KR20050020950A

KR20050020950A - 에모딘을 유효성분으로 하는 암 예방 및 치료용 약제학적조성물

Info

Publication number: KR20050020950A
Application number: KR1020040064989A
Authority: KR
Inventors: 이동웅; 김기권
Original assignee: 주식회사 선양; 이동웅
Priority date: 2003-08-18
Filing date: 2004-08-18
Publication date: 2005-03-04
Also published as: KR100623436B1

Abstract

본 발명은 산모근 유래의 에모딘(emodin)을 유효성분으로 하는 암 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 에모딘은 우수한 암 치료효과와 함께 암을 예방할 수 있는 항돌연변이효과를 동시에 가지고 있어 암 치료제 및 암 예방제로서 사용될 수 있으며, 특히 기존 항암제와 병용 투여시 기존 항암제의 독성을 경감시키는 효과가 있다.

Description

에모딘을 유효성분으로 하는 암 예방 및 치료용 약제학적 조성물{Pharmaceutical composition containing emodin for preventing and treating cancer from Rumex acetosa L }

본 발명은 산모근(Rumex acetosa L.)으로부터 분리한 에모딘을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 산모근 유래의 에모딘이 항암 효과와 암의 유발원인의 하나인 돌연변이를 억제하는 효과가 우수할뿐만 아니라 기존 항암제와 병용투여시 기존 항암제의 독성을 경감시키는 사실을 확인하고, 이를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

암은 여러 가지 원인에 의해 유전체에 변이가 축적됨으로서 발생하는 질병중의 하나로, 이를 치료하는 방법으로는 외과적 수술, 방사선 치료, 항암물질 투여에 의한 화학 요법 등이 있다.

그러나, 이들 치료방법들은 대부분 초기 암환자나 특정암의 치료에만 국한되어 있어 암으로 인한 사망이 꾸준히 증가하고 있고, 특히 방사선 치료법이나 화학 요법은 많은 부작용을 유발하는 등의 문제점이 있다.

일례로, 난소암은 우리나라의 경우, 전체 여성암의 2.9%를 차지하며 (보건복지부, 1993년) 미국에서는 약 4%의 발병율(1994, 미국립 보건원)을 보이는 것으로 보고되어 있으나, 난소암에서 방사선치료는 효과적이지 못하기 때문에 수술 후, 화학요법제이 주로 사용되고 있기때문에, 부작용을 줄이면서 제암율을 높일 수 있는 새로운 항암제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

이와 같은 문제점을 해결하기 위해, 최근에는 종래 천연물, 특히 식물생약으로부터 항암제를 개발하려는 연구가 이루어지고 있다.

그 중, 주목나무에서 분리한 택솔(Taxol; 파클리탁셀)이 항암제로 많이 알려져 있으며, 주로 난소암 치료제로 많이 사용되고 있다.

택솔은 암 세포내에서 염색체를 포함하는 여러 가지 물질의 운반과 세포의 골격을 유지시키는데 관여하는 미세소관(microtubule)과 결합하고, 암세포의 염색체 이동를 방해하여 암세포를 사멸시키는 활성기작을 가지는데, 신체 내 다른 정상세포에도 작용하기 때문에 다른 질환을 유발할 수 있으며, 물에 대한 용해도가 낮아서 독성 및 부작용이 심각한 것이 문제점으로 지적되고 있다.

한편, 본 발명에서 이룩한 에모딘의 난소암 치료효과는 난소암을 유발시킨 동물실험을 통해서 확인된 것으로서 이에 관한 기존 연구보고는 아직 없으며 항돌연변이 효과의 경우, 일부 보고는 있으나 연구가 매우 미흡한 실정이다.

에모딘에 대한 연구의 구체적인 예를 들면 다음과 같다.

에모딘을 난소암 치료제인 카보플라틴과 함께 난소암 세포와 반응시키면 암세포 저해효과는 증강되지 않았으나, 에토포사이드나 노보비오신과 함께 사용했을 경우에는 그 약효가 증강되었다는 보고가 있으며(Cancer Research 59, 1999년, Jan G. Hengstler 등, Contribution of c-erbB-2 and topoisomerase II to chemoresistance in ovarian cancer, pp. 3206-3214), 에모딘을 단독으로 사용해도 유방암 세포의 성장을 저해하는 효과가 있다고 알려져 있다(Cancer Research 55, 1995년, Lisha Zhang 등, Supressed transformation and induced differentiation of HER-2/neu-overexpressing breast cancer cells by emodin, pp. 3890-3896). 또 에모딘(emodin)은 카제인 단백질 인산화 효소Ⅱ의 강력한 억제제로 자궁암 세포의 성장억제작용이 있는 것으로도 알려져 있다(대한민국 특허등록 제 0221762호).

또한, 에모딘은 약한 백혈병 암세포 저해효과가 있으며 그 합성유도체들중에서 강한 혈액암 저해효과가 있는 물질을 탐색한 보고가 있다(Journal of Medicinal Chemistry 31, 1988년, M. Koyama 등, Novel type of potential anticancer agents derived from chrysophanol and emodin. Some structure-activity relationship studies, pp. 283-284; 32, 1989년, M. Koyama 등, Intercalating agents with covalent bond forming capability. A novel type of potential anticancer agents. 2. Derivatives of chrysophanol and emodin, pp. 1594-1599).

한편, 에모딘의 항돌연변이 효과와 관련된 연구에서는 여러 종의 살모넬라 TA 균주 가운데 TA 1573 균주에 대해서만 S-9 혼합물(mixture) 사용시 돌연변이 활성을 나타내며 S-9 혼합물 미사용시와 다른 균주에 대해서는 이러한 돌연변이 활성이 없는 것으로 보고되었다(Applied and Environmental Microbiology 37, 1979년, F. Wehner 등, Mutagenicity of the mycotoxin emodin in the Salmonella/microsome system, pp. 658-660).

그러나, 에모딘이 각종 돌연변이원 존재하에서 항돌연변이 활성을 나타내는지는 밝혀진 바 없었으며, 기존의 에모딘에 대한 연구결과를 종합하면, 에모딘이 난소암 치료 및 예방효과가 있는지에 대해서는 확인할 수 없었다.

이에, 본 발명의 목적은 종래 알려진 항암제들보다 항암효과가 우수하면서 항돌연변이 효과도 가진 생약 성분을 찾고자 연구를 거듭한 결과, 산모근(Rumex acetosa L.)의 염화메틸렌 추출물로부터 우수한 항암 효과 및 항돌연변이 효과를 갖는 성분을 분리하고 구조를 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 암을 치료할 수 있으면서 동시에 예방할 수 있는 생약성분을 함유한 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 난소암을 치료할 수 있으면서 동시에 예방할 수 있는 생약성분을 함유한 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 폐암, 흑색종, 중추신경암 및 직장암을 치료할 수 있으면서 동시에 예방할 수 있는 생약성분을 함유한 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 기존 난소암 치료제와 병용투여함으로써 기존 항암제의 독성을 크게 경감시키면서 항암효과를 유지시킬 수 있는 암 세포 사멸 또는 증식을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 산모근으로부터 암을 치료할 수 있으면서 동시에 예방할 수 있는 생약성분을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위해서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 하기 화학식 1로 표시되는 에모딘을 암 예방 및 치료하기에 유용한 양으로 함유함을 특징으로 한다.

[화학식 1]

또한, 다른 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 사용하여 암 세포 사멸 또는 증식을 억제하는 방법을 제공한다.

또한, 또 다른 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 산모근으로부터 에모딘의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

산모근(학명: Rumex acetosa)은 우리나라 각지의 산야에 자생하는 마디풀과(polygonaceae)에 속하는 다년초인 수영의 뿌리를 말한다.

어린 잎과 줄기는 식용으로 사용되고, 뿌리는 약용으로 사용되어 왔다. 수영은 해열, 지갈, 정혈, 수렴, 지출혈, 피부병, 토혈, 하혈, 옴, 버짐, 이질(이상 아세아생약도감, p. 149, 육창수저, 경원출판사, 1997년), 산후풍, 신경통, 관절염(이상 신약본초, p. 880, 동천출판사, 1999년), 해열, 이뇨, 경혈, 지갈, 토혈, 변혈, 소갈(이상 천연약물대사전, 하권, p. 125, 김재길저, 남산당, 1984년)등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명은 상기 효능을 갖는 산모근을 염화메틸렌으로 추출하여 얻어진 추출물이 항암효과를 가지며, 암의 원인인 돌연변이를 억제할 수 있다는 것을 발견하고, 이로부터 4종의 유효성분을 분리하여 그 중 가장 강력한 성분인 에모딘을 함유하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에서 에모딘을 유효성분으로 함유하는 상기 약제학적 조성물은 난소암, 폐암, 흑색종, 중추신경암 및 직장암을 예방 및 치료할 수 있다.

그리고, 본 발명에 의한 조성물은 돌연변이를 억제하는 특성을 가진다.

또한, 본 발명에 따른 에모딘은 택솔 또는 택솔 유도체과 병용하면, 기존 택솔의 부작용을 현저히 경감시키면서 항암효과는 유지되는 특성을 가진다.

이때, 상기 택솔 유도체는 공지된 10-데아세틸 바카틴(10-deacetyl baccatin)III, 바카틴 III, 10-데아세틸 택솔, 세팔로만닌 및 7-에피-10-데아세틸 택솔으로 이루어진 군에서 선택된 택솔 유도체를 사용할 수 있으며, 택솔의 유효 효과가 나타나는 유도체라면 어떠한 것이라도 사용이 무방하다.

그리고, 본 발명에서 사용된 산모근유래의 에모딘은 산모근을 그늘에서 충분히 말린 후, 분쇄하여 분말화하는 단계; 산모근 분말에 메탄올과 물의 혼합물을 부가한 후, 가열 추출하여 물 추출물을 얻는 단계; 물 추출물에 다시 물과 헥산을 부가한 후 진탕시켜 수층을 분리하는 단계; 수층에 염화메틸렌을 부가한 후 진탕시켜 염화메틸렌층을 분리하는 단계; 염화메틸렌층을 진공감압농축기로 농축하여 염화메틸렌을 제거한 다음, 건조시켜 염화메틸렌 분획을 얻는 단계; 및 염화메틸렌 분획을 염화메틸렌과 메탄올의 9 대 1 혼합용매를 분리용매로 사용하여 실리카겔 크로마토그래피하는 단계에 의해 얻어진다.

한편, 본 발명의 약제학적 조성물에 있어서, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

그리고, 본 발명의 약제학적 조성물에서 에모딘의 유효량은 투여경로, 제형, 사용하는 목적, 환자의 질환의 정도등에 따라 광범위한 범위 내에서 결정될 수 있다. 그러나, 일반적으로 함량이 22∼26 ㎎/㎏/주(week), 바람직하게는 24 ㎎/㎏/주의 농도로 투여되도록 제형화한다.

이때, 에모딘을 상기한 범위 내로 투여하기 위한 제제는 통상의 형태를 가질 수 있으며, 예를 들면 알약 형태나 의약품 내지는 건강보조 식품의 형태로 사용할 수 있다.

또한, 이들은 경구 또는 각종의 비경구 투여 경로를 통해 암의 예방 및 치료를 위해 투여될 수 있으며, 투여 제형에 따라 적합한, 그리고 당업자에게 이미 주지되어 있으며 당업자가 용이하게 선정할 수 있는 각종의 부형제, 담체, 또는 희석제 등을 함유할 수 있다.

그리고, 본 발명의 약제학적 조성물에 택솔 또는 택솔의 유도체를 병용투여할 경우, 택솔의 병용 유효량은 종래의 투여량을 따르는 것이 바람직하나, 실제 투여량은 경구 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하기 때문에, 상기 사용 범위가 한정하는 것은 아니다.

이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

[참고예 1] 산모근의 물 추출물 제조

울산지역 일원에서 채집한 후, 동국대학교 본초학교실 강병수교수에게 확인 검증한 산모근을 바람이 잘통하는 음지에서 건조하여 수분을 제거하였다. 대한약전 시험법에 따라 통상의 분쇄기로 산모근을 분쇄하여 분말로 만든 다음, 분말 200g에 2,000㎖의 80% 메탄올(물 400㎖와 메탄올 1,600㎖의 혼합액)을 넣고 3시간 동안 중탕기로 가열 추출하였다. 그런 다음, 감압 농축기로 메탄올을 제거하고 300㎖의 물추출물을 얻었다.

[참고예 2] 산모근의 염화메틸렌 분획물 제조

상기 참고예 1의 물추출물 300㎖에 다시 물 300㎖를 가하고, 분별깔대기에 넣은 다음, 헥산 500㎖를 혼합하고 10회 강하게 진탕하였다. 1시간 방치하여 두층이 생기게 한 다음, 하층의 수층을 분리하였다. 이 수층을 다시 분별깔대기에 넣은 다음, 염화메틸렌(methylene chloride) 500㎖를 가하여 10회 강하게 진탕하였다. 1시간 방치하여 두층이 생기게 한 다음, 하층의 염화메틸렌층을 분리하였다. 염화메틸렌층을 진공감압농축기로 농축하여 염화메틸렌을 제거한 다음, 냉동건조기로 건조하여 염화메틸렌 분획물 13.1g을 얻었다.

[실시예 1] 유효성분의 분리

염화메틸렌 분획물은 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel culumn chromatography)로 성분 분리를 실시하였다. 먼저 분리 용매로서 염화메틸렌을 사용하여 성분 1과 성분 2의 혼합물을 분리하였다. 다음으로 염화메틸렌과 메탄올의 성분비가 9 : 1인 용매를 분리 용매로 사용하여 성분 3과 성분 4를 각각 분리하였다. 성분 1과 성분 2의 혼합물은 다시 석유에테르와 염화메틸렌의 혼합용매(석유에테르 : 염화메틸렌 = 1 : 1)를 사용하여 두 성분을 각각 순수하게 분리하였다. 분리된 4개의 성분의 구조를 규명하기 위하여 기기분석을 실시하였다.

[실시예 2] 유효성분의 구조분석

염화메틸렌 분획에서 분리된 4종류의 성분의 구조를 규명하기 위하여 핵자기공명분광분석(Gemini-200, Varian, USA), 질량분석(MAT95, Finnigan, Germany), 적외선분광분석(MB100-10, Bomem, Canada), 자외선분광분석(UV-2001S, Schimadzu, Japan) 등의 기기분석을 실시하고 녹는점을 측정하였다. 기기분석을 해석한 결과, 성분 1은 크리소판올 (Chrysophanol), 성분 2는 피시온(Physcion), 성분 3은 에모딘(Emodin), 성분 4는 에모딘-8-O-D-글루코피라노시드(Emodin-8-O-D-glucopyranoside)로 규명되었으며, 이 중에서 가장 강한 활성을 가진 성분 3(에모딘)의 분석 결과를 하기에 나타내었다. 에모딘의 결정은 주홍색을 띄고 있으며, 녹는점은 262∼263℃로 측정되었다.

분자식: C₁₅H₁₀O₅

핵자기공명분광분석:δH (CDCl₃+DMSO-d₆, 200 MHz)(ppm)=6.97(H-2), 7.46(H-4), 7.18(H-5), 6.57(H-7), 2.40(CH₃), 12.10-12.13(OH-1, OH-6, OH-8).

핵자기공명분광분석:δC (CDCl₃+DMSO-d₆, 50 MHz)(ppm)=162.4(C-1), 121.1(C-2), 148.2(C-3), 124.4(C-4), 109.5(C-5), 166.1(C-6), 108.7(C-7), 165.5(C-8), 190.4(C-9), 182.0(C-10), 133.4(C-4a), 110.0(C-8a), 113.8(C-9a), 135.4(C-10a), 22.3(CH₃).

녹는점(mp): 262∼263℃

적외선분광분석νmax(nujol) : 3435 (OH), 1680 (CO), 1628cm^-1(CO)

자외선분광분석λmax(logε)(CH₂Cl₂):438(3.07),288(3.24), 266(3.24), 230nm(3.25)

질량분석(m/z)(rel. int.): 270 (M^+·, 100%), 242 (M-CO, 18%), 241 (M-CHO, 24)

[실험예 1] 항암효과 측정

인체 암세포주는 한국화학연구원에서 배양중인 세포주 5종을 사용하였으며, 암세포 증식 저해효과는 미국립암센터에서 약물의 일차적 항암효과의 측정방법으로 가장 널리 사용하는 SRB 법(Sulfrhodamine B 법)(Skehan, P. 등, 1990년 : New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer drug screening. J. Natl. Cancer. Inst. 82, 1107-1112) 으로 측정하였다. 검체군의 암세포 증식율(% cell growth)는 Tz>T인 경우에는 [(T-Tz)/(C-Tz)] ×100 으로, Tz<T인 경우에는 [(T-Tz)/Tz] ×100의 수식으로 계산하였다. 이 때, C는 대조군의 세포수를, Tz는 제로 시간(zero time)의 세포수를, 그리고 T는 검체군의 세포수를 의미한다. 각각의 농도에서 측정한 검체군의 암세포증식율을 바탕으로하여 로투스 프로그램의 데이타 리그레션(data regression)을 사용하여 검체가 해당암세포의 성장을 50% 저해하는 농도 (IC₅₀)를 계산하였다.

그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

암세포주	IC₅₀(㎍/㎖)
암세포주	참고예 1(염화메틸렌분획물)	실시예 2(크리소판올)	실시예 2(피시온)	실시예 2(에모딘)	실시예 2(에모딘-8-ㅇ-β-D-글루코피라노시드)
A549(폐암)	13.17	34.76	25.16	3.32	>30.0
SK-OV-3(난소암)	13.46	7.28	22.41	2.94	>30.0
SK-MEL-2(흑색종)	18.73	5.83	26.07	3.64	>30.0
XF498(중추신경암)	18.35	>30.0	26.40	2.98	>30.0
HCT15(직장암)	17.62	>30.0	36.88	3.10	>30.0
* IC₅₀은 암세포의 증식을 50% 억제하는 농도를 의미함.

상기 표 1로부터, 본 발명의 에모딘은 인체 암세포 중에서 특히, 난소암세포에 대한 항암 효과가 우수하다는 것을 알 수 있다. 즉, 에모딘은 난소암 세포주에 대한 IC₅₀가 2.94㎍/㎖이었다.

[실험예 2] 렛트에서의 난소암 억제효과

본 발명의 에모딘은 약 205g의 평균 체중을 가진 렛트(한국실험동물개발)에게 일주일에 한번씩 2mg(10㎎/㎏)을 5개월 동안 경구투여하여, 그 효과를 대조군과 비교하여 체중변화, 난소암 발생률, 난소암의 육안 및 조직학적 차이, 및 난소암의 예방 및 치료 효과 정도를 분석하였다.

(1) 전처리시의 체중변화에 따른 난소암 예방 효과

난소암 유발과 동시에 에모딘을 투여하여, 에모딘의 암발생 억제효과를 체중의 변화로 관찰하였는데, 실험기간중의 체중변화는 도 1과 같다. 실험 시작시 평균체중은 205.5g이었으며, 시간이 경과함에 따라 에모딘 투여군은 체중이 증가하였으나 에모딘을 투여하지 않은 군은 체중이 감소하였다.

따라서, 에모딘 전처리 기간중 발암제에 의한 체중감소를 억제하는 것으로 나타났다.

(2) 전처리시의 난소암 발생률

에모딘을 투여하면서 난소암을 유발시켰을 경우, 실험동물 10마리 가운데 2마리는 사망하였고 생존한 8마리중 4마리에서 암이 발생하였고 나머지 4마리는 비정형적인 선증식이 관찰되었다. 대조군은 5마리만 생존하였고 이중 4마리에서 암이 발생하였으며 나머지 1마리에는 비정형적인 선증식이 관찰되었다. 암발생률은 실험군(에모딘 투여군)이 50%인데 비해 대조군은 80%로 에모딘의 암 유발 억제효과가 인정되었다.

(3) 전처리시 생성된 암의 육안 및 조직학적 양상

난소암의 평균크기는 대조군의 경우, 평균장경이 2.3±1.3cm 이었고 실험군의 경우는 1.7±0.9cm 이었다. 종양의 조직학적 형태는 실험군 및 대조군에서 모두 선암이 3예, 선암과 편평상피암이 혼합된 종양이 1예이었다.

[실험예 4] 에모딘의 난소암 치료효과

좌측 난소에 DMBA (9,10-dimethyl-1,2-benzanthracene, Sigma Chemical Co, MO, USA)를 직접 삽입하여 4개월 간 난소에 종양을 유발시킨 다음, 종양이 발생한 렛트를 대상으로 본 발명에 따른 에모딘의 효과를 분석하였다.

이때, 실험동물로 레트 40마리 중 20마리는 사망하였으며, 생존한 20마리를 대상으로 실험을 수행하였다.

그리고, 에모딘 단독 투여군과 에모딘과 택솔의 병용투여군에서 에모딘은 3mg(12mg/kg)을 1주에 두번씩 8주 동안 경구투여하였고 에모딘과 택솔 병용투여군과 택솔 단독 투여군에는 택솔 2mg(8mg/kg)을 1주에 두번씩 8주 동안 복강내 투여하여 제암효과를 상호비교하였다.

(1) 실험기간중의 체중변화

암 발생 후 전체 실험기간의 체중변화는 도 2와 같다. 약물비투여군의 경우, 실험시작 전 평균체중이 약 275g이었으며, 실험이 완료된 8주 후에는 287.5g까지 증가하였다. 그리고, 에모딘 단독 투여군은 약물투여 시작 전 평균체중이 약 262g 이었으나 8주째에는 270g으로 증가하였다. 그러나 에모딘과 택솔의 병용투여군과 택솔 단독 투여군에는 체중이 감소하였으며 이는 택솔의 부작용으로 판단된다.

(2) 단독투여와 병용투여시의 치료효과 비교

암 발생 후, 암의 평균크기는 평균장경이 1.2±0.7cm였다. 종양이 발생한 20마리를 대상으로 약물투여를 실시하였으며 실험결과를 하기 표 2에 나타내었다. 약물비투여군의 경우 약물투여 전 종양크기가 평균1.5±1.1cm이었으나 약물투여 후에는 4.0±2.1cm으로 2.5cm 증가하였다(도 3 참조). 그리고, 에모딘 단독 투여군(도 4 참조)과 병용투여군(도 5 참조)의 경우에는 각각 평균 0.1cm, 0.4cm씩 증가하였으며, 택솔 단독 투여군의 경우에는 크기가 0.5cm 감소하여 약물비투여군에 비해 크기가 적게 증가하거나 감소하였고, 약물비투여군은 약물투여한 3개의 실험군에 비해 통계학적으로 유의하게 크기가 증가하였다(p<0.05).

그러나 나머지 택솔 단독 투여군, 에모딘 단독 투여군 그리고 병용투여군의 상호 간에는 크기변화의 차이에서 통계적 유의성은 없었다(p>0.05).

(3) 단독투여와 병용투여시의 사망률 비교

약물비투여군과 택솔 단독 투여군, 에모딘 단독 투여군 그리고 병용투여군의 생존율을 비교해보면, 하기 표 2와 같이, 약물비투여군의 경우 실험기간 8주동안 생존한 수가 100%였고 에모딘 단독 투여군의 경우도 100%인 것에 비해 택솔투여군과 병용투여군의 생존율은 각각 0%, 50%로 나타났다.

이는 에모딘 단독 투여군에 비해 택솔투여군의 사망률이 높은 것으로 보아, 택솔이 에모딘에 비해 항암효과는 높지만, 독성 및 부작용이 높다는 것을 입증할 수 있었다.

	투여전종양크기(㎝)	투여후종양크기(㎝)	종양크기변화(㎝)	사망률(%)
약물비투여군	1.5±1.1	4.0±2.1	2.5^*	0
택솔 단독 투여군	1.0±0.6	0.5±0.1	-0.5^*	100
에모딘+택솔 병용 투여군	1.1±0.8	1.2±0.8	0.1^*	50
에모딘 단독 투여군	1.1±0.7	1.5±2.0	0.4^*	0

(Kruskal-Wallis test or Chi-square test* p〈0.05)

따라서, 본 발명의 에모딘은 난소암 유발시, 정상적인 활동을 유지하면서 난소암을 억제하는 것으로 확인할 수 있었으며, 이를 사람에게 적용할 경우, 일인 기준으로, 에모딘을 일주일당 22∼26㎎/㎏, 바람직하게는 24㎎/㎏의 농도로 경구투여되도록 제형화할 수 있을 것으로 예상된다.

또한, 본 발명의 에모딘과 함께 택솔 또는 택솔의 효과를 나타내는 택솔 유도체를 병용하면, 택솔의 부작용은 상당히 경감시키면서 항암효과는 상승시키는 것을 알 수 있었다.

(4)배양한 난소암 세포에 미치는 에모딘의 영향

에모딘을 처리한 난소암 세포와 처리하지 않은 난소암 세포를 배양한 결과, 에모딘을 처리한 경우 난소암 세포에 괴사가 일어남을 알 수 있었다(도 6의 B 참조).

[실험 예 4] 항 돌연변이 효과 측정

4-1. 에임스 시험(Ames test)

히스티딘 요구성 돌연변이체인 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) TA100과 TA98(한국과학기술원 생명공학 연구소의 유전자 은행 ;Korea Collection for Type Cultures)에서 분양 받은 것을 계대 배양한 것)를 사용하여 시험하였다. 음성 대조군으로는 시료를 녹인 용매인 DMSO(dimethylsulfoxide)를 사용했고, 양성대조군으로는 돌연 변이원인 NPD(4-nitro-o-phenylene- diamine)와 NaN₃(sodium azide)를 사용하여 돌연 변이율을 상호 비교하였다.

한편, 실험전에 상기 균주들은 정기적으로 히스티딘 요구성 deep rough character, UV 감수성 및 R factor 존재 등의 유전형질을 확인한 후 시험 균주로 사용하였다.

항 돌연변이 실험을 위한 배지, 필요한 시약의 조제는 Maron과 Ames의 방법에 따라 행하였다.

즉, 하루밤 배양된 균주(1∼2×10⁹ cells/㎖) 0.1㎖, 돌연변이원0.1㎖ (NPD는 10㎍, NaN₃는 1㎍ 함유), 인산나트륨 완충액 0.5㎖와 실시예 2의 각 성분 100㎍/플레이트를 시험관에 첨가한 후, 가볍게 와류시키고, 37℃ 에서 20분 동안 예비 배양하였다. 45℃ 에 보관중이던 탑 아가(top agar) 2㎖씩을 각각 튜브에 붓고, 3초간 와류시킨 후, 최소 글루코스 아가 플레이트(minimal glucose agar plate)에 도말한 다음, 37℃ 에서 48시간 동안 배양하고, 복귀돌연변이수를 계수하였다. 그 결과를 도 7과 도 8에 나타내었다.

도 7로부터, 직접돌연변이 유발원인 NPD에 대해서는 에모딘(성분 3)은 NPD에 의한 복귀돌연변이수를 71.6%만큼 줄여 강한 항돌연변이 활성을 나타낸다는 것을 알 수 있다. 또, 도 8로부터는 다른 돌연변이원인 NaN₃에 대해서도 에모딘(성분 3)이 NaN₃에 의한 복귀돌연변이수를 53.2%만큼 줄여 양호한 항돌연변이 활성을 나타냄을 알 수 있다.

4-2. SOS 크로모테스트(Chromotest)

산모근에서 분리한 성분의 항돌연변이 효과를 보다 확실히 확인하기 위하여, MNNG(N-methyl-N'-nitrosoguadine)와 NQO(4-nitroquinoline-1- oxide)를 돌연변이원으로 하여 SOS 크로모테스트를 하기와 같은 방법으로 실시하였다.

배양된 0.5㎖의 E.coli PQ37(실험실에 보관중인 균을 계대 배양한 것)을 50㎖의 Liria Bertani 배지 (조성: 트립톤 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 10g, 증류수 1.0ℓ, pH 7.0)에 접종하여 37℃에서 4시간 동안 진탕배양하였다(O.D =0.4∼0.8). 이 배양액 600㎕, 돌연변이원 MNNG 또는 NQO 각 20㎕(1㎍/assay) 및 각 성분 10㎍을 시험관에 넣어 SOS반응을 유도하였다. 37℃에서 2시간 동안 정치한 후, β-갈락톡시다아제와 알카리성 포스파타아제의 효소활성을 측정하였다.

β-갈락톡시다아제 활성은 1.8㎖의 B 완충액(조성: Na₂HPO₄ 5.5g, KCl 0.75g, MgSO₄ 0.25g, SDS 1.0g, β-머캅토에탄올 2.7㎖, 증류수 1,000㎖, pH 7.0)을 넣어, 37℃에서 5분간 정치하여 온도를 균일화시킨 다음, 0.4㎖의 o-니트로페닐-β-갈락톡시다아제(ONGP) 용액을 첨가하여 10분간 발색을 유지하였다. 그리고, 1.4㎖의 2.0M Na₂CO₃용액을 첨가하여 반응을 시킨 후, 420nm에서의 흡광도를 측정하였다.

알카리성 포스파타아제 활성은 상기 β-갈락톡시다아제의 활성 측정 방법에서, B 완충액 대신 P 완충액(조성: tris-base 121 g, SDS 1.0g, 증류수 1,000㎖, pH 8.8)을, ONGP 용액 대신에 p-니트로페닐-포스포갈락톡시다아제 용액을 첨가하여, 활성을 측정하였다. 효소반응의 정지를 위하여 0.7㎖의 2.5M HCl를 첨가한 후 5분간 반응을 정지하고, 0.7㎖의 2.0M Tris-HCl 완충액를 첨가하였다.

각 효소의 활성은 「1000×A₄₂₀/t」의 식을 사용하여 측정하였고(식중, A₄₂₀은 420nm에서의 흡광도를, t는 반응시간(분)을 나타낸다), 효소활성 비율(induction factor)은 β-갈락톡시다아제 활성을 알카리성 포스파타아제 활성으로 나누어 계산하였다. 그 결과를 도 9과 도 10에 나타내었다.

도 9와 도 10으로부터, 에모딘(성분 3)이 가장 낮은 효소활성 비율값을 나타낸다는 것을 알 수 있다.

즉, 산모근의 성분인 에모딘은 돌연변이를 효과적으로 억제하므로, 이로부터 본 발명에 따른 에모딘은 암의 예방효과가 우수하다는 것을 알 수 있었다.

상기에서 설명한 바와 같이, 산모근(Rumex acetosa L.)의 유효성분인 에모딘은 암을 치료할 수 있으며, 동시에 돌연변이의 억제에 의해 암을 예방할 수 있으므로, 항암제 및 암 예방제로 유효하게 사용될 수 있다.

또한, 기존 항암제와 병용 투여시 기존 항암제의 독성은 경감시키고 항암효과는 유지되는 효과가 있다.

도 1은 약물비투여군과 에모딘 전처리군의 체중 변화를 보여주는 그래프이고,

도 2는 암발생 후 에모딘 단독, 택솔 단독 및 에모딘과 택솔의 병용 투여군의 체중 변화를 보여주는 그래프이고,

도 3은 약물비투여군에서 종양이 커졌음을 보여주는 사진이고(A: 실험전, B: 실험완료 후),

도 4는 에모딘 단독 투여군에서의 난소종양 크기가 작아진 것을 보여주는 사진이고(A: 투여전, B: 투여후),

도 5는 에모딘과 택솔의 병용 투여군에서 난소종양 크기가 작아진 것을 보여주는 사진이고(A: 투여전, B: 투여후),

도 6은 에모딘을 처리하지 않은 암세포(A)와 에모딘으로 처리하여 괴사된 암세포(B)의 사진으로, 화살표 부분이 괴사된 암세포 부분이고,

도 7은 살모넬라 티피뮤리움 TA98에서 돌연변이원 NPD에 대한 각 성분의 항돌연변이 효과를 보여주는 막대그래프로, S는 블랭크, 1은 크리소판올, 2는 피시온, 3은 에모딘, 4는 에모딘-8-O-D-글루코피라노시드이고,

도 8은 살모넬라 티피뮤리움 TA100에서 돌연변이원 NaN₃에 대한 각 성분의 항돌연변이 효과를 보여주는 막대그래프이고,

도 9는 대장균 PQ37에서 돌연변이원 MNNG에 대한 각 성분의 항돌연변이 효과를 보여주는 막대그래프이고,

도 10은 대장균 PQ37에서 돌연변이 NQO에 대한 각 성분의 항돌연변이 효과를 보여주는 막대그래프이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 에모딘을 유효성분으로 하는 암 예방 및 치료용 약제학적 조성물.

[화학식 1]
제 1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 난소암, 중추신경암, 직장암, 폐암 또는 흑색종에 사용되는 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 돌연변이를 억제하는 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
제 1항 기재의 약제학적 조성물을 사용하여 암 세포 사멸 또는 증식을 억제하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물에 택솔 또는 택솔 유도체를 병용하는 것을 특징으로 하는 암 세포 사멸 또는 증식을 억제하는 방법.
(a) 산모근을 그늘에서 충분히 말린 후, 분쇄하여 분말화하는 단계;

(b) 상기 산모근 분말에 메탄올과 물의 혼합물을 부가한 후, 가열 추출하여 물 추출물을 얻는 단계;

(c) 상기 물 추출물에 다시 물과 헥산을 부가한 후 진탕시켜 수층을 분리하는 단계;

(d) 상기 분리한 수층에 염화메틸렌을 부가한 후 진탕시켜 염화메틸렌층을 분리하는 단계;

(e) 상기 분리된 염화메틸렌층을 진공감압농축기로 농축하여 염화메틸렌을 제거한 다음, 건조시켜 염화메틸렌 분획을 얻는 단계; 및

(f) 상기 염화메틸렌 분획을 염화메틸렌과 메탄올의 9 대 1 혼합용매를 분리용매로 사용하여 실리카겔 크로마토그래피하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 화학식 1로 표시되는 에모딘의 제조방법.