백질의 이차 돌연변이 또는 후성 유전적 변화로 인해 보고되고 있다. 상피-중간엽 전이 과정은 약물을 피하기 위한 전략으로도 해석될 수 있다. 그럼에도 불구하고 방광암에서 젬시타빈 내성 관련 마커를 찾는 것은 여전히 필요하다.
따라서 본 발명의 목적은 방광암 환자의 항암제 내성 및 예후를 예측할 수 제제를 포함하는 항암제 내성 진단용 조성물 및 항암제 내성 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은, GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자를 포함하는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측을 위한 바이오마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 조성물을 포함하는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 개체로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계;
상기 분리된 생물학적 시료에서 상기의 키트를 이용하여, GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자의 발현수준을 측정하는 단계; 및
상기 유전자의 발현 수준을 대조군의 기준치와 비교하는 단계;를 포함하는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 개체로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계;
상기 분리된 생물학적 시료에 후보물질을 처리하는 단계;
상기 후보물질이 처리된 생물학적 시료에서 GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자의 발현수준을 측정하는 단계; 및
상기 유전자의 발현 수준을 대조군의 기준치와 비교하는 단계;를 포함하는 항암제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자를 포함하는 항암제 약물내성을 가지는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측을 위한 바이오마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 항암제 약물 내성을 가지는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 조성물을 포함하는 항암제 약물 내성을 가지는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 개체로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계;
상기 분리된 생물학적 시료에서 상기의 키트를 이용하여, GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자의 발현수준을 측정하는 단계; 및
상기 유전자의 발현 수준을 대조군의 기준치와 비교하는 단계;를 포함하는 항암제 약물 내성을 가지는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 개체로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계;
상기 분리된 생물학적 시료에 후보물질을 처리하는 단계;
상기 후보물질이 처리된 생물학적 시료에서 GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자의 발현수준을 측정하는 단계; 및
상기 유전자의 발현 수준을 대조군의 기준치와 비교하는 단계;를 포함하는 항암제 약물 내성을 가지는 암의 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자를 포함하는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측을 위한 바이오마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 조성물을 포함하는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 개체로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계;
상기 분리된 생물학적 시료에서 상기의 키트를 이용하여, GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자의 발현수준을 측정하는 단계; 및
상기 유전자의 발현 수준을 대조군의 기준치와 비교하는 단계;를 포함하는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 개체로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계;
상기 분리된 생물학적 시료에 후보물질을 처리하는 단계;
상기 후보물질이 처리된 생물학적 시료에서 GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자의 발현수준을 측정하는 단계; 및
상기 유전자의 발현 수준을 대조군의 기준치와 비교하는 단계;를 포함하는 항암제의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자를 포함하는 항암제 약물내성을 가지는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측을 위한 바이오마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 항암제 약물 내성을 가지는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 조성물을 포함하는 항암제 약물 내성을 가지는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 개체로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계;
상기 분리된 생물학적 시료에서 상기의 키트를 이용하여, GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자의 발현수준을 측정하는 단계; 및
상기 유전자의 발현 수준을 대조군의 기준치와 비교하는 단계;를 포함하는 항암제 약물 내성을 가지는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 개체로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계;
상기 분리된 생물학적 시료에 후보물질을 처리하는 단계;
상기 후보물질이 처리된 생물학적 시료에서 GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자의 발현수준을 측정하는 단계; 및
상기 유전자의 발현 수준을 대조군의 기준치와 비교하는 단계;를 포함하는 항암제 약물 내성을 가지는 암의 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 23개의 유전자인 GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E의 차별 발현을 확인하였으며, 상기 23개의 유전자의 발현이 방광암 환자의 예후 및 생존율과 관련성이 있는 것을 확인하여, 상기의 유전자를 이용한 항암제 내성 방광암 진단, 전이 또는 예후 예측용 바이오마커로 이용할 수 있음을 확인하였다. 또한, 방광암 세포주가 내성을 획득하면서 종양 침윤 및 이동 능이 증가하고, 항암제 저항성이 증가하는 것을 확인하였으며, 방광암 세포주가 항암제 내성을 획득함에 따라, 상기 23개의 유전자가 차별 발현되는 것을 확인하였다. 또한, 항암제 내성 방광암 세포주를 마우스에 투여하면, 종양 증식 및 전이능이 증가하는 것을 확인하였으며, 마우스 종양에서도 상기 유전자의 발현이 증가되는 것을 확인하였는 바, 암의 진단, 전이 또는 예후 예측에 효과적이고 항암제 내성암을 진단하는 효과도 우수한 바, 관련 산업에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 T24 방광암 세포로부터의 분자 진화 세포주의 수립 및 항암제 내성을 검증한 도이다.
a: 분자 진화 세포주의 수립 공정을 나타낸 도이다.
b: T24-P0 세포로부터의 분자 진화 세포주의 4가지 그룹(#1~4)을 나타낸 도이며, GRC1-P3, GRC1-P7, 및 GRC1-P15 세포는 젬시타빈을 통한 분자 진화 검정이 3, 7 및 15 회 처리된 세포를 나타낸다.
c: 단계적인 약물 처리를 통해 GRC1-P2 세포에서 약물 처리된 GRC1-P3 세포로, GRC1-P6 세포에서 약물 처리된 GRC1-P7 세포로, 및 GRC1-P14 세포에서 약물 처리된 GRC1-P15 세포로 수립하는 단계에서 세포 콜로니 형태를 나타낸 도이다.
d: 젬시타빈 약물 처리에 대한 투여량-반응 곡선을 나타낸 것이다.
e: T24 GRC #1 세포주에 젬시타빈을 24시간 처리 후 콜로니 형성 개수를 확인한 도이다.
f: T24 GRC #1 세포주에 젬시타빈을 처리하지 않은 세포주에서 콜로니 형성 개수를 확인한 도이다.
g: T24 세포주들의 비부착성 콜로니 형성 능력을 확인한 도이다.
h: GRC 세포 및 T24-P0 세포에서 검출된 트랜스웰 침습 검정 및 이동 검정 능력을 확인하여 (×400) 필드 당 세포 수를 계수하여 계산한 세포 침입 및 이동 능력을 나타낸 도이다.
도 2는 GRC 세포가 organ-on-chip에서 전이 능력이 항암제 내성이 증가함에 따라 촉진됨을 나타낸 것이다.
a: 마이크로유체 디바이스에서 HUVEC 세포로 겔 침습한 GRC 세포 및 GRC 세포의 최대 침투 거리, 침투 영역 및 침투 수를 정량화한 도이다.
b: T24-P0 및 GRC1-P15 세포에서의 EMT-관련 유전자 (MMP-1, MMP-2, MMP-9, VIM, SNAIL, SLUG, ZEB1, ZEB2, TWIST, NCAD, SDC1, SDC2, 및 ECAD)의 mRNA 수준과 MMP-1, MMP-2, MMP-9, NCAD, VIM, SNAIL, ECAD, GAPDH의 단백질 수준을 나타낸 것이다.
도 3은 RNA-시퀀싱 프로파일링에 의해 약물 내성의 유전자 발현을 발견하고 확인한 결과이다.
a: RNA-시퀀싱 프로파일링 전체 과정을 나타낸 공정도이다(DEGs; Differentially Expressed Genes, TCGA; The Cancer Genome Atlas).
b: GRC1 세포주(n=16)의 주성분 분석(PCA)을 통해 분자 메커니즘(CPM > 1 및 S.D > 1)과 관련된 1,869개의 유전자를 기반으로 한 결과이다.
c: GRC 세포의 분자 진화의 경로에서의 변화를 보이는 Gene Ontology (GO) 분석 결과로서, 모든 differentially expressed genes (DEGs)-관련 경로를 보이는 RNA-시퀀싱 데이터의 계층 클러스터링 및 히트맵을 나타낸 것이다.
도 4는 GRC 세포의 분자 진화의 경로에서 변화를 보이는 GO 분석 결과에 따라 DEG 관련 경로를 나타낸 결과이다.
a: RNA-시퀀싱 데이터 변화 경로에 대표 경로와 관련 유전자들의 발현 수준을 히트맵으로 나타낸 도이다.
b: 젬시타빈 내성의 분자 변화에 대한 개략도를 나타낸 도이다.
c: 왼쪽 패널은 GRC1 세포주에서 젬시타빈 내성과 관련된 23개의 유전자 특징의 히트맵을 나타낸 도이며, 중간 패널은 TCGA에서 젬시타빈 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 23개의 유전자 특징의 민감도 및 특이성을 나타낸 ROC 곡선이다.
d: 내화학성 점수에 따라 분류된 TCGA 코호트의 히트맵 및 임상정보를 나타낸도이다.
e: 왼쪽 패널은 젬시타빈 치료에 대한 객관적인 반응률을 두 그룹으로 계층화한 것이고, 중간 패널은 TCGA 코호트에서 두 그룹의 카플란-마이어 곡선을 통해 내화학성 점수로 계층화하였으며, 오른쪽 패널은 내화학성 점수에 의해 계층화된 TCGA 하위 유형의 분포를 나타낸 도이다.
f: TCGA 아형에 따른 내화학성 점수을 나타낸다.
도 5는 GRC1 세포주에 시스플라틴 및 독소루비신 내성에 대한 코호트를 분석한 도이다.
a: 왼쪽 패널은 GRC1 세포주에 시스플라틴과 독소루비신을 농도별로 72시간 처리한 후 MTT 분석으로 약물 민감도 곡선을 나타낸 도이며, 오른쪽 패널은 내화학성 점수에 따라 분류된 TCGA 코호트의 히트맵, 약물 반응 및 전체 생존을 나타낸 도이다.
b: 시스플라틴, 카보플라틴 및 독소루비신에 대한 완전한 반응을 예측하기 위한 내화학성 점수의 민감도 및 특이도를 ROC 곡선으로 나타낸 도이다.
c: 시스플라틴, 카보플라틴 및 독소루비신에 대한 객관적 반응률을 두 군으로 계층화한 도이다.
d: 카플란-마이어 곡선으로 TCGA 코호트에서 내화학성 점수로 계층화한 도이다.
도 6은 내화학성 점수를 기반으로 한 UROMOL 코호트의 NMIBC 환자에 대한 유전자 발현 패턴 및 생존 분석을 나타낸 도이다.
a: UROMOL 코호트에서 NMIBC 환자의 진행을 예측하기 위한 23개 유전자 특징의 민감도 및 특이성의 ROC 곡선을 나타낸 도이다.
b: 내화학성 점수에 따라 그룹화된 UROMOL 코호트의 히트맵을 나타낸 도이다.
c: UROMOL 코호트에서 두 그룹의 카플란-마이어 곡선은 내화학성 점수로 계층화한 도이다.
도 7은 GRC 세포가 in vivo에서 종양 성장 및 전이가 촉진되는 것을 나타낸 도이다.
a: 왼쪽 패널은 실험 스케줄을 나타낸 것으로, 실험 기간 동안 실시된 실험을 나타낸 것이며, 오른쪽 패널은 GRC1-P3, GRC1-P7 및 GRC1-P15 세포가 주입된 마우스 그룹의 체중 및 수술로 제거된 종양 조직 크기 이미지이다.
b: 종양 부피와 GRC 세포 이종이식 종양 샘플에서 면역화학에 의한 Ki67 발현을 나타낸 H&E 염색 결과이다.
c: 왼쪽 패널은 T24-P0, GRC1-P3, GRC1-P7, 및 GRC1-P15로부터 수득한 폐 조직 섹션의 H&E 조직학 이미지이며, 오른쪽 패널은 T24-P0, GRC1-P3, GRC1-P7, 및 GRC1-P15 세포의 꼬리 정맥 주입 후 형성된 전이 폐 결절의 수를 정량화한 도이다.
d: P0와 P15 세포주에서 23개유전자들 중 10개의 mRNA 수준을 정량화한 것이다.
e: mouse tumor에서 23개 유전자들 중 10개의 mRNA 수준을 정량화한 것이다.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명한다. 이하의 설명에 있어, 당업자에게 주지 저명한 기술에 대해서는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다.
따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자를 포함하는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측을 위한 바이오마커를 제공한다.
본 발명에서, 사용된 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 바이오마커는, 암(cancer)의 항암제 내성을 조절하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 항암제는 항암치료를 위해 사용되는 항암제일 수 있으며, 예를 들어, 젬시타빈(gemcitabine), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 독소루비신(doxorubicin), 마이토마이신 C(mitomycin C) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 항암제는 방광암 치료를 위해 사용된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 암은 방광암, 유방암, 교모세포종, 전립선암, 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 흉선종, 중피종, 식도암, 위암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암, 신장암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 및 피부암으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있고, 바람직하게는 방광암이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 바이오마커의 발현이 대조군의 기준치와 비교하여 증가하면, 암의 항암제 내성이 증가하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 바이오마커의 발현이 대조군의 기준치와 비교하여 증가하면, 암세포의 성장, 침습(invasion) 또는 이동(migration)이 증가하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 바이오마커의 발현이 대조군의 기준치와 비교하여 증가되면, 암의 임상적 예후(prognosis)가 불량한 것일 수 있으며, 상기 예후가 불량한 것은, 암의 반응률(response rate)이 감소하는 것일 수 있고, 암세포의 항암제 내성이 증가된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
상기 miRNA 또는 이의 단편의 발현 수준을 확인하는 방법에 사용되는 제제는 시료에 포함된 해당 miRNA 또는 이의 단편의 발현 여부를 확인하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는데, 예를 들어, RT-PCR, 경쟁적 RTPCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), 유전자 칩 분석법 등의 방법에 사용되는 표적 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxylgroup)를 가지는 핵산서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있다.
상기 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 항체, 엡타머, 올리고펩타이드 또는 PNA(Peptide nucleic acid), 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인 상보적 서열을 갖는 프라이머 또는 프로브 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 유전자의 발현항을 측정하는 제제는, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍; 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 쌍; 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머 쌍; 서열번호 17 및 서열번호 18의 프라이머 쌍; 서열번호 19 및 서열번호 20의 프라이머 쌍; 서열번호 21 및 서열번호 22의 프라이머 쌍; 서열번호 23 및 서열번호 24의 프라이머 쌍; 서열번호 25 및 서열번호 26의 프라이머 쌍; 서열번호 27 및 서열번호 28의 프라이머 쌍; 서열번호 29 및 서열번호 30의 프라이머 쌍; 서열번호 31 및 서열번호 32의 프라이머 쌍; 서열번호 33 및 서열번호 34의 프라이머 쌍; 서열번호 35 및 서열번호 36의 프라이머 쌍; 서열번호 37 및 서열번호 38의 프라이머 쌍; 서열번호 39 및 서열번호 40의 프라이머 쌍; 서열번호 41 및 서열번호 42의 프라이머 쌍; 서열번호 43 및 서열번호 44의 프라이머 쌍; 및 서열번호 45 및 서열번호 46의 프라이머 쌍;으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머 쌍인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기의 조성물을 포함하는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 개체로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계;
상기 분리된 생물학적 시료에서 상기의 키트를 이용하여, GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자의 발현수준을 측정하는 단계; 및
상기 유전자의 발현 수준을 대조군의 기준치와 비교하는 단계;를 포함하는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
구체적으로, 대상으로부터 분리된 시료에서 상기 유전자의 발현수준이 정상 대조군에 비해 상향발현될 경우 항암제에 대해 내성이 있는 것으로 판단할 수 있다. 상기 정상 대조군은 정상 환자 대조군일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 유전자의 발현수준은 유전자의 miRNA 또는 유전자가 코딩하고 있는 단백질 발현수준을 측정하는 것일 수 있으며, 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RTPCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 유전자 칩에 의해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 유전자의 발현이 대조군의 기준치와 비교하여 증가되면, 암의 반응률(response rate)이 감소하는 것으로 판단하는 것일 수 있고, 암의 항암제 내성이 증가한 것으로 판단하는 것일 수 있으며, 암세포의 성장, 침습(invasion) 또는 이동(migration)이 증가하는 것으로 판단하는 것일 수 있다.
상기 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 소변과 같은 시료 등을 포함할 수 있으며, 예를 들어 혈액 또는 조직일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 개체로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계;
상기 분리된 생물학적 시료에 후보물질을 처리하는 단계;
상기 후보물질이 처리된 생물학적 시료에서 GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자의 발현수준을 측정하는 단계; 및
상기 유전자의 발현 수준을 대조군의 기준치와 비교하는 단계;를 포함하는 항암제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 유전자의 발현이 대조군의 기준치와 비교하여 저발현 되면, 항암효과가 있는 것으로 판단하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 항암 효과는 암의 반응률(response rate)이 증가하는 것일 수 있고, 암세포의 성장, 침습(invasion) 또는 이동(migration)이 감소하는 것일 수 있으며, 암세포의 항암제 내성이 감소하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자를 포함하는 항암제 약물내성을 가지는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측을 위한 바이오마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 항암제 약물 내성을 가지는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 조성물을 포함하는 항암제 약물 내성을 가지는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 개체로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계;
상기 분리된 생물학적 시료에서 상기의 키트를 이용하여, GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자의 발현수준을 측정하는 단계; 및
상기 유전자의 발현 수준을 대조군의 기준치와 비교하는 단계;를 포함하는 항암제 약물 내성을 가지는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 개체로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계;
상기 분리된 생물학적 시료에 후보물질을 처리하는 단계;
상기 후보물질이 처리된 생물학적 시료에서 GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자의 발현수준을 측정하는 단계; 및
상기 유전자의 발현 수준을 대조군의 기준치와 비교하는 단계;를 포함하는 항암제 약물 내성을 가지는 암의 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실험예>
1. 세포 배양
인간 방광암 세포주인 T24, 5637, UC3, UC5 및 UC14는 American Type Culture Collection (ATCC)에서 구입하고 RT4 세포주는 Korean Cell Line Bank (KCLB)에서 구입하였다. T24, UC3, UC5, UC14 및 RT4 세포주는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에 배양하고, 5637 세포주는 10% FBS (Capricorn Scientific GmbH, Ebsdorfergrund, Germany) 및 1% penicillin/streptomycin (Capricorn Scientific GmbH, Ebsdorfergrund, Germany)이 보충된 RPMI 1640에 배양하였다. 모든 세포주는 37℃, 5% CO2조건으로 배양하였다.
2. 분자 진화 검정(Molecular Evolution Assay)
도 1a에 나타낸 공정을 통해 분자 진화 검정을 실시하였다. 분자 진화 검정에서 세포사멸에 대한 젬시타빈의 적절한 비율을 확인하기 위해, 사전 배양에서 다양한 젬시타빈 농도를 확인하였으며, 1,500 nM이 가장 적당한 농도임을 확인하였다. 그 후 인간 방광암 세포주 T24의 세포 포화도가 70%에 이르렀을 때 에 1,500 nM 젬시타빈 (GEM, Lilly, Eli 및 company)을 72시간 동안 처리하였다. 그 후, 젬시타빈을 포함하는 DMEM을 신선한 배지로 교체하여 세포를 90%의 포화도에 도달할 때까지 회복시켰다. 회복된 세포를 회수하고, RNA 분리, 단백질 침전, 세포독성 검정하고, 이를 계대 배양 하였다. 동일한 방법으로 15 회 계대한 후, 분자 진화 검정을 실시하였다. 각각의 계대에서, P0 (Phase 0)는 비처리 대조 T24 세포주(T24-P0, 부모 세포)이며, P1 및 P1+n은 각각 1회 계대 및 (1+n)회 계대된 세포를 나타낸다.
3. RNA 시퀀싱 샘플 준비
세포를 수확하고 RNeasy Mini Kit (#74316, Qiagen, CA, USA)를 사용하여 총 RNA 추출을 시행하였다. 구체적으로 RNA의 정량 및 RNA 정량 비교를 위하여, 추출된 RNA를 6% 포름알데하이드 겔에서 전기영동 한 후 ethidium bromide (EtBr) 염색으로 확인하였다. 전체 전사체 시퀀싱을 위한 라이브러리 구축은 키트를 사용해 실시하였으며, 분리된 총 RNA를 PrimeScriptTM (TakaraBio, Otsu, Japan)를 사용하여 poly (dT) 프라이머를 이용한 역전사 반응에 사용하였다.
4. 세포 생존율 및 콜로니 형성 확인
세포를 1 x 103 세포농도로 96-웰 플레이트의 각 접종하여 배양하였다. 그 후 DMEM를 제거하고 세포 시간 위치를 기록하고 이동 비율을 0, 24, 48 및 72 시간에 각각 측정하였다. 그 후 세포 생존율을 확인하기 위하여, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT; #298-93-1, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 각 웰에 첨가한 후 1시간 동안 배양하고 Dimethyl Sulfoxide (DMSO; Duchefa Biochemie, BH Haarlem, Netherlands)를 첨가하였다. 그 후 540 nm에서spectrophotometer microplate reader (Victor3)를 이용하여 흡광도를 측정하고 세포 생존률을 대조군과 비교하여, 대조군에 대한 생존비를 계산하였다.
또한, 세포를 6-웰 플레이트에 1 x 103 세포 농도로 접종하고, 각 웰에 콜로니가 형성될 때까지 7일간 배양하였다. 그 후 콜로니를 4% 포름알데히드로 10분간 고정하고 0.1% 크리스탈 바이올렛 용액을 이용하여, 1시간 동안 콜로니를 염색하였다. 염색된 콜로니 수는 Image J software (NIH; National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 계수하였다.
5. 세포 침입 및 이동 검정
세포 침윤 및 이동을 확인하기 위하여, 트렌스웰 검정을 사용하여 Boyden chamber에서 세포 침윤 및 이동을 확인하였다. 구체적으로 매트리겔(matrigel; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) 코팅된 챔버에 4×104 세포농도로 세포를 접종한 후 24시간 동안 배양하였다. 그 후 세포의 조정 배지(CM)에 대한 세포 침윤 및 이동 분석을 위하여, 세포를 1:1 비율의 CM 및 새로운 배지에서 24시간 동안 접종하고, 침윤 또는 이동 능력을 확인하였다.
6. 상처 회복 분석(Wound Healing Assay)
세포를 6-웰 플레이트에 접종하고 90% 포화도에 이를 때 까지, 24시간 동안 배양하였다. 그 후 P200 피펫의 옐로우 팁으로 배양된 세포 표면에 상처를 만든 후, 세포를 PBS(phosphate buffered solution)로 세척하고, 5% CO2, 37℃ 조건으로 추가 배양하였다. 배양 24시간 후, 세포를 광현미경으로 확인하였으며, 상처 부근의 사진을 시간 간격을 두고 촬영하였다. 그 후 3개의 무작위 필드를 표시하여 상처 회복 정도를 확인하였으며, 상처 회복에 대한 정량 분석을 위하여, 대조군 세포의 이동 거리에 대한 비율로 상처 회복 정도를 정량화 하였다.
7. 마이크로유체 디바이스(마이크로유체 디바이스) 제작
3D 세포 배양을 위한 마이크로유체 디바이스를 AutoCAD software (Autodesk, USA)를 사용하여 설계하였다. 설계된 디바이스를 이용하여, Si 마스터 몰드를 포토리소그래피 기법을 이용하여 제작하였다. 구체적으로 경화제와 혼합한 Poly-dimethylsiloxane (PDMS) (Sylgard 184, Dow Corning, USA) pre-polymer를 약 5-6 mm 두께로 Si 마스터에 붓고 80℃에서 2시간 동안 경화시켰다. 그 후 경화된 PDMS층을 분리하고 개별 디바이스로 절단하였으며, 주입구 및 유출구 구멍을 마이크로채널의 시작부에 뚫었다. 그 후 PDMS층을 오토클레이브로 멸균하였으며, PDMS층의 채널을 멸균된 커버 글라스(24 mm × 24 mm) 상에 플라즈마-활성 본딩으로 밀폐하였다. 본딩 후에, 친수성 채널 표면을 1 mg/㎖의 poly-D-lysinehydrobromide(PDL)(Sigma-Aldrich, MO, USA)로 4시간 동안 코팅하여 채널 표면에 대한 콜라겐 부착을 향상시키고 증류수로 3회 세척하였다. 제작된 마이크로유체 디바이스는 80℃ 오븐에서 완전히 건조시켰다.
8. 마이크로유체 디바이스에서 방광암 세포 및 HUVEC 세포 공동-배양
스캐폴드 물질로서, 타입 I 콜라겐 (Corning, USA) 용액(2 mg/㎖)을 종래 문헌에 기재된 바와 같이 제조하였다[Chung S. et al., Adv. Mater. 21(47):4863-4867; Jeong K. et al., Lab Chip 2020;(20):548-557]. 그 후, 마이크로유체 디바이스의 중앙 채널에 콜라겐 용액을 채우고, 디바이스를 37℃ 인큐베이터에서 30분간 반응시켰다. 겔화된 디바이스 표면의 세포 부착을 증가시키기 위하여, 희석된 콜라겐 용액(PBS 중 35 μg/㎖)을 배지 채널 내로 도입하였다. 그 후 5% CO2 인큐베이터에서 30분간 반응 시킨 후, 채널을 신선한 배지로 세척하였다. 각 조건(T24-P0, GRC1-P3, GRC1-P7, 및 GRC1-P15)에서의 방광암 세포의 현탁액(1×106 cells/㎖)을 배지 채널에 도입시킨 후 세포 부착을 위하여 배양하였다. 배양 4시간 이 후, HUVECs의 현탁액(1×106 cells/㎖) 또한 배지 채널의 반대쪽으로 도입하였다. 방광암 및 HUVECs를 위한 배지를 각 채널에 공급하였으며, 매일 배지를 교체하면서 마이크로유체 디바이스에서 공동 배양하였다.
9. 면역염색 및 종양 이동 확인
공동-배양하는 5일 동안 마이크로유체 디바이스에서 HUVEC 세포 쪽의 겔에 침입하는 방광암 세포의 이동을 확인하였다. 세포를 실온에서 20분간 4% 파라포름알데히드로 고정시키고 0.1% Triton X-100으로 20분간 반응 시켰다. 그 후 액틴 필라멘트 및 핵을 phalloidin-594 (1:400, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 및 Hoechst 33342 (1:2000, Thermo Fisher Scientific, USA)로 각각 염색하였다. 그 후 전체 디바이스를 스캐닝하고 high contents screening microscope (CELENA X, Logos Biosystems, Republic of Korea)를 이용하여 시각화 하였으며, 3개의 다른 디바이스에서 8 내지 9 영역의 ROI(region of interest) 이미지를 촬영하고(total n=25), 모든 바이너리(binary) 및 트레스홀드(thresholded) 이미지를 분석하였다. 그 후 시각화 된 방광암의 침습 이미지를 Image J software를 사용하여 최대 침습 거리, 침습 영역 및 침습한 암세포의 수를 정량적으로 분석하였다. 암의 침습 영역을 확인하기 위하여, 형광 픽셀의 비율을 ROI 이미지에서 계산하였으며, 겔로 침습한 세포의 총 수를 각 ROI에서 3개의 다른 디바이스에서 계수하였다. 세포의 최대 이동 거리 또한 Image J software를 사용하여 ROI 이미지를 이용하여 확인하였다.
10. 소프트 아가 검정
세포의 앵커리지-독립 성장(Anchorage Independent Growth)을 소프트 아가에서 콜로니의 생존률로 확인하였으며, 플레이트를 10일간 인큐베이션하고 콜로니를 현미경으로 계수하였다.
11. 세포독성 검정
세포독성을 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)를 사용하여 실시하였다. T24-P0, GRC1-P3, GRC1-P7, 및 GRC1-P15 세포(1,000 cells/well)를 96-웰 플레이트에 접종하고 실험 처리 시작 전에 약 60 내지 70% 포화도에 이를 때 까지 배양하였다. 그 후, 젬시타빈의 투여량-반응 곡선을 그리고 IC50을 non-linear (curve fit) regression algorithms와 GraphPad Prism9 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) 사용해 계산하였다.
12. qRT-PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction)
총 RNA를 RNAiso reagent (Takara, Otsu, Japan)를 사용하여 분리하였다. RNA 정량 체크를 spectrophotometer (ND-1000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 확인하였으며, cDNA PrimeScriptTM RT reagent Kit (#RR037A, Takara, Otsu, Japan)를 이용하여 합성하고, 1 ㎍ 총 RNA를 이용하여 RNA의 정량 분석을 수행하였다. qRT-PCR은 TB Green Premix Ex Taq (#RR420A, Takara, Otsu, Japan) 및 CFX 96 real-time PCR Detection system (#185-5096, BioRad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 수행하였으며, 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타내었다. 정량 분석은 총 3회의 독립적인 cDNA 합성 및 RNA 분석을 수행하여, 재연성을 평가하였다. 그 후 mRNA 분석 데이터를 GAPDH에 대해 정량화하고, 폴드 체인지(fold change)를 상대적 정량(2-ΔΔCt)을 이용하여 계산하였다. 각 프라이머 서열이 표적하는 유전자의 서열은 하기 표 2에 나타내었다.
[표 1]
Figure PCTKR2023014217-appb-img-000001
[표 2]
Figure PCTKR2023014217-appb-img-000002
Figure PCTKR2023014217-appb-img-000003
13. 웨스턴 블롯 분석
세포를 PBS를 사용해 세척한 후 단백질을 radio immunoprecipitation (RIPA) buffer (Ambion, 150 mM NaCl, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 50 mM Tris, pH 8.0, protease inhibitor cocktail, 및 phosphatase inhibitor)로 분리하고 12,000 g, 15 min, 4℃의 조건에서 원심분리 하여 단백질을 수득하였다. 단백질의 양은 BCA assay kit (#23225, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 확인하였으며, 10-12% SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동(electrophoresis) (SDS-PAGE)를 실시하였다. 그 후 니트로셀룰로오스(NC) 맴브레인(GE healthcare, Esbjerg, Denmark)에 단백질을 옮긴 후, 5% 탈지유가 포함된 0.05% TBS-T를 이용하여 맴브레인을 차단하였다. 그 후, 1차 항체인 STC1(#sc-293435, 1:100, Santa Cruz Biotech., Dallas, TX, USA), MMP-1 (sc-137044, 1:2000, Santa Cruz Biotech., Dallas, TX, USA), MMP-2 (#4022, 1:2000, Cell signaling, Danvers, MA, USA), MMP-9 (#3852, 1:4000, Cell signaling, Danvers, MA, USA), NCAD (#4061, 1:2000, Cell signaling, Danvers, MA, USA), ECAD (#3195, 1:2000, Cell signaling, Danvers, MA, USA), VIM (#sc-6260, 1:2000, Santa Cruz Biotech, Dallas, TX, USA), SNAIL (#sc-271977, 1:5000, Santa Cruz Biotech, Dallas, TX, USA), FAK(#3285, 1:4000, Cell signaling, Danvers, MA, USA), p-FAK (#3283, 1:4000, Cell signaling, Danvers, MA, USA), ERK (#9102, 1:5000, Cell signaling, Danvers, MA, USA), 및 p-ERK (#9101, 1:5000, Cell signaling, Danvers, MA, USA)를 이용하여 반응 시켰으며, 대조군으로는 GAPDH (#2118, 1:20000, Cell signaling, Danvers, MA, USA)를 사용하였다. 그 후, 2차 항체인, horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-rabbit 또는 anti-mouse immunoglobulin G (IgG)와 반응 시켰으며, 양성 밴드를 ECL 검출 시약을 사용하여 검출하였다. 검출된 밴드는 automatic X-ray film processor (#JP-33, JPI Healthcare, Seoul, Korea)로 확인하였으며, X-ray films (#47410-15788, Fuji film, Tokyo, Japan) 상의 밴드 발현 정도를 Image J software (NIH; National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)로 정량하였다.
14. 생체 내(in vivo) 종양 성장 및 전이 검정
in vivo 종양 형성 및 전이 검정을 위해, T24-P0 또는 GRC1-P3, GRC1-P7, 및 GRC1-P15 세포를 트립신으로 분리하고, PBS에 현탁하였다. 그 후, 세포 현탁액을 BALB/C 누드 마우스의 측면 및 꼬리 정맥에 피하 주사하였다. 또한, 4개 유형의 세포를 PBS 중의 세포 및 동량의 Matrigel (#354234, Corning Inc., Costar, NY, USA)과 혼합하여, 200 ㎕를 피하 주입하였다. 종양이 확인되는 시점에서, 종양 크기를 3일 간격으로 측정하고 종양 부피를 계산하였다: Tumor volume (mm3)= width2 (mm2) x length (mm). 그 후 4 그룹의 마우스를 35일차에 희생시켰으며, 희생된 마우스에서 종양 조직을 수득하여 PBS로 2회 세척한 후 RNA 및 단백질 추출에 이용하였다.
15. 조직 마이크로어레이(Tissue Microarray; TMA) 및 면역조직화학(Immunohistochemistry; IHC) 염색
마우스 조직을 파라핀 블록으로 제작하였으며, 조직 마이크로어레이(Tissue Microarray; TMA)을 위하여, 파라핀 블록의 조직 코어(지름 2 mm)로 설정하였다. 그 후, 슬라이드를 H&E(hematoxylin 및 eosin)로 염색하고 종양 조직을 확인하였다. 또한, 면역조직화학(Immunohistochemistry; IHC) 분석을 위하여, 모든 조직 샘플을 완충 포르말린(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 고정하고 파라핀에 몰딩하였다. 파라핀 몰딩 조직을 자일렌 내에서 탈파라핀화시키고 알코올(100 %, 90%, 80%, 및 60%)을 이용하여 탈수시켰다. 그 후, 항원 회수(끓는 물에서 10분)를 시행하고, 시트르산나트륨 (pH7)을 회수 버퍼로서 사용하였다. 사용된 1차 STC1 및 Ki67 항체(#sc-23900, Santa Cruz Biotech., Dallas, TX, USA)는 rabbit monoclonal IgG (#ab229477, Abcam, Cambridge, MA, USA)을 이용하였으며, Rabbit IgG를 음성 아이소타입 대조군으로 사용하였다. TMA 슬라이드를 일차 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하고 비오틴화된 이차 항체를 처리하였다. 그 후, Vectastain Elite ABC Reagent (#PK-6100, 벡터 Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 실온에서 30분간 첨가하고 3, 3`-diaminobenzidine (DAB, #D4293, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 색소원으로 사용하여 면역반응을 확인하였다. 그 후, TMA 슬라이드를 Mayer's hematoxylin (#S3309, Dako, Carpinteria, CA, USA)로 대조염색하고, 알코올(60%, 80%, 90%, 및 100%)로 탈수하였으며, 자일렌으로 3회 세척하고 자일렌 중의 봉입제로 고정하였다. Ki67 및 STC1 염색은 염색 강도에 따라 3개 등급으로 나누었다: 약함(weak), 중간(moderate), 및 강함(strong). 강도 및 퍼센트 스코어의 합을 최종 STC1 염색 스코어로서 사용하였으며, 하기와 같이 규정하였다: 무 발현 (total score 0); 약한 발현 (total score 1); 중간 발현 (total score 2); 및 강한 발현 (total score 3).
16. 환자 및 유전자 발현 데이터
National Center for Biotechnology information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) 데이터베이스 (GSE13507, GSE32894, 및 GSE120736)로 부터 임상 및 유전자 발현 데이터를 포함하는 데이터 세트를 수득하였다. 모든 데이터는 log2 스케일로 변환하였으며, quantile normalization으로 표준화하였다. 165명의 방광암 환자 데이터를 디스커버리 코호트(n=165; Korean cohort; GSE13507)로 사용하고, 453명의 방광암 환자 데이터를 발리데이션 코호트(n=308; Lund cohort; GSE32894, n=145; Yonsei cohort; GSE120736)로 사용하였다.
17. 연관성, 유전자 발현 및 Function Enrichment 분석
유전자 특성과 관련된 유의한 유전자 세트를 확인하기 위하여, 코리안 코호트로부터의 유전자 발현 데이터에 Pearson correlation test를 적용하고 유의한 연관성 계수(|r| > 0.4 및 p < 0.001)를 갖는 유전자를 선택하였다. 그 후, 유사성 및 완전 연결 클러스터링 방법(complete linkage clustering method)의 척도로서, 중심 상관 계수로 계층 클러스터링 분석을 실시하였다. 환자 클러스터링 결과에 따라, 환자를 2개의 서브그룹으로 나누고, 각 서브그룹에서 환자의 진행 시간 및 암 특이 생존률을 평가하였다. Kaplan-Meier 방법을 사용하여 log-rank statistics로 무진행 시간 및 암 특이 생존을 계산하였으며, Gene ontology (GO) 분석은 DAVID bioinformatic resources (http://david.ncifcrf.gov)로 실시하였다. 결과는 p < 0.001 및 false discovery rate (FDR) < 0.25일 때 유의한 것으로 간주하였다.
18. 통계 분석
데이터 결과는 3회 반복으로 획득하여, 평균 ± 표준 편차 (SD)로 나타냈다. 모든 분석은 3회 실시하였으며, 3회의 개별 실험으로부터 데이터를 나타냈다. 모든 실험은 3중 디바이스로 구성하였으며, 모든 수치 데이터는 평균 ± S.D로 나타냈다. 두 독립 그룹 사이의 차이의 유의성은 two-tailed Student's t-test를 사용하여 결정하였다. 차이는 p < 0.05에서 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다. * (p < 0.05), ** (p < 0.01), *** (p < 0.001). 통계 분석은 R 3.6.1 language environment (http://www.r-project.org)을 사용하여 실시하였다.
<실시예 1> 젬시타빈-내성 방광암 (GRC) 세포주의 특성화
방광암(BC)의 분자 진화를 이해하고, 적절한 진단 및 치료 가이드라인을 설립하기 위하여, 항암제 내성 방광암 세포주를 특성화 하였다. 구체적으로, 세포가 단계적으로 항암제 젬시타빈에 대한 내성을 습득함에 따라, 달라지는 분자적 차이를 확인하기 위하여 in vitro 모델을 이용하였다. 방광암 세포주 T24(T24-P0, P0)를 4개의 군으로 분류하고, 각각 젬시타빈을 처리하였으며 동일한 조건으로 15회 계대하여, 15상(Phase)에 걸친 젬시타빈 내성 방광암 세포주(GRC)를 수득하였다(도 1a). 각 그룹에서 수득된 젬시타빈 내성 방광암 세포주는 GRC1-P15, GRC2-P15, GRC3-P15 및 GRC4-P15으로 분류하였다(도 1b). 그 후 GRC1-P3, GRC1-P7 및 GRC1-P15 세포를 이용하여, GRC1 그룹에서 단계적 내성 습득 과정을 확인하였다. 또한, GRC2, GRC3 및 GRC4 각 군의 세포를 내성 습득의 최종 비교에 이용하였다. GRC1 그룹의 세포주들은, 항암제 내성을 획득함에 따라서, 콜로니 형성 시간이 단계적으로 가속화되었으며, 젬시타빈 처리 후에도 콜로니의 크기가 증가하였다(도 1c). 모든 GRC 세포의 화학 민감성을 확인하기 위하여, 성장 저해 검정을 수행하였으며, GRC1-P3, GRC1-P7 및 GRC1-P15 세포는 T24-P0 세포와 비교하여, 젬시타빈에 대한 저항성이 상(phase) 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 1d). 또한, GRC1 세포주들은 내성이 증가됨에 따라 콜로니 형성능이 증가하는 것을 확인하였으며(도 1e 및 도 1f), 비부착성 능력 검정에서도 확인하였다(도 1g). 또한, 세포의 이동성 및 침투성과 상처 회복 능력도 GRC 세포주들에서 확인하였으며, 내성을 획득함에 따란, 단계적으로 이동성 및 침투성이 증가하는 것을 확인하였다(도 1h).
<실시예 2> HUVEC 세포와의 3D 배양 조건에서 GRC 세포 침입 및 이동 능력 확인
최근 연구에서 약물 내성에 영향을 미치는 epithelial-mesenchymal transition(EMT)에 대하여 관심이 증가하고 있으며, EMT는 항암 약물 내성에서 중요한 역할을 하고 화학요법 치료 후 암의 전이에 기여하는 것으로 알려지게 되었다. 이에, GRC 세포를 HUVEC 세포주와함께 마이크로유체 디바이스에서 공동 배양하여, 3D 조건에서 GRC 세포의 이동성을 확인하였다. 그 결과 도 2a에 나타낸 바와 같이, GRC 세포가 마이크로유체 디바이스를 통해 콜라겐 겔을 관통하는 것을 확인하였으며, 핵 및 F-actin 면역 염색 결과, GRC1-P3, GRC1-P7 및 GRC1-P15 세포에서 침투한 세포의 수가 T24 세포와 비교하여, 단계적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 2a). 또한, 최대 침투 거리, 침투 영역 및 침투 방광암 세포 수는 T24-P0 세포와 비교하여, GRC1-P3, GRC1-P7 및 GRC1-P15 세포에서 단계적으로 증가하였으며, 상기의 결과로, 3D 조건에서 GRC 세포 침입 및 이동 능력이 T24-P0 세포와 비교하여 증가된 것을 확인하였다(도 2a). GRC 세포가 EMT에 영향을 미치는지를 확인하기 위해, 상피 및 간엽 마커의 발현을 확인하였으며, GRC1-P15 세포는 matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), MMP-9, vimentin (VIM), SNAIL, ZEB1, ZEB2, 및 NCAD의 mRNA 발현이 증가하였다(도 2b). 반대로, SDC1 및 SDC2의 mRNA 발현은 유의차가 없었으며 ECAD는 감소하였다. GRC1-P15 세포에서의 MMP-1, MMP-2, MMP-9, NCAD, 및 SNAIL의 단백질 발현은 T24-P0 세포에 비해 증가하였으며, VIM에서는 유의차가 없었다(도 2b). 따라서, T24-P0에 비해, 침습, 이동 능력 및 EMT가 GRC1-P3, GRC1-P7, 및 GRC1-P15 세포에서 단계적으로 증가하는 것을 확인하였다.
<실시예 3> Gene ontology(GO) 분석을 이용한 GRC 세포의 분자 진화 경로 변화 확인
GRC1 세포주의 유전자 발현 프로파일 데이터는 RNA 시퀀싱을 이용하여, 4가지 시점의 변화를 분석하였다. 차별적으로 발현된 1,869개의 유전자가 백만분의 카운트 및 표준편차(CPM > 1 및 S.D > 1)로 선택되었으며(도 3a), GRC1 세포주에서 주성분 분석(PCA)으로 투영된 2차원 공간의 분포는 모든 시점 간에서 명확한 분리된 것을 확인하였다. 특히, P0과 P15 사이의 분포에서 73.1%의 차이가 있었고, 초기 P3과 중간기 P7 사이에 유의미한 차이가 확인되었다(도 3b). 기능 분석을 기반으로 GRC1 세포주를 대표하는 중요한 생물학적 특성 유전자를 선택하였다(도 3c 및 4a). P0에서 세포 증식 관련 유전자(GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6 및 TRNP1) 및 방어 반응 관련 유전자(APOBEC3D, APOBEC3G, IFI27 및 IFITM1)의 발달 및 음성 조절이 상향 조절되었으며, 초기 단계 P3에서 JAK-STAT 경로(CCND3, IL6, IL11 및 IL23A), I형 IFN 경로(IFNB1, IFIT1, IFIT2 및 IFIT3) 및 PI3K-AKT 경로(CCNE1, FGF1, CDK6 및 VEGFC)가 상향된 것을 확인하였다(도 4a). 또한, 중간기인 P7에서, GRC1 세포주는 리소좀(LAMP1, LAMP2, NEU1) 및 펼쳐진 단백질 반응(HSPA5, HSP90B1, DDIT3)과 같은 소포체(ER) 스트레스와 관련된 유전자가 상향되었으며(도 4a), 후기인 P15에서 RAS 신호 전달 경로(ABL1, ABL2, RAC3, GNGT1, PLA2G6 및 ATF2), MAPK 신호 경로(CACNA2D1, CACNA2D2, FOS, JUN, JUND, GNG4, NGF, RRAS, MYC, MAP4K4 및 STC1), EMT 관련 유전자(VIM, ZEB1, ZEB2, SNAI1, MMP1, MMP2, MMP3, FOXD1 및 FOXC2) 및 TGF-β 경로(TGFB1, TGFB3, NOG 및 SMAD9)가 상향 조절되었다(그림 4a). 또한 젬시타빈 작용 기전과 직접적으로 관련된 NT5E와 CDA는 P0에서 후기 P15까지 지속적으로 증가하였다(그림 4a). 다양한 생물학적 경로가 각 시점에서 관찰되었으며, 이는 분자 메커니즘이 젬시타빈 처리를 피하기 위해 GRC1 세포주에서 유도되었음을 나타낸다(그림 4b).
<실시예 4> 내화학성 점수 개발을 위한 핵심 유전자 식별
활성화된 생물학적 경로(도 4a) 중 23개의 유전자(GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2 및 젬시타빈 내성 획득과 관련된 TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9, NT5E)를 선별하여 유전자 시그니처 셋(gene signature set)으로 명명하고, 다른 상(phase)과 유전자의 발현 수준이 차이가 있는 것을 확인하였다. 젬시타빈 치료(n=76)와 The Cancer Genome Atlas (TCGA) 코호트에 대한 23개 유전자 식별의 완전 반응 예측의 민감도와 특이성을 비교하기 위해 ROC(Receiver operating characteristics) 분석을 수행하였다. TCGA 코호트의 환자는 ROC 곡선 아래 면적(AUC = 0.755)과 최적 컷오프 값(컷오프 최적 = 3.302, 도 4c)으로 분류되었다. 내화학성 점수에 기초하여, 낮은 환자 또는 높은 환자, 두 그룹으로 분류하였으며(도 4c, 4d), 고득점 환자는 유의하게 낮은 반응률(response rate)(Fisher's exact test에 의한 P = 0.007, 도 4e)과 나쁜 예후(log-rank test에 의한 P = 0.01, 4e)를 나타내는 것을 확인하였다. TCGA 분자 아형과 내화학성 점수 사이의 연관성을 확인하기 위하여, 각 클러스터에서 5개의 분자 아형 분포를 조사하였다(도 4e). TCGA 코호트의 기저-편평 아형에서, 고득점 환자는 더 낮은 객관적 반응률을 가지는 것을 확인하였다(도 4f).
또한, GRC1 세포주에 대한 in vitro 실험을 통해 cisplatin과 doxorubicin에 내성을 나타내는 것을 확인하였다(도 5a). 다른 약물(시스플라틴, 독소루비신 및 카보플라틴)으로 치료받은 환자를 23개 유전자 시그니처(gene signature set)에 따라 분석하여 내화학성 점수와 반응률 사이의 연관성을 확인하였으며(도 5a), 내화학성 점수의 성능을 추정하였다(도 5b). 시스플라틴 치료의 경우 내화학성 점수가 높은 환자는 반응률이 유의하게 낮았고 예후가 좋지 않게 나타났으며(Fisher's exact test에서 P = 0.004, log-rank test에서 각각 P = 0.01, 도 5c), carboplatin과 doxorubicin 치료에서도 유사한 경향을 확인되었다(도 5d). UROMOL 코호트의 NMIBC 환자를 23개 유전자 시그니처에 따라 분석하여 내화학성 점수와 질병 진행 사이의 연관성을 확인하여 본 결과(도 6a), 내화학성 점수가 높은 환자는 불량한 예후를 가지는 것을 확인하였다(로그 순위 테스트에 의한 P < 0.001, 도 6b, 6c). 상기의 결과로 내화학성 점수가 방광암 환자의 다양한 화학요법에 대하여, 예후 잠재력 및 예측 가치를 가지는 것을 시사한다.
<실시예 5> GRC 세포의 생체 내(in vivo) 종양 성장 및 전이 확인
생체 내에서 방광암의 종양 성장 및 전이에 약물내성 세포주의 효과를 확인하기 위하여, GRC 세포주를 이용하여, in vivo에서 종양 성장 및 전이를 확인하였다. 종양 발생 실험의 과정은 도 7a 나타내었다. 구체적으로 GRC 및 T24-P0 세포를 5-6주령 BALB/C 누드에게 피하 주입하고 체중 및 종양 부피를 매주 확인하였으며, 초기에는 마우스의 체중은 유의미한 차이가 없었으나, 처리 후 28일째부터 체중이 유의적으로 차이가 나는 것을 확인하였다(도 7a). 또한, 마우스의 종양 부피는 21일째부터 증가하였으며(도 7b), 도 7a에 나타낸 바와 같이, T24-P0 세포에 비해 GRC1-P3, GRC1-P7, 및 GRC1-P15 세포가 마우스의 종양 크기를 단계적으로 증가시키는 것을 확인하였다. 또한, 증식 마커를 Ki67 및 H&E 염색으로 확인한 결과, GRC1 세포가 T24 GRC 세포에 비해 더 많은 증식 및 종양 성장을 유도하는 것을 확인 하였다(도 7b). 상기의 결과로, GRC 세포가 방광암 종양 성장을 촉진함을 확인하였다. 또한, GRC 세포의 in vivo에서 전이 능력을 평가하기 위하여, T24-P0, GRC1-P3, GRC1-P7, 및 GRC1-P15 세포를 5-6주령 BALB/C 누드 마우스의 꼬리 정맥에 주입하였으며(도 7a), 체중은 매주 확인하였다. 정맥내 주입된 GRC 세포는 T24-P0 세포보다 단계적으로 더 많은 폐 결절을 하는 것을 확인하였으며(도 7c), 폐 조직의 H&E 염색 결과로 확인된 폐 결절의 크기는 T24-P0 세포에 비해 GRC 세포 그룹에서 유의적으로 증가한 것을 확인하였다(도 7c). 상기의 결과로 GRC 세포가 T24-P0보다 침습성이 증가하고, 전이 능력 또한 증가하는 것을 확인하였다. GRC 세포주와 mice tumor에서의 23개 유전자군 중 10개의 유전자의 mRNA 수준을 확인하여 본 결과, GRC 세포주 및 마우스 종양에서 10개 유전자 중 다수의 유전자가 현저히 상향 발현된 것을 확인하였다(도 7d). 상기의 결과로 GRC 세포가 in vitro 및 in vivo 모두에서 종양형성 및 전이 능력을 촉진시키는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 23개의 유전자인 GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E의 차별 발현을 확인하였으며, 상기 23개의 유전자의 발현이 방광암 환자의 예후 및 생존율과 관련성이 있는 것을 확인하여, 상기의 유전자를 이용한 항암제 내성 방광암 진단, 전이 또는 예후 예측용 바이오마커로 이용할 수 있음을 확인하였다. 또한, 방광암 세포주가 내성을 획득하면서 종양 침윤 및 이동 능이 증가하고, 항암제 저항성이 증가하는 것을 확인하였으며, 방광암 세포주가 항암제 내성을 획득함에 따라, 상기 23개의 유전자가 차별 발현되는 것을 확인하였다. 또한, 항암제 내성 방광암 세포주를 마우스에 투여하면, 종양 증식 및 전이능이 증가하는 것을 확인하였으며, 마우스 종양에서도 상기 유전자의 발현이 증가되는 것을 확인하였는 바, 암의 진단, 전이 또는 예후 예측에 효과적이고 항암제 내성암을 진단하는 효과가 우수한 것을 확인하였다.

Claims (28)

  1. GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자를 포함하는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측을 위한 바이오마커.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 바이오마커는, 암(cancer)의 항암제 내성을 조절하는 것인, 바이오마커.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 항암제는 젬시타빈(gemcitabine), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 독소루비신(doxorubicin), 마이토마이신 C(mitomycin C) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 바이오마커.
  4. 제 2항에 있어서,
    상기 암은 방광암, 유방암, 교모세포종, 전립선암, 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 흉선종, 중피종, 식도암, 위암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암, 신장암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 및 피부암으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 바이오마커.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 바이오마커의 발현이 대조군의 기준치와 비교하여 증가하면, 암의 항암제 내성이 증가하는 것인, 바이오마커.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 바이오마커의 발현이 대조군의 기준치와 비교하여 증가하면, 암세포의 성장, 침습(invasion) 또는 이동(migration)이 증가하는 것인, 바이오마커.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 바이오마커의 발현이 대조군의 기준치와 비교하여 증가되면, 암의 임상적 예후(prognosis)가 불량한 것인, 바이오마커.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 예후가 불량한 것은, 암의 반응률(response rate)이 감소하는 것인, 바이오마커.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 예후가 불량한 것은, 암세포의 항암제 내성이 증가된 것인, 바이오마커.
  10. GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 유전자의 발현항을 측정하는 제제는, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍; 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 쌍; 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머 쌍; 서열번호 17 및 서열번호 18의 프라이머 쌍; 서열번호 19 및 서열번호 20의 프라이머 쌍; 서열번호 21 및 서열번호 22의 프라이머 쌍; 서열번호 23 및 서열번호 24의 프라이머 쌍; 서열번호 25 및 서열번호 26의 프라이머 쌍; 서열번호 27 및 서열번호 28의 프라이머 쌍; 서열번호 29 및 서열번호 30의 프라이머 쌍; 서열번호 31 및 서열번호 32의 프라이머 쌍; 서열번호 33 및 서열번호 34의 프라이머 쌍; 서열번호 35 및 서열번호 36의 프라이머 쌍; 서열번호 37 및 서열번호 38의 프라이머 쌍; 서열번호 39 및 서열번호 40의 프라이머 쌍; 서열번호 41 및 서열번호 42의 프라이머 쌍; 서열번호 43 및 서열번호 44의 프라이머 쌍; 및 서열번호 45 및 서열번호 46의 프라이머 쌍;으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머 쌍인 것인, 조성물.
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 암은 방광암, 유방암, 교모세포종, 전립선암, 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 흉선종, 중피종, 식도암, 위암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암, 신장암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 및 피부암으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 조성물.
  13. 제 10항의 조성물을 포함하는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측용 키트.
  14. 개체로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계;
    상기 분리된 생물학적 시료에서 13항의 키트를 이용하여, GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    상기 유전자의 발현 수준을 대조군의 기준치와 비교하는 단계;를 포함하는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 유전자의 발현이 대조군의 기준치와 비교하여 증가되면, 암의 반응률(response rate)이 감소하는 것으로 판단하는 것인, 방법.
  16. 제 14항에 있어서,
    상기 유전자의 발현이 대조군의 기준치와 비교하여 증가되면, 암의 항암제 내성이 증가한 것으로 판단하는 것인, 방법.
  17. 제 14항에 있어서,
    상기 유전자의 발현이 대조군의 기준치와 비교하여 증가되면, 암세포의 성장, 침습(invasion) 또는 이동(migration)이 증가하는 것으로 판단하는 것인, 방법.
  18. 제 14항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 및 소변으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
  19. 개체로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계;
    상기 분리된 생물학적 시료에 후보물질을 처리하는 단계;
    상기 후보물질이 처리된 생물학적 시료에서 GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    상기 유전자의 발현 수준을 대조군의 기준치와 비교하는 단계;를 포함하는 항암제의 스크리닝 방법.
  20. 제 19항에 있어서,
    상기 유전자의 발현이 대조군의 기준치와 비교하여 저발현 되면, 항암효과가 있는 것으로 판단하는 것인, 방법.
  21. 제 20항에 있어서,
    상기 항암 효과는, 암의 반응률(response rate)이 증가하는 것인, 방법.
  22. 제 20항에 있어서,
    상기 항암 효과는, 암세포의 성장, 침습(invasion) 또는 이동(migration)이 감소하는 것인, 방법.
  23. 제 20항에 있어서,
    상기 항암 효과는, 암세포의 항암제 내성이 감소하는 것인, 방법.
  24. GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자를 포함하는 항암제 약물내성을 가지는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측을 위한 바이오마커.
  25. GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 항암제 약물 내성을 가지는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물.
  26. GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 항암제 약물 내성을 가지는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물.
  27. 개체로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계;
    상기 분리된 생물학적 시료에서 26항의 키트를 이용하여, GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    상기 유전자의 발현 수준을 대조군의 기준치와 비교하는 단계;를 포함하는 항암제 약물 내성을 가지는 암의 진단, 전이 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  28. 개체로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계;
    상기 분리된 생물학적 시료에 후보물질을 처리하는 단계;
    상기 후보물질이 처리된 생물학적 시료에서 GATA3, FOXA1, RASSF5, PTPN6, TRNP1, APOBEC3D, APOBEC3G, ABL1, ABL2, CACNA2D1, JUN, GNG4, NGF, MYC, MAP4K4, STC1, FOXD1, FOXC2, TGFB1, TGFB3, NOG, SMAD9 및 NT5E로 이루어진 군에서 선택된 유전자의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    상기 유전자의 발현 수준을 대조군의 기준치와 비교하는 단계;를 포함하는 항암제 약물 내성을 가지는 암의 치료제 스크리닝 방법.
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