CN115427437B - 新型免疫刺激il-2类似物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及白细胞介素‑2α受体的改变和具有对白细胞介素‑2β受体增加的结合亲和力的白细胞介素‑2类似物。
Description
技术领域
本发明涉及新型白细胞介素-2类似物。
背景技术
白细胞介素-2是一种重要的免疫刺激剂，分子量约为15kDa，由总共133个氨基酸残基组成，并激活免疫系统的各种细胞，包括T细胞和B细胞。白细胞介素-2作为免疫刺激物的高功效可用于治疗各种免疫相关状况，包括癌症和AIDS(韩国专利申请公开号10-2017-0070091)。目前，白细胞介素-2(商标名：Proleukin)是FDA批准的用于治疗转移性肾细胞癌和转移性黑素瘤的药物。然而，由于高剂量白细胞介素-2疗法的严重毒性，适用的患者有限。事实上，这种疗法仅适用于少数合格患者。与白细胞介素-2相关的毒性包括严重发热、恶心、呕吐、血管渗漏、严重低血压、肺水肿和血管渗漏综合征，导致肝损伤。
白细胞介素-2受体有三种亚基受体。该亚基由α链(IL-2Rα，CD25)、β链(IL-2Rβ或CD122)和γ链(IL-2Rγ或CD132)组成。白细胞介素-2可以通过与各种组合的受体亚基结合而表现出各种功能。单个白细胞介素-2α受体被称为低亲和力白细胞介素-2受体，并且其不参与信号传导。白细胞介素-2β和白细胞介素-2γ受体的复合物以中等亲和力结合白细胞介素-2。白细胞介素-2α、白细胞介素-2β和白细胞介素-2γ受体的复合物以高亲和力结合白细胞介素-2。白细胞介素-2β和白细胞介素-2γ受体的复合物是多条信号通路中通过激酶活化进行有效的信号转换所必需的。具体地，白细胞介素-2β和白细胞介素-2γ结合受体在CD8+细胞和天然杀伤(NK)细胞中非常突出。此外，高亲和力白细胞介素-2α、白细胞介素-2β和白细胞介素-2γ受体的复合物通常发现于CD4+T调节细胞(Treg)，而最近它们也在活化的T细胞中发现。由于白细胞介素-2β受体分布在CD8+T细胞或天然杀伤细胞(NK细胞)中并参与体内的免疫反应，因此已经进行了研究，通过增加β受体对于免疫活化的活性来开发治疗剂。
同时，尽管白细胞介素-2作为各种免疫相关疾病的治疗剂具有潜力，但仍然没有很多药物能够在降低毒性和副作用的同时减少其剂量，因此对新的和改进的药物的研究需求越来越大。
发明内容
[技术问题]
本发明的目的是提供白细胞介素-2类似物。
本发明的另一个目的是提供编码白细胞介素-2类似物的分离的核酸；包括所述核酸的重组表达载体；以及包括所述载体的转化体。
本发明的又另一个目的是提供用于制备白细胞介素-2类似物的方法。
本发明的又另一个目的是提供用于增加对白细胞介素-2β受体的结合亲和力的方法，其包括修饰天然白细胞介素-2中的一个或多个氨基酸。
[技术方案]
本发明的一方面提供了新型白细胞介素-2类似物(或IL-2类似物)。白细胞介素-2类似物是相比于天然白细胞介素-2或阿地白介素(aldesleukin)(即一种白细胞介素-2类似物)具有对白细胞介素-2β受体增加的结合亲和力的白细胞介素-2类似物。在一个具体实施方式中，白细胞介素-2类似物可以包括天然白细胞介素-2中一个或多个氨基酸被修饰的序列。
在另一个具体实施方式中，白细胞介素-2类似物的特征在于，白细胞介素-2类似物包括对应于天然白细胞介素-2中第1、12、18、19、20、22、32、35、38、42、43、45、48、49、61、68、69、74、76、80、81、82、84、85、86、87、88、89、91、92、94、95、96、125、126和133位的氨基酸的一个或多个氨基酸被修饰的序列。
根据前述具体实施方式中任一项的白细胞介素-2类似物的特征在于，其相比于天然白细胞介素-2或阿地白介素具有对白细胞介素-2α受体改变的结合亲和力和对白细胞素-2β受体增加的结合亲合力。
根据前述具体实施方式中任一项的白细胞介素-2类似物的特征在于，一个或多个氨基酸被添加到对应于第133位的氨基酸。
根据前述具体实施方式中任一项的白细胞介素-2类似物的特征在于，其是第1位的氨基酸被去除并且第125位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2。
根据前述具体实施方式中任一项的白细胞介素-2类似物的特征在于，其进一步包括1至10个氨基酸取代。
根据前述具体实施方式中任一项的白细胞介素-2类似物的特征在于，第18、19、20、22、38、42、43、45、61、68、69、74、80、81、84、85、86、88、89、91、92、94和96位的一个或多个氨基酸进一步被不同的氨基酸取代。
根据前述具体实施方式中任一项的白细胞介素-2类似物的特征在于，第18、19、22、38、42、43、45、61、68、74、80、81、84、85、86、88、91、92、94和96位的一个或多个氨基酸进一步被不同的氨基酸取代。
根据前述具体实施方式中任一项的白细胞介素-2类似物的特征在于，其是以下类似物中的任一种：
(a)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125和32位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(b)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125和35位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(c)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125和38位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(d)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125和42位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(e)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125和43位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(f)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125和48位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(g)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125和49位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(h)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125和76位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(i)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、81、92、94和96位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(j)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125和87位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(k)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38和42位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(l)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38和80位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(m)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38和84位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(n)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、19、38和42位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(o)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、12、38和42位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(p)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42和61位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(q)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42和84位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(r)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42和88位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(s)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42和89位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(t)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42和91位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(u)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42和94位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(v)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42和126位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(w)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、80和84位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(x)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、94和96位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(y)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(z)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、61、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(aa)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(ab)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、80、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(ac)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、81、84和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(ad)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、20、38、42、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(ae)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、80、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(af)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、74、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(ag)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、81、84和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(ah)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、81、88和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(ai)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(aj)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、80、81、85和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(ak)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、80、81、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(al)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(am)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、45、74、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(an)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、74、80、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(ao)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、80、81、84和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(ap)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、45、80、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(aq)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(ar)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、42、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(as)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、61、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(at)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、69、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(au)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、80、81、85、86、91和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(av)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、18、22、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(aw)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(ax)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、45、74、80、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(ay)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、68、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(az)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、69、74、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(ba)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、80、81、84、85、86、91和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(bb)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、80、81、85、86、92、94和96位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(bc)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、18、19、22、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(bd)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、18、22、38、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(be)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、18、22、61、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(bf)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、18、22、68、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(bg)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、35、38、42、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(bh)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、45、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(bi)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、80、81、85、86、91和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(bj)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、80、81、85、86、92和95位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(bk)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、35、38、42、74、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(bl)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、43、61、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(bm)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、80、81、85、86、91、92和95位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(bn)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、35、38、42、74、80、81、82、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(bo)白细胞介素-2类似物，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、80、81、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；和
(bp)白细胞介素-2类似物，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、80、81、85和86位的氨基酸被不同的氨基酸取代。
根据前述具体实施方式中任一项的白细胞介素-2类似物的特征在于，其包括选自以下氨基酸取代的任一种氨基酸取代：
(a)第12位的氨基酸被缬氨酸或苯丙氨酸取代的取代；
(b)第18位的氨基酸被精氨酸取代的取代；
(c)第19位的氨基酸被酪氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸或精氨酸取代的取代；
(d)第20位的氨基酸被缬氨酸或苯丙氨酸取代的取代；
(e)第22位的氨基酸被谷氨酸取代的取代；
(f)第32位的氨基酸被半胱氨酸取代的取代；
(g)第35位的氨基酸被半胱氨酸或谷氨酸取代的取代；
(h)第38位的氨基酸被丙氨酸或天冬氨酸取代的取代；
(i)第42位的氨基酸被赖氨酸、丙氨酸或色氨酸取代的取代；
(j)第43位的氨基酸被半胱氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺取代的取代；
(k)第45位的氨基酸被丙氨酸取代的取代；
(l)第48位的氨基酸被半胱氨酸取代的取代；
(m)第49位的氨基酸被半胱氨酸取代的取代；
(n)第61位的氨基酸被谷氨酰胺、精氨酸或天冬氨酸取代的取代；
(o)第68位的氨基酸被天冬氨酸或谷氨酰胺取代的取代；
(p)第69位的氨基酸被甘氨酸取代的取代；
(q)第74位的氨基酸被组氨酸或丙氨酸取代的取代；
(r)第76位的氨基酸被半胱氨酸取代的取代；
(s)第80位的氨基酸被苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、天冬氨酸或色氨酸取代的取代；
(t)第81位的氨基酸被天冬氨酸、谷氨酸或天冬酰胺取代的取代；
(u)第82位的氨基酸被甘氨酸或缬氨酸取代的取代；
(v)第84位的氨基酸被谷氨酸、缬氨酸或苯丙氨酸取代的取代；
(w)第85位的氨基酸被缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、色氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、谷氨酸或苯丙氨酸取代的取代；
(x)第86位的氨基酸被缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸或亮氨酸取代的取代；
(y)第87位的氨基酸被半胱氨酸取代的取代；
(z)第88位的氨基酸被谷氨酰胺、缬氨酸或苯丙氨酸取代的取代；
(aa)第89位的氨基酸被苯丙氨酸取代的取代；
(ab)第91位的氨基酸被苏氨酸、苯丙氨酸或谷氨酸取代的取代；
(ac)第92位的氨基酸被苯丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸或色氨酸取代的取代；
(ad)第95位的氨基酸被天冬氨酸取代的取代；
(ae)第96位的氨基酸被苯丙氨酸、缬氨酸或异亮氨酸取代的取代；和
(af)第126位的氨基酸被苏氨酸取代的取代。
根据前述具体实施方式中任一项的白细胞介素-2类似物的特征在于，其选自SEQID NO:3至106。
实施本发明的另一方面提供了编码白细胞介素-2类似物的分离的核酸；包括所述核酸的重组表达载体；以及包括所述载体的转化体。
实施本发明的又一方面提供了用于制备白细胞介素-2类似物的方法。
实施本发明的又一方面提供了用于增加对白细胞介素-2β受体的结合亲和力的方法，其包括修饰天然白细胞介素-2中的一个或多个氨基酸，其中修饰可以是选自对应于第1、12、18、19、20、22、32、35、38、42、43、45、48、49、61、68、69、74、76、80、81、82、84、85、86、87、88、89、91、92、94、95、96、125、126和133位的氨基酸的一个或多个氨基酸中的修饰。
实施本发明的又一方面提供了白细胞介素-2类似物，其包括选自SEQ ID NO:3至106的氨基酸序列的任一个序列。
实施本发明的又一方面提供了白细胞介素-2类似物，其包括由以下通式1表示的氨基酸序列：
[通式1]
X1-P-T-S-S-S-T-K-K-T-Q-L-Q-L-E-H-L-X18-X19-D-L-X22-M-I-L-N-G-I-N-N-Y-K-N-P-K-L-T-X38-M-L-T-X42-X43-F-X45-M-P-K-K-A-T-E-L-K-H-L-Q-C-L-E-X61-E-L-K-P-L-E-X68-V-L-N-L-A-X74-S-K-N-F-H-X80-X81-P-R-X84-X85-X86-S-N-I-N-X91-X92-V-X94-E-X96-K-G-S-E-T-T-F-M-C-E-Y-A-D-E-T-A-T-I-V-E-F-L-N-R-W-I-T-F-S-Q-S-I-I-S-T-L-T(通式1，SEQ ID NO:212)
其中在上述通式1中，
X1是缺失；
X18是亮氨酸(L)或精氨酸(R)；
X19是亮氨酸(L)或酪氨酸(Y)；
X22是谷氨酸(E)或谷氨酰胺(Q)；
X38是丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)或精氨酸(R)；
X42是丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、赖氨酸(K)或色氨酸(W)；
X43是谷氨酸(E)、赖氨酸(K)或谷氨酰胺(Q)；
X45是丙氨酸(A)或酪氨酸(Y)；
X61是天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)或精氨酸(R)；
X68是天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)；
X74是组氨酸(H)或谷氨酰胺(Q)；
X80是苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)或酪氨酸(Y)；
X81是天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)或精氨酸(R)；
X84是天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)；
X85是丙氨酸(A)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)；
X86是丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)；
X91是苏氨酸(T)或缬氨酸(V)；
X92是苯丙氨酸(F)、异亮氨酸(I)或酪氨酸(Y)；
X94是苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)；以及
X96是苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)。
在一个具体实施方式中，白细胞介素-2类似物的特征在于，其包括选自SEQ IDNO:10、13、14、15、16、17、20、21、22、32、35、36、42、53、54、56、58、59、60、62、71、72、74、75、76、77、78、85、87、89、91、92、93、94、95、98、99、100、101、103、104、105和106的氨基酸序列的任一个序列。
在另一具体实施方式中，白细胞介素-2类似物的特征在于，在上述通式1中，
X43是赖氨酸(K)；
X45是酪氨酸(Y)；
X61是天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)或谷氨酰胺(Q)；
X68是谷氨酸(E)；
X74是谷氨酰胺(Q)；
X80是苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)；
X85是亮氨酸(L)、缬氨酸(V)或酪氨酸(Y)；
X86是异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)；和
X92是苯丙氨酸(F)或异亮氨酸(I)。
根据前述具体实施方式中任一项的白细胞介素-2类似物的特征在于，其包括选自SEQ ID NO:10、13、14、16、17、20、21、22、32、35、36、42、53、54、87、89、91、92、93、94、98、99、100、101、103、104和105的氨基酸序列的任一个序列。
根据前述具体实施方式中任一项的白细胞介素-2类似物的特征在于，其进一步包括在其C-末端的一个或多个氨基酸。
实施本发明的又一方面提供了白细胞介素-2类似物，其包括由以下通式2表示的氨基酸序列：
[通式2]
X1-P-T-S-S-S-T-K-K-T-Q-L-Q-L-E-H-L-X18-L-D-L-X22-M-I-L-N-G-I-N-N-Y-K-N-P-K-L-T-X38-M-L-T-X42-K-F-Y-M-P-K-K-A-T-E-L-K-H-L-Q-C-L-E-X61-E-L-K-P-L-E-X68-V-L-N-L-A-Q-S-K-N-F-H-F-X81-P-R-D-X85-X86-S-N-I-N-V-F-V-L-E-L-K-G-S-E-T-T-F-M-C-E-Y-A-D-E-T-A-T-I-V-E-F-L-N-R-W-I-T-F-S-Q-S-I-I-S-T-L-T(通式2，SEQ IDNO:213)
其中在上述通式2中，
X1是缺失；
X18是亮氨酸(L)或精氨酸(R)；
X22是谷氨酸(E)或谷氨酰胺(Q)；
X38是丙氨酸(A)或精氨酸(R)；
X42是苯丙氨酸(F)或赖氨酸(K)；
X61是天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)；
X68是天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)；
X81是天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)；
X85是亮氨酸(L)或缬氨酸(V)；以及
X86是异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)。
在具体实施方式中，白细胞介素-2类似物的特征在于，其包括选自SEQ ID NO:22、42、53、87、105和106的氨基酸序列的任一个序列。
在另一具体实施方式中，白细胞介素-2类似物的特征在于，其进一步包括在其C-末端的一个或多个氨基酸。
[有利效果]
根据本发明的白细胞介素-2类似物是在体内具有对白细胞介素-2β受体增加的结合亲和力的类似物并且可以用于各种目的。
附图说明
图1显示了证实白细胞介素-2类似物对白细胞介素-2α受体的结合亲和力的结果，其中(A)表示白细胞介素-2类似物#86，(B)表示白细胞介素-2类似物#104，以及(C)表示白细胞介素-2类似物#105。
图2显示了证实白细胞介素-2类似物对白细胞介素-2β受体的结合亲和力的结果，其中(A)表示白细胞介素-2类似物#86，(B)表示白细胞介素-2类似物104，以及(C)表示白细胞介素-2类似物#105。
具体实施方式
下面将描述实施本发明的细节。同时，本发明中公开的各个描述和实施方式都可适用于其它描述和实施方式。即，本发明中公开的各种要素的所有组合都落入本发明的范围内。此外，本发明的范围不能认为受到下文具体描述的限制。
在本发明的整个说明书中，使用氨基酸的常规的一个字母或三个字母代码。另外，如下根据IUPAC-IUB的命名规则对本文中提到的氨基酸进行缩写：
丙氨酸 A 精氨酸 R
天冬酰胺 N 天冬氨酸 D
半胱氨酸 C 谷氨酸 E
谷氨酰胺 Q 甘氨酸 G
组氨酸 H 异亮氨酸 I
亮氨酸 L 赖氨酸 K
甲硫氨酸 M 苯丙氨酸 F
脯氨酸 P 丝氨酸 S
苏氨酸 T 色氨酸 W
酪氨酸 Y 缬氨酸 V
本发明的又一方面提供了白细胞介素-2类似物。本发明的白细胞介素-2类似物的特征在于其具有对白细胞介素-2受体改变的结合亲和力，并且具体地在于其具有对白细胞介素-2β受体增加的结合亲和力。具体地，本发明的白细胞介素-2类似物可以是相比于天然白细胞介素-2或已知的阿地白介素具有对白细胞介素-2β受体增加的结合亲和力的白细胞介素-2类似物，并且更具体地是具有对白细胞素-2α受体的改变(增加或减少)的结合亲合力的白细胞介素-2类似物。
如本文所用，术语“白细胞介素-2(IL-2)”是指在体内免疫系统中传递信号的一类细胞因子。白细胞介素-2通常被认为是一种重要的免疫刺激剂，其大小约为15kDa。
如本文所用，术语“白细胞介素-2类似物”是指其序列中的一个或多个氨基酸被修饰的天然白细胞介素-2。特别是在本发明中，白细胞介素-2类似物可以是相比于天然白细胞介素-2具有对白细胞介素-2受体的减少或增加的结合亲和力的白细胞介素-2类似物，其中天然白细胞介素-2中的氨基酸(一个或多个)被修饰。本发明的白细胞介素-2类似物可以是非天然存在的。
天然白细胞介素-2可以是人白细胞介素-2，并且其序列可以从已知数据库等获得。具体地，天然白细胞介素-2可具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，但不限于此。
在本发明中，“天然白细胞介素-2可以具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列”意为不仅是与SEQ ID NO:1相同的序列，而且与SEQ ID NO:1具有80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、和99％或更高同源性的序列也都属于本发明的天然白细胞介素-2的范围；并且当基于SEQ ID NO:1比对同源性为80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、和99％或更高的序列时，SEQ ID NO:1的氨基酸序列上氨基酸修饰的对应位置(一个或多个)发生改变。
在本发明中，“天然序列中的一个或多个氨基酸被改变”的含义可以是在天然序列中的至少一个氨基酸中发生选自取代、添加、缺失、修饰、及其组合的修饰。
具体地，本发明的白细胞介素-2类似物可以包括对应于天然白细胞介素-2中第1、12、18、19、20、22、32、35、38、42、43、45、48、49、61、68、69、74、76、80、81、82、84、85、86、87、88、89、91、92、94、95、96、125、126和133位的一个或多个氨基酸被修饰的序列。具体地，本发明的白细胞介素-2类似物可以是第1位的氨基酸被去除并且第125位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；并且其进一步包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸取代。尽管不限于此，但第125位的氨基酸(即半胱氨酸)可以被丝氨酸取代，并且发生其它取代的氨基酸(一个或多个)可以是对应于第12、18、19、20、22、32、35、38、42、43、45、48、49、61、68、69、74、76、80、81、82、84、85、86、87、88、89、91、92、94、95、96、126和133位的氨基酸。
另外，包括在本发明范围内的还有，除了对位置进行上述修饰——达到可针对本领域已知肽的半衰期的稳定性和延长进行修饰的程度——之外还包括氨基酸残基的取代、添加、缺失、修饰等的白细胞介素-2类似物。
如本文所用，术语“阿地白介素”或“白细胞介素-2类似物(阿地白介素)”，其为市售的白细胞介素-2类似物，可以是阿地白介素(商标名：)，具体地可以是具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的阿地白介素。在本发明中，这些术语可与“白细胞介素-2类似物1”互换使用。相比于白细胞介素-2类似物1，根据本发明的白细胞介素类似物可具有对白细胞介素-2α受体改变的结合亲和力和/或对白细胞素-2β受体增加的结合亲和力。
虽然认为白细胞介素-2α受体不参与白细胞介素-2的信号传导系统，但它们将白细胞介素-2对其它白细胞介素-2受体(β或γ受体)的结合亲和力提高10至100倍，并且在CD4+调节T细胞等中表达。
由于白细胞介素-2β受体主要分布在CD8+T细胞或天然杀伤细胞(NK细胞)中，并且在激活免疫反应和巨噬细胞方面具有重要作用，因此预期通过白细胞介素-2β受体的活化可以促进肿瘤细胞死亡和身体免疫反应的激活。
因此，本发明的具有对白细胞介素-2β受体增加的结合亲和力的白细胞介素-2类似物能够具有增加肿瘤的抑制和死亡，同时减少副作用的治疗效果。
在本发明中，白细胞介素-2类似物可以包括天然白细胞介素-2的序列，其中第1位的氨基酸被去除并且第125位的氨基酸被不同的氨基酸取代，并且其进一步包括1至10个氨基酸修饰。例如，白细胞介素-2类似物可以包括天然白细胞介素-2的序列，其中第125位的氨基酸被丝氨酸取代并且第12、18、19、20、22、32、35、38、42、43、45、48、49、61、68、69、74、76、80、81、82、84、85、86、87、88、89、91、92、94、95、96和126位的一个或多个氨基酸被不同的氨基酸取代和/或一个或多个氨基酸被添加在第133位的氨基酸上，但该序列不限于此，并且相比于天然白细胞介素-2和/或阿地白介素具有对白细胞介素-2α受体改变的结合亲和力和对白细胞介素-2β受体增加的结合亲和力的任何白细胞介素-2类似物都无限制地包括在内。
在一个实施方式中，白细胞介素-2类似物可以是一个或多个氨基酸被添加到对应于第133位的氨基酸的类似物，但白细胞介素-2类似物不限于此。出于本发明的目的，待添加的氨基酸关于其类型或长度不受限制，只要白细胞介素-2类似物相比于天然白细胞介素-2和/或阿地白介素具有对白细胞介素-2α受体改变的结合亲和力和对白细胞介素-2β受体增加的结合亲和力即可，并且除了天然氨基酸之外还可以添加非天然存在的氨基酸和具有化学修饰的氨基酸。
在另一实施方式中，白细胞介素-2类似物可以是第1位的氨基酸被去除；第125位的氨基酸被不同的氨基酸取代；并且第18、19、20、22、38、42、43、45、61、68、69、74、80、81、84、85、86、88、89、91、92、94和96位的氨基酸当中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2，但白细胞介素-2类似物不限于此。
在又另一实施方式中，白细胞介素-2类似物可以是第1位的氨基酸被去除；第125位的氨基酸被不同的氨基酸取代；并且第18、19、22、38、42、43、45、61、68、74、80、81、84、85、86、88、91、92、94和96位的氨基酸当中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2，但白细胞介素-2类似物不限于此。
在又另一实施方式中，白细胞介素-2类似物可以是选自以下类似物的任一种：
(a)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125和32位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(b)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125和35位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(c)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125和38位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(d)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125和42位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(e)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125和43位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(f)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125和48位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(g)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125和49位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(h)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125和76位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(i)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、81、92、94和96位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(j)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125和87位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(k)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38和42位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(l)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38和80位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(m)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38和84位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(n)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、19、38和42位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(o)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、12、38和42位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(p)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42和61位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(q)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42和84位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(r)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42和88位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(s)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42和89位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(t)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42和91位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(u)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42和94位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(v)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42和126位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(w)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、80和84位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(x)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、94和96位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(y)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(z)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、61、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(aa)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(ab)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、80、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(ac)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、81、84和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(ad)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、20、38、42、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(ae)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、80、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(af)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、74、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(ag)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、81、84和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(ah)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、81、88和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(ai)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(aj)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、80、81、85和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(ak)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、80、81、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(al)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(am)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、45、74、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(an)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、74、80、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(ao)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、80、81、84和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(ap)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、45、80、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(aq)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(ar)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、42、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(as)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、61、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(at)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、69、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(au)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、80、81、85、86、91和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(av)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、18、22、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(aw)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(ax)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、45、74、80、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(ay)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、68、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(az)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、69、74、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(ba)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、80、81、84、85、86、91和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(bb)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、80、81、85、86、92、94和96位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(bc)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、18、19、22、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(bd)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、18、22、38、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(be)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、18、22、61、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(bf)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、18、22、68、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(bg)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、35、38、42、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(bh)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、45、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(bi)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、80、81、85、86、91和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(bj)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、80、81、85、86、92和95位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(bk)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、35、38、42、74、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(bl)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、43、61、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(bm)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、80、81、85、86、91、92和95位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(bn)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、35、38、42、74、80、81、82、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；
(bo)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、80、81、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2；和
(bp)白细胞介素-2类似物，其中白细胞介素-2类似物是第1位的氨基酸被去除并且第125、80、81、85和86位的氨基酸被不同的氨基酸取代的天然白细胞介素-2。
具体地，白细胞介素-2类似物中包括的氨基酸取代可以是选自以下氨基酸取代的任一个或多种：
(a)第12位的氨基酸被缬氨酸或苯丙氨酸取代的取代；
(b)第18位的氨基酸被精氨酸取代的取代；
(c)第19位的氨基酸被酪氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸或精氨酸取代的取代；
(d)第20位的氨基酸被缬氨酸或苯丙氨酸取代的取代；
(e)第22位的氨基酸被谷氨酸取代的取代；
(f)第32位的氨基酸被半胱氨酸取代的取代；
(g)第35位的氨基酸被半胱氨酸或谷氨酸取代的取代；
(h)第38位的氨基酸被丙氨酸或天冬氨酸取代的取代；
(i)第42位的氨基酸被赖氨酸、丙氨酸或色氨酸取代的取代；
(j)第43位的氨基酸被半胱氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺取代的取代；
(k)第45位的氨基酸被丙氨酸取代的取代；
(l)第48位的氨基酸被半胱氨酸取代的取代；
(m)第49位的氨基酸被半胱氨酸取代的取代；
(n)第61位的氨基酸被谷氨酰胺、精氨酸或天冬氨酸取代的取代；
(o)第68位的氨基酸被天冬氨酸或谷氨酰胺取代的取代；
(p)第69位的氨基酸被甘氨酸取代的取代；
(q)第74位的氨基酸被组氨酸或丙氨酸取代的取代；
(r)第76位的氨基酸被半胱氨酸取代的取代；
(s)第80位的氨基酸被苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、天冬氨酸或色氨酸取代的取代；
(t)第81位的氨基酸被天冬氨酸、谷氨酸或天冬酰胺取代的取代；
(u)第82位的氨基酸被甘氨酸或缬氨酸取代的取代；
(v)第84位的氨基酸被谷氨酸、缬氨酸或苯丙氨酸取代的取代；
(w)第85位的氨基酸被缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、色氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、谷氨酸或苯丙氨酸取代的取代；
(x)第86位的氨基酸被缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸或亮氨酸取代的取代；
(y)第87位的氨基酸被半胱氨酸取代的取代；
(z)第88位的氨基酸被谷氨酰胺、缬氨酸或苯丙氨酸取代的取代；
(aa)第89位的氨基酸被苯丙氨酸取代的取代；
(ab)第91位的氨基酸被苏氨酸、苯丙氨酸或谷氨酸取代的取代；
(ac)第92位的氨基酸被苯丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸或色氨酸取代的取代；
(ad)第95位的氨基酸被天冬氨酸取代的取代；
(ae)第96位的氨基酸被苯丙氨酸、缬氨酸或异亮氨酸取代的取代；和
(af)第126位的氨基酸被苏氨酸取代的取代。
如本文所用，术语“对应于”是指肽中所列位置的氨基酸残基，或与肽中所列残基类似、相同或同源的氨基酸残基。对应位置的氨基酸的确认可以是在参考具体序列的序列中确定具体氨基酸。
在一个实施方式中，氨基酸序列中的每个氨基酸残基都可通过如下进行编号：将任何氨基酸序列与SEQ ID NO:1且基于SEQ ID NO:1来比对，指出与SEQ ID NO:1的氨基酸残基对应的氨基酸残基的编号位置。
作为这样的一种比对，例如，可以使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443–453)、EMBOSS软件包的Needle程序(EMBOSS:TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000)、(TrendsGenet.16:276–277)等，但可用的程序不限于此，而可以适当地使用本领域已知的序列比对程序、成对序列比较算法等。
在本发明中，即使表示成肽中的氨基酸的具体位置，这种表示也可以指代参考序列中的对应位置。
在另一个实施方式中，白细胞介素-2类似物可以包括选自SEQ ID NO:3至106的氨基酸序列、由其组成或主要由其组成，但白细胞介素-2类似物不限于此。
此外，即使白细胞介素-2类似物在本发明中表示成“由特定SEQ ID NO组成的白细胞介素-2类似物”，也不排除可能通过在对应SEQ ID NO的氨基酸序列上游或下游添加无意义序列而发生的突变、或可能天然发生的突变、或其沉默突变，只要白细胞介素-2类似物具有与由对应SEQ ID NO的氨基酸序列组成的白细胞介素-2类似物相同或等效的活性即可，并且即使存在序列添加或突变，白细胞介素-2类似物显然也属于本发明的范围。
本发明的白细胞介素-2类似物可以包括与SEQ ID NO:3至106的氨基酸序列具有40％或更高、45％或更高、50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、81％或更高、82％或更高、83％或更高、84％或更高、85％或更高、86％或更高、87％或更高、88％或更高、89％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高的同源性的氨基酸序列，但白细胞介素-2类似物不限于此。
在本发明中，术语“同源性”和“同一性”指的是两个给定氨基酸序列或核苷酸序列之间的相关度，并且可以表示成百分比。
保守的多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可以通过标准比对算法确定，并且可与所用程序建立的默认空位罚分联用。基本上，同源的或相同的序列可通常在中度或高度严格的条件下与序列的全部或部分杂交。显然，杂交还包括多核苷酸与包括通用密码子或考虑密码子简并的密码子的多核苷酸的杂交。
术语同源性和同一性经常可以互换使用。
任意两个核苷酸或肽序列是否具有同源性、相似性、或同一性都可由例如已知的使用默认参数的计算机算法(例如，“FASTA”程序)(Pearson et al.,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444)确定。可选地，其可使用以下确定：Needleman–Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443–453)——在EMBOSS包的Needleman程序中执行(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice etal.,2000,Trends Genet.16:276–277)(5.0.0版本或更高版本)(包括GCG程序包(Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research 12:387(1984))，BLASTP，BLASTN，FASTA(Atschul,S.F.,et al.,J Molec Biol215:403(1990)；Guide to Huge Computers,MartinJ.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego,1994,和CARILLO et al.(1988)SIAM JApplied Math 48:1073)。例如，可使用美国国家生物技术信息中心的BLAST或ClustalW确定同源性、相似性、或同一性。
核苷酸或肽序列的同源性、相似性、或同一性可通过利用公开于Smith和Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482中的GAP计算机程序(例如，Needleman et al.(1970),J Mol Biol.48:443)比较序列信息来确定。简而言之，GAP程序将同源性、相似性、或同一性定义为通过将相似比对的符号(即核苷酸或氨基酸)的数量除以两个序列中较短者的符号总数而获得的值。GAP程序的默认参数可包括(1)一元比较矩阵(包含同一性数值1和非同一性数值0)和Gribskov et al.(1986),Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵，如Schwartz与Dayhoff,eds.,Atlas of Protein Sequence and Structure,NationalBiomedical Research Foundation,pp.353–358(1979)中公开(或EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)替换矩阵)；(2)每个空位3.0的罚分和每个空位中每个符号另外0.10的罚分(或10的空位开放罚分和0.5的空位扩展罚分)；和(3)末端空位无罚分。因此，本文使用的术语“同源性”和“同一性”表示序列之间的相关性。
以上内容可适用于本发明的其它实施方式或其它方面，但不限于此。
本发明的白细胞介素-2类似物可用作新型白细胞介素-2替代物，其通过减弱或增加白细胞介素-2类似物对白细胞介素-2α和/或白细胞介素-2β受体的结合亲和力来改变其体外活性。具体地，本发明的白细胞介素-2类似物由于其对这两种类型的受体的活性而可用作有效的治疗剂，因为它不仅对β受体具有增加的结合亲和力，而且对α受体具有改变(即，增加或减少)的结合亲合力。
在本发明中，用于制备白细胞介素-2类似物的此类修饰包括使用L型或D型氨基酸和/或非天然氨基酸的所有修饰；和/或天然序列的修饰，例如，侧链官能团的修饰、分子内共价键合(例如，侧链之间形成环)、甲基化、酰化、泛素化、磷酸化、氨基己基化、生物素化等。
此外，修饰包括将一个或多个氨基酸添加到天然白细胞介素-2的氨基和/或羧基末端的所有修饰。
作为待取代或添加的氨基酸，不仅可以使用人类蛋白质中常见的20种氨基酸，还可以使用非典型氨基酸或非天然存在的氨基酸。非典型氨基酸的商业来源包括Sigma-Aldrich、ChemPep Inc.和Genzyme Pharmaceuticals。包括这些氨基酸和典型肽序列的肽可以从商业供应商例如American Peptide Company、Bachem(美国)或Anygen(韩国)那里合成和购买。
可以以相同的方式获得氨基酸衍生物，并且作为一个这样的实例，可以使用4-咪唑并乙酸(4-imidazoacetic acid)等。
此外，根据本发明的白细胞介素-2类似物可以是修饰形式，其中白细胞介素-2的N-末端和/或C-末端等被化学修饰或被有机基团保护，或者可以将氨基酸添加到肽的末端等，以在体内使其免受蛋白酶的影响，同时增加其稳定性。
具体地，在化学合成肽的情况下，其N-末端和C-末端是带电荷的，因此肽的N-末端可以被乙酰化和/或肽的C-末端可以被酰胺化，但肽不特别限于此。
此外，由于根据本发明的白细胞介素-2类似物是肽形式，因此其可以包括肽本身、其盐(例如，肽的药学上可接受的盐)、或其溶剂化物形式的所有那些。此外，肽可以是任何药学上可接受的形式。
盐的种类没有特别限制。然而，期望盐对于对象(例如，哺乳动物)是安全且有效的形式，但盐类型不特别限于此。
术语“药学上可接受的”是指在医学判断范围内可有效用于所需目的而不会引起过度毒性、刺激、过敏反应等的材料。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”包括衍生自药学上可接受的无机酸、有机酸或碱的盐。合适的酸的实例包括盐酸、溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸(toluene-p-sulfonic acid)、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。衍生自合适的碱的盐可包括碱金属(例如，钠、钾等)、碱土金属(例如，镁等)、铵等。
此外，如本文所用，术语“溶剂化物”是指在根据本发明的肽或其盐与溶剂分子之间形成的复合物。
在本发明中，任何白细胞介素-2类似物对天然白细胞介素-2受体的结合亲和力都可以使用各种已知技术测量，这些技术是用于测量对受体的亲和力的方法。例如，可以使用表面等离子体共振(SPR)，但测量方法不限于此。
更具体地，本发明的白细胞介素-2类似物可具有相比于天然白细胞介素-2或阿地白介素对白细胞介素-2α受体的减少或增加的结合亲和力。
具体地，本发明的白细胞介素-2类似物可具有相比于天然白细胞介素-2或阿地白介素对白细胞介素-2α受体的约0.001倍或更高、约0.005倍或更高、约0.01倍或更高、约0.05倍或更高、约0.1倍或更高，约0.3倍或更高、约0.5倍或更高、约0.7倍或更高、约0.9倍或更高、约1.1倍或更高、约1.3倍或更高、约1.5倍或更高、或约1.7倍或更高的结合亲和力，但结合亲和力的数值不受限制，并且只要相比于天然白细胞介素-2或阿地白介素的结合亲和力存在变化，那么该值就将属于本发明的范围。
可选地，基于阿地白介素对白细胞介素-2α受体的结合亲和力(设置为100％)，本发明的白细胞介素-2类似物可以对白细胞介素-2α受体没有结合亲和力，或者具有对白细胞素-2α受体的约1％或更高、约5％或更高、约7％或更高、约10％或更高、约15％或更高、约20％或更高、约30％或更高、约50％或更高、约70％或更高、约90％或更高、约100％或更高、约150％或更高、或约200％或更高的结合亲和力，但结合亲和力的数值不受限制，并且只要相比于天然白细胞介素-2或阿地白介素的结合亲和力存在变化，那么该值就将属于本发明的范围。
此外，本发明的白细胞介素-2类似物相比于天然白细胞介素-2或阿地白介素对白细胞介素-2β受体的结合亲和力可特异性地具有约0.1倍或更高、约0.3倍或更高、约0.5倍或更高、约0.7倍或更高、约1.0倍或更高、约10倍或更高、约20倍或更高、约30倍或更高、约40倍或更高、约50倍或更高、约60倍或更高、约70倍或更高、约80倍或更高、约90倍或更高、或约100倍或更高的对白细胞介素-2β受体的结合亲和力，但结合亲和力的数值不受限制，并且只要相比于天然白细胞介素-2或阿地白介素的结合亲和力存在变化或增加，那么该值就将属于本发明的范围。
可选地，基于阿地白介素对白细胞介素-2β受体的结合亲和力(设置为100％)，本发明的白细胞介素-2类似物可具有约5％或更高、约9％或更高、约10％或更高、约20％或更高、约30％或更高、约50％或更高、约100％或更高、约200％或更高、约500％或更高、约700％或更高、约1,000％或更高、约1,500％或更高、约3,000％或更高、约5,000％或更高、约7,000％或更高、约10,000％或更高、约12,000％或更高、约15,000％或更高、约20,000％或更高、或约25,000％的对白细胞介素-2β受体的结合亲和力，但结合亲和力的数值不受限制，并且只要相比于天然白细胞介素-2或阿地白介素的结合亲和力存在增加，那么该值就将属于本发明的范围。
如本文所用，术语“约”指的是范围，其包括±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1等全部，并且包括所有这样的值：其等同或近似于这些值之后的值，但范围不限于此。
本发明的白细胞介素-2类似物的特征在于，其相比于天然白细胞介素-2或阿地白介素具有对白细胞介素-2α受体改变的结合亲和力和对白细胞素-2β受体增加的结合亲合力。
在本发明的一个具体实施方式中，为了制备本发明的白细胞介素-2类似物，将白细胞介素-2类似物制备成引入了基于天然白细胞介素-2(SEQ ID NO:1)的修饰。本发明中制备的白细胞介素-2类似物可以是包括SEQ ID NO:3至106当中任一个氨基酸序列的白细胞介素-2类似物，或者可以是由SEQ ID NO:108至211当中任一个核苷酸序列编码的白细胞介素-2类似物。
实施本发明的又一方面提供了编码白细胞介素-2类似物的核酸(多核苷酸)、包括所述核酸的重组表达载体、以及包括所述核酸或重组表达载体的转化体。
编码本发明的白细胞介素-2类似物的核酸可以是这样的核酸：其经修饰，使得可以将修饰(氨基酸的缺失、取代和/或添加)引入SEQ ID NO:1的天然白细胞介素-2特定位置的氨基酸，并且具体地，本发明的白细胞介素-2类似物可以包括编码SEQ ID NO:3至106当中任一个氨基酸序列的核苷酸序列。例如，本发明的核酸可以具有或包括SEQ ID NO:108至211当中任一个的核苷酸序列。
考虑到密码子简并性或本发明核酸待表达的生物体中优选的密码子，本发明的核苷酸序列可以在不改变本发明的白细胞介素-2类似物的氨基酸序列的范围内在编码区中进行各种修饰。具体地，本发明的核酸可以具有或包括与SEQ ID NO:108至211的序列中任一个具有70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高且小于100％的同源性或同一性的核苷酸序列；或者可以由与SEQ ID NO:108至211的序列中任一个具有70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高且小于100％的同源性或同一性的核苷酸序列组成或主要由其组成，但核酸不限于此。
另外，本发明的核酸可非限制地包括探针，其可由已知的基因序列(例如，可在严格条件下与和本发明的核酸序列的全部或部分互补的序列杂交的序列)制备。“严格条件”是指能够实现多核苷酸之间特异性杂交的条件。这样的条件被详细描述在文献中(参见J.Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版,Cold SpringHarbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York,9.50–9.51,11.7–11.8)。
杂交要求两个核酸具体互补序列，尽管根据杂交的严格性在碱基之间错配是可能的。术语“互补”用于描述能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，关于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，而胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本发明的核酸可包括分离的与整个序列互补的核酸片段以及与其基本上相似的核酸序列。
适于杂交多核苷酸的严格性取决于多核苷酸的长度和互补程度，并且这些变量是本领域公知的(例如，Sambrook et al.,同上)。
同源性和同一性如上所述。
根据本发明的重组载体可以构建成用于典型克隆的载体或用于表达的载体，并且可以构建成采用真核或原核细胞作为宿主细胞的载体。
如本文所用，术语“载体”，作为能够在适当宿主细胞中表达目标蛋白的重组载体，是指包括可操作地连接以实现核酸插入物表达的基本控制元件的核酸构建体。在本发明中，可以制备包括编码白细胞介素-2类似物的核酸的重组载体，并且本发明的白细胞介素-2类似物可以通过用重组载体转化或转染宿主细胞获得。
如本文所用，术语“转化”是指将DNA导入宿主细胞以允许DNA作为染色体的因子或通过完成染色体整合而复制，并且外源DNA被导入细胞以人为地引起遗传变化的现象。
适用于本发明的宿主可不作具体地限制，只要其能够表达本发明的核酸即可。可用于本发明的宿主的具体实例可包括：埃希氏菌(Escherichia)属的细菌(例如，大肠杆菌(E.coli))；芽孢杆菌(Bacillus)属的细菌(例如，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))；假单胞菌(Pseudomonas)属的细菌(例如，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida))；酵母(例如，毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))；昆虫细胞(例如，草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9))；以及动物细胞(例如，CHO、COS、BSC等)。
实施本发明的又一方面提供了用于制备包括一个或多个修饰的白细胞介素-2类似物的方法。
具体地，方法可包括将修饰引入选自与天然白细胞介素-2中第1、12、18、19、20、22、32、35、38、42、43、45、48、49、61、68、69、74、76、80、81、82、84、85、86、87、88、89、91、92、94、95、96、125、126和133位的氨基酸对应的氨基酸的一个或多个氨基酸中。
更具体地，方法可以是：
(a)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125和32位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(b)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125和35位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(c)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125和38位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(d)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125和42位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(e)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125和43位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(f)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125和48位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(g)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125和49位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(h)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125和76位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(i)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、81、92、94和96位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(j)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125和87位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(k)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38和42位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(l)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38和80位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(m)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38和84位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(n)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、19、38和42位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(o)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、12、38和42位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(p)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42和61位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(q)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42和84位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(r)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42和88位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(s)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42和89位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(t)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42和91位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(u)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42和94位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(v)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42和126位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(w)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、80和84位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(x)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、94和96位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(y)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(z)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、61、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(aa)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(ab)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、80、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(ac)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、81、84和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(ad)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、20、38、42、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(ae)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、80、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(af)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、74、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(ag)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、81、84和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(ah)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、81、88和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(ai)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(aj)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、80、81、85和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(ak)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、80、81、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(al)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(am)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、45、74、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(an)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、74、80、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(ao)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、80、81、84和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(ap)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、45、80、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(aq)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(ar)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、42、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(as)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、61、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(at)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、69、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(au)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、80、81、85、86、91和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(av)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、18、22、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(aw)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(ax)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、45、74、80、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(ay)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、68、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(az)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、69、74、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(ba)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、80、81、84、85、86、91和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(bb)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、80、81、85、86、92、94和96位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(bc)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、18、19、22、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(bd)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、18、22、38、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(be)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、18、22、61、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(bf)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、18、22、68、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(bg)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、35、38、42、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(bh)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、45、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(bi)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、80、81、85、86、91和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(bj)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、80、81、85、86、92和95位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(bk)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、35、38、42、74、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(bl)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、43、61、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(bm)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、80、81、85、86、91、92和95位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(bn)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、35、38、42、74、80、81、82、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(bo)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、80、81、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；或
(bp)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、80、81、85和86位的氨基酸被不同的氨基酸取代，
但方法不限于此。
白细胞介素-2类似物和修饰与上文相同。
在用于制备本发明的白细胞介素-2类似物的方法的另一个实施方式中，用于制备白细胞介素-2类似物的方法可以包括(a)培养转化体，所述转化体包括编码白细胞介素-2类似物并表达白细胞介素-2类似物的核酸；和(b)分离并纯化所表达的白细胞介素-2类似物，但方法不限于任何特定方法，并且可以使用本领域已知的任何方法，只要可以通过该方法制备白细胞介素-2类似物即可。
在本发明中，编码白细胞介素-2类似物的核酸可以包括SEQ ID NO:108至211当中任一个核苷酸序列或(主要)由其组成。
本发明中用于培养转化体的培养基必须满足以适当方式培养宿主细胞的要求。本领域技术人员可根据所产生的转化体的类型来决定适当选择可包括在培养基中供宿主细胞生长的碳源，并且可采用适当的培养条件来控制培养的时间和量。
可使用的糖源可包括糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素)；油和脂肪(例如，大豆油、葵花籽油、蓖麻油和椰子油等)；脂肪酸(例如，棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)；醇(例如，甘油和乙醇)；以及有机酸(例如，乙酸)。这些材料可以单独使用或作为混合物使用。
可使用的氮源可包括蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、豆粉和尿素，或无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)。氮源也可以单独使用或作为混合物使用。
可使用的磷源可包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和对应的含钠盐。此外，培养基可含有生长所需的金属盐(例如，硫酸镁和硫酸铁)。
最后，除了这些材料之外，还可以使用必需生长材料(例如，氨基酸和维生素)。此外，可以使用适合的培养基前体。上述原料可以在培养过程中以适合培养物的方式，按照分批或连续的方式添加。可以以适当的方式使用碱性化合物(例如，氢氧化钠、氢氧化钾和氨)或酸性化合物(例如，磷酸和硫酸)来调节培养物的pH。此外，可以使用消泡剂(例如，脂肪酸聚二醇酯)来抑制气泡的产生。为了维持有氧条件，将氧气或含氧气体(例如，空气)注入培养物中。
根据本发明的转化体的培养通常在20℃至45℃，具体是25℃至40℃的温度下进行。此外，继续培养直至获得最大量所需的白细胞介素-2类似物，为此，培养通常可以持续10至160小时。
如上所述，如果根据宿主细胞建立适当的培养条件，则根据本发明的转化体将产生白细胞介素-2类似物，并且根据载体的组成和宿主细胞的特性，产生的白细胞介素-2类似物可以分泌到宿主细胞的细胞质中、周质空间中，或分泌到细胞外。
在宿主细胞或其外部表达的蛋白质可以以常规方式纯化。纯化方法的实例包括盐析(例如，硫酸铵沉淀、磷酸钠沉淀等)、溶剂沉淀(例如，使用丙酮、乙醇等的蛋白质分级沉淀)、透析、凝胶过滤、离子交换、色谱法(例如，反相柱色谱法)、超滤等，并且可以单独使用或组合使用。
在本发明的具体实施方式中，用于制备白细胞介素-2类似物的方法可以包括：
(a)表达白细胞介素-2类似物；和
(b)分离表达的白细胞介素-2类似物。
在本发明的具体实施方式中，可以进一步包括以下步骤以从转化体中分离和纯化以包含体形式表达的白细胞介素-2类似物：
(b-1)从上述步骤(a)的培养基中收集并破坏转化体；
(b-2)回收并复性(refolding)被破坏的细胞裂解物中表达的白细胞介素-2类似物；和
(b-3)通过尺寸排阻色谱法纯化经复性的白细胞介素-2类似物。
实施本发明的又一方面提供了通过肽合成方法制备白细胞介素-2类似物的方法。由于已经提供了本发明的白细胞介素-2类似物的序列，因此可以使用已知的肽合成方法进行肽的合成。
白细胞介素-2类似物和修饰如上所述。
实施本发明的又一方面提供了用于增加对白细胞介素-2β受体的结合亲和力的方法，其包括修饰天然白细胞介素-2中的一个或多个氨基酸。
根据本发明的用于增加对白细胞介素-2β受体的结合亲和力的方法可以是相比于天然白细胞介素-2或阿地白介素不仅增加对白细胞介素-2β受体的结合亲和力，而且改变对白细胞介素-2α受体的结合亲和力的方法。
具体地，方法可包括将修饰引入对应于天然白细胞介素-2中第1、12、18、19、20、22、32、35、38、42、43、45、48、49、61、68、69、74、76、80、81、82、84、85、86、87、88、89、91、92、94、95、96、125、126和133位的氨基酸的一个或多个氨基酸的步骤。
更具体地，方法可以是：
(a)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125和32位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(b)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125和35位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(c)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125和38位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(d)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125和42位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(e)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125和43位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(f)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125和48位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(g)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125和49位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(h)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125和76位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(i)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、81、92、94和96位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(j)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125和87位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(k)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38和42位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(l)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38和80位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(m)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38和84位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(n)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、19、38和42位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(o)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、12、38和42位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(p)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42和61位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(q)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42和84位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(r)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42和88位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(s)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42和89位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(t)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42和91位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(u)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42和94位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(v)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42和126位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(w)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、80和84位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(x)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、94和96位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(y)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(z)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、61、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(aa)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(ab)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、80、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(ac)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、81、84和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(ad)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、20、38、42、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(ae)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、80、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(af)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、74、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(ag)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、81、84和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(ah)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、81、88和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(ai)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(aj)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、80、81、85和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(ak)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、80、81、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(al)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(am)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、45、74、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(an)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、74、80、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(ao)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、80、81、84和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(ap)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、45、80、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(aq)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(ar)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、42、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(as)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、61、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(at)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、69、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(au)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、80、81、85、86、91和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(av)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、18、22、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(aw)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(ax)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、45、74、80、81和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(ay)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、68、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(az)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、69、74、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(ba)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、80、81、84、85、86、91和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(bb)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、80、81、85、86、92、94和96位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(bc)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、18、19、22、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(bd)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、18、22、38、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(be)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、18、22、61、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(bf)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、18、22、68、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(bg)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、35、38、42、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(bh)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、45、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(bi)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、80、81、85、86、91和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(bj)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、80、81、85、86、92和95位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(bk)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、35、38、42、74、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(bl)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、43、61、80、81、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(bm)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、38、42、80、81、85、86、91、92和95位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(bn)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、35、38、42、74、80、81、82、85、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；
(bo)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、80、81、86和92位的氨基酸被不同的氨基酸取代；或
(bp)方法，其中在天然白细胞介素-2中，第1位的氨基酸被去除并且第125、80、81、85和86位的氨基酸被不同的氨基酸取代，但方法不限于此。
白细胞介素-2类似物和修饰与上文相同。
实施本发明的又一方面提供了包括选自SEQ ID NO:3至106的氨基酸序列的任一个序列的白细胞介素-2类似物。
由SEQ ID NO表示的白细胞介素-2类似物、修饰物和类似物的定义与上文相同。
具体地，白细胞介素-2类似物可以包括选自SEQ ID NO:3至106的任一个核苷酸序列、主要由其组成、或由其组成，但白细胞介素-2类似物不限于此。
实施本发明的又一方面提供了包括由以下通式1表示的氨基酸序列的白细胞介素-2类似物：
[通式1]
X1-P-T-S-S-S-T-K-K-T-Q-L-Q-L-E-H-L-X18-X19-D-L-X22-M-I-L-N-G-I-N-N-Y-K-N-P-K-L-T-X38-M-L-T-X42-X43-F-X45-M-P-K-K-A-T-E-L-K-H-L-Q-C-L-E-X61-E-L-K-P-L-E-X68-V-L-N-L-A-X74-S-K-N-F-H-X80-X81-P-R-X84-X85-X86-S-N-I-N-X91-X92-V-X94-E-X96-K-G-S-E-T-T-F-M-C-E-Y-A-D-E-T-A-T-I-V-E-F-L-N-R-W-I-T-F-S-Q-S-I-I-S-T-L-T(通式1，SEQ ID NO:212)
其中在上述通式1中，
X1是缺失；
X18是亮氨酸(L)或精氨酸(R)；
X19是亮氨酸(L)或酪氨酸(Y)；
X22是谷氨酸(E)或谷氨酰胺(Q)；
X38是丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)或精氨酸(R)；
X42是丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、赖氨酸(K)或色氨酸(W)；
X43是谷氨酸(E)、赖氨酸(K)或谷氨酰胺(Q)；
X45是丙氨酸(A)或酪氨酸(Y)；
X61是天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)或精氨酸(R)；
X68是天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)；
X74是组氨酸(H)或谷氨酰胺(Q)；
X80是苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)或酪氨酸(Y)；
X81是天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)或精氨酸(R)；
X84是天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)；
X85是丙氨酸(A)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)；
X86是丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)；
X91是苏氨酸(T)或缬氨酸(V)；
X92是苯丙氨酸(F)、异亮氨酸(I)或酪氨酸(Y)；
X94是苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)；以及
X96是苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)。
此外，在上述通式1中，一个或多个氨基酸可以添加到苏氨酸(T)，其对应于X133，但序列不限于此。
具体地，白细胞介素-2类似物可以包括选自SEQ ID NO:10、13、14、15、16、17、20、21、22、32、35、36、42、53、54、56、58、59、60、62、71、72、74、75、76、77、78、85、87、89、91、92、93、94、95、98、99、100、101、103、104、105和106的氨基酸序列的任一个序列、主要由其组成、或由其组成，但白细胞介素-2类似物不限于此。
此类白细胞介素-2类似物相比于阿地白介素或天然白细胞介素-2可具有增加的对β受体的结合亲和力，但白细胞介素-2类似物的结合亲和力不限于此。
在另一个实施方式中，本发明的白细胞介素-2类似物可以是：
在上述通式1中，
X43是赖氨酸(K)；
X45是酪氨酸(Y)；
X61是天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)或谷氨酰胺(Q)；
X68是谷氨酸(E)；
X74是谷氨酰胺(Q)；
X80是苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)；
X85是亮氨酸(L)、缬氨酸(V)或酪氨酸(Y)；
X86是异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)；和
X92是苯丙氨酸(F)或异亮氨酸(I)，但白细胞介素-2类似物不限于此。
具体地，白细胞介素-2类似物的特征在于，其包括选自SEQ ID NO:10、13、14、16、17、20、21、22、32、35、36、42、53、54、87、89、91、92、93、94、98、99、100、101、103、104和105的氨基酸序列的任一个序列。
在本发明的白细胞介素-2类似物中，一个或多个氨基酸可以进一步添加到其C-末端，但白细胞介素-2类似物不限于此。
实施本发明的又一方面提供了包括由以下通式2表示的氨基酸序列的白细胞介素-2类似物：
[通式2]
X1-P-T-S-S-S-T-K-K-T-Q-L-Q-L-E-H-L-X18-L-D-L-X22-M-I-L-N-G-I-N-N-Y-K-N-P-K-L-T-X38-M-L-T-X42-K-F-Y-M-P-K-K-A-T-E-L-K-H-L-Q-C-L-E-X61-E-L-K-P-L-E-X68-V-L-N-L-A-Q-S-K-N-F-H-F-X81-P-R-D-X85-X86-S-N-I-N-V-F-V-L-E-L-K-G-S-E-T-T-F-M-C-E-Y-A-D-E-T-A-T-I-V-E-F-L-N-R-W-I-T-F-S-Q-S-I-I-S-T-L-T(通式2，SEQ IDNO:213)
其中在上述通式2中，
X1是缺失；
X18是亮氨酸(L)或精氨酸(R)；
X22是谷氨酸(E)或谷氨酰胺(Q)；
X38是丙氨酸(A)或精氨酸(R)；
X42是苯丙氨酸(F)或赖氨酸(K)；
X61是天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)；
X68是天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)；
X81是天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)；
X85是亮氨酸(L)或缬氨酸(V)；以及
X86是异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)。
具体地，白细胞介素-2类似物可以包括选自SEQ ID NO:22、42、53、87、105和106的氨基酸序列的任一个序列，但白细胞介素-2类似物的序列不限于此。
此外，在上述通式2中，可以将一个或多个氨基酸添加到苏氨酸(T)中，其对应于X133，或者可选地，在白细胞介素-2类似物中，一个或多个氨基酸可以进一步添加到其C-末端，但本发明不限于此。
同时，除非本说明书中上下文另有要求，否则诸如“包括(include)”、“包括(including)”、“包含”等的表达式意味着它们包括指定的整数或整数组，但应理解，这些表达不排除其它整数或整数集。
在下文中，将通过实例更详细地描述本发明。这些实施例仅用于更详细地描述本发明，而本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例1：天然白细胞介素-2和白细胞介素-2类似物的表达载体的制备
为了制备编码133个氨基酸的天然白细胞介素-2的表达载体，将基于报道的白细胞介素-2序列(NM_000586.3；SEQ ID NO:1)所合成的白细胞介素-2克隆到pET-22b载体(Novagen)中。此外，制备了使用白细胞介素-2作为模板，对白细胞介素-2的氨基酸(一个或多个)进行修饰的新型白细胞介素-2类似物。扩增白细胞介素-2类似物的PCR条件为由95℃30秒、55℃60秒和65℃6.5分钟组成的这一过程16个循环。为了确认所期望位置的氨基酸(一个或多个)是否已被正确取代，对在上述条件下获得的诱变产物进行序列分析。结果，确认了下表1中所示的修饰是基于每种白细胞介素-2类似物的所期望突变位置的天然类型而发现的。由此获得的表达载体命名为pET22b-白细胞介素-2类似物1至105。
下表1显示了每种类似物的改变的氨基酸序列以及类似物名称。为了制备这些白细胞介素-2类似物，合成了正向(F)引物和反向(R)引物，然后进行PCR以扩增每种类似基因。
在下表1中，类似物1代表阿地白介素，而引物编号1至203分别对应于SEQ ID NO:214至417。
[表1]白细胞介素-2类似物的类型、其修饰位置、以及改变的序列
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在上表1中，desA1表示丙氨酸的缺失，丙氨酸是白细胞介素-2的第一个氨基酸。
下表2显示了白细胞介素-2类似物的全长蛋白质序列。表2中以粗体显示的字母表示修饰位置。
[表2]白细胞介素-2类似物的序列
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/>
/>
实施例2：白细胞介素-2类似物的表达
使用实施例1中制备的表达载体于T7启动子的控制下表达重组白细胞介素-2类似物。
用每个重组白细胞介素-2类似物表达载体转化表达大肠杆菌菌株，即大肠杆菌BL21DE3(大肠杆菌B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-)galλ(DE3)；Novagen)。至于转化方法，使用了Novagen推荐的方法。收集每个重组表达载体所转化的每一个单菌落，将其接种到含有氨苄青霉素(50μg/mL)的2X Luria肉汤培养基中，并在37℃下培养15小时。将每个重组菌株培养液和含有30％甘油的2X LB培养基以1:1(v/v)的比例混合，并将每1mL混合物分配到冷冻管中，并储存在-150℃。这被用作产生重组蛋白的细胞储液。
为了表达每种重组白细胞介素-2类似物，溶解每个细胞储液一小瓶，将其接种到500mL 2X LB中，并在37℃下摇动培养14至16小时。当600nm处的吸光度值达到4.0或更高时，终止培养，并将其用作种子培养液。将种子培养物接种到1.6L发酵培养基中，并使用5L发酵罐(Biolo-320，NBS，USA)开始初始发酵。采用37℃的温度、2.0L/min(1vvm)的空气体积、650rpm的搅拌速度和30％的氨水将培养条件维持在pH 6.70。至于发酵过程，当培养基中的营养物受到限制时，通过添加额外的其它培养基(补给(feeding)溶液)进行补料分批培养。通过吸光度观察菌株的生长，并在70或更高的吸光度值时引入最终浓度为500μM的IPTG。在引入IPTG后再进行培养，直到约23至25小时，并在培养终止后，并使用离心机回收重组菌株并将其储存在-80℃直到使用。
实施例3：白细胞介素-2类似物的提取和复性
为了从实施例2获得的表达白细胞介素-2类似物的大肠杆菌中将白细胞介素-2类似物转变为可溶形式，将细胞破碎并复性。将对应于100mL培养物的细胞团块(pellets)悬浮在1-200mL裂解缓冲溶液(20mM Tris-HCl(pH 9.0)，1mM EDTA(pH 9 9.0)，0.2M NaCl，0.5％Triton X-100)中，并使用微射流均质机(microfluidizer)在15,000psi下破碎重组大肠杆菌细胞。在13,900g离心30分钟后，丢弃上清液，并用400mL第一洗涤缓冲溶液(50mMTris-HCl(pH 8.0)，5mM EDTA(pH 9.0))洗涤团块。在与如上相同的条件下离心后，丢弃上清液，并用400mL第二洗涤缓冲溶液(50mM Tris-HCl(pH 8.0)，5mM EDTA(pH9.0)，2％Triton X-100)洗涤团块。在与如上相同的条件下离心后，丢弃上清液，并用400mL第三洗涤缓冲溶液(50mM Tris-HCl(pH 8.0)，5mM EDTA(pH 9.0)，1％脱氧胆酸钠)洗涤团块。在与如上相同的条件下离心后，丢弃上清液，并用400mL第四洗涤缓冲溶液(50mM Tris-HCl(pH8.0)，5mM EDTA(pH 9.0)，1M NaCl)洗涤团块。将所得物在与如上相同的条件下离心并洗涤，从中获得大肠杆菌包含体。将洗涤的包含体团块重新悬浮在400mL可溶性/还原性缓冲液(6M胍，100mM Tris(pH 8.0)，2mM EDTA(pH 9.0)，50mM DTT)中并在50℃下搅拌30分钟。向可溶性/还原的白细胞介素-2类似物中加入100mL蒸馏水以将6M胍稀释成4.8M胍，然后将所得物在13,900g下离心30分钟，并丢弃团块以仅获得其中的溶液。向稀释后的溶液中另外加入185.7mL蒸馏水，并将4.8M胍稀释成3.5M胍，并使用100％乙酸将pH调节至5.0。将pH调节后的溶液在室温下搅拌1小时。将含有沉淀杂质的溶液以13,900g离心30分钟，并丢弃上清液，并用最终洗涤缓冲溶液(3.5M胍，20mM乙酸钠(pH 5.0)，5mM DTT)洗涤团块。在与如上相同的条件下离心所得物以获得团块。将洗涤后的白细胞介素-2类似物溶于400mL复性缓冲溶液(6mM胍，100mM Tris(pH 8.0)，0.1mM CuCl2)。通过在4℃下搅拌混合溶液15至24小时来进行复性过程。
实施例4：尺寸排阻柱色谱法
将实施例3中获得的白细胞介素-2类似物复性溶液浓缩到少于1mL，以施加到尺寸排阻柱进行纯化。在用复性溶液引入之前，用缓冲溶液(2M胍，100mM Tris(pH 8.0))平衡该柱，并在引入复性溶液之后通过使缓冲溶液向其流动来洗脱。由于洗脱样品含有胍，因此用稳定溶液(10mM乙酸钠(pH 4.5)，5％海藻糖)对其进行置换，并通过RP-HPLC和肽图谱分析测量纯度。当样品测得的纯度达到80％或更高时，将其用于实验。
实施例5：白细胞介素-2类似物对受体的结合亲和力的评价
为了测量实施例4中获得的白细胞介素-2类似物对白细胞介素-2α受体和白细胞介素-2β受体中每一个的结合亲和力，使用表面等离子体共振测量(BIACORE T200，GEHealthcare)。测量所制备的类似物对α受体和β受体的结合亲和力，并将每个所制备的类似物的结合亲力与白细胞介素-2类似物01(阿地白介素)的结合亲合力进行比较。
首先，通过胺偶联将抗人免疫球蛋白抗体(Abcam，#ab97221)固定到CM5芯片(GEHealthcare)多达约5,000RU(共振单位)，然后，通过利用抗原-抗体结合反应使白细胞介素-2α受体(SYMANSIS，#4102H)或白细胞介素-2β受体(SYMANSIS，#4122H)——其每一个都与人免疫球蛋白Fc区结合——与每个免疫球蛋白抗体结合，最终将免疫球蛋白固定。此后，以各种浓度稀释上述制备的重组白细胞介素-2类似物，并使其流动到CM5芯片上——最终白细胞介素-2受体被固定到该芯片上——以测量每种白细胞介素-2受体的结合亲和力。结合亲和力的测量由结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)的测量构成，其中通过以10L/min的流速使每种白细胞介素-2类似物流动3分钟来测量结合速率，同时通过以相同时间段和相同流速仅使实验缓冲液流动来测量每种白细胞介素-2受体的解离速率。测量完成后，根据Biaevaluation程序中的1:1结合拟合模型来评价对受体的结合亲和力。
相对结合亲和力(KD)(％)＝
类似物01(阿地白介素)的结合亲和力(KD)/类似物的结合亲合力(KD)×100
在下表3中，“无法定义”表示无法定义对应受体的对应物理量，因为在表面等离子体共振测量中未观察到与受体的结合。
[表3]与类似物01(阿地白介素)相比白细胞介素-2类似物对白细胞介素-2α或白细胞介素-2β受体的相对结合亲和力
/>
/>
如测试结果(图1和图2以及表3)中明确显示的，证实了本发明的白细胞介素-2类似物对白细胞介素-2α受体没有结合亲和力、结合亲和力增加/减少等，因此显示出相比于天然白细胞介素-2或阿地白介素，对白细胞介素-2α受体改变的结合亲合力。相比之下，对于白细胞介素-2β受体，本发明的白细胞介素-2类似物显示出相比于天然白细胞介素-2或阿地白介素更强的结合亲和力，高达100倍。根据上述结果，证实了白细胞介素-2类似物的氨基酸序列对其与白细胞介素-2α或白细胞介素-2β受体的结合有影响。这些结果表明，对白细胞介素-2受体的结合亲和力能够通过在具体位置取代氨基酸来改变。
这些实验结果表明，根据本发明的白细胞介素-2类似物具有对白细胞介素-2α受体和白细胞介素-2β受体改变的结合亲和力，因此可基于此而用于多种药物的开发。
根据前述内容，本发明所属领域普通技术人员将能够理解，本发明能够以其它具体形式体现而不修改本发明的技术构思或必要特征。对此，本文公开的示例性实施方式仅出于示例目的，而不应被解释为限制本发明的范围。相反，本发明旨在不仅涵盖示例性实施方式，还涵盖各种可选方案、修改、等效方案和其它实施方式，这些实施方式可以包括在由所附权利要求限定的本发明的精神和范围内。
Claims (5)
1.白细胞介素-2类似物，其相比于阿地白介素具有对白细胞介素-2β受体增加的结合亲和力，其中所述白细胞介素-2类似物由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自SEQ IDNO:22、42、53、87、105和106的氨基酸序列中的任一个。
2.根据权利要求1所述的白细胞介素-2类似物，其中所述白细胞介素-2类似物相比于阿地白介素具有对白细胞介素-2α受体改变的结合亲和力。
3.分离的核酸，其编码根据权利要求1至2中任一项所述的白细胞介素-2类似物。
4.重组表达载体，其包括根据权利要求3所述的核酸。
5.转化体，其包括根据权利要求4所述的重组表达载体，不包括人。
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