KR20120041725A - 독성이 줄어든 식물 추출물 및 식물 추출물의 독성을 줄이는 방법 - Google Patents

독성이 줄어든 식물 추출물 및 식물 추출물의 독성을 줄이는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 락토바실러스 파라카제이로 발효되어 독성이 줄어든 것을 특징으로 하는 인진쑥 추출물 및 인진쑥 추출물의 독성을 줄이는 방법을 제공한다. 본 발명은 인진쑥 뿐만 아니라, 어성초, 구절초 또는 신이화 등의 식물에 대해서도, 락토바실러스 파라카제이로 발효되어 독성이 줄어든 것을 특징으로 하는 추출물 및 이러한 식물 추출물의 독성을 줄이는 방법을 제공한다. 본 발명의 인진쑥 추출물 등의 식물 추출물은 식물의 원래의 유용한 특성을 그대로 유지하면서 개선된 항염증성을 갖기 때문에, 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 발효 제품, 사료첨가용 조성물 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

독성이 줄어든 식물 추출물 및 식물 추출물의 독성을 줄이는 방법{Plant extracts having reduced toxicity and method for reducing toxicity of plant extracts}
본 발명은 항산화 특성 및 면역 조절 효능이 뛰어난 인진쑥의 특성은 그대로 유지 또는 개선하면서 독성이 줄어든 어성초, 구절초 또는 신이화(Magnoliae flos) 인진쑥 추출물, 및 인진쑥 추출물의 독성을 줄이는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 어성초, 구절초, 또는 신이화의 원래의 유용한 특성은 그대로 유지 또는 개선하면서 독성이 줄어든 식물 추출물, 및 식물 추출물의 독성을 줄이는 방법에 관한 것이다.
쑥은 국화과 쑥속에 속하며, 독특한 향기와 맛이 있어 종래로부터 식용과 약용으로 널리 사용되어온 다년생 식물이다. 쑥의 구성성분은 수분, 단백질, 지방, 조섬유 등의 일반 성분 외에도 당질, 비타민, 칼슘, 알칼로이드 등의 성분을 함유하고 있어 전통 의학의 거의 모든 분야에 빈번하게 사용되고 있어 그 관심이 날로 증가하고 있다.
쑥은 동의보감 등의 고문서에 위장의 소화력을 높이며 부인병과 각종 질환에 효험이 있는 것으로 기록되어 있지만, 이에 대한 과학적인 검증은 부족한 형편이다. 쑥에 포함된 다양한 유효 성분에 대한 연구들은 주로 생약학적 방법으로 연구한 결과이며, 주로 혈액순환 촉진, 이뇨작용, 강장작용, 지혈, 피부질환 치료, 항암 작용 등의 효과를 나타내는 것으로 보고되고 있으며, 최근에는 대사성 질환, 간보호, 항염증 및 항알레르기 효과 등에 관한 연구가 진행되고 있다.
이러한 쑥의 종류 중 하나인 인진쑥은 사철쑥 또는 더위지기라고도 지칭되며, 인진쑥은 비타민 A의 함량이 많아 암 예방에 효과적이고 발암물질의 생성 또는 활성을 억제하는데 중요한 역할을 한다. 또한, 인진쑥은 위장, 혈변, 설사, 소화불량, 식욕부진, 구충, 간장, 토혈, 복통, 하혈, 변비, 강정, 당뇨, 심장병, 요통, 월경불순, 여성냉대하, 습진, 심복냉통, 치질 등에 효과가 있고, 비타민 C가 많아서 감기에도 도움이 된다.
이와 같이 인진쑥은 다양한 유익한 효능이 있음에도 간을 손상시키는 독성 등의 부작용을 초래하여 다양한 분야에서 폭넓게 사용되지 못하는 면이 있다. 또한, 인진쑥 뿐만 아니라, 어성초, 구절초, 신이화 등 여러 유용한 식물 역시 독성을 포함하고 있어 다양한 용도로 폭넓게 제공되지 못하고 있는 실정이다.
따라서, 본 발명이 해결하려는 기술적 과제는 인진쑥 등의 식물이 가지고 있는 유용한 효능은 유지 또는 개선하면서도 독성을 줄임으로써 식물을 더 폭넓게 다양한 용도로 사용할 수 있도록 하는 것이다.
또한, 본 발명은 인진쑥 등의 식물의 추출물의 독성을 줄이는 방법 등을 제공하고자 한다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)로 발효되어 독성이 줄어든 인진쑥 추출물을 제공한다. 즉, 본 발명은 락토바실러스 파라카제이를 이용하여 인진쑥 추출물을 발효함으로써 인진쑥 자체의 항산화 특성을 유지할 뿐만 아니라, 인진쑥의 세포 독성을 줄여 안전성은 높이면서도, 인터류킨-10(IL-10)과 같은 항염증 인자를 유도하여 개선된 항염증성을 갖는 인진쑥 추출물을 제공한다.
또한, 본 발명은 어성초(Houttuynia cordata), 구절초(Chrysanthemum zawadskii var. latilobum) 또는 신이화(Magnoliae flos)에 대해서도 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)로 발효되어 독성이 줄어든 식물 추출물을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 파라카제이로는 락토바실러스 파라카제이 LS-2 균주가 바람직하며, 상기 LS-2 균주는 16S rDNA 염기서열에 기초하여 99% 상동성을 보이는 락토바실러스 파라카제이로 최종 동정되었고, 2010년 5월 25일자로 서울에 소재하는 한국미생물보존센터에 기탁번호 KFCC11490P로 기탁되었다.
상기 락토바실러스 파라카제이 LS-2(기탁번호 KFCC11490P)는 과채 발효를 통해 분리된 것으로서, 최적의 발효를 위한 조건은 30 ℃에서 36시간이 가장 바람직하다. 이러한 발효 조건에서, 유산균의 생장을 통해 pH가 약 4.03으로 떨어지며 유산균의 성장률(적정산도(TA)로 나타냄)은 약 1.78%로 높게 나타나며 생균수는 약 1.0 × 1010 CFU/ml에 이른다.
본 발명의 인진쑥 등의 식물 추출물은 본 발명이 속한 분야에서 통상적으로 알려진 용매를 이용하여 제조될 수 있다. 이러한 용매로 예를 들어, 정제수; 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올; 글리세린, 부틸렌글라이콜, 프로필렌글라이콜 등의 다가 알코올; 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매; 또는 이들의 혼합 용매가 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다만, 상기 추출 용매로 물(정제수)을 사용하는 것이 바람직하며, 열수추출물을 이용하는 것이 더욱 바람직한데, 이는 일반적으로 사용되는 유기용매는 락토바실러스 파라카제이의 발효 과정에 부정적 영향을 미칠 수 있으므로 제거되어야 하나, 물을 추출용매로 사용할 경우 그러한 과정이 불필요하다. 또한 가열된 물을 이용할 경우 추출 효율을 높일 수 있다.
본 발명의 어성초, 구절초 또는 신이화 추출물 또한 위와 같은 용매를 이용하여 제조될 수 있으며, 정제수 추출물이 더욱 바람직하다.
본 발명의 식물 추출물은 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려진 추출방법을 이용하여 제조할 수 있다. 즉, 건조된 인진쑥 등의 식물을 분쇄하여 분말로 만든 후, 상기 분말의 약 10 배의 추출용매를 가하여 추출한 후, 선택적으로 (감압)농축, 건조 또는 정제 과정을 거쳐 제조할 수 있다. 보다 구체적으로, 전술한 방법과 같이 추출용매를 가하여 유효성분 물질을 추출하되 (a) 냉각 콘덴서가 장치되어 용매가 증발되는 것을 방지한 상태에서 50 내지 100 ℃의 온도 조건에서 1 내지 20시간 가열하여 추출하거나, (b) 5 내지 37 ℃의 온도 조건에서 1 내지 15일간 침적시켜 유효성분을 추출할 수 있다. 즉, 교반 추출, 환류 냉각 추출, 냉침 추출, 초음파 추출 또는 초임계 추출 등의 추출방법을 사용하여 제조할 수 있다.
상기 용매 추출방법 중에서도, 추출 용매로 정제수를 사용하는 추출방법, 특히 열수 추출방법을 이용하여 본 발명의 추출물을 제조하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 도 1의 모식도에 나타낸 바와 같은 과정을 거쳐서 본 발명의 인진쑥 열수추출물을 얻을 수 있다. 먼저, 건조된 인진쑥을 분쇄하여 분말로 만든 후, 상기 인진쑥 분말(g)의 약 10 배의 정제수(mL)를 가한 후 100 ℃에서 3시간 동안 가열한 후, 와트만 페이퍼(Whatman No.2와 Whatman No.5)로 2회 감압 여과한다. 그 후 낙하세균이나 교차 오염의 가능성을 배제하기 위하여 오토클레이브(한백과학, 대한민국)에서 100 ℃, 30분간 처리한 후 실온으로 냉각한다. 그 결과 본 발명의 인진쑥 열수추출물을 얻을 수 있다. 다만, 본 발명은 이러한 구체적 제조 방법에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 발명은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)로 발효된 인진쑥 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
염증은 세균 감염과 같은 병원체의 침입이나 생체 혹은 그 조직에 물리적, 화학적으로 손상된 부위에 나타내는 국소적인 반응이며, 그 손상부위를 재생하려는 생체 기전이다. 일단 자극이 가해지면 국소적으로 혈관 활성 물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 염증이 유발되고, 초기 염증반응 시에는 일산화질소(NO)와 사이토카인(cytokine)을 생산하여 생체 방어에 중요한 역할을 하기도 하지만, 지속적인 염증 반응은 오히려 점막 손상을 촉진하고 부종을 가져오는 등 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다.
이러한 염증과 관련된 염증 질환은, 이에 한정되지는 않으나, (1) 전신 아나필락시스 및 과민성 장애, 아토피 피부염, 두드러기, 약물 알레르기, 곤충 자상 알레르기(insect sting allergies), 음식물 알레르기(만성소화장애증 및 이와 유사한 것을 포함함) 및 비만세포증을 포함하는 염증 질환 또는 알레르기 질환; (2) 크론병, 궤양성 대장염, 회장염(ileitis) 및 장염(enteritis)을 포함하는 염증성 장 질환; (3) 혈관염 및 베체트 증후군; (4) 피부염, 습진, 아토피 피부염, 알레르기성 접촉 피부염, 두드러기를 포함하는 건선 및 염증성 피부병, 인간 유두종 바이러스, HIV 또는 RLV 감염, 박테리아의, 곰팡이의 및 그외 다른 기생충성 피부의 병적 이상(parasital cutaneous pathologies) 및 피부의 홍반성 루푸스로부터 유래한 것을 포함하는 바이러스성 피부의 병적 이상(viral cutaneous pathologies); (5) 알레르기성 천식, 운동 유발성 천식, 알레르기 비염, 중이염, 알레르기 결막염, 과민성 폐병 및 만성 폐쇄 폐병을 포함하는 천식 및 알레르기성 호흡기병; (6) 관절염(류마티스성 관절염 및 건선 관절염을 포함함), 전신성 홍반성 낭창, 타입 I 당뇨병, 중증 근육 무력증, 다발 경화증, 그레이브스 병 및 사구체신염을 포함하는 자가면역 질환; (7) 급성 심부전, 저혈압, 고혈압, 협심증, 심근 경색증, 심근병증, 울혈성 심장 기능 상실, 죽상 동맥 경화증, 관상 동맥 질환, 재협착, 및 혈관 협착증을 포함하는 심장혈관 장애; (8) 외상 뇌 손상, 뇌졸증, 허혈 재관류 손상 및 동맥류를 포함하는 뇌혈관 장애; (9) 위염, 궤양, 메스꺼움, 췌장염 및 구토를 포함하는 위장 장애;를 포함할 수 있다.
상기 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 당업계에 공지된 방법에 따라서 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 독성이 줄어든 인진쑥 추출물은 약제학 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 혼합하여, 태블릿(tablet), 트로키(troche), 캡슐(capsule), 엘릭시르(elixir), 시럽(syrup), 산제(powder), 현탁제(suspension), 과립제(granule) 등의 형태로 제조되어 투여될 수 있다. 상기 담체는, 이에 한정되지는 않으나, 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등이 포함할 수 있다.
구체적으로, 산제는 본 발명의 독성이 줄어든 인진쑥 추출물과 유당, 전분, 미결정셀룰로오스 등 약제학적으로 허용되는 적당한 부형제를 단순 혼합함으로써 제조될 수 있다. 과립제는 본 발명의 독성이 줄어든 인진쑥 추출물; 약제학적으로 허용되는 적당한 부형제; 및 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 약제학적으로 허용되는 적당한 결합제를 혼합한 후, 물, 에탄올, 이소프로판올 등의 용매를 이용한 습식과립법 또는 압축력을 이용한 건식과립법을 이용하여 제조될 수 있다. 또한 정제는 상기 과립제를 마그네슘스테아레이트 등의 약제학적으로 허용되는 적당한 활택제와 혼합한 후, 타정기를 이용하여 타정함으로써 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)로 발효된 인진쑥 추출물, 어성초 추출물, 구절초 추출물 또는 신이화 추출물을 포함하는 발효 제품 또는 사료첨가용 조성물을 제공할 수 있다. 상기 사료첨가용 조성물은 기존 면역 증강제의 대체용으로 사용되어 가축의 건강 상태를 양호하게 하여, 가축의 증체량과 육질을 개선시키고 산유량 및 면역력을 증가시킬 수 있다.
본 발명은 또한 인진쑥의 추출물을 제조하는 단계; 및 상기 인진쑥 추출물을 락토바실러스 파라카제이로 발효시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인진쑥 추출물의 독성을 줄이는 방법을 제공한다. 바람직하게 상기 발효는 열수추출된 인진쑥 추출물을 미생물 배지로 하여 락토바실러스 파라카제이 LS-2를 약 37 ℃에서 약 36시간 동안 이루어질 수 있다.
또한 본 발명은 상기와 같은 방법을 사용하여, 어성초 추출물, 구절초 추출물, 또는 신이화 추출물의 독성을 줄이는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명은 락토바실러스 파라카제이를 이용하여 인진쑥 추출물을 발효함으로써 인진쑥의 세포 독성을 줄여 안전성은 높이면서도, 인터류킨 10과 같은 항염증 인자를 유도하여 개선된 항염증성을 나타내는 인진쑥 추출물을 제공한다. 본 발명에 따른 독성이 줄어든 인진쑥 추출물은 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 발효 제품, 사료첨가용 조성물 등 다양한 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 인진쑥 열수추출물을 얻는 과정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 락토바실러스 파라카제이 LS-2로 37 ℃의 발효 온도에서 발효된 인진쑥 열수추출물의 시간대별(0h, 24h, 36h, 48h) TA(%)를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 락토바실러스 파라카제이 LS-2가 37 ℃의 발효 온도에서 발효됨에 따른 시간대별(0h, 24h, 36h, 48h) pH를 나타낸 그래프(LS-2로 표시)와 락토바실러스 파라카제이 LS-2로 37 ℃의 발효 온도에서 발효된 인진쑥 열수추출물의 시간대별(0h, 24h, 36h, 48h) pH를 나타낸 그래프(FAC로 표시)이다.
도 4는 본 발명의 락토바실러스 파라카제이 LS-2로 25 ℃, 30 ℃ 및 37 ℃의 발효 온도에서 각각 발효된 인진쑥 열수추출물의 시간대별(24h, 36h, 48h) 생균수를 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 i) 대조구인 RAW 264.7 세포, ii) LPS 처리 후 인진쑥 열수추출물 250 ppm을 48시간 처리한 RAW 264.7 세포 및 iii) LPS 처리 후 발효된 인진쑥 열수추출물 250 ppm을 48시간 처리한 RAW 264.7 세포를, 각각 현미경으로 관찰하여 순서대로 나타낸 사진이다.
도 6은 i) 아무런 처리를 하지 않은 음성 대조구(control)인 RAW 264.7 세포, ii) 양성 대조구인 LPS를 처리한 RAW 264.7 세포, iii) LPS 처리 후 인진쑥 열수추출물을 처리한 RAW 264.7 세포(AC 500, AC 250, AC 100) 및 iv) LPS 처리 후 발효된 인진쑥 열수추출물을 처리한 RAW 264.7 세포(FAC 500, FAC 250, FAC 100)에서 각각 생성된 NO의 양을 나타낸 그래프이다.
도 7은 i) 아무런 처리를 하지 않은 음성 대조구(control)인 RAW 264.7 세포, ii) 양성 대조구인 LPS를 처리한 RAW 264.7 세포, iii) LPS 처리 후 인진쑥 열수추출물을 처리한 RAW 264.7 세포(AC 500, AC 250, AC 100) 및 iv) LPS 처리 후 발효된 인진쑥 열수추출물을 처리한 RAW 264.7 세포(FAC 500, FAC 250, FAC 100)에서 각각 생성된 IL-6의 양을 나타낸 그래프이다.
도 8은 i) 아무런 처리를 하지 않은 음성 대조구(control)인 RAW 264.7 세포, ii) 양성 대조구인 LPS를 처리한 RAW 264.7 세포, iii) LPS 처리 후 인진쑥 열수추출물을 처리한 RAW 264.7 세포(AC 500, AC 250, AC 100) 및 iv) LPS 처리 후 발효된 인진쑥 열수추출물을 처리한 RAW 264.7 세포(FAC 500, FAC 250, FAC 100)에서 각각 생성된 TNF-α의 양을 나타낸 그래프이다.
도 9는 i) 아무런 처리를 하지 않은 음성 대조구(control)인 RAW 264.7 세포, ii) 양성 대조구인 LPS를 처리한 RAW 264.7 세포, iii) LPS 처리 후 인진쑥 열수추출물을 처리한 RAW 264.7 세포(AC 500, AC 250, AC 100) 및 iv) LPS 처리 후 발효된 인진쑥 열수추출물을 처리한 RAW 264.7 세포(FAC 500, FAC 250, FAC 100)에서 생성된 IL-10의 양을 나타낸 그래프이다.
도 10은 i) 아무런 처리를 하지 않은 음성 대조구인 RAW 264.7 세포, ii) 양성 대조구인 LPS를 처리한 RAW 264.7 세포, iii) LPS 처리 후 500 ppm의 발효된 인진쑥 열수추출물을 처리한 RAW 264.7 세포(FAC1), iv) LPS 처리 후 500 ppm의 인진쑥 열수추출물을 처리한 RAW 264.7 세포(AC1), v) LPS 처리 후 250 ppm의 발효된 인진쑥 열수추출물을 처리한 RAW 264.7 세포(FAC2), vi) LPS 처리 후 250 ppm의 인진쑥 열수추출물을 처리한 RAW 264.7 세포(AC2)를 면역 블로팅하여 얻은 단백질 밴드를 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위하여 하기 실시예 등을 들어 설명한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예 들에 한정되는 것으로 해석돼서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 본 발명의 구체적 이해를 돕기 위해 예시적으로 제공되는 것이다.
<실시예 1> 인진쑥 열수추출물에 대한 락토바실러스 파라카제이 LS-2의 최적 발효 조건
하기 표 1은 인진쑥 열수추출물의 최적 발효 조건을 선발하기 위하여, 락토바실러스 파라카제이 LS-2의 발효 온도 및 시간에 따른 pH, 적정 산도(TA : titratable acidity) 및 생균수(CFU/ml)의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 표이다.
온도(℃) 시간 pH TA(%) 생균수(CFU/ml)


25		 0 5.30 - -
24 4.22 0.19 5.50 × 107
36 4.20 0.25 5.73 × 107
48 4.20 0.24 5.51 × 107

30		 24 4.13 0.34 6.20 × 107
36 4.11 0.38 6.50 × 107
48 4.11 0.35 7.70 × 107


37		 24 4.15 0.34 6.30 × 107
36 4.02 0.48 2.90 × 108
48 4.03 0.47 6.70 × 107
상기 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 젖산 생성에 따른 pH의 감소는 발효 온도가 25 ℃일 때보다 30 ℃와 37 ℃일 때 더 크게 나타났다. 특히 37 ℃의 발효 온도에서 36시간의 발효 시간을 거친 경우에 젖산의 생성에 따른 적정 산도(TA)와 생균수의 값이 더 크게 나타났다.
즉, 락토바실러스 파라카제이 LS-2에 의한 젖산 생성에 따른 pH의 감소, 적정 산도(TA) 및 생균수는 30 ℃의 발효 온도 및 36시간의 발효 시간에서 최적의 발효를 나타내나, 인진쑥 열수추출물을 미생물 배지로 사용한 경우의 락토바실러스 파라카제이 LS-2에 의한 젖산 생성에 따른 pH의 감소, 적정 산도(TA) 및 생균수는 37 ℃의 온도 및 36시간에서 최적의 발효를 나타냄을 알 수 있었다.
도 2에서 본 발명의 락토바실러스 파라카제이 LS-2로 37 ℃의 발효 온도에서 발효된 인진쑥 열수추출물의 시간대별(0h, 24h, 36h, 48h) TA(%)를 그래프로 나타냈다.
도 3에서 본 발명의 락토바실러스 파라카제이 LS-2로 37 ℃의 발효 온도에서 발효된 인진쑥 열수추출물의 시간대별(0h, 24h, 36h, 48h) pH를 그래프로 나타내고(FAC로 표시), 이와 함께 락토바실러스 파라카제이 LS-2가 37 ℃의 발효 온도에서 발효됨에 따른 시간대별(0h, 24h, 36h, 48h) pH를 그래프로 나타냈다(LS-2로 표시).
도 4에서 본 발명의 락토바실러스 파라카제이 LS-2로 25 ℃, 30 ℃ 및 37 ℃의 발효 온도에서 각각 발효된 인진쑥 열수추출물의 시간대별(24h, 36h, 48h) 생균수를 그래프로 나타냈다.
<실시예 2> 락토바실러스 파라카제이 LS-2로 37 ℃의 온도 및 36시간 동안 발효된 14종의 식물의 열수추출물의 세포 독성
하기 표 2는 14종의 식물의 열수추출물과 락토바실러스 파라카제이 LS-2로 발효된 식물의 열수추출물을 제조하여, 각각 농도별로 마우스의 대식 세포주인 RAW 264.7 세포에 48시간 처리한 후 Mosman 방법에 따라 MTT 분석하여 얻은 세포 생존률을 나타낸 표이다. RAW 264.7 세포에 열수추출물을 처리한 경우에 비해 발효된 식물의 열수추출물을 처리한 경우의 세포 생존률이 상승할 경우, 발효를 통하여 세포 독성이 줄어들었음을 알 수 있게 된다. 상기 발효된 식물의 열수추출물은, 14종의 식물의 열수추출물에 락토바실러스 파라카제이 LS-2를 15%(v/v) 접종한 후, 37 ℃의 온도에서 36시간 동안 발효시킨 것이다. 대조군으로 아무런 처리를 하지 않은 RAW 264.7 세포를 사용하였다.
식물 열수추출물
/발효된 열수추출물		 처리 농도
500 ppm 250 ppm 100 ppm
인진쑥 열수추출물 3 ± 0 52 ± 5 66 ± 17
발효된 열수추출물 79 ± 7 98 ± 2 105 ± 8
어성초 열수추출물 41 ± 1 79 ± 2 88 ± 5
발효된 열수추출물 72 ± 6 75 ± 6 91 ± 19
포공영 열수추출물 51 ± 1 74 ± 2 82 ± 11
발효된 열수추출물 19 ± 5 87 ± 9 89 ± 4
황금 열수추출물 12 ± 2 46 ± 2 53 ± 8
발효된 열수추출물 22 ± 3 50 ± 4 47 ± 8
박하 열수추출물 26 ± 2 69 ± 2 91 ± 22
발효된 열수추출물 33 ± 7 68 ± 7 88 ± 16
오미자 열수추출물 94 ± 3 98 ± 6 100 ± 3
발효된 열수추출물 81 ± 14 102 ± 2 97 ± 5
호장근 열수추출물 21 ± 5 45 ± 1 98 ± 3
발효된 열수추출물 28 ± 4 55 ± 1 99 ± 0
구절초 열수추출물 23 ± 0 58 ± 8 59 ± 13
발효된 열수추출물 69 ± 7 88 ± 3 99 ± 2
유근피 열수추출물 39 ± 4 63 ± 4 88 ± 3
발효된 열수추출물 38 ± 12 74 ± 19 87 ± 3
금은화 열수추출물 83 ± 13 99 ± 1 97 ± 2
발효된 열수추출물 99 ± 2 100 ± 1 100 ± 1
정향 열수추출물 10 ± 2 42 ± 3 74 ± 31
발효된 열수추출물 14 ± 1 64 ± 1 90 ± 14
연교 열수추출물 69 ± 6 86 ± 1 95 ± 2
발효된 열수추출물 83 ± 1 92 ± 1 94 ± 3
신이화 열수추출물 54 ± 6 82 ± 4 81 ± 9
발효된 열수추출물 71 ± 2 91 ± 2 101 ± 1
현지초 열수추출물 37 ± 2 93 ± 5 94 ± 7
발효된 열수추출물 43 ± 2 97 ± 4 88 ± 6
대조군 100
상기 표 2의 결과로부터 상기 실시예 2에서 발효를 통해 세포 독성이 줄어드는 식물의 열수추출물은 인진쑥, 어성초, 구절초 및 신이화였으며, 그 중에서도 인진쑥의 경우 발효를 통하여 세포 독성이 가장 많이 줄어들었다. 반면, 포공영의 경우 500 ppm 처리구에서 발효된 열수추출물의 세포 독성이 열수추출물보다 더 높게 관찰되었다. 또한 황금, 박하, 호장근 및 정향의 각각의 발효된 열수추출물 500 ppm을 처리한 경우 세포 생존율이 약 20 내지 30%에 불과하여 세포 독성이 높은 편이였으며, 이들은 발효를 통하여 세포 독성이 완화되지 않는 것으로 관찰되었다.
특히, 인진쑥 열수추출물 500 ppm을 처리한 경우 약 3%의 세포 생존율을 보인 반면, 발효된 인진쑥 열수추출물 500 ppm을 처리한 경우 약 79%의 세포 생존율을 보였다. 이러한 효과는 그 처리 농도가 낮은 경우에도 나타났다. 즉, 인진쑥 열수추출물 250 ppm을 처리한 경우 약 52%의 세포 생존율을 보인 반면, 발효된 인진쑥 열수추출물 250 ppm을 처리한 경우 약 98%의 세포 생존율을 보였다.
발효를 통하여 세포 독성이 가장 많이 줄어든 인진쑥 열수추출물의 세포 독성을 살펴보기 위하여 현미경으로 세포의 모양을 관찰하였다. 도 5에 i) 대조군인 RAW 264.7 세포, ii) 인진쑥 열수추출물 250 ppm을 48시간 처리한 RAW 264.7 세포 및 iii) 락토바실러스 파라카제이 LS-2로 발효된 인진쑥 열수추출물 250 ppm을 48시간 처리한 RAW 264.7 세포를, 각각 현미경으로 관찰한 사진을 순서대로 나타냈다. 사진에서 볼 수 있는 바와 같이, 인진쑥 열수추출물을 처리한 경우 세포 사멸이 관찰된 반면, 발효된 인진쑥 열수추출물을 처리한 경우에는 대조군과 비슷한 정도로 세포 형태를 유지하였다. 즉, 인진쑥 열수추출물을 락토바실러스 파라카제이 LS-2로 발효함으로써 세포 독성이 상당히 줄어든다는 것을 알 수 있다.
<실시예 3> 락토바실러스 파라카제이 LS-2로 발효된 인진쑥 열수추출물의 항산화 특성
하기 표 3은 BHA(butylated hydroxy anisole)와 알파-토코페롤을 양성 대조군으로 하여 인진쑥 열수추출물과 락토바실러스 파라카제이 LS-2로 발효시킨 인진쑥 열수추출물의 항산화 특성을 비교하여 나타낸 표이다. 상기 BHA는 유지 또는 유지를 함유한 식품에 주로 사용되는 산화방지제로 알려져 있으며, 상기 알파-토코페롤은 비타민의 일종으로서 항산화 특성이 있는 것으로 알려져 있다.
상기 항산화 특성은 DPPH 라디칼의 소거능을 측정하며 Maffi 등의 방법에 따라 평가하였다. 상기 DPPH는 화학적으로 안정된 프리 라디칼을 가지고 있는 수용성 물질로서 515 nm에서 최대 흡광도를 가지며, 전자를 받으면 흡광도가 감소된다. 즉, 항산화 활성이 있는 물질과 반응하면 DPPH의 라디칼이 소거됨에 따라 DPPH의 특유의 보라색이 탈색되어, 투명한 노란색으로 바뀌게 된다.
구체적으로 항산화 특성을 측정하는 방법은 다음과 같다. 에탄올에 녹인 200 마이크로몰의 DPPH 시약 100 ㎕에 상기의 각각의 시료(BHA, 알파-토코페롤, 인진쑥 열수추출물, 발효된 인진쑥 열수추출물)를 농도별(500 및 250 ppm)로 100 ㎕씩 넣고 잘 섞어준 다음, 암실에서 30분간 반응시킨 후 515 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. 양성 대조군의 경우에도 상기와 같은 방법으로 항산화 특성을 측정하되, 처리 농도를 100 ppm으로 하였다. 상기 흡광도를 측정한 결과를 하기의 표 3에 나타냈다.
시료 처리 농도 (ppm)
500 250 100
인진쑥 열수추출물 90.0 89.2 -
발효된 인진쑥 열수추출물 90.0 87.5 -
BHA - - 92.5
알파-토코페롤 - - 86.0
상기 표 3의 결과에서 볼 수 있는 바와 같이, 인진쑥 열수추출물을 처리한 경우의 DPPH 라디칼 소거능은 500 ppm을 처리한 경우 90.0%, 250 ppm을 처리한 경우 89.2%로 나타났으며, 양성 대조군들과 비교해 보았을 때 거의 차이가 없어 매우 우수한 항산화 특성이 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 발효된 인진쑥 열수추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 500 ppm을 처리한 경우 90.0%, 250 ppm을 처리한 경우 87.5%로 나타나 인진쑥 열수추출물의 유효성분의 항산화 특성은 락토바실러스 파라카제이 LS-2에 의한 발효를 통하여 유실되지 않는다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 4> 락토바실러스 파라카제이 LS-2로 발효된 인진쑥 열수추출물의 항염증성
(1) NO 분석
10% 혈청(FBS, fetal bovine serum)이 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 마우스의 RAW 264.7 세포를 배양하여 5 × 105 cells/ml로 24 웰 플레이트로 옮겼다. 아무런 처리를 하지 않은 상기 RAW 264.7 세포를 음성 대조군(control)으로 사용하였고, 상기 RAW 264.7 세포에 LPS를 처리하여 48시간 배양한 것을 양성 대조군(LPS)으로 사용하였다. 또한, 상기 LPS가 처리된 RAW 264.7 세포에 인진쑥 열수추출물 및 락토바실러스 파라카제이 LS-2로 발효된 인진쑥 열수추출물로 각각 처리하여 48시간 배양한 것을 실험군으로 사용하였다. 생성된 NO의 양을 살펴보기 위하여 Griess 시약[1% (w/v) 설파닐아미드(sulfanilamide) 및 0.1% (w/v) 나프틸에틸렌디아민(naphthylethylenediamine)의 2.5% 인산 용액]을 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO2 -의 양을 측정하였다. 세포배양 상등액 100 ㎕와 Griess 시약 100 ㎕를 혼합하여 96 웰 플레이트에서 5분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였고 생성된 NO의 양은 NaNO2를 표준(standard)으로 비교하여 실험한 것을 도 6의 그래프로 나타냈다.
인진쑥 열수추출물을 500 ppm 처리한 경우(AC 500)는 양성 대조군인 LPS를 2 마이크로그램/ml 처리한 경우(15.6 ± 1.5 마이크로몰)와 비슷한 양의 NO가 유도된 것으로 관찰되었다. 반면, 발효된 인진쑥의 열추출물을 500 ppm 처리한 경우(FAC 500)는 NO의 생성이 현격하게 감소되어 아무런 처리를 하지 않은 음성 대조군(control)인 RAW 264.7 세포(4.7 ± 0.0 마이크로몰)와 비슷한 양의 NO가 유도된 것으로 관찰되었다. 또한, 250 ppm과 100 ppm을 각각 처리한 경우에서 인진쑥 열수추출물(AC 250, AC 100)과 발효된 인진쑥 열수추출물(FAC 250, FAC 100)에서 유도된 NO 양은 많은 차이가 관측되지 않았다.
(2) 전-염증성 사이토카인 유도(pro-inflammatory cytokine induction)
마우스의 RAW 264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 2~3일 간격으로 배지를 갈아주어 세포 상태를 유지시켜 주었다. 세포를 처리하기 전, 4시간 동안 혈청이 고갈된 배지에서 배양시킨 후 5 × 105 cells/ml로 조절하여 6 웰 플레이트에 분주하였다. 배양된 상기 RAW 264.7 세포에 LPS를 처리하여 48시간 배양한 것을 양성 대조군(LPS)으로 사용하였고, 아무런 처리를 하지 않은 상기 RAW 264.7 세포를 음성 대조군(control)으로 사용하였다. 또한, 상기 LPS가 처리된 RAW 264.7 세포에 인진쑥 열수추출물 및 락토바실러스 파라카제이 LS-2로 발효된 인진쑥 열수추출물로 각각 처리하여 48시간 배양한 것을 실험군으로 사용하였다. 배양시간 종료 후 ELISA 키트를 이용하여 IL-6(interleukin-6)와 TNF-α의 유도량을 측정하여 각각 도 7 및 도 8의 그래프에 나타냈다.
양성 대조군인 LPS를 처리한 경우 상당한 양의 IL-6와 TNF-α가 유도되었다. 반면, 인진쑥 열수추출물을 500 ppm, 250 ppm 및 100 ppm을 각각 처리한 경우(AC 500, AC 250, AC 100)와, 발효된 인진쑥 열수추출물을 500 ppm, 250 ppm 및 100 ppm을 각각 처리한 경우(FAC 500, FAC 250, FAC 100)에는, 음성 대조군(control)인 RAW 264.7 세포와 비슷한 양의 IL-6와 TNF-α가 관찰되었다. 즉, 인진쑥 열수추출물과 발효된 인진쑥 열수추출물의 처리 농도와 상관없이, 초기 염증과 관련된 초기 염증과 관련된 사이토카인인 IL-6와 TNF-α는 거의 유도되지 않는 것을 알 수 있다.
(3) 항염증성 사이토카인 유도
상기 (2)와 같은 방법으로 세포를 유지하면서 처리하였고, 배양시간 종료 후 ELISA 키트를 이용하여 IL-10(interleukin-10)의 유도량을 측정하여 도 9의 그래프로 나타냈다.
양성 대조군인 LPS를 처리한 경우 46.1 ± 6.5 마이크로그램/ml의 IL-10이 유도되었다. 인진쑥 열수추출물을 500 ppm, 250 ppm 및 100 ppm을 각각 처리한 경우(AC 500, AC 250, AC 100)에는 농도에 의존적으로 IL-10을 유도하였으나, 250 ppm 이하의 농도로 처리한 경우에는 음성 대조군과 비슷한 양의 IL-10을 유도하였다. 즉, 인진쑥 열수추출물의 경우, 고농도로 처리하지 않으면 항염증 효과를 거의 기대할 수 없다는 것을 알 수 있다.
반면, 발효된 인진쑥 열수추출물을 500 ppm, 250 ppm 및 100 ppm을 각각 처리한 경우(FAC 500, FAC 250, FAC 100)에는 농도에 의존적으로 IL-10을 유도하였다. 특히 500 ppm을 처리한 경우에는 놀랍게도 71.6 ± 6.5 마이크로그램/ml의 IL-10을 유도하여, 양성 대조군보다 더 많은 양의 IL-10을 유도하였다. 250 ppm을 처리한 경우에도 양성 대조군과 유사한 양의 IL-10을 유도하였다. 이러한 결과로부터 본 발명의 발효된 인진쑥 열수추출물은 발효되지 않은 인진쑥 열수추출물에 비해 항염증성이 개선된 것임을 알 수 있다.
(4) 단백질의 정제 및 면역 블로팅(immunoblotting)
10% 혈청(FBS, fetal bovine serum)이 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 마우스의 RAW 264.7 세포를 배양하여 5 × 105 cells/ml로 24 웰 플레이트로 옮겼다. 아무런 처리를 하지 않은 상기 RAW 264.7 세포를 음성 대조군(control)으로 사용하였고, 상기 RAW 264.7 세포에 LPS(2 마이크로그램/ml)를 처리하여 24시간 배양한 것을 양성 대조군(LPS)으로 사용하였다. 또한, 상기 LPS가 처리된 RAW 264.7 세포에 인진쑥 열수추출물 및 락토바실러스 파라카제이 LS-2로 발효된 인진쑥 열수추출물로 각각 처리하여 24시간 배양한 것을 실험군으로 사용하였다.
24시간 동안 배양한 각각의 RAW 264.7 세포를 수집하여 PBS(phosphate buffered saline)로 2회 세척한 후 차가운 PBS에 부유시킨 후 1 ml의 라이시스 버퍼(lysis buffer)를 첨가하여 1시간 동안 세포 용해(lysis)한 후, 4 ℃에서 13,000 rpm로 20분 동안 원심 분리하여 세포 부스러기(debris)를 제거하고 사이토졸 단백질(cytosolic protein)을 얻었다. 상기 사이토졸 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 분석 키트를 사용하여 Bradford 분석 방법으로 정량하였고, BSA(bovine serum albumin)를 표준화 시약으로 사용하였다. 세포 펠렛(pellet)을 차가운 PBS에 부유시킨 후 300 g으로 4 ℃에서 5분 동안 원심분리한 후, 두 단계의 추출 시약(extraction reagent)을 사용하여 상기 사이토졸 단백질을 펠렛화하였다. 면역 블로팅을 위해 20 마이크로그램의 세포 용해물(lysate)을 12% SDS-PAGE 겔에서 분리하여, 이를 폴리아크릴아마이드 겔에 120 V로 2시간 동안 트랜스퍼하였다. 블로팅된 막(membrane)을 1시간 동안 블로킹시킨 후 p38 MAP 키나제와 phospho-p38 MAP 키나제의 발현 양을 관찰하기 위하여, 토끼의 단일클론 일차 항체(p38-MAP kinase, phospho-p38-MAP kinase, Cell Signaling Technology, USA)로 4 ℃에서 밤새 반응시킨 후, 2차 항체(horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody, Cell Signaling Technology, USA)로 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 ECL 시약(Amersham Biosciences, USA)으로 5분 동안 반응시켜 X-레이 필름에 감광하여 단백질 밴드를 확인하였다. 상기 MAP 키나제(미토젠 활성화 단백질 키나제)는 이중 인산화에 의해 기질을 활성화하는 키나제로서, 산화적 스트레스, 성장 인자, 염증성 사이토카인 등 다양한 신호에 의해 활성화된다.
도 10에서 각각의 단백질 밴드는, 순서대로 i) 음성 대조군, ii) 양성 대조군, iii) 발효된 인진쑥 열수추출물 500 ppm으로 처리한 것(FAC1), iv) 인진쑥 열수추출물 500 ppm로 처리한 것(AC1), v) 발효된 인진쑥 열수추출물 250 ppm으로 처리한 것(FAC2), vi) 인진쑥 열수추출물 250 ppm으로 처리한 것(AC2)을 나타낸다.
RAW 264.7 세포에서의 MAP 키나제의 일종인 p38의 발현량 비교를 통하여, LPS는 p38의 인산화(p-p38)를 유도한다는 것을 확인할 수 있다. 즉, 인진쑥 열수추출물(AC1, AC2) 및 발효된 인진쑥 열수추출물(FAC1, FAC2) 모두 처리 농도에 의존적으로 LPS에 의해 유도되는 p38의 인산화를 방해하며, 특히 락토바실러스 파라카제이 LS-2로 발효시킨 인진쑥 열수추출물 500 ppm을 처리한 경우(FAC1)에서 p38의 인산화가 매우 낮은 양으로 발현됨이 관측되었다. 상기 p38의 인산화는 TNF-α와 같은 염증성 사이토카인의 생성을 매개하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 발효된 인진쑥 추출물을 사용하여 p38의 인산화가 적게 발현되었다는 결과로부터 본 발명의 발효된 인진쑥 추출물은 개선된 항염증성을 갖는다는 것을 알 수 있다.
한국미생물보존센터(국내) KFCC11490P 20100525

Claims (6)

  1. 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)로 발효되어 독성이 줄어든 것을 특징으로 하는 어성초(Houttuynia cordata) 추출물.
  2. 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)로 발효되어 독성이 줄어든 것을 특징으로 하는 구절초(Chrysanthemum zawadskii var . latilobum) 추출물.
  3. 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)로 발효되어 독성이 줄어든 것을 특징으로 하는 신이화(Magnoliae flos) 추출물.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 락토바실러스 파라카제이는 락토바실러스 파라카제이 LS-2(기탁번호 KFCC11490P)인 것을 특징으로 하는 추출물.
  5. 어성초(Houttuynia cordata), 구절초(Chrysanthemum zawadskii var . latilobum) 또는 신이화(Magnoliae flos) 추출물을 제조하는 단계; 및
    상기 추출물을 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)로 발효시키는 단계를
    포함하는 것을 특징으로 하는 식물 추출물의 독성을 줄이는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 락토바실러스 파라카제이는 락토바실러스 파라카제이 LS-2(기탁번호 KFCC11490P)인 것을 특징으로 하는 방법.
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