KR20030023111A

KR20030023111A - 수영의 염화메틸렌 추출물을 함유하는 암 치료 및 예방용약제학적 조성물

Info

Publication number: KR20030023111A
Application number: KR1020010056081A
Authority: KR
Inventors: 이동웅; 유시용; 이남재; 임재철
Original assignee: 주식회사 선양; 이동웅
Priority date: 2001-09-12
Filing date: 2001-09-12
Publication date: 2003-03-19
Also published as: KR100422094B1

Abstract

본 발명은 수영(Rumex acetosa L.)의 염화메틸렌 추출물을 유효성분으로 함유하여 암을 치료 및 예방할 수 있는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 수영의 염화메틸렌 추출물은 우수한 항암효과를 나타내면서, 동시에 암의 유발 원인인 돌연변이를 억제하는 효과를 가지므로, 암 치료제 및 암 예방제로서 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

수영의 염화메틸렌 추출물을 함유하는 암 치료 및 예방용 약제학적 조성물{A composition having an effect of curing and preventing cancer by containing a methylenechloride extract of Rumex acetosa L.}

본 발명은 수영(Rumex acetosa L.)의 염화메틸렌 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 치료 및 예방용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 수영의 염화메틸렌 추출물이 항암 효과가 우수하고, 아울러, 암의 유발원인 중에 하나인 돌연변이를 억제하는 효과가 우수하다는 것을 확인하고, 이를 유효성분으로 함유하는 암 치료 및 예방용 약제학적 조성물을 제공하는 것에 관한 것이다.

암은 문명의 발달과 더불어 증가하고 있는 질병중의 하나로, 이를 치료하는 방법으로는 외과적 수술, 방사선 치료, 항암물질 투여에 의한 화학 요법 등이 있다.

그러나, 이들 치료방법들은 대부분 초기 암환자나 특정암의 치료에만 국한되어 있어 암으로 인한 사망이 꾸준히 증가하고 있고, 특히 방사선 치료법이나 화학 요법은 많은 부작용을 유발하는 등의 문제점이 있다.

따라서, 부작용을 줄이면서 제암율을 높일 수 있는 항암제의 개발이 요구되고 있다.

이 때문에 종래 천연물, 특히 생약재로부터 항암제를 개발하려는 시도가 이루어지고 있으며, 구체적인 예를 들면 다음과 같다.

즉, 단삼(Salvia miltiorrhiza)의 염화메틸렌 분획에서 분리한 18종의 테르펜류 화합물이 항암효과를 나타내며, 암세포에 따라 약 20~500 ㎍/㎖정도의 ED₅₀값을 갖는 다는 보고가 있었고(Planta Medica 63, 1997년, Georg Thieme Verlag, 독일, S.Y. Ryu, C.O. Lee, S.U. Choi, In vitro cytotoxicity of tanshinones from Salvia miltiorrhiza, pp. 339-342), 일목련(Magnolia obovata)의 에틸아세테이트 분획에서 분리한 6종의 다양한 구조를 갖는 화합물도 항암효과를 나타내며, 암세포에 따라 12.5~20.2 ㎍/㎖정도의 ED₅₀값을 갖는 다는 보고가 있었다(Planta Medica 65, 1999년, Georg Thieme Verlag, 독일, Y.K. Kim, S.Y. Ryu, Cytotoxic components from stem bark of Magnolia obovata, pp. 291-292).

또한, 아르테미시아 프린셉스(Artemisia princeps)의 염화메틸렌분획에서 분리한 8종의 다양한 구조를 갖는 화합물이 항암효과는 나타내며, 암세포에 따라 28.5~45.8 ㎍/㎖정도의 ED₅₀값을 갖는 다는 보고가 있었다(Planta Medica 63, 1997년, Georg Thieme Verlag, 독일, S.Y. Ryu, J.O. Kim, S.U. Choi, Cytotoxiccomponents of Artemisia princeps, pp. 384-385).

그러나, 상기와 같은 종래의 생약 추출물 항암제들은 생약추출물이기 때문에 부작용을 줄일 수는 있었지만, 항암효과가 약하여 암의 치료에 효과적이지 못하였다. 더구나, 이러한 종래의 생약추출물 항암제의 경우에는 암의 원인인 돌연변이를 억제할 수 있는지에 대한 연구가 이루어지지 않았기 때문에, 이들이 암을 예방할 수 있는지에 대해서는 확인할 수 없었다.

이에, 본 발명자들은 종래 알려진 생약추출물 항암제들보다 항암효과가 우수하면서 항돌연변이 효과도 가진 생약 성분을 찾고자 연구를 거듭한 결과, 수영(Rumex acetosa L.)의 염화메틸렌 추출물이 우수한 항암 효과 및 항돌연변이 효과를 갖는 다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 암을 치료할 수 있으면서 동시에 암을 예방할 수 있는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

도 1은 돌연변이원 MNNG에 대한 각각의 수영 추출물의 항돌연변이 효과를 나타낸 그래프이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 수영(Rumex acetosa L.)의 염화메틸렌 추출물을 암을 치료 및 예방하기에 유효한 양으로 함유함을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

수영(학명:Rumex acetosa)은 우리나라 각지의 산야에 자생하는 마디풀과(polygonaceae)에 속하는 다년초로, 길이는 30~80㎝정도 되며, 땅속줄기는약간 크고, 줄기에 능선이 있다. 근생엽은 밀생, 경생엽은 호생, 잎자루는 긴 창 모양이고, 길이가 5~10㎝정도로 생겼는데 위쪽으로 갈수록 짧아진다. 암수 딴그루 식물로 원추화서에서 윤생, 연녹색 또는 녹자색을 띤다. 수꽃은 꽃받침 6장, 수술이 6개이고 암꽃은 꽃받침이 6장, 암술대가 3갈래이며 열매는 수과, 세모진 타원형, 흑갈색, 황백색으로 3개의 능선이 있고, 날개 모양이다. 개화기는 5~6월까지이고, 결실기는 8~9월이다. 어린 잎과 줄기는 식용으로 사용되고, 뿌리는 약용으로 사용되어 왔다. 수영은 해열, 지갈, 정혈, 수렴, 지출혈, 피부병, 토혈, 하혈, 옴, 버짐, 이질(이상 아세아생약도감, p. 149, 육창수저, 경원출판사, 1997년), 산후풍, 신경통, 관절염(이상 신약본초, p. 880, 동천출판사, 1999년), 해열, 이뇨, 경혈, 지갈, 토혈, 변혈, 소갈(이상 천연약물대사전, 하권, p. 125, 김재길저, 남산당, 1984년)등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명은 상기 효능을 갖는 수영을 염화메틸렌으로 추출하여 얻어진 추출물이 항암효과를 가지며, 암의 원인인 돌연변이를 억제할 수 있다는 것을 발견하고, 이를 유효성분으로 하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에서 사용된 수영의 염화메틸렌 추출물은 채집한 수영을 그늘에서 충분히 말린 후, 분쇄하여 분말화하는 단계; 수영 분말에 메탄올과 물의 혼합물을 부가한 후, 가열 추출하여 물 추출물을 얻는 단계; 물 추출물에 다시 물과 헥산을 부가한 후 진탕시켜 수층을 분리하는 단계; 수층에 염화메틸렌을 부가한 후 진탕시켜 염화메틸렌층을 분리하는 단계; 및 염화메틸렌층을 진공감압농축기로 농축하여 염화메틸렌을 제거한 다음, 건조시켜 수영의 염화메틸렌 추출물을 얻는 단계에 의해얻어진다.

이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

[참고예 1] 수영의 물 추출물 제조

울산지역 일원에서 채집한 후, 동국대학교 한의과대학 본초학교실 강병수교수에게 확인 검증한 수영을 바람이 잘 통하는 음지에서 건조하여 수분을 제거하였다. 대한약전 시험법에 따라 통상의 분쇄기로 수영의 전초(뿌리, 잎, 줄기 모두 포함)를 분쇄하여 분말로 만든 다음, 수영 분말 200g에 2000㎖의 80% 메탄올(물 400㎖와 메탄올 1600㎖의 혼합액)을 넣고 3시간 동안 중탕기로 가열 추출하였다. 감압농축기로 메탄올을 제거하고 300㎖의 물 추출물을 얻었다.

[참고예 2] 수영의 헥산 추출물 제조

상기 참고예 1의 물추출물 300㎖에 다시 물 300㎖를 가하고, 분별깔대기에 넣은 다음, 헥산 500㎖를 혼합하고 10회 강하게 진탕하였다. 1시간 방치하여 두층이 생기게 한 다음, 상부의 헥산층을 분리하였다. 이를 진공감압농축기로 농축하여 헥산을 제거한 다음, 냉동건조기로 건조하여 헥산 추출물 11.2g을 얻었다

[실시예 1] 수영의 염화메틸렌 추출물 제조

상기 참고예 1의 물추출물 300㎖에 다시 물 300㎖를 가하고, 분별깔대기에 넣은 다음, 헥산 500㎖를 혼합하고 10회 강하게 진탕하였다. 1시간 방치하여 두층이 생기게 한 다음, 하층의 수층을 분리하였다. 이 수층을 다시 분별깔대기에 넣은 다음, 염화메틸렌 500㎖를 가하여 10회 강하게 진탕하였다. 1시간 방치하여 두층이생기게 한 다음, 하층의 염화메틸렌층을 분리하였다. 염화메틸렌층을 진공감압농축기로 농축하여 염화메틸렌을 제거한 다음, 냉동건조기로 건조하여 염화메틸렌 추출물 13.1g을 얻었다.

[참고예 3] 수영의 에틸아세테이트 추출물 제조

수층에 염화메틸렌 대신에 에틸아세테이트를 부가한다는 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 에틸아세테이트 추출물 4.3g을 얻었다.

[참고예 4] 수영의 부탄올 추출물 제조

수층에 염화메틸렌 대신에 부탄올을 부가한다는 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 부탄올 추출물 11.5g을 얻었다.

<실험예 1> 항암효과 측정

암세포주(cell line)는 한국화학연구원에서 배양중인 세포주를 사용하였으며, 세포배양은 온도 37℃, 습도 100%, CO₂농도 10%를 유지하였다. 시료투여 전일 24-웰 플레이트에 혈청 10%를 함유하는 D-MEM을 각웰마다 1.0㎖씩 넣은 다음, 배양중의 세포를 트립신처리하여 수확하여, 세포계수기(cell counter)로 세포농도를 계산하였다.

D-MEM으로 농도별로 희석하여 세포수를 달리하여 각각의 웰에 플레이팅하였다. 세포 플레이팅 18시간 후, 배지를 빨아내어 버린 후, 혈청을 함유하지 않는 D-MEM을 웰당 1.0㎖씩 넣고, 시료를 혈청을 함유하지 않는 D-MEM으로 농도별로 희석하여 각 웰에 투여하였다. 투여 4시간 후, 배지를 모두 제거한 뒤, 다시 혈청 10%를 함유하는 D-MEM을 웰당 2.0㎖씩 넣었다. 시료투여 6일 후, 배지를 모두 제거하고 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 3분간 염색하여 건조시킨 후, 해부현미경으로 관찰, 콜로니 수를 플레이팅한 세포수와 비교하여 암세포의 생존율을 계산하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

암세포주	ED₅₀(㎍/㎖)
암세포주	메탄올추출물	참고예 2(헥산추출물)	참고예 3(에틸아세테이트 추출물)	참고예 4(부탄올추출물)	실시예 1(염화메틸렌 추출물)
A549(폐암)	>200	29.14	36.51	184.62	13.17
SK-OV-3(난소암)	>200	24.66	35.49	56.22	13.46
SK-MEL-2(흑색종)	>200	34.28	35.11	143.90	18.73
XF498(중추신경암)	>200	47.07	43.64	193.67	18.35
HCT15(직장암)	>200	38.15	40.16	140.03	17.62
*ED₅₀은 암세포의 증식을 50% 억제하는 농도를 의미함.

상기 표 1로부터, 본 발명의 염화메틸렌 추출물은 인체 암세포에 대한 항암 효과가 우수하다는 것을 알 수 있다. 즉, 단삼의 염화메틸렌 분획은 A549(폐암 세포주)에 대한 ED₅₀이약 30㎍/㎖이었으며,아르테미시아 프린셉스의 염화메틸렌 분획은 암세포에 따라 ED₅₀이28.5~45.8 ㎍/㎖로서 본 발명의 조성물보다 모두 항암효과가 약하였다. 그리고, 일목련의 경우에는 ED₅₀이 폐암 18.5㎍/㎖, 난소암 20.2㎍/㎖, 흑색종 17.5㎍/㎖, 신경암 12.5㎍/㎖ 및 직장암 17.5㎍/㎖으로 암의 종류마다 상이한 것으로 보고 되어있는데, 상기한 표 1의 결과의 오차범위를 고려하여 비교했을 때, 본 발명의 수영 염화메틸렌 추출물은 폐암과 난소암에 있어서는 일목련보다 항암효과가 우수하였고, 흑색종과 직장암에서는 거의 비슷한 항암효과를, 그리고 중추신경계 암에는 다소 약한 항암효과를 나타내었다.

<실험예 2> 항 돌연변이 효과 측정

2-1. 에임스 시험(Ames test)

히스티딘 요구성 돌연변이체인 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) TA100과 TA98(한국과학기술원 생명공학 연구소의 유전자 은행 (Korea Collection for Type Cultures)에서 분양 받은 것을 계대 배양한 것)를 사용하여 시험하였다. 음성 대조군으로는 시료를 녹인 용매인 DMSO를 사용했고, 양성대조군으로는 돌연 변이원인 NPD(4-nitro-o-phenylenediamine)와 NaN₃(sodium azide)를 사용하여 돌연 변이율을 상호 비교하였다.

한편, 실험전에 상기 균주들은 정기적으로 히스티딘 요구성 deep rough character, UV 감수성 및 R factor 존재 등의 유전형질을 확인한 후 시험 균주로 사용하였다.

항 돌연변이 실험을 위한 배지, 필요한 시약의 조제는 Maron과 Ames의 방법에 따라 행하였다. 즉, 하루밤 배양된 균주(1∼2×10⁹cells/㎖) 0.1㎖, 돌연변이원 0.1㎖ (NPD는 10㎍, NaN₃는 1㎍ 함유), 인산나트륨 완충액 0.5㎖와 실시예 1의 염화메틸렌 추출물 1㎎/플레이트를 시험관에 첨가한 후, 가볍게 와류시키고, 37℃에서 20분 동안 예비 배양하였다. 45℃에 보관중이던 탑 아가(top agar) 2㎖씩을 각각 튜브에 붓고, 3초간 와류시킨 후, 최소 글루코스 아가 플레이트(minimal glucose agar plate)에 도말한 다음, 37℃에서 48시간 동안 배양하고, 복귀돌연변이수를 계수하였다. 그 결과를 표 2 및 표 3에 나타내었다.

살모넬라 티피뮤리움TA98에서 돌연변이원 NPD에 대한 각 추출물의 항돌연변이 효과

시료	복귀돌연변이/플레이트	저해율(%)
자연변이	6±1
NPD	640±24
NPD+메탄올추출물	391±37.5	39.35
NPD+헥산추출물(참고예 2)	110±107.5	83.67
NPD+에틸아세테이트 추출물(참고예 3)	590±11.5	7.96
NPD+부탄올 추출물(참고예 4)	528±14	17.66
NPD+염화메틸렌 추출물(실시예 1)	31±22	96.06

상기 표 2로부터, 직접돌연변이 유발원인 NPD에 대해서는 헥산 추출물과 염화메틸렌 추출물이 1㎎/플레이트의 농도에서 각각 83.7%와 96.1%의 항 돌연변이 활성을 나타낸다는 것을 알 수 있다.

살모넬라 티피뮤리움TA100에서 돌연변이원 NaN₃에 대한 각 추출물의 항돌연변이 효과

시료	복귀돌연변이/플레이트	저해율(%)
자연변이	150±12.5
NaN₃	287±3.5
NaN₃+메탄올 추출물	234±8.5	38.69
NaN₃+헥산 추출물(참고예 2)	244±1.5	31.39
NaN₃+에틸아세테이트 추출물(참고예 3)	237±1.5	36.50
NaN₃+부탄올 추출물(참고예 4)	275±3	8.39
NaN₃+염화메틸렌 추출물(실시예 1)	154±11	96.72

상기 표 3으로부터, 다른 돌연변이 원인 NaN₃에 대해서는 상기 표 2의 결과와 달리 염화메틸렌 추출물은 96.7%의 높은 항 돌연변이 활성을 나타내는데 비하여 헥산 추출물은 31.4%로 낮게 나타난다는 것을 알 수 있다.

2-2. SOS 크로모테스트(Chromotest)

각각의 수영 추출물의 항돌연변이 효과를 보다 확실히 확인하기 위하여, MNNG(N-methyl-N´-nitrosoguadine)를 돌연변이원으로 하여 SOS 크로모테스트를 하기와 같은 방법으로 실시하였다.

배양된 0.5㎖의 E.coli PQ37(실험실에 보관중인 균을 계대 배양한 것)을 50㎖의 Liria Bertani 배지 (조성: 트립톤 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 10g, 증류수 1.0ℓ, pH 7.0)에 접종하여 37℃에서 4시간 동안 진탕배양하였다(O.D=0.4∼0.8). 이 배양액 600㎕, 돌연변이원(MNNG) 10㎕ 및 염화메틸렌 추출물 10㎕를 시험관에 넣어 SOS반응을 유도하였다. 37℃에서 2시간 동안 정치한 후, 알카리성 포스파타아제 효소활성을 측정하였다.

β-갈락톡시다아제 활성은 1.8㎖의 B 완충액(조성: Na₂HPO₄5.5g, KCl 0.75g, MgSO₄0.25g, SDS 1.0g, β-머캅토에탄올 2.7㎖, 증류수 1,000㎖, pH 7.0)을 넣어, 37℃에서 5분간 정치하여 온도를 균일화시킨 다음, 0.4㎖의o-니트로페닐-β-갈락톡시다아제(ONGP) 용액을 첨가하여 10분간 발색을 유지하였다. 1.4㎖의 2.0M Na₂CO₃용액을 첨가하여 반응을 시킨 후, 420nm에서의 흡광도를 측정하였다.

알카리성 포스파타아제 활성은 B 완충액 대신 P 완충액(조성: tris-base 121 g, SDS 1.0g, 증류수 1,000㎖, pH 8.8)을, ONGP 용액 대신에 p-니트로페닐-포스포갈락톡시다아제 활성을 측정하였다. 효소반응의 정지를 위하여 0.7㎖의 2.5M HCl를 첨가한 후 5분간 반응을 정지하고, 0.7㎖의 2.0M Tris-HCl 완충액를 첨가하였다.

각 효소의 활성은 「1000×A₄₂₀/t」의 식을 사용하여 측정하였고(식중, A₄₂₀은 420nm에서의 흡광도를, t는 반응시간(분)을 나타낸다), 효소활성 비율(induction factor)은 β-갈락톡시다아제 활성을 알카리성 포스파타아제 활성으로 나누어 계산하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1로부터, 상기 에임스 시험과 동일하게 염화메틸렌 추출물이 가장 낮은 효소활성 비율값을 나타낸다는 것을 알 수 있다.

즉, 수영의 염화메틸렌 추출물은 돌연변이를 효과적으로 억제하므로, 이로부터 본 발명에 따른 수영의 염화메틸렌 추출물은 암의 예방효과가 우수하다는 것을 것을 알 수 있다.

본 발명은 상기한 수영의 염화메틸렌 추출물을 항암의 치료 및 암의 예방에 유효한 양으로 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약제학적 조성물에서 수영의 염화메틸렌 추출물의 유효량은 투여경로, 제형, 사용하는 목적, 환자의 질환의 정도등에 따라 광범위한 범위 내에서 결정될 수 있다. 그러나, 일반적으로 추출물이 0.1-0.3㎎/㎏/day, 바람직하게는 0.2㎎/㎏/day의 농도로 투여되도록 제형화될 수 있다.

수영의 염화메틸렌 추출물을 상기한 범위 내로 투여하기 위한 제제는 통상의형태를 가질 수 있으며, 예를 들면 알약 형태나 드링크제, 의약품 내지는 건강보조 식품의 형태로 사용할 수 있다. 이들은 경구 또는 각종의 비경구 투여 경로를 통해 암의 예방 및 치료를 위해 투여될 수 있으며, 투여 제형에 따라 적합한, 그리고 당업자에게 이미 주지되어 있으며 당업자가 용이하게 선정할 수 있는 각종의 부형제, 담체, 또는 희석제 등을 함유할 수 있다.

상기에서 설명한 바와 같이, 수영(Rumex acetosa L.)의 염화메틸렌 추출물은 암을 치료할 수 있으며, 동시에 돌연변이의 억제에 의해 암을 예방할 수 있으므로, 항암제 및 암 예방제로 유효하게 사용될 수 있다.

Claims

수영(Rumex acetosa L.)의 염화메틸렌 추출물을 유효성분으로 함유하여 암을 치료 및 예방할 수 있는 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 암은 폐암, 난소암, 흑색종, 중추신경암 또는 직장암임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 암의 예방은 돌연변이의 억제에 의한 것임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.