WO2020204605A1 - Cp2c 표적 펩티드 기반 항암제 - Google Patents

Cp2c 표적 펩티드 기반 항암제 Download PDF

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WO2020204605A1
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peptide
fatty acid
target peptide
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김철근
김민영
김찬길
손승환
김지숙
최성우
이설의
정민성
박동선
이상원
정재민
최동호
장기석
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한양대학교 산학협력단
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    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22

Definitions

  • the present invention relates to an anticancer agent based on a CP2c target peptide.
  • An object of the present invention is to provide an anticancer agent based on a CP2c target peptide that secures stability that can last for a long time in vivo, can selectively remove only various types of cancer cells, and acts on drug-resistant cancer cells as well.
  • the CP2c target peptide according to the present invention refers to a peptide that binds to the transcription factor CP2c and inhibits the formation of a transcription factor complex (CP2c homotetramer and CP2c/CP2b/PIAS1 heterohexamer) containing CP2c, thereby inducing cancer cell-specific cell death.
  • the CP2c target peptide corresponds to a peptide of the smallest size, in which Tyr-Pro-Gln-Arg (SEQ ID NO: 1) is composed of only amino acids essential for anticancer effect. Therefore, a peptide that essentially contains the four amino acids and exhibits anticancer effects by interacting with the CP2c protein can be used as the CP2c target peptide according to the present invention.
  • the CP2c target peptide according to the present invention may be a peptide consisting of 4 to 20 amino acids including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • it may be a peptide (ACP52) consisting of 6 amino acids (6 aa)'NYPQRP (Asn-Try-Pro-Gln-Arg-Pro, SEQ ID NO: 2)'.
  • the CP2c target peptide according to the present invention may be used by binding a cell-penetrating peptide (CPP) to enhance cell penetrating activity.
  • CPP cell-penetrating peptide
  • the CP2c target peptide according to the present invention is a peptide consisting of SEQ ID NO: 2 (ACP52) and a cell-penetrating peptide (CPP), with 9 amino acids (9aa)'CRGDKGPDC (Cys-Arg-Gly-Asp). It may be a peptide containing iRGD (internalizing RGD), which is a peptide consisting of -Lys-Gly-Pro-Asp-Cys, SEQ ID NO: 3)'.
  • iRGD internalizing RGD
  • 'ACP52C' an example of the CP2c target peptide according to the present invention, has iRGD bound to Ac (Acetyl group) and C-terminal Pro at the N-terminus of ACP52, and NH 2 (amide group) at the C-terminus of iRGD It is a bound peptide (see Fig. 7).
  • a CP2c target peptide-fatty acid conjugate combined with a fatty acid was prepared for the purpose of securing in vivo stability of the previously developed CP2c target peptide.
  • fatty acids When fatty acids are bound to the CP2c target peptide, it binds to albumin in the blood, thereby increasing its in vivo stability, providing high therapeutic effects.
  • the fatty acid may be a C 12 to C 20 fatty acid.
  • the fatty acid may be a C 16 fatty acid, such as palmitoyl acid (also expressed as'pal').
  • the fatty acid may be a modified fatty acid in a form combined with an amino acid sequence represented by EGLFG, which is a target sequence of glutamic acid (Glu, E) or protease Cathepsin B.
  • the modified fatty acid may be a modified fatty acid formed through a peptide bond between the carboxyl group of the fatty acid and the amino group of glycine in the amino acid sequence represented by glutamic acid or EGLFG.
  • palmitoyl acid bound to glutamic acid may be referred to as “E-pal”
  • palmitoyl acid bound to an amino acid sequence represented by EGLFG may be referred to as “EGLFG-pal”.
  • the CP2c target peptide-fatty acid conjugate according to the present invention may include a CP2c target peptide (eg, ACP52) providing CP2c targeting and a linker peptide linking them between CPP (eg, iRGD) and/or fatty acids.
  • a CP2c target peptide eg, ACP52
  • CPP eg, iRGD
  • linker peptide a peptide made of an amino acid known in the art or a combination thereof may be used without limitation.
  • the linker peptide may include glycine (Gly, G), such as Gn (where n is an integer of 1 to 6).
  • the linker peptide may consist of an amino acid sequence represented by G n KG m (where n and m are each independently an integer of 0 to 6).
  • n or m is 0, lysine (Lys, K) may be located at the N-terminus or C-terminus of the linker peptide, and when n and m are not 0, between glycine Can be located.
  • Lysine (Lys, K) included in the linker peptide is included for conjugation of a fatty acid and a peptide.
  • the terminal functional group of lysine (-HN 2 ) may enable the binding of additional amino acids
  • the conjugation of the CP2c target peptide and the fatty acid may be performed through the linker peptide. Specifically, it may be conjugated through a bond between glutamic acid, a peptide bound to the modified fatty acid, and lysine of the linker peptide. More specifically, the bond between glutamic acid of the modified fatty acid and lysine of the linker peptide may be formed through a peptide bond between the functional group (NH 2 ) of lysine and the carboxyl period of glutamic acid.
  • the CP2c target peptide-fatty acid conjugates used in the present invention have improved stability, enhanced pharmacological properties (half-life, absorption, titer, efficacy, etc.) of the peptide, altered specificity (e.g., broad biological activity spectrum), reduced
  • the N- and/or C-terminus of the peptide may be modified.
  • the formula is an acetyl group, a fluorenyl methoxy carbonyl group, an amide group, a formyl group, a myristyl group, a stearyl group, or a polyethylene glycol (PEG) bonded to the N- and/or C-terminus of the peptide.
  • the term "stability" as used in the present invention means not only in vivo stability that protects the peptide of the present invention from attack by protein cleavage enzymes in vivo, but also storage stability (eg, room temperature storage stability).
  • storage stability eg, room temperature storage stability
  • the N-terminus and C-terminus of the peptide may be modified with an acetyl group and an amide group, respectively.
  • the CP2c target peptide-fatty acid conjugate according to an embodiment of the present invention is as follows:
  • the K functional group is attached to the glutamic acid alpha carbon carboxyl group of E-Pal (C-16-ACP52Cm, ACP52GK)
  • the K functional group is attached to the glutamic acid gamma carbon carboxyl group of E-Pal ( ⁇ C16-ACP52Cm, ACP52CGK).
  • ACP52GK and ACP52CGK in the CP2c target peptide-fatty acid conjugate according to the present invention are as follows:
  • in vivo stability anticancer efficacy, in a xenograft mouse model of liver cancer cells (Hep3B) or breast cancer cells (MDA-MB-231) using the synthesized four types of CP2c target peptide-fatty acid conjugates,
  • the tumor metastasis inhibitory effect and physiological toxicity were analyzed, and as a result, it was confirmed that the in vivo stability, tumor suppression, and tumor metastasis inhibitory effect were excellent, and it was confirmed that it is a safe material without toxicity to the living body.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition and a health functional food composition for preventing, improving and treating cancer comprising a CP2c target peptide-fatty acid conjugate as an active ingredient.
  • the present invention comprises administering the CP2c target peptide-fatty acid conjugate or a pharmaceutical composition containing the same to an individual in need thereof in a pharmaceutically effective amount, treating an individual Provides a way to do it.
  • the cancer may include an anticancer agent, in particular, a resistant cancer exhibiting resistance to the anticancer agent based on the CP2c target peptide-fatty acid conjugate according to the present invention.
  • treatment refers to any action in which the symptoms of cancer are improved or advantageously changed by administration of the peptide according to the present invention or a pharmaceutical composition comprising the same.
  • the term "administration" means introducing a predetermined substance, that is, a peptide derivative according to the present invention or a pharmaceutical composition comprising the same, to a subject by any suitable method, and the route of administration thereof is to allow the drug to reach the target tissue. It can be administered through any general route as far as possible.
  • the route of administration may be intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, rectal administration, etc., but is not limited thereto.
  • the oral composition is preferably coated with an active agent or formulated to be protected from degradation in the stomach. Preferably, it can be administered in the form of an injection.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be administered by any device capable of moving the active substance to target cells.
  • the term "contained as an active ingredient” means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type of disease, severity, and drug Activity, sensitivity to drugs, time of administration, route of administration and rate of excretion, duration of treatment, factors including drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field.
  • the peptide according to the present invention or a pharmaceutical composition comprising the same may be administered as an individual therapeutic agent or administered in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with a conventional therapeutic agent, and may be administered single or multiple.
  • the dosage and frequency of the pharmaceutical composition of the present invention are determined according to the type of drug as the active ingredient, along with various related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the age, sex and weight of the patient, and the severity of the disease.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment.
  • suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on factors such as formulation method, mode of administration, age, weight, sex, severity of disease symptoms, food, administration time, route of administration, excretion rate and response sensitivity. In general, a skilled physician can easily determine and prescribe an effective dosage for the desired treatment.
  • the term "individual" of the present invention includes animals or humans such as horses, sheep, pigs, goats, camels, antelopes, dogs, etc., having diseases whose symptoms can be improved by administration of the therapeutic composition according to the present invention.
  • diseases can be effectively prevented and treated.
  • the treatment method according to the present invention may be a method of treating animals other than humans, but is not limited thereto. That is, in the case of humans, when considering having a disease in which symptoms can be improved by administration of the composition according to the present invention, it can be sufficiently used in human treatment.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may contain various pharmaceutically acceptable carriers as long as the peptide according to the present invention is contained as an active ingredient.
  • Pharmaceutically acceptable carriers can be used as binders, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, colors, flavors, etc. for oral administration, and buffers and preservatives for injections.
  • Painless agent, solubilizer, isotonic agent, stabilizer, etc. may be mixed and used, and in the case of topical administration, a base agent, excipient, lubricant, preservative, and the like may be used.
  • the formulation of the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in various ways by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, in the case of oral administration, it can be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc., and in the case of injections, it can be prepared in the form of unit dosage ampoules or multiple dosage forms. .
  • Other solutions, suspensions, tablets, pills, capsules, sustained-release preparations, and the like may be formulated.
  • examples of carriers, excipients and diluents suitable for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl Cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil may be used.
  • fillers, anti-aggregating agents, lubricants, wetting agents, flavoring agents, preservatives, and the like may additionally be included.
  • the peptide according to the present invention can also be contained as an active ingredient in a health functional food composition, and the food composition according to the present invention can be prepared in the form of a composition by mixing it with a known active ingredient known to have an anticancer function. Additional scientifically acceptable food supplements may be included.
  • the health functional food composition of the present invention includes compositions for all types of food such as functional food, nutritional supplement, health food, and food additives.
  • Food compositions of this type can be prepared in various forms according to conventional methods known in the art.
  • a health food it can be prepared in various forms such as tablets, pills, powders, capsules, gums, vitamin complexes, juices and drinks, and a food composition containing the peptide according to the present invention as an active ingredient is granulated, It can be encapsulated or powdered and consumed.
  • the food composition of the present invention may include ingredients that are commonly added during food production, and may include, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients, and seasonings.
  • citric acid liquid fructose, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, fruit juice, jujube extract, licorice extract, and the like may be additionally included in addition to the peptide of the present invention.
  • food additives common in the art, for example, flavoring agents, flavoring agents, coloring agents, fillers, stabilizers, and the like may be included.
  • various flavoring agents or natural carbohydrates may be contained as additional ingredients.
  • natural carbohydrates include, for example, monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and conventional sugars such as xylitol, sorbitol, These are sugar alcohols such as erythritol.
  • sugar alcohols such as erythritol.
  • natural flavoring agents tacrine, stevia extract (e.g., rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.)
  • synthetic flavoring agents sacharin, aspartame, etc.
  • the food composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic flavoring agents and natural flavoring agents, coloring agents and heavy weight agents (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and salts thereof, alginic acid. And salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonates used in carbonated beverages, and the like. These components may be used independently or in combination.
  • 1 is a graph showing GI 50 values according to ACP52c treatment in various cancer cell lines.
  • 2A-D show the results of analysis of G2/M cell cycle arrest and cell death induction (subG1 cells) according to ACP52c treatment using FACS.
  • 3A-C are diagrams showing that ACP52C treatment causes an increase in the expression of p53, which regulates cell cycle regulation and apoptosis.
  • 4A-C are diagrams showing that apoptosis is induced by ACP52C treatment.
  • FIG. 5 shows the results of analysis of the migration pathway of ACP52C over time in the MDA-MB-231 cell line, its intracellular location, and intracellular residence time.
  • 6A-H show the results of in vivo half-life analysis for the ACP52C peptide.
  • Figures 8a-d show the results of cell growth analysis according to treatment with C 16 fatty acid-binding peptide (ACP52C; ACP52CG; ACP52CK) in various cancer cell lines.
  • FIGS. 9A-C show the results of cell growth analysis according to C 16 fatty acid-binding peptide (ACP52C; ACP52CG; ACP52CK) treatment in various p53 mutant or null cancer cell lines.
  • 10A-G are cells according to ACP52CGK treatment in normal cell lines (BEAS2B, hMSC) and cancer cell lines (Hep3B, Hs746T, Caov-3, MDA-MB-231, U343, HCT116, PANC1, PC3, A549, THP-1) Shows the results of the growth analysis.
  • Figures 11a-e show the results of analysis of the anticancer effects of ACP52CG and ACP52CK in the Hep3B cell line xenograft mouse model.
  • 13A-D show the results of analysis of anticancer effects of ACP52CG and ACP52CK in a liver cancer induction mouse model by DEN treatment.
  • 14A-D show the results of analysis of anticancer effects of ACP52CG and ACP52CK in a xenograft mouse model of the MDA-MB-231 (LM1) cell line.
  • Figure 15a-j shows the anti-cancer effect (tumor size, weight, body weight and hematological analysis) and metastasis inhibitory effect analysis results when ACP52CGK was treated with three different doses at 3 days intervals in the Hep3B cell line xenograft mouse model.
  • Figures 16a-k show the anti-cancer effect (tumor size, weight, weight and hematological analysis) and metastasis inhibition effect analysis results when ACP52CGK was treated with three different doses at 5-day intervals in the Hep3B cell line xenograft mouse model.
  • Figure 17a-j shows the anticancer effect (tumor size, weight, weight, and hematologic analysis) and metastasis when ACP52CGK was treated with three different doses at 3-day intervals in the MDA-MB-231 (LM1) cell line xenograft mouse model. Inhibitory effect analysis results are shown.
  • 18A-K show anticancer effects (tumor size, weight, weight and hematologic analysis) and metastasis when ACP52CGK was treated with three different doses at 5-day intervals in the MDA-MB-231 (LM1) cell line xenograft mouse model. Inhibitory effect analysis results are shown.
  • 19a-b show the results of in vivo half-life analysis using fluorescently labeled ACP52CGK.
  • Figures 20a-b show the migration pathway of ACP52CGK over time in the MDA-MB-231 cell line and the results of analysis of the intracellular location and intracellular residence time.
  • Figure 21 shows the analysis results of the formation of antibodies to ACP52C, ACP52CG, ACP52CK and ACP52CGK through ELISA.
  • Figure 22a-e shows the results of in vivo emergency and repeated toxicity experiments for ACP52C.
  • 25A-D show the results of analysis of the efficacy of ACP52CGK in cells cultured from tumor tissues of breast cancer patients.
  • 26A-D show the results of analysis of the efficacy of ACP52CGK in cells cultured from cancer tissues of breast cancer patients that had been cryopreserved.
  • 27A-D show the results of comparative analysis of the efficacy of ACP52CGK in cells cultured from PDX tumor tissues by generation.
  • 28A-B show the results of analysis of potency and resistance to ACP52CGK in cells derived from patient tumor tissues.
  • 30A-C show the results of expression analysis of CP2c transcription-activity-independent pathway proteins according to ACP52C treatment in lung cancer cell lines (A549, PC9, KCL22).
  • 31A-B show the results of expression analysis of CP2c transcription-activity-independent pathway proteins according to MDM2 overexpression in lung cancer cell lines (A549, PC9).
  • 32A-D show the results of cell growth analysis according to ACP52C treatment in the A549 cell line that induced long-term MDM2 overexpression.
  • Figure 33a-d shows the MDM2p60 expression model and lung cancer cell line-specific alternative splicing and SNP analysis results.
  • Figures 34a-d show the results of the efficacy analysis according to the combination treatment of Caspase2 inhibitor and ACP52C in ACP52C resistant cells.
  • FIG. 35 shows cell morphology changes according to combination treatment with a Caspase2 inhibitor and ACP52C in ACP52C resistant cells.
  • the transcription factor CP2c is known to be overexpressed in a variety of cancers, and according to a study by a research team in the United States, inhibition of CP2c expression in liver cancer cell lines inhibits growth, and it has been reported that overexpression of CP2c results in malignant and metastasis of cancer. [Grant et al., Antiproliferative small-molecule inhibitors of transcription factor LSF reveal oncogene addiction to LSF in hepatocellular carcinoma, Proc. Natl. Acad. Sci. 2012; 109(12): 4503-4508].
  • the present inventors have identified peptides that bind to transcription factor CP2c (also known as Tfcp2, LSF, LBP1, UBP1, etc.) by phage display method [Kang et al., Identification and characterization of four novel peptide motifs that recognize] distinct regions of the transcription factor CP2, FEBS Journal 2005; 272:1265-1277], one of the peptides (CP2c target peptide, SEQ ID NO: 2) that interferes with the DNA binding of CP2c was selected, and 9 cell-penetrating peptides (CPP) were used to improve cell permeability.
  • CP2c target peptide SEQ ID NO: 2
  • iRGD internalizing RGD
  • 9aa)'CRGDKGPDC Cys-Arg-Gly-Asp-Lys-Gly-Pro-Asp-Cys, SEQ ID NO: 3'
  • the selected peptide binds to CP2c and inhibits the formation of a transcription factor complex (CP2c homotetramer and CP2c/CP2b/PIAS1 heterohexamer) containing CP2c, thereby indirectly interfering with the DNA binding of CP2c.
  • a transcription factor complex CP2c homotetramer and CP2c/CP2b/PIAS1 heterohexamer
  • CP2c CP2c homotetramer and CP2c/CP2b/PIAS1 heterohexamer
  • ACP52C The growth inhibition and cell death efficacy of ACP52C was determined by FACS analysis of cell cycle changes by synchronizing the cell cycle in the G1/S phase through the double thymidine block method, and then processing ACP52C to form polyploids at the G2/M phase. Confirmed. On the other hand, it was confirmed that when ACP52C was treated in the cell line synchronized with the G2/M phase according to the nocodazole treatment, the subG1 phase stopped and cell death was induced (FIGS. 2a-d).
  • the G2/M phase arrest caused by ACP52C was indicated by increased expression of CHK1/2 protein and decreased Cdc25c, CDK1 and cyclin B proteins, whereas induction of apoptosis resulted in decreased expression of anti-apoptotic marker protein and pro-apoptotic protein expression. It was confirmed that it is caused by apoptosis leading to an increase and activation of caspase (Figs. 3a-c, 4a-c).
  • Cy5-ACP52C Cy5 labeled peptide
  • the CP2c target peptide-fatty acid conjugate synthesized in Preparation Example 2 was analyzed for specific cell death effects in various cancer cells.
  • the three kinds of C 16 fatty acid-binding peptides ACP52CG, ACP52CK, and ACP52CGK all induced cancer cell-specific cell death similar to the control group ACP52C, and the GI 50 value confirmed at 48 hours after treatment was similar or more efficient (Fig. 8a). -d, Figs. 10a-g).
  • ACP52CG and ACP52CK were injected 5 times into the tail vein in Hep3B xenograft mice at intervals of 3 days.
  • both ACP52CG and ACP52CK showed similar efficacy to sorafenib, but were less effective than ACP52C.
  • no specific abnormalities were found in normal tissues and blood levels, so toxicity was not shown (FIGS. 11a-e).
  • mice 22 weeks after DEN treatment were treated with vehicle only as a control group (mock), sorafenib and ACP52CG-GFLGE (ACP52CK), the only licensed as a liver cancer treatment group, 3 groups (7-8 Two/group), and the drug was injected through the tail vein 12 times at 3 days intervals at a concentration of 5 mg/Kg.
  • ACP52GK was injected 5 times into the tail vein at 3 days intervals, and the efficacy was analyzed. As a result, the efficacy was inferior to ACP52C, but the effect was confirmed to be superior to the control group, FQI.
  • Hep3B xenograft mice were injected 5 times with ACP52CGK at three concentrations (1.39, 2.77 or 5.54 mg/kg) into the tail vein at 3 day intervals, and the volume of the tumor was measured. 24 days after tumor cell injection, the mice were sacrificed. And the tumor and major tissues were excised. For the collected blood, a basic CBC analysis was performed using a Coulter LH 750 Hematology Analyzer. After measuring the weight of the tumor, the tumor was stained with 4% formaldehyde along with the major organs, and then a piece of tissue was made through a paraffin section and then hematoxylin. /Eosin staining was performed. Various acquired data were statistically analyzed using an Excel program.
  • ACP52CGK exhibits a tumor suppressing effect similar to ACP52C, and no specific abnormalities were found in normal tissues and blood levels (FIGS. 15a-d and 15g-j).
  • Fig. 15e-f showing the mean and standard deviation of the tumor area metastasized to the lungs, it was confirmed that ACP52CGK has superior tumor metastasis inhibitory effect than ACP52C.
  • ACP52CGK was injected 5 times at 5 day intervals at 3 concentrations (1.39, 2.77, 5.54 mg/kg) and the anticancer effect was evaluated in the same manner as described above.
  • the inhibitory effect was concentration-dependent (FIGS. 16a-g).
  • ACP52CGK was injected at intervals of 5 days compared to when injected at intervals of 3 days, it showed more efficient tumor suppression and metastasis inhibitory effects (compared to Figs. 15a-j and 16a-k), and all results were synthesized and analyzed.
  • 2.77 mg/kg was the optimal concentration.
  • no specific abnormality was found in blood levels, so no toxicity was observed (Fig. 16h-k).
  • Cy5 labeled ACP52CGK was treated in the cell line culture for 30 minutes, and then the migration path of the peptide was tracked over time, and it was also used as mitochondria (Hsp60) and lysosome (LC3). Whether it is moving was analyzed by confocal microscopy. As a result, ACP52CGK was located in the nucleus from 4 hours through the cytoplasm, and came out to the cytoplasm after 8 hours, and part of it was located in the mitochondria, but moved to the lysosome and decomposed in 16 hours. These intracellular pathways, distributions, and stability of ACP52CGK were similar to those in ACP52C (FIGS. 20a-b).
  • ACP52C peptide was not immunogenic as 15 amino acids. To verify this, immunogenicity was confirmed. Since the final candidate material will bind C-16 palmitoyl acid to ACP52C, it was decided to analyze the formation of antibodies against ACP52CG and ACP52CK in the process of deriving the final new drug candidate. As a result of performing ELISA analysis on serum isolated from animals injected with ACP52CG and ACP52CK three times, both rabbit serum did not cause an immune response in all of ACP52CG, ACP52CK and ACP52CGK, including ACP52C. Therefore, it was determined that the final candidate material (ACP52CGK) would not exhibit immunogenicity in humans (FIG. 21).
  • ACP52CGK was injected intravenously for 28 days in a solvent group and a high-dose group (100 mg/Kg) consisting of 6 females and 6 males each at 3 days intervals, followed by weight change required in non-clinical experiments, drinking feed intake, major Histologic analysis of organs, organ weight, hematological test and blood biochemical test were analyzed. As a result, no abnormal findings were found (FIGS. 22a-e, 23, 24, Table 1, Table 2, Table 3, Table 4).
  • ACP52CGK which was tested on cancer cell lines and xenograft mouse models, can be applied equally to actual clinical practice.
  • the effect of ACP52CGK on cells cultured from tumor tissues of breast cancer patients in fresh state was evaluated. Analyzed. As a result, it was confirmed that ACP52CGK induces cell death within and outside of GI50: ⁇ 2 uM similar to that in the cancer cell line experiment (FIGS. 25a-d).
  • MDM2p60 is known to be a protein in which the C-terminal region of MDM2p90, which contains sites phosphorylated by ATM (S386, S395, S407), is known to be deleted, it was determined that it would not be degraded and regulated by ACP52C treatment (Fig. 29, Fig. 30A- c).
  • MDM2p90 was continuously overexpressed by treatment with doxycycline for 3 weeks, and the CP2c transcriptional activity-dependent and independent marker proteins were confirmed by immunoblot week by week. Interestingly, it was confirmed that the expression of p53 protein and YY1 decreased. I did. Meanwhile, as a result of analyzing the induction of cell death according to ACP52C treatment by the MTT assay, it was confirmed that cell death was induced from the second week. Therefore, it was proved that the low expression of MDM2p90 in lung cancer cell lines is the cause of ACP52C resistance (Figs. 31a-b, 32a-d).
  • the MDM2 protein was confirmed by immunoblot by treatment with a caspase2 inhibitor (AC-VDVAD-CHO).
  • a caspase2 inhibitor AC-VDVAD-CHO
  • the protein amount of MDM2p90 by treatment with the caspase2 inhibitor was While increasing, it was confirmed that the protein amount of MDM2p60 decreased. Therefore, the MDM2p60 form, which is overexpressed in lung cancer cells, is the result of cleavage of MDM2p90 by caspase2.
  • the ACP52CGK peptide improved in vivo stability compared to the existing ACP52C peptide and, like ACP52C, showed growth inhibition/cell death in all carcinoma cells, but did not have a significant effect on normal cells.
  • a combination treatment with a caspase 2 inhibitor on cancer cells showing drug resistance to ACP52C showed anticancer effects in all carcinomas.

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Abstract

본 발명은 CP2c 표적 펩티드 기반 항암제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 CP2c 표적 펩티드는 전사인자 CP2c에 결합하여 CP2c를 포함하는 전사인자 복합체 (CP2c homotetramer 및 CP2c/CP2b/PIAS1 heterohexamer) 형성을 억제함으로써 암세포 특이적 세포사를 유도하는 펩티드로, 이와 같은 펩티드에 지방산을 결합시킴으로써 생체 내에서 장기간 지속될 수 있는 안정성을 확보할 수 있다.

Description

CP2C 표적 펩티드 기반 항암제
본 발명은 CP2c 표적 펩티드 기반 항암제에 관한 것이다.
현재까지 많은 단백질/펩티드성 항암제와 저분자 화합물 기반 항암제가 개발되어 사용되고 있으나, 생체 내에서 암세포에만 선택적으로 작용하지 않고 정상세포에도 영향을 나타내는 심각한 부작용을 유발하며, 약제 내성을 가진 암세포의 출현으로 그 효력이 미미하게 작용하고 있다. 뿐만 아니라 개발 중인 많은 단백질/펩티드성 항암제가 생체 내에서 짧은 반감기를 가지고 있어서, 이를 극복하기 위한 다양한 연구가 진행 중이다. 이와 같이 전 세계적으로 항암제를 개발하기 위한 노력을 경쟁적으로 하고 있지만, 생체내 안정성, 안전성 및 약제 내성에 대한 문제점으로부터 자유로운 항암제는 아직까지 개발되고 있지 않다. 따라서 생체 내에서 장기간 지속될 수 있는 안정성을 확보하고, 다양한 종류의 암세포만을 선택적으로 제거할 수 있으며, 약제 내성 암세포에도 작용하는 항암제가 개발될 수 있다면 범세계적으로 고부가 가치를 가져올 수 있을 것이다.
본 발명은 생체 내에서 장기간 지속될 수 있는 안정성을 확보하고, 다양한 종류의 암세포만을 선택적으로 제거할 수 있으며, 약제 내성 암세포에도 작용하는 CP2c 표적 펩티드 기반 항암제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명에 따른 CP2c 표적 펩티드는 전사인자 CP2c에 결합하여 CP2c를 포함하는 전사인자 복합체 (CP2c homotetramer 및 CP2c/CP2b/PIAS1 heterohexamer) 형성을 억제함으로써 암세포 특이적 세포사를 유도하는 펩티드를 의미한다. CP2c 표적 펩티드는 Tyr-Pro-Gln-Arg (서열번호 1)가 항암 효과에 필수적인 아미노산들만으로 구성된 최소 크기의 펩티드에 해당한다. 따라서, 상기 4개의 아미노산을 필수적으로 포함하며, CP2c 단백질과 상호작용함으로서 항암 효과를 나타내는 펩타이드를 본 발명에 따른 CP2c 표적 펩티드로서 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 CP2c 표적 펩티드는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 4개 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 펩티드일 수 있다. 바람직하게는 6개의 아미노산(6 aa)'NYPQRP(Asn-Try-Pro-Gln-Arg-Pro, 서열번호 2)'로 이루어진 펩티드(ACP52)일 수 있다.
본 발명에 따른 CP2c 표적 펩티드는 세포 투과 활성의 증진을 위해, 세포막 투과 펩타이드(CPP: cell-penetrating peptide)를 결합시켜 사용할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 CP2c 표적 펩티드는 서열번호 2로 이루어진 펩티드(ACP52)와 세포막 투과 펩티드(CPP: cell-penetrating peptide)로서 9개의 아미노산(9aa)'CRGDKGPDC(Cys-Arg-Gly-Asp-Lys-Gly-Pro-Asp-Cys, 서열번호 3)'로 이루어진 펩티드인 iRGD(internalizing RGD)를 포함하는 펩티드일 수 있다. 본 발명에 따른 CP2c 표적 펩티드의 일예인 'ACP52C'는 ACP52의 N-말단에 Ac(Acetyl group) 및 C-말단 Pro에 iRGD가 결합되어 있으며, iRGD의 C-말단에 NH 2(amide group)가 결합되어 있는 펩티드이다(도 7 참조).
또한, 본 발명에서는 종래 개발된 CP2c 표적 펩티드의 생체 내 안정성을 확보할 목적으로 지방산과 결합된 CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트를 제조하였다. CP2c 표적 펩티드에 지방산을 결합시키면 혈액 내 알부민과 결합함으로써 생체 내 안정성이 증가되어 높은 치료 효과를 제공한다.
이에 제한되는 것은 아니나, 상기 지방산은 C 12 내지 C 20의 지방산일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 지방산은 C 16 지방산, 예컨데, 팔미토일산(palmitoyl acid, 'pal'로도 표현됨)일 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예에서, 상기 지방산은 글루탐산(Glu, E) 또는 단백질 분해효소 Cathepsin B의 표적서열인 EGLFG로 표시되는 아미노산 서열과 결합된 형태의 변형 지방산일 수 있다. 구체적으로, 상기 변형 지방산은 지방산의 카복실기와 글루탐산 또는 EGLFG로 표시되는 아미노산 서열 중 글리신의 아미노기 사이에서 펩티드 결합을 통해 형성된 변형 지방산일 수 있다. 본 명세서에서, 글루탐산과 결합된 팔미토일산은 “E-pal”로, EGLFG로 표시되는 아미노산 서열과 결합된 팔미토일산은 “EGLFG-pal”로 지칭될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트는 CP2c 표적성을 제공하는 CP2c 표적 펩티드(예컨대, ACP52)와 CPP(예컨대, iRGD) 및/또는 지방산 사이에 이들을 연결해 주는 링커 펩티드를 포함할 수 있다. 상기 링커 펩티드는 당 업계에 알려진 아미노산 또는 이들의 조합으로 이루어지는 펩티드가 제한없이 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 링커 펩티드는 글리신(Gly, G), 예컨대 Gn(여기서 n은 1 내지 6의 정수)을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 일 구체예에서, 상기 링커 펩티드는 G nKG m(여기서 n 및 m은 각각 독립적으로 0 내지 6의 정수이다)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 상기 n 또는 m이 0인 경우에는 라이신(Lys, K)이 상기 링커 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 위치할 수 있으며, n 및 m이 0이 아닌 경우에는 글리신의 사이에 위치할 수 있다. 상기 링커 펩티드에 포함된 라이신(Lys, K)은 지방산과 펩티드의 컨쥬게이션을 위해 포함된 것이다. 구체적으로, 라이신의 말단 작용기(-HN 2)는 추가적인 아미노산의 결합을 가능하게 할 수 있다,
본 발명에 따른 CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트에서 상기 CP2c 표적 펩티드 및 지방산의 컨쥬게이션은 상기 링커 펩티드를 통해 이루어질 수 있다. 구체적으로, 상기 변형 지방산에 결합된 펩티드인 글루탐산과 상기 링커 펩티드의 라이신 간의 결합을 통해 컨쥬게이션될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 변형 지방산의 글루탐산과 상기 링커 펩티드의 라이신 간의 결합은 라이신의 작용기(NH 2)와 글루탐산의 카복실기간의 펩티드 결합을 통해 형성된 것일 수 있다.
한편, 본 발명에서 사용된 CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트들은 펩타이드의 향상된 안정성, 강화된 약리 특성 (반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성 (예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 펩타이드의 N- 및/또는 C-말단이 수식(modification)되어 있을 수 있다. 바람직하게, 상기 수식은 상기 펩타이드의 N- 및/또는 C-말단에 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 아미드기, 포르밀기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 결합된 형태일 수 있으나, 펩티드의 개질, 특히 펩티드의 안정성을 향상시킬 수 있는 성분이라면, 제한없이 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "안정성"은 생체 내 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩티드를 보호하는 인 비보 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성 (예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다. 본 발명에 따른 CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트에서 펩티드의 N-말단과 C-말단은 각각 아세틸기와 아미드기로 수식되어 있을 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트는 다음과 같다:
1) Ac-K(E-pal)-GG-를 N-말단의 Ac가 없는 ACP52C의 N-말단에 붙인 것(C16-ACP52Cn, ACP52CG),
2) Ac-K(EGLFG-pal)-GG-를 N-말단의 Ac가 없는 ACP52C의 N-말단에 붙인 것(A16-GFLG-ACP52Cn, ACP52CK),
3) ACP52와 iRGD 사이에 위치한 GG-K-GG 연결 부위 중 K의 작용기를 E-Pal의 글루탐산 알파 탄소 카복실기에 붙인 것 (C-16-ACP52Cm, ACP52GK)
4) ACP52와 iRGD 사이에 위치한 GG-K-GG 연결 부위 중 K의 작용기를 E-Pal의 글루탐산 감마 탄소 카복실기에 붙인 것 (γC16-ACP52Cm, ACP52CGK).
[규칙 제91조에 의한 정정 17.06.2020]　
예를 들어, 본 발명에 따른 상기 CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트 중 ACP52GK 및 ACP52CGK의 구조는 다음과 같다:
[규칙 제91조에 의한 정정 17.06.2020]　
Figure WO-DOC-FIGURE-20
본 발명의 실시예에서는, 합성된 4종의 CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트를 사용하여 간암세포 (Hep3B) 또는 유방암세포 (MDA-MB-231)의 이종이식 생쥐모델에서 생체내 안정성, 항암 효력, 종양 전이 억제 효력 및 생리 독성을 분석하였고, 그 결과, 생체 내 안정성, 종양 억제 및 종양 전이 억제 효과가 우수함을 확인하였고, 생체에 대하여 독성이 없는 안전한 물질임을 확인하였다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서, 합성된 4종의 CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트를 처리하여 항암 효과를 확인하는 과정에서, CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트에 대한 내성을 갖는 세포가 발생함을 확인하였다. 이에 상기 내성의 발생 기전 및 원인이 CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트가 처리된 세포에서 MDM2p90의 감소 때문임을 확인하였다. 이에 따라, 내성 세포에서 MDM2p90의 분해를 억제하여 그 수를 유지 또는 증가시킬 수 있는 caspase2 억제제를 CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트와 함께 처리한 결과, 내성 암세포에서도 종양 억제 효과가 유지됨을 확인하였다.
이에 따라, 본 발명은 CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트를 유효성분으로 포함하는 암 예방, 개선 및 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에 약제학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 개체를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 암은 항암제, 특히, 본 발명에 따른 CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트 기반 항암제에 대한 저항성을 나타내는 내성암도 포함될 수 있다.
본 발명에서 용어 "치료"는 본 발명에 따른 펩티드 또는 이를 포함하는 약학적 조성물의 투여로 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 대상에게 소정의 물질, 즉 본 발명에 따른 펩티드 유도체 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 도입하는 것을 의미하고, 이의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예컨대, 투여 경로는 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나, 경구 투여 시 펩티드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에서, "유효 성분으로 함유"라는 용어는, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 펩티드 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량과 횟수는 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미한다. 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 용어 "개체"는 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 질병을 가진 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물 또는 인간을 포함한다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 개체에게 투여함으로써, 질병을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다. 본 발명에 따른 상기 치료방법은 인간을 제외한 동물을 치료하는 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 인간의 경우 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 질병을 가지는 것을 고려할 때, 인간의 치료에 있어서도 충분히 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 본 발명에 따른 펩티드가 유효 성분으로 함유되는 한, 약학적으로 허용 가능한 다양한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여용의 경우에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있고, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여용의 경우에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수도 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 펩티드는 건강기능식품 조성물에 유효성분으로서 함유되는 것도 가능한 바, 본 발명에 따른 식품 조성물은 항암 기능이 있는 것으로 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물 형태로 제조할 수 있으며, 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 건강기능식품 조성물은 기능성 식품 (functional food), 영양 보조제 (nutritional supplement), 건강식품 (health food) 및 식품 첨가제 (food additives) 등의 모든 형태의 식품에 대한 조성물을 포함한다.
상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강식품으로는 정제, 환약, 분말, 캡슐, 껌, 비타민 복합체, 쥬스 및 드링크 등의 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 본 발명에 따른 펩티드를 유효성분으로 하는 식품 조성물을 과립화, 캡슐화 또는 분말화하여 섭취할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함할 수 있다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 펩티드 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다. 또한, 식품보조첨가제로서, 당업계에 통상적인 식품첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함시킬 수 있다. 또한, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수도 있다. 천연 탄수화물의 구체적인 예로는, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스 등의 다이사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 폴리사카라이드 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 포함시킬 수도 있다.
더 나아가, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수도 있다. 이러한 성분들은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
발명에서는 범용 항암제로서의 효과를 보인 전사인자 CP2c 표적 펩티드 ACP52C의 생체내 안정성을 향상시킨 최종후보물질을 동정하기 위해, CP2c 표적 펩티드 선도물질 ACP52C에 C 16 지방산을 연결시켜 생체내 안정성 및 항암 효력을 보이는지를 암세포이종이식 생쥐 모델에서 확인하였다. 또한 각 종 암세포 및 정상세포에서 최종항암후보물질의 암세포 특이적 항암 효력을 확인하였다. 이러한 최종후보물질의 항암 효력은 caspase2 의존적으로 그 활성을 나타내었고, caspase2 억제제와 최종후보물질의 복합 처리에 의해 항암제 저항성을 가진 암세포에 대한 치료 효과를 확인하였다.
도 1은 다양한 암세포주에서 ACP52c 처리에 따른 GI 50 값을 보여주는 그래프이다.
도 2a-d는 FACS를 이용한 ACP52c 처리에 따른 G2/M 세포 주기 멈춤 및 세포사 유도(subG1 세포) 분석 결과를 보여준다.
도 3a-c는 ACP52C 처리에 의해 세포주기조절 및 아폽토시스를 조절하는 p53의 발현 증가를 야기함을 보여주는 도면이다.
도 4a-c는 ACP52C 처리에 의해 아폽토시스가 유도됨을 보여주는 도면이다.
도 5는 MDA-MB-231 세포주에서 시간 경과에 따른 ACP52C의 이동 경로 및 세포 내 위치 및 세포내 잔류 시간 분석 결과를 보여준다.
도 6a-h는 ACP52C 펩티드에 대한 생체 내 반감기 분석 결과를 보여준다.
도 7은 생체내 안정성을 향상을 위한 C16 지방산 결합 펩티드의 구성을 나타낸 것이다.
도 8a-d는 다양한 암세포주에서 C 16 지방산 결합 펩티드 (ACP52C; ACP52CG; ACP52CK) 처리에 따른 세포 성장 분석 결과를 보여 준다.
도 9a-c는 다양한 p53 돌연변이 혹은 null인 암세포주에서 C 16 지방산결합 펩티드 (ACP52C; ACP52CG; ACP52CK) 처리에 따른 세포 성장 분석 결과를 보여준다.
도 10a-g는 정상세포주 (BEAS2B, hMSC)와 암세포주 (Hep3B, Hs746T, Caov-3, MDA-MB-231, U343, HCT116, PANC1, PC3, A549, THP-1)에서 ACP52CGK 처리에 따른 세포 성장 분석 결과를 보여준다.
도 11a-e는 Hep3B 세포주 xenograft 생쥐 모델에서 ACP52CG, ACP52CK의 항암효과 분석 결과를 보여준다.
도 12a-d는 DEN 처리에 의한 간암 유도 생쥐 모델에서 ACP52CK의 항암효과 분석 결과를 보여준다.
도 13a-d는 DEN 처리에 의한 간암 유도 생쥐 모델에서 ACP52CG, ACP52CK의 항암효과 분석 결과를 보여준다.
도 14a-d는 MDA-MB-231 (LM1) 세포주 xenograft 생쥐 모델에서 ACP52CG, ACP52CK의 항암효과 분석 결과를 보여준다.
도 15a-j는 Hep3B 세포주 xenograft 생쥐 모델에서 ACP52CGK를 3일 간격으로 세 개의 다른 투여량으로 처리한 경우의 항암효과(종양 크기, 무게, 체중 및 혈액학적 분석) 및 전이 억제 효과 분석 결과를 보여준다.
도 16a-k는 Hep3B 세포주 xenograft 생쥐 모델에서 ACP52CGK를 5일 간격으로 세 개의 다른 투여량으로 처리한 경우의 항암효과(종양 크기, 무게, 체중 및 혈액학적 분석) 및 전이 억제 효과 분석 결과를 보여준다.
도 17a-j는 MDA-MB-231 (LM1) 세포주 xenograft 생쥐 모델에서 ACP52CGK를 3일 간격으로 세 개의 다른 투여량으로 처리한 경우의 항암효과(종양 크기, 무게, 체중 및 혈액학적 분석) 및 전이 억제 효과 분석 결과를 보여준다.
도 18a-k는 MDA-MB-231 (LM1) 세포주 xenograft 생쥐 모델에서 ACP52CGK를 5일 간격으로 세 개의 다른 투여량으로 처리한 경우의 항암효과(종양 크기, 무게, 체중 및 혈액학적 분석) 및 전이 억제 효과 분석 결과를 보여준다.
도 19a-b는 형광 표지 ACP52CGK를 이용한 생체 내 반감기 분석 결과를 보여준다.
도 20a-b는 MDA-MB-231 세포주에서 시간 경과에 따른 ACP52CGK의 이동 경로 및 세포 내 위치 및 세포내 잔류 시간 분석 결과를 보여준다.
도 21은 ELISA를 통한 ACP52C, ACP52CG, ACP52CK 및 ACP52CGK에 대한 항체 형성 여부 분석 결과를 보여준다.
도 22a-e는 ACP52C에 대한 생체 내 긴급 및 반복 독성 실험 결과를 보여준다.
도 23은 ACP52CGK에 대한 반복 독성 시험 결과를 보여준다.
도 24는 ACP52CGK의 반복 독성 시험 시 주요 장기의 조직학적 분석 결과를 보여준다.
도 25a-d는 유방암 환자 종양조직으로부터 배양한 세포에서 ACP52CGK의 효력 분석 결과를 보여준다.
도 26a-d는 동결 보존한 유방암 환자 암조직으로부터 배양한 세포에서 ACP52CGK의 효력 분석 결과를 보여준다.
도 27a-d는 세대별 PDX 종양 조직으로 부터 배양한 세포에서 ACP52CGK의 효력 비교 분석 결과를 보여준다.
도 28a-b는 환자 종양 조직 유래 세포에서 ACP52CGK에 대한 효력 및 내성 분석 결과를 보여준다.
도 29는 ACP52C에 대한 내성을 보인 폐암 세포주에서 CP2c 전사-활성 비의존적 경로 단백질들의 발현 분석 결과를 보여준다.
도 30a-c는 폐암 세포주(A549, PC9, KCL22)에서 ACP52C 처리에 따른 CP2c 전사-활성 비의존적 경로 단백질들의 발현 분석 결과를 보여준다.
도 31a-b는 폐암 세포주(A549, PC9)에서 MDM2 과발현에 따른 CP2c 전사-활성 비의존적 경로 단백질들의 발현 분석 결과를 보여준다.
도 32a-d는 장기간 MDM2 과발현을 유도한 A549 세포주에서 ACP52C 처리에 따른 세포 성장 분석 결과를 보여준다.
도 33a-d는 MDM2p60 발현 모델과 폐암 세포주 특이적인 alternative splicing 및 SNP 분석 결과를 보여준다.
도 34a-d는 ACP52C 내성 세포에서 Caspase2 저해제와 ACP52C 복합 처리에 따른 효력 분석 결과를 보여준다.
도 35는 ACP52C 내성 세포에서 Caspase2 저해제와 ACP52C 복합 처리에 따른 세포 형태 변화를 보여준다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
[제조예 1] 세포 투과 펩티드가 결합된 CP2c 표적 펩티드 제조
전사인자 CP2c는 다양한 암에서 과발현되고 있다고 알려져 있으며, 미국 연구팀의 연구에 의하면 간암 세포주에서 CP2c의 발현을 억제하면 성장이 억제되며, CP2c를 과발현할 경우 암의 악성화와 전이가 일어나는 것으로 보고된 바 있다[Grant et al., Antiproliferative small-molecule inhibitors of transcription factor LSF reveal oncogene addiction to LSF in hepatocellular carcinoma, Proc. Natl. Acad. Sci. 2012; 109(12): 4503-4508].
본 발명자들은 전사인자 CP2c (Tfcp2, LSF, LBP1, UBP1 등으로도 알려짐)와 결합하는 펩티드들을 파지 디스플레이(phage display) 방법으로 동정하였고 [Kang et al., Identification and characterization of four novel peptide motifs that recognize distinct regions of the transcription factor CP2, FEBS Journal 2005; 272:1265-1277], 이중 CP2c의 DNA 결합을 방해하는 펩티드 1종(CP2c 표적 펩티드, 서열번호 2)을 선별하였고 세포 침투성을 향상시키기 위하여 세포막 투과 펩티드(CPP: cell-penetrating peptide)로서 9개의 아미노산(9aa) 'CRGDKGPDC(Cys-Arg-Gly-Asp-Lys-Gly-Pro-Asp-Cys, 서열번호 3)'으로 이루어진 펩티드인 iRGD(internalizing RGD)를 상기 CP2c 표적 펩티드에 결합시킨 형태의 ACP52C 선도물질을 합성하였다 (도 7).
[실시예 1] ACP52C의 함암 효과 확인
상기 선별된 펩티드는 CP2c에 결합하여 CP2c를 포함하는 전사인자 복합체(CP2c homotetramer 및 CP2c/CP2b/PIAS1 heterohexamer) 형성을 억제함으로써 간접적으로 CP2c의 DNA 결합을 방해한다. 상기 합성된 ACP52C를 대상으로 다양한 암종에서 항암 효력을 분석한 결과 암세포 특이적으로 성장억제 및 세포사 효능을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 1).
이러한 ACP52C의 성장억제 및 세포사 효능은 Double thymidine block 방법을 통해 G1/S기에 세포주기를 동기화 한 다음 ACP52C를 처리하여 세포주기의 변화를 FACS로 분석한 결과, G2/M기에 멈추며 polyploid를 형성함을 확인하였다. 한편 nocodazole 처리에 따른 G2/M기에 동기화 시킨 세포주에 ACP52C를 처리할 경우 subG1기에 멈추며 세포사가 유도됨을 확인하였다(도 2a-d).
ACP52C에 의한 G2/M기 멈춤 현상은 CHK1/2 단백질의 발현 증가와 Cdc25c, CDK1 및 cyclin B 단백질의 감소로 나타난 반면, 세포사 유도는 anti-apoptotic 표지 단백질의 발현 감소와 함께 pro-apoptotic 단백질의 발현 증가 및 caspase의 활성화로 이어지는 아폽토시스에 의함을 확인한 바 있다(도 3a-c, 도 4a-c).
세포 내로 들어간 ACP52C의 이동경로와 분포 및 안정성을 Cy5 표지된 펩티드(Cy5-ACP52C)를 세포주 배양액에 30분간 처리한 후 시간 경과에 따른 펩티드의 이동경로를 confocal microscopy로 분석하였다. 펩티드는 세포질을 거쳐 4시간부터 거의 핵에 위치하였으며, 8시간 경과 시부터 세포질로 나와 16시간에는 분해되었다. 펩티드는 처리 1시간부터 핵에서 CP2c와 동소에 위치하며, CP2c 역시 8시간 이후에는 세포질에 분포하는 경향이 확인되었다(도 5).
혈청 내에서 ACP52C half life를 HPLC(Model : UHPLC DIONEX Ultimate 3000; Flow = 1.000ml/min)로 분석하였다. 다양한 시간 동안 혈청과 배양 후 혈청 단백질은 HPLC 분석 전 Centricon(Mw10,000)으로 제거하였다. 실험 결과, ACP52C는 24시간까지 전혀 분해되지 않았다. 한편 꼬리 정맥으로 ACP52C를 주입한 후, 시간 경과에 따른 혈액을 추출하여 ACP52C의 분해 정도를 HPLC로 분석한 결과 EC50는 2시간 정도이었다. 추가적으로 Cy5 표지된 펩티드(Cy5-ACP52C)를 생쥐의 꼬리 정맥(tail vein)으로 주입한 후 시간별로 생쥐 체내에 남아있는 형광 세기를 측정한 결과 약 7.95시간의 반감기를 보였다. 그러나 주입 후 5일이 경과된 후에도 ACP52C는 암조직에서 관찰되었다 (도 6a-h).
[제조예 2] CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트의 합성
상기 ACP52C에 대한 함암 효과를 확인한 실시예 결과를 종합하면, ACP52C의 안정성이 낮다고 판단하고, 이를 극복하기 위하여 4종의 알부민 친화성 C 16 지방산(팔미토일 산, palmitoyl acid) 결합 펩티드를 합성하였다 (도 7). 우선 N-말단 및 C-말단이 수식화된 각 펩티드를 합성한 후 마지막으로 C 16 지방산을 결합시켜 4종의 지방산 결합 펩티드를 합성하였다.
[실시예 2] CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트의 in vitro 항암 효과 확인
상기 제조예 2에서 합성된 CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트를 대상으로 다양한 암세포에서 특이적 세포사 효력을 분석하였다. 그 결과, 3종의 C 16 지방산 결합 펩타이드 ACP52CG, ACP52CK 및 ACP52CGK 모두 대조군인 ACP52C와 유사하게 암세포 특이적인 세포사를 유도하였으며, 처리 후 48시간에 확인한 GI 50 값도 유사하거나 더 효율이 좋았다(도 8a-d, 도 10a-g). 게다가 다양한 p53 돌연변이를 지니는 암세포주를 대상으로도 ACP52CG, ACP52CK를 처리하여 MTT 분석을 통한 세포 생존곡선을 구하고 GI 50 값을 측정한 결과, 세포주별로 GI 50 값은 편차를 나타내었지만 10 mM 이하로서, 정상세포주의 1,000 mM에 육박하는 결과와는 확연하게 구별되었다. (도 9a-c). 결론적으로 ACP52CG, ACP52CK 및 ACP52CGK 모두 항암효과는 ACP52C와 유사하며, 이 복합체에 결합된 지방산은 암세포 및 정상세포에 부정적인 영향을 전혀 나타내지 않았다.
[실시예 3] 다양한 암 세포주 이식 생쥐모델에서 CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트 처리에 따른 종양 성장 억제 효과 및 일반 생리 독성 확인
[3-1] 감암 및 유방암 세포주 이식 생쥐모델에서 ACP52CG, ACP52CK 및 ACP52GK의 종양 성장 억제 효과 및 일반 생리 독성 확인
상기 제조예 2에서 합성한 CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트의 동물 모델에서의 항암 효력을 분석하기 위해, Hep3B xenograft 생쥐를 대상으로 3일 간격으로 ACP52CG와 ACP52CK를 꼬리 정맥으로 5회 주입하였다. 그 결과, ACP52CG와 ACP52CK 모두 소라페닙(sorafenib)과 유사한 효능을 나타내었지만, ACP52C 대비 효능이 떨어졌다. 그러나 정상조직 및 혈액수치에 특별한 이상이 발견되지 않아 독성은 나타내지 않았다 (도 11a-e).
또한, DEN 처리 후 22주 경과한 생쥐를 대상으로 대조군으로 비히클(vehicle)만 처리한 군(mock), 간암치료제로 유일하게 허가된 소라페닙 및 ACP52CG-GFLGE (ACP52CK)의 3군 (7~8두/군)으로 한정하였으며, 약물은 5 mg/Kg의 농도로 3일 간격으로 총 12회 꼬리 정맥을 통해 주입하였다. 분석 결과, 소라페닙 처리군도 유의미한 항암효과(p = 0.04)를 나타낸 반면, ACP52CG-GFLGE (ACP52CK) 처리군에서는 소라페닙 처리군과 유사한 항암효과 (p = 0.001)를 나타내었다 (도 12a-d). 게다가 DEN 처리 후 15주 경과한 생쥐를 대상으로 ACP52CG, ACP52CK의 효력을 분석한 결과 역시 대조군으로 사용한 FQI 보다는 월등하지만 ACP52C에 비해 우수한 효능을 나타내지 않았다(도 13a-d).
MDA-MB-231 (LM1) xenograft 생쥐를 대상으로 3일 간격으로 ACP52CG와 ACP52CK를 꼬리 정맥으로 5회 주입한 경우, ACP52CG와 ACP52CK 모두 tumor regression 효능을 나타내고 있으나, 그 효능이 월등하게 우수하지는 않았다. 혈액수치에 특별한 이상이 발견되지 않는 것으로 보아 독성은 나타내지 않았다 (도 14a-d).
Hep3B xenograft 생쥐를 대상으로 3일 간격으로 ACP52GK를 tail vein으로 5회 주입한 후, 효력을 분석하였다. 그 결과, ACP52C 대비 효능이 떨어지나, 대조군인 FQI 보다는 우수한 효과를 확인하였다.
[3-2] 감암 및 유방암 세포주 이식 생쥐모델에서 ACP52CGK의 종양 성장 억제 효과, 전이 억제 효과 및 일반 생리 독성 확인
Hep3B xenograft 생쥐를 대상으로 3일 간격으로 3가지 농도(1.39, 2.77 또는 5.54mg/kg)로 ACP52CGK를 꼬리 정맥으로 5회 주입하면서 종양의 부피를 측정하였고, 종양세포 주입 후 24일째에 생쥐를 희생시켜 종양 및 주요 조직을 적출하였다. 채취한 혈액에 대해서는 Coulter LH 750 Hematology analyzer를 이용해 기본적인 CBC 분석을 진행하였고, 종양은 무게를 측정한 후 주요 장기와 함께 4% 포름알데히드로 염색한 후 파라핀 섹션을 통하여 조직 박편을 만든 후 헤마톡실린/에오신 염색을 수행하였다. 각종 획득한 데이터는 엑셀 프로그램을 이용하여 통계화 하였다.
그 결과, ACP52CGK는 ACP52C와 유사한 종양 억제 효능을 나타내고 있으며, 정상조직 및 혈액수치에 특별한 이상이 발견되지 않았다(도 15a-d 및 15g-j). 또한, 폐로 전이된 종양 면적 평균과 표준편차를 도시한 도 15e-f에 따르면, ACP52CGK는 ACP52C보다 종양의 전이 억제 효과가 우수함을 확인하였다.
Hep3B xenograft 생쥐를 대상으로 5일 간격으로 ACP52CGK를 3가지 농도 (1.39, 2.77, 5.54 mg/kg)로 5회 주입하여 상술한 것과 동일한 방법으로 항암 효과를 평가한 결과, 3가지 농도의 ACP52CGK 모두에서 소라페닙 및 ACP52C 처리군보다 더 우수한 종양 억제 및 전이 억제 효과를 나타내었으며, 억제효과는 농도-의존적 이었다(도 16a-g). 또한 ACP52CGK를 3일 간격으로 주입한 경우에 비해 5일 간격으로 주입한 경우 더 효율적으로 종양억제 및 전이억제 효과를 나타내었으며(도 15a-j 및 도16a-k 비교), 모든 결과를 종합하여 분석한 결과 2.77 mg/kg이 최적의 농도이었다. 또한 혈액수치에 특별한 이상이 발견되지 않아 독성은 나타내지 않았다(도 16h-k).
MDA-MB-231 (LM1) xenograft 생쥐를 대상으로 ACP52CGK의 항암 효력을 상기 Hep3B xenograft 생쥐 모델 실험과 동일하게 분석한 결과, 마찬가지로 3가지 농도(1.39, 2.77, 5.54 mg/kg)의 ACP52CGK 모두에서 소라페닙 및 ACP52C 처리군보다 더 우수한 종양 억제 및 전이 억제 효과를 나타내었으며(도 17a-f 및 도 18a-g), 3일 간격보다는 5일 간격으로 주입한 경우 더 우수한 억제효과를 나타내었고 2.77 mg/kg이 최적의 농도이었다. 또한 혈액수치에 특별한 이상이 발견되지 않아 독성은 나타내지 않았다(도 17g-j 및 18h-k).
[실시예 4] CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트의 안정성 및 안전성 평가
ACP52CGK의 생체 내 반감기를 분석하기 위해, Cy5 표지된 ACP52CGK를 생쥐의 꼬리 정맥으로 주입한 후 시간별로 생쥐 체내에 남아있는 형광 세기를 측정한 결과 약 20.2시간의 반감기를 보였다 (도 19a-b). 이러한 결과는 지방산이 컨쥬게이션 됨으로써 7.95 시간의 반감기를 보인 선도물질 ACP52C보다 생체 내 안정성이 현저히 향상되었음을 나타내는 것이다.
세포 내로 들어간 ACP52CGK의 이동경로와 분포 및 안정성을 분석하기 위해 Cy5 표지된 ACP52CGK를 세포주 배양액에 30분간 처리한 후 시간 경과에 따른 펩타이드의 이동경로를 추적하고 미토콘드리아(Hsp60) 및 리소좀(LC3)으로도 이동하는지를 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 분석하였다. 그 결과, ACP52CGK는 세포질을 거쳐 4시간부터 거의 핵에 위치하였으며, 8시간 경과 시부터 세포질로 나와 일부는 미토콘드리아에 위치하지만 리소좀으로 이동하여 16시간에는 분해되었다. 이러한 ACP52CGK의 세포내 이동경로, 분포 및 안정성은 ACP52C에서의 경우와 유사하였다(도 20a-b).
한편, ACP52C 펩타이드는 15 아미노산으로서 면역원성을 나타내지 않을 것으로 추정하였다. 이를 검증하기 위하여 면역원성을 확인하였다. 최종후보물질은 ACP52C에 C-16 팔미토일산을 결합시킬 것이므로, 최종신약후보물질 도출과정의 ACP52CG와 ACP52CK를 대상으로 항체형성 여부를 분석하기로 하였다. ACP52CG 및 ACP52CK를 3회 주입한 동물로부터 분리한 혈청을 대상으로 ELISA 분석을 수행한 결과, 토끼 혈청 2종 모두 ACP52C를 포함하여 ACP52CG, ACP52CK 및 ACP52CGK 모두에서 면역 반응을 일으키지 않았다. 따라서 최종후보물질(ACP52CGK)은 인체에서도 면역원성을 나타내지 않을 것으로 판단하였다(도 21).
ACP52CGK의 생체 투여에 대한 반복 독성 시험을 암컷과 수컷 생쥐를 이용하여 진행하였다. 이의 예비실험으로서 ACP52C 100 mg/kg 및 1000 mg/kg을 2회 반독 투여한 결과, 모두 생존하였으며 간 독성을 나타내지 않았고 주요장기에도 영향을 나타내지 않았다. 본 실험으로서 암컷과 수컷 각 6마리로 구성된 용매군과 고용량군 (100 mg/Kg)에 3일 간격으로 28일 동안 ACP52CGK를 정맥주입한 후 비임상 실험에서 요구하는 체중 변화, 음수사료 섭취량, 주요 장기의 조직학적 분석, 장기무게, 혈액학적 검사 및 혈액생화학적 검사를 분석하였다. 그 결과, 이상 소견은 발견되지 않았다(도 22a-e, 도 23, 도 24, 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 ).
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암세포주 및 이종이식 생쥐모델을 대상으로 실험한 ACP52CGK의 효력이 실제 임상에서도 동일하게 적용될 수 있는지를 알아보기 위해, Fresh한 상태의 유방암 환자의 종양 조직으로부터 배양한 세포를 대상으로 ACP52CGK에 대한 효력을 분석하였다. 그 결과, ACP52CGK가 암세포주 실험에서와 유사하게 GI50: ~ 2 uM 내외에서 세포사를 유도함을 확인하였다(도 25a-d). 게다가 동결 보존중인 유방암 환자의 암조직을 해동하여 1차 배양을 진행하고, 이로부터 얻어진 세포를 대상으로 ACP52CGK의 효력을 분석한 결과 역시 GI50: ~ 2 uM 내외에서 세포사를 유도함을 확인하였다(도 26a-d).
[실시예 5] CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트에 대한 저항성을 나타내는 세포에 대한 내성 원인 분석
세대별 PDX (patient derived xenograft) 종양 조직으로부터 일차 배양한 세포에서 ACP52CGK의 효력을 분석한 결과, 동일한 기원에서 유래된 세포의 경우 ACP52CGK에 대한 민감도가 크게 차이나지 않음을 확인하였다(도 27a-d). 그러나 일부 PDX 종양 조직으로부터 일차 배양한 세포에서 ACP52CGK에 대한 내성을 나타내는 경우가 발생하였다(도 28a-b).
이러한 ACP52CGK에 대한 내성을 나타내는 세포(주로 폐암세포주)들은 MDM2p90의 발현양이 낮고 상대적으로 MDM2p60의 발현이 높은 경향을 보였다. 실제로 3종의 폐암세포주(A549, PC9, KCL22)에 ACP52C를 처리한 후 이뮤노블롯으로 단백질 발현을 분석한 결과, 모든 세포주에서 YY1의 발현은 감소하였으나 p53, p63 및 p73의 발현은 변화를 나타내지 않았다. 특히 이 세포주들에서 MDM2(p90 및 p60)의 발현 감소가 나타나지 않았다. MDM2p60은 ATM에 의해 인산화되는 부위 (S386, S395, S407)를 포함하는 MDM2p90의 C-말단부위가 결실된 단백질이라 알려지고 있으므로 ACP52C 처리에 의해 분해 조절되지 않을 것으로 판단하였다(도 29, 도 30a-c).
이에 준하여 3주 동안 독시사이클린(doxycycline)을 처리하여 MDM2p90을 지속적으로 과발현 시키면서 주별로 CP2c 전사활성 의존적 및 비의존적 표지 단백질을 이뮤노블롯으로 확인한 결과, 흥미롭게도 p53 단백질과 YY1의 발현이 감소함을 확인하였다. 한편 ACP52C 처리에 따른 세포사 유도를 MTT 어세이로 분석한 결과, 2주째부터 세포사가 유도됨을 확인하였다. 따라서 폐암세포주에서는 MDM2p90의 발현이 낮은 것이 ACP52C 내성의 원인임을 증명하였다(도 31a-b, 도 32a-d).
MDM2p60의 생성은 caspase2에 의한 MDM2p90의 절단 혹은 alternative splicing에 기인한다는 2가지 모델이 제시되고 있다. 우선 다양한 암세포주를 대상으로 MDM2의 alternative splicing form을 감지할 수 있는 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행한 결과, 폐암세포 특이적인 splice form은 발견되지 않았다. 또한, 폐암세포주 특이적으로 MDM2 유전자 내에 SNP가 존재하여 truncated mRNA 생성에 따른 MDM2p60이 생성되는지를 알아보기 위하여 genomic DNA를 대상으로 PCR cloning한 후 염기서열을 분석한 결과, 폐암세포 특이적인 SNP는 발견되지 않았다(도 33a-d).
한편, 폐암세포 특이적으로 caspase2의 활성이 높아서 나타나는 현상일 것을 규명하기 위하여 caspase2 저해제 (AC-VDVAD-CHO)를 처리하여 MDM2 단백질을 이뮤노블롯으로 확인한 결과, caspase2 저해제 처리에 의해 MDM2p90의 단백질양은 증가하는 반면, MDM2p60의 단백질양은 감소함을 확인하였다. 따라서 폐암세포에서 과발현되고 있는 MDM2p60 form은 caspase2에 의해 MDM2p90이 절단되어 나타난 것이다. 이러한 결과에 기반하여, ACP52C에 대한 내성을 보인 세포 (A549, PDX cell; Breast F0-JOS)를 대상으로 caspase 2 저해제와 ACP52C를 복합 처리하여 세포사 유도 효력을 분석한 결과, caspase 2 저해제와 ACP52C를 복합 처리한 그룹에서 GI50 ~ 1 uM 내외로 효력을 나타냄을 확인하였다(도 34a-d, 도 35).
따라서 ACP52CGK 펩티드는 기존 ACP52C 펩티드에 비해 생체내 안정성을 향상 시켰으며 ACP52C와 동일하게 모든 암종의 세포에 성장억제/세포사를 나타내는 반면, 정상 세포에는 별다른 영향을 미치지 않았다. 또한 ACP52C에 대한 약제 내성을 보이는 암세포에 대해 caspase 2 저해제와 복합 처리할 경우 모든 암종을 대상으로 항암 효과를 나타냄을 확인하였다.

Claims (10)

  1. 4개 내지 20개의 아미노산으로 이루어지는 전사인자 CP2c 표적 펩티드,
    상기 CP2c 표적 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 결합되는 링커(linker) 펩티드,
    상기 CP2c 표적 펩티드의 C-말단, 또는 상기 C-말단에 결합된 링커 펩티드의 C-말단에 결합되는 세포막 투과 펩티드(CPP), 및
    상기 링커 펩티드와 컨쥬게이트된 지방산을 포함하고,
    상기 전사인자 CP2c 표적 펩티드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 전사인자 CP2c 표적 펩티드는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트의 펩티드 N-말단 및/또는 C-말단은 안정성을 높이기 위해 수식되어 있는 것인, CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트의 펩티드 N-말단은 아세틸기로 수식되고, 상기 펩티드의 C-말단은 아미드기로 수식되어 있는 것인, CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 링커 펩티드는 G nKG m로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 n 및 m은 각각 독립적으로 0 내지 6의 정수인 것인, CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 지방산은 C 12 내지 C 20의 지방산인 것인, CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 지방산은 글루탐산(Glu, E) 또는 EGLFG로 표시되는 펩티드의 글리신(Gly, G)과 펩티드 결합된 변형 지방산이고, 상기 지방산에 결합된 글루탐산 또는 EGLFG로 표시되는 펩티드의 글루탐산은 G nKG m로 표시되는 아미노산 서열 중 라이신(Lys, K)과 결합되어 있는 것인, CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 지방산은 C 16의 팔미토일산이고, 상기 G nKG m로 표시되는 아미노산 서열 중 라이신(Lys, K)의 작용기는 상기 지방산에 결합된 글루탐산(E) 또는 EGLFG로 표시되는 펩티드의 글루탐산의 감마 탄소 카복실기와 결합되어 있는 것인, CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 CP2c 표적 펩티드-지방산 컨쥬게이트를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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