TW202247856A - 新穎之三重升糖素／ｇｌｐ－１／ｇｉｐ受體促效劑及其用途 - Google Patents

新穎之三重升糖素／ｇｌｐ－１／ｇｉｐ受體促效劑及其用途 Download PDF

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Abstract

本發明係關於一種對升糖素、GLP-1及GIP受體均具有活性的三重促效劑及其用途。

Description

新穎之三重升糖素/GLP-1/GIP受體促效劑及其用途
本發明係關於一種對升糖素、GLP-1及GIP受體均具有活性的三重促效劑及其用途。
類升糖素肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)與葡萄糖依賴性促胰島素多肽(glucose-dependent insulinotropic polypeptide，GIP)係代表性的腸胃激素與神經元激素，且為依據食物攝入而參與控制血糖濃度(blood glucose level)的物質。升糖素為一種由胰臟分泌的肽類激素，與上述兩種物質一同參與血糖濃度的控制。
GLP-1為一種於食物攝入之刺激下由小腸分泌的激素，以血糖依賴性方式促進胰臟的胰島素分泌，並抑制升糖素的分泌以協助降低血糖濃度。此外，GLP-1作為飽腹感因子(satiety factor)，以減緩胃中的消化作用並延緩所消化的食物的通過時間，從而減少食物攝入。此外，據報導，GLP-1在給藥至小鼠時具有抑制攝食與減輕體重之作用，並證實無論於正常或肥胖狀態下均能觀察到該等作用，證明其作為肥胖治療劑的潛力。
與GLP-1相同，GIP係於食物攝入的刺激下分泌的一種腸胃激素，為一種由小腸中的K細胞所分泌的42種胺基酸所組成的激素。GIP的作用為以血糖依賴性方式促使胰臟分泌胰島素，並有助於降低血糖濃度。據報導，GIP能增加GLP-1活性。
當由於藥物治療、疾病或激素或酶的缺乏導致血糖開始下降時，胰臟會產生升糖素。升糖素向肝臟發出訊號，以使其分解肝醣而促使葡萄糖釋放，並在將血糖提升至正常濃度方面起作用。除了增加血糖濃度的作用外，據報導，升糖素還透過抑制動物和人類的食慾、活化脂肪細胞中的激素敏感脂酶來促進脂肪分解及能量消耗，以展現抗肥胖的功效。
此外，作為上述基於GLP-1的治療物質之替代物，且為了讓減重效果最大化，業已對同時具有GLP-1受體及升糖素受體兩者之活性的雙重促效劑進行了研究。據報導，與現有的GLP-1單獨治療相比，該雙重促效劑因其對升糖素受體之活性而具有更佳的減重效果(Jonathan W et al.,Nat Chem Bio.,2009 Oct(5)；749-757)。
此外，在最近對同時作用於所有GLP-1、GIP及升糖素受體的三重促效劑(或三重活化劑)的研究中，經努力透過胺基酸序列的替換等修飾來延長其半衰期，以增加其對於二肽基肽酶-IV(DPP-IV)的抗性；DPP-IV會降解腸胃激素，導致其喪失活性。然而，活化三種不同受體的效果並不大，且研究未演示具有不同活性比的三重促效劑。是以，對於能夠高度活化GLP-1、GIP與升糖素受體之新穎物質的需求仍不斷上升中。
對GLP-1、GIP與升糖素受體具有各種活性比的物質之開發需求也在增加。舉例而言，有必要開發一種對GLP-1和GIP具有高度活性的物質， 以在加強血糖控制的同時，具有相對較低的升糖素活性，從而展現出大於減重效果的血糖控制效果，或一種同時對GLP-1、GIP和升糖素具有高度活性的物質，從而展現出較強的減重效果。
同時，近年來，隨著經濟增長和生活方式的改變，飲食習慣產生了許多變化。尤其是由於西式飲食模式，使得過重和肥胖率增加。過重與肥胖會提高血壓和膽固醇，從而導致心臟疾病、糖尿病、關節炎等各種疾病之發作或惡化。過重與肥胖亦為兒童、青少年以及成人中，動脈硬化、高血壓、高血脂症或心臟疾病發病率升高的主要因素。
如上所述，肥胖為一種世界性的疾病，係一種能引起各種疾病的嚴重病症。然而，治療肥胖並不容易，這是因為肥胖為一種複雜的病症，涉及了與食慾控制和能量代謝相關的作用機制。因此，肥胖的治療不僅需要仰賴患者自身的努力，還需要一種治療與食慾控制及能量代謝相關作用機制異常的方法。是以，有必要開發一種能夠針對該異常的作用機制加以治療的藥物。
舉例而言，持續努力開發對GLP-1、GIP和升糖素受體具有活性之物質，以作為治療肥胖症及相關代謝症候群之治療劑。
本發明之目的係提供一種對升糖素受體、類升糖素肽-1(GLP-1)受體以及葡萄糖依賴性促胰島素多肽(GIP)受體均具有活性之肽。
本發明的另一個目的，係提供一種包含該肽之接合物。
本發明的另一個目的，係提供編碼該肽之多核苷酸、包含該多核苷酸之重組表現載體、以及包含該多核苷酸或該重組表現載體之轉形體。
本發明的再一個目的，係提供一種製備該肽之方法。
本發明的再一個目的，係提供一種用於預防或治療代謝症候群之醫藥組成物，該醫藥組成物包括該肽或該接合物。
本發明的再一個目的，係提供該肽或該組成物於製備藥物中之用途。
本發明的再一個目的，係提供一種預防或治療代謝症候群之方法，該方法包括向個體施用該肽、該接合物或包含其的組成物之步驟。
為實現上述目的，本發明的一個方面提供了一種對升糖素受體、類升糖素肽-1(GLP-1)受體和葡萄糖依賴性促胰島素多肽(GIP)受體均具有活性之肽。
於一具體實施例中，該肽之特徵在於，其為包含選自由SEQ ID NO：1至12所組成之群組中的序列之任一者的肽。
於另一具體實施例中，該肽之特徵在於，相較於天然的人類GLP-1、升糖素及GIP之活性，該肽對GLP-1受體、升糖素受體及GIP受體具有3%或更高的活性。
根據具體實施例的任一者的該肽之特徵在於，相較於天然的人類GLP-1、升糖素及GIP之活性，該肽對GLP-1受體、升糖素受體和GIP受體具有10%或更高的活性。
根據具體實施例的任一者的該肽之特徵在於，相較於天然的人類GLP-1、升糖素和GIP之活性，其對GLP-1受體、升糖素受體和GIP受體具有70%或更高的活性。
根據具體實施例的任一者的該肽之特徵在於，相較於天然的人類GLP-1之活性，其對GLP-1受體具有70%或更高的活性。
根據具體實施例的任一者的該肽之特徵在於，相較於天然的人類升糖素之活性，其對升糖素受體具有70%或更高的活性。
根據具體實施例的任一者的該肽之特徵在於，相較於天然的人類GIP之活性，其對GIP受體具有70%或更高的活性。
根據具體實施例的任一者的該肽之特徵在於，相較於天然升糖素之活性，其對升糖素受體具有100%或更高的活性，同時，相較於天然的GLP-1和GIP之活性，其對GLP-1受體和GIP受體均具有10%或更高的活性。
根據具體實施例的任一者的該肽之特徵在於，相較於天然的GIP之活性，其對GIP受體具有100%或更高的活性，同時，相較於天然的GLP-1和升糖素之活性，其對GLP-1受體和升糖素體均具有10%或更高的活性。
根據具體實施例的任一者的該肽之特徵在於，其自N-末端起位置12之胺基酸和位置16之胺基酸，或位置16之胺基酸和位置20之胺基酸形成環。
根據具體實施例的任一者的該肽之特徵在於，其C-末端係經醯胺化的。
根據具體實施例的任一者的該肽之特徵在於，其為長效接合物之形式，其中，係接合有能夠增加該肽之半衰期的物質。
本發明的另一方面，提供以下列化學式1表示之長效接合物：
[化學式1]X-L-F
其中，X代表對升糖素受體、類升糖素肽-1(GLP-1)受體和葡萄糖依賴性促胰島素多肽(GIP)受體均具有活性的肽；
L表示包含乙二醇重複單元的連接子，
F表示免疫球蛋白Fc區，及
「-」表示X和L之間及L和F之間的共價鍵。
於一個具體實施例中，X之特徵在於其係一種包含選自SEQ ID NOS：1至12所組成之群組中的序列的任一者的肽。
於另一個具體實施例中，該肽之特徵在於其C-末端係經醯胺化的。
根據具體實施例的任一者的接合物之特徵在於，其免疫球蛋白Fc區係源自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的免疫球蛋白Fc區。
根據具體實施例的任一者的該接合物之特徵在於，其免疫球蛋白Fc區係源IgG、IgA、IgD、IgE或IgM或其組合或其雜合體的免疫球蛋白Fc區。
根據具體實施例的任一者的該醫藥組成物之特徵在於，其免疫球蛋白Fc區係源自IgG Fc區。
根據具體實施例的任一者的該接合物之特徵在於，其免疫球蛋白Fc區係IgG4 Fc區。
根據具體實施例的任一者的該接合物之特徵在於，其免疫球蛋白Fc區係無糖基化的。
根據具體實施例的任一者的該接合物之特徵在於，其免疫球蛋白Fc區係源自人類IgG4之無糖基化的Fc區。
根據具體實施例的任一者的該接合物之特徵在於，其免疫球蛋白Fc區係選自(a)CH1結構域、CH2結構域、CH3結構域和CH4結構域；(b)CH1結構域和CH2結構域；(c)CH1結構域和CH3結構域；(d)CH2結構域和CH3結構域；(e)CH1結構域、CH2結構域、CH3結構域和CH4結構域之一者、二者或更多者，以及免疫球蛋白鉸鏈區(hinge region)或鉸鏈區的一部分之組合。
根據具體實施例的任一者的該接合物之特徵在於，其免疫球蛋白Fc區具有其中兩條多肽鏈係經由二硫鍵連接之結構，其中，它們僅經由該兩條鏈中的一條鏈之氮原子連接。
根據具體實施例的任一者的該接合物之特徵在於，其免疫球蛋白Fc區具有二聚體形式。
根據具體實施例的任一者的該合物之特徵在於，其免疫球蛋白Fc區包含具有SEQ ID NO：33的胺基酸序列之單體。
根據具體實施例的任一者的該合物之特徵在於，其免疫球蛋白Fc區具有SEQ ID NO：33的胺基酸序列之單體的同源二聚體。
根據具體實施例的任一者的該接合物之特徵在於，其免疫球蛋白Fc區係於其N-末端經由脯胺酸的氮原子連接。
根據具體實施例的任一者的該接合物之特徵在於，其免疫球蛋白Fc區之F和X係未經糖基化的。
根據具體實施例的任一者的該合物之特徵在於，L為包含乙二醇重複單元的連接子。
根據具體實施例的任一者的該接合物之特徵在於，乙二醇重複單元表示為[OCH2CH2]n，其中，n為自然數，其係依平均分子量所決定，以使如肽接合物中[OCH2CH2]n的數目平均分子量為1kDa至100kDa。
根據具體實施例的任一者的該接合物之特徵在於，n的值係依平均分子量所決定，以使如肽接合物中[OCH2CH2]n的數目平均分子量為10kDa。
根據具體實施例的任一者的該接合物之特徵在於，L中乙二醇重複單元部分的分子量落於1kDa至100kDa之範圍內。
根據具體實施例的任一者的該接合物之特徵在於，L為聚乙二醇。
根據具體實施例的任一者的該接合物之特徵在於，L為包含乙二醇重複單元的連接子，且F為二聚體免疫球蛋白Fc區。
根據具體實施例的任一者的該合物之特徵在於，X分子係經由包含乙二醇重複單元的連接子共價連接至該二聚體免疫球蛋白Fc區的一條Fc區鏈。
根據具體實施例的任一者的該接合物之特徵在於，包含乙二醇重複單元的連接子之一端，僅連接至該二聚體免疫球蛋白Fc區的兩條Fc區鏈的一條Fc區鏈。
根據具體實施例的任一者的該合物之特徵在於，F和X係經由共價鍵相互連接，該共價鍵係分別由L的一端與F的胺基或硫醇基反應，且由L的另一端與X的胺基或硫醇基反應而形成。
本發明的又一方面，提供編碼該肽之多核苷酸、包含該多核苷酸之重組表現載體、及包含該多核苷酸或該重組表現載體之轉形體。
本發明的又一方面，提供製備該肽或該接合物之方法。
本發明的又一方面，提供包含該肽或該接合物之組成物。
於一個具體實施例中，該組成物之特徵在於，其係用於預防或治療代謝症候群之醫藥組成物。
於另一個具體實施例中，該肽之特徵在於，其包含選自由SEQ ID NOS：1至12所組成之群組中的序列的任一者。
根據任一具體實施實的該組成物之特徵在於，該肽為長效接合物形式，其以下列化學式1表示：
[化學式1]X-L-F
其中，X表示該肽；
L表示包含乙二醇重複單元的連接子，
F表示免疫球蛋白Fc區，以及
「-」表示X和L之間以及L和F之間的共價鍵。
根據具體實施例的任一者的組成物之特徵在於，該代謝症候群係選自下列所組成群組的一者或多者：葡萄糖耐受性受損、高膽固醇血症、血脂異常、肥胖、糖尿病、高血壓、血脂異常誘發型動脈硬化、動脈粥狀硬化、動脈硬化及冠狀動脈心臟病。
本發明的又一方面，提供一種預防或治療代謝症候群的方法，該方法包括將該肽、該肽的接合物或包含其的組成物給藥至有其需要之個體的步驟。
本發明的又一方面，提供該肽、該肽之接合物或其組成物用於預防或治療代謝症候群的用途。
本發明的又一方面，提供該肽、該肽之接合物或其組成物在製備用於預防或治療代謝症候群的藥物之用途。
根據本發明的肽，對升糖素受體、類升糖素肽-1(GLP-1)受體和葡萄糖依賴性促胰島素多肽(GIP)受體均具有活性，並可用作代謝症候群之治療劑。
[最佳模式]
下文中將更詳細闡述本揭露。
同時，本揭露中揭示的各項描述及實施例亦可應用於其他描述及實施例。意即，本揭露中所揭示之各種要件的所有組合均落於本揭露範圍內。此外，本揭露之範圍不侷限於下列具體描述。另，於整個說明書中參照及引用諸多論文及專利文件，為進一步闡明本發明所屬主題之層次與範圍，該等論文及專利文件揭露之內容係藉由引用其整體而併入本文。
於整個說明書中，不僅使用天然存在之胺基酸的傳統單字母或三字母代碼，亦使用其他胺基酸通常允許的三字母代碼，例如2-胺基異丁酸(Aib)、 N-甲基甘胺酸(Sar)及α-甲基-麩胺酸等。進一步地，本文提及的胺基酸係根據IUPAC-IUB命名規則縮寫如下：
Figure 110148701-A0202-12-0011-1
在本文中，「Aib」可與「2-胺基異丁酸」或「胺基異丁酸」互換使用，且2-胺基異丁酸與胺基異丁酸可互換使用。
本發明的一個方面，提供了一種對升糖素受體、類升糖素肽-1(GLP-1)受體和葡萄糖依賴性促胰島素多肽(GIP)受體均具有活性之肽。
對升糖素、GLP-1和GIP受體具有活性之肽可與「肽」或「三重促效劑」互換使用。
於一個具體實施例中，該三重促效劑可包含選自由SEQ ID NOS：1至12所組成之群組中的胺基酸序列，其可實質上由選自由SEQ ID NOS：1至 12所組成之群組中的胺基酸序列所組成，或可由選自由SEQ ID NO：1至12所組成之群組中的胺基酸序列所組成，但不以此為限。
雖然本說明書中的肽被描述為由特定序列號所「組成」，但只要該肽與由對應序列編號的胺基酸序列組成之肽具有相同或等效活性，不排除於相應序列號之胺基酸序列上游或下游添加無意義序列所發生之突變、自然發生之突變、或其中之沉默突變，顯然地，具有該等序列添加或突變者亦涵蓋於本發明的範圍內。
本發明之三重促效劑可顯著活化升糖素受體、GLP-1受體和GIP受體中之一者或多者、兩者或多者、或是全部，但並不以此為限。
本發明之三重促效劑的特徵在於具有以下i)至iii)中的活性之一者或多者，尤其是顯著之活性：
i)對GLP-1受體之活性；ii)對升糖素受體之活性；iii)對GIP受體之活性。
於此處，舉例而言，相較於天然形式，其對於受體的活性可展現為0.1%或更高、1%或更高、2%或更高、3%或更高、4%或更高、5%或更高、6%或更高、7%或更高、8%或更高、9%或更高、10%或更高、20%或更高、30%或更高、40%或更高、50%或更高、60%或更高、70%或更高、80%或更高、90%或更高、100%或更高、200%或更高、300%或更高、400%或更高、500%或更高、600%或更高、700%或更高、800%或更高的體外活性，但不以此為限。
對升糖素、GLP-1和GIP受體均具有顯著活性之三重促效劑，相較於其對應受體的天然配體(天然升糖素、天然GLP-1與天然GIP)，可展現出對升糖素、GLP-1和GIP受體中之受體的一者或多者，特別係對受體的二者或 更多者，更特別係對受體三者的全部具有但不特別限於0.1%或更高、1%或更高、2%或更高、3%或更高、4%或更高、5%或更高、6%或更高、7%或更高、8%或更高、9%或更高、10%或更高、20%或更高、30%或更高、40%或更高、50%或更高、60%或更高、70%或更高、80%或更高、90%或更高、100%或更高、200%或更高、300%或更高、400%或更高、500%或更高、600%或更高的體外活性。
三重促效劑的體外活性測定方法可參照本說明書的實施例3進行，但不特別以此為限。
於一個具體實施例中，相較於天然的人類GLP-1、升糖素和GIP，本發明的三重促效劑對GLP-1、升糖素和GIP受體可具有3%或更高的活性，但不特別以此為限。
於另一個具體實施例中，本發明之三重促效劑相較於天然的人類GLP-1、升糖素和GIP，其對於GLP-1、升糖素和GIP受體可具有10%或更高的活性，但不特別以此為限。該三重促效劑的示例可為包含SEQ ID NOS：1至6與SEQ ID NOS：9至11的胺基酸序列之肽的任一者，但不以此為限。
在又一具體實施例中，本發明之三重促效劑相較於天然的人類GLP-1、升糖素和GIP，其對於GLP-1、升糖素與GIP受體可具有70%或更高的活性，但不特別以此為限。該三重促效劑的示例可為包含SEQ ID NO：2或6的胺基酸序列之肽，但不以此為限。
於又一個具體實施例中，相較於天然的人類GLP-1，本發明之三重促效劑對GLP-1受體可具有70%或更高的活性。該三重促效劑的示例可為包含SEQ ID NO：2、6、7、11與12的胺基酸序列的肽之任一者，但不以此為限。
於又一個具體實施例中，相較於天然的人類升糖素，本發明之三重促效劑對升糖素受體可具有70%或更高的活性。該三重促效劑的示例可為包含SEQ ID NO：1至3、5和6的胺基酸序列的肽之任一者，但不以此為限。
於又一個具體實施例中，相較於天然的人類GIP，本發明的三重促效對GIP受體可具有70%或更高的活性。該三重促效劑的示例可為包含SEQ ID NO：1、2、4和6的胺基酸序列的肽之任一者，但不以此為限。
本發明之三重促效劑可對GLP-1受體、升糖素受體和GIP受體之二者或更多者展現出顯著的活性，舉例而言，展現出10%或更高、30%或更高、50%或更高、或70%或更高的活性，同時，其對另一受體展現出特別優異的活性，例如100%或更高、150%或更高、200%或更高、300%或更高、400%或更高、或500%或更高的活性，但並不以此為限。
於一個具體的實施例中，相較於天然存在的GLP-1和GIP，本發明之三重促效劑可對GLP-1受體和GIP受體均具有10%或更高的活性，同時，相較於天然存在的升糖素，其對升糖素受體具有100%或更高的活性。本發明之三重促效劑的示例可包含SEQ ID NOS：1、2、3與5的胺基酸序列的肽之任一者，但不以此為限。
於另一個具體實施例中，本發明之三重促效劑相較於天然存在的GLP-1和GIP，其對GLP-1受體和升糖素受體均具有10%或更多的活性，同時，其相較於天然存在的GIP，對GIP受體亦具有100%或更高的活性。本發明之三重促效劑的示例可包含SEQ ID NOS：2、4與6的胺基酸序列的肽之任一者，但不以此為限。
在又一個具體實施方案中，本發明之三重促效劑可包含SEQ ID NO：35的胺基酸序列，但不特別以此為限。該三重促效劑可包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列作為該肽N-末端起位置27至30殘基，且可例示為包含SEQ ID NO：1至3、8與10的胺基酸序列的肽之任一者，但不以此為限。
在又一個具體實施例中，本發明的三重促效劑可包含SEQ ID NO：36的胺基酸序列，但不特別以此為限。該三重促效劑可包含SEQ ID NO：36的胺基酸序列作為該肽N-末端起位置27至30殘基，且可例示為包含SEQ ID NO：5、6和11的胺基酸序列的肽之任一者，但不以此為限。
此外，本發明的三重促效劑可包含與SEQ ID NO：1至12之胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.7%、或99.9%、或是更高同源性或同一性之胺基酸序列。進一步地，顯見，只要該胺基酸序列具有如此之同源性或同一性，並展現出相應於本發明三重促效劑之功效，具有部分序列缺失、修飾、取代、保守取代或添加的胺基酸序列之肽亦可包含在本發明範圍內。
舉例而言，該肽於其胺基酸序列的N-末端或C-末端及/或內部包含具有序列添加或缺失、自然發生之突變、沉默突變或保守取代之肽，其不改變本發明三重促效劑之功能。
「保守取代」係指以具有相似結構及/或化學性質之另一種胺基酸取代一種胺基酸。此種胺基酸的取代通常可基於殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性及/或兩親性之相似性加以進行。通常地，該保守取代可能很少影響或可能不影響蛋白質或肽之活性。
在本文中，術語「同源性」或「同一性」係指兩個給定的胺基酸序列或核苷酸序列之間的相關程度，且可表示為百分比。術語「同源性」及「同一性」通常可互換使用。
藉由標準比對算法，可確定保守多核苷酸或多肽之序列同源性或同一性，且可與所使用程式建立之默認空位罰分一併使用。實質上，通常預期同源或相同序列於中等或高度嚴格條件下，與全部或部分序列雜合。顯見，慮及多核苷酸中之密碼子簡併性，雜合尚包括與含通用密碼子或密碼子之多核苷酸的雜合。
任意兩個多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性，可使用任意已知的電腦演算法，例如引入默認參數的「FASTA」程式確定之，如同在Pearson et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444中使用者。或者，可由Needleman-Wunsch演算法決定之(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48：443-453)，該演算法係由使用EMBOSS套件的Needleman程式執行(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,Trends Genet.16：276-277)(第5.0.0版或更高版本)(GCG程式套件(Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research 12：387(1984)))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.F.,et al.,J MOLEC BIOL 215：403(1990))；Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego,1994,and CARILLO et al.(1988)SIAM J Applied Math 48：1073)。舉例而言，同源性、相似性或同一性可採用美國國家生物技術資訊中心的BLAST或ClustalW確定之。
如Smith and Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2：482中所揭示，多核苷酸或多肽間之同源性、相似性或同一性可藉由使用諸如GAP電腦程式(諸 如Needleman et al.(1970),J Mol Biol.48：443)比較序列資訊加以確定。簡言之，GAP程式將相似性定義為相似排比之符號(即核苷酸或胺基酸)的數量除以兩個序列中較短序列中的符號總數量。GAP程式之默認參數可包括(1)一元比較矩陣(包含具同一性之值1及非同一性之值0)，以及Gribskov et al.(1986)Nucl.Acids Res.14：6745中之加權比較矩陣(或EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)替換矩陣)，其係揭示於Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas Of Protein Sequence And Structure,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358(1979)；(2)每個空位罰分3.0，且各空位中之每個符號額外罰分0.10(或空位開放罰分10及空位延展罰分0.5)；以及(3)末端空位無罰分。
進一步地，相較於與天然GLP-1、天然升糖素和天然GIP中任一者，本發明三重促效劑可具有增加的體內半衰期，但不特別以此為限。舉例而言，本發明三重促效劑可係長效接合物形式，其藉由將用於增加半衰期之生物相容性物質(例如免疫球蛋白Fc區)直接或經由連接子連接到該三重促效劑而具有增加的半衰期，但不以此為限。
三重促效劑可係但不特別限於非天然存在之三重促效劑。
本發明三重促效劑可包括分子內橋(例如共價交聯或非共價交聯)，具體可包括環的形式。例如，該三重促效劑可係於三重促效劑之位置12與位置16及/或位置16與位置20的胺基酸之間形成環的形式，但不特別以此為限。
該環的非限制性示例可包括內醯胺交聯(或內醯胺環)。
此外，該三重促效劑包括所有經修飾而能在所欲之位點形成環、或包含環的胺基酸。
例如，該三重促效劑可為其中的位置12與16、或位置16與20之胺基酸對可分別被能形成環的麩胺酸或離胺酸取代之三重促效劑，但不以此為限。
該環可形成於該三重促效劑內的胺基酸側鏈間，例如以離胺酸側鍊與麩胺酸側鏈間形成的內醯胺環之形式，但不特別以此為限。
此外，在本發明之三重促效劑中，胺基酸的一部分可以但不特別限於被另一種胺基酸或非天然化合物取代，以避免其被該促效劑的降解酶辨識，從而延長其在體內之半衰期。
具體而言，本發明之三重促效劑可藉由取代該三重促效劑胺基酸序列中的第二胺基酸序列以避免其被降解酶辨識，從而延長其在體內之半衰期。惟，其係包括但不限於避免能被體內降解酶辨識的任意胺基酸之取代或修飾。
此外，本發明的三重促效劑的修飾可以包括使用L型或D型胺基酸及/或非天然胺基酸的所有修飾；及/或天然序列(native sequence)之修飾，如側鏈官能基團之修飾、分子內共價鍵結諸如側鏈間之環形成、甲基化、乙醯化、泛素化、磷酸化、胺基己烷化、生物素化等。
此外，該修飾尚可包含在胺基及/或羧基端添加一或多個胺基酸之所有修飾。
在胺基酸的取代或添加過程中，不僅可使用人類蛋白質中常見的20種胺基酸，亦可採用非典型或非天然存在的胺基酸。非典型胺基酸的商業來源可包含Sigma-Aldrich、ChemPep Inc.與Genzyme Pharmaceuticals。包含此類胺基酸與典型肽序列之肽可自供應商如American Peptide Company與Bachem(USA)或Anygen(Korea)處合成與購買。
胺基酸衍生物可以同樣方式獲得，例如可使用4-咪唑乙酸等。
此外，本發明之三重促效劑可為其N-及/或C-末端等經有機基團化學修飾或被其保護之變體的形式，或可於該肽末端添加胺基酸以保護其免受體內蛋白酶影響，並增加其穩定性。
特別地，化學合成的肽之N-末端與C-末端帶電，因此，該N-末端可經乙醯化及/或C-末端可經醯胺化以移除電荷，但該三重促效劑不特別以此為限。
具體地，本發明之三重促效劑的C-末端可經醯胺化或可具有游離羧基(-COOH)，或者可不經修飾，但不以此為限。
於一個具體實施例中，該三重促效劑可在其C-末端經醯胺化，但不以此為限。
於一個具體實施例中，該三重促效劑可係無糖基化的，但不以此為限。
根據本發明之三重促效劑可包括所有該肽，其鹽類(例如該肽的藥學上可接受之鹽類)，或其溶劑化物。此外，該肽可具有任何藥學上可接受的形式。
鹽之種類無特別限制。惟，鹽類在個體如哺乳動物中可為安全及有效的形式，但不以此為限。
術語「藥學上可接受的」係指在醫藥決策範圍內可有效用於預期用途而不會引起過度毒性、刺激、過敏反應等的物質。
如本文所用，術語「藥學上可接受之鹽類」係指衍生自藥學上可接受的無機酸、有機酸或鹼之鹽類。合適的酸之實例可包含鹽酸、溴酸、硫酸、 硝酸、高氯酸、富馬酸、馬來酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水楊酸、琥珀酸、對甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、2-萘磺酸、苯磺酸等。衍生自合適的鹼之鹽類的實例可包含鹼金屬如鈉、鉀等，及鹼土金屬如鎂等、銨等。
此外，在本文中，術語「溶劑合物(solvate)」係指根據本發明的三重促效劑或其鹽類與溶劑分子的複合物。
本發明的三重促效劑可藉由固相合成法合成，亦可藉由重組法生產，或可商業化製備，但不以此為限。
此外，本發明的三重促效劑可依據其長度，藉由所屬技術領域中習知的方法合成，例如藉由自動肽合成儀，且可藉由基因工程技術生產。
具體地，本發明的三重促效劑可藉由標準合成方法、重組表現系統或所屬技術領域中其他已知的任何方法來製備。據此，根據本發明之三重促效劑可藉由複數種方法合成，包括以下方法：
(a)藉由固相或液相方法以分步或片段組裝的方式合成肽，隨後單離與純化最終肽產物之方法；或
(b)在宿主細胞中表現編碼肽的核酸構建體，並從宿主細胞培養物回收表現產物之方法；或
(c)進行編碼肽的核酸構建體的體外無細胞表現，並從中回收表現產物之方法；或
藉由方法(a)、(b)和(c)的任何組合獲得肽片段、藉由連接該等肽片段而獲得肽，且接著回收肽之方法。
此等描述亦可應用於本發明的其他具體實施例或態樣(aspect)，但不以此為限。
本發明的另一方面提供對升糖素受體、GLP-1受體與GIP受體具有活性之肽接合物。
於本發明中，對升糖素受體、GLP-1受體與GIP受體具有活性之肽接合物可係如此之形式：其中，將能夠延長其體內半衰期的生物相容性物質連接至對升糖素受體、GLP-1受體和GIP受體具有活性之肽。在本發明中，生物相容性物質可與載劑互換使用。
於本發明中，相較於未連接載劑之肽，該肽之接合物可表現出增加的功效持久性，且於本發明中，此種接合物被稱為「長效接合物」。
同時，該接合物可係非天然存在者。
於本發明的一個具體實施例中，該長效接合物可具有其中作為生物相容性物質之免疫球蛋白Fc區連接至該三重促效劑的形式。具體地，在該接合物中，免疫球蛋白Fc區經由連接子共價連接至該三重促效劑，但不特別以此為限。
於本發明的一個具體實施例中，該接合物可係由以下化學式1表示之接合物：
[化學式1]X-L-F
其中，X表示包含選自由SEQ ID NO：1至12所組成之群組中的序列的任一者之肽；
L表示包含乙二醇重複單元之連接子；
F表示免疫球蛋白Fc區；以及
「-」表示共價連結。
化學式1之長效接合物中，X和F之間的連結可為物理鍵或化學鍵，或者非共價鍵或共價鍵，尤其可為共價鍵，但不以此為限。
更具體而言，X和L、L和F可經由共價鍵相互連接。於此方面，該接合物為其中X、L和F分別經由如化學式1的順序共價鍵連接之接合物。
化學式1之長效接合物的X可為上述對升糖素受體、GLP-1受體與GIP受體具有活性之肽(三重促效劑)，尤其是包含SEQ ID Nos：1至12任一胺基酸序列之肽，或實質上由或由SEQ ID Nos：1至12任一胺基酸序列組成之肽，但不以此為限。
於本發明中，「對升糖素受體、GLP-1受體與GIP受體具有活性之肽」可為構成該接合物一個部分的要素，具體可對應於化學式1中的X，且可對應於本發明之三重促效劑。該三重促效劑係與如上所述者相同。
即便其為接合物的形式，本發明之長效接合物可對GLP-1受體、升糖素受體和GIP受體展現出顯著活性。
具體而言，相較於其天然物，本發明之該接合物對GLP-1受體、升糖素受體及/或GIP受體可具有0.01%或更高、0.1%或更高、0.2%或更高、0.5%或更高、0.7%或高、1%或更高、2%或更高、3%或更高、4%或更高、5%或更高、6%或更高、7%或更高、8%或更高、9%或更高、10%或更高、20%或更高、30%或更高、40%或更高、相比，50%或更多、60%或更高、70%或更高、80%或更高、90%或更高、100%或更高的體外活性，但並不以此為限。
關於本發明之目的，相較於其天然物，該三重促效劑或其接合物對GLP-1受體、升糖素受體及/或GIP受體可具有0.1%或更高、0.2%或更高、0.5%或更高、0.7%或更高、1%或更高、2%或更高、3%或更高、4%或更高、5%或更高、10%或更高、20%或更高、30%或更高、40%或更高、50%或更高、60%或更高、70%或更高、80%或更高、90%或更高、100%或更高的活性，但並不以此為限。
化學式1之長效接合物可為如此形式：其中，肽(X)包含SEQ ID NOs：1至12之任一胺基酸序列、以及能增加其半衰期的物質(F，如免疫球蛋白Fc區)經由連結子彼此連接，其中，相較於包含SEQ ID NOs：1至12之任一胺基酸序列的肽(X)及未連接至能增加半衰期的物質(F，如免疫球蛋白Fc區)者，該接合物能展現出增加的功效持續時間。
本發明之長效接合物可為C-末端經醯胺化的三重促效劑與免疫球蛋白Fc區經由連接子相互連接之接合物，但不以此為限。
包含與選自SEQ ID NOS：1至12之任一序列或包含相同序列之肽的C-末端，且可經醯胺化或可具有游離羧基(-COOH)，或者可不經修飾，但不以此為限。
在該接合物中，F為能夠增加X半衰期之物質，即，對升糖素受體、GLP-1受體與GIP受體具有活性之肽或三重促效劑，且其對應於構成本發明接合物之部分的組分。
F和X可藉由共價鍵相互連接，F和X可經由L藉由共價化學鍵相互連接。
能增加X半衰期之物質可為生物相容性物質，例如FcRn結合物質，但不特別以此為限。
作為更具體的實施例，FcRn結合物質可為免疫球蛋白Fc區，更具體地為IgG Fc區或無糖基化的IgG4 Fc區，但不特別以此為限。
本發明之該肽內的一個或多個胺基酸側鏈可連接到生物相容性物質上以增加其體內溶解度及/或半衰期，及/或增加其生物可利用度。此類修飾可能會降低治療性蛋白質和肽的清除率。
上述生物相容性物質可係可溶者(兩親或親水者)及/或無毒者及/或藥學上可接受者。
於一個具體實施例中，在本發明之長效接合物中，該三重促效劑與免疫球蛋白Fc區可相互連接，但不以此為限。
具體地，在化學式1之長效接合物中，F可為免疫球蛋白Fc區，更具體地，該免疫球蛋白Fc區可源自IgG，但不特別以此為限。
在本發明的一個具體實施例中，F(免疫球蛋白Fc區)係由兩條多肽鏈組成之二聚體，並具有如此之結構：L一端僅與兩條多肽鏈中的一條多肽鏈相連，但不以此為限。
在本發明中，「免疫球蛋白Fc區」係指包括重鏈恆定區2(CH2)及/或重鏈恆定區3(CH3)的區域，不包含免疫球蛋白的重鍊和輕鏈可變區。免疫球蛋白Fc區可係構成本發明接合物部分的組分。具體而言，免疫球蛋白Fc區對應於化學式1中的F。
在本文中，該Fc區不僅包含從木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白獲得的天然序列，還包含其衍生物例如變體，其中，天然序列中的一或多個胺基酸殘 基藉由缺失、插入、非保守或保守取代或其組合而發生轉化，從而異於其天然序列等。上述衍生物、取代物與變體為維持FcRn結合能力所必需者。在本發明中，F可為人類免疫球蛋白區域，但不以此為限。F(免疫球蛋白Fc區)具有如此之結構：其中，兩條多肽鏈經二硫鍵彼此連接，且僅經由兩條鏈中的一條鏈的氮原子連接，但不以此為限。此經由氮原子之連接可藉離胺酸的ε胺基或N-末端胺基之還原胺化而形成。
該還原胺化反應係指一種反應物的胺基(amine group)或胺基(amino group)與另一反應物的醛(即能參與還原胺化的官能基團)反應而生成胺，隨後藉由還原反應形成胺鍵。此係所屬領域中習知之有機合成反應。
在本發明三重促效劑之長效接合物的一個具體實施例中，該免疫球蛋白Fc區經由其N-末端處的氮原子接合至連接子。
此種免疫球蛋白Fc區可包含重鏈恆定區中之鉸鏈區，但不以此為限。
在本發明中，免疫球蛋白Fc區可包含N-末端之特定鉸鏈序列。
如本文所用，術語「鉸鏈序列(hinge sequence)」係指位於重鏈中並透過二硫鍵(二硫間鍵)形成該免疫球蛋白Fc區之二聚體的區域。
在本發明中，可藉由刪除具有以下胺基酸序列之鉸鏈序列中的一部分，將鉸鏈序列改變為僅具有一個半胱胺酸殘基，但不以此為限：
Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro(SEQ ID NO：13)。
藉由刪除SEQ ID NO：13的鉸鏈序列中的位置8或位置11之半胱胺酸殘基，該鉸鏈序列可僅包括一個半胱胺酸殘基。本發明的鉸鏈序列可僅包括一個半胱胺酸殘基並可由3至12個胺基酸組成，但不以此為限。更具體地， 本發明之鉸鏈序列可具有以下序列：Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro(SEQ ID NO：14),Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Pro(SEQ ID NO：15)、Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser(SEQ ID NO：16)、Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro(SEQ ID NO：17)、Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser(SEQ ID NO：18)、Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys(SEQ ID NO：19)、Glu-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys(SEQ ID NO：20)、Glu-Ser-Pro-Ser-Cys-Pro(SEQ ID NO：21)、Glu-Pro-Ser-Cys-Pro(SEQ ID NO：22)、Pro-Ser-Cys-Pro(SEQ ID NO：23)、Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro(SEQ ID NO：24)、Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro(SEQ ID NO：25)、Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Ser-Cys-Pro(SEQ ID NO：26)、Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys(SEQ ID NO：27)、Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro(SEQ ID NO：28)、Glu-Ser-Lys-Pro-Ser-Cys-Pro(SEQ ID NO：29)、Glu-Ser-Pro-Ser-Cys-Pro(SEQ ID NO：30)、Glu-Pro-Ser-Cys(SEQ ID NO：31)、Ser-Cys-Pro(SEQ ID NO：32)。
更具體而言，該鉸鏈序列可包括SEQ ID NO：23(Pro-Ser-Cys-Pro)或SEQ ID NO：32(Ser-Cys-Pro)之胺基酸序列，但不以此為限。
在本發明的三重促效劑的長效接合物的更具體的實施例中，在該接合物中，免疫球蛋白Fc區的N末端是脯胺酸。在此接合物中，Fc區經由脯胺酸的氮原子與該連接子連接。
在本發明三重促效劑之長效接合物的一個具體實施例中，該免疫球蛋白Fc區可具有二聚體形式，其中，該免疫球蛋白Fc區的兩條鏈由於鉸鏈序 列的存在而形成同源二聚體或異源二聚體。本發明化學式1之接合物可係由連接子的一端與二聚體免疫球蛋白Fc區的一條鏈連接之形式，但不以此為限。
如本文所用，術語「N-末端(N-terminus)」係指蛋白質或多肽之胺基末端，且包括胺基末端的最末端，或距最末端至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個之胺基酸。本發明之免疫球蛋白Fc區可包含位於N-末端之鉸鏈序列，但不以此為限。
此外，本發明之免疫球蛋白Fc區可係包含重鏈恆定區1(CH1)及/或輕鏈恆定區1(CL1)的一部分或全部之延伸Fc區，但不包含免疫球蛋白之重鍊與輕鏈可變區域，只要免疫球蛋白Fc相較其天然形式具有實質上等同或改進的效果。又，免疫球蛋白Fc區可係移除了對應於CH2及/或CH3的顯著長胺基酸序列的一部分區域。
例如，本發明之免疫球蛋白Fc區可為1)CH1結構域、CH2結構域、CH3結構域及CH4結構域、2)CH1結構域與CH2結構域、3)CH1結構域與CH3結構域、4)CH2結構域與CH3結構域、5)CH1結構域、CH2結構域、CH3結構域與CH4結構域中之一個、兩個或更多結構域與該免疫球蛋白鉸鏈區(或鉸鏈區一部分)間之組合，以及6)重鏈恆定區與輕鏈恆定區之各結構域間的二聚體，但不以此為限。
於本發明中，免疫球蛋白Fc區可係由相同來源之結構域所組成的單鏈免疫球蛋白構成的二聚體或多聚體，但不以此為限。
此外，於一具體實施例中，免疫球蛋白Fc區F係由兩條多肽鏈組成的二聚體，其中，該二聚體Fc區F與X可經由一個相同之包含乙二醇重複單元的連接子L彼此共價連接。於一具體實施例中，X經由連接子L與該二聚Fc 區F的兩條多肽鏈中的僅一條多肽鏈共價連接。於更具體的實施例中，僅有一個X分子經由L與一條多肽鏈共價連接，該與X相連的多肽鏈為該二聚Fc區F之兩條多肽鏈中的一條多肽鏈。於最具體的實施例中，F為同源二聚體。
於另一具體實施例中，該免疫球蛋白Fc區F係由兩條多肽鏈組成的二聚體，L一端僅與兩條多肽鏈中的一條多肽鏈相連，但不以此為限。
在本發明另一實施例中之長效接合物中，兩個分子X亦可以二聚體形式對稱地連結至一個Fc區。於此一方面，該免疫球蛋白Fc區與X可經由連接子(L)相連，但不限於上述示例。
此外，本發明之免疫球蛋白Fc區包含天然胺基酸序列及其序列衍生物。該胺基酸序列衍生物係指天然胺基酸序列中的一或多個胺基酸殘基，由於缺失、插入、非保守或保守取代或其組合而具有相異序列。
舉例而言，已知對連接係屬重要之IgG Fc中的位置214至238、297至299、318至322、或327至331的胺基酸殘基可用作合適的變異位點。
進一步地，多種類型之衍生物係為可能者，舉例而言，能形成二硫鍵之位點經移除者，自天然Fc中移除幾個N-末端胺基酸者，於天然FcN-末端添加一個甲硫胺酸殘基者。此外，可移除補體結合位點，例如C1q結合位點或抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)位點以除去效應子功能。製備該免疫球蛋白Fc區序列衍生物之技術係揭露於國際專利公開第WO 97/34631號與WO 96/32478號等。
不改變分子整體活性的蛋白質或肽中之胺基酸交換係本領域的習知技術(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常見之交換發生於下列胺基酸殘基之間：Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、 Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu與Asp/Gly。某些情況下，胺基酸可藉由磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙醯化及醯胺化等進行修飾。
上述Fc衍生物可為與本發明的Fc區表現出同等生物學活性者，及增加Fc區對熱、pH等之結構穩定性者。
此外，該Fc區可從分離自人類或動物如牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠、豚鼠等的天然類型獲取，或可為彼等之重組體或從經轉化的動物細胞或微生物獲得之衍生物。於此，從天然形式獲取之方法係從人類或動物有機體中分離完整的免疫球蛋白，隨後以蛋白酶處理之方法。當使用木瓜蛋白酶處理時，該天然形式被消化為Fab與Fc，當使用胃蛋白酶處理時，其被裂解為pF'c與F(ab)2。Fc或pF'c可使用粒徑排阻層析法等分離。於更具體的實施例中，Fc區可係重組免疫球蛋白Fc區，其中人源Fc區係由微生物獲取之。
此外，相較天然類型，免疫球蛋白Fc區可具有天然聚醣或增加或減少的聚醣，或為去糖基化之形式。免疫球蛋白Fc聚醣之增加、減少或去除可藉由本領域常用之任意方法實現之，諸如化學方法、酶方法與使用微生物之基因工程方法。於此一方面，藉由去除聚醣獲取之免疫球蛋白Fc區顯示出與補體c1q之結合親和力顯著降低、及抗體依賴性細胞毒性或補體依賴性細胞毒性降低或喪失，因此不會在生物體中誘發不必要的免疫反應。基於此，鑑於本發明之目的，去糖基化或無糖基化的免疫球蛋白Fc區可能更適合作為藥物載體。
在本文中，術語「去糖基化(deglycosylation)」係指使用酶自其移除聚醣的Fc區，而術語「無糖基化(aglycosylation)」係指在原核生物中產生的未糖基化的Fc區，更具體地係大腸桿菌。同時，免疫球蛋白Fc區可源自人 類或動物，包括牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠、豚鼠等，在更具體實施例中，其可源自人類。
此外，免疫球蛋白Fc區可係源自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或其組合或雜合體的Fc區。於一個更具體實施例中，其可源自IgG或IgM，彼等係人類血液中最豐富的蛋白質；於一個甚至更具體的實施例中，其可源自IgG，已知其可延長配體結合蛋白之半衰期。於更具體的實施例中，免疫球蛋白Fc區可為IgG4 Fc區，並且於甚至更具體的實施例中，免疫球蛋白Fc區可為源自人類IgG4的無糖基化的Fc區，但不以此為限。
此外，在一個具體實施例中，免疫球蛋白Fc區為人類IgG4 Fc區，且可為同源二聚體的形式，其中，兩個單體經由半胱胺酸間的二硫鍵(鏈間形式)連接於各單體位置3處的胺基酸。於此一方面，該同源二聚體之各單體具有或可具有獨立的兩個內二硫鍵(分子內鏈(intra-chain))，即位置35與95的半胱胺酸之間形成之二硫鍵，及位置141與199的半胱胺酸之間形成之二硫鍵。各單體之胺基酸數目可為221個胺基酸，且形成同源二聚體之胺基酸可由總共442個胺基酸組成，但不以此為限。具體而言，免疫球蛋白Fc片段可為同源二聚體形式，其中，具有SEQ ID NO：33胺基酸序列(由221個胺基酸組成)之兩個單體經由各單體位置3處的半胱胺酸間的二硫鍵相互連接。且該同源二聚體之單體可各自獨立地於位置35與95的半胱胺酸間形成分子內鏈二硫鍵，及於位置141與199的半胱胺酸間形成分子內鏈二硫鍵，但並不以此為限。化學式1之F可包含SEQ ID NO：33胺基酸序列之單體，且F可為SEQ ID NO：33胺基酸序列之單體的同源二聚體，但並不以此為限。
舉例而言，免疫球蛋白Fc區可為包含SEQ ID NO：34胺基酸序列(由442個胺基酸組成)之同源二聚體，但不以此為限。
於一具體實施例中，免疫球蛋白Fc區與X可未經糖基化，但不以此為限。
同時，在本文中，與免疫球蛋白Fc區相關之術語「組合(combination)」係指編碼相同來源之單鏈免疫球蛋白Fc區的多肽與不同來源之單鏈多肽連接而形成二聚體或多聚體。換言之，二聚體或多聚體可由選自IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc與IgE的Fc區組成之群組的兩個或更多個區域製備之。
在本文中，術語「雜合(hybrid)」係指對應於不同來源的兩個或更多個免疫球蛋白Fc區之序列存在於單鏈免疫球蛋白恆定區中。於本發明中，多種雜合形式係屬可能者。換言之，該雜合結構域可由選自IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc與IgD Fc的CH1、CH2、CH3與CH4組成之群組的1至4個結構域所構成，且可包含鉸鏈區。
同時，IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3與IgG4次分類，本發明可包含其組合或雜合體，具體地係IgG2與IgG4次分類，最具體地係IgG4的Fc片段，其很少具有效應子功能，例如補體依賴性細胞毒性(CDC)。
此外，相較於天然肽或未經F修飾之X，上述接合物可具有增加之功效持久性，且此種接合物不僅可為上述形式，亦可為包封於生物可降解奈米顆粒中之形式，但不以此為限。
於化學式1中，L為非肽基連接子。
在本文中，術語「非肽基連接子(non-peptidyl linker)」包含其中兩個或更多個重複單元相互接合之生物相容性聚合物。該等重複單元透過任意共價鍵而非肽鍵相互連接。該非肽基聚合物可為構成本發明接合物之部分的組分，且對應於化學式1中的L。
適用於本發明之非肽基連接子可不受限制地使用，只要其為體內對於蛋白水解酶具有抗性的聚合物即可。於本發明中，非肽基連接子可與非肽基聚合物互換使用。
此外，本發明中與對應於F之多肽結合的非肽基連接子可為單一類型聚合物，亦可為不同類型聚合物之組合。
於一具體實施例中，該接合物可為其中的F與X經由非肽基連接子共價相連之接合物，該非肽基連接子於其兩端包含能與F結合之反應性基團，尤其係免疫球蛋白Fc區與X，特別是該三重促效劑。
具體地，於本發明中，非肽基連接子可於其末端包含反應性基團以透過與構成接合物的其他組分反應而形成接合物。當兩端具有反應性官能基團之非肽基連接子透過各自之反應性基團與化學式1的X與F結合而形成接合物時，該非肽基連接子或非肽基聚合物可視為非肽基聚合物連接子部分或非肽基連接子部分。
此外，於一具體實施方案中，該接合物可為其中的F與X經非肽基連接子(L)共價相連之接合物，該非肽基連接子(L)於其兩端包含能與F結合之反應基團，尤其係免疫球蛋白Fc區與X，特別是一種肽類藥物。
該非肽基連接子可為但不特別限於包含乙二醇重複單元之連接子，例如聚乙二醇連接子。本領域已知之其衍生物、以及本領域具通常知識者可容易地製備之衍生物亦涵蓋於本發明範圍內。
在本文中，「聚乙二醇連接子(polyethylene glycol linker)」包含結合有兩個或更多個乙二醇重複單元之生物相容性聚合物。該等重複單元並非經由肽鍵而是經由任意之共價鍵相互連接。該聚乙二醇連接子可為構成本發明接合物之部分的組分，且對應於化學式1中之L。
具體地，L(聚乙二醇連接子)可為包含乙二醇重複單元之連接子，例如聚乙二醇，但不以此為限。在本文中，聚乙二醇(polyethylene glycol)為一術語，其包含所有乙二醇同元聚合物、PEG共聚物、或單甲基取代的PEG聚合物(mPEG)，但不特別以此為限。本領域已知之其衍生物、及本領域具通常知識者可容易地製備之衍生物亦涵蓋於本發明範圍內。
聚乙二醇連接子可包含乙二醇重複單元，同時在其末端包含在形成接合物前用於製備接合物之官能基團。在依據本發明之長效接合物中，X與F可經由官能基團彼此連接，但不以此為限。於本發明中，非肽基連接子可包含兩個或三個或更多個官能基團，其中各個官能基團彼此相同或相異，但不以此為限。
具體地，該連接子可為由以下化學式2表示之聚乙二醇(PEG)，但不以此為限：
Figure 110148701-A0202-12-0034-2
其中，n=10至2400、n=10至480、或n=50至250，但不以此為限。
於該長效接合物中，PEG部分可包含-(CH2CH2O)n-結構及介於連接組分與-(CH2CH2O)n-間的氧原子，但不以此為限。
於一具體實施例中，乙二醇重複單元可由例如[OCH2CH2]n表示，其中，n值為自然數，其依平均分子量決定，如肽接合物中[OCH2CH2]n部位的數目平均分子量為大於0kDa至約100kDa，但不以此為限。於另一具體實施例中，n值為自然數，且依平均分子量而決定，以使得其平均分子量，如肽接合物中[OCH2CH2]n部位的數目平均分子量可為約1kDa至約100kDa、約1kDa至約80kDa、約1kDa至約50kDa、約1kDa至約30kDa、約1kDa至約25kDa、約1kDa至約20kDa、約1kDa至約15kDa、約1kDa至約13kDa、約1kDa至約11kDa、約1kDa至約10kDa、約1kDa至約8kDa、約1kDa至約5kDa、約1kDa至約3.4kDa、約3kDa至約30kDa、約3kDa至約27kDa、約3kDa至約25kDa、約3kDa至約22kDa、約3kDa至約20kDa、約3kDa至約18kDa、約3kDa至約16kDa、約3kDa至約15kDa、約3kDa至約13kDa、約3kDa至約11kDa、約3kDa至約10kDa、約3kDa至約8kDa、約3kDa至約5kDa、約3kDa至約3.4kDa、約8kDa至約30kDa、約8kDa至約27kDa、約8kDa至約25kDa、約8kDa至約22kDa、約8kDa至約20kDa、約8kDa至約18kDa、約8kDa至約16kDa、約8kDa至約15kDa、約8kDa至約13kDa、 約8kDa至約11kDa、約8kDa至約10kDa、約9kDa至約15kDa、約9kDa至約14kDa、約9kDa至約13kDa、約9kDa至約12kDa、約9kDa至約11kDa、約9.5kDa至約10.5kDa或約10kDa，但不以此為限。
此外，於一特定實施例中，該接合物可具有如此之結構：其中，三重促效劑(X)與免疫球蛋白Fc區(F)經由包含乙二醇重複單元的連接子(L)彼此共價連接，但不以此為限。
此外，於一具體實施例中，該長效接合物可具有如此之結構：其中，本發明的肽(X)與免疫球蛋白Fc區(F)經由包含乙二醇的重複單元連接子(L)彼此共價連接，但不以此為限。
於另一具體實施例中，於該長效接合物中，L可為包含乙二醇重複單元之連接子，且F可為二聚免疫球蛋白Fc區。更具體地，一個X分子經由包含乙二醇重複單元之連接子與二聚免疫球蛋白Fc區的一個Fc區共價連接，但不以此為限。於又一具體實施例中，包含乙二醇重複單元之連接子的一端可僅與二聚免疫球蛋白Fc區的兩條Fc區鏈中之一條Fc區鏈相連接，但不以此為限。
適用於本發明之非肽基連接子可不受限制地使用，只要它是體內對蛋白水解酶具有抗性的聚合物即可。具體地，該非肽基聚合物的分子量可在大於0kDa和約200kDa的範圍內，具體地在約1kDa至約100kDa的範圍內，更具體地在約1kDa至約50kDa的範圍內，更具體地在約1kDa至20kDa的範圍內，甚至更具體地在約3.4kDa至10kDa的範圍內，甚至更具體地約3.4kDa，但不以此為限。
在本文中，術語「約(about)」包括包含±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1等在內之所有範圍，且包含等於或類似於該術語「約」之後的值的範圍內之所有值，但不以此為限。
具體而言，該非肽基連接子可在F與X不結合之狀態下，於其兩端具有反應性基團，且可經由該等反應性基團與F及X結合。
於一具體實施例中，該連接子兩端可結合免疫球蛋白Fc區的硫醇基、胺基或羥基，及肽(X)的硫醇基、胺基、疊氮基或羥基，但不以此為限。
具體地，該連接子可於其兩端分別包含能與免疫球蛋白Fc區與肽(X)結合之反應性基團，及能與半胱胺酸的硫醇基結合的特異性反應性基團；位於N-末端之胺基、離胺酸、精胺酸、麩醯胺酸及/或組胺酸；及/或免疫球蛋白Fc區C-末端的羥基；以及半胱胺酸之硫醇基團；離胺酸、精胺酸、麩醯胺酸及/或組胺酸之胺基；疊氮基離胺酸之疊氮基團；及/或肽(X)之羥基，但不以此為限。
更具體地，連接子之反應性基團可選自醛基、順丁烯二醯亞胺與琥珀醯亞胺衍生物中的一種或多種，但不以此為限。
在上文中，醛基之示例可包含丙醛基或丁醛基，但不以此為限。
在上文中，琥珀醯亞胺衍生物之示例可包含琥珀醯亞胺基戊酸酯(succinimidyl valerate)、琥珀醯亞胺基甲基丁酸酯(succinimidyl methylbutanoate)、琥珀醯亞胺基甲基丙酸酯(succinimidyl methylpropionate)、琥珀醯亞胺基丁酸酯(succinimidyl butanoate)、琥珀醯亞胺基丙酸酯(succinimidyl propionate)、N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxysuccinimide)、羥基琥珀醯亞胺基 (hydroxy succinimidyl)、琥珀醯亞胺基羧甲基(succinimidyl carboxymethyl)或琥珀醯亞胺基碳酸酯(succinimidyl carbonate)，但不以此為限。
連接子可經由反應性基團與免疫球蛋白Fc區F與肽(三重促效劑)X連接，以轉化為連接子之部分。
此外，經由醛鍵還原胺化產生的最終產物比由醯胺鍵形成之鍵更加穩定。醛反應性基團在低pH條件下選擇性地與N-末端反應，同時在高pH條件下，例如在pH 9.0下，與離胺酸殘基形成共價鍵。
此外，非肽基連接子兩端的反應性基團可為相同也可為相異者，例如，可於兩端提供醛基，於一端可以提供順丁烯二醯亞胺基，於另一端可提供醛基、丙醛基或丁醛基。惟，反應性基團無特別限制，只要F、尤其是免疫球蛋白Fc區與X可連接至非肽基連接子之各個末端即可。
舉例而言，非肽基連接子可包含在一端的順丁烯二醯亞胺基團與在另一端的醛基、丙醛基或丁醛基作為反應性基團。
當使用兩端具有羥基反應性基團的聚乙二醇作為非肽基聚合物時，根據本發明之長效蛋白質接合物可藉由已知之化學反應，將羥基活化為各種反應性基團來製備，或者使用市售之具有經修飾的反應性基團之聚乙二醇。
於一個具體實施例中，非肽基聚合物可連接至X的半胱胺酸殘基，更具體地，半胱胺酸之-SH基團，但不以此為限。
舉例而言，該非肽基聚合物可連接至對應於X的肽中位置10之半胱胺酸殘基、位置24之半胱胺酸殘基或位置40之半胱胺酸殘基，但不特別以此為限。具體而言，非肽基聚合物的反應性基團可連接至半胱胺酸殘基之-SH基團，且上述彼等均應用於反應性基團。
具體而言，非肽基聚合物的反應性基團可連接至半胱胺酸殘基的-SH基團，且上述彼等均應用於反應性基團。當使用順丁烯二醯亞胺-PEG-醛時，順丁烯二醯亞胺基團可經由硫醚鍵與X之-SH基團連接，而醛基團可經由還原烷基化與F的-NH2基團，尤其是免疫球蛋白Fc區連接，但不以此為限，此僅係一個示例。
在另一具體實施例中，該非肽基聚合物可連接至X的離胺酸殘基，更具體為離胺酸之胺基，但不以此為限。
此外，於該接合物中，非肽基聚合物之反應性基團可連接至位於免疫球蛋白Fc區N-末端的-NH2，但此僅係一個示例。
當使用順丁烯二醯亞胺-PEG-醛時，順丁烯二醯亞胺基團可經由硫醚鍵與肽的-SH基團連接，而醛基團可經由還原烷基化與免疫球蛋白Fc區的-NH2基團連接，但不以此為限。此僅係一個示例。
藉此還原性烷基化，免疫球蛋白Fc區的N-末端胺基透過具有-CH2CH2CH2-結構的連接子官能基團與位於PEG一端的氧原子連接，而形成-PEG-O-CH2CH2CH2NH-免疫球蛋白Fc之結構。透過硫醚鍵，可形成其中PEG的一端連接至肽的半胱胺酸中之硫原子結構。上述硫醚鍵可包含此結構：
Figure 110148701-A0202-12-0038-3
然而，本發明並不特別限於上述示例，其僅係一個示例。
此外，於該接合物中，連接子之反應性基團可與位於免疫球蛋白Fc區N-末端的-NH2連接，但此僅係一個示例。
進一步地，於該接合物中，根據本發明的肽可經由C-末端與具有反應性基團的連接子連接，但此僅係一個示例。
在本文中，術語「C-末端」係指肽的羧基末端，且就本發明之目的而言，其係指能與連接子結合之位點。舉例而言，C-末端可包含以下全部：C-末端最末端之胺基酸殘基與鄰近C-末端之胺基酸殘基，具體可包含自最末端起第1個至第20個胺基酸殘基，但C-末端不以此為限。
更進一步，相較於未以F修飾之X，上述接合物可具有增加之功效持久性，且此類接合物不僅可為上述形式，亦可為其中該接合物包封於生物可降解奈米粒子內之形式。
同時，關於上述三重促效劑及其長效接合物，國際專利公開第WO 2017/116204號與第WO 2017/116205號揭示之內容係藉由引用其整體併入本文。
本發明又一方面提供編碼該肽(三重促效劑)或接合物之多核苷酸、包含該多核苷酸之重組表現載體、以及包含該多核苷酸或該重組表現載體之轉形體。
該肽與接合物係與如上所述相同者。
此外，編碼該肽或接合物之分離的多核苷酸可包括與本發明範圍內相應序列具有75%或更高、具體地85%或更高、更具體地係90%或更高、更具體地95%或更高序列同一性之多核苷酸序列。
在本文中，術語「重組載體(recombinant vector)」係指DNA構建體，其中之靶標肽，例如，肽可操作地連接至適宜調節序列以使靶標肽表現，例如適宜宿主中之肽。
調節序列包括能啟動轉錄的啟動子、用於調節此類轉錄的任意操縱子序列、編碼合適的mRNA核醣體結合位點之序列，以及用於調節轉錄與轉譯終止之序列。該重組載體可轉化至適當的宿主細胞中，隨後可獨立於宿主基因組複製或產生作用，或者可整合至宿主之基因組中。
本發明中使用的重組載體無特別限制，只要其能於宿主細胞中複制即可，可使用本領域習知之任意載體來製備。普遍使用之載體的實例可包括天然或重組質粒、黏質體、病毒和噬菌體。可用於本發明的載體無特別限制，可使用任意已知之表現載體。
為生產本發明之該肽或該接合物，該重組載體係用於轉化宿主細胞。此外，作為本發明一部分的轉化細胞可係用於擴增本發明的核酸片段與載體，或用於重組生產本發明的該肽或接合物之培養細胞或細胞株。
在本文中，「轉化(transformation)」係指將包含編碼靶標蛋白之多核苷酸的重組載體引入宿主細胞，使得由多核苷酸編碼之蛋白質於宿主細胞中表現。只要轉化的多核苷酸可於宿主細胞中表現，其可插入並處於宿主細胞的染色體中、或存在於染色體外，或為兩種情況之任一者。
此外，多核苷酸包括編碼靶標蛋白的DNA與RNA。多核苷酸可以任何形式引入，只要可引入宿主細胞並在其中表現即可。舉例而言，可將多核苷酸以表現匣(expression cassette)形式引入宿主細胞，表現匣為一種基因構建體，包括其自主表現所需的所有組分。通常，表現匣可包括與多核苷酸有效連接之啟動子、轉錄終止訊號、核醣體結合位點與轉譯終止訊號。表現匣可為可自我複制之表現載體的形式。此外，可將多核苷酸原狀引入宿主細胞中，並可操作地連接到宿主細胞中表現所需之序列，但不以此為限。
在本文中，術語「可操作地連接(operably linked)」係指啟動與介導編碼本揭露之該肽或接合物的多核苷酸之轉錄的啟動子序列，與多核苷酸序列間的功能性連接。
適用於本發明之宿主無特別限制，只要其允許表現本發明之多核苷酸即可。可用於本發明的宿主之具體示例可包括大腸桿菌屬(Escherichia)的細菌，例如大腸桿菌(E.coli)；芽孢桿菌屬(Bacillus)細菌，例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；假單胞菌屬細菌(Pseudomonas)，例如惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)；酵母，例如畢赤酵母(Pichia pastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；昆蟲細胞，如草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda，Sf9)；以及動物細胞如CHO、COS、BSC等。
本發明又一方面提供了製備該肽或該接合物之方法。
該肽與該接合物係與如上所述相同者。
本發明的該肽可依據其長度，藉由所屬技術領域中習知方法合成，例如藉由自動肽合成儀，且可藉由基因工程技術生產。
具體地，本發明之肽可藉由標準合成方法、重組表現系統或其他所屬技術領域已知的任何方法製備之。據此，根據本發明之肽可以藉由複數種方法合成，包括以下方法：
(a)藉由固相或液相方法以分步或片段組裝的方式合成肽，隨後單離與純化最終肽產物之方法；或
(b)於宿主細胞中表現編碼肽之核酸構建體，並從宿主細胞培養物回收表現產物之方法；或
(c)進行編碼肽之核酸構建體的體外無細胞表現，並從中回收表現產物之方法；或
藉由方法(a)、(b)和(c)之任意組合獲得肽片段、藉由連接該等肽片段而獲得肽，且隨後回收肽之方法。
更具體的實施例係可藉由遺傳操作，藉製備編碼包含融合配偶體與該肽之融合蛋白的融合基因，將融合基因轉化至宿主細胞中，以融合蛋白形式表現融合基因，並使用蛋白酶或化合物從融合蛋白中裂解與分離肽。以及使用蛋白酶或化合物從融合蛋白中裂解與分離肽。為了此目的，舉例而言，可被蛋白酶如因子Xa、或腸激酶、或化合物如CNBr或羥胺裂解之胺基酸殘基編碼DNA序列可插入融合配偶體與編碼該肽之多核苷酸間。
本發明之接合物可藉由同時或順序反應，將該肽與連接子與生物相容性物質連接來加以製備，只要該接合物具有如此之形式：作為最終產物，該肽與該生物相容性物質經由接接子加以連結，連接的順序、方法、反應條件等並無特別限制。
本發明又一方面提供包含該肽或該接合物之組成物。
該肽與該接合物與上述相同。
包含本發明之該肽或該長效接合物的組成物，可係用於預防或治療代謝症候群的組成物，尤其係用於預防或治療代謝症候群之醫藥組成物。舉例而言，該組成物可係用於預防或治療代謝症候群的醫藥組成物，包括藥學上可接受之賦形劑；以及醫藥有效量之該肽或該長效接合物，但並不以此為限。
在本文中，術語「醫藥有效量(pharmaceutically effective amount)」可指該肽或其長效接合物對代謝症候群展現預防或治療效果，但對病患不具毒 性或副作用之安全給藥劑量。具體而言，醫藥有效量可指能夠對GLP-1受體、升糖素受體和GIP受體表現出顯著活性之劑量，但不以此為限。
於本發明的一個具體實施例中，該組成物可係用於預防或治療代謝症候群之醫藥組成物，包括含有選自SEQ ID NO：1至12之胺基酸序列所組成之群組的肽或其長效接合物，但不以此為限。
該「肽」與「接合物」與上述相同。
在本文中，「預防(preventing)」係指透過施用該肽、接合物或包含其的組成物，而與抑制或延遲代謝症候群發作相關之所有作用，且術語「治療(treating)」係指藉由施用施用該肽、接合物或包含其的組成物，而與代謝症候群症狀改善或有利改變相關之所有作用。
在本文中，術語「給藥(administering)」係指藉由適當方式將特定物質引入患者體內。給藥途徑可係但不特別限於能將該組成物遞送至體內靶標組織之常用途徑，例如腹膜內、靜脈內、肌內內、皮下、皮內、口服、局部、鼻內、肺內和直腸內給藥。
在本文中，術語「代謝症候群(metabolic syndrome)」係指由慢性代謝異常引起之各種疾病單獨或合併發生之症狀。具體而言，代謝症候群對應之疾病可包括葡萄糖耐性下降、高膽固醇血症、血脂異常、肥胖、糖尿病、高血壓、血脂異常引起之動脈硬化、動脈粥樣硬化、動脈硬化及冠狀動脈心臟病等，但不以此為限。
在本文中，術語「肥胖(obesity)」係指體內脂肪組織過度堆積，定義為身體質量指數(體重(kg)除以身高(m)的平方)在25以上。肥胖通常係由於長期攝入過多營養物質與能量消耗間之能量失衡所造成。肥胖為一種影 響全身之代謝疾病，會增加罹患糖尿病和高脂血症的風險及罹患性功能障礙、關節炎、心血管疾病風險，在某些情況下，還與癌症有關。
在本文中，術語「糖尿病(diabetes)」係指一種代謝疾病，例如缺乏胰島素分泌或功能異常，其特徵在於血液中葡萄糖上升時發生之高血糖症。糖尿病係指高血糖引起各種症狀與徵候，並導致葡萄糖排出至尿液中之疾病。本發明中之糖尿病不僅包括1型糖尿病與2型糖尿病，尚包括肥胖型糖尿病、糖尿病之併發症，及其類似者。
在本文中，術語「肥胖型糖尿病(obesity-type diabetes)」係指具有肥胖症狀而導致之糖尿病，特別是2型糖尿病或2型糖尿病患者之肥胖症狀。約80%至90%的2型糖尿病患者有肥胖症狀，此類患者的特點是胰島素阻抗。適當的運動、飲食和藥物治療可預防與緩解肥胖型糖尿病。於本發明中，肥胖型糖尿病可由肥胖引起。
在本文中，術語「糖尿病併發症(diabetes complications)」係指當長期處於高血糖時，體內出現之各種病理症狀，糖尿病併發症的實施例有視網膜病變、腎功能不全、神經病變、由於血管疾病引起之中風、腎臟或心臟病或糖尿病足潰瘍，以及心血管疾病，但不以此為限。當血糖於長時間維持於高血糖狀態時，視網膜病變、腎功能障礙、神經病變、血管疾病引起之中風、腎臟或心臟病或糖尿病足潰瘍以及心血管疾病的風險會增加。因此，有效血糖管理對於預防這些併發症至關重要。
在本文中，術語「血脂異常(dyslipidemia)」係指膽固醇與三酸甘油酯超出正常範圍之狀態，具體係指血液中之總膽固醇(total cholesterol)、 低密度脂蛋白膽固醇(LDL cholesterol)與三酸甘油酯(triglycerides)升高，或高密度脂蛋白膽固醇(HDL cholesterol)降低之狀態。
本發明之醫藥組成物尚可包含藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。此類藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑可為非天然存在者。
在本文中，術語「藥學上可接受的(pharmaceutically acceptable)」係指足以展現治療效果而不引起副作用的量，且可由本領域技術人員基於醫學領域周知之因素容易地確定，例如疾病類型、患者年齡、體重、健康狀況、性別、對藥物的敏感性、給藥途徑、給藥方法、給藥頻率、治療時間、聯合或併用藥物。
包含本發明之三重促效劑的醫藥組成物可進一步包含藥學上可接受之載劑。儘管對載劑無特別限制，但黏合劑、潤滑劑、崩解劑、賦形劑、增溶劑、分散劑、穩定劑、助懸劑、著色劑與調味劑可用於口服給藥；緩衝劑、防腐劑、鎮痛劑、增溶劑、等滲劑與穩定劑可組合用於注射製劑中；局部給藥製劑中可使用基質、賦形劑、潤滑劑、防腐劑等。
本發明組成物可與上述藥學上可接受之載劑組合製成各種形式。舉例而言，對口服給藥而言，可將組成物配製為錠劑、口含錠、膠囊、酏劑、混懸劑、糖漿劑、薄片等。對注射製劑而言，可將組成物配製為單劑量安瓿或多劑量的形式。該組成物尚可配製為溶液、混懸劑、錠劑、丸劑、膠囊劑、緩釋製劑等。
同時，適用於製劑之載體、賦形劑與稀釋劑的實例可包含：乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、澱粉、阿拉伯膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸鎂或 礦物油。此外，該組成物尚可包含填充劑、抗凝劑、潤滑劑、保濕劑、調味劑、防腐劑等。
另外，本發明之醫藥組成物可具有選自錠劑、丸劑、粉末劑、顆粒劑、膠囊劑、混懸劑、內服劑、乳劑、糖漿劑、滅菌水溶液、非水溶劑、冷凍乾燥製劑與栓劑中的任一種劑型。
此外，根據本領域中常用之方法，該組成物可配製為適於投予至患者體內之單位劑型，尤其是適於蛋白質藥物給藥的形式，並經由口服給藥途徑，或以本領域習知的腸胃外給藥途徑給藥，諸如皮內、靜脈內、肌肉內、動脈內、髓內、鞘內、心室內、肺內、經皮、皮下、腹膜內、鼻內、腸內、局部、舌下、陰道或直腸途徑等，但不以此為限。
此外，三重促效劑或其結合物可與允許作為藥物之各種載體組合使用，例如食鹽水溶液或有機溶劑。作為藥物，可使用碳水化合物如葡萄糖、蔗糖或葡聚醣等、抗氧化劑如抗壞血酸(ascorbic acid)或麩胱甘肽(glutathione)等、螯合劑、低分子量蛋白質或其他安定劑來提高穩定性或吸收性。
本發明之醫藥組成物的給藥劑量與給藥頻率，可依據作為活性成分之藥物種類及所治療之疾病、給藥途徑、患者年齡、性別、體重以及疾病嚴重程度等各種相關因素所決定。
本發明組成物之總有效劑量可單次向患者給藥，或可依據分次治療方案分成多次長期給予。在本發明之醫藥組成物中，活性成分含量可依據疾病嚴重程度而變更。具體地，本發明接合物之較佳總日劑量可為每1kg患者體重約0.0001mg至500mg。惟，除了醫藥組成物的給藥途徑與治療頻率外，該肽或其接合物之有效劑量係慮及多種因素來決定，包括患者之年齡、體重、健康狀況、 性別、疾病嚴重程度、飲食與排除速率。於此方面，本領域技術人員可容易地確定適用於本發明組成物的特定用途之有效劑量。本發明醫藥組成物只要能展現本發明之效果，其製劑、給藥途徑與方式並無特別限定。
本發明的醫藥組成物可具有優異的體內持續時間和效價，從而明顯地降低本發明藥物製劑的給藥次數和頻率。
具體地，本發明的三重促效劑、其長效接合物或包含其的組成物可以每週一次、每兩週一次、每四周一次或每月一次給藥，但不以此為限。
本發明的又一方面提供一種預防或治療代謝症候群的方法，該方法包括將該肽或該肽的接合物、或包含其的組成物，給藥至有其需要的個體的步驟。
該肽或包含其的組成物、代謝症候群、預防和治療係與如上所述相同者。
本發明中，個體係指疑似患有代謝症候群的個體，疑似患有代謝症候群的個體係指患有代謝症候群或具有代謝症候群風險的哺乳動物，例如人類、大鼠、家畜等，但可包括但不限於可以本發明的該肽、該接合物或包含其的組成物治療的任何個體。
本發明之方法可包括施用醫藥有效量的包含該肽的醫藥組成物。合適之每日總劑量可由醫師於正確的醫療決策範圍內決定，可單次給藥或分多次給藥。然而，就本發明之目的而言，較佳的是，針對特定患者的特定治療有效量將取決於各種因素，包括欲達成的反應類型與程度、特定組成物、某些情況下包括是否有合併使用其他藥物、患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食、 給藥時間、給藥途徑與組成物的排除速率、治療持續時間、與特定組成物合併使用或同時使用的藥物，以及醫學領域習知的類似因素。
具體地，本發明之三重促效劑、其長效接合物、或包含其的組成物可以每週給藥一次、每兩週給藥一次、每四周給藥一次或每月給藥一次，但不以為限。
本發明的又一方面提供該肽、該肽的接合物、或包含其的組成物，於預防或治療代謝症候群的用途。
本發明的又一方面提供該肽、該肽的接合物、或包含其的組成物，於製備代謝症候群的預防劑或治療劑的用途。
該肽、該肽之接合物、或包含其的組成物，以及代謝症候群之預防和治療與上述相同。
[發明模式]
下文中，將參考以下實施例更詳細闡述本發明。然而，該等實施例僅用於說明之目的，本發明範圍不受該等實施例限制。
實施例1：三重促效劑之製備
製備對GLP-1、GIP和升糖素受體均具有活性之三重促效劑，其序列如下表1所示。
[表1]
Figure 110148701-A0202-12-0049-4
於表1所揭序列中，X表示的胺基酸代表非天然胺基酸Aib(胺基異丁酸)，而下劃線和粗體的胺基酸則表示該下劃線和粗體的胺基酸彼此形成環。同時，藉由使用合成儀的固相肽合成方法來製備該等肽。當藉由固相肽合成法、使用合成儀製備C-末端醯胺化的三重促效劑時，採用醯胺樹脂進行C-末端醯胺化。
實施例2：三重促劑長效接合物之製備
(1)三重促效劑長效接合物之製備例1
為使兩端分別具有順丁烯二醯亞胺(maleimide)基和醛基的10kDa PEG(即順丁烯二醯亞胺-PEG-醛(10kDa，NOF，Japan))聚乙二醇化至實施例1之各三重促效劑的半胱胺酸殘基上，由各三重促效劑與順丁烯二醯亞胺-PEG-醛以蛋白質濃度為1mg/mL至5mg/mL及1：1至3的莫耳比，在低溫下反應0.5至3小時。於此例中，反應係在包含50mM Tris緩衝液(pH 7.5)的環境中進行，該50mM Tris緩衝液中添加有20%至60%異丙醇。反應終止後，將反應溶液施加於SP sepharose HP(GE Healthcare，USA)，以純化在半胱胺酸上經單聚乙二醇化(mono-pegylated)的各三重促效劑。
接著，由經純化的單聚乙二醇化三重促效劑與免疫球蛋白Fc，以1：1至5莫耳比、蛋白質濃度10mg/mL至50mg/mL，在4℃至8℃下反應12至18小時。反應係在已添加10mM至50mM氰基硼氫化鈉(作為還原劑)及10%至30%異丙醇到100mM磷酸鉀緩衝液(pH 6.0)之環境中所進行。待反應完成後，取反應物加至丁基瓊脂(butyl sepharose)FF純化管柱(GE Healthcare，USA)與Source ISO純化管柱(GE Healthcare，USA)，以從反應溶液中純化包含三重促效劑與免疫球蛋白Fc的接合物。
關於該免疫球蛋白區域，各具有SEQ ID NO：33之胺基酸序列(由221個胺基酸組成)的兩個單體係經各單體位置3之半胱胺酸胺基酸間的二硫鍵形成同源二聚體，其中，該同源二聚體的單體各自獨立地在位置35和95半胱胺酸間形成內二硫鍵(intra-disulfide bond)，以及在位置141和199半胱胺酸間形成內二硫鍵。
製備後，藉由反相色層分析、粒徑排阻層析法與離子交換層析法分析，得知純度為95%或更高。
(2)三重促效劑長效接合物之製備例2
為使3.4kDa或10kDa ALD(2)PEG(聚乙二醇，其中在兩端的氫係經丙醛基團修飾；NOF，日本)聚乙二醇化至實施例1中各三重促效劑之賴胺酸殘基(lysine residue)或N-末端，各三重促效劑與PEG以1：5至1：20的莫耳比與5mg/mL至10mg/mL蛋白質濃度，於2℃至8℃下反應4至16小時。於此例中，反應係在20mM HEPES(pH 7.5)和乙醇中，並將20mM氰基硼氫化鈉作為還原劑加至反應中所進行。使用Source 15S管柱(GE，US)純化反應溶液，使用氯化鉀濃度梯度與含有檸檬酸鈉(pH 2.0)及乙醇的緩衝液純化單聚乙二醇化三重促效劑。
經純化之單聚乙二醇化三重促效劑與免疫球蛋白Fc區的接合物係依據相同於製備例1的反應及純化條件加以製備及純化。
實施例3：三重促效劑之體外活性測量
為測量實施例1中製備之三重促效劑之活性，使用各含有經轉化之GLP-1受體、升素(GCG)受體或GIP受體的細胞係來測量體外細胞活性。
各細胞系均經過轉化，在中國倉鼠卵巢(CHO)中表現人類GLP-1受體、人類升糖素受體或人類GIP受體之基因，故適用於量測GLP-1、升糖素或GIP的活性。因此，該經轉化為具有各受體的細胞系，係用於測量各受體的活性。
為測量實施例1中製備之三重促效劑的GLP-1、升糖素和GIP活性，將實施例1中製備之人類GLP-1、升糖素、GIP及三重促效劑從50nM到0.000048nM進行4倍連續稀釋。將表現人類GLP-1、升糖素或GIP受體的CHO細胞分別在384孔板中培養24小時。從中除去培養基，將循序稀釋之材料分別以5μL的量加入板中。隨後，加入5μL含有cAMP抗體之緩衝液，在室溫下溫 育15分鐘。然後，向其中加入10μL含有細胞裂解緩衝液的檢測混合物以裂解細胞並在室溫下反應90分鐘。反應完成後，將細胞裂解物施於LANCE cAMP試劑組(PerkinElmer，USA)，以通過累積的cAMP計算EC50值，並將這些值相互比較。作為結果，其相對於人類GLP-1、升糖素和GIP的活性示於表2中。於表2中，經確認活性的SEQ ID NO：1至12之三重促效劑肽為C-末端醯胺化物三重促效劑。
[表2]
Figure 110148701-A0202-12-0052-5
以上製備之肽具有三重促效劑之功能，能活化GLP-1受體GIP受體和升糖素受體之全部。
上述實驗結果顯示，本發明三重促效劑具有能活化升糖素、GLP-1與GIP受體之全部的三重促效劑之功能，顯示其作為代謝症候群治療劑的潛力。
關於以上的描述，所屬領域技術人士將理解，本揭露可以不同具體形式實施之而不改變其技術構思或本質特徵。在此應理解，上述具體實施例於所有態樣中均為說明性的，並不限制本發明。本揭露的範圍由所附申請專利範圍而非之前的描述來定義，因此，所有落於申請專利範圍內之變更與修改，或該等範圍之等同物，皆涵蓋於本申請專利範圍內。

Claims (23)

  1. 一種對升糖素受體、類升糖素肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)受體及葡萄糖依賴性促胰島素多肽(glucose-dependent insulinotropic polypeptide，GIP)受體具有活性之肽，該肽包含選自由SEQ ID NOS：1至12所組成之群組中的序列的任一者。
  2. 如請求項1所述的肽，其中，相較於天然的人類GLP-1、升糖素及GIP之活性，該肽對於GLP-1受體、升糖素受體及GIP受體具有10%或更高的活性。
  3. 如請求項1所述的肽，其中，相較於天然的人類GLP-1、升糖素及GIP之活性，該肽對於GLP-1受體、升糖素受體及GIP受體具有70%或更高的活性。
  4. 如請求項1所述的肽，其中，相較於天然的人類GLP-1之活性，該肽對於GLP-1受體具有70%或更高的活性。
  5. 如請求項1所述的肽，其中，相較於天然的人類升糖素之活性，該肽對於升糖素受體具有70%或更高的活性。
  6. 如請求項1所述的肽，其中，相較於天然的人類GIP之活性，該肽對於GIP受體具有70%或更高的活性。
  7. 如請求項1所述的肽，其中，相較於天然的升糖素之活性，該肽對於升糖素受體具有100%或更高的活性，同時，相較於天然GLP-1及GIP之活性，該肽對於GLP-1受體及GIP受體二者均具有10%或更高的活性。
  8. 如請求項1所述的肽，其中，相較於天然GIP之活性，該肽對於GIP受體具有100%或更高的活性，同時，相較於天然GLP-1及升糖素之活性，該肽對於GLP-1受體及升糖素受體二者均具有10%或更高的活性。
  9. 如請求項1所述的肽，其中，其N-末端起位置12之胺基酸及位置16之胺基酸，或位置16之胺基酸及位置20之胺基酸形成環。
  10. 如請求項1所述的肽，其中，該肽之C-末端係經醯胺化的。
  11. 一種下列化學式1所示之長效接合物：
    [化學式1]X-L-F
    其中，X表示如請求項1至10中任一項所述的肽；
    L表示包含乙二醇重複單元之連接子，
    F表示免疫球蛋白Fc區，以及
    「-」表示X與L之間以及L與F之間的共價鍵。
  12. 如請求項11所述的長效接合物，其中，該免疫球蛋白Fc區為源自IgG、IgA、IgD、IgE、或IgM、或其組合、或其雜合體之免疫球蛋白Fc區。
  13. 如請求項11所述的長效接合物，其中，該免疫球蛋白Fc區為IgG4 Fc區。
  14. 如請求項11所述的長效接合物，其中，該免疫球蛋白Fc區係無糖基化的。
  15. 如請求項11所述的長效接合物，其中，L中的該乙二醇重複單元部分之分子量範圍在1kDa至100kDa之間。
  16. 如請求項11所述的長效接合物，其中，L為聚乙二醇。
  17. 如請求項11所述的長效接合物，其中，F為二聚體免疫球蛋白Fc區。
  18. 如請求項17所述的長效接合物，其中，一個X分子係經由包含乙二醇重複單元之連接子共價連接至該二聚體免疫球蛋白Fc區的一個Fc區。
  19. 如請求項17所述的長效接合物，其中，該包含乙二醇重複單元之連接子的一端係僅連接至該二聚免疫球蛋白Fc區的兩條Fc區鏈的一條Fc區鏈。
  20. 一種用於預防或治療代謝症候群之醫藥組成物，該醫藥組成物包含如請求項1至10中任一項所述的肽。
  21. 如請求項20所述的醫藥組成物，其中，該肽為長效接合物的形式，其為下列化學式1所示：
    [化學式1]X-La-F
    其中，X表示如請求項1至10中任一項所述的肽；
    L表示包含乙二醇重複單元之連接子；
    F表示免疫球蛋白Fc區；以及
    「-」表示X與L之間以及L與F之間的共價鍵。
  22. 如請求項20所述的醫藥組成物，其中，該代謝症候群係選自由以下組成之群組的一者或多者：葡萄糖耐受性受損、高膽固醇血症、血脂異常、肥胖、糖尿病、高血壓、血脂異常誘發型動脈硬化、動脈粥狀硬化、動脈硬化及冠狀動脈心臟病。
  23. 一種編碼如請求項1至10中任一項所述的肽的多核苷酸。
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