CN116003626A

CN116003626A - 基于机械偶联的蛋白质异质索烃的生物合成方法及其应用

Info

Publication number: CN116003626A
Application number: CN202211121806.7A
Authority: CN
Inventors: 张文彬; 刘雅杰
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2022-09-15
Filing date: 2022-09-15
Publication date: 2023-04-25

Abstract

本发明提供了一种基于机械偶联的蛋白质异质索烃的生物合成方法及其应用。本发明基于二聚结构基元介导的分子内缠结和正交分离型内含肽介导的定点环化，能够实现含有目标蛋白质与功能蛋白质基元的蛋白质异质索烃的模块化制备。本发明提供的方法基于合理的基因序列设计，不需要额外的胞外反应，通过表达纯化即可获得相应的蛋白质异质索烃。所制备的蛋白质异质索烃可以保留各组成功能基元对相应受体的亲和能力，同时由于索烃结构对蛋白质的构象具有限制作用，可以有效提升蛋白质的整体稳定性。利用本发明所述方法可将蛋白质药物的线型主链拓展为链环拓扑结构，制备得到的基于机械偶联的蛋白质异质索烃能够有效延长蛋白质药物的体内半衰期。

Description

基于机械偶联的蛋白质异质索烃的生物合成方法及其应用

技术领域

本发明属于蛋白质药物的生物合成领域，特别涉及基于机械偶联的蛋白质异质索烃的生物合成方法及其应用。

背景技术

在过去几十年里，包括抗体、酶和细胞因子等在内的蛋白质药物迅速发展，成为现代生物制药领域最重要的一类产品之一。与小分子药物相比，蛋白质药物具有高活性、特异性强、毒性低和生物功能明确的特点。然而，由于蛋白质固有的不稳定性和较差的体内药代动力学，通常需要对其加以修饰来提高蛋白质药物的稳定性和整体药效，同时减少蛋白质药物的副作用。

目前，通过将蛋白质药物与各种功能基团进行生物偶联，从而延长蛋白质药物的体内半衰期，已经被证明是一种相对有效的改进策略。该策略可以进一步分为两大类，一类是与人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)、抗体的可结晶区片段或类弹性蛋白多肽等稳定的蛋白质基元进行融合表达；另一类则是利用聚乙二醇、合成的聚多肽或羟乙基淀粉等高分子聚合物进行共价修饰。前者往往会导致生物活性降低，而后者的制备纯化过程复杂，除使生物活性降低外并可能带来额外的免疫原性。因此，发展全新的生物偶联策略以有效改善蛋白质药物的性质是一个非常值得研究的方向。

机械键是由两个或多个组分之间的空间缠结而产生的一种独特的键合类型。在超分子化学领域，机械键通常被应用于制造分子机器。近年来，随着天然拓扑蛋白质的不断发掘，具有机械键的拓扑蛋白质，例如纽结蛋白、套索肽和蛋白质索烃等，由于其高稳定性特征受到了研究者的广泛关注。其中，蛋白质索烃作为一种典型的具有机械键的分子，其是由两个或多个环状基元形成了独特的机械偶联结构，为分子偶联提供了一种新的模式。基于组装-反应协同的策略，结合能够形成相互缠结的组装基元，多种人工合成蛋白质索烃的方法已经被开发出来，包括被动和主动模板法、流水线型合成和拓扑结构转化等。

索烃化策略也已经被证明可以在有效保留蛋白质原始活性的情况下进一步提高其稳定性。索烃化策略包含同质索烃和异质索烃，相比较于同质索烃，异质索烃由于组成基元各不相同，事实上是多种功能蛋白质通过机械偶联得到的偶联物。因此，将基于异质索烃化的机械偶联策略运用于蛋白质药物的工程化中，有望实现蛋白质药物的功能整合和稳定性提升。同时，该策略可以运用直接生物合成的方式进行制备，是不同于简单融合的一种新的偶联方法。

发明内容

发明要解决的问题

针对现有蛋白质药物长效化技术中常见的生物活性降低、合成制备方法繁琐、纯化工艺复杂，以及额外的免疫原性等问题，本发明提供了一种基于机械偶联的蛋白质异质索烃的生物合成方法及其应用。

用于解决问题的方案

本发明人鉴于上述现有技术中存在的问题，进行了深入研究、反复试验，通过机械偶联实现蛋白质药物与其他功能组分的偶联，制备得到异质索烃化的蛋白质药物，从而完成了本发明。即本发明如下所述：

[1].一种基于机械偶联的蛋白质异质索烃的生物合成方法，所述方法包括以下步骤：

1)设计蛋白质异质索烃的蛋白质前体序列，并合成所述蛋白质前体序列对应的编码基因序列；其中，所述蛋白质前体序列中至少包含：i)形成二聚体的缠结基元；ii)在细胞内发生正交偶联反应的两对环化基元；iii)目标蛋白质；和iv)功能蛋白质基元；

其中，所述蛋白质前体序列中包含的形成二聚体的缠结基元为异质化的缠结基元，其包含第1缠结基元和第2缠结基元；在一些优选的实施方案中，所述异质化的缠结基元为能够形成异质二聚体结构的p53dim突变体对；

2)将步骤1)设计的编码基因序列导入表达载体中，得到重组表达载体；

3)将步骤2)所述重组表达载体转入宿主细胞中进行表达，获得融合蛋白；

4)对步骤3)所述的融合蛋白进行纯化，得到基于机械偶联的蛋白质异质索烃。

[2].根据[1]所述的生物合成方法，其中，所述第1缠结基元和第2缠结基元包含以下序列中的一种或多种：

(i)如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：13～16中任一项所示的氨基酸序列；

在一些优选的实施方案中，所述第1缠结基元选自所述SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15中的任一种，所述第2缠结基元选自所述SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16中的任一种；

在一些更优选的实施方案中，所述SEQ ID NO：2作为第1缠结基元与所述SEQ IDNO：3作为第2缠结基元组成异质化的缠结基元、所述SEQ ID NO：13作为第1缠结基元与所述SEQ ID NO：14作为第2缠结基元组成异质化的缠结基元、或者所述SEQ ID NO：15作为第1缠结基元与所述SEQ ID NO：16作为第2缠结基元组成异质化的缠结基元；

在最优选的实施方案中，所述SEQ ID NO：2作为第1缠结基元与所述SEQ ID NO：3作为第2缠结基元组成异质化的缠结基元；

(ii)与所述SEQ ID NO:2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：13～16中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且保留如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：13～16中任一项所示的氨基酸序列形成缠结二聚体的功能；

(iii)在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：13～16中任一项所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，并且其保留如SEQ IDNO:2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：13～16中任一项所示的氨基酸序列形成缠结二聚体的功能；或，

(iv)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：13～16中任一项所示的氨基酸序列的多核苷酸序列在严格条件下杂交，并且所述氨基酸序列保留以SEQ ID NO:2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：13～16中任一项所示的氨基酸序列形成缠结二聚体的功能，所述严格条件是中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件或非常高严格条件。

[3].根据[1]或[2]所述的生物合成方法，其中，所述蛋白质前体序列中包含的在细胞内发生正交偶联反应的两对环化基元选自由以下组成中的任一种：(a)两种正交的多肽-蛋白质反应对、(b)多肽-蛋白质反应对和分离型内含肽组合、或(c)两种正交的分离型内含肽；

在上述(a)和(b)中的表达载体和表达宿主与上述(c)中的表达载体和表达宿主一致，它们之间差别在于(a)和(b)表达时需要共表达蛋白酶进行原位酶切，最终实现蛋白质异质索烃的生物合成。

具体实施差异为：1)在两种正交的偶联基元序列之间引入烟草脉斑驳病毒(Tobacco vein mottling virus，TVMV)蛋白酶的识别序列ETVRFQG；2)将构建的表达载体转入BL21(DE3)感受态细胞进行表达，对于共表达体系，BL21(DE3)感受态细胞中应该含有可以编码TVMV蛋白酶的pRK1037质粒。

在一些优选的实施方案中，所述在细胞内发生正交偶联反应的两对环化基元由(c)两种正交的分离型内含肽组成；

在一些更优选的实施方案中，所述分离型内含肽为：(1)Npu DnaE分离型内含肽，其由分离型内含肽C端部分I(IntC1)和分离型内含肽N端部分I(IntN1)组成环化基元和/或由分离型内含肽C端部分II(IntC2)和分离型内含肽N端部分II(IntN2)组成环化基元，所述IntC1、IntN1、IntC2和IntN2的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示；(2)gp41-1；(3)gp41-8；和/或(4)VidaL。

[4].根据[1]～[3]中任一所述的生物合成方法，其中，所述蛋白质前体序列中包含的目标蛋白质为由酶、抗菌蛋白、细胞因子、激素、毒素、酶抑制剂、抗体及抗体类似物、蛋白质疫苗以及免疫系统相关蛋白组成的组中的任一种或其任意组合；

在一些优选的实施方案中，所述蛋白质前体序列中包含的目标蛋白质为干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、生长因子、激素和/或酶；

在一些更优选的实施方案中，所述干扰素包括IFN-α、IFN-β、IFN-γα、IFN-λ及其亚型中的任一种；所述白细胞介素包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31和/或IL-32中的任一种；所述集落刺激因子包括粒细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、多能集落刺激因子、干细胞因子、白血病抑制因子和/或红细胞生成素中的任一种；所述生长因子包括表皮细胞生长因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子和/或神经生长因子中的任一种；所述激素包括下丘脑激素、垂体激素、胃肠激素、胰岛素和/或降钙素中的任一种；所述酶包括尿激酶、精氨酸酶、丝氨酸脱水酶、苯丙氨酸氨解酶、亮氨酸脱氢酶、青霉素酶、超氧化物歧化酶和/或门冬氨酸酶中的任一种。

[5].根据[1]～[4]中任一所述的生物合成方法，其中，所述蛋白质前体序列中包含的功能蛋白质基元为(1)长效化功能基元、(2)具有靶向特征的功能基元，或(3)与目标蛋白质具有协同作用的其它蛋白质药物；

在一些优选的实施方案中，所述长效化功能基元为白蛋白结合结构域(ABD)、弹性蛋白类多肽(ELP)、白蛋白(HSA)、血清转铁蛋白、免疫球蛋白片段、重组聚多肽XTEN、PAS、HAP或GLK中的任一种；所述具有靶向特征的功能基元为亲合体(Affibody)、纳米抗体(Nanobody)、单体结合蛋白(Monobody)、单链抗体(ScFv)、预设计锚蛋白重复蛋白(DARPin)以及其它可发生特定蛋白-蛋白相互作用的基元；所述与目标蛋白质具有协同作用的其它蛋白质药物可以与所述目标蛋白质相同或者不相同。

[6].根据[1]～[5]中任一所述的生物合成方法，其中，所述蛋白质前体序列的基本结构为：

(i-1)分离型内含肽C端部分I-第1缠结基元-目标蛋白质-分离型内含肽N端部分I-分离型内含肽C端部分II-第2缠结基元-功能蛋白质基元-分离型内含肽N端部分II；

(i-2)分离型内含肽C端部分I-第1缠结基元-功能蛋白质基元-分离型内含肽N端部分I-分离型内含肽C端部分II-第2缠结基元-目标蛋白质-分离型内含肽N端部分II；

(ii-1)分离型内含肽C端部分I-目标蛋白质-第1缠结基元-分离型内含肽N端部分I-分离型内含肽C端部分II-第2缠结基元-功能蛋白质基元-分离型内含肽N端部分II；

(ii-2)分离型内含肽C端部分I-功能蛋白质基元-第1缠结基元-分离型内含肽N端部分I-分离型内含肽C端部分II-第2缠结基元-目标蛋白质-分离型内含肽N端部分II；

(iii-1)分离型内含肽C端部分I-第1缠结基元-目标蛋白质-分离型内含肽N端部分I-分离型内含肽C端部分II-功能蛋白质基元-第2缠结基元-分离型内含肽N端部分II；

(iii-2)分离型内含肽C端部分I-第1缠结基元-功能蛋白质基元-分离型内含肽N端部分I-分离型内含肽C端部分II-目标蛋白质-第2缠结基元-分离型内含肽N端部分II；

(iv-1)分离型内含肽C端部分I-目标蛋白质-第1缠结基元-分离型内含肽N端部分I-分离型内含肽C端部分II-功能蛋白质基元-第2缠结基元-分离型内含肽N端部分II；或，

(iv-2)分离型内含肽C端部分I-功能蛋白质基元-第1缠结基元-分离型内含肽N端部分I-分离型内含肽C端部分II-目标蛋白质-第2缠结基元-分离型内含肽N端部分II。

[7].根据[1]～[6]中任一所述的生物合成方法，其中，所述蛋白质前体序列中包含的形成二聚体的缠结基元既可以在所述目标蛋白质和/或所述功能蛋白质基元的N端，也可以在所述目标蛋白质和/或所述功能蛋白质基元的C端；

在一些优选的实施方案中，步骤1)中在所述分离型内含肽C端部分I之后、所述分离型内含肽N端部分I之前，或者在所述分离型内含肽C端部分II之后、所述分离型内含肽N端部分II之前引入组氨酸标签序列；在一些更优选的实施方案中，在所述分离型内含肽C端部分II之后、所述分离型内含肽N端部分II之前引入组氨酸标签序列；

可选的，步骤1)中在第1个缠结基元之前引入烟草蚀斑病毒(Tobacco etchvirus,TEV)蛋白酶的识别序列。

[8].利用[1]～[7]中任一所述的生物合成方法制备得到的蛋白质异质索烃；在一些优选的实施方案中，所述蛋白质前体序列的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：8～10所示。

[9].一种药物组合物，其特征所述，所述药物组合物包含[8]所述的蛋白质异质索烃和药学上可接受的载体。

[10].利用[8]所述的蛋白质异质索烃或者[9]所述的药物组合物在制备预防和/或治疗疾病中药物中的用途；

在一些优选的实施方案中，所述疾病选自癌症、免疫相关疾病或感染性疾病；

在一些更优选的实施方案中，所述癌症为实体瘤，所述免疫相关疾病为自身免疫性疾病，所述感染性疾病为病毒感染疾病或细菌感染疾病；

在最优选的实施方案中，所述癌症为卵巢癌、B细胞淋巴癌；所述免疫相关疾病为系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、干燥综合征、脏器移植排斥反应、移植物抗宿主疾病、皮肌炎或多发性硬化中的任一种；所述感染性疾病为病毒感染疾病。

[11].一种蛋白质异质索烃，其特征在于，所述蛋白质异质索烃是由蛋白质前体序列对应的编码基因序列通过转录、翻译得到，其中所述蛋白质前体序列的基本结构为：

[12].根据[11]所述的蛋白质异质索烃，其中，所述第1缠结基元和/或所述第2缠结基元包含以下序列中的一种或多种：

(iii)在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：13～16中任一项所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，并且其保留如SEQ IDNO:2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：13～16中任一项所示的氨基酸序列形成缠结二聚体的功能；或者，

[13].根据[11]或[12]所述的蛋白质异质索烃，其中，所述分离型内含肽C端部分I(IntC1)、分离型内含肽N端部分I(IntN1)、分离型内含肽C端部分II(IntC2)和分离型内含肽N端部分II(IntN2)的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQID NO:7所示。

[14].根据[11]～[13]中任一所述的蛋白质异质索烃，其中，所述目标蛋白质为由酶、抗菌蛋白、细胞因子、激素、毒素、酶抑制剂、抗体及抗体类似物、蛋白质疫苗以及免疫系统相关蛋白组成的组中的任一种或其任意组合；

在一些优选的实施方案中，所述目标蛋白质为干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、生长因子、激素和/或酶；

[15].根据[11]～[14]中任一所述的蛋白质异质索烃，其中，所述功能蛋白质基元为(1)长效化功能基元，(2)具有靶向特征的功能基元；或(3)与目标蛋白质具有协同作用的其它蛋白质药物；

[16].根据[11]～[15]中任一所述的蛋白质异质索烃，其中所述蛋白质前体序列的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：8～10所示。

下文对本发明提供的技术方案作进一步的解释和说明。

本发明提供了一种基于机械偶联的蛋白质异质索烃的生物合成方法，通过合理运用蛋白质缠结基元和定点偶联策略，将蛋白质药物与能够延长所述蛋白质药物在体内半衰期的功能蛋白质基元进行异质索烃化，实现两者的机械偶联，制备了多种新型拓扑蛋白质药物。所制备的异质索烃化新型拓扑蛋白质药物能够保留蛋白质药物和功能蛋白质基元对相应受体的亲和力，并且具有明显提高的稳定性和有效延长的体内半衰期。

利用本发明提供的方法制备具有机械偶联结构特征的蛋白质药物时，需要注意以下几点：(1)适当选择可以形成缠结结构的组装基元，常用的是p53dim结构域，具体可以构建两个p53dim(X)结构域顺序串联的基因卡带，将分子间二聚转为分子内二聚，以提高异质索烃的产率。其中，所述“p53dim”代表肿瘤抑制蛋白质p53的突变型二聚体结构域，它能够指导分子链间的相互缠结；所述“X”代表可以形成二聚体的缠结基元，它是形成异质索烃的关键元素之一，进一步运用p53dim异质二聚突变体结合分子内串联表达可以获得高选择性、高产率的异质索烃合成；(2)适当选择可以在胞内发生的两种环化方式，并且两种环化方式之间应该具备一定的正交性，常用的是拆分方式不同的Npu DnaE分离型内含肽；(3)除蛋白质药物外，另一功能蛋白质基元可以选择具有长效化特征的基元，例如白蛋白结合结构域(ABD)或弹性蛋白类多肽(ELP)；(4)由于需要对蛋白质药物和功能蛋白质基元进行环化，两者的N/C端距离均会影响环化效率，最终影响异质索烃的合成效率，其中当两者的N/C端均位于同侧并且距离较近将更有利于环化。

本发明的研究包括以下几方面内容：

A.选择蛋白质药物和合适的功能蛋白质基元制备蛋白质异质索烃，设计相关的编码基因序列，引入表达载体，通过宿主细胞进行表达，再进行亲和纯化获得相应产物；

B.对蛋白质异质索烃进行基本性质表征；

C.对蛋白质异质索烃进行体内半衰期和生物活性(如抑瘤活性等)实验测试；

根据上述研究，本发明提供了如下技术方案：

一种基于机械偶联的蛋白质异质索烃的生物合成方法，包括以下步骤：

1)设计并构建制备蛋白质异质索烃的基因序列，将其命名为：IntC1-p53dim(X⁺)-POI1-IntN1-IntC2-p53dim(X^-)-POI2-IntN2，并将上述基因序列引入合适的表达载体，得到重组表达载体；

2)将步骤1)所构建的重组表达载体转入大肠杆菌(例如BL21(DE3)或Origami(DE3))感受态细胞中进行表达；

3)对步骤2)所获得的菌体进行破碎，纯化之后，即可得到相应的蛋白质异质索烃。

上述步骤1)中，典型的p53dim结构域的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，X⁺和X^-代表异质化的p53dim突变体，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，也可以应用能够形成类似二聚结构的p53dim突变体对，其氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16所示。所述突变体是指在p53dim的上述氨基酸序列基础上经过氨基酸残基的取代、缺失或添加而衍生的肽链，所述取代、缺失或添加的氨基酸残基不会影响其缠结二聚体的生成。Npu DnaE分离型内含肽的两种拆分方式所产生的IntC1、IntN1、IntC2和IntN2的氨基酸序列分别如序列表中SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。除此之外，其他满足条件的分离型内含肽(例如gp41-1，gp41-8，VidaL)也可以用于蛋白质异质索烃的生物合成。其中，所述分离型内含肽gp41-1和gp41-8包括但不限于来自J.Biol.Chem.,2012Aug 17；287(34):28686-96.doi:10.1074/jbc.M112.372680.Epub 2012Jun 28.PMID:22753413；PMCID:PMC3436554中描述的gp41-1和gp41-8；所述分离型内含肽VidaL包括但不限于来自Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2020Jun2；117(22):12041-12049.doi:10.1073/pnas.2003613117.Epub2020May 18.PMID:32424098；PMCID:PMC7275667中描述的VidaL。

上述步骤1)中，p53dim突变体既可以融合在所述目标蛋白质(即POI1)和/或所述功能蛋白质基元(即POI2)的N端，也可以融合在所述目标蛋白质(即POI1)和/或所述功能蛋白质基元(即POI2)的C端；为了便于纯化，在第二个p53dim结构域(即p53dim(X^-))前引入了组氨酸标签序列，在步骤3)通过镍柱亲和层析进行蛋白纯化。

在本发明中，将包含编码IntC1-p53dim(X⁺)-POI1-IntN1-IntC2-p53dim(X^-)-POI2-IntN2核苷酸序列的重组质粒转化到宿主细胞中，得到重组宿主细胞，通过重组宿主细胞的外源表达得到蛋白质前体，通过异质p53dim结构域的分子内二聚形成机械偶联的结构，两对分离型内含肽IntC1/IntN1和IntC2/IntN2发生顺序的反式剪接反应，介导两种目标蛋白质(即POI1和POI2)的环化并从体系中离去，最终实现蛋白质异质索烃cat-X⁺POI1-X^-POI2的制备。

下面通过一些具体的实例说明蛋白质异质索烃生物合成过程中蛋白质前体的基因序列和氨基酸序列：

(a)IntC1-p53dim(X⁺)-IFN-IntN1-IntC2-p53dim(X^-)-ABD-IntN2：从N端到C端分别为分离型内含肽C端部分IntC1、缠结基元p53dim结构域的突变体X⁺、模型蛋白质药物干扰素(Interferon，IFN)、分离型内含肽N端部分IntN1、分离型内含肽C端部分IntC2、缠结基元p53dim结构域的突变体X^-、模型长效化基元白蛋白结合结构域(Albumin BindingDomain，ABD)和分离型内含肽N端部分IntN2，其中IntC1和p53dim(X⁺)之间插入了烟草蚀斑病毒(Tobacco etch virus,TEV)蛋白酶的识别序列。IntC1-p53dim(X⁺)-IFN-IntN1-IntC2-p53dim(X^-)-ABD-IntN2所对应的氨基酸序列如列表中SEQ ID No:8所示，其中第6-40位氨基酸残基为IntC1，第46-52位氨基酸残基为TEV蛋白酶的识别序列，第55-90位氨基酸残基为p53dim(X⁺)，第93-257位氨基酸残基为IFN，第265-366位氨基酸残基为IntN1，第388-401位氨基酸残基为IntC2，第407-412位氨基酸残基为6×His标签，第415-450位氨基酸残基为p53dim(X^-)，第469-519位氨基酸残基为ABD，第527-649位氨基酸残基为IntN2。

(b)IntC1-p53dim(X⁺)-IFN-IntN1-IntC2-p53dim(X^-)-ELP-IntN2：从N端到C端分别为分离型内含肽C端部分IntC1、缠结基元p53dim结构域的突变体X⁺、模型蛋白质药物干扰素(Interferon，IFN)、分离型内含肽N端部分IntN1、分离型内含肽C端部分IntC2、缠结基元p53dim结构域的突变体X^-、模型长效化基元弹性蛋白类多肽(Elastin-likepolypeptide，ELP)和分离型内含肽N端部分IntN2，其中IntC1和p53dim(X⁺)之间插入了TEV蛋白酶的识别序列。IntC1-p53dim(X⁺)-IFN-IntN1-IntC2-p53dim(X^-)-ELP-IntN2所对应的氨基酸序列如列表中SEQ ID No:9所示，其中第6-40位氨基酸残基为IntC1，第46-52位氨基酸残基为TEV蛋白酶的识别序列，第55-90位氨基酸残基为p53dim(X⁺)，第93-257位氨基酸残基为IFN，第265-366位氨基酸残基为IntN1，第388-401位氨基酸残基为IntC2，第407-412位氨基酸残基为6×His标签，第415-450位氨基酸残基为p53dim(X^-)，第468-542位氨基酸残基为ELP，第557-679位氨基酸残基为IntN2。

(c)IntC1-p53dim(X⁺)-IL-2-IntN1-IntC2-p53dim(X^-)-ABD-IntN2：从N端到C端分别为分离型内含肽C端部分IntC1、缠结基元p53dim结构域的突变体X⁺、模型蛋白质药物白介素2(Interleukin-2，IL-2)、分离型内含肽N端部分IntN1、分离型内含肽C端部分IntC2、缠结基元p53dim结构域的突变体X^-、模型长效化基元ABD和分离型内含肽N端部分IntN2，其中IntC1和p53dim(X⁺)之间插入了TEV蛋白酶的识别序列。IntC1-p53dim(X⁺)-IL-2-IntN1-IntC2-p53dim(X^-)-ABD-IntN2所对应的氨基酸序列如列表中SEQ ID No:10所示，其中第6-40位氨基酸残基为IntC1，第46-52位氨基酸残基为TEV蛋白酶的识别序列，第55-90位氨基酸残基为p53dim(X⁺)，第93-225位氨基酸残基为IL-2，第233-334位氨基酸残基为IntN1，第356-369位氨基酸残基为IntC2，第375-380位氨基酸残基为6×His标签，第383-418位氨基酸残基为p53dim(X^-)，第437-487位氨基酸残基为ABD，第495-617位氨基酸残基为IntN2。

本发明利用常规的表征手段，如十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)、超高效液相色谱-质谱(LC-MS)、尺寸排阻色谱(SEC)、TEV酶解反应、热漂移和抗热聚集实验以及圆二色谱对所制备的蛋白质异质索烃进行基本表征以及拓扑结构证明。进一步利用表面等离子共振技术或生物膜干涉技术探究蛋白质异质索烃对相应受体的亲和力；利用细胞增殖抑制实验测试相应的体外活性；通过不同时刻血药浓度测定体内半衰期；建立小鼠模型评估体内的抑瘤效果。

上文所述SEQ ID NO：1～10的氨基酸序列和本发明中实施例3中构建的线型和环状的IFN-ABD融合蛋白质(分别为SEQ ID NO：11～12)的氨基酸序列以及能够形成类似二聚结构的p53dim突变体的氨基酸序列SEQ ID NO：13～16如下表1所示：

表1

其中，表1中的SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15属于带正电荷的异质化的p53dim突变体，SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16属于带负电荷的异质化的p53dim突变体。所述SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：3之间、所述SEQ ID NO：13与SEQ ID NO：14之间以及所述SEQ ID NO：15与SEQ ID NO：16之间可发生异质二聚。

编码表1中SEQ ID NO：1～16所示氨基酸的核苷酸序列SEQ ID NO:17～32如表2所示：

表2

发明定义

本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术的改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。为了本发明的目的，下文定义了以下术语。

术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大于5％的上限的范围内的数字数值。

术语“和/或”当用于连接两个或多个可选项时，应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或多项。

如本文中所用，术语“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。

术语“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。

术语“以上”或“以下”表示的数值范围是指包含本数的数值范围。

术语“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。

术语“任选”或“任选的”表示某些物质、组分、执行步骤、施加条件等因素使用或者不使用。

本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

根据本发明，术语“蛋白质药物”指具有治疗作用的蛋白质，包括抗体、抗体类似物、细胞因子、激素、毒素、酶、酶抑制剂以及免疫系统相关蛋白等；

根据本发明，术语“目标蛋白质”指进行工程化改性的蛋白质；在本发明的一些具体实施方式中，使用“POI1”代表目标蛋白质；

根据本发明，术语“功能蛋白质基元”指具有特定功能(如与特定靶点结合、催化某种反应、延长体内循环时间等)的蛋白质序列；在本发明的一些具体实施方式中，使用“POI2”代表功能蛋白质基元；

典型的“功能蛋白质基元”包括可有效延长蛋白质药物在体内循环半衰期的“长效化功能基元”。在另外一些实施方式中，“功能蛋白质基元”还可以包括“具有靶向特征的功能基元”或“与目标蛋白质具有协同作用的其它蛋白质药物”。

根据本发明，术语“长效化功能基元”指能够延长蛋白质在体内循环时间的基元序列。在一些具体的实施方案中，所述长效化功能基元选自由白蛋白结合结构域(ABD)、弹性蛋白类多肽(ELP)、白蛋白(HSA)、血清转铁蛋白、免疫球蛋白片段、重组聚多肽XTEN、PAS、HAP或GLK中的任一种。所述重组聚多肽XTEN包含使用大肠杆菌表达的具有丙氨酸(A)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)的氨基酸序列库；所述PAS中的P、A和S分别代表Porline、Alanine和Serine，其是由100-200个重复序列组成的非结构化肽聚合物；所述HAP富含甘氨酸，由(Gly₄Ser)_n多肽组成，包含100-200个重复序列；所述GLK为明胶样蛋白(GLK，Gelatin-like protein)。

根据本发明，术语“具有靶向特征的功能基元”指能够与靶标分子(如目标蛋白质)发生特异性结合的基元序列。在一些具体的实施方案中，所述具有靶向特征的功能基元为亲合体(Affibody)、纳米抗体(Nanobody)、单体结合蛋白(Monobody)、单链抗体(ScFv)、预设计锚蛋白重复蛋白(DARPin)以及其它可发生特定蛋白-蛋白相互作用的基元。

根据本发明，术语“蛋白质异质索烃”或“异质索烃化蛋白质”指由不同组成的环状蛋白质之间彼此机械偶联形成的蛋白质偶联物；

根据本发明，术语“机械偶联”指两个或多个独立组分之间通过空间上的缠结作用形成不可分离的整体。

根据本发明，术语“拓扑蛋白质药物”指具有特殊化学拓扑结构(通常为非线型结构)的蛋白质药物。

根据本发明，术语“内含肽”(intein)是指位于宿主蛋白质中的一段插入序列，内含肽对应的核苷酸序列嵌合在宿主蛋白质对应的核酸序列之中，与宿主蛋白质基因存在于同一开放阅读框架(open reading frame，ORF)内，并与宿主蛋白质基因进行同步转录和翻译，当翻译形成蛋白质前体后，内含肽从宿主蛋白质中切除，从而形成成熟的具有活性的蛋白。根据其存在形式，分为整体内含肽和分离型内含肽。前者的两个剪接区域共同存在于同一多肽片段上，后者的两个剪接区域分裂成两份或者更多片段，存在于不同的多肽片段上，所以成为分离型内含肽。整体内含肽进行顺式剪接作用，分离型内含肽进行反式剪接作用。

在制备重组蛋白的技术中，可以通过将表达前体蛋白质的基因分裂在两个开放阅读框中，利用包括N端蛋白质剪接区域(N’fragment of intein，简称IntN)和C端蛋白质剪接区域(C’fragment of intein，简称IntC)两部分的分离型内含肽(split intein)催化蛋白质反式剪接反应进行，从而将构成所述前体蛋白质的两个分离的外显肽(En、Ec)以肽键连接，得到重组蛋白(Ozawa.T.，Nat Biotechbol.21(2003)287-93)。

在一些具体的实施方式中，所述分离型内含肽为Npu DnaE分离型内含肽，其由分离型内含肽C端部分1(IntC1)和分离型内含肽N端部分1(IntN1)组成环化基元和/或由分离型内含肽C端部分2(IntC2)和分离型内含肽N端部分2(IntN2)组成环化基元，所述IntC1、IntN1、IntC2和IntN2的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQID NO:7所示。

根据本发明，所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.Biol.Chem，243，p3558(1968)中所述。

根据本发明，术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)和NS0细胞。

根据本发明，氨基酸“添加”指在氨基酸序列的C端或N端添加氨基酸。根据本发明，氨基酸“缺失”指可以从氨基酸序列中删除1、2或3个以上氨基酸。根据本发明，氨基酸“插入”指在氨基酸序列中的适当位置插入氨基酸残基，插入的氨基酸残基也可以全部或部分彼此相邻，或插入的氨基酸之间都不彼此相邻。

根据本发明，氨基酸“取代”指在氨基酸序列中的某个位置的某个氨基酸残基被其他氨基酸残基替代；其中，“取代”可以是保守氨基酸取代。

根据本发明，“保守修饰”、“保守取代”或“保守置换”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。示例性保守取代于下表“示例性氨基酸保守取代”中陈述。

示例性氨基酸保守取代

原始残基	保守取代
		Ala(A)	Gly；Ser
Arg(R)	Lys；His
		Asn(N)	Gln；His；Asp
Asp(D)	Glu；Asn
		Cys(C)	Ser；Ala；Val
Gln(Q)	Asn；Glu
		Glu(E)	Asp；Gln
Gly(G)	Ala
		His(H)	Asn；Gln
Ile(I)	Leu；Val
		Leu(L)	Ile；Val
Lys(K)	Arg；His
		Met(M)	Leu；Ile；Tyr
Phe(F)	Tyr；Met；Leu
		Pro(P)	Ala
Ser(S)	Thr
		Thr(T)	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe
		Tyr(Y)	Trp；Phe
Val(V)	Ile；Leu

根据本发明，“中等至非常高等严格条件”包括“中等严格条件”，“中-高严格条件”，“高严格条件”或“非常高严格条件”，其描述了核酸杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指导参见Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6，其通过引用并入本文。在该文献中描述了含水的和非含水的方法，且可以使用任一种。例如，具体的杂交条件如下：(1)低严格性杂交条件在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，在约45℃，然后在至少50℃，在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤2次(对于低严格性条件，可以将洗涤温度升高到55℃)；(2)中等严格性杂交条件在6×SSC，在约45℃，然后在60℃，在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤1次或多次；(3)高严格性杂交条件在6×SSC，在约45℃，然后在65℃，在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤1次或多次且优选；(4)非常高的严格性杂交条件是0.5M磷酸钠，7％SDS，在65℃，然后在65℃，在0.2×SSC，1％SDS中洗涤1次或多次。

根据本发明，“同源性”或“同一性”可相互替换，它们是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源；如果两个序列中的100个位置有95个匹配或同源，那么两个序列为95％同源。通常，当比对两个序列时进行比较以给出最大百分比同源性。例如，可以通过BLAST算法执行比较，其中选择算法的参数以在各个参考序列的整个长度上给出各个序列之间的最大匹配。以下参考文献涉及经常用于序列分析的BLAST算法：BLAST算法(BLAST ALGORITHMS):Altschul，S.F.等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410；Gish，W.等人，(1993)Nature Genet.3:266-272；Madden，T.L.等人，(1996)Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul，S.F.等人，(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402；Zhang，J.等人，(1997)Genome Res.7:649-656。其他如NCBI BLAST提供的常规BLAST算法也为本领域技术人员所熟知。

根据本发明，术语“标签”是指这样的短肽，其与目的蛋白质融合或连接，并由此促进重组蛋白的可溶性表达、检测和/或纯化。标签可融合或连接至目的蛋白的N端和/或C端或蛋白质前体序列中其他特定位置。此类标签是本领域技术人员熟知的，并且已在现有技术文献中进行了详细描述。

根据本发明，术语“载体”是指，可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸所编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体、柯斯质粒等等。

根据本发明，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。因此，单词“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。

根据本发明，术语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如，润滑剂、滑石粉、硬脂酸镁、钙或锌或硬脂酸)或溶剂包封材料，涉及将化合物从身体的一个部位(例如，递送部位)运送或运输到另一个部位(例如，器官、组织或身体的一部分)。药学上可接受的载体是“可接受的”，意思是与制剂的其他成分相容并且对受试者的组织无害(例如，生理学相容的、无菌的、生理学的pH等)。可以充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；(4)粉末黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石粉；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯，聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)增量剂(bulking agent)，如多肽和氨基酸(23)血清成分，如血清白蛋白、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)和低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)；(22)C2-C12醇，如乙醇；和(23)药物制剂中采用的其他无毒相容物质。润湿剂、着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于制剂中。诸如“赋形剂”、“药学上可接受的载体”等术语在本文中可互换使用。

发明的效果

由本发明的技术方案可见，本发明的技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

(1)本发明基于蛋白质异质索烃的生物合成体系，向两个机械偶联的环状组分中分别引入蛋白质药物和功能蛋白质基元，构建了具有机械偶联结构的新型拓扑蛋白质药物。

(2)通过使用p53dim结构域的异质突变二聚体(或具有类似功能的异质缠结二聚体)，能够得到高选择性的蛋白质异质索烃的合成。

(3)本发明提供的基于机械偶联的蛋白质药物的生物合成方法不影响蛋白质基元的结构并且能有效保持所述蛋白质药物和功能蛋白质基元对相应受体的亲和力。

(4)通过机械偶联实现蛋白质药物与功能蛋白质基元(例如长效化蛋白质基元)的偶联，所制备的异质索烃化蛋白质药物(又称为“蛋白质异质索烃”)可集成两者的功效，实现蛋白质药物的药效提升。同时，由于机械偶联以及环化结构的构象限制效应，还可以进一步提高蛋白质药物的稳定性和药效。

为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并以相应的野生型蛋白质作为对照，特别地结合线型融合蛋白质以及环状融合蛋白质作为进一步对照，配合说明书附图，作详细说明如下：

附图说明

图1中的(a)显示了本发明实现蛋白质异质索烃合成的示意图，图1中的(b)显示了构建相应线型和环状的融合蛋白质的示意图。

图2中的(a)显示了实施例4中野生型IFN(wt-IFN)、cat-IFN-ABD及其线型和环状对照的SDS-PAGE表征结果，图2中的(b)显示了cat-IFN-ELP和cat-IL-2-ABD的SDS-PAGE表征结果。

图3中的(a)显示了实施例4中野生型IFN(wt-IFN)、cat-IFN-ABD及其线型和环状对照的LC-MS表征结果，图3中的(b)显示了cat-IFN-ELP(b)以及cat-IL-2-ABD(c)的LC-MS表征结果。

图4中的(a)和(b)分别显示了实施例5中cat-IFN-ABD及其环状对照(c-IFN-ABD)的TEV蛋白酶酶切表征结果。

图5显示了实施例6中野生型IFN(wt-IFN)、cat-IFN-ABD及其线型对照(l-IFN-ABD)和环状对照(c-IFN-ABD)由热漂移实验测得的T_m值。

图6显示了实施例6中野生型IFN(wt-IFN)、cat-IFN-ABD及其线型对照(l-IFN-ABD)和环状对照(c-IFN-ABD)抗热聚集实验的SDS-PAGE表征结果。

图7显示了实施例7中野生型IFN(wt-IFN)、cat-IFN-ABD及其线型对照(l-IFN-ABD)和环状对照(c-IFN-ABD)的圆二色谱表征结果。

图8显示了实施例8中野生型IFN(wt-IFN)、cat-IFN-ABD及其线型对照(l-IFN-ABD)和环状对照(c-IFN-ABD)与受体IFNAR2的表面等离子共振表征结果。

图9显示了实施例8中cat-IFN-ABD及其线型对照(l-IFN-ABD)和环状对照(c-IFN-ABD)与受体HSA的表面等离子共振表征结果。

图10显示了实施例9中野生型IFN(wt-IFN)、cat-IFN-ABD及其线型对照(l-IFN-ABD)和环状对照(c-IFN-ABD)的体外活性测试结果。

图11显示了实施例10中野生型IFN(wt-IFN)、cat-IFN-ABD及其线型对照(l-IFN-ABD)和环状对照(c-IFN-ABD)的体内半衰期测试结果。

图12为实施例11中野生型IFN(wt-IFN)、cat-IFN-ABD及其线型对照(l-IFN-ABD)和环状对照(c-IFN-ABD)的体内抗肿瘤测试结果：图12中的(a)示出了各组的肿瘤生长曲线，图12中的(b)示出了各组的最终肿瘤重量，图12中的(c)示出了各组的小鼠体重对时间变化的曲线。

图13为实施例12中野生型IFN(wt-IFN)和cat-IFN-ELP的体内半衰期测试结果。

图14为实施例13中cat-IL-2-ABD与受体IL-2Rα、IL-2Rβ的BLI亲和力测试结果。

图15为实施例14中野生型IL-2(wt-IL-2)和cat-IL-2-ABD的体内半衰期测试结果。

具体实施方式

本发明所列举的具体实施例只作为本发明的范例，本发明并不限制于下文所描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对下文所述的实施例进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

本发明实施例中所使用的试验材料、试验试剂和仪器均可市购获得。

构建具有机械偶联结构的长效化蛋白质药物的蛋白质前体及生物合成纯化的具体步骤包括：

利用重组基因工程技术构建含有6×His标签(用于蛋白质纯化)、p53dim异质二聚结构域(X⁺和X^-)、正交分离型内含肽反应对IntC1/IntN1和IntC2/IntN2以及两种目标蛋白质(即“蛋白质药物”和“功能蛋白质基元”，分别命名为POI1和POI2)的基因序列，即IntC1-p53dim(X⁺)-POI1-IntN1-IntC2-p53dim(X^-)-POI2-IntN2。其中POI1和POI2分别为IFN/ABD，IFN/ELP和IL-2/ABD，将上述三种不同的基因序列(即表2中所示IntC1-p53dim(X⁺)-IFN-IntN1-IntC2-p53dim(X^-)-ABD-IntN2、IntC1-p53dim(X⁺)-IFN-IntN1-IntC2-p53dim(X^-)-ELP-IntN2和IntC1-p53dim(X⁺)-IL-2-IntN1-IntC2-p53dim(X^-)-ABD-IntN2的核苷酸序列SEQ ID NO：24～26)分别插入表达载体pMSCG19(Protein Expr Purif.2006 Jun；47(2):446-454)中，并转入大肠杆菌BL21(DE3)或Origami(DE3)感受态细胞进行表达。在表达过程中，通过原位组装和正交分离型内含肽反应对介导的环化反应，实现cat-IFN-ABD、cat-IFN-ELP和cat-IL-2-ABD的生物合成。通过镍柱亲和层析、尺寸排阻色谱等蛋白提纯方法获得相应的蛋白质异质索烃。

实施例1：异质索烃化蛋白质的生物合成

将IntC1-p53dim(X⁺)-IFN-IntN1-IntC2-p53dim(X^-)-ABD-IntN2、IntC1-p53dim(X⁺)-IFN-IntN1-IntC2-p53dim(X^-)-ELP-IntN2和IntC1-p53dim(X⁺)-IL-2-IntN1-IntC2-p53dim(X^-)-ABD-IntN2的基因片段分别插入表达载体pMCSG19中，所述基因片段编码的氨基酸序列分别如表1中SEQ ID No:8、SEQ ID No:9和SEQ ID No:10所示。所得3种构建体经测序确认后，将含有IFN的两种构建体转入BL21(DE3)感受态细胞中，利用含有100μg/mL氨苄青霉素钠的2×YT平板在37℃温度下进行过夜培养。将含有编码序列IntC1-p53dim(X⁺)-IL-2-IntN1-IntC2-p53dim(X^-)-ABD-IntN2的重组载体转入Origami(DE3)感受态细胞中进行相应培养。随后挑出单克隆菌落，接种至5mL含有相同抗性的2×YT培养基中，在37℃震荡培养10～12小时制备种子菌液。将该种子菌液按1:100比例接种到300mL含有相同抗性的2×YT培养基中，在37℃震荡培养至OD₆₀₀在0.5～0.7之间，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mM，转至16℃表达15～20小时。

图1中的(a)示出了本发明制备异质索烃化蛋白质的示意图。

实施例2：异质索烃化蛋白质的纯化

实施例1中所述蛋白质表达结束后，用高速冷冻离心机离心收集菌体(5000g×15min)，弃去上清液。将菌体用约30mL裂解缓冲液A(50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，10mM咪唑，pH 8.0)重悬。重悬液在冰水浴条件下用超声波细胞破碎仪超声破碎，随后离心收集上清液(12000g×30min)。取上清液与Ni-NTA树脂混合均匀并在4℃孵育1h。将该混合液倒入纯化用PD-10重力空柱(Bio-rad)中，待裂解缓冲液A流尽后，用5-10倍树脂体积的洗涤缓冲液B(50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，20mM咪唑，pH 8.0)冲洗树脂以减少非特异性吸附。随后用洗脱缓冲液C(50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，250mM咪唑，pH 8.0)进行洗脱。

蛋白质洗脱液利用快速纯化液相色谱系统(

pure，GE Healthcare)和尺寸排阻色谱柱(Superdex 200 increase 10/300GL，GE Healthcare)进行进一步纯化，流动相为经过0.22μm滤膜过滤的磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)，流速为0.5mL/min，通过280nm的紫外吸收监测蛋白质的流出峰，收集样品进行表征。

利用上述方法对实施例1中所述异质索烃化蛋白质进行纯化，将通过本实施例纯化得到的3种异质索烃化蛋白质分别命名为cat-IFN-ABD、cat-IFN-ELP和cat-IL-2-ABD。

实施例3：构建线型和环状的IFN-ABD融合蛋白质对照

为体现本发明制备和纯化的异质索烃化蛋白质的特征优势，本发明人通过简单融合构建了线型的IFN-ABD融合蛋白质对照，其氨基酸序列如表1中SEQ ID No:11所示，将相应的基因片段IFN-linker1-ABD插入表达载体pET21a中；同时构建了环状的IFN-ABD融合蛋白质对照，其氨基酸序列如列表中SEQ ID No:12所示，将相应的基因片段IntC1-IFN-linker2-ABD-IntN1插入表达载体pET15b中，借助分离型内含肽IntC1/IntN1介导环化反应并最终从体系中离去的特性获得IFN-ABD的环化构建体。图1中的(b)示出了分别构建线型和环状融合蛋白质的示意图。

所得构建经测序确认后，转入BL21(DE3)感受态细胞中，其表达和纯化方式与实施例1和实施例2相同。将纯化后的线型和环状的IFN-ABD融合蛋白质分别命名为l-IFN-ABD和c-IFN-ABD。相关的性质表征与实施例4-实施例11相同。

实施例4：异质索烃化蛋白质的SDS-PAGE和LC-MS表征

对于实施例2中纯化得到的异质索烃化蛋白质，首先加入5×SDS上样缓冲液(250mM Tris，50％甘油，10％SDS，250mMβ-巯基乙醇，0.05％溴酚蓝)至终浓度为1×，并于98℃加热10min后，进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表征。

将SEC纯化后的蛋白质样品用超滤管置换至ddH₂O中后，利用高效液相色谱-电喷雾质谱(LC-MS)对其分子量进行表征。cat-IFN-ABD、cat-IFN-ELP和cat-IL-2-ABD的SDS-PAGE表征如图2所示，具体参见图2的(a)中所示cat-IFN-ABD的SDS-PAGE电泳结果和图2的(b)中所示cat-IFN-ELP和cat-IL-2-ABD的SDS-PAGE电泳结果。图2的(a)中同时示出了实施例3中所述l-IFN-ABD、c-IFN-ABD以及野生型IFN(wt-IFN)的SDS-PAGE电泳结果。

LC-MS表征如图3所示，具体参见图3的(a)中所示cat-IFN-ABD的LC-MS表征结果和图3的(b)、(c)中所示cat-IFN-ELP和cat-IL-2-ABD的LC-MS表征结果。图3的(a)中同时示出了实施例3中所述l-IFN-ABD、c-IFN-ABD的LC-MS表征结果。

根据图2和图3所示的结果，可以看出对所制备蛋白质进行分子量表征的实验数据与理论计算数据基本吻合。

实施例5：cat-IFN-ABD的TEV酶切表征

通过超微量分光光度计(NanoPhotometer P330,Implen,Inc.)测定蛋白质的浓度。为了进行异质索烃的拓扑结构证明，将实施例2制备的SEC纯化的cat-IFN-ABD蛋白质溶液(10μM)与10μM TEV蛋白酶以20:1的摩尔比混合，在37℃条件下进行酶切(酶切时间分别设置为1、3、6、9小时)。酶切结束后，取10μL酶切液加入5×SDS上样缓冲液，并于98℃条件下加热10min终止反应，利用SDS-PAGE表征酶切之后的产物组成。cat-IFN-ABD酶切前后的SDS-PAGE表征如图4中的(a)所示，泳道1为蛋白质Marker，泳道2为未酶切的阴性对照，泳道3-6分别对应酶切1、3、6、9小时的酶切液，从中可以看出酶切后生成了分子量较小的两条条带，其表观分子量与线型l-X⁺IFN和环状c-X^-ABD相符，表明拓扑结构的正确性。

参考上文所述的方法，对实施例3制备的c-IFN-ABD进行TEV酶切表征。图4中的(b)示出了酶切的结果，泳道1为蛋白质Marker，泳道2为未酶切的阴性对照，泳道3-6分别对应酶切1、3、6、9小时的酶切液，从中可以看出酶切后生成了表观分子量更大的一条条带，对应拓扑结构由环状转变为线型结构，表明拓扑结构的正确性。

实施例6：cat-IFN-ABD的热稳定性测试

通过热漂移试验(Thermal Shift Assay)测试蛋白质的熔融温度(T_m值)，其原理为隐藏在蛋白质折叠结构内部的疏水区，会由于温度升高导致的结构解散而被暴露出来，与荧光染料Sypro Orange结合而使体系荧光增强。

将实施例2制备的SEC纯化后的cat-IFN-ABD蛋白质样品用PBS缓冲液稀释至5～10μM，取45μL稀释液与5μL 20×SYPRO Orange Protein Gel Stain(Sigma-Aldrich)混匀。将混合液加入八连排管(AXYGEN)中，设置5～6个复孔，置于罗氏荧光定量PCR仪，以2.2℃/min的速度从37℃升温至98℃并稳定3min，利用yellow 555通道检测荧光强度随温度的变化。荧光信号曲线以及荧光信号对温度的一阶导数曲线由

96获得，T_m值为一阶导数曲线中最小值所对应的温度。图5中示出了野生型IFN(wt-IFN)和cat-IFN-ABD样品的T_m值，两者相当，均为55.4℃。图5中同时还示出了实施例3中所述l-IFN-ABD、c-IFN-ABD的T_m值，分别为54.0℃和56.1℃，相较于野生型IFN变化不大。以上结果表明融合表达和拓扑结构改造并未影响蛋白质药物IFN的有效折叠。

为了更全面地评估热稳定性的差异，对融合蛋白质进行抗热聚集能力测试。热聚集现象是指随着温度的升高，氢键作用被破坏，导致蛋白质解折叠暴露出内部的疏水氨基酸，这些解散的多肽链倾向于聚集，无法有效复性而丧失活性。将实施例2中制备的经过SEC纯化后的cat-IFN-ABD蛋白质样品稀释至10μM，分装成20μL/管，分别在37℃、45℃、55℃、65℃、75℃、85℃孵育60min，然后在15000g离心20min(4℃)。取10μL上清液制样进行SDS-PAGE分析。对照样品(Control)放置于4℃保存，未进行高温孵育。

参照上述操作，对野生型IFN(wt-IFN)和实施例3中所述l-IFN-ABD、c-IFN-ABD进行同样的抗热聚集能力测试并作SDS-PAGE分析。

如图6所示，l-IFN-ABD与wt-IFN类似，在55℃孵育后仅剩极少一部分可溶，在更高的温度下则完全沉淀，c-IFN-ABD则在55～85℃范围内均能保持极少一部分可溶，而异质索烃cat-IFN-ABD即使在85℃孵育后仍能保持相当一部分可溶。由该对比结果可知，异质索烃cat-IFN-ABD抗热聚集能力的明显提升与其独特的拓扑结构密切相关。相比于环状对照，异质索烃化分别对IFN和ABD两个结构域进行环化，并保持两者之间的机械偶联，能有效保持分子内以及分子间的结构域独立，从而提高整体的抗热聚集能力。

实施例7：cat-IFN-ABD的圆二色谱测试

将实施例2中制备的经过SEC纯化得到的cat-IFN-ABD蛋白质样品用ddH₂O稀释至约0.04mg/mL后，取2mL加入到10mm光程的石英比色池中，室温扫描样品在190～250nm范围内的椭偏率，步长为1nm，采集时间为1s/点。在相同的试验条件下，对野生型IFN(wt-IFN)和实施例3中所述l-IFN-ABD、c-IFN-ABD也进行圆二色谱测试。

如图7所示，由于wt-IFN具有的α螺旋束结构，其在209nm和222nm处具有较强的负峰，l-IFN-ABD、c-IFN-ABD以及异质索烃化的cat-IFN-ABD融合蛋白质也均表现出典型的α螺旋的结构特征，且其信号强度与wt-IFN基本一致。由于ABD的三级结构也是α-螺旋束，该结果表明这三种融合蛋白质中IFN和ABD的二级结构均能很好地保持。

实施例8：cat-IFN-ABD的表面等离子共振测试

利用表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)测试IFN和ABD对相应受体IFNAR2和HSA的亲和力：

IFN-IFNAR2的SPR测试方法：将购买的干扰素受体IFNAR2干粉(Sino Biological)溶于超纯水配成0.5mg/mL的浓储液，再利用醋酸钠缓冲液(10mM,pH 4.5)稀释成50μg/mL的工作液。IFN对IFNAR2的亲和力测试在Biacore 8K分子间相互作用分析系统上进行。所用缓冲液为HBS-P+缓冲液(10mM HEPES,150mM NaCl,0.05％v/v P20,pH 7.4)，测试所用芯片为八通道的CM5芯片(GE Healthcare)，利用EDC/NHS活化后通入受体蛋白IFNAR2的工作液进行锚定，锚定量控制在500～800RU。锚定结束后利用乙醇胺(1M,pH 8.5)进行封闭。将纯化后的蛋白质样品利用HBS-P+缓冲液稀释成一系列不同浓度的分析液(分别为20.0nM、10.0nM、5.00nM、2.50nM、1.25nM、0.625nM和0.312nM)。分析液以30μL/min的流速进样120s后，连续通入HBS-P+缓冲液解离360s。再生缓冲液为甘氨酸-盐酸缓冲液(10mM,pH 3.0)，再生时间为15s，稳定100s后再次进样，依次由低到高测试不同浓度的分析液。各样品的平衡解离常数K_D利用软件BIA evaluation software基于1-1结合模型进行拟合。

ABD-HSA的SPR测试方法：称取人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)干粉(Solarbio)溶于PBS缓冲液配成1～2mg/mL的HSA浓储液，再利用醋酸钠缓冲液(10mM,pH4.5)稀释成10μg/mL的工作液。ABD对HSA的亲和力测试在Biacore 8K分子间相互作用分析系统上进行。所用缓冲液为HBS-P+缓冲液(10mM HEPES,150mM NaCl,0.05％v/v P20,pH7.4)，测试所用芯片为八通道的CM5芯片，利用EDC/NHS活化后通入受体蛋白HSA的工作液进行锚定，锚定量控制在500～800RU。锚定结束后利用乙醇胺(1M,pH 8.5)进行封闭。将纯化得到的蛋白质样品利用HBS-P+缓冲液稀释成一系列不同浓度的分析液(分别为300nM、100nM、33.3nM、11.1nM、和3.70nM)。分析液以50μL/min的流速进样240s后，连续通入HBS-P+缓冲液解离3600s。再生缓冲液为甘氨酸-盐酸缓冲液(10mM,pH 1.5)，再生时间为15s，稳定100s后再次进样，依次由低到高测试不同浓度的分析液。各样品的平衡解离常数K_D利用软件BIA evaluation software基于1-1结合模型进行拟合。

SPR亲和试验的具体测试图谱如图8和9所示，由测试图谱计算所得结合速率常数k_a、解离速率常数k_d和平衡速率常数K_D的具体数据如表3和表4所示。具体来说，表3的实验结果显示，wt-IFN对IFNAR2的平衡速率常数K_D为1.79nM，l-IFN-ABD，c-IFN-ABD以及cat-IFN-ABD对IFNAR2的K_D值分别为2.03nM、9.16nM和8.40nM，与wt-IFN相比K_D值的变化范围在6倍以内，表明在这三种IFN-ABD融合蛋白质中，环状和索烃拓扑结构的形成并未明显影响干扰素的结合活性。表4的实验结果则显示l-IFN-ABD，c-IFN-ABD以及cat-IFN-ABD对HSA的平衡速率常数K_D分别为1.12nM、1.00nM和0.60nM，变化在2倍以内，表明在这三种IFN-ABD融合蛋白质中，环状或索烃拓扑结构的形成并未明显影响ABD对HSA的结合活性。这些结果充分证明异质索烃化并不会明显影响两个环化蛋白质基元对相应受体的亲和力。

表3野生型IFN、cat-IFN-ABD及其线型和环状对照对IFNAR2的SPR亲和力测试结果

表4cat-IFN-ABD及其线型和环状对照对HSA的SPR亲和力测试结果

实施例9：cat-IFN-ABD的体外活性测试

采用对IFNα敏感的人B淋巴瘤细胞系Daudi(来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)作为实验细胞系，检测cat-IFN-ABD的体外抗肿瘤活性。

具体实验步骤为：以5000个细胞/孔的浓度铺板至96孔板中，将测试样品(包括实施例2中制备的经过SEC纯化得到的cat-IFN-ABD、实施例3中制备的l-IFN-ABD、c-IFN-ABD和野生型IFN)稀释至合适梯度加入到铺有细胞的96孔板中，每个浓度设置6个复孔。在二氧化碳培养箱中37℃培养72小时之后，利用Cell

Viability Assay检测细胞活力，在酶标仪上读取相应数据，通过GraphPad Prism软件计算半数抑制浓度IC50。

实验结果如图10所示，wt-IFN、l-IFN-ABD、c-IFN-ABD和cat-IFN-ABD的半数抑制浓度分别为47、65、69和56pg/mL，三种融合蛋白质均表现出很好的活性保留，说明融合ABD以及拓扑结构改造并没有明显影响IFN的体外抑瘤活性。

实施例10：cat-IFN-ABD的体内半衰期测试

将雌性SD大鼠(约250g)随机分组，每组3只，通过尾静脉分别注射0.2mg/kg(均以干扰素质量计算)的待测样品(包括实施例2中制备的经过SEC纯化得到的cat-IFN-ABD、实施例3中制备的l-IFN-ABD、c-IFN-ABD和野生型IFN)。在注射后15min、30min，1h、3h、6h、9h、12h、24h、48h和72h分别取血100～200μL存于抗凝管(4℃)。血液在4000g离心15min后，收集血清，分装冻存于-80℃。待血样收集完毕，利用Human IFN-αELISA Platinum Kit(eBioscience)测定不同时间点时血清中的干扰素浓度，通过GraphPad Prism软件计算半衰期。

试验结果：蛋白质样品在血清中的浓度变化曲线如图11所示，IFN-ABD融合蛋白质的体内循环半衰期远高于wt-IFN(t_1/2＝1.9h)。线型对照l-IFN-ABD可以借助于ABD对HSA的亲和作用提高IFN的体内循环半衰期(t_1/2＝6.9h)，环状对照c-IFN-ABD的体内循环时间(t_1/2＝9.2h)稍长于线型对照，而具有异质索烃结构的cat-IFN-ABD延长干扰素体内循环时间的效果最为显著，其体内循环半衰期长达11.8h。综合上述结果，相较于线型和环状融合蛋白质，cat-IFN-ABD不仅能够提高干扰素的稳定性，保留干扰素的高活性，同时还可以大大延长干扰素在体内的循环时间。

实施例11：cat-IFN-ABD的体内抗肿瘤测试

本实施例中，以人卵巢癌肿瘤细胞SKOV3(来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)作为研究的肿瘤细胞系，利用雌性BALB/c裸鼠(6周龄)构建肿瘤模型。在裸鼠腋下部位注射100μL含有10⁶个SKOV3细胞的1×PBS，当肿瘤体积生长至约100mm³时，将小鼠随机分组，每组6只，开始给药(各给药组包括：实施例2中制备的经过SEC纯化得到的cat-IFN-ABD、实施例3中制备的l-IFN-ABD、c-IFN-ABD、野生型IFN和PBS)。通过尾静脉分别注射，给药剂量为1.0mg IFN/kg，每隔四天给药一次，共给药6次。每隔2-4天记录一次体重和肿瘤体积。肿瘤体积计算方法为V＝L*W²/2。

试验结果：图12中的(a)示出了PBS、野生型IFN(wt-IFN)、l-IFN-ABD、c-IFN-ABD和cat-IFN-ABD在体内抗肿瘤测试中的肿瘤生长曲线，从中可以看出cat-IFN-ABD抑制肿瘤生长的效果最为显著；图12中的(b)为各给药组最终小鼠肿瘤质量，第24天时，PBS空白对照组以及wt-IFN、l-IFN-ABD和c-IFN-ABD治疗组的肿瘤平均质量分别1215mg，986mg，696mg和466mg，cat-IFN-ABD治疗组的肿瘤平均质量仅为195mg，远低于其他治疗组；图12中的(c)为各给药组小鼠体重对时间变化的曲线，其显示整个治疗过程中小鼠体重并未出现明显降低，表明在给药期间小鼠均耐受良好，无明显的毒副作用。上述抗肿瘤和生物安全研究表明，相对于线型和环状对照，异质索烃cat-IFN-ABD能够显著提高IFN的抗肿瘤效果，并且没有明显毒副作用。

实施例12：cat-IFN-ELP的体内半衰期测试

六周龄雌性KM鼠(来自北京维通利华实验动物技术有限公司)随机分组适应性培养一周，腹腔注射300μg IFN/kg剂量的待测样品(包括实施例2中制备的经过SEC纯化得到的cat-IFN-ELP和野生型IFN)，在注射后0.5、1、3、6、12、24、48、72h共8个时间点分别取对应编号小鼠眼眶外周血0.2mL。外周血样品冰上放置4小时后，4000g离心15min后收集上清液移至对应编号无酶EP管-80℃保存待用。采集完全部血清样本后，利用Neobioscience公司的Human IFN-αELISA Kit测定不同时间点时血清中的干扰素浓度，通过GraphPad Prism软件计算半衰期。

试验结果：蛋白质样品在血清中的浓度变化曲线如图13所示，cat-IFN-ELP的体内循环半衰期(t_1/2＝22.8h)远高于wt-IFN(t_1/2＝5.4h)，表明将弹性蛋白类多肽(ELP)作为长效化功能基元构建蛋白质异质索烃同样能够有效延长干扰素的体内循环半衰期。

实施例13：cat-IL-2-ABD的BLI亲和力测试

利用生物膜干涉(Bio-Layer Interferometry,BLI)技术测试实施例2中制备的经过SEC纯化得到的cat-IL-2-ABD中的IL-2对相应受体IL-2Rα、IL-2Rβ的亲和力：

购置百赛普斯的人IL-2Rα、人IL-2Rβ受体干粉(含缓冲液所需磷酸盐)，用蒸馏水配置成100μM的浓储液，分装后-20℃保存，每100μL IL-2Rα受体添加0.53μL的生物素(10mM)，每100μL IL-2Rβ受体添加0.78μL的生物素(10mM)，室温孵育半小时后利用脱盐柱将生物素化受体置换到PBS溶液中，洗去多余生物素，超滤浓缩至20μM。配制PBST+0.1％BSA的上样缓冲液及pH 2.2甘氨酸盐酸洗脱液。利用上样缓冲液稀释样品至1000nM为最高浓度，3倍梯度稀释，每次稀释后将样品涡旋均匀，针对IL-2Rα和IL-2Rβ分别设置五个浓度梯度(具体浓度分别参见图14)，空白样品为上样缓冲液。利用Octet Red 96(Pall-Fortebio)检测样品同受体亲和能力，所用探针为Streptavidin(SA)探针(Unique，用于大分子生物素锚定)。固定好探针后运行程序，监测探针稳定性，并锚定生物素化受体蛋白至信号平稳。检测时，探针流动流程为Buffer 1 60s，受体锚定300s，Buffer 2 60s，样品结合200s，样品解离200s，(洗脱5s，Buffer 3 5s)×3，检测白介素2和待测样品分别同人IL-2Rα、人IL-2Rβ的亲和力。BLI亲和力试验的具体测试图谱如图14所示，由测试图谱计算所得结合速率常数k_a、解离速率常数k_d和平衡速率常数K_D的具体数据如表5所示。实验结果显示，cat-IL-2-ABD对IL-2Rα和IL-2Rβ的平衡速率常数K_D分别为8.5nM和42.2nM，在文献报道所报道的野生型IL-2对IL-2Rα和IL-2Rβ的亲和力范围内，表明异质索烃化不会明显影响IL-2对相应受体的亲和力。

表5 cat-IL-2-ABD对人IL-2Rα、人IL-2Rβ的BLI亲和力测试结果

实施例14：cat-IL-2-ABD的体内半衰期测试

六周龄雌性KM鼠(来自北京维通利华实验动物技术有限公司)随机分成两组适应性培养一周，腹腔注射60μg IL-2/kg剂量的野生型白介素2(wt-IL-2，欣吉尔)和待测样品(实施例2中制备的经过SEC纯化得到的cat-IL-2-ABD)，在注射后0.5、1、3、6、9、12、24、48h共8个时间点分别取对应编号小鼠眼眶外周血0.2mL。外周血样品冰上放置4小时后，4000g离心15min取上清液移至对应编号无酶EP管-80℃保存待用。采集完全部血清样本后，利用Neobioscience公司的Human IL-2ELISA Kit测定不同时间点时血清中的IL-2浓度。通过GraphPad Prism软件计算半衰期。

试验结果：蛋白质样品在血清中的浓度变化曲线如图15所示，cat-IL-2-ABD的体内循环半衰期(t_1/2＝4.2h)远高于wt-IL-2(t_1/2＝1.2h)，表明将ABD作为长效化功能基元构建IL-2的蛋白质异质索烃同样能够有效延长IL-2的体内循环半衰期。

Claims

1.一种基于机械偶联的蛋白质异质索烃的生物合成方法，所述方法包括以下步骤：

其中，所述蛋白质前体序列中包含的形成二聚体的缠结基元为异质化的缠结基元，其包含第1缠结基元和第2缠结基元；优选的，所述异质化的缠结基元为能够形成异质二聚体结构的p53dim突变体对；

2.根据权利要求1所述的生物合成方法，其中，所述第1缠结基元和第2缠结基元包含以下序列中的一种或多种：

优选的，所述第1缠结基元选自所述SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15中的任一种，所述第2缠结基元选自所述SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16中的任一种；

更优选的，所述SEQ ID NO：2作为第1缠结基元与所述SEQ ID NO：3作为第2缠结基元组成异质化的缠结基元、所述SEQ ID NO：13作为第1缠结基元与所述SEQ ID NO：14作为第2缠结基元组成异质化的缠结基元、或者所述SEQ ID NO：15作为第1缠结基元与所述SEQ IDNO：16作为第2缠结基元组成异质化的缠结基元；

最优选的，所述SEQ ID NO：2作为第1缠结基元与所述SEQ ID NO：3作为第2缠结基元组成异质化的缠结基元；

(iii)在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：13～16中任一项所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，并且其保留如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：13～16中任一项所示的氨基酸序列形成缠结二聚体的功能；或，

(iv)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码如SEQ ID NO:2、SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：13～16中任一项所示的氨基酸序列的多核苷酸序列在严格条件下杂交，并且所述氨基酸序列保留以SEQ ID NO:2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：13～16中任一项所示的氨基酸序列形成缠结二聚体的功能，所述严格条件是中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件或非常高严格条件。

3.根据权利要求1或2所述的生物合成方法，其中，所述蛋白质前体序列中包含的在细胞内发生正交偶联反应的两对环化基元选自由以下组成中的任一种：(a)两种正交的多肽-蛋白质反应对、(b)多肽-蛋白质反应对和分离型内含肽组合、或(c)两种正交的分离型内含肽；

优选的，所述在细胞内发生正交偶联反应的两对环化基元由(c)两种正交的分离型内含肽组成；

更优选的，所述分离型内含肽为：(1)Npu DnaE分离型内含肽，其由分离型内含肽C端部分I(IntC1)和分离型内含肽N端部分I(IntN1)组成环化基元和/或由分离型内含肽C端部分II(IntC2)和分离型内含肽N端部分II(IntN2)组成环化基元，所述IntC1、IntN1、IntC2和IntN2的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示；(2)gp41-1；(3)gp41-8；和/或(4)VidaL。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的生物合成方法，其中，所述蛋白质前体序列中包含的目标蛋白质为由酶、抗菌蛋白、细胞因子、激素、毒素、酶抑制剂、抗体及抗体类似物、蛋白质疫苗以及免疫系统相关蛋白组成的组中的任一种或其任意组合；

优选的，所述蛋白质前体序列中包含的目标蛋白质为干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、生长因子、激素和/或酶；

更优选的，所述干扰素包括IFN-α、IFN-β、IFN-γα、IFN-λ及其亚型中的任一种；所述白细胞介素包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31和/或IL-32中的任一种；所述集落刺激因子包括粒细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、多能集落刺激因子、干细胞因子、白血病抑制因子和/或红细胞生成素中的任一种；所述生长因子包括表皮细胞生长因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子和/或神经生长因子中的任一种；所述激素包括下丘脑激素、垂体激素、胃肠激素、胰岛素和/或降钙素中的任一种；所述酶包括尿激酶、精氨酸酶、丝氨酸脱水酶、苯丙氨酸氨解酶、亮氨酸脱氢酶、青霉素酶、超氧化物歧化酶和/或门冬氨酸酶中的任一种。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的生物合成方法，其中，所述蛋白质前体序列中包含的功能蛋白质基元为(1)长效化功能基元、(2)具有靶向特征的功能基元，或(3)与目标蛋白质具有协同作用的其它蛋白质药物；

优选的，所述长效化功能基元为白蛋白结合结构域(ABD)、弹性蛋白类多肽(ELP)、白蛋白(HSA)、血清转铁蛋白、免疫球蛋白片段、重组聚多肽XTEN、PAS、HAP或GLK中的任一种；所述具有靶向特征的功能基元为亲合体(Affibody)、纳米抗体(Nanobody)、单体结合蛋白(Monobody)、单链抗体(ScFv)、预设计锚蛋白重复蛋白(DARPin)以及其它可发生特定蛋白-蛋白相互作用的基元；所述与目标蛋白质具有协同作用的其它蛋白质药物可以与所述目标蛋白质相同或者不相同。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的生物合成方法，其中，所述蛋白质前体序列的基本结构为：

7.根据权利要求1～6中任一项所述的生物合成方法，其中，所述蛋白质前体序列中包含的形成二聚体的缠结基元既可以在所述目标蛋白质和/或所述功能蛋白质基元的N端，也可以在所述目标蛋白质和/或所述功能蛋白质基元的C端；

优选的，步骤1)中在所述分离型内含肽C端部分I之后、所述分离型内含肽N端部分I之前，或者在所述分离型内含肽C端部分II之后、所述分离型内含肽N端部分II之前引入组氨酸标签序列；更优选的，在所述分离型内含肽C端部分II之后、所述分离型内含肽N端部分II之前引入组氨酸标签序列；

可选的，步骤1)中在第1个缠结基元之前引入烟草蚀斑病毒(Tobacco etch virus,TEV)蛋白酶的识别序列。

8.利用权利要求1～7中任一项所述的生物合成方法制备得到的蛋白质异质索烃；优选的，所述蛋白质前体序列的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：8～10所示。

9.一种药物组合物，其特征所述，所述药物组合物包含权利要求8所述的蛋白质异质索烃和药学上可接受的载体。

10.利用权利要求8所述的蛋白质异质索烃或者权利要求9所述的药物组合物在制备预防和/或治疗疾病中药物中的用途；

优选的，所述疾病选自癌症、免疫相关疾病或感染性疾病；

更优选的，所述癌症为实体瘤，所述免疫相关疾病为自身免疫性疾病，所述感染性疾病为病毒感染疾病或细菌感染疾病；

最优选的，所述癌症为卵巢癌、B细胞淋巴癌；所述免疫相关疾病为系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、干燥综合征、脏器移植排斥反应、移植物抗宿主疾病、皮肌炎或多发性硬化中的任一种；所述感染性疾病为病毒感染疾病。

11.一种蛋白质异质索烃，其特征在于，所述蛋白质异质索烃是由蛋白质前体序列对应的编码基因序列通过转录、翻译得到，其中所述蛋白质前体序列的基本结构为：

12.根据权利要求11所述的蛋白质异质索烃，其中，所述第1缠结基元和/或所述第2缠结基元包含以下序列中的一种或多种：

(iii)在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：13～16中任一项所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，并且其保留如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：13～16中任一项所示的氨基酸序列形成缠结二聚体的功能；或者，

13.根据权利要求11或12所述的蛋白质异质索烃，其中，所述分离型内含肽C端部分I(IntC1)、分离型内含肽N端部分I(IntN1)、分离型内含肽C端部分II(IntC2)和分离型内含肽N端部分II(IntN2)的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQID NO:7所示。

14.根据权利要求11～13中任一项所述的蛋白质异质索烃，其中，所述目标蛋白质为由酶、抗菌蛋白、细胞因子、激素、毒素、酶抑制剂、抗体及抗体类似物、蛋白质疫苗以及免疫系统相关蛋白组成的组中的任一种或其任意组合；

优选的，所述目标蛋白质为干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、生长因子、激素和/或酶；

15.根据权利要求11～14中任一项所述的蛋白质异质索烃，其中，所述功能蛋白质基元为(1)长效化功能基元，(2)具有靶向特征的功能基元；或(3)与目标蛋白质具有协同作用的其它蛋白质药物；

16.根据权利要求11～15中任一项所述的蛋白质异质索烃，其中所述蛋白质前体序列的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：8～10所示。