TW202304521A - 免疫刺激ｉｌ－２類似物的新穎接合物及其製備方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種介白素-2類似物之長效接合物，其具有對介白素-2受體改變的結合親和力。

Description

免疫刺激IL-2類似物的新穎接合物及其製備方法
本發明係關於一種介白素-2類似物之新穎接合物，及其製備方法及使用方法。
介白素-2是一種重要的免疫刺激劑，分子量約為15kDa，由總共133個胺基酸殘基所組成，可激活包括T細胞及B細胞在內的免疫系統的各種細胞。介白素-2作為免疫刺激劑的高效性可用於治療包括癌症及愛滋病在內的各種免疫相關疾病(韓國專利申請公開第10-2017-0070091號)。目前，介白素-2(商標名：Proleukin)為FDA批准用於治療轉移性腎細胞癌及轉移性黑色素瘤的藥物。然而，由於與大劑量介白素-2治療相關的嚴重毒性，適用的患者有限。事實上，此種療法僅適用於少數符合條件的患者。與介白素-2相關的毒性包括嚴重發燒、噁心、嘔吐、血管滲漏、嚴重低血壓、肺水腫及血管滲漏症候群，這會導致肝損傷。
介白素-2受體具有三種次單元受體。該次單元由一α鏈(IL-2Rα或CD25)、一β鏈(IL-2Rβ或CD122)及一γ鏈(IL-2Rγ或CD132)組成。介白素-2可透過與各種組合的受體次單元結合而發揮諸多功能。單一的介白素-2α 受體稱為低親和力介白素-2受體，並不參與訊息傳遞。介白素-2β和γ受體之複合物以中等親和力與介白素-2結合。介白素-2α、β和γ受體之複合物以高親和力與介白素-2結合。介白素-2β和γ受體複合物必須透過多種訊息傳遞路徑中的激酶活化以進行有效的訊息轉換。尤其介白素-2β和γ結合受體在CD8+細胞和自然殺手(NK)細胞中特別重要。此外，高親和力介白素-2α、β和γ受體之複合物通常存在於CD4+調節T細胞(Tregulatory cells，Treg)中，最近在活化的T細胞中也有發現。由於介白素-2β受體分佈在CD8+T細胞或自然殺手細胞(NK細胞)中並參與體內的免疫反應，藉由增加β受體之活性以達免疫活化來開發治療劑的研究業已進行。
儘管介白素-2具有作為各種免疫相關疾病治療劑的潛力，但在減少毒性及副作用的同時，能夠降低使用劑量的藥物仍然不多，是以，對新藥及改良藥物的研究需求仍在增加中。
本發明的目的為提供包含介白素-2類似物的長效接合物。
本發明的另一個目的為提供製備該長效接合物的方法。
本發明的另一個目的為提供用於預防或治療癌症的醫藥組成物，包括介白素-2類似物或其長效接合物。
本發明的另一目的為提供預防或治療癌症的方法，包括向有需要的個體施用介白素-2類似物、其長效接合物或包含其之組成物。
本發明的再一個目的為提供介白素-2類似物、其長效接合物或包含其之組成物用於預防或治療癌症之用途。
本發明的又一目的為提供用於預防或治療癌症的提供藥物之用 途，包括介白素-2類似物或其長效接合物，或包含其之組成物。
本發明的目的為提供一種新穎的介白素-2類似物(或IL-2類似物)。該介白素-2類似物為與天然介白素-2或阿地介白素(aldesleukin，即一種介白素-2類似物)相比，其對介白素-2β受體之結合親和力增加的介白素-2類似物。該介白素-2類似物可包括天然介白素-2中的一個或多個胺基酸經過修飾的序列。
在一個具體的態樣中，該長效接合物的特徵在於其係由下述化學式1表示的長效接合物：
[化學式1]X-La-F
其中，X為介白素-2類似物，當X不形成長效接合物的一部分並且單獨存在時，與阿地介白素相比，其係對介白素-2β受體具有增加之結合親和力的介白素-2類似物；
L為聚乙二醇連接子；
a為0或自然數，條件是當a為2或更大時，每個L相互獨立；
F為二聚體形式的免疫球蛋白Fc區；以及
-表示X和L之間以及L和F之間的共價鍵；
其中，介白素-2類似物包含一序列，其對應於天然介白素-2中位置1、12、18、19、20、22、32、35、38、42、43、45、48、49、61、68、69、74、76、80、81、82、84、85、86、87、88、89、91、92、94、95、96、125、126及133的一個或多個胺基酸經過修飾。
另一個具體態樣中，該長效接合物係包含介白素-2類似物，其係天然介白素-2中的一個或多個胺基酸係經由選自下列方法之一進行突變：取代、 添加、缺失、修飾，及其組合。
根據上述任一具體態樣的長效接合物，其特徵在於與天然的介白素-2或阿地介白素相比，其與介白素-2α受體的結合親和力發生改變，並且包含對介白素-2β受體具有增加之結合親和力的介白素-2類似物作為該接合物一部分。
根據上述任一具體態樣的長效接合物，其特徵在於其包含在對應於位置133之胺基酸加成一個或多個胺基酸的介白素-2類似物作為該接合物的一部分。
根據上述任一具體態樣的長效接合物，其特徵在於其包含天然介白素-2類似物中位置1之胺基酸經移除並且位置125之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物作為該接合物的一部分。
根據上述任一具體態樣的長效接合物，其特徵在於其包括進一步包含1至10個胺基酸取代的介白素-2類似物作為該接合物的一部分。
根據上述具體態樣中任一項的長效接合物，其特徵在於其包含介白素-2類似物作為接合物的一部分，其中，該介白素-2類似物於位置18、19、20、22、38、42、43、45、61、68、69、74、80、81、84、85、86、88、89、91、92、94及96的一或多個胺基酸進一步由不同胺基酸所取代。
根據上述具體態樣中任一項的長效接合物，其特徵在於其包含介白素-2類似物作為接合物的一部分，其中，該介白素-2類似物於位置18、22、38、42、61、68、80、81、85、86及92的一或多個胺基酸進一步由不同胺基酸所取代。
根據上述任一具體態樣的長效接合物包括下述類似物中的任一 者作為介白素-2類似物的一部分：
(a)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125及32之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物。
(b)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125及35之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物。
(c)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125及38之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物。
(d)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125及42之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物。
(e)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125及43之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物。
(f)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125及48之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物。
(g)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125及49之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物。
(h)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125及76之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物。
(i)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、81、92、94及96之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物。
(j)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125及87之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物。
(k)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38及42之胺基酸 由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物。
(l)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38及80之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物。
(m)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38及84之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物。
(n)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、19、38及42之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物。
(o)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、12、38及42之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物。
(p)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42及61之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物。
(q)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42及84之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物。
(r)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42及88之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物。
(s)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42及89之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物。
(t)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42及91之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物。
(u)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42及94之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物。
(v)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42及126之 胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物。
(w)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、80及84之胺基酸由同胺基酸所取代的介白素-2類似物。
(x)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、94及96之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物。
(y)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物。
(z)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、61、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物。
(aa)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物。
(ab)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、80、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(ac)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、81、84及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(ad)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、20、38、42、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(ae)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、80、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(af)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、74、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(ag)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、81、84 及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(ah)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、81、88及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(ai)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(aj)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、80、81、85及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(ak)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、80、81、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(al)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(am)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、45、74、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(an)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、74、80、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(ao)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、80、81、84及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(ap)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、45、80、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(aq)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(ar)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、42、80、81、85、 86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(as)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、61、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(at)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、69、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(au)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、80、81、85、86、91及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(av)天然介白素-2類似物中位置1之胺基酸經移除並且位置125、18、22、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(aw)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(ax)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、45、74、80、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(ay)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、68、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(az)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、69、74、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(ba)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、80、81、84、85、86、91及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(bb)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、80、81、85、86、92、94及96之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(bc)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、18、19、22、80、 81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(bd)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、18、22、38、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(be)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、18、22、61、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(bf)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、18、22、68、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(bg)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、35、38、42、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(bh)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、45、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(bi)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、80、81、85、86、91及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(bj)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、80、81，85、86、92及95之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(bk)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、35、38、42、74、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(bl)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、43、61、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(bm)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、80、81、85、86、91、92及95之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(bn)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、35、38、、42、 74、80、81、82、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(bo)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、80、81、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(bp)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、80、81、85及86之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物。
根據上述任一具體態樣的長效接合物，其特徵在於其包括介白素-2類似物，該介白素-2類似物包括由下列胺基酸取代所組成群組選出的任一種或多種取代：
(a)位置12之胺基酸由纈胺酸或苯丙胺酸所取代之取代；
(b)位置18之胺基酸由精胺酸所取代之取代；
(c)位置19之胺基酸由酪胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸或精胺酸所取代之取代；
(d)位置20之胺基酸由纈胺酸或苯丙胺酸所取代之取代；
(e)位置22之胺基酸由麩胺酸所取代之取代；
(f)位置32之胺基酸由半胱胺酸所取代之取代；
(g)位置35之胺基酸由半胱胺酸或麩胺酸所取代之取代；
(h)位置38之胺基酸由丙胺酸或天門冬胺酸所取代之取代；
(i)位置42之胺基酸由離胺酸、丙胺酸或色胺酸所取代之取代；
(j)位置43之胺基酸由半胱胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸所取代之取代；
(k)位置45之胺基酸由丙胺酸所取代之取代；
(l)位置48之胺基酸由半胱胺酸所取代之取代；
(m)位置49之胺基酸由半胱胺酸所取代之取代；
(n)位置61之胺基酸由麩醯胺酸、精胺酸或天門冬胺酸所取代之取代；
(o)位置68之胺基酸由天門冬胺酸或麩醯胺酸所取代之取代；
(p)位置69之胺基酸由甘胺酸所取代之取代；
(q)位置74之胺基酸由組胺酸或丙胺酸所取代之取代；
(r)位置76之胺基酸由半胱胺酸所取代之取代；
(s)位置80之胺基酸由苯丙胺酸、酪胺酸、纈胺酸、天門冬胺酸或色胺酸所取代之取代；
(t)位置81之胺基酸由天門冬胺酸、麩胺酸或天門冬醯胺所取代之取代；
(u)位置82之胺基酸由甘胺酸或纈胺酸所取代之取代；
(v)位置84之胺基酸由麩胺酸、纈胺酸或苯丙胺酸所取代之取代；
(w)位置85之胺基酸由纈胺酸、丙胺酸、甘胺酸，色胺酸，酪胺酸、蘇胺酸，異白胺酸，麩胺酸或苯丙胺酸所取代之取代；
(x)位置86之胺基酸由纈胺酸、丙胺酸、甘胺酸或白胺酸所取代之取代；
(y)位置87之胺基酸由半胱胺酸所取代之取代；
(z)位置88之胺基酸由麩醯胺酸、纈胺酸或苯丙胺酸所取代之取代；
(aa)位置89之胺基酸由苯丙胺酸所取代之取代；
(ab)位置91之胺基酸由蘇胺酸、苯丙胺酸或麩胺酸所取代之取代；
(ac)位置92之胺基酸由苯丙胺酸、白胺酸、酪胺酸或色胺酸所取代之取代；
(ad)位置94之胺基酸由苯丙胺酸或纈胺酸所取代之取代；
(ae)位置95之胺基酸由天門冬胺酸所取代之取代；
(af)位置96之胺基酸由苯丙胺酸、纈胺酸或異白胺酸所取代之取代；
(ag)位置125之胺基酸由絲胺酸所取代之取代；
(ah)位置126之胺基酸由蘇胺酸所取代之取代。
根據上述任一具體態樣的長效接合物，其特徵在於其包括一種介白素-2類似物，該介白素-2類似物包括由SEQ ID NOS：3至106所組成的群組選出之胺基酸序列。
根據上述任一具體態樣的長效接合物，其特徵在於其包含下述任一類似物之介白素-2類似物：
(a)一種介白素-2類似物，其中，該介白素-2類似物係天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除且位置125、38、42、80、81及92之胺基酸由不同的胺基酸所取代；
(b)一種介白素-2類似物，其中，該介白素-2類似物係天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除且位置125、80、81、85、86及92之胺基酸由不同的胺基酸所取代；
(c)一種介白素-2類似物，其中，該介白素-2類似物係天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除且位置125、18、22、80、81、85、86及92之胺基酸由不同的胺基酸所取代；
(d)一種介白素-2類似物，其中，該介白素-2類似物係天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除且位置125、38、42、80、81、85、86及92之胺基酸由不同的胺基酸所取代；
(e)一種介白素-2類似物，其中，該介白素-2類似物係天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除且位置125、18、22、61、80、81、85、86及92之胺基酸由不同的胺基酸所取代；
(f)一種介白素-2類似物，其中，該介白素-2類似物係天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除且位置125、18、22、68、80、81、85、86及92之胺基酸由不 同的胺基酸所取代。
根據上述任一具體態樣中之長效接合物，其特徵在於其包括由下列胺基酸取代所組成群組選出之任一種或多種胺基酸取代的介白素-2類似物：
(a)位置18之胺基酸由精胺酸所取代之取代；
(b)位置22之胺基酸由麩胺酸所取代之取代；
(c)位置38之胺基酸由丙胺酸所取代之取代；
(d)位置42之胺基酸由離胺酸所取代之取代；
(e)位置61之胺基酸由天門冬胺酸所取代之取代；
(f)位置68之胺基酸由天門冬胺酸所取代之取代；
(g)位置80之胺基酸由苯丙胺酸所取代之取代；
(h)位置81之胺基酸由麩胺酸所取代之取代；
(i)位置85之胺基酸由纈胺酸所取代之取代；
(j)位置86之胺基酸由纈胺酸所取代之取代；
(k)位置92之胺基酸由苯丙胺酸所取代之取代；以及
(l)位置125之胺基酸由絲胺酸所取代之取代。
根據上述任一具體態樣中的長效接合物，其特徵在於其包括選自由下列所組成群組之免疫球蛋白Fc區：IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或其組合，或其雜合體。
根據上述任一具體態樣中的長效接合物，其特徵在於其包括IgG4 Fc區。
根據上述任一具體態樣中的長效接合物，其特徵在於其包含非糖基化的免疫球蛋白Fc區。
根據前述任一態樣中的長效接合物，其特徵在於該免疫球蛋白Fc區源自人類IgG4衍生的非糖基化Fc區。
根據上述任一具體態樣中的長效接合物，其中，該免疫球蛋白Fc區具有兩條多肽鏈藉由雙硫鍵連接的結構，並且僅透過兩條鏈之一中的氮原子連接。
根據上述任一具體態樣中的長效接合物，其特徵在於該免疫球蛋白Fc區包括具有SEQ ID NO：438的胺基酸序列之單體。
根據上述任一具體態樣中的長效接合物，其特徵在於該該免疫球蛋白Fc區為SEQ ID NO：438的胺基酸序列之單體的同源二聚體。
根據上述任一具體態樣中的長效接合物，其特徵在於該免疫球蛋白Fc區經由其N端脯胺酸之氮原子來連接。
根據上述任一具體態樣中的長效接合物，其特徵在於該L含有乙二醇重複單元，且該乙二醇重複單元部分的式量為範圍1kDa至100kDa。
根據上述任一具體態樣中的長效接合物，其特徵在於一個X分子經由聚乙二醇連接子與二聚免疫球蛋白Fc區的Fc區之一共價鍵結。
根據上述任一具體態樣中的長效接合物，其特徵在於該乙二醇重複單元的分子式為[OCH2CH2]n，其中，n為自然數，以及該介白素-2類似物接合物中[OCH2CH2]n區域的平均分子量，舉例來說，數目平均分子量確定為1kDa至100kDa。
根據上述任一具體態樣中的長效接合物，其特徵在於n值為確定的值，令該介白素-2類似物接合物中[OCH2CH2]n區域的平均分子量，舉例來說，數目平均分子量為3.4kDa。
根據上述任一具體態樣中的長效接合物，其特徵在於a為1，且一個X分子經由含有乙二醇重複單元的連接子與二聚體免疫球蛋白Fc區的Fc區鏈之一共價鍵結。
根據上述任一具體態樣中的長效接合物，其特徵在於該連接子的一端僅與二聚免疫球蛋白Fc區的兩條Fc區鏈之一連接。
根據上述任一具體態樣中的長效接合物，其特徵在於該接合物的L的一端與F連接，且L的另一端分別透過與F的胺或硫醇基團反應及與X的胺或硫醇基團反應形成的共價鍵與X連接。
本發明的另一種方面提供由下述化學式2表示的介白素-2類似物之長效接合物：
[化學式2]X-Z-Fc
其中，X為介白素-2類似物，其包含SEQ ID NOS：3至106的胺基酸序列中選出的任一多肽序列；
Z為分子量2kDa至30kDa的聚乙二醇連接子；
Fc為二聚體形式的免疫球蛋白Fc區；及
-表示X與Z之間以及Z與Fc之間的共價鍵；
其中，該長效接合物為其Z的一端與二聚體Fc區中的僅一條多肽鏈共價連接，且一個X分子與Z的另一端共價連接的長效接合物。
在一個具體態樣中，該介白素-2類似物的特徵在其包含由SEQ ID NOS：10，13，14，15，16，17，20，21，22、32、35、36、42、53、54、56、58、59、60、62、71、72、74、75、76、77、78、85、87、89、91、92、93、94、 95、98、99、100、101、103、104、105及106之胺基酸序列所組成群組選出的任一序列。
在另一具體態樣中，該介白素-2類似物的特徵在於其包含由SEQ ID NOS：10、13、14、16、17、20、21、22、32、35、36、42、53、54、87、89、91、92、93、94、98、99、100、101、103、104及105之胺基酸序列所組成群組選出的任一序列。
根據上述任一具體態樣中的長效接合物，其特徵在於其包括介白素-2類似物，該介白素-2類似物包含由SEQ ID NOS：22，42，53，87，105及106之胺基酸序列所組成群組選出的任一序列。
根據上述任一具體態樣中的介白素-2類似物的長效接合物，其特徵在於其C端進一步包含一個或多個胺基酸。
本發明的另一個方面提供一種由下述化學式3表示的介白素-2類似物之長效接合物：
[化學式3]X'-Z-Fc
其中，X'為包含由下述通式1表示的胺基酸序列之介白素-2類似物：
[通式1]
Figure 111112574-A0202-12-0017-2
Figure 111112574-A0202-12-0018-3
(通式1，SEQ ID NO：212)
其中，上述通式1中，
X1為缺失；
X18為白胺酸(L)或精胺酸(R)；
X19為白胺酸(L)或酪胺酸(Y)；
X22為麩胺酸(E)或麩醯胺酸(Q)；
X38為丙胺酸(A)、天門冬胺酸(D)或精胺酸(R)；
X42為丙胺酸(A)、苯丙胺酸(F)、離胺酸(K)或色胺酸(W)；
X43為麩胺酸(E)、離胺酸(K)或麩醯胺酸(Q)；
X45為丙胺酸(A)或酪胺酸(Y)；
X61為天門冬胺酸(D)、麩胺酸(E)、麩醯胺酸(Q)或精胺酸(R)；
X68為天門冬胺酸(D)或麩胺酸(E)；
X74為組胺酸(H)或麩醯胺酸(Q)；
X80為苯丙胺酸(F)、白胺酸(L)、纈胺酸(V)或酪胺酸(Y)；
X81為天門冬胺酸(D)、麩胺酸(E)或精胺酸(R)；
X84為天門冬胺酸(D)或麩胺酸(E)；
X85為丙胺酸(A)、麩胺酸(E)、甘胺酸(G)、白胺酸(L)、纈胺酸(V)、色胺酸(W)或酪胺酸(Y)；
X86為丙胺酸(A)、甘胺酸(G)、異白胺酸(I)或纈胺酸(V)；
X91為蘇胺酸(T)或纈胺酸(V)；
X92為苯丙胺酸(F)、異白胺酸(I)或酪胺酸(Y)；
X94為苯丙胺酸(F)或白胺酸(L)；
X96為苯丙胺酸(F)或白胺酸(L)；
Z為具有分子量2kDa至30kDa的聚乙二醇連接子；
Fc為二聚體形式的免疫球蛋白Fc區；及
-表示X與Z之間以及Z與Fc之間的共價鍵；
其中，該長效接合物為其Z的一端與二聚體Fc區中的僅一條多肽鏈共價連接，並且一個X’分子與Z的另一端共價連接的長效接合物。
在一個具體態樣中，上述通式1中，
X43為離胺酸(K)；
X45為酪胺酸(Y)；
X61為天門冬胺酸(D)，麩胺酸(E)或麩醯胺酸(Q)；
X68為麩胺酸(E)；
X74為麩醯胺酸(Q)；
X80為苯丙胺酸(F)或白胺酸(L)；
X85為白胺酸(L)、纈胺酸(V)或酪胺酸(Y)；
X86為異白胺酸(I)或纈胺酸(V)；及
X92為苯丙胺酸(F)或異白胺酸(I)。
在另一個態樣中，該介白素-2類似物在其C端進一步包括一個或多個胺基酸。
本發明的又一方面方面提供由下述化學式4表示的介白素-2類似物之長效接合物：
[化學式4]X"-Z-Fc
其中，X"為包括由下述通式2表示之胺基酸序列的介白素-2類似物：
[通式2]
Figure 111112574-A0202-12-0020-4
Figure 111112574-A0202-12-0020-5
(通式2，SEQ ID NO：213)
X1為缺失；
X18為白胺酸(L)或精胺酸(R)；
X22為麩胺酸(E)或麩醯胺酸(Q)；
X38為丙胺酸(A)或精胺酸(R)；
X42為苯丙胺酸(F)或離胺酸(K)；
X61為天門冬胺酸(D)或麩胺酸(E)；
X68為天門冬胺酸(D)或麩胺酸(E)；
X81為天門冬胺酸(D)或麩胺酸(E)；
X85為白胺酸(L)或纈胺酸(V)；
X86為異白胺酸(I)或纈胺酸(V)；
Z為具有分子量2kDa至30kDa的聚乙二醇連接子；
Fc為二聚體形式的免疫球蛋白Fc區；及
-表示X"與Z之間以及Z與Fc之間的共價鍵；
其中，該長效接合物為其Z的一端與二聚體Fc區中的僅一條多肽鏈共價連 接，並且一個X"分子與Z的另一端共價連接的長效接合物。
在一個具體態樣中，該介白素-2類似物的特徵在於其包含選自由SEQ ID NOS：22、42、53、87、105及106之胺基酸序列所組成群組的任一序列。
本發明的另一方面提供一種製備包含介白素-2類似物的長效接合物的方法，係包括：藉由非肽基聚合物將介白素-2類似物與免疫球蛋白Fc區連接。
在一個具體態樣中，該介白素-2類似物的特徵在於選自對應於天然介白素-2中位置1、12、18、19、20、22、32、35、38、42、43、45、48、49、61、68、69、74、76、80、81、82、84、85、86、87、88、89、91、92、94、95、96、125、126及133的胺基酸所組成群組之一者或多者經過修飾。
本發明的另一方面提供一種用於預防或治療癌症的醫藥組成物，其包含介白素-2類似物或其長效接合物。
在一個具體態樣中，該醫藥組成物的特徵在於其包含藥學有效量之介白素-2類似物的長效接合物及藥學上可接受的賦形劑。
在另一個具體態樣中，該醫藥組成物的介白素-2類似物之特徵在於其包含對應於天然介白素-2中位置1、12、18、19、20、22、32、35、38、42、43、45、48、49、61、68、69、74、76、80、81、82、84、85、86、87、88、89、91、92、94、95、96、125、126及133的一個或多個胺基酸經過修飾的序列。
根據上述任一具體態樣中的醫藥組成物，其特徵在於其包含與阿地介白素相比，對介白素-2β受體具有增加之結合親和力的介白素-2類似物。
根據上述任一具體態樣中的醫藥組成物，其特徵在於該介白素-2 類似物選自由包含SEQ ID NOS：3至106所組成的群組。
根據上述任一具體態樣中的醫藥組成物，其特徵在於該介白素-2類似物選自由包含SEQ ID NOS：22、42、53、87、105及106所組成的群組。
根據上述任一具體態樣中的醫藥組成物，其特徵在於該長效接合物係由下述化學式1表示：
[化學式1]X-La-F
其中，X為與阿地介白素相比介，具有對介白素-2β受體增加之結合親和力的介白素-2類似物；
L為聚乙二醇連接子；
a為0或自然數，條件為當a為2或更大時，每個L相互獨立；
F為二聚體形式的免疫球蛋白Fc區；以及
-表示X與L之間以及L與F之間的共價鍵。
根據上述任一具體態樣的醫藥組成物，其特徵在於該癌症係選自由轉移性腎細胞癌、轉移性黑色素瘤、結腸直腸癌、肝癌、卵巢癌、胰癌、膽囊癌、腎癌、結腸直腸癌、肺癌、皮膚癌、黑色素瘤、乳癌、膀胱癌及胃癌所組成的群組中之任一者。
根據上述任一具體態樣的醫藥組成物，其特徵在於該組成物相對於阿地介白素展現高血液暴露、腫瘤生長抑制及/或記憶T細胞反應。
根據上述任一具體態樣的醫藥組成物，其特徵在於該醫藥組成物經由腹膜內、靜脈內、肌內、皮下、皮內、口服、局部、鼻內、肺內或直腸內途徑給藥。
根據上述任一具體態樣的醫藥組成物，其特徵在於該醫藥組成物以範圍1週至1個月的時間間隔給藥。
本發明的另一個方面提供一種用於預防或治療癌症的方法，包括：向有需要的個體施用介白素-2類似物、其長效接合物或包含其之組成物。
本發明的另一方面提供介白素-2類似物、其長效接合物或包含其之組成物用於預防或治療癌症的用途。
本發明的另一方面提供用於提供預防或治療癌症之藥物的用途，包括介白素-2類似物、其長效接合物，或包含其之組成物。
該介白素-2類似物或包含其之長效接合物是對體內介白素-2β受體具有增加之結合親和力的類似物，並且具有在抗癌治療目的上改善給藥便利性和副作用的效果。
圖1為介白素-2類似物的長效接合物的SDS-PAGE結果(類似物21、41及52)。
圖2為介白素-2類似物的長效接合物的純度分析結果(類似物21、41和52)。
圖3表示介白素-2類似物的長效接合物在ICR和C57BL/6小鼠中的藥物動力學分析結果。A是介白素-2類似物接合物41及介白素-2類似物接合物52在ICR小鼠中的藥物動力學分析結果，而B是介白素-2類似物接合物21、介白素-2類似物接合物86、介白素-2類似物接合物104及介白素-2類似物接合物105 在C57BL/6小鼠中的藥物動力學分析結果。圖3中，長效接合物的劑量和血清濃度僅基於整個接合物中介白素-2類似物區域所佔重量表示。
圖4顯示在小鼠中確認介白素-2類似物接合物21、介白素-2類似物接合物41及介白素-2類似物接合物52在動物模型中的抗癌效果之結果。圖4中，長效接合物的劑量是僅基於整個接合物中介白素-2類似物區域所佔重量表示的值。
圖5為介白素-2類似物的長效接合物在動物模型中證實記憶T細胞變化之結果。A顯示介白素-2類似物接合物21、介白素-2類似物接合物41和介白素-2類似物接合物52的腫瘤生長抑制作用，而B是分析介白素-2類似物接合物21、介白素-2類似物接合物41及介白素-2類似物接合物52的記憶T細胞數量之結果。圖5中，長效接合物的劑量是僅基於介白素-2類似物區域所佔重量來表示的值。
圖6是介白素-2類似物的長效接合物在惡性黑色素瘤動物模型中的抗腫瘤效果評估結果。A顯示阿地介白素和介白素-2類似物的長效接合物86的腫瘤大小，而B是確認阿地介白素和介白素-2類似物的長效接合物86的存活率之結果。在圖6中，長效接合物的劑量是僅基於介白素-2類似物區域在整個接合物中所佔重量來表示的值。
下述將描述用於實施本發明的細節。同時，本發明中公開的各個描述和實施例也可以應用於其他描述和實施例。亦即本發明所公開的各種要素的所有組合都在本發明的範圍內。此外，不應認為本發明的範圍受下述具體描述限制。再者，在整個說明書中引用許多論文和專利文獻。引用的論文及專利文獻 的揭露內容係透過引用其整體併入本發明，進而闡明本發明所屬主題的層次和範圍。
在本發明的整個說明書中，採用習用之胺基酸的單一字母和三字母代碼。此外，本發明提及之胺基酸係根據IUPAC-IUB的命名規則縮寫如下：
Figure 111112574-A0202-12-0025-6
如本文所述，「Aib」可以與「2-胺基異丁酸」或「胺基異丁酸」互換使用，並且2-胺基異丁酸和胺基異丁酸可彼此互換使用。
本發明的另一方面提供一種包含介白素-2類似物之長效接合物。
除非上下文中明確指示，否則於此使用之術語「或」意指且可替換為術語「及/或」。
具體而言，該長效接合物可由下述化學式1表示：
[化學式1]X-La-F
其中，X為與阿地介白素相比，具有對介白素-2β受體增加之結合親和力的介白素-2類似物；
L為聚乙二醇連接子；
a為0或自然數，條件為當a為2或更大時，每個L相互獨立；
F為二聚體形式的免疫球蛋白Fc區；以及
-表示X與L之間以及L與F之間的共價鍵。
本發明的介白素-2類似物的長效接合物，其特徵在於當其單獨存在而不形成接合物的一部分時，對介白素-2受體具有改變的結合親和力，尤其是對介白素-2 β受體具有增加的結合親和力。具體而言，本發明的介白素-2類似物當單獨存在而不形成接合物的一部分時，與天然介白素-2或已知的阿地介白素相比，對介白素-2β受體具有增加的結合親和力，更具體而言，其對介白素-2α受體亦具有改變(增加或降低)的結合親和力，並且可能包括天然介白素-2中的一個或多個胺基酸經過修飾的序列。
如本發明所述，用語「介白素-2(IL-2)」係指一種在體內的免疫系統中傳遞訊息的細胞因子。介白素-2通常被認為是一種重要的免疫刺激劑，大小約15kDa。
如本發明所述，用語「介白素-2類似物」係指天然介白素-2之序列中的一個或多個胺基酸經過修飾。尤其是在本發明中，該介白素-2類似物可為天然介白素-2中之胺基酸經過修飾之介白素-2類似物，其與天然介白素-2相比，具有對介白素-2受體降低或增加之結合親和力。具體而言，本發明的介白素-2類似物可為非天然存在者。
該天然介白素-2可以是人介白素-2，其序列可以從已知的資料庫 等中獲得。具體而言，該天然介白素-2可具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列，但不限於此。
在本發明中「天然介白素-2可具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列」不僅指具有與SEQ ID NO：1相同的序列，還包括與屬於本發明的天然介白素-2的SEQ ID NO：1具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高同源性的胺基酸序列；並且當與SEQ ID NO：1比對具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高同源性的序列時，在SEQ ID NO：1的胺基酸序列上相應的胺基酸修飾位置經過改變。
在本發明中，「天然序列中的一個或多個胺基酸經過改變」可指可選自由包含取代、添加、缺失、修飾及其組合所組成的群組的修飾發生在天然序列中的至少一個胺基酸。
具體而言，本發明的介白素-2類似物可包括對應於天然介白素-2位置1、12、18、19、20、22、32、35、38、42、43、45、48、49、61、68、69、74、76、80、81、82、84、85、86、87、88、89、91、92、94、95、96、125、126及133的一個或多個胺基酸經過修飾的序列。具體而言，本發明的介白素-2類似物可以是天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除且位置125之胺基酸由不同的胺基酸取代者；並且進一步包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個胺基酸取代。儘管不限於此，其位置125之胺基酸(即半胱胺酸)可取代為絲胺酸，且發生進一步取代的胺基酸可為對應於位置12、18、19、20、22、32、35、38、42、43、45、48、49、61、68、69、74、76、80、81、82、84、85、86、87、88、89、91、92、94、95、96、126及133之胺基酸。
此外，該介白素-2類似物除了上述修飾位置外，還包括胺基酸殘基的取代、添加、缺失、修飾等，其程度可提高已知肽的穩定性和半衰期之本領域中的任何一種方法也包括在本發明的範圍內。
如本發明所述，用語「阿地介白素」或「介白素-2類似物(阿地介白素)」為市售的介白素-2類似物，可為阿地介白素(商品名：Proleukin®)，具體而言，其可為具有胺基酸序列SEQ ID NO：2者。本發明中，該等用語與「介白素-2類似物1」可互換使用。與介白素-2類似物1相比，本發明的介白素類似物對介白素-2α受體可具有改變的結合親和力，及/或增加的結合親和力。
雖然介白素-2α受體如何參與介白素-2的訊息傳遞系統係屬未知，但它們將介白素-2對其他介白素-2受體(β或γ受體)的結合親和力提高10至100倍，並表達在CD4+調節性T細胞等當中。
由於介白素-2β受體主要分佈於CD8+T細胞或自然殺手細胞(NK細胞)中，具有激活免疫反應和巨噬細胞的重要作用，因此有望透過活化介白素-2β受體促進腫瘤細胞死亡和活化身體的免疫反應。
因此，本發明的介白素-2類似物對介白素-2β受體的結合親和力增加，能增加腫瘤的抑制及死亡，同時降低副作用的治療效果。
在本發明中，該介白素-2類似物可包括在天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除且位置125之胺基酸由不同胺基酸取代之序列，進一步包括1至10個胺基酸修飾。例如，該介白素-2類似物可包含天然介白素-2位置125之胺基酸被絲胺酸取代，以及位置12、18、19、20、22、32、35、38、32、43、45、48、49、61、68、69、74、76、80、81、82、84、85、86、87、88、89、91、92、94、95、96及126的一個或多個胺基酸被不同的胺基酸取代，及/或在位置133 之胺基酸加成一個或多個胺基酸之序列，但不限於此，以及對介白素α受體具有改變之結合親和力的任何介白素-2類似物，包括但不限於與天然介白素-2及/或阿地介白素相比，具有對介白素-2β受體增加之結合親和力者。
作為本發明的該介白素-2類似物的一個例子，該介白素-2類似物可為在對應於位置133之胺基酸上添加一個或多個胺基酸者，但不限於此。為了本發明的目的，待添加的胺基酸之類型或長度沒有限制，只要與天然介白素-2或阿地介白素相比，該介白素-2類似物對介白素-2α受體的結合親和力改變，並且具有對介白素-2β受體增加之結合親和力，並且除了天然胺基酸外，還可以添加非天然存在的胺基酸及具有化學修飾的胺基酸。
在另一個實施例中，該介白素-2類似物可為天然介白素-2中位置1之胺基酸被移除；位置125之胺基酸被不同的胺基酸取代；位置18、19、20、22、38、42、43、45、61、68、69、74、80、81、84、85、86、88、89、91、92、94及96之胺基酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9個或更多個胺基酸被不同胺基酸取代者，但不限於此。
又一個實施例中，該介白素-2類似物可為天然介白素-2中位置1之胺基酸被移除；位置125之胺基酸被不同的胺基酸取代；位置18、19、22、38、42、43、45、61、68、74、80、81、84、85、86、88、91、92、94及96之胺基酸被1、2、3、4、5、6、7、8、9個或更多個胺基酸取代者，但不限於此。
又一個實施例中，該介白素-2類似物可為天然介白素-2中位置1之胺基酸被移除；位置125之胺基酸被不同的胺基酸取代；並且位置18、22、38、42、61、68、80、81、85、86及92之胺基酸中的一個或多個胺基酸被不同的胺基酸取代者，但不限於對此。
又一個實施例中，該介白素-2類似物可包括選自由下列類似物所組成的群組之任一者：
(a)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125及32之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(b)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125及35之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(c)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125及38之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(d)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125及42之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(e)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125及43之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(f)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125及48之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(g)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125及49之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(h)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125及76之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(i)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、81、92、94及96之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(j)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125及87之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(k)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38及42之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(l)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38及80之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(m)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38及84之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(n)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、19、38及42之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(o)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、12、38及42之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(p)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42及61之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(q)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42及84之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(r)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42及88之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(s)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42及89之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(t)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42及91之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(u)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42及94之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(v)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42及126之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(w)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、80及84之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(x)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、94及96之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(y)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(z)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、61、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(aa)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(ab)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、80、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(ac)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、81、84及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(ad)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、20、38、42、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(ae)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、80、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(af)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、74、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(ag)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、81、84及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(ah)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、81、88及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(ai)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(aj)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、80、81、85及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(ak)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、80、81、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(al)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(am)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125，、38、42、45、74、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(an)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、74、80、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(ao)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、80、81、84及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(ap)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、45、80、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(aq)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(ar)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、42、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(as)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、61、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(at)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、69、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(au)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、80、81、85、86、91及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(av)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、18、22、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(aw)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(ax)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、45、74、80、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(ay)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、68、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(az)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、69、74、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(ba)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、80、81、84、85、86、91及92由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(bb)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、80、81、85、86、92、94及96之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(bc)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、18、19、22、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(bd)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、18、22、38、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(be)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、18、22、61、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(bf)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、18、22、68、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(bg)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、35、38、42、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(bh)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、45、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(bi)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、80、81、85、86、91及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(bj)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、80、81、85、86、92及95之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(bk)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、35、38、42、74、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(bl)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、43、61、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(bm)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、80、81、85、86、91、92及95之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(bn)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、35、38、42、74、80、81、82、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(bo)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、80、81、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物；
(bp)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、80、81、85及86之胺基酸由不同胺基酸所取代的介白素-2類似物。
具體而言，該介白素-2類似物包含選自由下列胺基酸取代所組成群組中的任一種或多種胺基酸取代：
(a)位置12之胺基酸由纈胺酸或苯丙胺酸所取代之取代；
(b)位置18之胺基酸由精胺酸所取代之取代；
(c)位置19之胺基酸由酪胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸或精胺酸所取代之取代；
(d)位置20之胺基酸由纈胺酸或苯丙胺酸所取代之取代；
(e)位置22之胺基酸由麩胺酸所取代之取代；
(f)位置32之胺基酸由半胱胺酸所取代之取代；
(g)位置35之胺基酸由半胱胺酸或麩胺酸所取代之取代；
(h)位置38之胺基酸由丙胺酸或天門冬胺酸所取代之取代；
(i)位置42之胺基酸由離胺酸、丙胺酸或色胺酸所取代之取代；
(j)位置43之胺基酸由半胱胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸所取代之取代；
(k)位置45之胺基酸由丙胺酸所取代之取代；
(l)位置48之胺基酸由半胱胺酸所取代之取代；
(m)位置49之胺基酸由半胱胺酸所取代之取代；
(n)位置61之胺基酸由麩醯胺酸、精胺酸或天門冬胺酸所取代之取代；
(o)位置68之胺基酸由天門冬胺酸或麩醯胺酸所取代之取代；
(p)位置69之胺基酸由甘胺酸所取代之取代；
(q)位置74之胺基酸由組胺酸或丙胺酸所取代之取代；
(r)位置76之胺基酸由半胱胺酸所取代之取代；
(s)位置80之胺基酸由苯丙胺酸、酪胺酸、纈胺酸、天門冬胺酸或色胺酸所取代之取代；
(t)位置81之胺基酸由天門冬胺酸，麩胺酸或天門冬醯胺所取代之取代；
(u)位置82之胺基酸由甘胺酸或纈胺酸所取代之取代；
(v)位置84之胺基酸由麩胺酸、纈胺酸或苯丙胺酸所取代之取代；
(w)位置85之胺基酸由纈胺酸、丙胺酸，甘胺酸，色胺酸、酪胺酸、蘇胺酸、異白胺酸、麩胺酸或苯丙胺酸所取代之取代；
(x)位置86之胺基酸由纈胺酸、丙胺酸、甘胺酸或白胺酸所取代之取代；
(y)位置87之胺基酸由半胱胺酸所取代之取代；
(z)位置88之胺基酸由麩醯胺酸、纈胺酸或苯丙胺酸所取代之取代；
(aa)位置89之胺基酸由苯丙胺酸所取代之取代；
(ab)位置91之胺基酸由蘇胺酸、苯丙胺酸或麩胺酸所取代之取代；
(ac)位置92之胺基酸由苯丙胺酸、白胺酸、酪胺酸或色胺酸所取代之取代；
(ad)位置94之胺基酸由苯丙胺酸或纈胺酸所取代之取代；
(ae)位置95之胺基酸由天門冬胺酸所取代之取代；
(af)位置96之胺基酸由苯丙胺酸、纈胺酸或異白胺酸所取代之取代；
(ag)位置125之胺基酸由絲胺酸所取代之取代；以及
(ah)位置126之胺基酸由蘇胺酸所取代之取代。
又一個實施例中，該介白素-2類似物可選自由下列介白素-2類似物所組成群組之任一者：
(a)天然介白素-2類似物中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、80、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
(b)天然介白素-2類似物中位置1之胺基酸經移除並且位置125、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
(c)天然介白素-2類似物中位置1之胺基酸經移除並且位置125、18、22、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
(d)天然介白素-2類似物中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
(e)天然介白素-2類似物中位置1之胺基酸經移除並且位置125、18、22、61、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；以及
(f)天然介白素-2類似物中位置1之胺基酸經移除並且位置125、18、22、68、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物。
具體而言，該介白素-2類似物包含選自由下列胺基酸取代所組成的群組中之任一種或多種胺基酸取代：
(a)位置18之胺基酸由精胺酸所取代之取代；
(b)位置22之胺基酸由麩胺酸所取代之取代；
(c)位置38之胺基酸由丙胺酸所取代之取代；
(d)位置42之胺基酸由離胺酸所取代之取代；
(e)位置61之胺基酸由天門冬胺酸所取代之取代；
(f)位置68之胺基酸由天門冬胺酸所取代之取代；
(g)位置80之胺基酸由苯丙胺酸所取代之取代；
(h)位置81之胺基酸由麩胺酸所取代之取代；
(i)位置85之胺基酸由麩胺酸所取代之取代；
(j)位置85之胺基酸由纈胺酸所取代之取代；
(k)位置92之胺基酸由苯丙胺酸所取代之取代；以及
(l)位置125之胺基酸由絲胺酸所取代之取代。
如本發明所述，用語「對應於」係指肽中所列位置的胺基酸殘基，或與肽中所列殘基相似、相同或同源的胺基酸殘基。確定對應位置的胺基酸可以是指特定序列之序列中特定胺基酸。
例如，可藉由將任一胺基酸序列與SEQ ID NO：1進行比對，對胺基酸序列中的每個胺基酸殘基進行編號，並以此為基礎指定胺基酸殘基位置對應SEQ ID NO：1的胺基酸殘基的編號。
作為如此之比對，可以使用例如Needleman-Wunsch演算法(Needleman and Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)、EMBOSS系列的Needle程式(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice et al.2000)，(Trends Genet.16：276-277)等，但可用的程式不限於此，並且可適當使用本領域已知的序列比對程式及成對序列比較演算法等。
在本發明中，即使表達為肽中胺基酸的特定位置，此種表達也可指參考序列中的相應位置。
在另一個實施例中，該介白素-2類似物可包括、基本上由、或由選自由SEQ ID NOS：3至106所組成群組的胺基酸序列所組成，但不限於此。
此外，即使在本發明中將介白素-2類似物表達為「由特定的SEQ ID NO組成的介白素-2類似物」，也不排除藉在對應SEQ ID NO的胺基酸序列上游或下游添加無意義的序列而可能發生的突變、可能天然發生的突變，或其沉默突變，只要該介白素-2類似物具有與由對應SEQ ID NO的胺基酸組成的介白素-2類似物相同或等效的活性，即使存在序列添加或突變，該介白素-2類似物顯然也屬於本發明的範圍。
本發明的介白素-2類似物可包括與SEQ ID NOS：3至106之胺基酸序列具有40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的同源性或同一性的胺基酸序列，但不限於此。
在一個具體態樣中，本發明的介白素-2類似物可以包括、基本上由、或由選自由SEQ ID NOS：21、41、52、86、104及105所組成的群組的胺基酸序列所組成，但不限於此。
如本發明所述，用語「同源性」和「同一性」係指兩個給定胺基酸序列或核苷酸序列之間的相關程度，並且可以表示為百分比。
可透過標準比對演算法確定保守多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性，並且可組合使用由欲使用的程式所建立的默認空位罰分。基本上，同源或相同的序列通常可以在中等或高度嚴格的條件下與全部或部分序列雜合。顯然，雜交還包括多核苷酸與多核苷酸的雜交，該多核苷酸包括一般密碼子或考慮密碼子簡併性的密碼子。
用語同源性及同一性經常可以互換使用。
任何兩個核苷酸或肽序列是否具有同源性、相似性或同一性可透過例如已知的電腦演算法，例如引入默認參數的「FASTA」程式來確定，如同在Pearson等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444中使用者。或者，可使用在EMBOSS套件中由Needleman程式執行的Needleman-Wunsch演算法來決定(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48：443-453)(EMBOSS：歐洲分子生物學開放軟體套組，Rice et al.,2000,Trends Genet.16：276-277)(版本5.0.0或更新版)(包含GCG程式套件(Devereux,J.et al.,Nucleic Acids Research 12：387(1984))，BLASTP，BLASTN，FASTA(Atschul,S.F.et al.,J Molec Biol 215：403(1990)；Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego,1994,and CARILLO et al.(1988)SIAM J Applied Math 48：1073)。舉例而言，同源性、相似性或同一性可以使用國家生物技術資訊中心的BLAST或ClustalW來決定。
核苷酸或肽序列的同源性、相似性或同一性可透過使用GAP電腦程式(例如Needleman等人(1970)，J Mol Biol 48：443)比較序列資訊來確認，如Smith and Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2：482所揭示者。簡而言之，GAP程式將同源性、相似性或同一性定義為相似對齊符號(即核苷酸或胺基酸)的數量除以兩個序列中較短的序列中的符號總數。GAP程式的默認參數可包括：(1)一元比較矩陣(包含值1表示同一性，0表示非同一性)及Gribskov(1986)Nucl.Acids Res.14：6745中的加權比較矩陣(或EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)替換的矩陣)，其係揭示於Schwartz和Dayhoff,eds.,Atlas Of Protein Sequence And Structure，National Biomedical Research Foundation,pp.353-358(1979)；(2)對每個空位處以3.0的罰分，對每個空位中的每個符號額外處以0.10 的罰分(或空位開放罰分10，空位擴展罰分0.5)；(3)末端空位無罰分。因此，本文使用的用語「同源性」和「同一性」表示序列之間的相關性。
上述可以應用於本發明的其他態樣或其他方面，但不限於此。
本發明的介白素-2類似物可作為新穎的介白素-2替代物，其透過減弱或增加介白素-2類似物對介白素-2α及/或β受體的結合親和力來改變其體外活性。特別地，本發明的介白素-2類似物由於其對兩種受體的活性而可作為有效的治療劑，因為它不僅對β受體具有增加的結合親和力，而且改變了(即增加或降低)對α受體的結合親和力。
在本發明中，此種用於製備介白素-2類似物的修飾包括採用L型或D型胺基酸及/或非天然胺基酸的所有修飾；及/或天然序列的修飾，例如側鏈官能基團的修飾、分子內共價鍵(例如，側鏈之間的環形成)、甲基化、醯化、泛素化、磷酸化、胺基己化、生物素化等。
此外，該修飾包含其中一個或多個胺基酸被添加到天然介白素-2的胺基及/或羧基末端的所有修飾。
作為被取代或加成的胺基酸，不僅可以使用人類蛋白質中常見的20種胺基酸，還可以使用非典型胺基酸或非天然存在的胺基酸。非典型胺基酸的商業來源包括Sigma-Aldrich、ChemPep Inc.和Genzyme Pharmaceuticals。包括該等胺基酸和典型肽序列的肽可以從用於肽合成的商業供應商例如American Peptide Company、Bachem(USA)或Anygen(Korea)處合成和購買。
也可以同樣方法得到胺基酸衍生物，例如可以使用4-咪唑乙酸等。
此外，根據本發明的介白素-2類似物可為經修飾的形式，其中， 該介白素-2的N端及/或C端等被有機基團化學修飾或保護，或者可添加胺基酸到該肽的末端等以保護其免受體內蛋白酶的作用，同時增加其穩定性。
特別地，在化學合成肽的情況中，其N-端和C-端帶電，因此該肽的N-端可被乙醯基化及/或該肽的C-端可被乙醯基化以除去電荷，但該肽不特別限於此。
本發明的介白素-2類似物可透過固相合成法合成，也可透過重組法製備，或者可商業化製備，但不限於此。
此外，本發明的介白素-2類似物可根據其長度藉由本領域周知的方法合成，例如透過自動肽合成儀，也可以透過基因工程技術生產。
具體而言，本發明的介白素-2類似物可透過標準合成方法、重組表達系統或本領域周知的任何其他方法來製備。因此，本發明的介白素-2類似物可透過許多方法合成，包括例如下述方法：
(a)一種透過固相或液相方法逐步或透過片段組裝合成肽，然後分離和純化最終肽產物的方法；
(b)一種在宿主細胞中表達編碼肽的核酸構建體並從宿主細胞培養物中回收表達產物的方法；或者
(c)一種對編碼肽的核酸構建體進行體外無細胞表達並從中回收表達產物的方法；或者透過方法(a)、(b)和(c)的任意組合獲得肽片段的方法，透過連接肽片段獲得該肽，然後回收該肽。
在本發明中，任何介白素-2類似物(或包含其之長效接合物)對天然介白素-2受體之結合親和力可使用表面等離子共振(SPR)來測量，表面等離子共振(SPR)係一種針對受體測量親和力的方法。
具體而言，在SPR分析中，利用蛋白質-配體結合原理將介白素-2受體固定在感測器的晶片上，將介白素-2類似物以連續稀釋法稀釋到實驗緩衝液中的方法流入並誘使其與固定化受體結合，接著僅以相同流速流過實驗緩衝液以誘使介白素-2類似物與受體解離從而測量結合親和力；或者將人類免疫球蛋白Fc區的抗體固定在感測器晶片上，然後固定與Fc區結合的介白素-2受體，使介白素-2類似物流動以測定結合親和力的方法。可使用上述方式，但不限於此。
更具體而言，將生物素標記的人類介白素-2受體固定在鏈親和素生物感測器晶片上，使用兩倍連續稀釋法稀釋到HBS-P+緩衝液中的介白素-2類似物的長效接合物以20μL/min的流速持續3分鐘，僅以相同流速流過HBS-P+緩衝液，以促使介白素-2受體與介白素-2類似物的長效接合物之間的解離，而獲得之結合常數和解離常數係藉由Biaevaluation程式的1：1結合擬合模型用於測量結合親和力，但不限於此。
更具體而言，本發明的介白素-2類似物與天然介白素-2或介白素-2類似物(阿地介白素或介白素-2類似物1)相比，對介白素-2α受體的結合親和力可能降低或增加。
具體而言，和天然介白素-2或阿地介白素對介白素-2α受體的結合親和力相比，本發明的介白素-2類似物對介白素-2α受體的結合親和力可為約0.001倍或更大、約0.005倍或更大、約0.01倍或更大、約0.05倍或更大，約0.1倍或更大、約0.3倍或更大、約0.5倍或更大、約0.7倍或更大、約0.9倍或更大、約1.1倍或更大、約1.3倍或更大，約1.5倍或更大，或約1.7倍或更大，但結合親和力的數值不受限制，只要與天然介白素-2或阿地介白素相比，結合親和 力有改變，該值就屬於本發明的範圍。
具體而言，基於阿地介白素對介白素-2α受體的結合親和力(設定為100%)，本發明的介白素-2類似物對介白素-2α受體可不具有結合親和力或可具有為約1%或更大，約5%或更大、約7%或更大、約10%或更大、約15%或更大、約20%或更大、約30%或更大、約50%或更大、約70%或更大、約90%或更大、約100%或更大、約150%或更大、約200%或更大，但結合親和力的數值不受限制，只要與天然介白素-2或阿地介白素相比，結合親和力有改變，該值就屬於本發明的範圍。
或者，與天然介白素-2或阿地介白素相比，本發明的介白素-2類似物特別地具有對介白素-2β受體約0.1倍或更大、約0.3倍或更大、約0.5倍或更大、約0.7倍或更大、約1.0倍或更大、約10倍或更大、約20倍或更大、約30倍或更大、約40倍或更大、約50倍或更大、約60倍或更大，約70倍或更大、約80倍或更大、約90倍或更大或約100倍或更大的結合親和力，但結合親和力的數值不受限制，只要與天然介白素-2或阿地介白素相比，結合親和力有改變或增加，該值均屬於本發明的範圍。
或者，基於阿地介白素對介白素-2β受體的結合親和力(設定為100%)，本發明的介白素-2類似物對介白素-2β受體的結合親和力可為約5%或更大，約9%或更大、約10%或更大、約20%或更大、約30%或更大、約50%或更大、約100%或更大、約200%或更大、約500%或更大、約700%或更大、約1,000%或更大、約1,500%或更大、約3,000%或更大、約5,000%或更大、約7,000%或更大、約10,000%或更大、約12,000%或更大、約15,000%或更大，約20,000%或更大，或約25,000%，但結合親和力的數值不受限制，只要與天然介 白素-2或阿地介白素的結合親和力相比，結合親和力增加，該值將屬於本發明的範圍。
如本發明所述，用語「約」是指包括±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1等所有值的範圍，並且包括與這些值後面的值等效或相似的所有值，但範圍不限於此。
本發明的介白素-2類似物的特徵在於，與天然介白素-2或阿地介白素相比，其對介白素-2α受體的結合親和力有所改變及對介白素-2β受體的結合親和力增加。
在本發明的一個具體態樣中，為了製備本發明的介白素-2類似物，基於天然介白素-2(SEQ ID NO：1)準備引入修飾的介白素-2類似物。本發明所製備的介白素-2類似物可包含SEQ ID NOS：3至106中任一胺基酸序列，也可為SEQ ID NOS：108至211中任一核苷酸序列所編碼者。
編碼本發明的介白素-2類似物的核酸可以是在編碼SEQ ID NO：1的天然介白素-2的核苷酸序列中被修飾的核酸，使得修飾(缺失、取代和/或加成胺基酸)可被引入到特定位置的胺基酸中。具體而言，本發明的介白素-2類似物可以包含編碼SEQ ID NOS：3至106中任一種胺基酸序列的核苷酸序列。例如，本發明的核酸可以具有或包括SEQ ID NOS：108至211中任一項的核苷酸序列。
本發明的核苷酸序列可以在不改變本發明的介白素-2類似物的胺基酸序列的範圍內的編碼區中進行各種修飾，考慮到密碼子簡併性或本發明中核酸待表達的生物體中的較佳密碼子。具體而言，本發明的核酸可以具有或包含與SEQ ID NOS：108至211的任一序列有70%或更高、75%或更高、80%或更 高、85%或更高、90%或更高、95%或更高、96%或更高、97%或更高、98%或更高及低於100%之同源性或同一性的核苷酸序列；或者可由或基本上由與SEQ ID NO：108至211中的任一序列有70%或更高、75%或更高、80%或更高、85%或更高、90%或更高、95%或更高、96%或更高、97%或更高、98%或更高及低於100%之同源性或同一性的核苷酸序列所組成，但核酸不限於此。
另外，本發明的核酸可包括但不限於可以從已知基因序列(例如，在嚴格條件下可以與本發明的全部或部分核酸序列互補的序列雜交的序列)製備的探針。「嚴格條件」是指能夠在多種核苷酸之間進行特異性雜交的條件。這些條件在文獻中有詳細描述(參見J.Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons，Inc.,New York,9.50-9.51,11.7-11.8)。
雜交需要兩個核酸具有互補序列，儘管鹼基之間的配置可能取決於雜交嚴格性。用語「互補」用於描述可相互雜交的核苷酸鹼基之間的關係。例如，對於DNA，腺嘌呤與胸腺嘧啶互補，胞嘧啶與鳥嘌呤互補。因此，本發明的核酸可包括與整個序列互補的分離的核酸片段以及基本上相似的核酸序列。
用於雜交聚核苷酸的適當嚴格性取決於聚核苷酸的長度和互補程度，並且變數是本領域眾所周知的(例如Sambrook等人，同上)。
同源性和同一性如上所述。
此外，本發明的介白素-2類似物與天然介白素-2或阿地介白素相比可具有增加的體內半衰期，但不特別限於此。例如，本發明的介白素-2類似物可為長效接合物的形式，其透過連接用於增加半衰期的生物相容性材料(例如免 疫球蛋白Fc區)以直接或透過連接子來增加介白素-2類似物的半衰期，但不限於此。
本發明的長效接合物不僅包括對介白素-2β受體的結合親和力增加的介白素-2類似物，而且還與作為代表載體的免疫球蛋白Fc區結合以增加其半衰期，從而增加介白素-2類似物的半衰期、增加血液暴露量、增加體內免疫反應，因而有效實現抑制癌細胞生長和減少癌細胞。
實施本發明的另一方面提供一種介白素-2類似物的長效接合物。
在本發明中，介白素-2類似物的長效接合物可為能夠增加其體內半衰期的生物相容性材料與介白素-2類似物連接的形式。在本發明中，生物相容性材料可與載體互換使用。
在本發明中，與未連接載體的介白素-2類似物相比，該長效接合物可以表現出更長的效力持續時間，並且在本發明中，這種接合物被稱為「長效接合物」或「接合物」。
同時，該接合物可以是非天然存在的。
本發明的一個具體態樣中，該長效接合物可以是由下述化學式1的長效接合物來表示：
[化學式1]X-La-F
其中，X為與阿地介白素相比，對介白素-2β受體具有增加之結合親和力的介白素-2類似物；
L為聚乙二醇連接子
a為0或自然數，條件是當a為2或更大時，每個L彼此獨立；
F為二聚體形式的免疫球蛋白Fc區；及
-表示共價鍵；
更具體而言，X和L、L和F可以透過共價鍵相互連接。特別地，接合物是其中X、L和F分別透過共價鍵連接的接合物，如化學式1中的順序。
此外，F可以直接與X連接(即a在化學式1中為0)，或者可以透過連接子(L)連接。
在本發明中，該介白素-2類似物可以對應於構成接合物的一個部分的元素。具體而言，對應於上述化學式1中的X，且該介白素-2類似物與上述相同。
在接合物中，F是能夠增加X，即介白素-2類似物的半衰期的材料，並且它對應於構成本發明接合物的一個部分的元素。
F和X可以透過共價化學鍵彼此連接，並且F和X可以透過L經由共價化學鍵彼此連接。
具體而言，F為免疫球蛋白Fc區，免疫球蛋白Fc區可以是IgG Fc區，也可以是非糖基化的IgG4 Fc區，但不特別限定於此。
作為本發明的一個具體態樣，F(免疫球蛋白Fc區)是由兩條多肽鏈組成的二聚體，可以具有L的一端僅與兩條多肽鏈之一連接的結構，但不限於此。
本發明的肽內的一個或多個胺基酸側鏈可以連接到生物相容性材料上，以增加體內溶解度及/或半衰期，及/或增加其生物利用度。這些修飾可能會降低治療性蛋白質和肽的清除率。
上述生物相容性材料可以是可溶的(兩親的或親水的)及/或無毒 的及/或藥學上可接受的。
此外，F可以直接與X連接(亦即在化學式1中a為0)，或者可以透過聚乙二醇連接子(L)連接。
在一個具體的態樣中，本發明的長效接合物可以是介白素-2類似物和免疫球蛋白Fc區連接的接合物，但不限於此。
在本發明中，「免疫球蛋白Fc區」是指包括重鏈恆定區2(CH2)及/或重鏈恆定區3(CH3)的區域，不包括免疫球蛋白的重鍊和輕鏈可變區。該免疫球蛋白Fc區可以是構成本發明接合物部分的元件。具體而言，免疫球蛋白Fc區對應於上述化學式1中的F。
在本說明書中，Fc區不僅包括從免疫球蛋白的木瓜蛋白酶消化獲得的天然序列，還包括其衍生物，例如，其中天然序列中的一個或多個胺基酸殘基透過缺失、插入，非保守或保守取代或或其組合而轉化的變體。因此變得與天然序列不同等。
上述衍生物、取代基和變體是保持FcRn結合能力所必需的。在本發明中，F可以是人類免疫球蛋白區，但不限於此。在本說明書中，「生物相容性材料」或「載體」可以指Fc區。
F(例如，免疫球蛋白Fc區)具有如是之結構，其中兩個多肽鏈透過雙硫鍵彼此連接，僅透過兩條鏈中的一條鏈的氮原子，但不限於此。經由氮原子的連接可以經由還原胺化連接至ε胺基或離胺酸的N-端胺基。
還原胺化反應是指一種反應物的胺基或胺基與另一種反應物的醛(即能還原胺化的官能基團)反應生成胺，然後透過還原反應形成胺鍵的反應。這是本領域周知的有機合成反應。
在本發明的長效接合物的一個具體態樣中，免疫球蛋白Fc區透過其N-端處的氮原子連接至連接子。
此種免疫球蛋白Fc區可以包括重鏈恆定區中的鉸鏈區，但不限於此。
在本發明中，免疫球蛋白Fc區可以在N-端包括特定的鉸鏈序列。
如本發明所述，用語「鉸鏈序列」是指位於重鏈中並透過雙硫鍵間形成免疫球蛋白Fc區的二聚體的區域。
在本發明的鉸鏈序列中，可以透過刪除具有下述胺基酸序列的部份鉸鏈序列的僅有一個半胱胺酸殘基來改變，但不限於此：
Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro(SEQ ID NO：418)。
鉸鏈序列可以僅包含一個半胱胺酸殘基，透過刪除一個在位置8或11的SEQ NO：418的鉸鏈位置的半胱胺酸殘基。本發明的鉸鏈序列殘基可以僅包含一個半胱胺酸殘基及可以由3至12個胺基酸組成，但不限於此。更具體而言，本發明的鉸鏈序列可以具有下述序列：
Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro(SEQ ID NO：419)，Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Pro(SEQ ID NO：420)，Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser(SEQ ID NO：421)，Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro(SEQ ID NO：422)，Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser(SEQ ID NO：423)，Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys(SEQ ID NO：424)，Glu-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys(SEQ ID NO：425)，Glu-Ser-Pro-Ser-Cys-Pro(SEQ ID NO：426)，Glu-Pro-Ser-Cys-Pro(SEQ ID NO：427)，Pro-Ser-Cys-Pro(SEQ ID NO：428)，Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro(SEQ ID NO：429)，Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser- Cys-Pro(SEQ ID NO：430)，Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Ser-Cys-Pro(SEQ ID NO：431)，Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys(SEQ ID NO：432)，Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro(SEQ ID NO：433)，Glu-Ser-Lys-Pro-Ser-Cys-Pro(SEQ ID NO：434)，Glu-Ser-Pro-Ser-Cys-Pro(SEQ ID NO：435)，Glu-Pro-Ser-Cys(SEQ ID NO：436)，Ser-Cys-Pro(SEQ ID NO：437)。
更具體而言，鉸鏈序列可以包括SEQ ID NO：428(Pro-Ser-Cys-Pro)或SEQ ID NO：437(Ser-Cys-Pro)的胺基酸序列，但不限於此。
在本發明的長效接合物的一個更具體的態樣中，在該接合物中，免疫球蛋白Fc區的N-端是脯胺酸。在該接合物中，Fc區透過脯胺酸的氮原子與連接子連接。
在本發明的長效接合物的一個實施例中，免疫球蛋白Fc區可以具有二聚體形式，其中免疫球蛋白Fc區的兩條鏈由於鉸鏈序列的存在而形成同源二聚體或異源二聚體。本發明的化學式1的接合物可以是連接子的一端與二聚體的免疫球蛋白Fc區的一條鏈連接的形式，但不限於此。
如本發明述，用語「N-端」是指蛋白質或多肽的胺基末端，並且包括胺基末端的最末端或最多包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個或更多的胺基酸。本發明的免疫球蛋白Fc區可以在N-端包括鉸鏈序列，但不限於此。
此外，本發明的免疫球蛋白Fc區可以是包括重鏈恆定區1(CH1)及/或輕鏈恆定區1(CL1)的一部分或全部的延伸的Fc區，不包括免疫球蛋白的重鍊和輕鏈可變區，只要其具有與其天然形式相比，基本上等同或改進的效果。此外，免疫球蛋白Fc區可以是其中去除對應於CH2及/或CH3的顯著長的胺基酸序列的一部分的區域。
例如，本發明的免疫球蛋白Fc區可以是：1)CH1結構域、CH2結構域、CH3結構域及CH4結構域，2)CH1結構域和CH2結構域，3)CH1結構域和CH3結構域，4)CH2結構域和CH3結構域，5)CH1結構域、CH2結構域、CH3結構域和CH4結構域中的一個或兩個或更多個結構域與免疫球蛋白鉸鏈區(或鉸鏈區的一部分)之間的組合，以及6)每個結構域之間的二聚體重鏈恆定區和輕鏈恆定區，但不限於此。
在本發明中，該免疫球蛋白Fc區可以是由同源結構域組成的單鏈免疫球蛋白組成的二聚體或多聚體，但不限於此。
此外，在本發明的長效接合物的一個實施例中，該免疫球蛋白Fc區的F是由兩條多肽鏈組成的二聚體，其中二聚體Fc區F和X可以透過一個含有乙二醇重複單元的相同連接子L相互共價連接。在一個具體態樣中，X僅透過連接子L與二聚體Fc區F的兩條多肽鏈中的一條多肽鏈共價連接。在更具體的態樣中，僅一個X分子透過L與一條多肽鏈共價連接，在二聚體Fc區F的兩條多肽鏈中，X連接到其上。在最具體的態樣中，F為同型二聚體。
在另一具體態樣中，免疫球蛋白Fc區F為由兩條多肽鏈組成的二聚體，L的一端僅與兩條多肽鏈中的一條多肽鏈相連，但不限於此。
在本發明的長效接合物的另一個實施例中，兩個X分子也可以以二聚體形式對稱地結合到一個Fc區。特別地，該免疫球蛋白Fc區和X可以透過連接子(L)彼此連接，但不限於上述實例。
此外，本發明的免疫球蛋白Fc區包括天然胺基酸序列及其序列衍生物。胺基酸序列衍生物是指天然胺基酸序列中的一個或多個胺基酸殘基由於缺失、插入、非保守或保守取代或其組合而具有不同的序列。
例如，已知對連接很重要的IgG Fc中的214至238、297至299、318至322或327至331位的胺基酸殘基可用作適合變異的位點。
此外，各種類型的衍生物都是可能的，例如，其中能夠形成雙硫鍵的位點被去除的衍生物，從天然Fc中去除幾個N-末端胺基酸的衍生物，在N-端添加甲硫胺酸殘基的衍生物等。此外，可以去除補體結合位點，例如C1q結合位點或抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)位點以去除效應功能。製備免疫球蛋白Fc區序列衍生物的技術公開於國際專利公開第WO 97/34631、WO 96/32478號等。
不改變分子的全部活性的蛋白質或肽中的胺基酸交換是本領域眾所周知的(H.Neurath，R.L.Hill，The Proteins，Academic Press，New York，1979)。最常見的交換發生在該些胺基酸殘基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly。在某些情況下，胺基酸可以透過磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙醯基化、醯胺化等進行修飾。
上述Fc衍生物可以是與本發明的Fc區表現出相同的生物活性，並且對熱、pH等具有提升結構穩定性的Fc區。
此外，此種Fc區可以從分離自人或動物如牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠、豚鼠等的天然品種獲得，或者可以是它們的重組體或從轉化獲得的衍生物動物細胞或微生物。具體而言，從天然形式獲得的方法是從人或動物有機體中分離完整免疫球蛋白，然後用蛋白酶處理它們的方法。當用木瓜蛋白酶處理時，天然形式被消化成Fab和Fc，當用胃蛋白酶處理時，它被切割成pF'c和F(ab)2。Fc或pF'c可以使用尺寸排阻層析法等分離。在更具體的態樣中，Fc 區可以是重組免疫球蛋白Fc區，其中人源Fc區從微生物獲得。
此外，與天然存在的形式相比，該免疫球蛋白Fc區可以具有天然聚醣或增加或減少的聚醣，或者是去糖基化的形式。該免疫球蛋白Fc聚醣的增加、減少或去除可以透過本領域常用的任何方法來實現，例如化學方法、酶方法和使用微生物的基因工程方法。特別是，透過去除聚醣獲得的免疫球蛋白Fc區顯示出與補體c1q的結合親和力顯著降低，以及抗體依賴性細胞毒性或補體依賴性細胞毒性降低或喪失，因此在有機活體不會誘導不必要的免疫反應。基於此，鑑於本發明的目的，去糖基化或非糖基化免疫球蛋白Fc區可能更適合作為藥物載體。
如本發明所述，用語「去糖基化(deglycosylation)」是指使用酶去除聚醣的Fc區，並且用語「無糖基化(aglycosylation)」是指未糖基化並在原核生物，具體而言為在大腸桿菌中生產的Fc區。
同時，免疫球蛋白Fc區可以源自人或動物，包括牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠、豚鼠等，在更具體的態樣中，它可以源自人。
此外，免疫球蛋白Fc區可以是源自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或其組合或雜合體的Fc區。在一個更具體的態樣中，它可以源自IgG或IgM，它們是人血液中最豐富的蛋白質，在一個甚至更具體的態樣中，它可以來源於已知可以提高配體結合蛋白的半衰期的IgG。在更具體的態樣中，免疫球蛋白Fc區可以是IgG4 Fc區，並且在最具體的態樣中，免疫球蛋白Fc區可以是源自人IgG4的非糖基化Fc區，但不限於此。
此外，在一個具體的態樣中，該免疫球蛋白Fc區可以是同源二聚體形式的人類IgG4片段，其中兩個單體以雙硫鍵(鏈間)相互連接，形成於半 胱胺酸間胺基酸位置3的個別單體。特別地，同型二聚體的單體可以具有兩個雙硫鍵(鏈內)，具體而言，在半胱胺酸間位置35和95形成雙硫鍵，在半胱胺酸間位置141和199形成雙硫鍵。
每個單體可由221個胺基酸組成，構成同源二聚體的胺基酸總數可為442個，但不限於此。具體而言，Fc片段可以是免疫球蛋白同源二聚體的形式，其中兩個單體具有SEQ ID NO：438的序列(由221個胺基酸組成)經由一個雙硫鍵在各別單體的半胱胺酸位置3互相鍵結，其中該同源二聚體的單體分別各自在半胱胺酸位置35及95形成鏈內雙硫鍵，及在半胱胺酸位置141及199形成鏈內雙硫鍵，但不限於此。
化學式1的F可以包括SEQ ID NO：438的胺基酸序列的單體，並且F可以是SEQ ID NO：438的胺基酸序列的單體的同源二聚體，但不限於此。
在一個態樣中，免疫球蛋白Fc區可以是包括SEQ ID NO：439的胺基酸序列(由442個胺基酸組成)的同源二聚體，但不限於此。
在一個具體的態樣中，免疫球蛋白Fc區及X可不為糖基化的，但不限於此。
同時，如本發明所述，用語「組合」是指編碼相同來源的單鏈免疫球蛋白Fc區的多肽與不同來源的單鏈多肽連接以形成二聚體或多聚體。換言之，二聚體或多聚體可以由選自IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc和IgE的Fc區的兩個或更多個片段製備。
如本發明所述，用語「雜交」是指對應於不同來源的兩個或更多個免疫球蛋白Fc區的序列存在於單鏈免疫球蛋白恆定區中。在本發明中，各種混合形式都是可能的。換言之，雜交結構域可以由選自IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、 IgE Fc和IgD Fc的CH1、CH2、CH3和CH4的1至4個結構域組成，並且可以包括鉸鏈區。
同時，IgG可以分為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亞類，並且本發明可以包括它們的組合或雜合體，特別是IgG2和IgG4亞類，最特別是IgG4的Fc片段，其很少具有效應功能，例如補體依賴性細胞毒性(CDC)。
此外，與天然介白素-2或阿地介白素相比，或與未用F修飾的X相比，上述接合物可具有增加的效力持續時間，並且這種接合物不僅可以是上述形式，而且可以是封裝在可生物降解的奈米顆粒中的形式，但不限於此。
在化學式1中，L是聚乙二醇連接子。
如本發明所述，用語「聚乙二醇連接子」包括其中兩個或更多個乙二醇重複單元接合的生物相容性聚合物。重複單元透過任何共價鍵而不是肽鍵相互連接。聚乙二醇連接子可以是構成本發明接合物的部分的元素，並且對應於化學式1中的L。在本說明書中，連接子可以與「非肽基連接子」或「肽基聚合物」互換使用。
La中，a可為1或以上，a為2或以上時，L可以相互獨立。
在一個具體的態樣中，該接合物可以是其中F和X透過非肽基連接子彼此共價連接的接合物，該非肽基連接子包含能夠結合F(特別是免疫球蛋白Fc區)和X(特別是介白素-2類似物)在兩端的反應性基團。
具體地，在本發明中非肽基連接子可以在其末端包括反應性基團以透過與構成接合物的其他成分的反應形成接合物。當兩端具有反應性官能基團的非肽基連接子透過各自的反應基團與化學式1的X和F結合形成接合物時，非肽基連接子或非肽基聚合物可稱為非肽基聚合物連接子部分或非肽基連接子 部分。
在一個具體態樣中，L(聚乙二醇連接子)可以是含有乙二醇重複單元的連接子，例如聚乙二醇，但不限於此。如本發明所述，聚乙二醇是包括所有乙二醇均聚物、PEG共聚物或單甲基取代的PEG聚合物(mPEG)的名詞，但不特別限於此。此外，本領域已知的衍生物及經由本領域的技術人員可以輕易地製備的衍生物也包含在本發明的範圍內。
聚乙二醇連接子可以包括乙二醇重複單元，同時在其末端包含用於在形成接合物之前製備接合物的官能基團。在根據本發明的長效接合物中，X和F可以透過官能基團相互連接，但不限於此。在本發明中，非肽基連接子可以包括兩個或三個或更多個官能基團，其中各個官能基團彼此相同或不同，但不限於此。
具體而言，該連接子可為下述化學式5表示的聚乙二醇(PEG)，但不限於此：
Figure 111112574-A0202-12-0058-7
在此，n=10至2400、n=10至480或n=50至250，但不限於此。
在長效接合物中，PEG部分可以包括-(CH2CH2O)n-的結構和介於連接元件和-(CH2CH2O)n-之間的氧原子，但不限於此。
在一個具體的態樣中，乙二醇重複單元可以由例如(CH2CH2O)n表示，其中n的值是自然數並且可以確定為令平均分子量，例如介白素-2類似物 接合物中(CH2CH2O)n位點的數均分子量為大於0kDa至約100kDa，但不限於此。在另一個實施例中，n值是自然數並且可以確定為令平均分子量，例如肽接合物中(CH2CH2O)n位點的數均分子量可為約1kDa至約100kDa、約1kDa至約80kDa、約1kDa至約50kDa、約1kDa至約30kDa、約1kDa至約25kDa、約1kDa至約20kDa、約1kDa至約15kDa、約1kDa至約13kDa、約1kDa至約11kDa、約1kDa至約10kDa、約1kDa至約8kDa、約1kDa至約5kDa、約1kDa至約3.4kDa、約3kDa至約30kDa、約3kDa至約27kDa、約3kDa至約25kDa、約3kDa至約22kDa、約3kDa至約20kDa、約3kDa至約18kDa、約3kDa至約16kDa、約3kDa至約15kDa、約3kDa至約13kDa、約3kDa至約11kDa、約3kDa至約10kDa、約3kDa至約8kDa、約3kDa至約5kDa、約3kDa至約3.4kDa、約8kDa至約30kDa，約8kDa至約27kDa，約8kDa至約25kDa，約8kDa至約22kDa，約8kDa至約20kDa，約8kDa至約18kDa，約8kDa至約16kDa、約8kDa至約15kDa、約8kDa至約13kDa、約8kDa至約11kDa、約8kDa至約10kDa、約9kDa至約15kDa、約9kDa至約14kDa、約9kDa至約13kDa、約9kDa至約12kDa、約9kDa至約11kDa、約9.5kDa至約10.5kDa或約10kDa，但不限於此。
此外，在一個具體態樣中，該接合物可以具有介白素-2類似物和免疫球蛋白Fc區(F)透過包括乙二醇重複單元的連接子(L)彼此共價連接的結構，但不限於對此。
在另一個具體態樣中，長效接合物中，L可為包括乙二醇重複單位的連接子，以及F可為二聚體式免疫球蛋白Fc區。更具體而言，一個X分子係經由含有乙二醇重複單位的連接子共價地連接至該二聚體式免疫球蛋白Fc區 的一個Fc區，但不限於此。又另一具體的態樣中，含有乙二醇重複單位的連接子的一端可僅連接至該二聚體式免疫球蛋白Fc區的二個Fc區鏈之一個Fc區鏈，但不限於此。
可用於本發明的聚乙二醇連接子的分子量可以在大於0kDa至200kDa的範圍內，具體地在約1kDa至100kDa、約1kDa至50kDa、約1kDa至30kDa、約2kDa至30kDa、約1kDa至20kDa，更具體地在約3.4kDa至10kDa的範圍內，更具體地約3.4kDa，但不限於此。
另外，本發明的非肽基連接子接合至以F對應的多肽，不僅可以使用一種聚合物，還可以使用不同類型的聚合物的組合。
如本發明所述，用語「約」包含±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1等在內的所有範圍，並且包含等於或類似於該名詞「約」後面的範圍內所有的值，但不限於此。
具體而言，非肽基連接子可以在F和X不結合的狀態下在其兩端具有反應性基團，並且可以透過反應性基團與F和X結合。
在一個具體的態樣中，連接子的兩端可以與免疫球蛋白Fc區的硫醇基、胺基或羥基結合，與介白素-2類似物(X)的硫醇基、胺基、疊氮基或羥基結合，但不限於此。
具體地，連接子可以在其兩個末端分別包含能夠與免疫球蛋白Fc區及介白素-2類似物(X)結合的反應性基團，能夠與半胱胺酸的硫醇基團結合的特異性反應性基團；位於N端的胺基、離胺酸、精胺酸、麩醯胺酸及/或組胺酸；及/或免疫球蛋白Fc區C端的羥基；和半胱胺酸的硫醇基團；離胺酸、精胺酸、麩醯胺酸及/或組胺酸的胺基；疊氮離胺酸的疊氮基團；及/或介白素-2類似 物(X)的羥基，但不限於此。
更具體地，連接子的反應基團可以是選自醛基、馬來醯亞胺基和琥珀醯亞胺衍生物中的一種或多種，但不限於此。
如上述，醛基的實例可包括丙醛基或丁醛基，但不限於此。
如上述，琥珀醯亞胺衍生物的實例可包括戊酸琥珀醯亞胺酯、甲基丁酸琥珀醯亞胺酯、甲基丙酸琥珀醯亞胺酯、丁酸琥珀醯亞胺酯、丙酸琥珀醯亞胺酯、N-羥基琥珀醯亞胺、羥基琥珀醯亞胺、羧甲基琥珀醯亞胺或碳酸琥珀醯亞胺酯，但不限於此。
連接子可以透過反應性基團與免疫球蛋白Fc區F和介白素-2類似物X連接以轉化為連接子部分。
此外，透過醛鍵還原烷基化產生的最終產物比由醯胺鍵形成的鍵更穩定。醛反應基團在低pH條件下選擇性地與N端反應，同時在高pH條件下，例如在9.0的條件下，與離胺酸殘基形成共價鍵。
此外，連接子兩端的反應性基團可以相同或不同，例如，可以在兩端提供醛基，在一端可以提供馬來醯亞胺基，在一端可以提供醛基，可以在另一端提供丙醛基或丁醛基。然而，反應性基團沒有特別限制是要F，特別是免疫球蛋白Fc區和X可以連接到連接子的各個末端即可。
例如，連接子可以包括在一端的馬來醯亞胺基團和在另一端的醛基、丙醛基或丁醛基作為反應性基團。
當使用兩端具有羥基反應基團的聚乙二醇作為連接子時，本發明的介白素-2類似物的長效接合物可以透過已知的化學反應將羥基活化為各種反應基團來製備，或者使用經修飾反應基團的市售聚乙二醇。
在一個特定態樣中，該聚合物可以是一個X的半胱胺酸殘基，更具體而言，該聚合物可以與一個SH的半胱胺酸基團相連接，但不限於此。
具體而言，可以將與上述半胱胺酸殘基的-SH基連接的連接子的反應性基團，全部應用於反應性基團。當使用馬來醯亞胺-PEG-醛時，馬來醯亞胺基團可以透過硫醚鍵連接到X的-SH基團，而醛基可以透過還原性連接到F的-NH2基團，特別是免疫球蛋白Fc胺化，但不限於此。
在另一個具體的態樣中，連接子可以連接到X的離胺酸殘基，更具體地，連接到離胺酸的胺基，但不限於此。
此外，在接合物中，連接子的反應性基團可以連接至位於免疫球蛋白Fc區N-端的-NH2，但不限於此。
此外，在接合物中，根據本發明的介白素類似物可以透過C端與具有反應性基團的連接子連接，但這僅是示例。
如本發明所述，用語「C端」是指肽的羧基末端，並且就本發明的目的而言，它是指能夠與連接子結合的位點。例如，C端可以包括C端最末端的胺基酸殘基和靠近C端的胺基酸殘基的全部，具體包括從最末端起第1至第20個胺基酸殘基，但是不限於此。
此外，與未用F修飾的X相比，上述接合物可以具有延長的效力持續時間，並且這樣的接合物不僅可以是上述形式，而且可以是其中被封裝在可生物降解的形式中的奈米粒子。
用於實施本發明的另一方面提供一種長效接合物，其中介白素-2類似物包含選自SEQ ID NOS：3至106的胺基酸序列和免疫球蛋白Fc區中的任一個胺基酸序列透過連接子連接。
介白素-2類似物、連接子和包含其的長效接合物如上所述。
實施本發明的又一方面提供由下述化學式2表示的介白素-2類似物的長效接合物：
[化學式2]X-Z-Fc
其中，X為包含SEQ ID NOS：3至106的胺基酸序列選出的任一多肽序列的介白素-2類似物；
Z為分子量2kDa至30kDa的聚乙二醇連接子；Fc是二聚體形式的免疫球蛋白Fc區；及
-表示為X和Z之間以及Z和Fc之間的共價鍵；
其中，該長效接合物為其Z的一端與二聚體Fc區中的僅一條多肽鏈共價鍵結，並且一個分子X與Z的另一端共價鍵結的長效接合物。
介白素-2類似物、連接子、Fc區和包含其的長效接合物如上所述。
在一個具體態樣中，該介白素-2類似物可以包括、基本上由、或由選自由SEQ ID NOS：10，13，14，15，16，17，20，21，22，32，35，36，42，53，54，56，58，59，60，62，71，72，74，75，76，77，78，85，87，89，91，92，93，94，95，98，99，100，101，103，104，105和106之胺基酸序列所組成的群組之任一序列所組成，但不限於此。
在另一個具體的態樣中，該介白素-2類似物可以包括、基本上由、或由選自由SEQ ID NOS：10、13、14、16、17、20，21、22、32、35、36、42、53、54、87、89、91、92、93、94、98、99、100、101、103、104及105之胺基酸序列所組成的群組之任一序列所組成，但不限於此。
在另一個具體的態樣中，介白素-2類似物可以包括、基本上由、或由選自由SEQ ID NOS：22、42、53、87、105及106之胺基酸序列所組成的群組之任一序列所組成，但不限於此。
此外，該介白素-2類似物可以在其C端進一步包含一個或多個胺基酸。
實施本發明的再一方面提供由下述化學式3所表示的介白素-2類似物的長效接合物：
[化學式3]X'-Z-Fc
其中，X'為包含由下述通式1所表示之胺基酸序列的介白素-2類似物：
[通式1]
Figure 111112574-A0202-12-0064-8
Figure 111112574-A0202-12-0064-9
(通式1，SEQ ID NO：212)
上述通式1中，
X1為缺失；
X18為白胺酸(L)或精胺酸(R)；
X19為白胺酸(L)或酪胺酸(Y)；
X22為麩胺酸(E)或麩醯胺酸(Q)；
X38為丙胺酸(A)、天門冬胺酸(D)或精胺酸(R)；
X42為丙胺酸(A)、苯丙胺酸(F)、離胺酸(K)或色胺酸(W)；
X43為麩胺酸(E)、離胺酸(K)或麩醯胺酸(Q)；
X45為丙胺酸(A)或酪胺酸(Y)；
X61為天門冬胺酸(D)、麩胺酸(E)、麩醯胺酸(Q)或精胺酸(R)；
X68為天門冬胺酸(D)或麩胺酸(E)；
X74為組胺酸(H)或麩醯胺酸(Q)；
X80為苯丙胺酸(F)、白胺酸(L)、纈胺酸(V)或酪胺酸(Y)；
X81為天門冬胺酸(D)、麩胺酸(E)或精胺酸(R)；
X84為天門冬胺酸(D)或麩胺酸(E)；
X85為丙胺酸(A)、麩胺酸(E)、甘胺酸(G)、白胺酸(L)、纈胺酸(V)、色胺酸(W)或酪胺酸(Y)；
X86為丙胺酸(A)、甘胺酸(G)、異白胺酸(I)或纈胺酸(V)；
X91為蘇胺酸(T)或纈胺酸(V)；
X92為苯丙胺酸(F)、異白胺酸(I)或酪胺酸(Y)；
X94為苯丙胺酸(F)或白胺酸(L)；
X96為苯丙胺酸(F)或白胺酸(L)；
Z為具有分子量2kDa至30kDa的聚乙二醇連接子；
Fc是二聚體形式的免疫球蛋白Fc區；及
-表示X'和Z之間以及Z和Fc之間的共價鍵；
其中，該長效接合物為其Z的一端與二聚體Fc區中的僅一條多肽鏈共價連接，並且一個X'分子與Z的另一端共價連接的長效接合物。
該介白素-2類似物、連接子、Fc區和包含其的長效接合物如上所述。
上述通式1中，X133對應的蘇胺酸(T)中可以添加一個或多個胺基酸，但不限於此。
具體而言，該介白素-2類似物可以包含、基本上由、或由選自由SEQ ID NOS：10，13，14，15，16，17，20，21，22，32，35，36，42，53，54，56，58，59，60，62，71，72，74，75，76，77，78，85，87，89，91，92，93，94，95，98，99，100，101，103，104，105和106之胺基酸序列所組成的群組之任一序列所組成，但不限於此。
與阿地介白素或天然介白素-2相比，此類介白素-2類似物對β受體的結合親和力可能增加，但不限於此。
在一個具體態樣中，在通式1中，
X43為離胺酸(K)；
X45為酪胺酸(Y)；
X61為天門冬胺酸(D)、麩胺酸(E)或麩醯胺酸(Q)；
X68為麩胺酸(E)；
X74為麩醯胺酸(Q)；
X80為苯丙胺酸(F)或白胺酸(L)；
X85為白胺酸(L)、纈胺酸(V)或酪胺酸(Y)；
X86為異白胺酸(I)或纈胺酸(V)；和
X92為苯丙胺酸(F)或異白胺酸(I)，但不限於此。
具體而言，該介白素-2類似物的特徵在於其包含選自由SEQ ID NOS：10、13、14、16、17、20、21、22、32、35、36、42、53、54、87、89、91、92、93、94、98、99、100、101、103、104和105之胺基酸序列所組成群組的任一序列，但不限於此。
本發明的介白素-2類似物在其C端進一步包括一個或多個胺基酸，但不限於此。
實施本發明的另一方面提供由下述化學式4所表示的介白素-2類似物的長效接合物：
[化學式4]X"-Z-Fc
其中，X"為包含由下述通式2表示之胺基酸序列介白素-2類似物：
[通式2]
Figure 111112574-A0202-12-0067-10
Figure 111112574-A0202-12-0067-11
(通式2，SEQ ID NO：213)
X1為缺失；
X18為白胺酸(L)或精胺酸(R)；
X22為麩胺酸(E)或麩醯胺酸(Q)；
X38為丙胺酸(A)或精胺酸(R)；
X42為苯丙胺酸(F)或離胺酸(K)；
X61為天門冬胺酸(D)或麩胺酸(E)；
X68為天門冬胺酸(D)或麩胺酸(E)；
X81為天門冬胺酸(D)或麩胺酸(E)；
X85為白胺酸(L)或纈胺酸(V)；
X86為異白胺酸(I)或纈胺酸(V)；
Z為具有分子量2kDa至30kDa的聚乙二醇連接子；
Fc為二聚體形式的免疫球蛋白Fc區；及
-表示X"和Z之間以及Z和Fc之間的共價鍵；
其中，該長效接合物為其Z的一端與二聚體Fc區中的僅一條多肽鏈共價連接，並且一個X"分子與Z的另一端共價連接的長效接合物。
該介白素-2類似物、連接子、Fc區和包含其的長效接合物如上所述。
具體而言，該介白素-2類似物可包括選自SEQ ID NOS：22、42、53、87、105和106之胺基酸序列組成的群組中的任一序列，但不限於此。
此外，在通式2中，可以在對應於X133的蘇胺酸(T)中添加一個或多個胺基酸，或者在介白素-2類似物的C末端進一步包括一個或多個胺基酸，但不限於此。
實施本發明的又一個方面提供一種長效接合物，其係包括介白素-2類似物。
該介白素-2類似物和包含其之長效接合物如上所述。
具體而言，該方法可以包括連接該介白素-2類似物的步驟，將修飾引入選自對應於天然介白素-2中位置1、12、18、19、20、22、32、35、38、 42、43、45、48、49、61、68、69、74、76、80、81、82、84、85、86、87、88、89、91、92、94、95、96、125、126和133之胺基酸所組成群組的一個或多個胺基酸，並透過連接子(例如非肽基聚合物)連接具有生物相容性之材料(例如免疫球蛋白Fc區)。
本發明的製備長效接合物的方法進一步包括將修飾引入選自由對應於天然介白素-2中位置1、12、18、19、20、22、32、35、38、42、43、45、48、49、61、68、69、74、76、80、81、82、84、85、86、87、88、89、91、92、94、95、96、125、126和133之胺基酸所組成群組的一個或多個胺基酸的步驟。該方法不受具體步驟或順序的限制，只要製備其中根據本發明的介白素-2類似物與生物相容性物質(例如免疫球蛋白Fc區)連接的長效接合物即可。
此外，本發明的長效接合物的製備方法還可以包括下述步驟：a)培養含有編碼介白素-2類似物的核酸的轉化體以表達介白素-2類似物；b)分離及純化表達的介白素-2類似物，但不限於此。
編碼介白素-2類似物的核酸可以包括或(基本上)由SEQ ID NOS：109至212中任一項的核苷酸序列所組成，但不限於此。
本發明用於培養轉化體的培養基必須滿足適合培養宿主細胞的要求。本領域技術人員可以根據所產生的轉化體的類型，適當選擇培養基中用於宿主細胞生長的碳源，並且可以採用適當的培養條件控制時間和所需量。
可以使用的糖源可以包括糖和碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、澱粉和纖維素)；油脂(例如大豆油、葵花油、蓖麻油、椰子油等)；脂肪酸(例如棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸)；醇類(例如甘油和乙醇)；和有機酸(例如乙酸)。這些材料可以單獨使用或混合使用。
可以使用的氮源可以包括蛋白腖、酵母提取物、肉汁、麥芽提取物、玉米漿、豆粕和尿素，或無機化合物(例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨)，氮源也可以單獨使用或混合使用。
可以使用的磷源可以包括磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀，或其對應的含鈉鹽類。此外，培養基可含有生長所需的無機鹽類(例如，硫酸鎂及硫酸鐵)。
最後，除了這些材料之外，還可以使用必需的生長材料(例如胺基酸和維生素)。此外，可以使用培養基的合適前體。上述原料可以在培養過程中以適合培養的方式分批或連續添加。鹼性化合物(例如氫氧化鈉、氫氧化鉀和胺)或酸性化合物(例如磷酸和硫酸)可以以適當的方式用於調節培養物的pH值。此外，消泡劑(例如脂肪酸聚乙二醇酯)可用於抑制氣泡的產生。為了保持有氧條件，將氧氣或含氧氣體(例如空氣)注入培養物中。
本發明的轉化體的培養通常在20℃至45℃、特別是25℃至40℃的溫度進行。此外，繼續培養直到獲得最大量的所需介白素-2類似物，為此，培養通常可以持續10至160小時。
如上所述，如果根據宿主細胞建立適當的培養條件，根據本發明的轉化體將產生介白素-2類似物，並且根據載體的組成和宿主細胞的特性，介白素-2類似物可以分泌到宿主細胞的細胞質、周質空間或細胞外。
可以習用方式純化在宿主細胞中或其外部表達的蛋白質。純化方法的實例包括鹽析(例如：硫酸銨沉澱、磷酸鈉沉澱等)、溶劑沉澱(例如，使用丙酮、乙醇等的蛋白質分級沉澱)、透析、凝膠過濾、離子交換、色譜法(例如、反相管柱層析)、超濾等，可單獨使用或組合使用。
此外，透過肽合成法製備的介白素-2類似物可以經由非肽基聚合 物與生物相容性物質(例如免疫球蛋白Fc區)連接。由於業已提供本發明的介白素-2類似物的序列，因此可以使用已知的肽合成方法進行肽的合成。
該介白素-2類似物如上所述。
實施本發明的另一方面提供經由上述方法製備的長效接合物。
除非本發明另有說明，詳細描述或申請專利範圍中關於根據本發明的「介白素-2類似物」或「接合物」的描述，其中該介白素-2類似物共價連接至生物相容性材料，可以是應用於形式，其不僅包括相應的介白素-2類似物或接合物，而且還包括相應的介白素-2類似物或接合物的鹽(例如，介白素-2類似物的藥學上可接受的鹽)，或其溶劑合物。因此，即使在本發明僅描述「介白素-2類似物」或「接合物」的情況下，該描述也可以同樣適用於其特定鹽、其特定溶劑合物、以及其特定鹽的特定溶劑合物。例如，這些鹽可以是其中使用任何藥學上可接受的鹽的形式。鹽的種類沒有特別限制。然而，上述的鹽較佳為對個體，例如哺乳動物安全且有效的鹽，但不特別限於此。
用語「藥學上可接受的」是指在醫學判斷的範圍內，可以有效地用於所需目的而不會引起過度毒性、刺激、過敏反應等的材料。
如本發明所述，用語「藥學上可接受的鹽」包括衍生自藥學上可接受的無機酸、有機酸或鹼的鹽。合適的酸的實例包括鹽酸、溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富馬酸、馬來酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水楊酸、琥珀酸、甲苯-對-磺酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。衍生自合適鹼的鹽可包括鹼金屬(例如鈉、鉀等)、鹼土金屬(如鎂等)、銨等。
此外，如本發明所述，用語「溶劑合物」是指在根據本發明的介 白素-2類似物或其鹽與溶劑分子之間形成的複合物。
實施本發明的另一個方面提供一種組成物，其包括介白素-2類似物或其長效接合物。該介白素-2類似物及其長效接合物如上所述。本發明的組成物可以是醫藥組成物，在具體態樣中，可以是具有預防或治療癌症用途的醫藥組成物。
根據本發明的組成物可以包括介白素-2類似物或其長效接合物，具體可以包括藥理有效量的介白素-2類似物或其長效接合物。此外，它還可以包括藥學上可接受的載體。
根據本發明的組成物的一個具體態樣中，該組成物可以包括介白素-2類似物，該介白素-2類似物包含選自由SEQ ID NOS：3至106的任意一種胺基酸序列；或長效接合物，更具體而言，包含選自由SEQ ID NOS：22、42、53、87、105和106的任何一種胺基酸序列的介白素-2類似物；或包含介白素-2類似物的長效接合物，但不限於此。
如本發明所述，用語「藥學有效量」可以指介白素-2或其接合物表現出癌症預防或治療作用但對患者沒有毒性或副作用的安全給藥劑量，並且可以指能夠對介白素-2受體，特別是β及/或α受體表現出顯著活性的給藥劑量。
根據本發明的組成物可以表現出下述一種或多種性質，但不限於此，只要其對介白素-2β受體的結合親和力增加而表現出增加的免疫反應和抗癌作用等即可：
(i)相對於阿地介白素的高的血液暴露；
(ii)與阿地介白素相比，具有高的腫瘤生長抑制作用；
(iii)與阿地介白素相比，產生高的記憶T細胞的反應。
介白素-2已知為T細胞生長因子，是一種參與免疫調節的蛋白質，具有增殖T細胞、刺激B細胞、作用於T細胞分泌γ-干擾素的活性。基於介白素-2的免疫調節活性，可以透過利用人體免疫系統去除癌細胞來獲得癌症預防或治療效果。
特別地，本發明的介白素-2類似物對介白素-2β受體具有增加的結合親和力，介白素-2β受體在訊息傳遞中起主要作用，從而在個體的免疫系統中產生更有效的抗癌作用。此外，包括介白素-2類似物的長效接合物表現出優異的生物利用度，因為隨著效力持續時間的增加，血液暴露量增加，同時對介白素-2β受體的結合親和力增加，因此表現出優異的腫瘤生長抑制和記憶力產生T細胞的能力，從而顯示出有效的癌症預防或治療效果。
具體地，本發明的介白素-2類似物的長效接合物可不具有結合親和力或對介白素-2α受體的結合親和力，與天然介白素-2，阿地介白素或包含其長效接合物的結合親和力相比，可為約0.001倍或更大、約0.005倍或更大、約0.01倍或更大、約0.05倍或更大、約0.1倍或更大、約0.3倍或更大、約0.5倍或更大、約0.6倍或更大、約0.7倍或更大、約0.8倍或更大、約0.9倍或更大、約1.1倍或更大、約1.3倍或更大、約1.5倍或更大、或約1.7倍或更大，但結合親和力的數值不受限制，只要與天然介白素-2或阿地介白素相比的結合親和力有改變，該數值均屬於本發明的範圍。
此外，與天然介白素-2、阿地介白素或長效接合物對介白素-2β受體的結合親和力相比，本發明的介白素-2類似物的長效接合物可特別對介白素-2β受體具有約0.1倍或更大、約0.3倍或更大、約0.5倍或更大、約0.7倍或更大、約1.0倍或更大、約10倍或更大、約20倍或更大、約30倍或更大、約40 倍或更大、約50倍或更大、約60倍或更大、約70倍或更大、約80倍或更大、約90倍或更大、約100倍或更大、約130倍或更大、約150倍或更大、以及約200倍或更高的結合親和力，但結合親和力的數值不受限制，只要和天然介白素-2或阿地介白素相比，結合親和力有變化或增加，都屬於本發明的範圍。
在本發明中，癌症可以是選自結腸直腸癌、肝癌、卵巢癌、胰癌、膽囊癌、腎癌、肺癌、皮膚癌、黑色素瘤、乳癌、膀胱癌和胃癌，或者可以是轉移性癌症，但不限於此。它還可能包括轉移性腎細胞癌或轉移性黑色素瘤。
如本發明所述，用語「預防」是指透過施用介白素-2類似物(例如介白素-2類似物本身或長效接合物形式，其中一種生物相容性材料結合到其上)，或包含其之組成物。
如本發明所述，用語「治療」是指透過施用介白素-2類似物(例如介白素-2類似物本身或其上結合有生物相容性材料)，或包含其之組成物。
使用本發明的介白素-2類似物或其長效接合物具有很大的優勢，由於其血液暴露、血中半衰期和體內藥效持續時間顯著增加，因而可透過減少對每天施用的慢性患者的給藥次數來改善患者的生活品質。
本發明的醫藥組成物還可包含藥學上可接受的載體或稀釋劑。此類藥學上可接受的載體或稀釋劑可以是非天然存在的。
如本發明所述，用語「藥學上可接受的」是指足以顯示治療效果而不引起副作用的量，並且可以由本領域技術人員基於醫學領域眾所周知的要素輕易地判定，例如疾病類型、患者年齡、體重、健康狀況、性別、對藥物的敏感性、給藥途徑、給藥方法、給藥頻率、治療時間、聯合或併用藥物。
包含本發明的介白素-2類似物或其長效接合物的醫藥組成物還 可包含藥學上可接受的賦形劑。儘管賦形劑沒有特別限制，但黏合劑、潤滑劑、崩解劑、增溶劑、分散劑、穩定劑、助懸劑、著色劑和調味劑可用於口服給藥、緩衝劑、防腐劑、鎮痛劑、增溶劑、等滲劑和穩定劑可以組合用於注射劑中，局部給藥時可以使用基質、賦形劑、潤滑劑、防腐劑等。
本發明的組成物可以與上述藥學上可接受的賦形劑組合製成各種形式。例如，對於口服給藥，可以將組成物配製成錠劑、含片、膠囊、酏劑、混懸劑、糖漿劑、薄片等。對於可注射製劑，可以將組成物配製成單劑量安瓿或多劑量形式。該組成物還可配製成溶液、混懸劑、錠劑、丸劑、膠囊劑、緩釋製劑等。
同時，適用於製劑的載體、賦形劑和稀釋劑的實例可以包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、澱粉、阿拉伯膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸鎂或礦物油。此外，該組成物還可包含填充劑、抗凝劑、潤滑劑、保濕劑、調味劑、防腐劑等。
另外，本發明的醫藥組成物可以具有選自錠劑、丸劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑、混懸劑、內服劑、乳劑、糖漿劑、滅菌水性溶液、非水溶劑、凍乾製劑和栓劑所成群組的任一種劑型。
再者，根據本領域常用的方法，該組成物可以配製成適合施用到患者體內的單位劑型，特別是用於施用蛋白質藥物的形式，並透過口服給藥途徑或透過腸胃外給藥途徑給藥。使用本領域常用的給藥方法的皮內、靜脈內、肌肉內、動脈內、髓內、鞘內、心室內、肺內、經皮、皮下、腹膜內、鼻內、腸內、 局部、舌下、陰道或直腸給藥途徑，但不限於此。
此外，該結合物可以與允許作為藥物的各種載體組合使用，例如鹽水溶液或有機溶劑。作為藥物，可以使用葡萄糖、蔗糖或葡聚醣等碳水化合物、抗壞血酸或穀胱甘肽等抗氧化劑、螯合劑、低分子量蛋白質或其他穩定劑來提高穩定性或吸收性。
實施本發明的另一個方面提供一種預防或治療癌症的方法，包括向有需要的個體施用介白素-2類似物、其長效接合物或包含其之醫藥組成物。
該介白素-2類似物及/或介白素-2類似物的長效接合物、包括其之組成物、癌症、預防和治療如上所述。
如本發明所述，個體是指患有癌症或疑似患有癌症的個體，並且可以指哺乳動物，例如人、大鼠、家畜等，但是可以用介白素-2類似物及/或可以包括但不限於接合物或包含其之組成物。
如本發明所述，用語「給藥」是指透過適當方式將特定材料(例如，介白素-2類似物或其長效接合物)引入患者。組成物可以但不特別限於透過能夠將組成物遞送至體內靶組織的一般途徑施用，例如腹膜內、靜脈內、肌內、皮下、皮內、口服、局部、鼻內、肺內和直腸內給藥。
本發明的方法可以包括以藥學有效量施用包含介白素-2類似物或其長效接合物的醫藥組成物。合適的每日總劑量應由醫生在適當的醫學判斷範圍內確定，並分次給藥一次或數次。為了本發明的目的，對於任何特定患者的特定治療有效劑量可以較佳的應用，取決於醫學領域中眾所周知的各種因素，包括要實現的反應的種類和程度，特定的組成物，包括其他藥物是否偶爾與其一起使用，患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食、給藥時間和途徑、組成 物的分泌率、治療持續時間、與藥物聯合或同時使用的其他藥物特定的成分，以及醫學領域中眾所周知的類似因素。
在本發明的方法中，給藥的劑量和頻率是根據藥物的種類、活性成分以及治療疾病、給藥途徑、患者年齡、性別、體重和疾病嚴重程度等相關因素確定。具體而言，本發明的組成物可以包括藥學有效量的介白素-2類似物或包含其之長效接合物，但不限於此。
以藥學有效量包含介白素-2類似物或長效接合物意味著由於介白素-2類似物或長效接合物可獲得所需藥理活性(例如預防、改善或治療癌症)的程度。或可以表示藥學上可接受的水平，即不會在給藥個體中引起毒性或副作用的水平，但不限於此。這樣的藥學有效量可以考慮給藥頻率、患者、製劑等加以綜合判定。
本發明的醫藥組成物可包含重量對體積為0.01%至99%的組分(活性成分)，但不特別限於此。
本發明的組成物的總有效劑量可以單劑量給予患者，或者可以根據分次治療方案以多劑量長期給予。在本發明的醫藥組成物中，活性成分的含量可以根據疾病的嚴重程度而變化。具體而言，本發明的介白素-2類似物或其長效接合物的較佳總日劑量可為每1kg患者體重約0.0001mg至500mg。然而，介白素-2類似物或其接合物的有效劑量除了藥物成分的給藥途徑外，還要考慮各種因素，包括患者的年齡、體重、健康狀況、性別、疾病嚴重程度、飲食和排泄率和治療頻率。在這方面，本領域技術人員可以輕易地確定適用於本發明組成物的特定用途的有效劑量。根據本發明的醫藥組成物只要能發揮本發明的效果，其劑型、給藥途徑、方式等並無特別限定。
本發明的醫藥組成物可具有優異的體內持續時間和效價，從而顯著降低本發明藥物製劑的給藥次數和頻率。醫藥組成物可以透過腹膜內、靜脈內、肌內、皮下、皮內、口服、局部、鼻內、肺內或直腸內途徑給藥，但給藥不限於特定的給藥途徑，只要可以達到所需的藥理作用即可。
在一個示例中，本發明的醫藥組成物可以每週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次或每月一次施用，或者可以時間間隔施用一次或多次，範圍從1週到1個月不等，但頻率不限於此。
實施本發明的又一個方面提供介白素-2類似物、其長效接合物或包含其之組成物在製備用於預防或治療癌症的藥物。
該介白素-2類似物及/或其長效接合物，或包含其之組成物，在癌症、預防、治療、給藥途徑和給藥頻率與上述相同。
實施本發明的又一方面提供介白素-2類似物、其長效接合物或包含其之組成物在預防或治療癌症中的用途。
介白素-2類似物及/或其長效接合物，或包含其之組成物，在癌症、預防、治療、給藥途徑和給藥頻率與上述相同。
同時，除非在本說明書中上下文另有要求，諸如「包括」、「包括」、「包含」等表達是指它們包括指定的整數或整數組，但應理解這些表達並不排除其他整數或一組整數。
在下文中，將參照下述實施例更詳細地描述本發明。然而，這些實施例僅用於更詳細地描述本發明，本發明的範圍不受這些實施例的限制。
實施例1：天然介白素-2和介白素-2類似物的表達載體的製備
為了製備編碼133個胺基酸的天然介白素-2的表達載體，將基於報導的介白素-2序列(NM_000586.3；SEQ ID NO：1)合成的介白素-2克隆到pET-22b載體中(Novagen)。此外，製備一種新穎的介白素-2類似物，其中介白素-2的一個或多個胺基酸使用介白素-2作為模板進行修飾。
介白素-2類似物擴增的PCR條件為由95℃進行30秒、55℃進行60秒和65℃進行6.5分鐘所組成的過程的16個循環。為確認目標位置的胺基酸是否被正確替換，對在上述條件下獲得的誘變產物進行序列分析。結果，證實了在每種介白素-2類似物的所需突變位置處基於天然類型發現如下表1中所示的修飾。將由此獲得的表達載體命名為pET22b-介白素-2類似物1至105。
下述表1顯示改變的胺基酸序列和各類似物名稱。為製備這些介白素-2類似物，合成了正向(F)和反向(R)引子，然後進行PCR以擴增各類似物基因。
在下表1中，類似物1代表阿地介白素，以及引子nos.1至204分別對應於SEQ ID NOS：214至417。
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在上表1中，desA1代表丙胺酸的缺失，丙胺酸是介白素-2中的第一個胺基酸。
下述表2顯示介白素-2類似物的全長蛋白質序列。表2中以粗體顯示的字母代表修飾的位置。
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實施例2：介白素-2類似物的表達
使用實施例1中製備的表達載體表達T7啟動子控制下的重組介白素-2類似物。表達大腸桿菌菌株，大腸桿菌BL21DE3(E.coli B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-)galλ(DE3)；Novagen)經每種重組介白素-2類似物表達載體轉化。至於轉化方法，使用的是Novagen推薦的方法。收集轉化各重組表達載體的各單個菌落，接種到含有胺芐青黴素(50μg/mL)的2X Luria Broth培養基中，37℃培養15小時。將每種重組菌株培養液和含有30%甘油的2X LB培養基以1：1(v/v)的比例混合，並將每1mL混合物分裝到冷凍管中，並在-150℃下保存。這被用作生產重組蛋白的細胞原液。
對於每種重組介白素-2類似物的表達，將每種細胞原液各取一小瓶溶解，接種到500mL 2X LB中，並在37℃下振盪培養14至16小時。當600nm的吸光度值達到4.0或是更高時，終止培養，將其用作種子培養液。將種子培養物接種到1.6L發酵培養基中，並使用5L發酵罐(Bioflo-320，NBS，USA)開始初始發酵。使用37℃的溫度、2.0L/min(1vvm)的空氣體積、650rpm的攪拌速度和30%的氨水溶液，將培養條件維持在pH值6.70。至於發酵過程，當培養基中的營養成分有限時，透過添加額外的培養基(補料溶液)進行補料分批培養。透過吸光度觀察菌株的生長，在吸光度值為70或更高時，引入終濃度為500μM的IPTG。進一步進行培養直至導入IPTG後約23~25小時，結束培養後，使用離心機回收重組菌株，在-80℃保存直至使用。
實施例3：介白素-2類似物的提取和重折疊
為了將來自實施例2中獲得的表達介白素-2類似物的大腸桿菌中的介白素-2類似物轉化為可溶形式，將細胞破碎並重新折疊。將對應於100mL培養物的細胞沉澱懸浮在1-200mL裂解緩衝溶液(20mM Tris-HCl(pH 9.0)，1mM EDTA(pH 9.0)，0.2M NaCl，0.5% Triton X-100)，並使用微流化器在15,000psi下破壞重組大腸桿菌細胞。在13,900g離心30分鐘後，棄去上清液，用400mL第一洗滌緩衝溶液(50mM Tris-HCl(pH 8.0)，5mM EDTA(pH 9.0))洗滌沉澱。在與上述相同的條件下離心後，棄去上清液，並用400mL的第二洗滌緩衝溶液(50mM Tris-HCl(pH 8.0)，5mM EDTA(pH 9.0)，2% Triton X-100)洗滌顆粒。在與上述相同的條件下離心後，棄去上清液，將沉澱用400mL第三種洗滌緩衝液(50mM Tris-HCl(pH 8.0)，5mM EDTA(pH 9.0)，1%脫氧膽酸鈉)洗滌顆粒。在與上述相同的條件下離心後，棄去上清液，用400mL第四洗滌緩衝液(50mM Tris-HCl(pH 8.0)，5mM EDTA(pH 9.0)，1M NaCl)洗滌顆粒。將所得物在與上述相同的條件下進行離心和洗滌，由此獲得大腸桿菌包涵體。將洗滌過的包涵體沉澱重新懸浮在400mL可溶性/還原緩衝液(6M胍，100mM Tris(pH 8.0)，2mM EDTA(pH 9.0)，50mM DTT)中，並在50℃下攪拌30分鐘。向可溶性/還原型介白素-2類似物加入100mL蒸餾水，將6M胍稀釋成4.8M胍，然後以13,900g離心30分鐘，移除沉澱，僅獲得其中的溶液。向稀釋溶液中額外加入185.7mL蒸餾水，將4.8M胍稀釋至3.5M胍，並使用100%乙酸將pH調節至5.0。將調節pH的溶液在室溫攪拌1小時。將含有沉澱雜質的溶液以13,900g離心30分鐘，棄去上清液並用最終洗滌緩衝溶液(3.5M胍，20mM乙酸鈉(pH 5.0)，5mM DTT)洗滌沉澱。將所得物在與上述相同的條 件下離心以獲得顆粒。將洗滌過的介白素-2類似物溶解在400mL重折疊緩衝溶液(6mM胍，100mM Tris(pH 8.0)，0.1mM CuCl2)中。藉由在4℃攪拌混合溶液15至24小時來進行重折疊處理。
實施例4：尺寸排阻管柱層析法
將實施例3中獲得的介白素-2類似物重折疊溶液濃縮至小於1mL，上樣到尺寸排阻管柱進行純化。該管柱在引入重折疊溶液之前以緩衝溶液(2M胍，100mM Tris(pH 8.0))平衡，並在引入重折疊溶液之後透過向其流動緩衝溶液來洗脫。由於洗脫的樣本中含有胍，因此將其替換為穩定溶液(10mM乙酸鈉(pH 4.5)，5%海藻糖)，並藉RP-HPLC和肽圖分析測量純度。樣本在其測量純度達到80%或更高時用於實驗中。
實施例5：評估介白素-2類似物對受體的結合親和力
為測量實施例4中獲得的介白素-2類似物對介白素-2α受體和β受體中的每一種的結合親和力，使用表面等離子體共振測量(BIACORE T200，GE Healthcare)。量測製備的類似物對α受體和β受體的結合親和力，並將每種製備的類似物的結合親和力與介白素-2類似物1(阿地介白素)的結合親和力進行比較。
首先，將抗人免疫球蛋白抗體(Abcam，#ab97221)透過胺偶聯以約5,000 RU(共振單位)固定在CM5晶片(GE Healthcare)上，然後，藉著免疫球蛋白抗體最終係，允許介白素-2α受體(SYMANSIS，#4102H)或介白素-2β受體(SYMANSIS，#4122H)透過抗原-抗體結合反應與每個疫球蛋白抗體，其中每個受體都結合了人免疫球蛋白Fc區，來加以固定化。此後，將上述製備的重組介白素-2類似物用不同濃度的兩倍連續稀釋法稀釋至HBS-P+緩衝液(Cytiva， BR100671)，並流到CM5晶片上，介白素-2受體最終流入CM5晶片並被固定，以測量每個介白素-2受體的結合親和力。結合親和力的測量包括結合速率常數(ka)和解離速率常數(kd)的測量，其中，結合速率是藉由以10μL/min的流速流動每個介白素-2類似物持續3分鐘來測量。而透過僅在相同時間段和相同流速下流動HBS-P+緩衝液來測量各介白素-2受體的解離速率。測量完成後，根據Biaevaluation程序中的1：1結合擬合模型對受體的結合親和力進行評估。
相對結合親和力(KD)(%)=類似物1(阿地介白素)的結合親和力(KD)/類似物的結合親和力(KD)×100
在下表3中，用語「無法定義」表示不能定義相應受體的相應物理量，因為在表面等離子共振測量中沒有觀察到其與受體的結合。
Figure 111112574-A0202-12-0125-54
Figure 111112574-A0202-12-0126-55
Figure 111112574-A0202-12-0127-56
Figure 111112574-A0202-12-0128-57
如測試結果(圖1和2及表3)中所明確顯示，證實本發明的介白素-2類似物和介白素-2類似物1等相比，對介白素-2α受體沒有結合親和力、降低/增加的結合親和力。因此，與天然介白素-2或阿地介白素相比，顯示出對介白素2α受體的結合親和力有所改變。相反地，對於介白素-2β受體，本發明的介白素-2類 似物與天然介白素-2或阿地介白素相比，展現出高達100倍的更強結合親和力。根據以上結果，確認了介白素-2類似物的胺基酸序列對其與介白素-2α或β受體的結合有影響。這些結果表明，可以透過在特定位置取代胺基酸來改變對介白素-2受體的結合親和力。
這些實驗結果表明，根據本發明的介白素-2類似物對介白素-2α受體和介白素-2β受體的結合親和力有所改變，因此可用於開發基於它們的各種藥物。
實施例6：介白素-2類似物和聚乙二醇(3.4K PEG)連接子的偶聯反應和介白素-2類似物連接材料的純化
為製備在實施例4中獲得的介白素-2類似物與免疫球蛋白Fc區結合的長效接合物，首先製備介白素-2類似物與聚乙二醇(PEG)接頭的一端連接的連接材料。。介白素-2類似物21、41、52、86、104和105用於製備連接材料，作為PEG連接子，聚乙二醇(日本NOF製造的ALD(2)3.4K PEG)分子量為3.4kDa且兩端的羥基氫被丙醛基團修飾，被接合至介白素-2類似物的N端。介白素-2類似物：PEG連接子的莫耳比為1：15至1：20，它們在2℃至10℃反應1小時，而介白素-2類似物的濃度為1mg/mL或更低。在此，反應在100mM磷酸鉀(pH 5.5)下進行，加入20mM氰基硼氫化鈉(SCB)作為還原劑。使用脫鹽管柱將反應溶液改為20mM三乙胺(pH 8.0)緩衝液後，藉Fractogel® EMD TMAE(S)(Merck Millipore)或Source 15Q(Cytiva)管柱，使用三乙胺(pH 8.0)和氯化鈉的濃度梯度進行純化，，獲得白細胞介素2類似物3.4K PEG連接材料。
實施例7：製備介白素-2類似物-3.4K PEG-免疫球蛋白Fc區的長效接合物
為製備介白素-2類似物-3.4K PEG-免疫球蛋白Fc區的長效接合物，使用實 施例6的方法獲得的介白素-2類似物-3.4K PEG連接材料與免疫球蛋白Fc區的莫耳比(SEQ ID NO：438)設定為1：10，總蛋白濃度設定為30mg/mL，在2℃至10℃反應15至16小時。在此，使用100mM磷酸鉀(pH 6.0)作為反應溶液，添加20mM氰基硼氫化鈉作為還原劑。在此時使用的免疫球蛋白區域中，具有SEQ ID NO：423的胺基酸序列的兩個單體(由221個胺基酸組成)在半胱胺酸之間藉雙硫鍵形成同型二聚體，即各單體的第3個胺基酸，且該同型二聚體的單體各自獨立地在位置35及95的半胱胺酸間形成內雙硫鍵，以及在位置141及199的半胱胺酸間形成內雙硫鍵。
Figure 111112574-A0202-12-0130-58
反應完成後，使用Bis-Tris(pH 6.5)和氯化鈉藉由丁基FF(Cytiva)從反應溶液中去除未反應的免疫球蛋白Fc區，並使用檸檬酸鈉緩衝液(pH 5.5)和純化反應溶液並以硫酸銨透過Source 15ISO(Cytiva)獲得介白素-2類似物-3.4K PEG-免疫球蛋白Fc區接合物(長效接合物)，其中介白素-2類似物的N 端連接到3.4kDa PEG連接子，3.4kDa PEG連接子的另一端與Fc區的N端脯胺酸的氮相連。以SDS-PAGE、RP-HPLC及SE-HPLC分析該長效接合物(圖1和2)。
實施例8：評估介白素-2類似物接合物的介白素-2受體結合親和力
以表面等離子體共振(Surface plasma resonance)(SPR，BIACORE T200，GE Healthcare)測量實施例7中獲得的介白素-2類似物長效接合物與介白素-2α和β受體各自的受體結合親和力。
具體而言，將生物素標記的人類介白素-2受體α和β次單元(ACROBiosystems)分別以約100 RU和500 RU固定在鏈親和素親和素生物感測器晶片(SA晶片，Cytiva)上，使用兩倍稀釋法稀釋在HBS-EP+緩衝液(Cytiva，BR100669)的介白素-2類似物長效接合物或阿地介白素以20μL/min的流速流動。結合步驟3分鐘後，僅HBS-EP+緩衝液以相同流速流動3分鐘，以誘導介白素-2類似物長效接合物或阿地介白素從介白素-2受體上解離，結合親和力係透過獲得的締合常數和解離常數計算。根據Biaevaluation程序中的1：1結合擬合模型評估受體的結合親和力。確認所評估的介白素-2類似物接合物的內在介白素-2受體結合親和力，特別是在介白素-2受體α次單元中證實了每種候選物質之間的結合親和力的明顯差異。詳細參考結果，介白素-2類似物接合物21和52不與介白素-2受體α次單元結合，介白素類似物接合物41、86、104和105與阿地介白素相比，顯示出50.8%、65.2%、81.0%和112.9%的相對結合親和力。在介白素-2受體β次單元的情況中，與阿地介白素相比，所有介白素-2類似物接合物(包括介白素-2類似物接合物21和52)均證實了具有更高的結合親和力。
總結每種α和β受體製備的介白素-2類似物長效接合物相較於阿地介白素之結合親和力的相對結合親和力(%)。在表5中，相應的長效接合物由構成其的介白素-2類似物的編號表示(例如，介白素-2類似物21的長效接合物表示為「介白素-2類似物接合物21」)。
Figure 111112574-A0202-12-0132-59
實施例9：介白素-2類似物長效接合物的藥物動力學評估
基於實施例5和7中證實的介白素-2類似物，確認使用介白素-2類似物和長效接合物的藥物是否具有優異的血液暴露和生物利用度，以及包括其的長效接合物對介白素-2受體的結合能力。
具體而言，本發明人在ICR和C57BL/6正常譜系小鼠模型中比較並分析介白素-2類似物長效接合物和阿地介白素的藥物動力學。
更具體地，對照組中將阿地介白素，以及實驗組中將介白素-2類似物接合物(介白素-2類似物接合物21、介白素-2類似物接合物41、介白素-2類似物接合物52、介白素-2類似物接合物86、介白素-2類似物接合物104及介白素-2類似物接合物105)以皮下、靜脈內或腹膜內注射至正常小鼠中。在經皮下注射介白素-2類似物結合物的組別中，在1、4、8、24、48、72和96小時後透過眼眶後採血從3隻動物中抽取血液，並且透過靜脈內或腹腔內途徑給予阿地介白素的組別中，在0.08、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8和24小時以相同方式從3隻動物中抽取血液。將取自各組的血液離心分離成血清，使用人介白素-2抗體，藉ELISA對血液中的介白素-2類似物接合物和阿地介白素進行定量。結果，與阿地介白素相比，介白素-2類似物接合物在ICR和C57BL/6正常譜系小鼠中表現出更高的血液暴露水平(圖3，表6和7)。下表所示的接合物的劑量、AUC和濃度值中，接合物的量(mg、ng)僅根據整個接合物中介白素-2類似物區域所佔的重量來表示。
Figure 111112574-A0202-12-0134-60
Figure 111112574-A0202-12-0134-61
從上述結果可以看出，儘管經皮下途徑給藥，與經靜脈內或腹膜內注射的阿地介白素相比，根據本發明的介白素-2類似物接合物表現出更高的血中分佈。此等結果表明，當給藥時，與人重組介白素-2相比，即使給藥量較少，介白素-2類似物接合物暴露於血液中的量較高，確保了給藥的便利性。
實施例10：介白素-2類似物長效接合物的抗癌功效評估
為了研究介白素-2類似物接合物的治療效果，在每次將介白素-2類似物接合物21、介白素-2類似物接合物41和介白素-2類似物52，以及作為對照材料的阿地介白素給藥至CT26結腸腫瘤同源小鼠模型後，評估腫瘤大小和個體死亡率。
具體而言，將在細胞培養瓶中培養的CT26細胞(ATCC)以皮下注射到BALB/c小鼠的腿部，幾天後，以肉眼觀察腫瘤，每組分配7隻小鼠以使腫瘤大小相似。各組經皮下途徑每週一次重複施用0.5mg/kg的介白素-2類似物接合物21、介白素-2類似物接合物41和介白素-2類似物接合物52，總共兩次。在此，長效接合物的劑量僅代表對應的接合物中之介白素-2類似物區域的重量。在阿地介白素給藥組中，由腹膜內途徑給予3.0mg/kg的普留淨(Proleukin)(Novartis)，每天1次，連續5天，休息兩天後，按照相同的時間程追加給藥5天。
從第一次給藥日起觀察體重和個體死亡32天，並且基於結果，在所有介白素-2類似物接合物給藥組中證實了優異的抗癌功效。特別地，在給予介白素-2類似物接合物41的組別中所有個體均觀察到完全緩解。相反，在給予阿地介白素的組別中，7隻小鼠中有2隻死亡，而只有2隻小鼠表現出完全緩解。可以理解為，本發明的介白素-2類似物接合物透過改變胺基酸序列與人介白素-2受體β次單元強力結合，從而表現出優異的抗癌作用(圖4)。此外，人免疫球蛋白Fc區所連接的長效接合物結構能夠實現高血液暴露而延長給藥間隔，從而表明可藉由將傳統的注射療法轉變為皮下途徑，為患者和醫療人員帶來給藥的便利性。
實施例11：根據腫瘤的重複暴露評估記憶T細胞反應
在實施例10的抗癌功效評估之後，評估記憶T細胞對腫瘤反覆暴露的反應。具體而言，對於在完成抗癌效果評估後確認完全緩解的個體，在第一次給藥後42天和70天，以與第一次暴露相同的方式皮下給予CT26細胞作為再次暴露並觀察腫瘤生長情況。在第二次再暴露後的第4天和第7天，使用FACS Canto II(Becton Dickinson)設備分析來自小鼠脾臟的記憶T細胞的數量。
結果，在除陰性對照組之外的所有給藥組中，根據再次暴露抑制了腫瘤生長，並且在脾臟中觀察到記憶T細胞顯著增加(圖5)。總之，根據本發明的介白素-2類似物接合物僅以單一劑便在CT26結腸腫瘤同源小鼠模型中誘導了記憶免疫反應，因此，不僅在第一次腫瘤暴露中而且在腫瘤的再次暴露中都維持了強大的抗癌功效。
實施例12：評估介白素-2類似物長效接合物在惡性黑色素瘤中的抗癌功效
為了評估根據本發明的介白素-2類似物接合物的抗癌功效，將該介白素-2類似物接合物86和作為對照材料的阿地介白素分別給藥至B16F10黑色素瘤腫瘤同源小鼠模型以評估腫瘤大小和個體存活率。
具體而言，將在細胞培養瓶中培養的B16F10細胞(ATCC)經皮下注射到C57BL/6小鼠的大腿中，幾天後以肉眼觀察腫瘤，每組分配9隻小鼠以使腫瘤大小相似。在長效接合物中，基於介白素-2類似物區域的重量，將0.08mg/kg至10mg/kg的介白素-2類似物接合物86個別以皮下給藥，每週一次，共重複4次。此外，在作為對照組的阿地介白素給藥組中，經腹膜內途徑給予3.0mg/kg的普留淨(Proleukin)(Novartis)，每天1次，連續5天，隨後休息2天，重複給藥一共4次。
從第一個給藥日起第15天，觀察各組的腫瘤大小(圖6A)和每個個體60天的存活率(圖6B)。結果證實，與給予阿地介白素的組別相比，給予本發明的介白素-2類似物接合物86的組別具有更小的腫瘤尺寸和提高的個體存活率，證實本發明的長效接合物長期的劑量依賴性抗癌功效。特別地，在每週給予4.0mg/kg或更高劑量的介白素-2類似物接合物86的組別中，在一些個體中觀察到完全緩解和腫瘤完全消除。相反，在以阿地介白素3.0mg/kg連續給藥5天的組別中，任何個體均未發現完全緩解。
這代表本發明的介白素-2類似物接合物被設計為具有能與人介白素-2受體的β次單元結合的特色，且與阿地介白素相比，與該次單元的結合力較強，因此可以展現優異的抗癌效果。此外，其透過與人介白素-2受體的α次單元結合，有效地控制過度免疫反應，而不會引起不欲之副作用，因此，根據長效接合物中介白素-2類似物區域的重量，即使在10mg/kg或更高的高劑量組中也沒有觀察到任何副作用。
上述實驗結果顯示，根據本發明的包括其中將胺基酸突變引入天然介白素-2之介白素-2類似物的長效接合物具有改變的對於介白素-2α受體之結合親和力，及對於介白素-2β受體之結合親和力，從而表明它可用於利用該接合物開發各種藥物，尤其是抗癌藥物的開發。
基於以上描述，本領域技術人員將理解，本發明可以不同的具體形式實施而不改變其技術精神或本質特徵。在這點上，應理解上述實施例並非限制性者，而是在所有方面均為例示性者。本發明揭露的範圍由所附申請專利範圍加以定義而非由之前的描述來定義，因此，所有變動及修改皆落入申請專利範圍之內或與其同等的範圍，其旨在被申請專利範圍所涵蓋之。
Figure 111112574-A0202-11-0001-1

Claims (32)

  1. 一種長效接合物，其係包含由下述化學式1表示的介白素-2類似物之長效接合物：
    [化學式1]X-La-F
    其中，X係與阿地介白素相比，對介白素-2β受體具有增加的結合親和力之介白素-2類似物；
    L為聚乙二醇連接子；
    a為0或自然數，條件為當a為2或更大時，每個L彼此獨立；
    F為二聚體形式的免疫球蛋白Fc區；以及
    - 表示X與L之間以及L與F之間的共價鍵；
    其中，該介白素-2類似物包含對應於天然介白素-2之位置1、12、18、19、20、22、32、35、38、42、43、45、48、49、61、68、69、74、76、80、81、82、84、85、86、87、88、89、91、92、94、95、96、125、126及133的一個或多個胺基酸經過修飾的序列。
  2. 如請求項1項所述之長效接合物，其中，與阿地介白素相比，該介白素-2類似物對介白素-2α受體具有改變之結合親和力。
  3. 如請求項1所述之長效接合物，其中，一個或多個胺基酸經加成至對應於位置133之胺基酸。
  4. 如請求項1所述之長效接合物，其中，該介白素-2類似物係天然介白素-2類似物中位置1之胺基酸經移除且位置125之胺基酸由不同胺基酸取代者。
  5. 如請求項4所述之長效接合物，其中，該介白素-2類似物進一步包含1至10個胺基酸取代。
  6. 如請求項5所述之長效接合物，其中，該介白素-2類似物包含位置18、19、20、22、38、42、43、45、61、68、69、74、80、81、84、85、86、88、89、91、92、94及96的一個或多個胺基酸進一步由不同胺基酸所取代者。
  7. 如請求項5所述之長效接合物，其中，該介白素-2類似物包含位置18、22、38、42、61、68、80、81、85、86及92的一個或多個胺基酸進一步由不同胺基酸所取代者。
  8. 如請求項1所述之長效接合物，其中，該介白素-2類似物為下列類似物中之任一者：
    (a)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125及32之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (b)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125及35之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (c)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125及38之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (d)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125及42之胺基酸經由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (e)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125及43之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (f)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125及48之胺基酸經由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (g)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125及49之胺基酸經由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (h)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125及76之胺基酸經由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (i)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、81、92、94及96之胺基酸經由不同胺基酸所取代類似物；
    (j)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125及87由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (k)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38及42之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (l)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38及80之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (m)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38及84之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (n)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、19、38及42之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (o)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、12、38及42之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (p)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42及61之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (q)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42及84之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (r)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42及88之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (s)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42及89之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (t)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42及91之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (u)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42及94之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (v)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42及126之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (w)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、80及84之胺基酸經由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (x)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、94及96之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (y)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (z)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、61、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (aa)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (ab)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、80、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (ac)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、81、84及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (ad)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、20、38、42、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (ae)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、80、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (af)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、74、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (ag)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、81、84及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (ah)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、81、88及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (ai)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (aj)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、80、81、85及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (ak)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且胺基酸位置125、38、80、81、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (al)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (am)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、45、74、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (an)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、74、80、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物-2；
    (ao)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、80、81、84及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (ap)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、45、80、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (aq)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (ar)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、42、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (as)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、61、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (at)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、69、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (au)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、80、81、85、86、91及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (av)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、18、22、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (aw)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (ax)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除之胺基酸經移除並且位置125、38、42、45、74、80、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (ay)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、68、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (az)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、69、74、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (ba)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、80、81、84、85、86、91及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (bb)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、80、81、85、86、92、94及96之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (bc)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、18、19、22、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (bd)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、18、22、38、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (be)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、18、22、61、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (bf)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、18、22、68、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (bg)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、35、38、42、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (bh)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、45、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (bi)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、80、81、85、86、91及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (bj)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、80、81、85、86、92及95之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (bk)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、35、38、42、74、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (bl)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、43、61、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (bm)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、80、81、85、86、91、92及95之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (bn)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、35、38、42、74、80、81、82、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (bo)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、80、81、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (bp)天然介白素-2中位置1之胺基酸經移除並且位置125、80、81、85及86之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物。
  9. 如請求項8所述之長效接合物，其中，該胺基酸取代係選自由下列胺基酸取代所組成的群組之任一者：
    (a)位置12之胺基酸取代為纈胺酸或苯丙胺酸之取代；
    (b)位置18之胺基酸取代為精胺酸之取代；
    (c)位置19之胺基酸取代為酪胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸或精胺酸之取代；
    (d)位置20之胺基酸取代為纈胺酸或苯丙胺酸之取代；
    (e)位置22之胺基酸取代為麩胺酸所取代；
    (f)位置32之胺基酸取代為半胱胺酸之取代；
    (g)位置35之胺基酸取代為半胱胺酸或麩胺酸之取代；
    (h)位置38之胺基酸取代為丙胺酸或天門冬胺酸之取代；
    (i)位置42之胺基酸取代為離胺酸、丙胺酸或色胺酸之取代；
    (j)位置43之胺基酸取代為半胱胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸之取代；
    (k)位置45之胺基酸取代為丙胺酸之取代；
    (l)位置48之胺基酸取代為半胱胺酸之取代；
    (m)位置49之胺基酸取代為半胱胺酸之取代；
    (n)位置61之胺基酸取代為麩醯胺酸、精胺酸或天門冬胺酸之取代；
    (o)位置68之胺基酸取代為天門冬胺酸或麩醯胺酸之取代；
    (p)位置69之胺基酸取代為甘胺酸之取代；
    (q)位置74之胺基酸取代為組胺酸或丙胺酸之取代；
    (r)位置76之胺基酸取代為半胱胺酸之取代；
    (s)位置80之胺基酸取代為苯丙胺酸、酪胺酸、纈胺酸、天門冬胺酸或色胺酸之取代；
    (t)位置81之胺基酸取代為天門冬胺酸、麩胺酸或天門冬醯胺之取代；
    (u)位置82之胺基酸取代為甘胺酸或纈胺酸之取代；
    (v)位置84之胺基酸取代為麩胺酸、纈胺酸或苯丙胺酸之取代；
    (w)位置85之胺基酸取代為纈胺酸、丙胺酸、甘胺酸、色胺酸、酪胺酸、蘇胺酸、異白胺酸、麩胺酸或苯丙胺酸之取代；
    (x)位置86之胺基酸取代為纈胺酸、丙胺酸、甘胺酸或白胺酸之取代；
    (y)位置87之胺基酸取代為半胱胺酸之取代；
    (z)位置88之胺基酸取代為麩醯胺酸、纈胺酸或苯丙胺酸之取代；
    (aa)位置89之胺基酸取代為苯丙胺酸之取代；
    (ab)位置91之胺基酸取代為蘇胺酸、苯丙胺酸或麩胺酸之取代；
    (ac)位置92之胺基酸取代為苯丙胺酸、白胺酸、酪胺酸或色胺酸之取代；
    (ad)位置94之胺基酸取代為苯丙胺酸或纈胺酸之取代；
    (ae)位置95之胺基酸取代為天門冬胺酸之取代；
    (af)位置96之胺基酸取代為苯丙胺酸、纈胺酸或異白胺酸之取代；
    (ag)位置125之胺基酸取代為絲胺酸之取代；及
    (ah)位置126之胺基酸取代為蘇胺酸之取代。
  10. 如請求項8所述之長效接合物，其中，該介白素-2類似物係下列類似物之任一者：
    (a)天然介白素-2類似物中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、80、81及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (b)天然介白素-2類似物中位置1之胺基酸經移除並且位置125、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (c)天然介白素-2類似物中位置1之胺基酸經移除並且位置125、18、22、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (d)天然介白素-2類似物中位置1之胺基酸經移除並且位置125、38、42、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (e)天然介白素-2類似物中位置1之胺基酸經移除並且位置125、18、22、61、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物；
    (f)天然介白素-2類似物中位置1之胺基酸經移除並且位置125、18、22、68、80、81、85、86及92之胺基酸由不同胺基酸所取代之介白素-2類似物。
  11. 如請求項10所述之長效接合物，其中，該胺基酸取代係由下列胺基酸取代所組成的群組選出之任一者：
    (a)位置18之胺基酸取代為精胺酸之取代；
    (b)位置22之胺基酸取代為麩胺酸之取代；
    (c)位置38之胺基酸取代為丙胺酸之取代；
    (d)位置42之胺基酸取代為離胺酸之取代；
    (e)位置61之胺基酸取代為天門冬胺酸之取代；
    (f)位置68之胺基酸取代為天門冬胺酸之取代；
    (g)位置80之胺基酸取代為苯丙胺酸之取代；
    (h)位置81之胺基酸取代為麩胺酸之取代；
    (i)位置85之胺基酸取代為纈胺酸之取代；
    (j)位置86之胺基酸取代為纈胺酸之取代；
    (k)位置92之胺基酸取代為苯丙胺酸之取代；及
    (l)位置125之胺基酸取代為絲胺酸之取代。
  12. 如請求項1所述之長效接合物，其中，該免疫球蛋白Fc區係衍生自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或其組合，或其雜合體。
  13. 如請求項1所述之長效接合物，其中，該免疫球蛋白Fc區為IgG4區。
  14. 如請求項1所述之長效接合物，其中，該免疫球蛋白Fc區為非糖基化者。
  15. 如請求項1所述之長效接合物，其中，該L含有乙二醇重複單元，以及該乙二醇重複單元部分的式量為範圍1kDa至100kDa。
  16. 如請求項1項所述之長效接合物，其中，該長效接合物係一個X分子藉由聚乙二醇連接子與二聚體免疫球蛋白Fc區的一個Fc區共價鍵結之長效接合物。
  17. 一種介白素-2類似物之長效接合物，其係由下述化學式2表示：
    [化學式2]X-Z-Fc
    其中，X係包含SEQ ID NOS：3至106的胺基酸序列選出的任一多肽序列的介白素-2類似物；
    Z為分子量2kDa至30kDa的聚乙二醇連接子；
    Fc為二聚體形式的免疫球蛋白Fc區；及
    -表示X與Z之間以及Z與Fc之間的共價鍵；
    其中，該長效接合物為其Z的一端與二聚體Fc區中的僅一條多肽鏈共價連接，並且一個X分子與Z的另一端共價連接之長效接合物。
  18. 如請求項17所述之長效接合物，其中，該介白素-2類似物包含由SEQ ID NOS：10、13、14、15、16、17、20、21、22、32、35、36、42、53、54、56、58、59、60、62、71、72、74、75、76、77、78、85、87、89、91、92、93、94、95、98、99、100、101、103、104、105及106之胺基酸序列所組成的群組選出之任一序列。
  19. 如請求項17所述之長效接合物，其中，該介白素-2類似物包含由SEQ ID NOS：10、13、14、16、17、20、21、22、32、35、36、42、53、 54、87、89、91、92、93、94、98、99、100、101、103、104及105之胺基酸序列所組成的群組選出之任一序列。
  20. 如請求項17所述之長效接合物，其中，該介白素-2類似物包含由SEQ ID NOS：22、42、53、87、105及106之胺基酸序列所組成的群組選出之任一序列。
  21. 如請求項17所述之長效接合物，其中，該介白素-2類似物在其C端進一步包含一個或多個胺基酸。
  22. 一種介白素-2類似物之長效接合物，其係由下述化學式3表示：
    [化學式3]X'-Z-Fc
    其中，X'為包含由下述通式1表示之胺基酸序列的介白素-2類似物：
    [通式1]
    Figure 111112574-A0202-13-0013-62
    Figure 111112574-A0202-13-0013-63
    (通式1，SEQ ID NO：212)
    上述通式1中，
    X1為缺失；
    X18為白胺酸(L)或精胺酸(R)；
    X19為白胺酸(L)或酪胺酸(Y)；
    X22為麩胺酸(E)或麩醯胺酸(Q)；
    X38為丙胺酸(A)、天門冬胺酸(D)或精胺酸(R)；
    X42為丙胺酸(A)、苯丙胺酸(F)、離胺酸(K)或色胺酸(W)；
    X43為麩胺酸(E)、離胺酸(K)或麩醯胺酸(Q)；
    X45為丙胺酸(A)或酪胺酸(Y)；
    X61為天門冬胺酸(D)、麩胺酸(E)、麩醯胺酸(Q)或精胺酸(R)；
    X68為天門冬胺酸(D)或麩胺酸(E)；
    X74為組胺酸(H)或麩醯胺酸(Q)；
    X80為苯丙胺酸(F)、白胺酸(L)、纈胺酸(V)或酪胺酸(Y)；
    X81為天門冬胺酸(D)、麩胺酸(E)或精胺酸(R)；
    X84為天門冬胺酸(D)或麩胺酸(E)；
    X85為丙胺酸(A)、麩胺酸(E)、甘胺酸(G)、白胺酸(L)、纈胺酸(V)、色胺酸(W)或酪胺酸(Y)；
    X86為丙胺酸(A)、甘胺酸(G)、異白胺酸(I)或纈胺酸(V)；
    X91為蘇胺酸(T)或纈胺酸(V)；
    X92為苯丙胺酸(F)、異白胺酸(I)或酪胺酸(Y)；
    X94為苯丙胺酸(F)或白胺酸(L)；
    X96為苯丙胺酸(F)或白胺酸(L)；
    Z為具有分子量2kDa至30kDa的聚乙二醇連接子；
    Fc為二聚體形式的免疫球蛋白Fc區；及
    -表示X'與Z之間以及Z與Fc之間的共價鍵；
    其中，該長效接合物為其Z的一端與二聚體Fc區中的僅一條多肽鏈共價連接，並且一個X'分子與Z的另一端共價連接之長效接合物。
  23. 如請求項22所述之長效接合物，其中，上述通式1中，
    X43為離胺酸(K)；
    X45為酪胺酸(Y)；
    X61為天門冬胺酸(D)、麩胺酸(E)或麩醯胺酸(Q)；
    X68為麩胺酸(E)；
    X74為麩醯胺酸(Q)；
    X80為苯丙胺酸(F)或白胺酸(L)；
    X85為白胺酸(L)、纈胺酸(V)或酪胺酸(Y)；
    X86為異白胺酸(I)或纈胺酸(V)；及
    X92為苯丙胺酸(F)或異白胺酸(I)。
  24. 如請求項22所述之長效接合物，其中，該介白素-2類似物在其C端進一步包含一個或多個胺基酸。
  25. 一種介白素-2類似物之長效接合物，其係由下述化學式4表示：
    [化學式4]X"-Z-Fc
    其中，X"為包含由下述通式2表示之胺基酸序列的介白素-2類似物：
    [通式2]
    Figure 111112574-A0202-13-0015-64
    Figure 111112574-A0202-13-0016-65
    Figure 111112574-A0202-13-0016-66
    (通式2，SEQ ID NO：213)
    X1為缺失；
    X18為白胺酸(L)或精胺酸(R)；
    X22為麩胺酸(E)或麩醯胺酸(Q)；
    X38為丙胺酸(A)或精胺酸(R)；
    X42為苯丙胺酸(F)或離胺酸(K)；
    X61為天門冬胺酸(D)或麩胺酸(E)；
    X68為天門冬胺酸(D)或麩胺酸(E)；
    X81為天門冬胺酸(D)或麩胺酸(E)；
    X85為白胺酸(L)或纈胺酸(V)；
    X86為異白胺酸(I)或纈胺酸(V)；
    Z為具有分子量2kDa至30kDa的聚乙二醇連接子；
    Fc為二聚體形式的免疫球蛋白Fc區；及
    -表示X"與Z之間以及Z與Fc之間的共價鍵；
    其中，該長效接合物係Z的一端與該二聚體Fc區中的僅一條多肽鏈共價連接，並且一個X"分子與Z的另一端共價連接之長效接合物。
  26. 如請求項25所述之長效接合物，其中，該介白素-2類似物包含由SEQ ID NOS：22、42、53、87、105及106之胺基酸序列所組成的群組選出之任一序列。
  27. 一種用於預防或治療癌症的醫藥組成物，其包含藥學有效量之如請求項1或17中所述的長效接合物及藥學上可接受的賦形劑。
  28. 如請求項27所述之醫藥組成物，其中，該介白素-2類似物係選自由SEQ ID NOS：22、42、53、87、105及106所組成的群組。
  29. 如請求項27所述之醫藥組成物，其中，該癌症係選自由轉移性腎細胞癌、轉移性黑色素瘤、結腸直腸癌、肝癌、卵巢癌、胰癌、膽囊癌、腎癌、結腸直腸癌、肺癌、皮膚癌、黑色素瘤、乳癌、膀胱癌及胃癌所組成的群組。
  30. 如請求項27所述之醫藥組成物，其中，該醫藥組成物展現下列性質之一者或多者：
    (i)相對於阿地介白素的高血液暴露；
    (ii)與阿地介白素相比，具有高的腫瘤生長抑制活性；
    (iii)與阿地介白素相比，具有高的記憶T細胞生成反應。
  31. 如請求項27所述之醫藥組成物，其中，該醫藥組成物經腹膜內、靜脈內、肌肉內、皮下、皮內、口服、局部、鼻內、肺內或直腸內途徑給藥。
  32. 如請求項27所述之醫藥組成物，其中，該醫藥組成物以範圍1週至1個月之時間間隔給藥。
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