CN102186488A - 含有齿裂黄鹌菜提取物，其级分或由其分离的化合物作为有效成分的肝功能改善用药物组合物及肝功能改善用健康功能食品组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含有齿裂黄鹌菜(Youngia denticulata)提取物，其级分或是由其分离的化合物的选自氯原酸(Chlorogenic acid)，3，5-二-O-咖啡酰奎尼酸(3，5-Di-O-caffeoylquinic acid)，黄鹌菜苷A(Youngiaside A)，黄鹌菜苷B(Youngiaside B)，黄鹌菜苷C(Youngiaside C)的一种以上的化合物作为有效成分的癌预防用药物组合物或肝功能改善用药物组合物，而由于根据本发明的齿裂黄鹌菜提取物，其级分或由此分离被的化合物使作为癌预防指标酶的醌还原酶(Quinone reductase，QR)与是抗氧化反应因子的以抗氧化反应因子(Antioxidant response element，ARE)为首的肝的解毒酶的活性增强，而不仅无细胞毒性，而且从由乙醇与醋氨酚诱导的肝损伤保护肝，所以根据本发明的组合物可作为用于癌预防或肝功能改善的药品，健康功能食品有用地被使用。

Description

含有齿裂黄鹌菜提取物,其级分或由其分离的化合物作为有效成分的肝功能改善用药物组合物及肝功能改善用健康功能食品组合物

【技术领域】

本发明涉及含有齿裂黄鹌菜(Youngia denticulata)提取物，其级分或由其分离的化合物作为有效成分的癌预防或肝功能改善用组合物，而更详细，则涉及示优秀的解毒酶活性，且不示细胞毒性的含有齿裂黄鹌菜的提取物，其级分或选自氯原酸，3，5-二-O-咖啡酰奎尼酸，黄鹌菜苷A，黄鹌菜苷B及黄鹌菜苷C的一种以上的化合物作为有效成分的癌预防或肝功能改善用药物组合物，健康功能食品组合物。

【背景技术】

在对于癌的研究有深度地进行30年以上的当今也由于环境污染，错误的饮食生活习惯等而癌发生率继续增加而全世界性地每年发生1,000万人左右，且世界卫生组织(WHO)称作为死亡的主要原因之一数癌。癌作为中年人的疾病，新的临床例的70％以上是在60岁以上被诊断，而随着世界人口高龄化而癌发生率增加是不可避免的现象。在韩国国内，也根据保健福祉部，称每年发生10万人左右的癌患者。

作为一般的癌的治疗法，则有手术，放射线治疗，抗癌剂治疗等。为癌的确实的治疗，则有必要在早期诊断癌而手术，且并行放射线或抗癌剂治疗。但是，癌的诊断变迟，或癌转移时，治疗方法变复杂，且治疗中消耗的精神上，经济上的负担显著增大。从而，使用安全的化学物质而在事先防止使正常细胞不能转变至癌细胞的化学的癌预防(cancer chemoprevention)与为在初期发现癌的诊断方法开发是最近癌研究的重要领域。

抗癌领域可分为使既发生的癌细胞死灭而治疗癌的领域与致癌物质与细胞内标的物反应，或抑制到达靶标物，或使致癌物质释放到体外，从而抑制癌发生自身而预防癌的领域。被知为可被用作癌治疗用途的物质的情况中，有不可被用作癌预防用途的情况，且相反也有能被用作癌预防用途，但不可被用作癌治疗用途的物质而，最近则是将各自具体地分而接近的趋势。

以往的抗癌剂被用作了癌治疗用途，然而这不仅是对癌细胞，而对正常细胞也带给损伤而有示严重的毒性及副作用的缺点。

与此相反，癌预防用途的组合物利用比较无毒性的安全的化学物质而使致癌过程人为地抑制，或延迟或逆转，从而是为预防正常细胞转变为癌细胞的癌研究的新的策略。为成化学的癌预防物质的候补组，则由于应无毒性，或微弱，且用到可使至给多数人广泛地普及而从天然物质分离或合成容易的化学物质，所以除几种维生素代谢物质外，而主要用到植物性化合物(Surh YJ，Nature Rev Cancer，3，768-780，2003)。

癌由如开始阶段(initiation)，促进阶段(promotion)，进行阶段(progression)，转移阶段(metastasis)的多阶段组成，然而化学的癌预防以主要在开始阶段与促进阶段抑制癌发生作为目标，且根据其机理而大地被区分为两种。即是，从源头上封锁致癌物质到达标的细胞，或抑制经代谢活性化(metabolic activation)而攻击标的细胞的DNA而诱发结构性的损伤与突变的阻断剂(blocking agent)与抑制暴露于致癌物质而已经被起始的细胞经促进及进行阶段而各自发展成为良性癌与恶性癌的过程的抑制剂(suppressing agent)(Surh YJ，Nature Rev Cancer，3，768～780，2003)。

作为阻断剂，则已知是细胞色素P-450(cytochrome P-450)酶的抑制物质的二烯丙基硫化物(diallyl sulfide)，异硫氰酸盐(isothiocyanate)，鞣花酸(ellagic acid)等，且已知是2相解毒酶系的诱导剂的苯基乙基异硫氰酸盐(phenylethyl isothiocyanate)，莱菔硫烷(sulforaphane)，奥替普拉(oltipraz)等。

作为抑制剂，则已知：作为聚胺(polyamine)代谢抑制物质的DFMO，作为细胞分化促进剂的类视黄醇(retinoid)系列，作为蛋白激酶C(protein kinase C)抑制物质的染料木素(genistein)，作为氧化性DNA损伤抑制物质的EGCG等。

2相解毒酶被知为示对于各种癌细胞的特异性的细胞毒性而具有抗癌功能的等的具有从由致癌物质，变异原性物质，活性氧的DNA损伤的保护作用。在2相解毒酶中，醌还原酶(Quinone reductase，QR)作为主要在肝细胞中生成的第2相酶系的一种，而使醌还原而使无毒，而阻止在细胞内被诱导而由多种突变物质而发生的突变与肿瘤化，而发挥使致癌物质无毒的作用。更具体地，醌还原酶是阻断由突变或致癌物质等的与DNA的相互作用的酶，且是利用NADP(H)而催化醌类的还原的酶。分子量是54,000Da，而作为相同的结构结合2个的同型二聚体(homodimer)，而其各自由273个氨基酸构成，且在活性部位中含有黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)，且被叫作甲萘醌还原酶(menadione reductase)，维生素K还原酶(vitamin K reductase)，DT-黄递酶(DT-diaphorase)等。从而，醌还原酶使肝的解毒功能增强，从而使肝功能改善，而在事先阻断可使癌发生的致癌物质的作用而可预防癌。

由化学的癌预防的解毒酶系的基因调节中则报告为，抗氧化反应因子(Antioxidant response element；ARE)与活体异物反应因子(Xenobiotics-responsive element；XRE)的两个调节因子关联(Okey AB et al.，Toxicol Lett，70，1～22)。其中抗氧化反应因子(ARE)由于调节2相解毒酶系的活性诱导，可在单一功能诱导剂的效果检定中被利用。

通过通过这样的2相解毒酶的活性的增强的使肝的解毒功能增强的机理而阻止由于乙醇摄取的肝的损伤，从而可保护肝。另一方面，是在体内代谢为醌系化合物的药物的醋氨酚(acetaminophen)是代替阿司匹林而频繁地被使用的代表性的解热镇痛剂。但是，长期施用醋氨酚时，有导致严重的肝毒性的问题(A.J.Ware et al.，Int.Med.，88：267(1978)；及H.L.Bonkowsky et al.，Lancet，2：1016(1978))。通过醌还原酶为首的肝解毒酶的增强而可从由于如醋氨酚的醌系列药物的肝毒性保护肝。

目前，全世界性地为找出诱导解毒酶系的活性的癌预防用或肝功能改善用组合物的尝试在进行中，且代表性地从植物分离天然组合物的研究在进行中。但是，在韩国为首的东北亚地域则是成主要局限于药用植物而研究的倾向，且对于各国中自产的山菜类，蔬菜类及水果类的研究至现在是几乎无被报告的实情。另外，本发明人为了从以往完全无被知的植物开发具有癌预防或肝功能改善用途的物质而进行了努力，且在其中，也对于在韩国自产的齿裂黄鹌菜便具有了关心。

齿裂黄鹌菜(Youngia denticulata)作为双子叶植物合瓣花纲吊钟花目菊花科的一年生或两年生草，在山野的干燥处生长，且高度是30～70cm，而茎细，且是紫色。枝展，且切则出汁。结于根的叶是勺模样，且花开时消失，而结于茎的叶错开，且无叶柄。叶长度是6～11cm，宽度是3～7cm，且端钝。底部成耳状而将茎半分包裹，而边缘稀疏有此模样的齿叶。花在8～9月开成黄色，而头花是直径15mm左右，结为伞房花序，然而花开时直立，而凋谢之后下垂。总苞长成窄筒样，而总苞瓣是长的椭圆模样柳叶刀形，排列为2行，而内瓣是线形，且是8个。果实是瘦果，是褐色或黑色，且有12个棱线。冠毛是白色，且长度是约3.5mm，且将幼笋作为菜吃，而分布于韩国·日本·中国·印度支那。

但是，以往完全不知齿裂黄鹌菜的提取物，其级分或由其分离的化合物的癌预防用途或肝保护效果，且另外，具体地对于通过何种途径而具有这样的活性也完全无被公开。对此，本发明人为开发人体毒性无或微弱的化学的癌预防剂或肝功能改善剂而在可食用的天然物质中检索解毒酶活性时，齿裂黄鹌菜提取物，其级分或由其分离的化合物不仅是肝的解毒酶，而且诱导作为癌预防指标酶的醌还原酶的活性，且无细胞毒性，而诱导解毒酶系的活性，从而保护肝功能，进而示化学的癌预防效果，而解明含有其作为有效成分的组合物可用作为癌预防或肝功能改善的药品及健康功能食品，从而完成了本发明。

【发明内容】

【发明要解决的技术课题】

本发明的目的在提供含有齿裂黄鹌菜提取物，其级分或下记化学式1～5的化合物作为有效成分的癌预防用药物组合物。

[化学式1]

[化学式2]

[化学式3]

[化学式4]

[化学式5]

本发明的另一目的在提供含有齿裂黄鹌菜提取物，其级分或所述化学式1～5的化合物作为有效成分的癌预防或改善用健康功能食品组合物。

本发明的再一目的在提供含有齿裂黄鹌菜提取物，其级分或所述化学式1～5的化合物作为有效成分的肝功能改善用药物组合物。

进而，本发明的再一目的在提供含有齿裂黄鹌菜提取物，其级分或所述化学式1～5的化合物作为有效成分的肝功能改善用健康功能食品组合物。

【解决课题的技术方案】

为达成所述目的，本发明提供诱导醌还原酶的活性，且使抗氧化反应因子(ARE)的活性增加，且从由乙醇与醋氨酚诱导的肝损伤保护肝的含有齿裂黄鹌菜的提取物，其级分或选自所述化学式1的氯原酸，所述化学式2的3，5-二-O-咖啡酰奎尼酸，所述化学式3的黄鹌菜苷A，所述化学式4的黄鹌菜苷B及所述化学式5的黄鹌菜苷C的一种以上的化合物作为有效成分的癌预防用药物组合物。

另外，本发明提供诱导醌还原酶的活性，且使抗氧化反应因子(ARE)的活性增加，且从由乙醇与醋氨酚诱导的肝损伤保护肝的含有齿裂黄鹌菜的提取物，其级分或选自所述化学式1的氯原酸，所述化学式2的3，5-二-O-咖啡酰奎尼酸，所述化学式3的黄鹌菜苷A，所述化学式4的黄鹌菜苷B及所述化学式5的黄鹌菜苷C的一种以上的化合物作为有效成分的癌预防或改善用健康功能食品组合物。

本发明提供诱导醌还原酶的活性，且使抗氧化反应因子(ARE)的活性增加，且从由乙醇与醋氨酚诱导的肝损伤保护肝的含有齿裂黄鹌菜的提取物，其级分或选自所述化学式1的氯原酸，所述化学式2的3，5-二-O-咖啡酰奎尼酸，所述化学式3的黄鹌菜苷A，所述化学式4的黄鹌菜苷B及所述化学式5的黄鹌菜苷C的一种以上的化合物作为有效成分的肝功能改善用药物组合物。

另外，本发明提供诱导醌还原酶的活性，且使抗氧化反应因子(ARE)的活性增加，且从由乙醇与醋氨酚诱导的肝损伤保护肝的含有齿裂黄鹌菜的提取物，其级分或选自所述化学式1的氯原酸，所述化学式2的3，5-二-O-咖啡酰奎尼酸，所述化学式3的黄鹌菜苷A，所述化学式4的黄鹌菜苷B及所述化学式5的黄鹌菜苷C的一种以上的化合物作为有效成分的肝功能改善用健康功能食品组合物。

【发明效果】

由于根据本发明的含有齿裂黄鹌菜提取物，其级分或选自所述化学式1的氯原酸，所述化学式2的3，5-二-O-咖啡酰奎尼酸，所述化学式3的黄鹌菜苷A，所述化学式4的黄鹌菜苷B及所述化学式5的黄鹌菜苷C的一种以上的化合物作为有效成分的组合物使诱导作为癌预防指标酶的醌还原酶的活性，而使诱导2相解毒酶系活性的抗氧化反应因子(ARE)活性化，且不仅无细胞毒性，且从由乙醇与醋氨酚诱导的肝损伤保护肝，所以根据本发明的提取物，其级分或所述化学式1～5的化合物可在癌的预防或肝功能改善中有用地被使用。

【附图说明】

图1是示根据本发明的齿裂黄鹌菜提取物的醌还原酶相对比活性与细胞生存率的坐标图；

图2是示根据本发明的4种齿裂黄鹌菜级分的醌还原酶相对比活性的坐标图；

图3是示根据本发明的4种齿裂黄鹌菜级分的细胞生存率的坐标图；

图4是示根据本发明的化学式1～5的化合物的醌还原酶相对比活性的坐标图；

图5是示根据本发明的化学式1的氯原酸的醌还原酶相对比活性与细胞生存率的坐标图；

图6是示根据本发明的化学式2的3，5-二-O-咖啡酰奎尼酸的醌还原酶相对比活性与细胞生存率的坐标图；

图7是示根据本发明的化学式3的黄鹌菜苷A的醌还原酶相对比活性与细胞生存率的坐标图；

图8是示根据本发明的化学式4的黄鹌菜苷B的醌还原酶相对比活性与细胞生存率的坐标图；

图9是示根据本发明的化学式5的黄鹌菜苷C的醌还原酶相对比活性与细胞生存率的坐标图；

图10是示根据本发明的齿裂黄鹌菜的乙酸乙酯级分的对于抗氧化反应因子(Antioxidant response element；ARE)的效果的坐标图；

图11是示根据本发明的化学式1的氯原酸，化学式2的3，5-二-O-咖啡酰奎尼酸，化学式3的黄鹌菜苷A，化学式4的黄鹌菜苷B，化学式5的黄鹌菜苷C的对于抗氧化反应因子(Antioxidant response element；ARE)的效果的坐标图；

图12是示根据本发明的齿裂黄鹌菜提取物的在CYP2E1过表达细胞中使由乙醇诱导的毒性减小的效果的坐标图；

图13是示根据本发明的齿裂黄鹌菜提取物的使由醋氨酚诱导的毒性减小的效果的坐标图。

【实施方式】

本发明提供含有齿裂黄鹌菜提取物作为有效成分的癌预防用药物组合物。

以下，详细地说明本发明。

根据本发明的齿裂黄鹌菜提取物可从齿裂黄鹌菜或其干燥物提取而得到，且所述齿裂黄鹌菜可采集，养殖或市售等无限制地使用。

根据本发明的齿裂黄鹌菜提取物可使用利用超临界提取，亚临界提取，高温提取，高压提取或超声波提取法等的提取装置的方法或利用包括XAD及HP-20的吸附树脂的方法等本领域的常规的提取方法，且优选可加温，且回流提取或于常温提取而制备，但不限定于此。提取次数优选为1～5次，且更优选3次反复提取，或不限定于此。

所述提取物可利用水，有机溶剂或这些的混合溶剂而提取。所述有机溶剂优选为选自C₁～C₄的醇，醋酸乙酯，二氯甲烷及氯仿的任一种或这些的混合溶剂，而更优选为C₁～C₄的醇，而最优选用甲醇或乙醇提取。

作为一例，根据本发明的齿裂黄鹌菜提取物是将齿裂黄鹌菜干燥物以适当的大小粉碎而放入提取容器，并放入提取溶剂，而将溶液煮沸，且回流提取之后，放置一定时间之后用滤纸等过滤而可得到醇提取物。提取时间优选为2～12小时，且更优选为3～5小时。在以后可额外地经浓缩或冷冻干燥等的方法。

另外，本发明提供含有齿裂黄鹌菜级分作为有效成分的癌预防用药物组合物。

根据本发明的齿裂黄鹌菜级分可将所述齿裂黄鹌菜提取物使用n-己烷，乙酸乙酯及n-丁醇而施行依次地系统分级分离而得到。

进而，本发明提供含有选自由下记化学式1表示的氯原酸，由化学式2表示的3，5-二-O-咖啡酰奎尼酸，由化学式3表示的黄鹌菜苷A，由化学式4表示的黄鹌菜苷B及由化学式5表示的黄鹌菜苷C的一种以上的化合物作为有效成分的癌预防用药物组合物。

[化学式1]

[化学式2]

[化学式3]

[化学式4]

[化学式5]

所述化学式1～化学式5的化合物可由包括下列阶段而组成的制备方法而制成：

向齿裂黄鹌菜加水，有机溶剂或这些的混合物而收获齿裂黄鹌菜提取物的阶段(阶段1)；

在所述阶段1中收获的提取物用n-己烷，乙酸乙酯及n-丁醇依次地系统分级分离而得到级分的阶段(阶段2)；及

对于在所述阶段2中收获的级分而施行硅胶层析而将化学式1～化学式5的化合物分离并纯化的阶段(阶段3)。

以下依阶段更具体地说明根据本发明的所述制备方法。

首先，根据本发明的所述阶段1是用提取溶剂收获齿裂黄鹌菜提取物的阶段。所述齿裂黄鹌菜可无限制地使用采集的，养殖的或市售的等。将经干燥的齿裂黄鹌菜以适当的大小粉碎而放入提取容器。作为提取溶剂，则可使用C₁～C₄的醇，醋酸乙酯，二氯甲烷，氯仿或这些的混合溶剂，而在这些中优选使用甲醇或乙醇。将其于常温用超声波提取4小时之后用滤纸等过滤而可收获根据本发明的齿裂黄鹌菜提取物。

然后，所述阶段2是将在所述阶段1中得到的齿裂黄鹌菜提取物用改变极性的溶剂依次地分级分离而得到级分的阶段。作为所述溶剂，则可依次地使用n-己烷(n-hexane)，乙酸乙酯(ethyl acetate)及n-丁醇(butanol)。

然后，所述阶段3是对于在所述阶段2中得到的级分而施行硅胶层析而将化学式1～化学式5的化合物分离并纯化的阶段。

所述硅胶层析可使用大小排阻层析用柱而施行，且优选，则可使用填充Sephadex LH-20的柱。对于在所述阶段2中收获的级分而将100％甲醇作为移动相而施行利用Sephadex LH-20柱的硅胶层析。此时，对于收获的级分而施行高效液相层析而可分离化学式1～化学式5的化合物。

所述高效液相层析可将用20体积％到30体积％，25体积％到40体积％，25体积％乙腈被赋予浓度梯度的水与乙腈的混合溶剂用作展开溶剂而施行。此时，所述移动相的流速优选为2～15ml/分钟，而施行时间优选为0.5～1小时。

根据本发明的所述齿裂黄鹌菜提取物，级分或所述化学式1～5的化合物使醌还原酶的酶活性增加而将致癌物质解毒，从而可被用于癌的预防或肝功能改善用途。将这些的癌的预防或肝功能改善用途以具体的实验结果作为根据说明。

将对于根据本发明的齿裂黄鹌菜提取物，其级分或化学式1～5的化合物而施行以白色小鼠的肝癌细胞系(Hepa1clc7)作为对象，测定作为癌预防指标酶的醌还原酶活性诱导效果的实验(参照实施例1，实施例2及实施例3)，测定细胞毒性而将其作为基础导出癌预防指标的实验(参照实施例4，实施例5及实施例6)，以人的结肠癌细胞系(HCT116)作为对象，测定诱导2相解毒酶系活性的ARE活性的实验(参照实施例7，实施例8)及以人的肝癌细胞系(HepG2)作为对象，测定对于由乙醇与醋氨酚诱导的毒性的影响的实验(参照实施例9，实施例10)的结果整理，则如下。

首先，可知根据本发明的齿裂黄鹌菜提取物在12.5，25，50μg/ml的浓度与未处理的对照组相比而使醌还原酶活性增加各自2.3倍，2.7倍，2.4倍(图1参照)，在将醌还原酶活性的增加诱导2倍以上的12.5μg/ml的浓度不诱发细胞毒性(参照图1)。

另外，可知根据本发明的齿裂黄鹌菜的乙酸乙酯级分在12.5，25，50μg/ml的浓度与未处理的对照组相比而使醌还原酶活性增加各自2.1倍，2.7倍，3.2倍(参照图2)，在将醌还原酶活性的增加诱导2倍以上的12.5μg/ml的浓度不诱发细胞毒性(参照图3)，对在10，50，100μg/ml的浓度诱导2相解毒酶系活性的ARE活性浓度依赖性地波及影响(参照图10)。

另外，可知化学式1的氯原酸在250μM的浓度与未处理的对照组相比而使醌还原酶活性增加1.54倍(参照图5)，在将醌还原酶活性的增加诱导1.5倍以上的250μM的浓度不诱发细胞毒性(参照图5)，使在50μM的浓度诱导2相解毒酶系活性的ARE活性增加1.17倍(参照图11)。

另外，可知化学式2的3，5-二-O-咖啡酰奎尼酸在250μM的浓度与未处理的对照组相比而使醌还原酶活性增加1.39倍(参照图6)，在将醌还原酶活性的增加诱导1.3倍以上的250μM的浓度不诱发细胞毒性(参照图6)，使在50μM的浓度诱导2相解毒酶系活性的ARE活性增加1.22倍(参照图11)。

另外，可知化学式3的黄鹌菜苷A在125μM与250μM的浓度与未处理的对照组相比而使醌还原酶活性增加各自2.96，3.91倍(参照图7)，在将醌还原酶活性的增加诱导2倍以上的上述浓度不诱发细胞毒性(参照图7)，使在50μM的浓度诱导2相解毒酶系活性的ARE活性增加1.65倍(参照图11)。

另外，可知化学式4的黄鹌菜苷B在125μM与250μM的浓度与未处理的对照组相比而使醌还原酶活性增加各自2.71，3.61倍(参照图8)，在将醌还原酶活性的增加诱导2倍以上的上述浓度不诱发细胞毒性(参照图8)，使在50μM的浓度诱导2相解毒酶系活性的ARE活性增加1.22倍(参照图11)。

另外，可知化学式5的黄鹌菜苷C在62.5μM，125μM，250μM的浓度与未处理的对照组相比而使醌还原酶活性增加各自2.26，3.19，3.88倍(参照图9)，在将醌还原酶活性的增加诱导2倍以上的上述浓度不诱发细胞毒性(参照图9)，使在50μM的浓度诱导2相解毒酶系活性的ARE活性增加1.67倍(参照图11)。

另外，处理乙醇250mM时，细胞生存率减小约32％，而将本发明的齿裂黄鹌菜提取物用3.125，6.25，12.5及25μg/ml的浓度处理时，细胞生存率增加约100％以上，从而可知根据本发明的齿裂黄鹌菜提取物有效地抑制由乙醇的肝细胞的死灭(参照图12)。

另外，处理醋氨酚40mM时，细胞生存率减小约60％，而处理根据本发明的齿裂黄鹌菜提取物时，浓度依赖性地细胞生存率增加到约120％，而根据本发明的齿裂黄鹌菜乙酸乙酯级分相比丁醇级分示更高的细胞生存率，从而可知根据本发明的齿裂黄鹌菜提取物及级分有效地抑制由醋氨酚的肝细胞的死灭(参照图13)。

从而，由于根据本发明的齿裂黄鹌菜的提取物，其级分或化学式1～5的化合物使作为癌预防指标酶的醌还原酶为首的肝的解毒酶的活性增强，而不仅无细胞毒性，且从由乙醇与醋氨酚诱导的肝损伤保护肝，所以含有这些作为有效成分的药物组合物示化学的癌预防效果而可在预防癌，或改善肝功能中有用地被使用。

优选，则根据本发明的药物组合物可在肝癌或结肠预防癌中有用地被使用，但不限制于此。

另外，本发明提供含有上述的齿裂黄鹌菜提取物，其级分或化学式1～5的化合物作为有效成分的癌预防或改善用健康功能食品组合物。

进而，本发明提供含有上述的齿裂黄鹌菜提取物，其级分或化学式1～5的化合物作为有效成分的肝功能改善用药物组合物。

另外，本发明提供含有上述的齿裂黄鹌菜提取物，其级分或化学式1～5的化合物作为有效成分的肝功能改善用健康功能食品组合物。

根据本发明的含有齿裂黄鹌菜的提取物，其级分或化学式1～5的化合物作为有效成分的癌预防用药物组合物，肝功能改善用药物组合物可剂型化为下记的多样的经口或非经口施用形态，但不限定于此。

作为经口施用用剂型，则有例如，片剂，丸剂，硬/软质胶囊剂，液剂，悬浮剂，乳化剂，糖浆剂，颗粒剂，酏剂等，然而这些剂型在所述有效成分以外，可使用1种以上常规地被使用的填充剂，增量剂，润湿剂，崩解剂，助流剂，结合剂，表面活性剂等的稀释剂或赋形剂。作为崩解剂，则可用到琼脂，淀粉，海藻酸或其钠盐，无水磷酸一氢钙盐等，而作为助流剂，则可用到硅石，滑石，硬脂酸或其镁盐或钙盐，聚乙二醇等，且作为结合剂，则可用到硅酸镁铝，浆糊，明胶，黄蓍胶，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，聚乙烯吡咯烷酮，低取代度羟基丙基纤维素等。此外，也可将乳糖，右旋糖，蔗糖，甘露糖醇，山梨糖醇，纤维素、甘氨酸等用作稀释剂，且根据情况，则可一起使用一般被知的沸腾混合物，吸收剂，着色剂，香味剂，甜味剂等。

另外，含有齿裂黄鹌菜的提取物，其级分或化学式1～5的化合物作为有效成分的癌预防用药物组合物，肝功能改善用药物组合物可非经口施用，且非经口施用由注入皮下注射剂，静脉注射剂，肌肉内注射剂或胸部内注射剂的方法。此时，为制剂化为非经口施用用剂型而将齿裂黄鹌菜的提取物，其级分或化学式1～5的化合物与稳定剂或缓冲剂一起在水中混合而制备为溶液或悬浮液，而可将其制备为安瓿或瓶的单位施用型。

所述组合物被灭菌，或者可含有防腐剂，稳定剂，水化剂或乳化促进剂，为渗透压调节的盐，缓冲剂等的佐剂及其他治疗性地有用的物质，且可根据作为常规的方法的混合，颗粒化或包被方法而制剂化。

将本发明的含有齿裂黄鹌菜的提取物，其级分或化学式1～5的化合物作为有效成分的癌预防用药物组合物，肝功能改善用药物组合物剂型化为单位用量形态的情况中，作为有效成分，优选将齿裂黄鹌菜的提取物，其级分或化学式1～5的化合物以约0.1～1,500mg的单位用量含有。施用量根据如患者的体重，年龄及疾病的特殊的性质与严重性的因素而根据医生的开处方。但是，对于成人治疗必要的施用量根据施用的频度与强度而一般是一天约1～500mg范围。给成人肌肉内或静脉内施用时，作为一次施用量，则分离而一天一般是约5～300mg的全体施用量就充分，或在部分患者的情况中，可优选为更高的一天施用量。

根据本发明的齿裂黄鹌菜的提取物，其级分或化学式1～5的化合物可以癌的预防或改善，肝功能的改善作为目的而添加于食品，饮料等的健康辅助或健康功能性食品。此情况中，在将齿裂黄鹌菜的提取物，其级分或化学式1～5的化合物用作食品添加物时，对于原料而0.01～20重量％，优选则为可以0.1～5重量％的量添加。有效成分的混合量可根据使用目的(预防，健康或治疗性的处置)而适合地确定。但是，以健康及卫生作为目的而进行，或以健康调节作为目的而进行的长期的摄取时，所述量可为所述范围以下，且由于在稳定性方面无任何的问题，有效成分也可用作所述范围以上的量。所述提取物，级分或化学式1～5的化合物可与不同的食品或食品成分一起被使用，而可根据常规的方法而适宜地被使用。

对于所述食品的种类无特别的限制。作为可添加所述提取物，由其分离的级分或化学式1～5的化合物的食品的例，则有：肉类，香肠，面包，巧克力，糖果类，快餐类，饼干类，比萨饼，拉面，其他面条类，口香糖类，包括冰淇淋类的乳产品，各种汤，饮料水，茶，饮剂，醇饮料及维生素复合剂等，且均包括常规的含义上的健康食品。

本发明的食品辅助添加剂可使用多种香味剂或天然碳水化合物等。所述天然碳水化合物是如葡萄糖，果糖的单糖，如麦芽糖，蔗糖等的二糖及如糊精，环糊精的多糖，木糖醇，山梨糖醇，赤藓糖醇等的糖醇。作为甜味剂，则可使用如祝马丁，甜叶菊提取物的天然甜味剂，或如糖精，阿司帕坦的合成甜味剂等。所述天然碳水化合物的比率，根据本发明的组合物每100重量份一般是约0.01～0.04重量份，优选则为0.02～0.03重量份。

此外，根据本发明的组合物可含有：多种营养剂，维生素，电解质，香料，着色剂，果胶酸及其盐，海藻酸及其盐，有机酸，保护性胶体增稠剂，pH调节剂，稳定剂，防腐剂，甘油，醇，被用于碳酸饮料的碳酸化剂等。此外，根据本发明的组合物可含有为天然水果汁及野菜饮料的制备的果肉。这样的成分可独立地或组合而使用，且添加剂的比率不大重要，但根据本发明的组合物每100重量份，一般是从0.01～0.1重量份的范围中选择。

【实施例】

以下，通过实施例而详细地说明本发明。但，下记的实施例仅例示本发明，本发明的内容不由下记的实施例限定。

【制备例1：齿裂黄鹌菜提取物的制备】

将在江原道平昌山菜试验场采集的齿裂黄鹌菜在背阴处干燥而以适当的大小细切而向提取容器中加齿裂黄鹌菜1kg与94％乙醇5L而用超声波提取了，而用滤纸过滤而得到了提取物。提取过程反复了3次，而以后将溶剂减压浓缩及干燥而收获了70g的乙醇提取物。

【制备例2：齿裂黄鹌菜级分的制备】

将所述乙醇提取物实施系统分级分离而用n-己烷，乙酸乙酯，n-丁醇依次地分级分离而各自在n-己烷收获了18.7g，在乙酸乙酯收获了2.3g，在n-丁醇收获了5.8g及在水收获了34.4g的级分。

【制备例3：从齿裂黄鹌菜级分的化合物的制备】

【3-1：氯原酸(Chlorogenic acid)的制备】

对于在所述制备例2中收获的乙酸乙酯级分，将100％甲醇作为移动相而施行利用Sephadex LH-20柱的层析而收获了级分1～9。所述级分中将级分4(324mg)溶解于甲醇之后，施行高效液相层析而得到了氯原酸。此时，作为移动相使用了水与乙腈的混合溶剂，而用20体积％到30体积％乙腈依次地给极性40分钟而赋予了浓度梯度，而流速是10ml/分钟，使用了YMC Hydrosphere ODS(

20×250mm，5μm)柱。

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ2.02-1.74(4H，m，H-2，6)，3.54(1H，m，H-3)，3.92(1H，m，H-4)，5.07(1H，m，H-5)，6.98(1H，dd，J＝8.2，2.0Hz，H-2′)，6.77(1H，d，J＝8.2Hz，H-3′)，7.03(1H，d，J＝2Hz，H-6′)，7.43(1H，d，J＝15.9Hz，H-7′)，6.16(1H，d，J＝15.9Hz，H-8′)

¹³C-NMR(DMSO-d₆)δ73.96(C-1)，36.76(C-2)，70.74(C-3)，68.49(C-4)，71.35(C-5)，37.64(C-6)，126.04(C-1′)，121.79(C-2′)，116.17(C-3′)，148.75(C-4′)，145.98(C-5′)，115.21(C-6′)，145.37(C-7′)，114.75(C-8′)，166.20(C-9′)，175.42(COOH)

【3-2：3，5-二-O-咖啡酰奎尼酸(3，5-Di-O-caffeoylquinic acid)的制备】

将在所述制备例3-1中得到的级分5(584g)溶解于甲醇之后，将100％甲醇作为移动相而施行利用Sephadex LH-20柱的层析之后，施行高效液相层析而得到了3，5-二-O-咖啡酰奎尼酸。此时，作为移动相使用了水与乙腈的混合溶剂，且用25体积％乙腈经40分钟而赋予了浓度梯度，而流速是2ml/分钟，使用了YMC Hydrosphere ODS(

10×250mm，5μm)柱。

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ2.23-2.04(4H，m，H-2，6)，5.27(1H，m，H-3)，3.90(1H，m，H-4)，5.20(1H，m，H-5)，7.08(2H，dd，J＝2.3，8.3Hz，H-2′，2″)，6.86(2H，d，J＝8Hz，H-3′，3″)，7.13(2H，d，J＝2Hz，H-6′，6″)，7.57(1H，d，J＝16.2Hz，H-7′)，6.33(1H，d，J＝16.0Hz，H-8′)，7.53(1H，d，J＝16.3Hz，H-7″)，6.25(1H，d，J＝16.0Hz，H-8″)

¹³C-NMR(DMSO-d₆)δ73.04(C-1)，36.44(C-2)，71.47(C-3)，68.10(C-4)，71.48(C-5)，35.29(C-6)，126.12(C-1′)，121.72(C-2′)，116.38(C-3′)，148.96(C-4′)，146.14(C-5′，5″)，115.31(C-6′，8′)，145.32(C-7′)，166.67(C-9′)，126.20(C-1″)，121.96(C-2″)，116.37(C-3″)，148.83(C-4″)，115.40(C-6″)，145.69(C-7″)，114.69(C-8″)，166.14(C-9″)，175.94(COOH)

【3-3：黄鹌菜苷A(Youngiaside A)的制备】

将在所述制备例3-1中得到的级分3(621mg)溶解于甲醇之后，施行高效液相层析而得到了黄鹌菜苷A。此时，作为移动相使用了水与乙腈的混合溶剂，且用25体积％到40体积％乙腈依次地给极性40分钟而赋予了浓度梯度，而流速是10ml/分钟，使用了YMCHyd rosphere ODS(

20×250mm，5μm)柱。

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ2.12(1H，dd，J＝2.4，13.9Hz，H-2)2.45(1H，d，J＝13.9Hz，H-2)，5.96(1H，m，H-3)，3.67-3.59(4H，m，H-5，6，9，Glc-6)，2.93(1H，m，H-7)，3.06(2H，m，H-8)，6.11(1H，dd，J＝1.7，3.0Hz，H-13)，5.97(1H，m，H-13)，1.69(3H，s，H-14)，4.35(2H，quar，J＝1.6，14.3Hz，H-15)，4.13(1H，d，J＝7.8Hz，Glc-1)，3.00(1H，m，Glc-2)，3.12(1H，m，Glc-3)，3.06(2H，m，Glc-4，5)，3.45(1H，m，Glc-6)

¹³C-NMR(DMSO-d₆)δ136.51(C-1)，45.81(C-2)，128.49(C-3)，141.26(C-4)，51.88(C-5)，82.24(C-6)，57.70(C-7)，37.28(C-8)，68.06(C-9)，126.56(C-10)，139.23(C-11)，169.73(C-12)，121.35(C-13)，23.42(C-14)，67.52(C-15)，102.22(Glc-1)，73.95(Glc-2)，77.09(Glc-3)，70.46(Glc-4)，77.23(Glc-5)，61.43(Glc-6)

【3-4：黄鹌菜苷B(Youngiaside B)的制备】

将所述制备例3-1在中得到的级分3(621mg)溶解于甲醇之后，施行高效液相层析而得到了黄鹌菜苷B。此时，作为移动相使用了水与乙腈的混合溶剂，且用25体积％到40体积％乙腈依次地给极性40分钟而赋予了浓度梯度，而流速是10ml/分钟，使用了YMCHyd rosphere ODS(

20×250mm，5μm)柱。

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ2.14(1H，dd，J＝2.4，13.9Hz，H-2)2.45(1H，d，J＝13.9Hz，H-2)，5.96(1H，m，H-3)，3.67-3.63(4H，m，H-5，6，9，Glc-6)，2.93(1H，m，H-7)，3.00(2H，m，H-8)，6.12(1H，dd，J＝1.7，3.0Hz，H-13)，5.98(1H，m，H-13)，1.72(3H，s，H-14)，4.37(2H，quar，J＝1.6，14.3Hz，H-15)，4.25(1H，d，J＝7.8Hz，Glc-1)，3.21-3.17(1H，m，Glc-2，5)，4.79(1H，t，J＝9.4Hz，Glc-3)，3.30(1H，m，Glc-4)，3.49(1H，m，Glc-6)，3.35(2H，s，H-β)，7.06(2H，d，J＝8.6Hz，H-2′，6′)，6.68(2H，d，J＝8.6Hz，H-3′，5′)

¹³C-NMR(DMSO-d₆)δ136.49(C-1)，45.90(C-2)，129.06(C-3)，139.23(C-4)，51.73(C-5)，82.24(C-6)，57.70(C-7)，37.31(C-8)，68.06(C-9)，126.58(C-10)，136.49(C-11)，167.74(C-12)，121.36(C-13)，23.42(C-14)，67.53(C-15)，101.64(Glc-1)，71.85(Glc-2)，78.46(Glc-3)，68.22(Glc-4)，76.90(Glc-5)，61.09(Glc-6)，171.47(C-α)，40.14(C-β)，125.18(C-1′)，130.80(C-2′，6′)，115.43(C-3′，5′)，156.48(C-4′)

【3-5：黄鹌菜苷C(Youngiaside C)的制备】

将所述制备例3-1在中得到的级分3(621mg)溶解于甲醇之后，施行高效液相层析而得到了黄鹌菜苷C。此时，作为移动相使用了水与乙腈的混合溶剂，且用25体积％到40体积％乙腈依次地给极性40分钟而赋予了浓度梯度，而流速是10ml/分钟，使用了YMCHyd rosphere ODS(

20×250mm，5μm)柱。

¹H-NMR δ2.15(1H，dd，J＝2.4，13.9Hz，H-2)2.46(1H，d，J＝13.9Hz，H-2)，5.97(1H，m，H-3)，3.67-3.61(3H，m，H-5，6，9)，2.93(1H，m，H-7)，3.00(2H，m，H-8)，6.12(1H，dd，J＝1.3，3.0Hz，H-13)，5.98(1H，m，H-13)，1.70(3H，s，H-14)，4.37(2H，quar，J＝1.6，14.3Hz，H-15)，4.24(1H，d，J＝7.8Hz，Glc-1)，3.11-3.07(1H，m，Glc-2)，3.40-3.31(3H，m，Glc-3，5，6)，4.58(1H，t，J＝9.6Hz，Glc-4)，3.30(1H，m，Glc-4)，3.24(1H，m，Glc-6)，3.53(2H，d，J＝2.6Hz，H-β)，7.05(2H，d，J＝8.6Hz，H-2′，6′)，6.69(2H，d，J＝8.6Hz，H-3′，5′)

¹³C-NMR(DMSO-d₆)δ136.46(C-1)，45.81(C-2)，128.57(C-3)，141.06(C-4)，51.90(C-5)，82.23(C-6)，57.69(C-7)，37.31(C-8)，68.05(C-9)，126.58(C-10)，139.24(C-11)，169.72(C-12)，121.35(C-13)，23.43(C-14)，67.73(C-15)，102.13(Glc-1)，74.04(Glc-2)，74.27(Glc-3)，72.05(Glc-4)，74.53(Glc-5)，61.03(Glc-6)，171.26(C-α)，40.01(C-β)，124.87(C-1′)，130.74(C-2′，6′)，115.51(C-3′，5′)，156.58(C-4′)

【实施例1：齿裂黄鹌菜提取物的醌还原酶活性诱导效果测定】

为测定根据本发明的齿裂黄鹌菜提取物的作为癌预防指标酶的醌还原酶活性诱导效果而以白色小鼠的肝癌细胞系(Hepa1clc7)作为对象，施行了下记的实验。首先，将添加有10％胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)的a-MEM(最小必需培养基；minimum essential medium)溶液与肝癌细胞培养液混合而将细胞的数调至1×10⁵细胞/ml之后在96-孔平板处理各100μl而在5％二氧化碳及37℃的条件下培养了24小时。在细胞稳定化之后，将在所述制备例1中收获的提取物以2倍浓度梯度用3.125～200.000μg/ml之间的7个浓度处理之后，在5％二氧化碳及37℃的条件下培养了24小时。培养结束后，将细胞用磷酸缓冲盐水(PBS；phosphate buffered saline)溶液洗出之后用包含0.08％毛地黄皂苷(digitonin)与2mM EDTA的溶液80μl使细胞膜溶解，而得到了蛋白溶液。将所述蛋白溶液50μl与反应溶液A(49ml的25mM Tris缓冲液，34mg的BSA，0.34ml的1.5％吐温-20溶液，0.34ml的辅酶溶液，100单位(units)的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase)，15mg MTT，50μl的50mM甲萘醌)200μl混合而用酶标仪测定了610nm处吸光度增加率，且使用布拉德福德(Bradford)溶液而在595nm处测定而求出了蛋白的量。所述的反应溶液A中辅酶溶液由150mM葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate)，4.5mM NADP，0.75mM FAD构成了，且所述的MTT是3-(4，5-dimethylthiazo-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物)的缩略语。醌还原酶的活性由下记数学式1计算。

[数学式1]

醌还原酶的活性＝A/B

A：nmol MTT/min(处理试验样品的细胞内醌还原酶的610nm处的吸光度增加率)

B：mg蛋白(处理试验样品的细胞全体的蛋白量)

其结果示于了图1。

如从图1可知，本发明的齿裂黄鹌菜提取物在6.25，12.5，25μg/ml的浓度与未处理的对照组相比而使醌还原酶活性增加了各自2.2倍，2.3倍，2.6倍。

另一方面，由下记数学式2而计算了所述提取物的癌预防指标(Chemoprevention Index，CI)。计算结果示于了下记表1。

[数学式2]

癌预防指标(CI)＝A/B

A：IC₅₀(处理试验样品的细胞的生存率成50％的样品的浓度)

B：CD(处理试验样品的细胞的醌还原酶活性成两倍的样品的浓度)

[表1]

如示于所述表1，对于根据本发明的齿裂黄鹌菜提取物的癌预防指标(CI)是21.20，而与以往被知为癌预防功能性食品素材的莱菔硫烷(Sulforaphane，CI＝12.83)比较时，可知具有非常好的功效，且也如在图1出现，确认了在使醌还原酶活性增加两倍以上的浓度几乎无毒性。

【实施例2：齿裂黄鹌菜级分的醌还原酶活性诱导效果测定】

为测定根据本发明的齿裂黄鹌菜级分的作为癌预防指标酶的醌还原酶活性诱导效果而将白色小鼠的肝癌细胞系(Hepa1clc7)用与实施例1相同的方法处理之后，将在所述制备例2中收获的级分以2倍浓度梯度用3.125～200.000μg/ml之间的7个浓度处理之后，在5％二氧化碳及37℃的条件下培养了24小时。培养结束后，将细胞用磷酸缓冲盐水(PBS；phosphate buffered saline)溶液洗出之后用包含0.08％毛地黄皂苷(digitonin)与2mM EDTA的溶液80μl使细胞膜溶解，而得到了蛋白溶液。将所述蛋白溶液用与实施例1相同的方法测定了醌还原酶蛋白活性。测定结果示于了图2。

如从图2可知，本发明的齿裂黄鹌菜乙酸乙酯级分在12.5，25，50μg/ml的浓度与未处理的对照组相比而使醌还原酶活性增加了各自2.1倍，2.7倍，3.2倍。

另一方面，利用所述数学式2而计算了所述级分的癌预防指标(Chemoprevention Index，CI)。计算结果示于了下记表2。

[表2]

如示于所述表2，对于根据本发明的齿裂黄鹌菜级分中乙酸乙酯级分的癌预防指标(CI)是15.27，确认了与不同的溶剂的级分相比具有更好的功效。

【实施例3：化学式1～5的化合物的醌还原酶活性诱导效果测定】

为测定根据本发明的化学式1～5的化合物的作为癌预防指标酶的醌还原酶活性诱导效果而将白色小鼠的肝癌细胞系(Hepa1clc7)用与实施例1相同的方法处理之后，将在所述制备例3中收获的化合物以2倍浓度梯度7.81～250.00μg/ml之间的7个浓度用处理之后，在5％二氧化碳及37℃的条件下培养了24小时。培养结束后，将细胞用磷酸缓冲盐水(PBS；phosphate buffered saline)溶液洗出之后用包含0.08％毛地黄皂苷(digitonin)与2mM EDTA的溶液80μl使细胞膜溶解，而得到了蛋白溶液。将所述蛋白溶液用与实施例1相同的方法测定了醌还原酶蛋白活性。测定结果示于了图4。

如从图4可知，根据本发明的化学式1～5的化合物中黄鹌菜苷A在125.00，250.00μM的浓度与未处理的对照组相比而使醌还原酶活性增加了各自2.96倍，3.92倍(参照图7)。另外，黄鹌菜苷B在125.00，250.00μM的浓度与未处理的对照组相比而使醌还原酶活性增加了各自2.71，3.61倍(参照图8)。另外，黄鹌菜苷C在62.50，125.00，250.00μM的浓度与未处理的对照组相比而使醌还原酶活性增加了各自2.26倍，3.18倍，3.88倍(参照图9)。

另一方面，利用所述数学式2而计算了所述化合物的癌预防指标(Chemoprevention Index，CI)。计算结果示于了下记表3。

[表3]

化合物

CD(μg/ml)

IC50(μg/ml)

CI

氯原酸	＞500.00	＞500.00	0.27
				3，5-二-O-咖啡酰奎尼酸	＞500.00	＞500.00	0.64
黄鹌菜苷A	54.30	＞500.00	9.21
				黄鹌菜苷B	61.51	＞500.00	8.13
黄鹌菜苷C	38.26	＞500.00	13.07

如示于所述表3，化学式1～5的化合物中黄鹌菜苷A，黄鹌菜苷B，黄鹌菜苷C的癌预防指标(CI)是各自9.21，8.13，13.07，与另外两个化合物相比而使醌还原酶活性增加的效果非常卓越了，且此中确认了黄鹌菜苷C具有最好的功效。另外，如示于图7，图8及图9，确认了在使醌还原酶活性增加两倍以上的浓度几乎无毒性。

【实施例4：齿裂黄鹌菜提取物的细胞毒性测定】

为测定所述制备例1中制备的齿裂黄鹌菜提取物的细胞毒性而以白色小鼠的肝癌细胞系(Hepa1c1c7)作为对象，施行了下记的实验。首先，将添加有10％胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)的a-MEM(最小必需培养基；minimum essential medium)溶液与肝癌细胞培养液混合而将细胞的数调至1×10⁵细胞/ml之后在96-孔平板各处理100μl而在5％二氧化碳及37℃的条件下培养了24小时。在细胞稳定化之后，将在所述制备例1中收获的提取物以2倍浓度梯度用3.125～200μg/ml的7个浓度处理，而在5％二氧化碳及37℃的条件下培养了24小时。培养结束后添加CCK-8(Dojindo laboratory，Japan)试剂而在5％二氧化碳及37℃的条件下培养1小时之后测定了450nm处的吸光度。

对于齿裂黄鹌菜提取物的测定结果示于了图1。

如从图1可知，齿裂黄鹌菜提取物被确认为了在诱导醌还原酶活性化效果的12.5～50μg/ml的浓度无细胞毒性。

【实施例5：齿裂黄鹌菜级分的细胞毒性测定】

为测定所述制备例2中制备的齿裂黄鹌菜级分的细胞毒性而在对白色小鼠的肝癌细胞系(Hepa1c1c7)与所述实施例4相同地处理之后，在所述制备例2中收获的级分以2倍浓度梯度用3.125～200μg/ml的7个浓度处理，而在5％二氧化碳及37℃的条件下培养了24小时。培养结束后添加CCK-8(Dojindo laboratory，Japan)试剂而在5％二氧化碳及37℃的条件下培养1小时之后测定了450nm处的吸光度。

对于齿裂黄鹌菜级分的测定结果示于了图3。

如从图3可知，齿裂黄鹌菜级分中醌还原酶活性化效果最优秀的乙酸乙酯级分被确认为了在诱导醌还原酶活性化效果的12.550μg/ml的浓度无细胞毒性。

【实施例6：化学式1～5的化合物的细胞毒性测定】

为测定根据本发明的化学式1～5的化合物的细胞毒性而在对白色小鼠的肝癌细胞系(Hepa1c1c7)与所述实施例4相同地处理之后，将在所述制备例3中分离的化合物以2倍浓度梯度7.81～250.00μg/ml之间的7个浓度用处理，而在5％二氧化碳及37℃的条件下培养了24小时。培养结束后添加CCK-8(Dojindo laboratory，Japan)试剂而在5％二氧化碳及37℃的条件下培养1小时之后测定了450nm处的吸光度。

测定结果示于了图5，图6，图7，图8及图9。

化学式1～5的化合物中醌还原酶活性化效果最优秀的黄鹌菜苷C被确认为了在诱导醌还原酶活性化效果的至250.00μM的浓度无细胞毒性(参照也9)。

【实施例7：齿裂黄鹌菜级分的对于抗氧化反应因子(ARE)的效果测定】

为测定根据本发明的齿裂黄鹌菜级分的对于诱导2相解毒酶系的活性的抗氧化反应因子(antioxidant response element，ARE)的效果而以人的结肠癌细胞系(HCT116)作为对象，施行了抗氧化反应因子的报告基因测定(reporter gene assay)。首先，将添加有10％胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)的a-MEM(最小必需培养基；minimum essential medium)溶液与结肠癌细胞培养液混合而将细胞的数调至1×10⁵细胞/ml之后在96-孔平板各处理100ml而在5％二氧化碳及37℃的条件下培养了24小时。在细胞稳定化之后将包括抗氧化反应因子的启动子与插入有荧光素酶(luciferase)蛋白表达基因的载体phARE-luc利用Fugene(Fugene6，Roche Biochemicals)而使转化了。向插入有荧光素酶蛋白表达基因的pGL3-Basic载体(Promega)插入包括人的醌还原酶基因的抗氧化反应因子的启动子部位而制作了载体。在细胞稳定化之后，将在所述制备例1中收获的乙酸乙酯级分用10，50，100μM的浓度处理，而在5％二氧化碳及37℃的条件下培养24小时之后，使用荧光素酶分析试剂盒(Luciferase assay Kit；Promega)而分析了细胞裂解物(cell lysate)。其结果示于了图10。

如图10所示，可确认级分的处理浓度越增加，抗氧化反应因子(ARE)的活性越是浓度依赖性地增加。对此，可知本发明的乙酸乙酯级分使解毒酶系的活性增加，从而具有肝功能改善效果及化学的致癌预防效果。

【实施例8：化学式1～5的化合物的对于抗氧化反应因子(ARE)的效果测定】

为测定根据本发明的化学式1～5的化合物的对于诱导2相解毒酶系的活性的抗氧化反应因子(antioxidant response element，ARE)的效果而以人的结肠癌细胞系(HCT116)作为对象，在与所述实施例7相同地处理之后，在制备例3中分离的化合物用50μM的浓度处理，而在5％二氧化碳及37℃的条件下培养了24小时。培养结束后，使用荧光素酶分析试剂盒(Luciferase assay Kit；Promega)而分析了细胞裂解物(cell lysate)。其结果示于了图11。

如图11所示，可确认化学式1～5的化合物在50μM的浓度，抗氧化反应因子(ARE)的活性与未处理的对照组相比而增加。从而，可知根据本发明的化学式1～5的化合物使解毒酶系的活性增加，从而具有肝功能改善效果及化学的致癌预防效果。

【实施例9：齿裂黄鹌菜提取物的对于在CYP2E1过表达细胞中由乙醇诱导的毒性的影响测定】

以人的肝癌细胞系(HepG2)作为对象测定了根据本发明的齿裂黄鹌菜提取物的对于由乙醇诱导的毒性的影响。制造使在人的肝癌细胞系(HepG2)过表达CYP2E1基因的细胞系，而处理乙醇250mM而诱导肝损伤，同时，对所述制备例1中制备的提取物以2倍浓度梯度用3.125～50.000μg/ml之间的4个浓度处理，而在5％二氧化碳及37℃的条件下培养了48小时。培养结束后添加MTT试剂而在5％二氧化碳及37℃的条件下培养1小时之后测定了450nm处的吸光度。

其结果示于了图12。

如从图12可知，处理乙醇250mM时，细胞生存率减小约32％，而将本发明的齿裂黄鹌菜提取物用3.125，6.25，12.5及25μg/ml的浓度处理时，确认了细胞生存率增加约100％以上。另外，通过此而确认了根据本发明的齿裂黄鹌菜提取物有效地抑制由乙醇的肝细胞的死灭。

【实施例10：齿裂黄鹌菜提取物及级分的对于由醋氨酚诱导的毒性的影响测定】

以人的肝癌细胞系(HepG2)作为对象测定了根据本发明的齿裂黄鹌菜提取物及级分的对于由醋氨酚诱导的毒性的影响。对HepG2细胞系在不含FBS的培养基中，将齿裂黄鹌菜提取物及级分以2倍浓度梯度5～40μg/ml处理了24小时。此时，作为阳性对照组也处理莱菔硫烷(5μM)，谷胱甘肽(1mM)而比较了活性程度。除去培养基后，用PBS洗涤2次之后，向不包含FBS的培养基中添加40mM的醋氨酚而额外培养了24小时。培养结束后添加MTT试剂而在5％二氧化碳及37℃的条件下培养1小时之后测定了450nm处的吸光度。

其结果示于了图13。

如从图13可知，处理醋氨酚40mM时，细胞生存率减小约60％，而处理根据本发明的齿裂黄鹌菜提取物时，确认了浓度依赖性地细胞生存率增加到约120％，而确认了根据本发明的齿裂黄鹌菜乙酸乙酯级分相比丁醇级分示更高的细胞生存率。另外，通过此而确认了根据本发明的齿裂黄鹌菜提取物及级分有效地抑制由醋氨酚的肝细胞的死灭。

由此，由于本发明的齿裂黄鹌菜提取物，其级分或化学式1～5的化合物是代表性的第2相解毒酶，且示使作为癌预防指标酶的醌还原酶的活性增加的效果，而使抗氧化反应因子(ARE)活性化的同时，不仅无细胞毒性，且从由乙醇与醋氨酚诱导的肝损伤保护肝，所以可作为对于癌预防用药品，肝功能改善用药品，健康功能食品安全的物质有用地被利用。

在下记例示为本发明的癌的预防剂或肝功能改善剂的制剂例。

【制剂例1：药学制剂的制备】

【1-1：散剂的制备】

齿裂黄鹌菜提取物，其级分或化学式1～5的化合物2g

乳糖1g

将所述的成分混合，而填充于气密包而制备了散剂。

【1-2：片剂的制备】

齿裂黄鹌菜提取物，其级分或化学式1～5的化合物100mg

玉米淀粉100mg

乳糖100mg

硬脂酸镁2mg

将所述的成分混合之后，根据常规的片剂的制备方法而压片而制备了片剂。

【1-3：胶囊剂的制备】

齿裂黄鹌菜提取物，其级分或化学式1～5的化合物100mg

玉米淀粉100mg

乳糖100mg

硬脂酸镁2mg

将所述的成分混合之后，根据常规的胶囊剂的制备方法而填充于明胶胶囊而制备了胶囊剂。

【1-4：注射剂的制备】

齿裂黄鹌菜提取物，其级分或化学式1～5的化合物100mg

甘露糖醇180mg

Na₂HPO₄·2H₂O 26mg

蒸馏水2974mg

根据常规的注射剂的制备方法而使以被提示的含量含有所述成分而制备了注射剂。

【制剂例2：健康功能食品的制备】

【1-1：饮料的制备】

蜂蜜522mg

硫辛酸酰胺5mg

烟酸酰胺10mg

盐酸核黄素钠3mg

盐酸吡哆素2mg

肌醇30mg

乳清酸50mg

齿裂黄鹌菜提取物，其级分或化学式1～5的化合物

0.48～1.28mg

水200ml

作为所述组成及含量而使用常规的方法而制备了饮料。

【1-2：咀嚼型口香糖的制备】

口香糖基料20％

蔗糖76.36～76.76％

齿裂黄鹌菜提取物，其级分或化学式1～5的化合物

0.24～0.64％

水果香1％

水2％

作为所述组成及含量而使用常规的方法而制备了咀嚼型口香糖。

【1-3：糖果的制备】

蔗糖50～60％

淀粉浆39.26～49.66％

齿裂黄鹌菜提取物，其级分或化学式1～5的化合物

0.24～0.64％

橙香0.1％

作为所述组成及含量而使用常规的方法而制备了糖果。

【1-4：面粉食品的制备】

将根据本发明的齿裂黄鹌菜提取物，其级分或化学式1～5的化合物0.5～5重量份添加于面粉100重量份，而利用此混合物而制备面包，蛋糕，饼干，薄脆饼干及面条类而制备了健康增强用食品。

【1-5：乳制品(dairy products)的制备】

将根据本发明的齿裂黄鹌菜提取物，其级分或化学式1～5的化合物5～10重量份添加于牛奶100重量份，而利用所述牛奶而制备了如黄油及冰淇淋的多样的乳制品。

【1-6：膳食的制备】

使糙米，大麦，糯米，薏苡用公知的方法α化而使干燥而烘烤之后用粉碎机制备成粒度60筛目的粉末。

将黑豆，黑芝麻，荏胡麻也用公知的方法蒸而使干燥而烘烤之后用粉碎机制备成粒度60筛目的粉末。

将所述中制备的谷物类及种籽类与根据本发明的齿裂黄鹌菜的提取物，或级分，或化学式1～5的化合物配合为如下的比率而制备了。

糙米30％

薏苡15％

大麦20％

荏胡麻7％

黑豆7％

黑芝麻7％

齿裂黄鹌菜提取物，其级分或化学式1～5的化合物3％

灵芝0.5％

地黄0.5％

Claims (21)

1.癌预防用药物组合物，其含有利用水，有机溶剂或这些的混合溶剂而提取的齿裂黄鹌菜提取物作为有效成分。

2.权利要求1的癌预防用药物组合物，其特征在于所述有机溶剂是选自C₁～C₄的醇，醋酸乙酯，二氯甲烷及氯仿的任一种或这些的混合溶剂。

3.权利要求2的癌预防用药物组合物，其特征在于所述有机溶剂是C₁～C₄的醇。

4.权利要求3的癌预防用药物组合物，其特征在于所述C₁～C₄的醇是甲醇或乙醇。

5.权利要求1的癌预防用药物组合物，其特征在于所述齿裂黄鹌菜提取物使作为癌预防指标酶的醌还原酶的活性增加而将致癌物质解毒。

6.权利要求1的癌预防用药物组合物，其特征在于所述齿裂黄鹌菜提取物使诱导2相解毒酶系活性的抗氧化反应因子(ARE)的活性增加而将致癌物质解毒。

7.权利要求1的癌预防用药物组合物，其特征在于所述癌是肝癌或结肠癌。

8.癌预防用药物组合物，其含有齿裂黄鹌菜级分作为有效成分。

9.权利要求8的癌预防用药物组合物，其特征在于所述级分是将权利要求1的齿裂黄鹌菜提取物用n-己烷(n-hexane)，乙酸乙酯(ethyl acetate)及n-丁醇(n-butanol)依次地分级分离而得到。

10.权利要求8的癌预防用药物组合物，其特征在于所述齿裂黄鹌菜级分使作为癌预防指标酶的醌还原酶的活性增加而将致癌物质解毒。

11.权利要求8的癌预防用药物组合物，其特征在于所述齿裂黄鹌菜级分使诱导2相解毒酶系活性的抗氧化反应因子(ARE)的活性增加而将致癌物质解毒。

12.权利要求8的癌预防用药物组合物，其特征在于所述癌是肝癌或结肠癌。

13.癌预防用药物组合物，其含有选自下记化学式1，2，3，4及5的一种以上的化合物作为有效成分：

[化学式1]

[化学式2]

[化学式3]

[化学式4]

[化学式5]

14.权利要求13的癌预防用药物组合物，其特征在于所述化学式1～5的化合物由包括下列阶段的方法制成：

向齿裂黄鹌菜加水，有机溶剂或这些的混合物而收获齿裂黄鹌菜提取物的阶段(阶段1)；

将在所述阶段1中收获的提取物用n-己烷，乙酸乙酯及n-丁醇分级分离而得到级分的阶段(阶段2)；及

对在所述阶段2中收获的级分施行硅胶层析而将化合物分离并纯化的阶段(阶段3)。

15.权利要求14的癌预防用药物组合物，其特征在于所述阶段1的有机溶剂是甲醇或乙醇。

16.权利要求13的癌预防用药物组合物，其特征在于所述选自化学式1，2，3，4及5的一种以上的化合物使作为癌预防指标酶的醌还原酶的活性增加而将致癌物质解毒。

17.权利要求13的癌预防用药物组合物，其特征在于所述选自化学式1，2，3，4及5的一种以上的化合物使诱导2相解毒酶系活性的抗氧化反应因子(ARE)的活性增加而将致癌物质解毒。

18.权利要求13的癌预防用药物组合物，其特征在于所述癌是肝癌或结肠癌。

19.癌预防或改善用健康功能食品组合物，其含有权利要求118中任一项的齿裂黄鹌菜的提取物，其级分或化学式1～5的化合物作为有效成分。

20.肝功能改善用药物组合物，其含有权利要求1～18中任一项的齿裂黄鹌菜的提取物，其级分或化学式1～5的化合物作为有效成分。

21.肝功能改善用健康功能食品组合物，其含有权利要求1～18中任一项的齿裂黄鹌菜的提取物，其级分或化学式1～5的化合物作为有效成分。

Images