JP2022551282A - グルカゴン、及びｇｌｐ－１受容体及びｇｉｐ受容体二重アゴニストを含む組成物及びその治療学的使用 - Google Patents

グルカゴン、及びｇｌｐ－１受容体及びｇｉｐ受容体二重アゴニストを含む組成物及びその治療学的使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、グルカゴン誘導体；及びＧＬＰ-１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを含む組成物及びその使用に関する。

Description

本発明は、グルカゴン活性を有する化合物または物質とＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストとを含む組成物及びその治療学的使用に関する。
最近、経済的発展と食習慣などの変化により肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化、高インスリン血症、糖尿病または肝疾患など多様な疾患を含むメタボリックシンドローム関連疾患の発病が急増している状況である。このような疾患は、それぞれ発生することもあるが、一般には、互いに密接な関連を結んでいながら複数の症状を伴って発生する場合が大部分である。
過体重及び肥満は、血圧とコレステロール数値を増加させて心臓疾患、糖尿、関節炎などの各種疾患の発病または悪化の原因になっている。また、過体重及び肥満は成人だけでなく、子供や青少年でも動脈硬化、高血圧、高脂血症または心臓疾患などの発病率を増加させる主要な要因になっている。
肥満は食欲調節及びエネルギー代謝の作用機序が関与した複雑な疾患であるため、食欲調節及びエネルギー代謝と関連した非正常な作用機序を治療する方法が同時に行われなければならないため、上記非正常な作用機序を治療する医薬を開発しようとする努力が続いている。上述した努力の結果として、リモナバント（Ｒｉｍｏｎａｂａｎｔ， Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ）、シブトラミン（Ｓｉｂｕｔｒａｍｉｎ， Ａｂｂｏｔｔ）、コントレイブ（Ｃｏｎｔｒａｖｅ， Ｔａｋｅｄａ）、オルリスタット（Ｏｒｌｉｓｔａｔ， Ｒｏｃｈｅ）などの肥満治療剤が開発されたが、これらは致命的な副作用を示したり肥満治療効果が不備であるという短所があった。例えば、リモナバントは中枢神経障害の副作用を示し、シブトラミンとコントレイブは心血管の副作用を示し、オルリスタットは１年間服用時に約４ｋｇの体重減少効力が示されるに過ぎないことが報告された。
一方、肥満をはじめとするメタボリックシンドロームは、肝臓でも疾患を引き起こす可能性を高める。その例としては、代謝性肝疾患、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝疾患、脂肪肝炎、肝線維症などが挙げられる。このような肝疾患は、肥満及び糖尿病人口が増加するにつれて共に増加している傾向であり、韓国でも年間発症率が約１６％に達している。肝疾患は初期に自覚症状がなく、かなり進んでこそ発見されるため、韓国内だけでなく、世界的に死亡原因の数位を占めており、薬物開発の必要性が高い。
一方、グルカゴンは、薬物治療または疾病、ホルモンや酵素欠乏などの原因として血糖が落ち出すと膵臓で生産される。グルカゴンは肝臓でグリコーゲンを分解してグルコースを放出するように信号し、血糖水準を正常水準まで高める役割をする。しかし、グルカゴンは、低溶解度と中性ｐＨでの沈殿により治療剤としてその使用が制限されてきた。
このようなグルカゴンの誘導体の一つであるグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）は、食物摂取に刺激を受け、小腸から分泌されるホルモンであり、血糖濃度依存的に膵臓におけるインスリン分泌を促進し、グルカゴンの分泌を抑制して血糖濃度を下げる作用を助ける。また、満腹因子として作用して胃腸の消化作用を遅らせ、食物消化物の胃腸通過時間を遅延させて食物の摂取を減らす役割を担う。
ＧＬＰ－１と共に食物摂取に刺激を受けて分泌される胃腸ホルモンの一つであるＧＩＰは、小腸のＫ細胞から分泌される４２個のアミノ酸からなるホルモンであり、血糖濃度に依存して膵臓におけるインスリン分泌を促進し、血糖濃度を下げるのに役立つ機能を果たし、ＧＬＰ－１の活性増加効果、抗炎症効果、脂質代謝改善の効果などが報告された。
そこで、ＧＬＰ－１の血糖制御及び体重減少効果を利用して糖尿病や肥満の治療剤として開発しようとする研究が活発に進められている。しかし、ＧＬＰ－１だけでは、ＨｂＡ１ｃの減少が０．５％～１．８％しか見られず、ＨｂＡ１ｃが９％以下の患者に適切であると考えられる（Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ． ２０１５ Ｆｅｂ； ６（１）： ３－１８）。即ち、ＧＬＰ－１単独投与だけでは期待できる血糖調節能力の限界がある。
そこで、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ受容体を同時に活性化させる二重アゴニストの研究が行われ、このような二重アゴニストの例は、国際公開公報ＷＯ２０１３１６４４８３、国際公開公報ＷＯ２０１６１１１９７１、国際公開公報ＷＯ２０１４１９２２８４などに記載されている。
上記グルカゴン及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストは、一般に、互いに反対の作用をすることが知られており、互いに異なる病症に対する治療剤として使用されてきた。即ち、グルカゴン及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストは、体内で互いに反対となる役割をするため、これを共に投与する薬物治療法はまだ伝えられていない。一方、多様なメタボリックシンドロームに関連する治療剤は患者に投与する場合、体重増加と過多投与、低血糖のような副作用の危険が存在する。
国際公開公報ＷＯ２０１３／１６４４８３ 国際公開公報ＷＯ２０１６／１１１９７１ 国際公開公報ＷＯ２０１４／１９２２８４ 国際特許公開第ＷＯ９７／３４６３１号明細書 国際特許公開第９６／３２４７８号明細書
Ther Adv Endocrinol Metab. 2015 Feb; 6(1): 3－18 H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979 G.J. Webbら、J. Autoimmunity、2015 Nov; 64:42－52
本発明の一つの目的は、グルカゴン受容体に対する活性を有する物質、及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを含むメタボリックシンドロームの予防または治療用薬学的組成物に関する。
本発明のもう一つの目的は、グルカゴン受容体に対する活性を有する物質、及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを、これを必要とする個体に投与する段階を含む、メタボリックシンドロームの予防または治療方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、グルカゴン受容体に対する活性を有する物質、及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストのメタボリックシンドロームの予防または治療への使用を提供することにある。
本発明を具現する一つの態様は、グルカゴン受容体に対する活性を有する物質及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを併用する治療学的使用である。
一具体例において、本発明は、グルカゴン受容体に対する活性を有する物質及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを含む組成物に関する。
先の具体例において、本発明は、グルカゴン受容体に対する活性を有する物質及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを含むメタボリックシンドロームの予防または治療用薬学的組成物に関する。
先の具体例（ら）において、上記グルカゴン受容体に対する活性を有する物質は、下記一般式１のアミノ酸配列を含むペプチドであることを特徴とする：
Ｘ１－Ｘ２－ＱＧＴＦ－Ｘ７－ＳＤ－Ｘ１０－Ｓ－Ｘ１２－Ｘ１３－Ｘ１４－Ｘ１５－Ｘ１６－Ｘ１７－Ｘ１８－Ｘ１９－Ｘ２０－Ｘ２１－Ｆ－Ｘ２３－Ｘ２４－Ｗ－Ｌ－Ｘ２７－Ｘ２８－Ｘ２９－Ｘ３０（一般式１、配列番号４６）
上記式において、
Ｘ１はチロシン（Ｙ）であり、
Ｘ２はアルファ－メチル－グルタミン酸（α－ｍｅｔｈｙｌ－ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）、Ａｉｂ（ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、Ｄ－アラニン、グリシン（Ｇ）、Ｓａｒ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）、セリン（Ｓ）またはＤ－セリンであり；
Ｘ７はトレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）またはシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１０はチロシン（Ｙ）またはシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１２はリシン（Ｋ）またはシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１３はチロシン（Ｙ）またはシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１４はロイシン（Ｌ）またはシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１５はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）またはシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１６はグルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）、アルファーメチル－グルタミン酸、またはシステイン（Ｃ）であるか、不在であり；
Ｘ１７はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、システイン（Ｃ）、またはバリン（Ｖ）であるか、不在であり；
Ｘ１８はアラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アルギニン（Ｒ）、バリン（Ｖ）、またはシステイン（Ｃ）であるか、不在であり；
Ｘ１９はアラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）、またはシステイン（Ｃ）であるか、不在であり；
Ｘ２０はリシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アルギニン（Ｒ）、アルファ－メチル－グルタミン酸、またはシステイン（Ｃ）であるか、不在であり；
Ｘ２１はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、またはシステイン（Ｃ）であるか、不在であり；
Ｘ２３はイソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、またはアルギニン（Ｒ）であるか、不在であり；
Ｘ２４はバリン（Ｖ）、アルギニン（Ｒ）、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、グルタミン酸（Ｅ）、リシン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、アルファ－メチル－グルタミン酸、またはロイシン（Ｌ）であるか、不在であり；
Ｘ２７はイソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、リシン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、グルタミン（Ｑ）、またはアルギニン（Ｒ）であるか、不在であり；
Ｘ２８はグルタミン（Ｑ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、またはアルギニン（Ｒ）であるか、不在であり；
Ｘ２９はトレオニン（Ｔ）であり、
Ｘ３０はシステイン（Ｃ）であるか、不在である。
（ただし、上記一般式１のアミノ酸配列が配列番号１または配列番号１２と同一の場合は除く）。
先行する具体例（ら）において、
前記ペプチドは持続型結合体の形態であり、前記持続型結合体は下記化学式（１）で表されることを特徴とする：
Ｘ－Ｌ－Ｆ・・・（１）
ただし、このとき、Ｘは上記一般式１のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
Ｌはエチレングリコール繰り返し単位を含むリンカーであり、
Ｆは免疫グロブリンＦｃ領域であり、
－はＸとＬの間、ＬとＦの間の共有結合連結を表す。
先の具体例（ら）において、上記一般式１において、
Ｘ２がＡｉｂ（ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）であり、
Ｘ７はトレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）またはシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１０はチロシン（Ｙ）であり、
Ｘ１２はリシン（Ｋ）であり、
Ｘ１３はチロシン（Ｙ）であり、
Ｘ１４はロイシン（Ｌ）またはシステイン（Ｃ）であり、
Ｘ１５はアスパラギン酸（Ｄ）であり、
Ｘ１６はグルタミン酸（Ｅ）またはセリン（Ｓ）であり、
Ｘ１７はリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはシステイン（Ｃ）であり、
Ｘ１８はアルギニン（Ｒ）であり、
Ｘ１９はアラニン（Ａ）、またはシステイン（Ｃ）であり、
Ｘ２０はグルタミン（Ｑ）、またはリシン（Ｋ）であり、
Ｘ２１はアスパラギン酸（Ｄ）、またはグルタミン酸（Ｅ）であり、
Ｘ２３はバリン（Ｖ）であり、
Ｘ２４はグルタミン（Ｑ）であり、
Ｘ２７はメチオニン（Ｍ）であり、
Ｘ２８はアスパラギン（Ｎ）であり、
Ｘ２９はトレオニン（Ｔ）であり、
Ｘ３０はシステイン（Ｃ）であるか、不在であることを特徴とする。
上記の具体例（ら）において、前記ペプチドは、配列番号２～４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
先の具体例（ら）において、前記ペプチドは、配列番号７～１１、及び１３～２５、２７、２９、３１、３３、３５～４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
先の具体例（ら）において、前記ペプチドは、配列番号２０、２２、２３、２７、３３、３５、３７、３８、４０、４１、４２、及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
先の具体例（ら）において、一般式１のＸ１０とＸ１４、Ｘ１２とＸ１６、Ｘ１６とＸ２０、Ｘ１７とＸ２１、Ｘ２０とＸ２４、及びＸ２４とＸ２８のアミノ酸対のうち、少なくとも一つのアミノ酸対においてそれぞれのアミノ酸が環を形成することを特徴とする。
先の具体例（ら）において、前記ペプチドのＣ末端がアミド化したことを特徴とする。
先の具体例（ら）において、上記ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストは、ＧＬＰ－１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－１）受容体及びＧＩＰ（Ｇｌｕｃｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）受容体に対して活性を有する物質であることを特徴とする。
先の具体例（ら）において、上記ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストは、ｔｉｒｚｅｐａｔｉｄｅ、ＮＮ９７０９、及びＳＡＲ－４３８３３５からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする。
先の具体例（ら）において、前記Ｌ中のエチレングリコール繰り返し単位部分の化学式量は、１～１００ｋＤａの範囲にあることを特徴とする。
先の具体例（ら）において、上記メタボリックシンドロームは、耐糖能障害、高コレステロール血症、脂質異常症、肥満、糖尿、高血圧、肝疾患、脂質異常症による動脈硬化、粥状動脈硬化症、動脈硬化症、冠状動脈心疾患（冠動脈性心臓病）、及び脳卒中からなる群から選択されたことを特徴とする。
先の具体例（ら）において、上記肝疾患は、単純脂肪症、非アルコール性脂肪肝、肝炎症、非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ， ＮＡＳＨ），胆汁うっ滞性肝疾患、肝線維症、肝硬変、肝不全及び肝癌からなる群から選択される少なくとも一つの疾患であることを特徴とする。
先の具体例（ら）において、前記胆汁うっ滞性肝疾患は、原発性胆汁性硬変症（Ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）， 原発性硬化性胆管炎（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ）及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする。
先の具体例（ら）において、前記肝疾患は、非アルコール性脂肪肝炎によるものであるか、または伴うことを特徴とする。
先の具体例（ら）において、前記組成物は、下記特性中の一つ以上の特性を行うことを特徴とする。
（ａ）体重及び脂肪重量の減少；
（ｂ）血中脂質数値の改善；
（ｃ）インスリン感受性の改善；
（ｄ）ＵＣＰ－１、及びＰＧＣ－１α遺伝子発現の減少；
（ｅ）ＮＡＳ（ＮＡＦＬＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）の減少；及び
（ｆ）肝組織内におけるコラーゲン発現の減少。
本発明を具現するもう一様態は、グルカゴン受容体に対する活性を有する物質、及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニスト；またはそれを含む組成物を含むメタボリックシンドロームの予防または治療のための薬学的キットである。
本発明を具現化するもう一つの態様は、グルカゴン受容体に対する活性を有する物質、及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニスト；またはそれを含む組成物を必要とする個体に投与する段階を含む、メタボリックシンドロームの予防または治療方法である。
本発明を具現化するもう一つの態様は、グルカゴン受容体に対する活性を有する物質、及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニスト；またはそれを含む組成物のメタボリックシンドロームの予防または治療への使用である。
本発明を具現化するもう一つの態様は、グルカゴン受容体に対する活性を有する物質、及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニスト；またはそれを含む組成物のメタボリックシンドロームの予防または治療のための薬剤の製造への使用である。
本発明によるグルカゴン受容体に対する活性を有する物質及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストの併用投与は、肥満、糖尿病、非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ，ＮＡＳＨ）をはじめとするメタボリックシンドローム（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）とこれと関連する肝疾患の予防または治療に有用に使用することができる。
持続型グルカゴン誘導体及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストであるチルゼパチド（ｔｉｒｚｅｐａｔｉｄｅ）の併用投与による体重変化を確認した結果である。 （Ａ）及び（Ｂ）：持続型グルカゴン誘導体及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストであるチルゼパチド（ｔｉｒｚｅｐａｔｉｄｅ）の併用投与による脂肪重量及び血中脂質減少を確認した結果である。 （Ａ）及び（Ｂ）：持続型グルカゴン誘導体及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストであるチルゼパチド（ｔｉｒｚｅｐａｔｉｄｅ）の併用投与によるインスリン感受性及びＵＣＰ－１及びＰＧＣ－１α遺伝子発現増加を確認した結果である。 持続型グルカゴン誘導体及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストであるチルゼパチド（ｔｉｒｚｅｐａｔｉｄｅ）の併用投与によるＮＡＳ（ＮＡＦＬＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）の変化を確認した結果である。 持続型グルカゴン誘導体及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストであるチルゼパチド（ｔｉｒｚｅｐａｔｉｄｅ）の併用投与による肝組織内におけるコラーゲン発現の減少を確認した結果である。
本発明を実施するための具体的な内容を説明すると次の通りである。一方、本願で開示されるそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用され得る。即ち、本願で開示された多様な要素の全ての組み合わせが本発明の範疇に属する。また、下記記述される具体的な記述により本発明の範疇が制限されるとは言えない。
また、当該技術分野における通常の知識を有する者は、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本発明の特定様態に対する多数の等価物を認知または確認することができる。また、このような等価物は本発明に含まれることが意図される。
本明細書全般を通じて、天然に存在するアミノ酸に対する通常の１文字及び３文字コードが用いられるだけでなくＡｉｂ（α－アミノイソ酪酸）、Ｓａｒ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）などのような他のアミノ酸に対して一般的に許容される３文字コードが用いられる。また、本明細書で略語に言及されたアミノ酸はＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ命名法により記載された。
アラニン Ａ アルギニン Ｒ
アスパラギン Ｎ アスパラギン酸 Ｄ
システイン Ｃ グルタミン酸 Ｅ
グルタミン Ｑ グリシン Ｇ
ヒスチジン Ｈ イソロイシン Ｉ
ロイシン Ｌ リシン Ｋ
メチオニン Ｍ フェニルアラニン Ｆ
プロリン Ｐ セリン Ｓ
トレオニン Ｔ トリプトファン Ｗ
チロシン Ｙ バリン Ｖ
本発明を具現する一様態は、グルカゴン受容体に対する活性を有する物質及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを併用する治療学的使用を提供する。
具体的には、本発明の一様態は、グルカゴン受容体に対する活性を有する物質；及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを含む組成物を提供する。一具現例として、メタボリックシンドロームの予防または治療用薬学的組成物を提供する。
本発明の（ｉ）グルカゴン受容体に対する活性を有する物質；及び（ｉｉ）ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを含む薬学的組成物は、
ａ）（ｉ）グルカゴン受容体に対する活性を有する物質；及び（ｉｉ）ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストが混合された一つの混合物（ｍｉｘｔｕｒｅ）で投与されたり；または
ｂ）（ｉ）グルカゴン受容体に対する活性を有する物質；及び（ｉｉ）ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストが分離された形態で投与され得る形態であってもよいが、これらに限定されない。
例えば、グルカゴン受容体に対する活性を有する物質及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストが一つの製剤に製剤化されたものであるか、または個別的に製剤化されたものであってもよい。グルカゴン受容体に対する活性を有する物質；及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストが分離された形態である場合、グルカゴン受容体に対する活性を有する物質及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストが別個の製剤に製剤化されて同時、個別、順次、または逆順で投与されるものであってもよい。
本発明において、併用投与は、単に同時の投与を意味するだけではなく、グルカゴン受容体に対する活性を有する物質及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストが個体に共に作用して各物質が本来の機能と同等またはそれ以上の水準を行うことができる投与形態として理解されるべきである。従って、本願において、「併用」という用語が用いられる場合、これはグルカゴン受容体に対する活性を有する物質及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストの同時、個別、順次、または逆順投与を示すことと理解されるべきである。上記投与が順次、逆順または個別の場合、投与の順序は特に制限されず、単に２次成分投与の間隔は、上記併用の有益な効果を失わないようにしなければならない。
本発明のグルカゴン受容体に対する活性を有する物質；及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニスト、またはそれらを含む組成物は、キットの形態で提供されるものであってもよいが、これらに限定されるものではない。本発明における「キット」とは、グルカゴン受容体に対する活性を有する物質及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを併用投与するために、本発明による組成物を含むものであってもよい。具体的には、本発明に係るキットには、一つの製剤に製剤化されたグルカゴン受容体に対する活性を有する物質及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニスト、又はグルカゴン受容体に対する活性を有する物質、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストの個別製剤を含むものであってもよく、両物質の併用投与に必要な物質をさらに含むものであってもよいが、これに制限されない。
上記グルカゴン受容体に対する活性を有する物質は、グルカゴン受容体に対して有意な水準の活性を有する多様な物質、例えば、化合物またはペプチド形態の物質を含む。
特にこれに制限されるものではないが、上記グルカゴンに対して有意な水準の活性を有する物質は天然型グルカゴンだけでなく、グルカゴン受容体に対してｉｎ ｖｉｔｒｏ活性が当該受容体の天然型リガンド（天然型グルカゴン）比０．１％以上、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上を示すものであってもよい。
上記グルカゴン受容体に対する活性を有する物質の例として、天然型グルカゴン、そのアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）、またはその誘導体があるが、特にこれに制限されるものであってもよい。
本発明によるグルカゴン誘導体は、天然型グルカゴンと比較してアミノ酸配列に一つ以上の差があるペプチド、天然型グルカゴン配列を改質（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を通じて変形させたペプチド、または天然型グルカゴンのようにグルカゴン受容体を活性化させる天然型グルカゴンの模倣体を含む。例えば、上記天然型グルカゴンの誘導体は、天然型グルカゴンにおいて一つ以上のアミノ酸が変異されたものであり、上記変異は、置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、追加（ａｄｄｉｔｉｏｎ）、除去（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及びこれらの組み合わせからなる群から選択された変異であってもよいが、特にこれに制限されるものではない。
このようなグルカゴン誘導体は、天然型グルカゴンに対して変化したｐＩを有して改善された物性を示すものであってもよい。また、上記グルカゴン誘導体は、グルカゴン受容体を活性化させる活性を有しながら溶解度が改善されたものであってもよいが、これに制限されない。
また、上記グルカゴン誘導体は、天然に存在しない（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ものであってもよい。
一方、天然型グルカゴンは、次のアミノ酸配列を有することができる：
Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｎ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ（配列番号１）
本発明において用語「等電点（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ）」または「ｐＩ」とは、あるポリペプチドあるいはペプチドのような分子においてその全体純荷電（ｎｅｔ ｃｈａｒｇｅ）がなくなる（０）ｐＨ値を意味する。多様な荷電された作用基が存在するポリペプチドの場合、ｐＩにおいてこれら荷電の和はゼロである。ｐＩより高いｐＨにおいてポリペプチドの全体純荷電は陰性になるはずであり、ｐＩより低いｐＨ値においてポリペプチドの全体純荷電は陽性になるはずである。
ｐＩは、ポリアクリルアミド、澱粉またはアガロースで構成される固定されたｐＨ勾配ゲル状で等電点電気泳動により、または、例えば、ＥｘＰＡＳｙサーバでｐＩ／ＭＷツール（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌ；Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００３）を用いてアミノ酸配列からｐＩを推算することにより決定されてもよい。
本発明において用語「変化したｐＩ」とは、天然グルカゴンのアミノ酸配列で一部配列が負電荷及び正電荷を帯びたアミノ酸残基で置換されて天然グルカゴンのｐＩとは異なる、即ち、これより減少または増加したｐＩを有することを意味する。このように変化したｐＩを有するペプチドはグルカゴン誘導体であり、中性ｐＨで改善された溶解度及び／又は高安定性を示すことができる。しかし、特に、これに制限されるものではない。
より具体的には、上記グルカゴン誘導体は天然型グルカゴンのｐＩ値（６．８）ではなく変化したｐＩ値を有するものであってもよく、より具体的には、６．８未満、具体的には６．７以下、さらに具体的には６．５以下であるｐＩ値、また、具体的には６．８超、７以上、さらに具体的には７．５以上であってもよいが、これに制限されず、天然型グルカゴンと相違するｐＩ値を有すると、本発明の範疇に含まれる。特に、天然型グルカゴンと相違するｐＩ値を有することにより天然型グルカゴンに比べて中性ｐＨで改善された溶解度を示すことにより凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）される程度が低ければ、本発明の範疇に特に含まれる。
さらに具体的には、４～６．５及び／又は７～９．５、さらに具体的には７．５～９．５、より一層具体的には８．０～９．３のｐＩ値を有するものであってもよいが、これに制限されない。この場合、天然型グルカゴンに比べて高いか、低いｐＩを有するため、中性ｐＨで天然型グルカゴンに比べて改善された溶解度及び高い安定性を示すことができる。しかし、これに制限されるものではない。
具体的には、天然型グルカゴンの誘導体は天然型グルカゴンで一部アミノ酸が置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、追加（ａｄｄｉｔｉｏｎ）、除去（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）及び修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）中のいずれか一つの方法またはこのような方法の組み合わせを通じて変形させることができる。
このような方法の組み合わせにより製造されるグルカゴンの誘導体の例として、天然型グルカゴンとアミノ酸配列が一つ以上異なり、Ｎ末端アミノ酸残基に脱アミノ化（ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）した、グルカゴン受容体に対する活性化機能を保有しているペプチドなどがあるが、これに制限されず、誘導体の製造のための複数の方法の組み合わせにより本発明に適用される天然型グルカゴンの誘導体を製造することができる。
また、天然型グルカゴンの誘導体の製造のためのこのような変形は、Ｌ－型あるいはＤ－型アミノ酸、及び／又は非天然型アミノ酸を用いた変形；及び／又は天然型配列を改質、例えば、側鎖作用基の変形、分子内共有結合、例えば、側鎖間環形成、メチル化、アシル化、ユビキチン化、リン酸化、アミノヘキサン化、ビオチン化等のように改質することにより変形することを全て含む。また、上記変形は非天然型化合物での置換を全て含む。
また、天然型グルカゴンのアミノ及び／又はカルボキシ末端に一つまたはそれ以上のアミノ酸が追加されたことを全て含む。
上記置換または追加されるアミノ酸は、ヒトタンパク質から通常観察される２０個のアミノ酸だけでなく非定形または非自然的発生アミノ酸を用いることができる。非定形アミノ酸の商業的出所にはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣｈｅｍＰｅｐとＧｅｎｚｙｍｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが含まれる。このようなアミノ酸が含まれたペプチドと定形的なペプチド配列は商業化されたペプチド合成会社、例えば、米国のＡｍｅｒｉｃａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐａｎｙやＢａｃｈｅｍ、または韓国のＡｎｙｇｅｎを通じて合成及び購買可能である。
アミノ酸誘導体も同様の方式で入手することができるが、その例を一部だけ挙げると、４－イミダゾ酢酸（４－ｉｍｉｄａｚｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）などを用いることができる。
グルカゴンは、約７のｐＩを有しており、生理学的ｐＨ（ｐＨ４－８）の溶液中で不溶性であり、中性ｐＨでは沈殿する傾向がある。ｐＨ３以下の水溶液中で、グルカゴンは初期には溶解するが、１時間以内にゲル形成により沈殿する。ゲル化したグルカゴンは、主にβ－シートフィブリルからなり、このように沈殿したグルカゴンはゲルが注射針や、静脈に投与される場合、血管を詰まらせるため、注射剤として用いるのに適しない。沈殿過程を遅延させるために、酸性（ｐＨ２－４）の剤形を用いることが通常であるが、これを通じて短時間で相対的に無凝集状態でグルカゴンを維持することができる。しかし、グルカゴンのフィブリル形成が低いｐＨで非常に速やかになされるため、このような酸性剤形は、調剤後に直ちに注射されなければならない。
本発明のグルカゴン受容体に対する活性を有する物質はグルカゴン誘導体であり、天然グルカゴンのｐＩを負電荷及び正電荷を帯びたアミノ酸残基の置換により変化させて延長された作用プロファイルを有することに開発されたものを含み、このような誘導体は天然グルカゴンに比べて変化したｐＩを有することにより中性ｐＨで改善された溶解度及び／又は高い安定性を示すことができることを特徴とする。
一つの具体的な様態として、上記本発明のグルカゴン受容体に対する活性を有する物質であるグルカゴン誘導体は、下記一般式１のアミノ酸配列を含むペプチドであってもよい。
Ｘ１－Ｘ２－ＱＧＴＦ－Ｘ７－ＳＤ－Ｘ１０－Ｓ－Ｘ１２－Ｘ１３－Ｘ１４－Ｘ１５－Ｘ１６－Ｘ１７－Ｘ１８－Ｘ１９－Ｘ２０－Ｘ２１－Ｆ－Ｘ２３－Ｘ２４－Ｗ－Ｌ－Ｘ２７－Ｘ２８－Ｘ２９－Ｘ３０（一般式１、配列番号４６）
上記一般式１において、
Ｘ１はチロシンであり；
Ｘ２はアルファ－メチル－グルタミン酸（α－ｍｅｔｈｙｌ－ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）、Ａｉｂ（ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、Ｄ－アラニン、グリシン、Ｓａｒ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）、セリンまたはＤ－セリンであり；
Ｘ７はトレオニン、バリンまたはシステインであり；
Ｘ１０はチロシンまたはシステインであり；
Ｘ１２はリシンまたはシステインであり；
Ｘ１３はチロシンまたはシステインであり；
Ｘ１４はロイシンまたはシステインであり；
Ｘ１５はアスパラギン酸、グルタミン酸またはシステインであり；
Ｘ１６はグルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、アルファ－メチル－グルタミン酸、またはシステインであるか、不在であり；
Ｘ１７はアスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、リシン、アルギニン、セリン、システイン、またはバリンであるか、不在であり；
Ｘ１８はアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、バリン、またはシステインであるか、不在であり；
Ｘ１９はアラニン、アルギニン、セリン、バリン、またはシステインであるか、不在であり；
Ｘ２０はリシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン酸、アルギニン、アルファ－メチル－グルタミン酸、またはシステインであるか、不在であり；
Ｘ２１はアスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、バリン、またはシステインであるか、不在であり；
Ｘ２３はイソロイシン、バリン、またはアルギニンであるか、不在であり；
Ｘ２４はバリン、アルギニン、アラニン、システイン、グルタミン酸、リシン、グルタミン、アルファ－メチル－グルタミン酸、またはロイシンであるか、不在であり；
Ｘ２７はイソロイシン、バリン、アラニン、リシン、メチオニン、グルタミン、またはアルギニンであるか、不在であり；
Ｘ２８はグルタミン、リシン、アスパラギン、またはアルギニンであるか、不在であり；
Ｘ２９はトレオニンであり；
Ｘ３０はシステインであるか、不在であってもよい
（ただし、上記一般式１のアミノ酸配列が配列番号１または配列番号１２と同一の場合は除く）。
また、上記一般式１において、
Ｘ１はチロシンであり；
Ｘ２がセリンまたはＡｉｂ（ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）であり；
Ｘ７はトレオニン、バリンまたはシステインであり；
Ｘ１０はチロシンまたはシステインであり；
Ｘ１２はリシンまたはシステインであり；
Ｘ１３はチロシンまたはシステインであり；
Ｘ１４はロイシンまたはシステインであり；
Ｘ１５はアスパラギン酸、またはシステインであり；
Ｘ１６はグルタミン酸、セリンまたはシステインであり；
Ｘ１７はアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、セリン、システイン、またはバリンであり；
Ｘ１８はアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、またはシステインであり；
Ｘ１９はアラニン、またはシステインであり；
Ｘ２０はグルタミン、アスパラギン酸、リシン、またはシステインであり；
Ｘ２１はアスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、バリン、またはシステインであり；
Ｘ２３はイソロイシン、バリンまたはアルギニンであり；
Ｘ２４はバリン、アルギニン、アラニン、グルタミン酸、リシン、グルタミン、またはロイシンであり；
Ｘ２７はイソロイシン、バリン、アラニン、メチオニン、グルタミンまたはアルギニンであり；
Ｘ２８はグルタミン、リシン、アスパラギンまたはアルギニンであり；
Ｘ２９はトレオニンであり；
Ｘ３０はシステインであるか、不在であってもよいが、これに限定されない（一般式１のアミノ酸配列が配列番号１または配列番号１２と同一の場合は除く）。
その例として、上記ペプチドは、配列番号７～１１、１３～２５、２７、２９、３１、３３、３５～４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むもの、具体的には配列番号７～１１、１３～２５、２７、２９、３１、３３、３５～４５からなる群から選択されたアミノ酸配列で（必須で）構成されたものであってもよいが、これに制限されない。
また、上記一般式１において、
Ｘ２がＡｉｂ（ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）であり；
Ｘ７はトレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）またはシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１０はチロシン（Ｙ）であり；
Ｘ１２はリシン（Ｋ）であり；
Ｘ１３はチロシン（Ｙ）であり；
Ｘ１４はロイシン（Ｌ）またはシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１５はアスパラギン酸（Ｄ）であり；
Ｘ１６はグルタミン酸（Ｅ）またはセリン（Ｓ）であり；
Ｘ１７はリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１８はアルギニン（Ｒ）であり；
Ｘ１９はアラニン（Ａ）、またはシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ２０はグルタミン（Ｑ）、またはリシン（Ｋ）であり；
Ｘ２１はアスパラギン酸（Ｄ）、またはグルタミン酸（Ｅ）であり；
Ｘ２３はバリン（Ｖ）であり；
Ｘ２４はグルタミン（Ｑ）であり；
Ｘ２７はメチオニン（Ｍ）であり；
Ｘ２８はアスパラギン（Ｎ）であり；
Ｘ２９はトレオニン（Ｔ）で、
Ｘ３０はシステイン（Ｃ）であってもよいが、これらに限定されない。
その例として、上記ペプチドは、配列番号２０、２２、２３、２７、３３、３５、３７、３８、４０、４１、４２、及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むもの、具体的には、配列番号２０、２２、２３、２７、３３、３５、３７、３８、４０、４１、４２、及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列で（必須で）構成されたものであってもよいが、これに制限されない。
具体的には、前記ペプチドは、配列番号２０、２２、２３、２７、３３、３７、３８、及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むもの、具体的には、配列番号２０、２２、２３、２７、３３、３７、３８、及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列で（必須で）構成されているものであってもよいが、これらに限定されない。
また、上記一般式１において、
上記一般式１において
Ｘ１がチロシンであり；
Ｘ２はセリンまたはＡｉｂ（ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）であり；
Ｘ７はシステイン、トレオニン、またはバリンであり；
Ｘ１０はチロシンまたはシステインであり；
Ｘ１２はリシンまたはシステインであり；
Ｘ１３はチロシンまたはシステインであり；
Ｘ１４はロイシンまたはシステインであり；
Ｘ１５はアスパラギン酸、またはシステインであり；
Ｘ１６はグルタミン酸、セリンまたはシステインであり；
Ｘ１７はグルタミン酸、リシン、アルギニン、システイン、またはバリンであり；
Ｘ１８はアルギニン、またはシステインであり；
Ｘ１９はアラニン、またはシステインであり；
Ｘ２０はグルタミンまたはリシンであり；
Ｘ２１はアスパラギン酸、グルタミン酸、バリン、またはシステインであり；
Ｘ２３はバリンであり；
Ｘ２４はバリンまたはグルタミンであり；
Ｘ２７はメチオニンであり；
Ｘ２８はアスパラギンまたはアルギニンであり；
Ｘ２９はトレオニンであり；
Ｘ３０はシステインであるか、不在であってもよいが、これに限定されない。
その例として、前記ペプチドは、配列番号１１、１３～１７、１９～２７、２９、３１、３３、３５～４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むもの、具体的には、配列番号１１、１３～１７、１９～２７、２９、３１、３３、３５～４５からなる群から選択されたアミノ酸配列で（必須で）構成されたものであってもよいが、これに制限されない。
また、
上記一般式１において
Ｘ１がチロシンであり；
Ｘ２がＡｉｂ（ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）であり；
Ｘ７はシステイン、トレオニン、またはバリンであり；
Ｘ１０はチロシンまたはシステインであり；
Ｘ１２はリシンであり；
Ｘ１３はチロシンまたはシステインであり；
Ｘ１４はロイシンまたはシステインであり；
Ｘ１５はアスパラギン酸、またはシステインであり；
Ｘ１６はグルタミン酸、セリンまたはシステインであり；
Ｘ１７はリシン、アルギニン、システイン、またはバリンであり；
Ｘ１８はアルギニン、またはシステインであり；
Ｘ１９はアラニン、またはシステインであり；
Ｘ２０はグルタミンまたはリシンであり；
Ｘ２１はアスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステインであり；
Ｘ２３はバリンであり；
Ｘ２４はグルタミンであり；
Ｘ２７はメチオニンであり；
Ｘ２８はアスパラギンまたはアルギニンであり；
Ｘ２９はトレオニンであり；
Ｘ３０はシステインであるか、不在であってもよいが、これに限定されない。
その例として、前記ペプチドは、配列番号１１、１４、１７、１９～２５、２７、２９、３１、３３、３５～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むもの、具体的には、配列番号１１、１４、１７、１９～２５、２７、２９、３１、３３、３５～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列で（必須で）構成されたものであってもよいが、これに制限されない。
また、上記一般式１において
Ｘ１がチロシンであり；
Ｘ２がセリンまたはＡｉｂ（ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）であり；
Ｘ７はトレオニン、バリンまたはシステインであり；
Ｘ１０はチロシンまたはシステインであり；
Ｘ１２はリシンまたはシステインであり；
Ｘ１３はチロシンまたはシステインであり；
Ｘ１４はロイシンまたはシステインであり；
Ｘ１５はアスパラギン酸、またはシステインであり；
Ｘ１６はグルタミン酸、セリンまたはシステインであり；
Ｘ１７はアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、セリン、システイン、またはバリンであり；
Ｘ１８はアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、またはシステインであり；
Ｘ１９はアラニン、またはシステインであり；
Ｘ２０はグルタミン、アスパラギン酸、またはリシンであり；
Ｘ２１はアスパラギン酸、またはグルタミン酸であり；
Ｘ２３はバリンであり；
Ｘ２４はバリンまたはグルタミンであり；
Ｘ２７はイソロイシンまたはメチオニンであり；
Ｘ２８はアスパラギンまたはアルギニンであり；
Ｘ２９はトレオニンであり；
Ｘ３０はシステインであるか、不在であってもよいが、これに限定されない。
その例として、前記ペプチドは、配列番号７～１１、１３～１５、１７、１９～２４、２７、２９、３１、３３、３５～４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むもの、具体的には、配列番号７～１１、１３～１５、１７、１９～２４、２７、２９、３１、３３、３５～４５からなる群から選択されたアミノ酸配列で（必須で）構成されたものであってもよいが、これに制限されない。
また、上記一般式１において
Ｘ１がチロシンであり；
Ｘ２がＡｉｂ（ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）であり；
Ｘ７はトレオニンであり；
Ｘ１０はチロシンであり；
Ｘ１２はリシンであり；
Ｘ１３はチロシンであり；
Ｘ１４はロイシンであり；
Ｘ１５はアスパラギン酸、またはシステインであり；
Ｘ１６はグルタミン酸、セリンまたはシステインであり；
Ｘ１７はリシンまたはアルギニンであり；
Ｘ１８はアルギニンであり；
Ｘ１９はアラニンであり；
Ｘ２０はグルタミン、システイン、またはリシンであり；
Ｘ２１はアスパラギン酸、システイン、バリンまたはグルタミン酸であり；
Ｘ２３はバリンまたはアルギニンであり；
Ｘ２４はグルタミンまたはロイシンであり；
Ｘ２７はメチオニンであり；
Ｘ２８はアスパラギンまたはアルギニンであり；
Ｘ２９はトレオニンであり；
Ｘ３０は不在であってもよいが、これに限定されない。
その例として、前記ペプチドは、配列番号１４、１６、１８、１９、２５、３１、３３、３７、及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むもの、具体的には、配列番号１４、１６、１８、１９、２５、３１、３３、３７、及び４４からなる群から選択されたアミノ酸配列で（必須で）構成されたものであってもよいが、これに制限されない。
より具体的には、前記ペプチドは、下記一般式２のアミノ酸配列を含むペプチドであってもよい：
Ｙ－Ａｉｂ－ＱＧＴＦ－Ｘ７－ＳＤ－Ｘ１０－Ｓ－Ｘ１２－Ｙ－Ｌ－Ｘ１５－Ｘ１６－Ｘ１７－Ｒ－Ａ－Ｘ２０－Ｘ２１－Ｆ－Ｖ－Ｘ２４－Ｗ－Ｌ－Ｍ－Ｎ－Ｔ－Ｘ３０（一般式２、配列番号４７）
上記一般式２において
Ｘ７はトレオニン、バリンまたはシステインであり；
Ｘ１０はチロシンまたはシステインであり；
Ｘ１２はリシンまたはシステインであり；
Ｘ１５はアスパラギン酸、またはシステインであり；
Ｘ１６はグルタミン酸またはセリンであり；
Ｘ１７はリシンまたはアルギニンであり；
Ｘ２０はグルタミンまたはリシンであり；
Ｘ２１はアスパラギン酸、またはグルタミン酸であり；
Ｘ２４はバリンまたはグルタミンであり；
Ｘ３０はシステインであるか、不在であってもよい。
その例として、上記ペプチドは、配列番号１３、１５及び３６～４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むもの、具体的には 配列番号１３、１５及び３６～４５からなる群から選択されたアミノ酸配列で（必須で）構成されたものであってもよいが、これに制限されない。より具体的には、前記ペプチドは、配列番号２０、あるいは３７のアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列で（必須で）構成されることを特徴とする。しかし、これに制限されるものではない。
具体的には、上記一般式２において
Ｘ７はトレオニン、バリンまたはシステインであり；
Ｘ１０はチロシンまたはシステインであり；
Ｘ１２はリシンであり；
Ｘ１５はアスパラギン酸であり；
Ｘ１６はグルタミン酸またはセリンであり；
Ｘ１７はリシンまたはアルギニンであり；
Ｘ２０はグルタミンまたはリシンであり；
Ｘ２１はアスパラギン酸またはグルタミン酸であり；
Ｘ２４はグルタミンであり；
Ｘ３０はシステインであるか、不在であってもよいが、特にこれに制限されるものではない。
その例として、上記ペプチドは、配列番号３６～３８、４０～４２、４４、及び４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むもの、具体的には、配列番号３６～３８、４０～４２、４４、及び４５からなる群から選択されたアミノ酸配列で（必須で）構成されたものであってもよいが、これに制限されない。
上記ペプチドの他の例として、配列番号２～１１、１３～４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド、具体的には、配列番号２～１１、１３～４５からなる群から選択されるアミノ酸配列で（必須で）構成されたものであってもよいが、これに制限されない。
ただし、前記ペプチドは、前記範疇から除外される組み合わせも存在し得るが、特にこれに制限されるものではなく、請求項に別途の言及がない限り、請求項に記述されたペプチドはいずれも本発明の範疇に含まれる。
なお、本願において「特定の配列番号で構成されるペプチド」と記載されていても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるペプチドと同一もしくは相当する活性を有する場合であれば、当該配列番号のアミノ酸配列前後の無意味な配列の追加または自然に発生し得る突然変異、またはその潜在性突然変異（ｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を除外するものではなく、このような配列の追加もしくは突然変異を有する場合であっても、本願の範囲内に属することが自明である。
以上の内容は、本発明の他の具体例または他の態様にも適用し得るが、これらに限定されるものではない。
本発明において、前記ペプチドは、天然型グルカゴンと配列同一性を比較したとき、少なくとも６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、または９５％以上の配列同一性を有するものであってもよいが、特にこれに限定されるものではなく、前記ペプチドと天然型グルカゴンの配列比較を通じて当業者が容易に把握することができる。
本発明の用語、「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」は、野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）タンパク質のアミノ酸配列またはそれをコードする塩基配列との類似度を示すためのものであり、本発明のアミノ酸配列または塩基配列と上記のようなパーセント以上の同一な配列を有する配列を含む。このような相同性は、両配列を肉眼で比較して決定することもできるが、比較対象となる配列を並べて配列して相同性程度を分析する生物情報アルゴリズム（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を用いて決定することができる。前記二つのアミノ酸配列間の相同性は百分率で表すことができる。有用な自動化したアルゴリズムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗ， ＵＳＡ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡとＴＦＡＳＴＡコンピュータソフトウェアモジュールで利用可能である。前記モジュールで自動化された配列アルゴリズムには、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆ＷｕｎｓｃｈとＰｅａｒｓｏｎ＆ＬｉｐｍａｎとＳｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎの配列アルゴリズムを含む。他の有用な配列に対するアルゴリズムと相同性の決定は、ＦＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＰＳＩＢＬＡＳＴとＣＬＵＳＴＡＬ Ｗを含むソフトウェアで自動化されている。
また、本発明において、前記ペプチドは、グルカゴン受容体に対する活性を示すペプチドまたはグルカゴン誘導体であってもよいが、これらに限定されるものではない。
特に、これに限定されるものではないが、前記グルカゴン受容体に対して有意な水準の活性を有するペプチドは、グルカゴン受容体に対してｉｎ ｖｉｔｒｏ活性が天然型リガンド（天然型グルカゴン）に対して約０．００１％以上、約０．０１％以上、約０．１％以上、約１％以上、約２％以上、約３％以上、約４％以上、約５％以上、約６％以上、約７％以上、約８％以上、約９％以上、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１００％以上を表すことができるが、有意に活性を示す範囲は制限なく含まれる。そのようなペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を測定する方法は、本願明細書の実施例４を参照することができるが、特にこれに限定されるものではない。
本発明において用語「約」は、±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１などを全て含む範囲であり、約という用語に続く数値と同等または類似の範囲の数値を全て含むが、これに限定されない。
特に、これに限定されるものではないが、そのようなペプチドは、非天然に発生した（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ものであってもよい。
上述したグルカゴン誘導体は、分子内架橋（ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｉｄｇｅ）を含んでもよく（例えば、共有結合的架橋または非共有結合的架橋）、具体的には環を含む形態であってもよい。例えば、グルカゴン誘導体の１６番及び２０番アミノ酸間に環が形成された形態であってもよいが、特にこれに制限されるものではない。
上記環の非制限的な例としてラクタム架橋（またはラクタム環）を含んでもよい。
また、上記グルカゴン誘導体は環を含むように、目的とする位置に環を形成することができるアミノ酸を含むように変形されたものを全て含む。
このような環は、上記グルカゴン誘導体内のアミノ酸側鎖間に形成されてもよく、その例としてリシンの側鎖とグルタミン酸の側鎖との間にラクタム環が形成される形態であってもよいが、特にこれに制限されるものではない。
例えば、上記一般式１あるいは一般式２のアミノ酸配列を含むペプチドは、一般式１あるいは一般式２のＸ１０とＸ１４、Ｘ１２とＸ１６、Ｘ１６とＸ２０、Ｘ１７とＸ２１、Ｘ２０とＸ２４、及びＸ２４とＸ２８のアミノ酸対において、各アミノ酸対のアミノ酸がそれぞれグルタミン酸またはリシンで置換されたものであってもよいが、これに制限されない。上記、Ｘｎ（ｎは自然数）でｎは提示されたアミノ酸配列のＮ末端からのアミノ酸位置を示す。
また、上記一般式１あるいは一般式２のアミノ酸配列を含むペプチドは、Ｘ１２とＸ１６のアミノ酸対、Ｘ１６とＸ２０のアミノ酸対、またはＸ１７とＸ２１のアミノ酸対のアミノ酸のそれぞれが環を形成するグルタミン酸またはリシンで置換されたものであってもよいが、これに制限されない。
また、上記一般式１あるいは２において、Ｘ１０とＸ１４、Ｘ１２とＸ１６、Ｘ１６とＸ２０、Ｘ１７とＸ２１、Ｘ２０とＸ２４、及びＸ２４とＸ２８のアミノ酸対のうち少なくとも一つのアミノ酸対で各アミノ酸対のそれぞれのアミノ酸間に環（例えば、ラクタム環）を形成したものであってもよいが、これに制限されない。
また、上記一般式１または２において、Ｘ１６がグルタミン酸であり、Ｘ２０はリシンであり、Ｘ１６とＸ２０の側鎖がラクタム環を形成しているものであってもよいが、これに制限されない。
また、本発明によるペプチドはＮ末端及び／又はＣ末端が変形されていないものであってもよいが、生体内のタンパク質切断酵素から保護し、安定性を増加させるために、このＮ末端及び／又はＣ末端などが化学的に修飾されたり有機基で保護されたり、またはペプチド末端などにアミノ酸が追加されて変形された形態も本発明によるペプチドの範疇に含まれる。Ｃ末端が変形されていない場合、本発明によるペプチドの末端はカルボキシル基を有するが、特にこれに制限されるものではない。
特に、化学的に合成したペプチドの場合、Ｎ及びＣ末端が電荷を帯びているため、このような電荷を除去するためにＮ末端をアセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）及び／又はＣ末端をアミド化（ａｍｉｄａｔｉｏｎ）することができるが、特にこれに制限されない。
本明細書において別途に指すことがなければ、本発明による「ペプチド」またはこのようなペプチドが生体適合性物質に共有結合で連結された「結合体」に関する明細書の詳細な説明や請求範囲の技術は、当該ペプチドまたは結合体はもちろん、当該ペプチドまたは結合体の塩（例えば、上記ペプチドの薬学的に許容可能な塩）、またはその溶媒和物の形態を全て含む範疇にも適用される。従って明細書に「ペプチド」または「結合体」とだけ記載されていても当該記載内容はその特定塩、その特定溶媒和物、その特定塩の特定溶媒和物にも同様に適用される。このような塩形態は、例えば、薬学的に許容される任意の塩を用いた形態であってもよい。上記塩の種類は特に制限されない。ただし、個体、例えば、哺乳類に安全で効果的な形態であることが好ましいが、特にこれに制限されるものではない。
上記用語、「薬学的に許容される」とは、医薬学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、またはアレルギー反応などを誘発することなく所望の用途に効果的に使用可能な物質を意味する。
本発明において用語、「薬学的に許容される塩」とは、薬学的に許容される無機酸、有機酸、または塩基から誘導された塩を含む。適した酸の例としては、塩酸、臭素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン－ｐ－スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などを挙げることができる。適した塩基から誘導された塩はナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、マグネシウムなどのアルカリ土類金属、及びアンモニウムなどを含み得る。
また、本発明で用いられた用語「溶媒和物」とは、本発明によるペプチド、結合体、またはこの塩が溶媒分子と複合体を形成したことをいう。
また、本発明のグルカゴン誘導体ペプチドは、その長さに応じてこの分野でよく知られている方法、例えば、自動ペプチド合成器により合成することができ、遺伝子操作技術により生産することもできる。
具体的には、本発明のグルカゴン誘導体ペプチドは、標準合成方法、組換え発現システム、または任意の他の当該分野の方法により製造されてもよい。従って、本発明によるグルカゴン誘導体は、例えば、下記を含む方法を含む多数の方法で合成されることができる：
（ａ）ペプチドを固相または液相法の手段で段階的にまたは断片組立により合成し、最終ペプチド生成物を分離及び精製する方法；または
（ｂ）ペプチドをエンコードする核酸作製物を宿主細胞内で発現させ、発現生成物を宿主細胞培養物から回収する方法；または
（ｃ）ペプチドをエンコードする核酸作製物の無細胞試験管内の発現を行い、発現生成物を回収する方法；または
（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の任意の組み合わせによりペプチドの断片を得、続いて、断片を連結させてペプチドを得、当該ペプチドを回収する方法。
より具体的な例として、遺伝子操作を通じて、融合パートナー及びグルカゴン誘導体を含む融合タンパク質をコードする融合遺伝子を製造し、これを宿主細胞に形質転換させた後、融合タンパク質形態で発現し、タンパク質分解酵素または化合物を用いて融合タンパク質からグルカゴン誘導体を切断、分離して所望のグルカゴン誘導体を生産することができる。このため、例えば、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａやエンテロキナーゼのようなタンパク質分解酵素、ＣＮＢｒまたはヒドロキシルアミンのような化合物により切断され得るアミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列を融合パートナーとグルカゴン誘導体をコードするポリヌクレオチドとの間に挿入することができる。
より具体的な様態として、本発明によるペプチド、あるいはグルカゴン誘導体、例えば上記一般式１のアミノ酸配列を含むペプチドは、この生体内半減期を増加させる生体適合性物質部に結合した、持続型結合体の形態であってもよいが、これに制限されない。上記生体適合性物質部はキャリアと混用されてもよい。
具体的には、上記結合体は、ペプチド部位及び上記ペプチド部位に共有結合により連結された生体適合性物質部を含み、上記ペプチド部位は、上記一般式１のアミノ酸配列と同一の配列であるか、またはこれを含む配列であってもよい。
本発明において、前記ペプチドの結合体は、キャリアが結合していないペプチドに比べて増加した効力の持続性を示すことができ、本発明では、このような結合体を「持続型結合体」と称する。
一方、そのような結合体は非自然な（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ものであってもよい。
本発明において用語、「持続型結合体」とは、生理活性物質（例、グルカゴン誘導体） に生体適合性物質部またはキャリアが結合した形態として、生体適合性物質部またはキャリアが結合していない生理活性物質に比べて増加した効力の持続性（例、体内半減期増加）を示す結合体を指す。上記持続型結合体において生体適合性物質部またはキャリアは生理活性物質に共有結合で連結されたものであってもよいが、特にこれに制限されない。
本発明の具体的な実施形態において上記グルカゴン誘導体の持続型結合体は、効力の持続性はキャリアが結合していない天然型グルカゴンあるいはグルカゴン誘導体に比べて増加することができる。
本発明の一具体例において、前記持続型結合体は、下記化学式（１）で表される結合体であってもよいが、これに限定されない。
Ｘ－Ｌ－Ｆ・・・（１）
ただし、このとき、Ｘは前記ペプチドであり；
Ｌはエチレングリコール繰り返し単位を含むリンカーであり、
Ｆは免疫グロブリンＦｃ領域であり、
－はＸとＬの間、ＬとＦの間の共有結合の連結を表す。
前記持続型結合体において、Ｘは、本発明によるペプチド（グルカゴン誘導体）であってもよい。具体的には、前記Ｘは、一般式１のアミノ酸配列を含むペプチドであってもよく、または、前記Ｘは、配列番号２～１１、１３～４５のいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチドであってもよく、または、Ｘは、配列番号２０、２２、２３、２７、３３、３５、３７、３８、４０、４１、４２、及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドであってもよいが、これらに限定されない。
前記持続型結合体において、Ｆは、Ｘ、即ち、グルカゴン誘導体の半減期を増加させる物質であり、本発明の前記結合体を構成する一部の一構成に相当する。
前記Ｆは、Ｘと共有化学結合または非共有化学結合で互いに結合するものであってもよく、具体的には、共有化学結合でＬを介してＦとＸが互いに結合されるものであってもよい。
具体的な例として、前記Ｆは免疫グロブリンＦｃ領域であってもよく、より具体的には前記免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ由来であってもよいが、特にこれに限定されない。
本発明において、「免疫グロブリンＦｃ領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域を除いた、重鎖不変領域２（ＣＨ２）及び／又は重鎖不変領域３（ＣＨ３）部分を含む部位を意味する。上記免疫グロブリンＦｃ領域は、本発明のタンパク質結合体の一部をなす一構成であってもよい。
本明細書においてＦｃ断片とは、免疫グロブリンのパパイン消化から得られる天然型配列だけでなく、その誘導体、例えば、天然配列中の１以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換またはそれらの組合せにより変換され、天然型と相違する配列まで網羅して含まれる。
前記Ｆは、二つのポリペプチド鎖がジスルフィド結合で連結されている構造であり、前記二鎖のうちの一鎖の窒素原子を介してのみ連結されている構造であってもよいが、これに限定されない。窒素原子を介した連結は、リシンのイプシロンアミノ原子やＮ末端アミノ基に還元的アミノ化を通じて連結することができる。
還元的アミノ化反応とは、反応物のアミン基又はアミノ基が他の反応物のアルデヒド（即ち、還元的アミノ化が可能な官能基）と反応してアミンを生成した後、還元反応によりアミン結合を形成させる反応を意味し、当技術分野において広く知られている有機合成反応である。
一具体例として、前記Ｆは、そのＮ末端プロリンの窒素原子を介して連結されていてもよいが、これらに限定されない。
そのような免疫グロブリンＦｃ断片は、重鎖不変領域にヒンジ（ｈｉｎｇｅ）部分を含むことができるが、これらに限定されない。
本発明において、免疫グロブリンＦｃ断片は、Ｎ末端に特定のヒンジ配列を含んでもよい。
本発明の用語「ヒンジ配列」は、重鎖に位置し、ジスルフィド結合（ｉｎｔｅｒ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）を通じて免疫グロブリンＦｃ断片の二量体を形成する部位を意味する。
本発明において、ヒンジ配列は、下記のアミノ酸配列を有するヒンジ配列の一部が欠失して一つのシステイン残基のみを有するように変異したものであってもよいが、これに限定されない。
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号５１）。
ヒンジ配列は、配列番号５１のヒンジ配列のうちの８番目または１１番目のシステイン残基が欠失して一つのシステイン残基のみを含むものであってもよい。本発明のヒンジ配列は、一つのシステイン残基のみを含む３～１２個のアミノ酸で構成されてもよいが、これらに限定されない。より具体的には、本発明のヒンジ配列は、以下のような配列を有することができる：
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号５２）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ（配列番号５３）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号５４）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（配列番号５５）、Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号５６）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（配列番号５７）、Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（配列番号５８）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号５９）、Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６０）、Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６１）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６２）、Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６３）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６４）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（配列番号６５）、Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６６）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６７）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６８）、Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ（配列番号６９）、Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号７０）。
より具体的には、前記ヒンジ配列は、配列番号６１（Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ）または配列番号７０（Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ）のアミノ酸配列を含むものであってもよいが、これらに限定されない。
本発明の免疫グロブリンＦｃ断片は、ヒンジ配列の存在で免疫グロブリンＦｃ鎖２分子が二量体を形成した形態であってもよく、また、本発明の化学式（１）の結合体は、リンカーの一末端が二量体の免疫グロブリンＦｃ断片の一本鎖に連結した形態であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の用語、「Ｎ末端」とは、タンパク質またはポリペプチドのアミノ末端を意味するものであり、アミノ末端の最末端、または最末端から１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個以上のアミノ酸まで含むものであってもよい。本発明の免疫グロブリンＦｃ断片は、ヒンジ配列をＮ末端に含むことができるが、これらに限定されない。
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ断片は、天然型と実質的に同等または向上した効果を奏する限り、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域のみを除いて、一部または全体重鎖不変領域１（ＣＨ１）及び／又は軽鎖不変領域１（ＣＬ１）を含む拡張されたＦｃ断片であってもよい。また、ＣＨ２及び／又はＣＨ３に該当する相当長い一部アミノ酸配列が除去された断片であってもよい。
例えば、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、５）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン中の１個または２個の以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（またはヒンジ領域の一部）との組み合わせ、６）重鎖不変領域各ドメインと軽鎖不変領域の二量体であってもよい。しかし、これに制限されるものではない。
また、一具体例として、上記免疫グロブリンＦｃ領域は二量体形態（ｄｉｍｅｒｉｃ ｆｏｒｍ）であってもよく、二量体形態の一つのＦｃ領域にグルカゴン誘導体一分子が共有結合的に連結されてもよく、この時、上記免疫グロブリンＦｃとグルカゴン誘導体は非ペプチド性ポリマーにより互いに連結されてもよい。一方、二量体形態の一つのＦｃ領域にグルカゴン誘導体の二分子が対称的に結合することも可能である。この時、上記免疫グロブリンＦｃとグルカゴン誘導体またはインスリン分泌ペプチドは、非ペプチド性リンカーにより互いに連結されてもよい。しかし、上記記述された例に制限されるものではない。
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型アミノ酸配列だけでなくこの配列誘導体を含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列中の一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保全的または保全的置換またはこれらの組み合わせにより相違する配列を有することを意味する。
例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であると知られている２１４～２３８、２９７～２９９、３１８～３２２または３２７～３３１番アミノ酸残基が変形のために適当な部位として用いられてもよい。
また、ジスルフィド結合を形成する部位が除去されたり、天然型ＦｃでＮ末端のいくつかのアミノ酸が除去されたり、または天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加される等、多様な種類の誘導体が可能である。また、エフェクタ機能をなくすために補体結合部位、例としてＣｌｑ結合部位が除去されてもよく、ＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）部位が除去されてもよい。このような免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体を製造する技術は、国際特許公開第ＷＯ９７／３４６３１号、国際特許公開第９６／３２４７８号等に開示されている。
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸交換は当該分野において公知となっている（Ｈ． Ｎｅｕｒａｔｈ， Ｒ． Ｌ． Ｈｉｌｌ， Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７９）。最も通常生じる交換は、アミノ酸残基 Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アクリル化（ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ）、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）及びアミド化（ａｍｉｄａｔｉｏｎ）などで修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されてもよい。
上述したＦｃ誘導体は、本発明のＦｃ領域と同等の生物学的活性を示し、Ｆｃ領域の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性を増大させたものであってもよい。
また、このようなＦｃ領域は、ヒト、ウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ラビット、ハムスター、ラットまたはモルモットなどの動物の生体内で分離した天然型から得られてもよく、形質転換された動物細胞または微生物から得られた組換え型またはその誘導体であってもよい。ここで、天然型から獲得する方法は、全体免疫グロブリンをヒトまたは動物の生体から分離した後、タンパク質分解酵素を処理して獲得する方法であってもよい。パパインを処理する場合には、Ｆａｂ及びＦｃに切断され、ペプシンを処理する場合には、ｐＦ’ｃ及びＦ（ａｂ）２に切断される。これをサイズ排除クロマトグラフィ（ｓｉｚｅ－ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）などを用いてＦｃまたはｐＦ’ｃを分離することができる。さらに具体的な実施形態ではヒト由来のＦｃ領域を微生物から得た組換え型免疫グロブリンＦｃ領域である。
また、免疫グロブリンＦｃ領域は天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖または糖鎖が除去された形態であってもよい。このような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減または除去には、化学的方法、酵素学的方法及び微生物を用いた遺伝工学的方法のような通常の方法が用いられてもよい。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ領域は補体（ｃｌｑ）との結合力が顕著に低下し、抗体依存性細胞傷害または補体依存性細胞傷害が減少または除去されるため、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このような点で薬物のキャリアとしての本来の目的に、より符合する形態は糖鎖が除去されたり、非糖鎖化された免疫グロブリンＦｃ領域と言える。
本発明において「糖鎖の除去（Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）」とは、酵素で糖を除去したＦｃ領域を言い、非糖鎖化（Ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）は原核動物、さらに具体的な実施形態では大腸菌で生産して糖鎖化されないＦｃ領域を意味する。
一方、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトまたはウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ラビット、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であってもよく、さらに具体的な実施形態ではヒト起源である。
また、免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来またはこれらの組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）またはこれらの混成（ｈｙｂｒｉｄ）によるＦｃ領域であってもよい。さらに具体的な実施形態では、ヒト血液に最も豊富なＩｇＧまたはＩｇＭ由来であり、より具体的な実施形態ではリガンド結合タンパク質の半減期を向上させることが公知となったＩｇＧ由来である。より一層具体的な実施形態において上記免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、最も具体的な実施形態において上記免疫グロブリンＦｃ領域はヒトＩｇＧ４由来の非糖鎖化されたＦｃ領域であるが、これに制限されるものではない。
また、一つの具体的な実施形態において、免疫グロブリンＦｃ断片は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃの断片であり、各モノマー（ｍｏｎｏｍｅｒ）の３番アミノ酸であるシステイン間のジスルフィド結合（ｉｎｔｅｒ－ｃｈａｉｎ形態）を通じて二個のモノマーが連結されたホモ二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）の形態であってもよく、このとき、ホモ二量体の各モノマーは、独立して３５番及び９５番のシステイン間の内部のジスルフィド結合及び１４１番及び１９９番のシステイン間の内部のジスルフィド結合、即ち、二個の内部のジスルフィド結合（ｉｎｔｒａ－ｃｈａｉｎの形態）を有したり／有することができる。各モノマーのアミノ酸の数は２２１個のアミノ酸で構成されてもよく、ホモ二量体を形成するアミノ酸は、全部で４４２個のアミノ酸からなってもよいが、これに限定されない。具体的には、免疫グロブリンＦｃ断片は、配列番号７１のアミノ酸配列（２２１個のアミノ酸からなる）を有するモノマー２個が各モノマーの３番アミノ酸であるシステイン間にジスルフィド結合を通じてホモ二量体を形成し、前記ホモ二量体のモノマーは、それぞれ独立して３５番及び９５番のシステイン間の内部のジスルフィド結合及び１４１番及び１９９番のシステイン間の内部のジスルフィド結合を形成するものであってもよいが、これらに限定されない。
一方、本発明において「組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」とは、二量体または多量体を形成する時、同一起源の単鎖免疫グロブリンＦｃ領域を暗号化するポリペプチドが相違する起源の単鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。即ち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ Ｆｃ及びＩｇＥのＦｃ断片からなるグループから選択された２個以上の断片から二量体または多量体の製造が可能である。
一方、前記Ｌは、非ペプチド性リンカー、例えば、エチレングリコール繰り返し単位を含有するリンカーであってもよい。
本発明において「非ペプチド性リンカー」は、繰り返し単位が二個以上結合した生体適合性ポリマーを含む。前記繰り返し単位は、ペプチド結合ではなく任意の共有結合を通じて互いに連結される。前記非ペプチド性リンカーは、本発明の結合体の一部をなす一構成であってもよく、前記化学式（１）においてＬに対応する。本発明で使用し得る非ペプチド性リンカーは、生体内タンパク質分解酵素に抵抗性のあるポリマーであれば、制限なく使用することができる。本発明において、前記非ペプチド性リンカーは、非ペプチド性ポリマーと混用して使用することができる。
特にこれに限定されないが、前記非ペプチド性リンカーは、エチレングリコール繰り返し単位を含有するリンカー、例えば、ポリエチレングリコールであってもよく、また、当該分野において既知のそれらの誘導体及び当該分野の技術水準で容易に製造することができる誘導体も本発明の範囲に含まれる。
前記非ペプチド性リンカーの繰り返し単位は、エチレングリコール繰り返し単位であってもよく、具体的には、非ペプチド性リンカーは、エチレングリコール繰り返し単位を含みながら、結合体の製造に用いられる作用基を末端に含むものであってもよい。本発明による持続型結合体は、上記作用基を介してＸとＦが連結された形態であってもよいが、これらに限定されない。本発明において、前記非ペプチド性リンカーは、２個、または３個以上の作用基を含んでいてもよく、各作用基は同一または互いに異なっていてもよいが、これらに限定されない。
具体的には、前記リンカーは、下記化学式（２）で表されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であってもよいが、これに限定されるものではない：
Figure 2022551282000002
・・・（２）
ここで、ｎ＝１０～２４００、ｎ＝１０～４８０、又はｎ＝５０～２５０であるが、これに限定されない。
前記持続型結合体においてＰＥＧ部分は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－構造だけでなく、連結要素とこの－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－との間に介在する酸素原子も含むことができるが、これに限定されるものではない。
また、一つの具体的な実施形態において、前記結合体は、前記グルカゴン誘導体ペプチドまたは一般式１のアミノ酸配列を含むペプチド（Ｘ）と免疫グロブリン断片（Ｆ）がエチレングリコール繰り返し単位を含むリンカーを介して共有結合で連結された構造であってもよいが、これに限定されるものではない。前記ポリエチレングリコールは、エチレングリコールホモポリマー、ＰＥＧコポリマー、またはモノメチル置換ＰＥＧポリマー（ｍＰＥＧ）の形態をすべて包括する用語であるが、特にこれに限定されるものではない。具体的には、前記Ｌ中のエチレングリコール繰り返し単位部分の化学式量は、１～１００ｋＤａの範囲にあるものであってもよいが、これに限定されない。
前記非ペプチド性ポリマーの分子量は、１～１００ｋＤａの範囲、具体的には１～２０ｋＤａの範囲、または１～１０ｋＤａの範囲であるが、これらに限定されない。また、前記Ｆに該当するポリペプチドと結合する本発明の非ペプチド性リンカーは、１種類のポリマーだけでなく、異なる種類のポリマーの組み合わせが使用されてもよい。
一つの具体的な実施形態において、前記非ペプチドリンカーの両末端は、それぞれＦ、例えば、免疫グロブリンＦｃ断片のアミノ基またはチオール基及びＸのアミノ基またはチオール基に結合することができる。
具体的には、前記非ペプチド性ポリマーは、両末端にそれぞれＦ（例えば、免疫グロブリンＦｃ断片）及びＸと結合することができる反応基、具体的には、Ｘ、またはＦのＮ末端またはリシンに位置するアミノ基、またはシステインのチオール基と結合できる反応基を含んでもよいが、これらに限定されない。
また、Ｆ、例えば、免疫グロブリンＦｃ断片及びＸと結合され得る、前記非ペプチド性ポリマーの反応基は、アルデヒド基、マレイミド基及びスクシンイミド誘導体で構成された群から選択されてもよいが、これらに限定されない。
上記において、アルデヒド基としてプロピオンアルデヒド基またはブチルアルデヒド基を例として挙げることができるが、これに限定されない。
上記において、スクシンイミド誘導体としては、スクシンイミジル吉草酸、スクシンイミジルメチルブタノエート、スクシンイミジルメチルプロピオン酸、スクシンイミジルブタノエート、スクシンイミジルプロピオネート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチルまたはスクシンイミジルカーボネートが利用されるが、これらに限定されない。
非ペプチド性リンカーは、そのような反応基を介してＸ及びＦに連結することができるが、特にこれに限定されるものではない。
また、アルデヒド結合による還元性アミノ化により生成された最終産物は、アミド結合により連結されたものより遥かに安定している。アルデヒド反応基は、低ｐＨでＮ末端に選択的に反応し、高ｐＨ、例えば、ｐＨ９．０の条件下ではリシン残基と共有結合を形成することができる。
また、前記非ペプチド性リンカーの両末端の反応基は、互いに同一または異なっていてもよく、例えば、一方の末端にはマレイミド基を、他方の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、またはブチルアルデヒド基を有してもよい。しかしながら、非ペプチド性リンカーの各末端に、Ｆ、具体的には免疫グロブリンＦｃ断片とＸを結合されるものであれば、特にこれに限定されない。
例えば、前記非ペプチド性リンカーの一方の末端には、反応基としてマレイミド基を含み、他方の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基またはブチルアルデヒド基などを含むことができる。
両末端にヒドロキシ反応基を有するポリエチレングリコールを非ペプチド性ポリマーとして用いる場合には、公知の化学反応により前記ヒドロキシ基を前記多様な反応基で活性化したり、商業的に入手可能な変形した反応基を有するポリエチレングリコールを用いて本発明の持続型タンパク質結合体を製造することができる。
一つの具体的な実施形態において、前記非ペプチド性ポリマーは、Ｘのシステイン残基、より具体的には、システインの－ＳＨ基に連結されていてもよいが、これらに限定されない。
具体的には、上記システイン残基の－ＳＨ基に非ペプチド性ポリマーの反応基を連結されてもよく、反応基に対しては前述の内容が全て適用される。もし、マレイミド－ＰＥＧ－アルデヒドを使用する場合、マレイミド基は、Ｘの－ＳＨ基とチオエーテル（ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ）結合で連結し、アルデヒド基はＦ、具体的には免疫グロブリンＦｃの－ＮＨ2基と還元的アミノ化反応を通じて連結することができるが、これに限定されず、これは一例に該当する。
また、前記結合体において、非ペプチド性ポリマーの反応基が免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端に位置した－ＮＨ2に連結されたものであってもよいが、これは一例に該当する。
また、上述した結合体は、効果の持続性が天然型グルカゴンに比べて、またはＦが修飾されていないＸに比べて増加したものであってもよく、このような結合体は上述した形態だけでなく、生分解性ナノパーティクルに封入された形態などをすべて含む。
一方、本発明のＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストは、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して有意な水準の活性を有する様々な物質、例えば、化合物またはペプチド形態の物質を含む。本願において、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストは「ＧＬＰ－１／ＧＩＰ二重アゴニスト」または「二重アゴニスト」と混用して使用することができる。
具体的には、二重アゴニストは、下記のｉ）～ｉｉ）のうちの一つ以上の活性、具体的には、有意な活性を有することを特徴とする：
ｉ）ＧＬＰ－１受容体の活性化；及びｉｉ）ＧＩＰ受容体の活性化。
特にこれに限定されるものではないが、前記ＧＬＰ－１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－１）受容体及びＧＩＰ（Ｇｌｕｃｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）受容体二重アゴニストは、前記受容体に対して有意な水準の活性を有する物質であり、天然型ＧＬＰ－１及びＧＩＰだけでなく、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対してｉｎ ｖｉｔｒｏ活性が、当該受容体の天然型リガンド（天然型ＧＬＰ－１及びＧＩＰ）に対して０．１％以上、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上を示すものであってもよいが、有意に増加した範囲は制限なく含まれる。
このような二重アゴニストのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を測定する方法は、当業界において公知となった多様なｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を、測定を用いて達成することができ、その例として本願明細書の実施例２を参照することができるが、特にこれに限定されるものではない。
特にこれに限定されるものではないが、そのような二重アゴニストは、非自然に発生する（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ものであってもよい。
上記ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対する活性を有する物質の例として、天然型ＧＬＰ－１及びＧＩＰ、そのアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）、またはその誘導体があるが、特にこれに限定されるものであってもよい。「誘導体」は上記の通りである。
特にこれに限定されるものではないが、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストは、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドであってもよい。
具体的には、本発明のＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストは、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を示すＧＬＰ－１またはＧＩＰの誘導体であり、当業界において公知となったＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストであれば、制限なく本発明の範疇に含まれ得る。本発明によるＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストは、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を示すことができる限り、販売されるものや、又は当業界において公知となった方法で製造したものであってもよい。ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストの例として、ｔｉｒｚｅｐａｔｉｄｅ、ＮＮ９７０９、ＳＡＲ－４３８３３５であってもよいが、これらに限定されない。
本発明によるＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストの一例であるチルゼパチド（ｔｉｒｚｅｐａｔｉｄｅ）は、Ｌ－ｔｙｒｏｓｙｌ－２－ｍｅｔｈｙｌａｌａｎｙｌ－Ｌ－α－ｇｌｕｔａｍｙｌｇｌｙｃｙｌ－Ｌ－ｔｈｒｅｏｎｙｌ－Ｌｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ－Ｌ－ｔｈｒｅｏｎｙｌ－Ｌ－ｓｅｒｙｌ－Ｌ－α－ａｓｐａｒｔｙｌ－Ｌ－ｔｙｒｏｓｙｌ－Ｌｓｅｒｙｌ－Ｌ－ｉｓｏｌｅｕｃｙｌ－２－ｍｅｔｈｙｌａｌａｎｙｌ－Ｌ－ｌｅｕｃｙｌ－Ｌ－α－ａｓｐａｒｔｙｌ－Ｌｌｙｓｙｌ－Ｌ－ｉｓｏｌｅｕｃｙｌ－Ｌ－ａｌａｎｙｌ－Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｙｌ－Ｎ ６－［（２２Ｓ）－２２，４２－ｄｉｃａｒｂｏｘｙ－１０，１９，２４－ｔｒｉｏｘｏ－３，６，１２，１５－ｔｅｔｒａｏｘａ－９，１８，２３－ｔｒｉａｚａｄｏｔｅｔｒａｃｏｎｔａｎ－１－ｏｙｌ］－Ｌ－ｌｙｓｙｌ－Ｌ－ａｌａｎｙｌ－Ｌ－ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ－Ｌｖａｌｙｌ－Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｙｌ－Ｌ－ｔｒｙｐｔｏｐｈｙｌ－Ｌ－ｌｅｕｃｙｌ－Ｌ－ｉｓｏｌｅｕｃｙｌ－Ｌａｌａｎｙｌｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｙｌ－Ｌ－ｐｒｏｌｙｌ－Ｌ－ｓｅｒｙｌ－Ｌ－ｓｅｒｙｌｇｌｙｃｙｌ－Ｌ－ａｌａｎｙｌ－Ｌｐｒｏｌｙｌ－Ｌ－ｐｒｏｌｙｌ－Ｌ－ｐｒｏｌｙｌ－Ｌ－ｓｅｒｉｎａｍｉｄｅ（ＣＡＳ＃ ２０２３７８８－１９－２） として知られており、次のような配列を有する物質である：
ＹＸＥＧＴＦＴＳＤＹ ＳＩＸＬＤＫＩＡＱＫ ＡＦＶＱＷＬＩＡＧＧ ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号５０）
ここで、Ｘ、Ｋ及びＳはそれぞれ次のように変形された残基である。
Figure 2022551282000003
一方、特にこれに限定されるものではないが、本発明のＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニトは、末端が変形された形態、具体的には、前記二重アゴニストの一末端がアシル化又はアミド化されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のペプチドは、その長さに応じて、この分野において周知の方法、例えば、自動ペプチド合成機により合成することができ、遺伝子操作技術により生産することもできる。
具体的には、本発明のペプチドは、標準合成方法、組換え発現システム、または任意の異なる当該分野の方法により製造されてもよい。したがって、本発明によるペプチドは、例えば、以下を含む方法を含む多数の方法で合成することができる。
（ａ）ペプチドを固相または液相法の手段で段階的または断片組立により合成し、最終ペプチド生成物を分離及び精製する方法；または
（ｂ）ペプチドをエンコードする核酸作製物を宿主細胞内で発現させ、発現生成物を宿主細胞培養物から回収する方法；または
（ｃ）ペプチドをエンコードする核酸作製物の無細胞試験管内の発現を行い、発現生成物を回収する方法；または
（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の任意の組合せによりペプチドの断片を得、続いて、断片を連結させてペプチドを得、当該ペプチドを回収する方法。
より具体的な例として、遺伝子操作を通じてペプチドをコードするポリヌクレオチドを製造し、それを宿主細胞に形質転換させた後、所望のペプチドを生産することができる。
特にこれに限定されるものではないが、本発明の組成物は、グルカゴンのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がグルカゴン受容体の天然型リガンド活性に対して約０．１％以上、約１％以上、約２％以上、約３％以上、約４％以上、約５％以上、約６％以上、約７％以上、約８％以上、約９％以上、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１００％以上、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストの場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性が当該受容体の天然型リガンド活性のそれぞれＧＬＰ－１活性は、約０．１％以上、約１％以上、約２％以上、約３％以上、約４％以上、約５％以上、約６％以上、約７％以上、約８％以上、約９％以上、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１００％以上、ＧＩＰ受容体活性は、約０．１％以上、約１％以上、約２％以上、約３％以上、約４％以上、約５％以上、約６％以上、約７％以上、約８％以上、約９％以上、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１００％以上のものであってもよいが、これに限定されるものではない。特にこれに限定されるものではないが、本発明の組成物は、グルカゴンのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性がグルカゴン受容体の天然型リガンド活性に対して約０．１％以上約３００％以下、約２％以上約３００％以下、約３％以上約３００％以下、約４％以上約３００％以下、約５％以上約３００％以下、約６％以上約３００％以下、約７％以上約３００％以下、約８％以上約３００％以下、約９％以上約３００％以下、約１０％以上約３００％以下、約２０％以上約３００％以下、約３０％以上約３００％以下、約４０％以上約３００％以下、約５０％以上約３００％以下、約６０％以上約３００％以下、約７０％以上約３００％以下、約８０％以上約３００％以下、約９０％以上約３００％以下、約１００％以上約３００％以下、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストの場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性が当該受容体の天然型リガンド活性に対してそれぞれＧＬＰ－１活性は、約０．１％以上約２００％以下、約２％以上約２００％以下、約３％以上約２００％以下、約４％以上約２００％以下、約５％以上約２００％以下、約６％以上約２００％以下、約７％以上約２００％以下、約８％以上約２００％以下、約９％以上約２００％以下、約１０％以上約２００％以下、約２０％以上約２００％以下、約３０％以上約２００％以下、約４０％以上約２００％以下、約５０％以上約２００％以下、約６０％以上約２００％以下、約７０％以上約２００％以下、約８０％以上約２００％以下、約９０％以上約２００％以下、約１００％以上約２００％以下、ＧＩＰ受容体活性は、約０．１％以上約３００％以下、約２％以上約３００％以下、約３％以上約３００％以下、約４％以上約３００％以下、約５％以上約３００％以下、約６％以上約３００％以下、約７％以上約３００％以下、約８％以上約３００％以下、約９％以上約３００％以下、約１０％以上約３００％以下、約２０％以上約３００％以下、約３０％以上約３００％以下、約４０％以上約３００％以下、約５０％以上約３００％以下、約６０％以上約３００％以下、約７０％以上約３００％以下、約８０％以上約３００％以下、約９０％以上約３００％以下、約１００％以上約３００％以下のものであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の組成物は、メタボリックシンドロームの予防または治療に使用することができる。
本発明において用語「予防」とは、（ｉ）グルカゴン活性を有する物質、及び（ｉｉ）ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニスト；またはそれを含む組成物の投与により目的とする疾患、例えば、メタボリックシンドロームの発病を抑制または遅延させる全ての行為を意味し、「治療」とは、（ｉ）グルカゴン活性を有する物質、及び（ｉｉ）ＧＬＰ－１受容体、及びＧＩＰ受容体二重アゴニスト；またはそれを含む組成物の投与により目的とする疾患、例えば、メタボリックシンドロームの症状が好転したり有益になる全ての行為を意味する。
本発明において用語「投与」とは、任意の適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、上記組成物の投与経路は、特にこれに制限されないが、上記組成物が生体内標的に到達することができる任意の一般的な経路を通じて投与されてもよく、例えば、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与などになる。
グルカゴン活性を有する物質、及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストは、メタボリックシンドロームの予防または治療に使用することができる。
本発明の（ｉ）グルカゴン活性を有する物質、及び（ｉｉ）ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストの併用投与は、体重増加を予防したり、体重減少を促進したり、過体重を減少させたり、病的肥満を含む肥満（例えば、食欲、摂食、食品摂取、カロリー摂取及び／又はエネルギー消費の調節により）に対して効果を示すだけでなく、肥満関連の炎症、肥満関連の胆嚢疾患及び肥満誘導された睡眠時無呼吸を含む疾患にも効力を示す。また、本発明の（ｉ）グルカゴン活性を有する物質、及び（ｉｉ）ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストの併用投与は、メタボリックシンドローム又は肥満に関連する肝疾患においても効力を示すことができるが、これに限定されない関連疾患及び健康状態を治療するための薬剤として用いられる。本発明のグルカゴン活性を有する物質及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストは、また、肥満以外のメタボリックシンドローム、即ち、耐糖能障害、高コレステロール血症、脂質異常症、肥満、糖尿、高血圧、肝疾患、脂質異常症による動脈硬化、粥状動脈硬化症、動脈硬化症、冠状動脈心疾患（冠動脈性心臓病）、及び脳卒中などのような関連疾患の治療に用いられる。しかし、これら病態において本発明によるグルカゴン活性を有する物質、及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストの効果は、前述した体重関連の効果を通じて全体的にまたは部分的に媒介されたり、これとは独立的であってもよい。
本発明において用語「メタボリックシンドローム（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）」とは、慢性的な代謝障害により生じる多様な疾患が単独または複合的に生じる症状をいい、特に、メタボリックシンドロームに該当する疾患としては、耐糖能障害、高コレステロール血症、脂質異常症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、肥満、糖尿、高血圧、肝疾患、脂質異常症による動脈硬化、粥状動脈硬化症、動脈硬化症、冠状動脈心疾患（冠動脈性心臓病）、及び脳卒中などがあるが、これに制限されない。
本発明において用語「肥満」とは、体内に脂肪組織が過多な状態であり、身体肥満指数（体重（ｋｇ）を身長（ｍ）の二乗で割った値）が２５以上であれば、肥満と定義される。肥満は、長い期間にわたりエネルギー消費量に比べて栄養素を過多に摂取する場合、エネルギー不均衡により誘発されることが普通である。肥満は、身体全体に影響を及ぼす代謝疾患であり、糖尿病及び高脂血症にかかる可能性が高くなり、性機能障害、関節炎、心血管系疾患の発病危険が高くなり、一部の場合、癌の発生とも連関がある。肥満の治療は、体重及び体内脂肪の減少を通じて行うことができるが、これらに限定されるものではない。
本発明において、用語「高脂血症（Ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉａ）」とは、血液中に遊離コレステロール、コレステロールエステル、リン脂質、中性脂肪などの脂肪質が非正常に増加した状態をいう。高脂血症は、一般にそれ自体が特定の症状を示すわけではないが、血液中の過剰な脂質は、血管の壁にくっついて血管の大きさを減らし、炎症反応による動脈硬化（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）を引き起こす。これにより、冠状動脈の心臓疾患や脳血管疾患、末梢血管の閉鎖などが発生することがある。また、過剰な血液中の脂質は肝臓組織に蓄積し、それにより脂肪肝（Ｆａｔ ｌｉｖｅｒ）が誘発され得る。上記において脂肪肝とは、肝臓の重量で脂肪が占める割合が５％を超えた状態をいい、過剰な脂肪摂取だけでなくアルコールの摂取によっても誘発され得る。高脂血症の治療は、血中脂質数値の改善により行うことができるが、これらに限定されるものではない。
本発明において、用語「糖尿病」は、インスリンの分泌量が不足したり、正常な機能が得られないなどの代謝疾患の一種であり、血中グルコースの濃度が高くなる高血糖を特徴とし、最近、肥満率、特に腹部肥満の増加により糖尿の発生率が爆発的に増加している傾向である。慢性的な高血糖状態に適切な治療ができなければ、体内で種々の病的症状が伴われるが、代表的なものが、網膜病症、腎臓機能障害、神経病症、血管障害による脳卒中、腎臓、心臓疾患や糖尿性足部潰瘍、そして心血管疾患のリスクが高くなる。糖尿病の治療は、インスリン感受性の改善による血糖の改善を通じて行うことができるが、これらに限定されるものではない。
上述のメタボリックシンドロームは、肝組織に蓄積する脂肪と、それによる炎症の発生と線維化につながる肝疾患と密接な関連を有し、メタボリックシンドロームの例として様々な肝疾患を含むことができる。
そこで、本発明の組成物は、肝疾患に対する予防または治療用途を有するものであってもよい。具体的には、本発明による（ｉ）グルカゴン活性を有する物質、及び（ｉｉ）ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを含む組成物は、肝組織における炎症及び／又は線維化を抑制し、改善する効果を示して肝疾患に対する予防または治療用途を有するものであってもよいが、これに限定されない。
本発明において「肝疾患」とは、肝臓で発症する疾患を意味するものであり、代謝性肝疾患を含むことができるが、これに限定されるものではない。前記肝疾患の代表的な例としては、単純脂肪症、非アルコール性脂肪肝、肝炎症、非アルコール性脂肪肝炎、胆汁うっ滞性肝疾患（ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）、肝線維症、肝硬変、肝不全及び肝癌などが挙げられ、肝臓の組織及び機能に異常が生じる限り、本発明による肝疾患であってもよい。アルコール摂取、薬物、ウイルス感染以外にも肥満、代謝障害などにより肝臓に炎症が発生することがあり、肝炎症の進行及び慢性化に伴い、肝硬変、肝癌などの疾患で発病することが知られている。
具体的には、本発明による（ｉ）グルカゴン活性を有する物質、及び（ｉｉ）ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを含む組成物は、メタボリックシンドロームと関連し、又はメタボリックシンドロームにより発生した肝疾患に対する予防または治療効果を示すことができる。
本発明による（ｉ）グルカゴン活性を有する物質、及び（ｉｉ）ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを含む組成物が治療効果を有する肝疾患は、代謝性肝疾患であってもよいが、これらに限定されない。代謝性肝疾患は、身体の非正常な化学反応が身体の新陳代謝を妨げることにより生じる疾患であり、単純脂肪症、脂肪肝、脂肪肝炎、非アルコール性脂肪肝疾患などが含まれる。
本発明において、「非アルコール性脂肪肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ， ＮＡＦＬＤ）」とは、アルコール摂取の過去歴がなく、アルコール摂取に関係がないのに脂肪肝を伴う場合をいう。脂肪肝とは、中性脂肪が正常な場合とは異なり、肝細胞内に非正常に沈着する現象が現れたものをいう。正常な肝臓は、約５％が脂肪組織で構成されており、中性脂肪、脂肪酸、リン脂質、コレステロール及びコレステロールエステルが脂肪の主成分であるが、一旦脂肪肝が発生すると、大部分の成分が中性脂肪に代替され、中性脂肪の量が肝臓重量の５％以上であれば脂肪肝と診断される。脂肪肝は、肝細胞内の脂肪代謝障害や過剰脂肪を運搬する過程における欠陥などによりもたらされるものであり、主に肝臓における脂肪代謝の障害により発生する。前記脂肪肝に蓄積された脂肪の大部分は中性脂肪（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）であってもよい。
非アルコール性脂肪肝疾患は、肝細胞に脂肪の過剰な蓄積のみがある単純脂肪症（ｓｉｍｐｌｅ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）、非アルコール性脂肪肝（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ）、肝細胞壊死と炎症と線維化を伴う非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ、ＮＡＳＨ）などを含む一連の疾患群を意味するが、本発明の組成物で治療される限り、これに限定されるものではない。本発明による非アルコール性脂肪肝疾患は、非アルコール性脂肪肝炎を伴うものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
また、本発明に係る（ｉ）グルカゴン活性を有する物質、及び（ｉｉ）ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを含む組成物が治療効果を有する肝疾患は、肝炎症（ｌｉｖｅｒ ｉｎｆｌａｍａｔｉｏｎ）であってもよいが、これに限定されない。本発明において、「肝炎症」とは、肝疾患の最大の原因であり、肝臓に炎症を引き起こす疾患を意味し、原因と症状に応じて急性肝炎と慢性肝炎に区別される。ウイルス、アルコール、薬物、免疫異常、代謝疾患などを主原因とする。
本発明による（ｉ）グルカゴン活性を有する物質、及び（ｉｉ）ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを含む組成物は、肝臓の炎症自体を軽減する効果を有するだけでなく、肝臓の炎症を伴うか、又は肝臓の炎症に起因して発病した疾患、例えば、肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、肝線維症などに効果を示すことができる。
本発明において、「非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）」は、非アルコール性脂肪肝疾患の一つであり、肝細胞壊死、炎症、及び線維化を伴う肝疾患の代表的な例である。本発明による（ｉ）グルカゴン活性を有する物質、及び（ｉｉ）ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを含む組成物は、肝炎症及び線維化を抑制し、非アルコール性脂肪肝炎に対する効果を示すことができ、具体的には、脂肪肝、肝線維症または肝硬変を伴う非アルコール性脂肪肝炎；または非アルコール性脂肪肝炎による肝臓癌に対する効果を示すことができるが、これに限定されるものではない。
具体的には、本発明の（ｉ）グルカゴン活性を有する物質、及び（ｉｉ）ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを含む組成物はＮＡＳ（ＮＡＦＬＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）減少効果を示し、これは、非アルコール性脂肪肝炎に対する治療効果を意味する。
本発明において、「肝線維症（ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）」とは、反復的な肝損傷に対する損傷回復過程の結果であり、再生（ｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）や反応過程で器官や組織に過剰な線維性結合組織が形成されることを意味する。肝炎症の慢性化及び深化が発症の一つの原因として知られている。肝硬変症とは異なって可逆的であり、薄い原繊維（ｔｈｉｎ ｆｉｂｒｉｌ）で構成され、結節（ｎｏｄｕｌｅ）の形成がないことが知られており、肝損傷の原因が消失すれば、正常回復が可能であってもよいが、このような肝線維症の過程が繰り返し続くと、ＥＣＭ（ｅｘｔｒａ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）間の架橋結合（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）が増加し、結節（ｎｏｄｕｌｅ）のある不可逆的な肝硬変症に進行する。本発明による組成物は、肝線維症、具体的には、非アルコール性脂肪肝炎を伴う肝線維症に対する予防または治療効果を示すことができるが、これらに限定されない。
具体的には、本発明の（ｉ）グルカゴン活性を有する物質、及び（ｉｉ）ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを含む組成物は、肝線維症に効果を奏することができ、具体的には、肝組織内におけるコラーゲンの発現が減少し、肝線維症を予防または治療するものであってもよい。
本発明において、「胆汁うっ滞症（ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ）」は、肝臓から十二指腸への胆汁の流動が遅くなったり遮断された病態であり、「胆汁うっ滞性肝疾患（ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）」は肝臓内において、胆汁形成が各種疾患、拡張された頸静脈栄養、または特定の薬物（例えば、一部の抗生剤）の副作用のような病態により妨害されたことを意味する。胆汁うっ滞症の通常の徴候には、疲労、そう痒感（かゆみ）、黄疸、及び黄色腫（皮下への高コレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ｒｉｃｈ）物質の堆積）が含まれる。胆汁うっ滞症の影響は極度で広範囲であり、これは、肝疾患の全身性疾患への悪化、肝不全、及び肝移植の必要性をもたらす。胆汁うっ滞性肝疾患の原因としては、急性肝炎、胆管の炎症などが挙げられる。
前記胆汁うっ滞性肝疾患には、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（ＰＦＩＣ）、及びアラジール症候群（Ａｌａｇｉｌｌｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＡＳ）などが含まれるが、これに限定されない。
原発性胆汁性胆管炎（ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ：ＰＢＣ）としても知られている原発性胆汁性硬変症は、原因不明の慢性胆汁うっ滞性肝疾患である。門脈（ｐｏｒｔａｌ）及び門脈周囲（ｐｅｒｉｐｏｒｔａｌ）の炎症による進行性胆管損傷は、進行性線維症及び最終的な肝硬変を引き起こすことがある。これまでは、免疫学的、遺伝的及び環境的要因が疾患の潜在的な原因として知られている。原発性胆汁性硬変症は、主に中年の女性に多く見られ、症状は初期発現において疲労、かゆみ、または不糾明の高脂血症も原発性胆汁性硬変症の症状として現れることがある。
現在までは、原発性胆汁性硬化症が免疫媒介された疾患であることが知られており、具体的には、門脈及び門脈周辺の部位においてＴリンパ球の免疫組織化学的染色は、ＣＤ４－陽性及びＣＤ８－陰性Ｔ細胞を示す。また、罹患した個体の無症候性第一等級の同類（ｒｅｌａｔｉｖｅｓ）において、非正常抑制性Ｔ細胞活性が報告された。インターロイキンが変更された免疫機能及び線維症に寄与することによりＰＢＣの発病機転に役割を果たすことが報告された（Ｇ．Ｊ． Ｗｅｂｂら、Ｊ． Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ、２０１５ Ｎｏｖ； ６４：４２－５２）。
ＰＢＣの治療方法は、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＳＡ）及びオベチコール酸（ＯＣＡ）を用いた胆汁酸治療法である。ＰＢＣにおいて両薬物の作用機序は、ＦＸＲ及びＴＧＦＲ－５を活性化させて抗炎症性効果を発揮させるそれらの能力と関連している。しかしながら、ＵＤＣＡで治療された患者の約４０％で十分な生化学反応が達成されなかった。
原発性硬化性胆管炎（Ｐｒｉｍａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ：ＰＳＣ）は、原因不明の肝内／肝外胆道の炎症と線維化により引き起こされる慢性進行性胆汁うっ滞性肝疾患である。具体的には、胆管及び胆道の炎症性疾患として疾患が進行すると、線維化が起こり、胆管壁が厚くなりながら、狭くなったり狭窄する疾患である。まだ原因は不明であるが、遺伝的要因、環境的要因、これに関連する免疫反応など多様な因子が複合的な原因として推定されている。
血液による肝機能検査において、ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ値の上昇、ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ値の上昇、ガンマグロブリン血症などが見られれば、原発性硬化性胆管炎と診断している。
ＰＳＣの治療方法は、まだ明確に報告されておらず、肝移植手術が根本的に治療できる唯一の治療方法である。
そこで、患者の利便性の確保及び副作用なしにＰＢＳ及びＰＳＣを治療することができる薬物の開発が依然として求められている。
本発明の「肝硬変（ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）」は、肝細胞再生及び線維組織の増加を繰り返しながら発病し、病理学的に壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）、炎症（ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）及び線維化（ｆｉｂｒｏｓｉｓ）を伴う慢性疾患であり、最終的には、肝不全のような肝硬変合併症及び肝癌などの疾患に進行して死亡に至る。特に、初期に自覚症状がなく、かなり進んでこそ発見されるため、肝硬変などに進化する前の状態である肝線維症を迅速に治療することが求められる。本発明による組成物は、肝硬変、具体的には、非アルコール性脂肪肝炎を伴う肝硬変に対する予防または治療効果を示すことができるが、これらに限定されない。
本発明の「肝不全（ｌｉｖｅｒ ｄｅｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）」とは、ウイルス性肝炎、肝硬変症、薬物またはアルコールのような肝損傷または肝疾患により肝機能が弱くなり、肝臓が正常な生理作用としてのタンパク質合成と代謝機能を行えない状態を意味する。進行速度によって急性肝不全または慢性肝不全に分けられ、様々な合併症を引き起こすことが知られている。本発明による組成物は、炎症及び線維化抑制などの効果を示すため、肝不全に対する予防または治療効果を示すことができる。
本発明の「肝癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）」とは、肝細胞に由来する悪性腫瘍を意味し、肝細胞自体から発生した原発性肝癌（肝細胞癌；ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）と他の組織の癌が肝臓に転移されてきた転移性肝癌に区分することができるが、肝癌の約９０％以上は原発性肝癌である。主な原因としては、肝炎、慢性肝疾患以外に、アルコール、喫煙、肥満などが知られている。本発明による組成物は、肝臓癌、具体的には、非アルコール性脂肪肝炎による肝癌に対する予防または治療効果を示すことができるが、これらに限定されない。
本発明の実施例では、高脂肪食餌誘導肥満マウス及びＣＤ－ＨＦＤ（コリン欠乏及び高脂肪、高コレステロール）食餌で誘導されたマウスモデルを用いた。ＣＤ－ＨＦＤ食餌で誘導されたモデルは、高脂肪及び高コレステロール含有量を有しており、長期摂取時に、脂肪肝及び脂肪肝炎を誘発することがあり、コリンの欠乏はこのような脂肪肝炎をさらに深化させて線維症まで誘発しうることが知られている。
本発明の実施例では、本発明の（ｉ）グルカゴン活性を有する物質、及び（ｉｉ）ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを含む組成物の効果を上記各モデルで確認したところ、これは、メタボリックシンドローム、肝線維症、単純脂肪症、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎などの肝疾患の予防または治療に有用であることを示唆するものである。
本発明による組成物は、下記特性のうちの一つ以上を行うものであってもよいが、これらに限定されない：
（ａ）体重及び脂肪重量の減少；
（ｂ）血中脂質数値の改善；
（ｃ）インスリン感受性の改善；
（ｄ）ＵＣＰ－１、及びＰＧＣ－１α遺伝子発現の減少；
（ｅ）ＮＡＳ（ＮＡＦＬＤ ＡＣＴＩＶＩＴＹ ＳＣＯＲＥ）の減少；及び
（ｆ）肝組織内におけるコラーゲン発現の減少。
本発明による組成物は、既存の肝疾患治療剤の副作用である体重増加がないか、またはその程度が相対的に低いことを特徴とすることができる。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含んでもよい。本発明の用語「薬学的に許容可能な」とは、治療効果を示すことができる程度の十分な量と副作用を引き起こさないことを意味し、疾患の種類、患者の年齢、体重、健康、性別、患者の薬物に対する敏感度、投与経路、投与方法、投与回数、治療期間、配合または同時用いられる薬物など、医学分野によく知られている要素に応じて当業者により容易に決定され得る。
本発明のグルカゴン活性を有する物質、及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを含む薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含んでもよい。上記担体は、特にこれに制限されないが、経口投与時には、結合剤、滑沢剤、崩解剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを用いることができ、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して用いることができ、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを用いることができる。
本発明の組成物の剤形は、上述したような薬学的に許容可能な担体と混合して多様に製造され得る。例えば、経口投与時には、錠剤、トローチ、カプセル、エリクサー、サスペンション、シロップ、ウエハなどの形態で製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは多数回投薬形態で製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放型製剤などに剤形化することができる。
一方、製剤化に適した担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシア、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートまたは鉱物油などが用いられる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、防腐剤などをさらに含んでもよい。
また、本発明の薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、凍結乾燥製剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれか一つの剤形を有することができる。
また、上記組成物は、薬学的分野において通常の方法により患者の身体内投与に適した単位投与型の製剤、具体的には、ペプチド医薬品の投与に有用な製剤形態に剤形化させて当業界において通常に用いる投与方法を用いて経口、または皮膚、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、髄膜腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹内、鼻腔内、消化管内、局所、舌下、膣内または直腸経路を含む非経口投与経路により投与されてもよいが、これらに限定されるものではない。
また、上記グルカゴン活性を有する物質、及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストは、生理食塩水または有機溶媒のように薬剤として許容された種々の担体（ｃａｒｒｉｅｒ）と混合して用いられ、安定性や吸収性を増加させるために、グルコース、スクロースまたはデキストランのような炭水化物、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）またはグルタチオンのような抗酸化剤（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ）、キレート剤、低分子タンパク質または他の安定化剤（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ）などが薬剤として用いられる。
本発明の薬学的組成物の投与量と回数は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別及び体重及び疾患の重症度等の種々の関連因子と共に、活性成分である薬物の種類に応じて決定される。
特にこれに制限されないが、本発明の上記薬学的組成物は、上記成分（有効成分）を０．０１～９９％重量対体積で含有することができる。
本発明の組成物の総有効量は、単一投与量（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ）で患者に投与することができ、多重投与量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅ）で長期間投与される分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）により投与されてもよい。本発明の薬学的組成物は、疾患の程度に応じて有効成分の含量を異にすることができる。具体的には、本発明のグルカゴン活性を有する物質、及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストの好ましい全体用量は、１日に患者体重１ｋｇ当たり約０．０００１μｇ～５００ｍｇであってもよい。
具体的には、本発明の組成物は、グルカゴン活性を有する物質を０．１５～２．５、０．１９～２．２５、０．２５～１．５、０．３７～１．１２ｎｍｏｌ／ｋｇで、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを２．０～３５、２．０８～３１．１６、１０．３９～３１．１６ｎｍｏｌ／ｋｇで含むものであってもよく、より具体的には、グルカゴン活性を有する物質を０．３７、０．７５、または１．１２ｎｍｏｌ／ｋｇで、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを１０．３９、２０．７７、または３１．１６ｎｍｏｌ／ｋｇを含むものであってもよいが、これらに限定されない。また、本発明の組成物は、グルカゴン活性を有する物質：ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを１：０．１～１：５００、１：０．５～１：２５０、１：０．９～１：１６７、又は１：１０～１：５６．２のモル比で含むものであってもよいが、これらに限定されない。
しかし、上記のペプチドの用量は、薬学的組成物の投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌及び排泄率等、多様な要因を考慮して患者に対する有効投与量が決定されるため、このような点を考慮すると、当分野の通常の知識を有する者であれば、上記本発明の組成物の特定の用途に応じた適切な有効投与量を決定し得るものである。本発明による薬学的組成物は、本発明の効果を奏する限り、その剤形、投与経路及び投与方法に特に制限されない。
本発明の薬学的組成物は、生体内持続性及び力価に優れ、他の薬剤に比べて低い投与回数及び頻度を示すことができるが、特にこれに制限されるものではない。
特に、本発明の薬学的組成物は、天然グルカゴンに比べて変化したｐＩを有するグルカゴン誘導体を有効成分として含むため、中性ｐＨで改善された溶解度及び／又は高い安定性を示すため、メタボリックシンドロームをはじめとした目的とする疾患の治療のための安定したグルカゴン剤形の製造に有用に用いられる。
上記メタボリックシンドロームの予防または治療のための薬学的組成物、またはメタボリックシンドロームの予防または治療のための療法などにおいて、グルカゴン受容体に対する活性を有する物質；及び／またはＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニスト以外にも、メタボリックシンドロームに対する治療的活性を有する化合物または物質を含んでもよく、上記療法は、上記化合物または物質の追加使用を含んでもよい。
本発明を具現するもう一様態は、グルカゴン受容体に対する活性を有する物質；及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを、これを必要とする個体に投与する段階を含む、メタボリックシンドロームの予防または治療方法を提供する。
前記グルカゴン受容体に対する活性を有する物質、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニスト、これを含む組成物、メタボリックシンドローム、予防、及び治療については、先に説明した通りである。
本発明において上記個体は、メタボリックシンドローム（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）が疑われる個体であり、上記メタボリックシンドローム（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）が疑われる個体は、当該疾患が発病しているか、または発病し得るヒトを含むラット、家畜などを含む哺乳動物を意味するが、本発明のグルカゴン誘導体あるいはこれを含む上記組成物で治療可能な個体は制限なく含まれる。また、本発明の薬学的組成物をメタボリックシンドロームの疑いのある個体に投与することにより、個体を効率よく治療することができる。メタボリックシンドロームについては上記で説明した通りである。
本発明の方法は、（ｉ）グルカゴン受容体に対する活性を有する物質及び（ｉｉ）ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを含む薬学的組成物を薬学的有効量で投与することを含んでもよい。本発明による方法は、（ｉ）グルカゴン受容体に対する活性を有する物質及び（ｉｉ）ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを一つの製剤として投与したり、または個別製剤を同時、個別、順次または逆順で投与するものであってもよいが、これに制限されない。
適した総１日使用量は、正しい医学的判断範囲内で担当医により決定され、１回または数回に分けて投与することができる。しかし、本発明の目的上、特定患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によって他の製剤が用いられるかどうかをはじめとした具体的組成物、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物と共に用いられたり、同時用いられる薬物をはじめとした多様な因子と医薬分野によく知られている類似因子に応じて異なって適用することが好ましい。
具体的には、グルカゴン受容体に対する活性を有する物質及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストは、それぞれ１日に患者体重１ｋｇ当たり約０．０００１ｍｇ～５００ｍｇ投与されるものであってもよく、両物質を併用するときには、総量が１日に患者体重１ｋｇ当たり約０．０００１ｍｇ～１０００ｍｇ投与されるものであってもよいが、これに限定されない。
また、併用投与されるグルカゴン受容体に対する活性を有する物質及びＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストは、１：０．０１～１：１００のモル比で投与することができるが、これらに限定されない。
具体的には、グルカゴン活性を有する物質を０．１５～２．５、０．１９～２．２５、０．２５～１．５、０．３７～１．１２ｎｍｏｌ／ｋｇで、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを２．０～３５、２．０８～３１．１６、１０．３９～３１．１６ｎｍｏｌ／ｋｇで投与するものであってもよく、より具体的には、グルカゴン活性を有する物質を０．３７、０．７５、または１．１２ｎｍｏｌ／ｋｇで、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを１０．３９、２０．７７、または３１．１６ｎｍｏｌ／ｋｇで投与するものであってもよいが、これに限定されない。また、グルカゴン活性を有する物質：ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを１：０．１～１：５００、１：０．５～１：２５０、１：０．９～１：１６７、又は１：１０～１：１：５６．２のモル比で投与するものであってもよいが、これらに限定されない。
一方、特にこれに制限されないが、上記メタボリックシンドロームの予防または治療方法は（ｉ）グルカゴン受容体に対する活性を有する物質及び（ｉｉ）ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニスト以外に、一つ以上のメタボリックシンドロームに対する治療的活性を有する化合物または物質を投与することをさらに含む併用療法であってもよい。
本発明を具現するもう一様態は、（ｉ）グルカゴン受容体に対する活性を有する物質及び（ｉｉ）ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを含む組成物のメタボリックシンドロームの予防または治療への使用を提供する。
本発明を具現するもう一様態は、メタボリックシンドロームの予防または治療のための、（ｉ）グルカゴン受容体に対する活性を有する物質、及び（ｉｉ）ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを含む組成物の薬剤製造のための使用を提供する。
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。しかし、これら実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１：グルカゴンに対してｃＡＭＰ反応を示す細胞株の生産
ヒトグルカゴン受容体遺伝子のｃＤＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． ＵＳＡ）においてＯＲＦに該当する部分を鋳型とし、ＥｃｏＲＩ切断部位とＸｈｏＩ切断部位をそれぞれ含む下記配列番号４８及び４９の正方向及び逆方向プライマーを用いたＰＣＲを行った。
この時、ＰＣＲ反応は９５℃で６０秒の変性、５５℃で６０秒のアニーリング及び６８℃で３０秒の伸長過程を３０回繰り返して行った。これから増幅されたＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、４５０ｂｐサイズのバンドを溶離して得た。
正方向プライマー（配列番号４８）：
5'－CAGCGACACCGACCGTCCCCCCGTACTTAAGGCC－3'
逆方向プライマー（配列番号４９）：
5'－CTAACCGACTCTCGGGGAAGACTGAGCTCGCC－3'
上記ＰＣＲ産物を公知となった動物細胞発現ベクターであるｘｏＧｃ／ｄｈｆｒにクローニングして組換えベクターｘ０ＧＣ／ＧＣＧＲを製造した。
上記製造した組換えベクターｘＯＧＣ／ＧＣＧＲを１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養したＣＨＯ ＤＧ４４細胞にリポフェクタミンを用いて形質転換し、１ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８及び１０ｎＭメトトレキサートを含む選択培地で選択培養した。これから制限希釈法でモノクローナル細胞株を選択し、その中からグルカゴンに対して優れた濃度依存的ｃＡＭＰ反応を示す細胞株を最終的に選択した。
実施例２：グルカゴン誘導体の合成
改善された物性を有するグルカゴン誘導体を開発するために、配列番号１の天然グルカゴンのアミノ酸配列を負電荷及び正電荷を帯びたアミノ酸残基で置換して下記表１のようなグルカゴン誘導体を合成した。これに記載された相対的ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性は、下記実施例４に記述された方法で測定した。
Figure 2022551282000004
Figure 2022551282000005
上記表１に記載された配列においてＸと表記されたアミノ酸は非天然型アミノ酸であるアミノイソ酪酸（Ａｉｂ）を、アミノ酸記号での下線は、下線を引いた当該アミノ酸対の側鎖の間でラクタム環の形成を、そして「－」は当該位置にはアミノ酸残基がないことを示す。また、環形成如何に対する列において「－」は当該配列には環が形成されていないことを示す。
実施例３：グルカゴン誘導体のｐＩ測定
上記実施例２で合成されたグルカゴン誘導体の改善された物性を確認するためにＥｘＰＡＳｙサーバでｐＩ／Ｍｗツール（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ． ｈｔｍｌ ； Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００３）を用いてアミノ酸配列からｐＩを推算した。
上記表１に示された通り、配列番号１の天然グルカゴンが６．８のｐＩを有する一方、本発明による一部のグルカゴン誘導体は約４～６の範囲のｐＩを有した。このようなグルカゴン誘導体は、天然グルカゴンに比べて低いか、または高いｐＩを有するため、中性ｐＨなどで天然型グルカゴンに比べて改善された溶解度及び高い安定性を示すことができる。
このような本発明によるグルカゴン誘導体はメタボリックシンドロームなど、目的とする疾患に対する治療剤として使用時に患者順応度を高めることができ、他の抗肥満治療剤または糖尿治療剤と併用投与に適合であり、肥満、糖尿、非アルコール脂肪肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ， ＮＡＳＨ）、脂質異常症、冠動脈性心臓病をはじめとしたメタボリックシンドローム（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）治療剤として有用に用いることができる。
実施例４：グルカゴン誘導体のｃＡＭＰ活性の測定
実施例１で生産されたヒトグルカゴン受容体を有する細胞株で実施例２で合成されたグルカゴン誘導体の活性を測定した。具体的には、上記形質転換細胞株を１週間に３回または４回継代培養した後、３８４ウェルプレートに各ウェル当たり６×１０3個の継代培養された細胞株を分注して２４時間培養した。上記培養された細胞に０．５ｍＭ ＩＢＭＸ（３－ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）、０．１％ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、５ｍｍ ＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を含むＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）緩衝液に天然型グルカゴンは２００ｎＭで、グルカゴン誘導体は１６００ｎＭでそれぞれ懸濁させた後、４倍ずつ１０回連続的に希釈し、これをｃＡＭＰアッセイキット（ＬＡＮＣＥ ｃＡＭＰ ３８４ ｋｉｔ， ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に適用して上記細胞に添加した後、蛍光値を測定した。測定後に最高の蛍光値を１００％に選定した後、これからグルカゴン誘導体のＥＣ50値を算出した後、天然型グルカゴンと相互比較した。その結果を上記表１に示した。
実施例５：グルカゴン誘導体と免疫グロブリンＦｃを含む結合体の製造（グルカゴン誘導体－免疫グロブリンＦｃ領域結合体）
代表的なグルカゴン誘導体として上記実施例２で製造したｐＩ値が６－７であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性が２００％以上であるグルカゴン誘導体を選択して結合体を製造した。具体的には、両末端にそれぞれマレイミド基及びアルデヒド基を有する１０ｋＤａのＰＥＧ、即ち、マレイミド－ＰＥＧ－アルデヒド（１０ｋＤａ、ＮＯＦ、日本）をグルカゴン誘導体のシステイン残基にペギル化させるために、グルカゴン誘導体とマレイミド－ＰＥＧ－アルデヒドのモル比を１：１～５、タンパク質の濃度を３～１０ｍｇ／ｍｌにして低温で１～３時間反応させた。この時、反応は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に２０～６０％イソプロパノールが添加された環境下で行われた。反応が終了した後、上記反応液をＳＰ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， 米国）に適用してシステインにモノ－ペギル化されたグルカゴン誘導体を精製した。
次に、上記精製されたモノ－ペギル化されたグルカゴン誘導体と免疫グロブリンＦｃ（配列番号７１のホモ二量体）をモル比が１：２～１０、タンパク質の濃度を１０～５０ｍｇ／ｍｌにして４～８℃で１２～１８時間反応させた。反応液は、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に還元剤である１０～５０ｍＭシアノ水素化ほう素ナトリウムと１０～２０％イソプロパノールが添加された環境下で行われた。反応が終了した後、上記反応液をＢｕｔｙｌ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ精製カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， 米国）とＳｏｕｒｃｅ ＩＳＯ精製カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， 米国）に適用し、グルカゴン誘導体と免疫グロブリンＦｃを含む結合体を精製した。
一方、前記免疫グロブリンＦｃは、配列番号７１のアミノ酸配列（２２１個のアミノ酸で構成される）を有するモノマー２個が各モノマーの３番アミノ酸であるシステイン間にジスルフィド結合を通じてホモ二量体を形成し、前記ホモ二量体のモノマーはそれぞれ独立して３５番及び９５番のシステイン間の内部のジスルフィド結合及び１４１番及び１９９番のシステイン間の内部のジスルフィド結合が形成されたものである。
製造後に逆相クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ及びイオン交換クロマトグラフィで分析した純度は９５％以上であった。
ここで、グルカゴン誘導体及び免疫グロブリンＦｃがＰＥＧを通じて連結された結合体を、「グルカゴン誘導体持続型結合体」、または「持続型グルカゴン誘導体」と命名し、これらは本願で混用されてもよい。
実施例６：ＧＬＰ－１及びＧＩＰに対してｃＡＭＰ反応を示す細胞株の生産
ヒトＧＬＰ－１受容体、及びヒトＧＩＰ受容体を発現できるように組換えベクターを発現ベクターＸ０ＧＣ／ｄｈｆｒを用いて作製した後、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞にリポフェクタミンを用いて形質転換し、Ｇ４１８及びメトトレキサートを含む選択培地で選択培養した。これから制限希釈法でモノクローナル細胞株を選択し、その中からＧＬＰ－１及びＧＩＰに対して優れた濃度依存的なｃＡＭＰ反応を示す細胞株を最終的に選択した。
実施例７：アシル化ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストの製造
ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体にいずれも活性を示す二重アゴニストであるｔｉｒｚｅｐａｔｉｄｅを合成し、その製造方法は公知の方法（ＷＯ２０１６－１１１９７１ Ａ１）を参照した。
実施例８：アシル化ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストのｃＡＭＰ活性の測定
実施例６で生産されたヒトＧＬＰ－１受容体及びヒトＧＩＰ受容体を発現する細胞株において実施例７で合成された二重アゴニストの活性を測定した。
具体的には、上記実施例６の形質転換細胞株を１週間に３回または４回継代培養した後、３８４ウェルプレートに各ウェル当たり６×１０3個の継代培養された細胞株を分注して２４時間培養した。前記培養された細胞に、０．５ ｍＭ ＩＢＭＸ（３－ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）， ０．１％ ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）， ５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を含むＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）緩衝液に天然型ＧＬＰ－１及びＧＩＰは２００ｎＭで、二重アゴニストは１６００ｎＭでそれぞれ懸濁させた後、４倍ずつ１０回連続的に希釈し、これをｃＡＭＰアッセイキット（ＬＡＮＣＥ ｃＡＭＰ ３８４ ｋｉｔ， ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に適用してそれぞれの前記細胞に添加した後、蛍光値を測定した。その後、それぞれの細胞株で使用した最高濃度の天然型物質の蛍光値を１００％に選定した後、これから二重アゴニストのＥＣ50値を算出し、これを天然型ＧＬＰ－１及びＧＩＰと相互比較した。その結果を下記表２に示した。
Figure 2022551282000006
実験例１：高脂肪食餌誘導された肥満マウスにおいて持続型グルカゴン誘導体と二重アゴニストの体重及び脂肪重量の減少、血中脂質数値の改善、インスリン感受性の改善及びエネルギー代謝遺伝子増加効力の比較及び併用投与による追加効力の確認
肥満動物モデルとして広く用いられている高脂肪食餌誘導肥満マウスをこの研究のために用いた。マウスの体重は投与前に約５０－５５ｇであった。研究期間の間マウスは７匹ずつ収容され、水に自由に接近するようにした。光は６ＰＭから６ＡＭまで消しておいた。
高脂肪食餌給食された試験群は、群１：持続型グルカゴン誘導体が含まれていない賦形剤の投与（５ｍｌ／ｋｇ、２日１回注射）－対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）、群２：ＧＬＰ－１類似体肥満治療剤サクセンダ（Ｓａｘｅｎｄａ（登録商標）） ５０ｎｍｏｌ／ｋｇ（１日２回注射）、群３：持続型グルカゴン誘導体２．０ｎｍｏｌ／ｋｇ（２日１回注射）、群４：二重アゴニスト（ｔｉｒｚｅｐａｔｉｄｅ）２０ｎｍｏｌ／ｋｇ（２日１回注射）、群５：二重アゴニスト２０ｎｍｏｌ／ｋｇ（２日１回注射）と持続型グルカゴン誘導体２．０ｎｍｏｌ／ｋｇ（２日１回注射）の併用投与がある。全ての投与は皮下注射で行われた。
実験は２１日目に終了し、実験が進められる間、２日単位で各群に該当するマウスの体重変化を測定し、実験が終了した後、脂肪の重量、血中脂質数値、及びＨＯＭＡ－ＩＲ、そして組織におけるエネルギー代謝関連の遺伝子発現を確認した。
体重変化を測定した結果、図１から確認できるように、持続型グルカゴン誘導体（２．０ｎｍｏｌ／ｋｇ、２日１回投与）単独投与群と持続型グルカゴン誘導体（２．０ｎｍｏｌ／ｋｇ、２日１回投与）及び二重アゴニスト（ｔｉｒｚｅｐａｔｉｄｅ）２０ｎｍｏｌ／ｋｇ（２日１回注射）の併用投与群は、それぞれ投与前比－３４．９２％、－５１．１６％で持続型グルカゴン誘導体の単独投与群より併用投与群で優れた体重減少効力を示し、その効果は対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）、ＧＬＰ－１類似体肥満治療薬サクセンダ（Ｓａｘｅｎｄａ（登録商標））、及び二重アゴニスト（ｔｉｒｚｅｐａｔｉｄｅ）の体重減少の効力である２．２２％、－１４．７３％、そして－１９．３９％より優れていた。
また、図２（Ａ）及び（Ｂ）から確認できるように、体重減少とともに脂肪重量及び血中脂質数値の顕著な減少を確認し、図３（Ａ）のようにインスリン感受性も改善されたことをＨＯＭＡ－ＩＲ測定結果を通じて確認した。さらに、図３（Ｂ）のように脂肪組織におけるエネルギー代謝関連の遺伝子の（熱エネルギー生成関連マーカーであるＵＣＰ－１とミトコンドリア生合成関連マーカーであるＰＧＣ－１α）発現増加も確認した。
実験例２：コリン欠乏及び高脂肪、高コレステロール食餌で誘導されたＮＡＳＨ及び線維症マウスにおいて持続型グルカゴン誘導体及び二重アゴニストのＮＡＳＨ及び線維症改善効果
上記実施例で製造された、本発明による製造された持続型グルカゴン誘導体とＧＬＰ－１／ＧＩＰ二重アゴニスト（ｔｉｒｚａｐｔｉｄｅ）との併用によるＮＡＳＨ及び線維化（ｆｉｂｒｏｓｉｓ）の改善効能を確認するために、ＣＤ－ＨＦＤ（コリン欠乏及び高脂肪、高コレステロール）食餌マウスモデルを使用した。
８週間のＣＤ－ＨＦＤ食餌で誘導されたマウスを賦形剤対照群、持続型グルカゴン誘導体（１．３ｎｍｏｌ／ｋｇ、Ｑ２Ｄ、皮下）投与群、二重アゴニスト（７３ｎｍｏｌ／ｋｇ、Ｑ２Ｄ、皮下）投与群、そして持続型グルカゴン誘導体と二重アゴニストの併用投与群に分け、６週間の繰り返し投与を行った。陰性対照群としては、正常食餌マウスに賦形剤を投与した群を用いた。６週間の繰り返し投与後、剖検で各マウスの肝組織を採取し、Ｈ＆Ｅ染色によるＮＡＳ（ＮＡＦＬＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）及び定量（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）ＰＣＲによるコラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）発現測定によりＮＡＳＨ及び線維化改善効果を評価した。
その結果、持続型グルカゴン誘導体もしくは二重アゴニストを６週間繰り返し投与した際、ＣＤ－ＨＦＤ食餌、賦形剤対照群比ＮＡＳが有意に減少したことを確認した。
さらに、持続型グルカゴン誘導体と二重作用体を併用投与するとき、追加的なＮＡＳ減少が有意に現れることを確認（図４）することにより、持続型グルカゴン誘導体とＧＬＰ－１／ＧＩＰ二重アゴニストのＮＡＳＨ改善効能が併用投与を通じてさらに改善され得ることを確認した。
それだけでなく、ＣＤ－ＨＦＤ食餌、賦形剤群で増加した肝組織内におけるコラーゲン発現が、持続型グルカゴン誘導体または二重アゴニストの投与により有意に減少し、このような減少も持続型グルカゴン誘導体または二重アゴニストの併用投与により、さらに改善されることを確認した（図５）。
ＮＡＳ減少及び肝組織内におけるコラーゲン発現の減少効果を通じて持続型グルカゴン誘導体とＧＬＰ－１／ＧＩＰ二重アゴニストの併用投与によりＣＤ－ＨＦＤ食餌マウスで優れたＮＡＳＨ及び肝線維化改善効能を得ることができることを確認した。
全ての統計処理は、一元ＡＮＯＶＡを用いて賦形剤群（対照群）及び試験群との間を比較し、ｔ－ｔｅｓｔを用いて単独投与比併用投与群の追加効能を比較した。（＊～＊＊＊ｐ＜０．０５～０．００１ ｖｓ． 賦形剤対照群）。
この結果は、持続型グルカゴン誘導体が他の肥満治療薬であるＧＬＰ－１類似体及び二重アゴニスト単独より優れた体重減少効力を示すことを示唆している。さらに、持続型グルカゴン誘導体をＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストと併用投与する場合、追加の体重減少を通じて強化した肥満治療効果が期待できるだけでなく、インスリン感受性を改善して血糖改善効果も期待できることを確認した。また、このような肥満及び血糖改善効果とともにＮＡＳの減少及び肝組織内におけるコラーゲン発現の減少を通じて非アルコール性脂肪肝炎またはそれに起因する肝線維症のような肝疾患においても、持続型グルカゴン誘導体とＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストと併用投与するときに優れた効果が得られることを確認した。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は上記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。

Claims (15)

  1. （ｉ）グルカゴン受容体に対する活性を有する物質及び（ｉｉ）ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストを含む、メタボリックシンドロームの予防または治療用薬学的組成物であって、
    前記グルカゴン受容体に対する活性を有する物質は、下記一般式１のアミノ酸配列を含むペプチドである、組成物：
    Ｘ１－Ｘ２－ＱＧＴＦ－Ｘ７－ＳＤ－Ｘ１０－Ｓ－Ｘ１２－Ｘ１３－Ｘ１４－Ｘ１５－Ｘ１６－Ｘ１７－Ｘ１８－Ｘ１９－Ｘ２０－Ｘ２１－Ｆ－Ｘ２３－Ｘ２４－Ｗ－Ｌ－Ｘ２７－Ｘ２８－Ｘ２９－Ｘ３０（一般式１、配列番号４６）
    上記式において、
    Ｘ１はチロシン（Ｙ）であり；
    Ｘ２はα－メチル－グルタミン酸（α－ｍｅｔｈｙｌ－ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）、Ａｉｂ（ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、Ｄ－アラニン、グリシン（Ｇ）、Ｓａｒ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）、セリン（Ｓ）またはＤ－セリンであり；
    Ｘ７はトレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）またはシステイン（Ｃ）であり；
    Ｘ１０はチロシン（Ｙ）またはシステイン（Ｃ）であり；
    Ｘ１２はリシン（Ｋ）またはシステイン（Ｃ）であり；
    Ｘ１３はチロシン（Ｙ）またはシステイン（Ｃ）であり；
    Ｘ１４はロイシン（Ｌ）またはシステイン（Ｃ）であり；
    Ｘ１５はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）またはシステイン（Ｃ）であり；
    Ｘ１６はグルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）、アルファ－メチル－グルタミン酸、またはシステイン（Ｃ）であるか、不在であり；
    Ｘ１７はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、システイン（Ｃ）、またはバリン（Ｖ）であるか、不在であり；
    Ｘ１８はアラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アルギニン（Ｒ）、バリン（Ｖ）、またはシステイン（Ｃ）であるか、不在であり；
    Ｘ１９はアラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）、またはシステイン（Ｃ）であるか、不在であり；
    Ｘ２０はリシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アルギニン（Ｒ）、アルファ－メチル－グルタミン酸、またはシステイン（Ｃ）であるか、不在であり；
    Ｘ２１はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、またはシステイン（Ｃ）であるか、不在であり；
    Ｘ２３はイソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、またはアルギニン（Ｒ）であるか、不在であり；
    Ｘ２４はバリン（Ｖ）、アルギニン（Ｒ）、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、グルタミン酸（Ｅ）、リシン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、アルファ－メチル－グルタミン酸、またはロイシン（Ｌ）であるか、不在であり；
    Ｘ２７はイソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、リシン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、グルタミン（Ｑ）、またはアルギニン（Ｒ）であるか、不在であり；
    Ｘ２８はグルタミン（Ｑ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、またはアルギニン（Ｒ）であるか、不在であり；
    Ｘ２９はトレオニン（Ｔ）であり、
    Ｘ３０はシステイン（Ｃ）であるか、不在である。
    （但し、上記一般式１のアミノ酸配列が配列番号１または配列番号１２と同一の場合は除く）。
  2. 前記ペプチドは、持続型結合体の形態であり、前記持続型結合体は下記化学式（１）で表される、請求項１に記載の組成物：
    Figure 2022551282000007
     ただし、このとき、Ｘは上記一般式１のアミノ酸配列を含むペプチドであり；
    Ｌはエチレングリコール繰り返し単位を含むリンカーであり、
    Ｆは免疫グロブリンＦｃ領域であり、
    －はＸとＬの間、ＬとＦの間の共有結合連結を表す。
  3. 上記一般式１において、
    Ｘ２がＡｉｂ（ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）であり；
    Ｘ７はトレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）またはシステイン（Ｃ）であり；
    Ｘ１０はチロシン（Ｙ）であり；
    Ｘ１２はリシン（Ｋ）であり；
    Ｘ１３はチロシン（Ｙ）であり；
    Ｘ１４はロイシン（Ｌ）またはシステイン（Ｃ）であり；
    Ｘ１５はアスパラギン酸（Ｄ）であり；
    Ｘ１６はグルタミン酸（Ｅ）またはセリン（Ｓ）であり；
    Ｘ１７はリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはシステイン（Ｃ）であり；
    Ｘ１８はアルギニン（Ｒ）であり；
    Ｘ１９はアラニン（Ａ）、またはシステイン（Ｃ）であり；
    Ｘ２０はグルタミン（Ｑ）、またはリシン（Ｋ）であり；
    Ｘ２１はアスパラギン酸（Ｄ）、またはグルタミン酸（Ｅ）であり；
    Ｘ２３はバリン（Ｖ）であり；
    Ｘ２４はグルタミン（Ｑ）であり；
    Ｘ２７はメチオニン（Ｍ）であり；
    Ｘ２８はアスパラギン（Ｎ）であり；
    Ｘ２９はトレオニン（Ｔ）であり；
    Ｘ３０はシステイン（Ｃ）である、
    請求項１または２に記載の組成物。
  4. 前記ペプチドは、配列番号７～１１、及び１３～２５、２７、２９、３１、３３、３５～４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記ペプチドは、配列番号２０、２２、２３、２７、３３、３５、３７、３８、４０、４１、４２、及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の組成物。
  6. 一般式１のＸ１０とＸ１４、Ｘ１２とＸ１６、Ｘ１６とＸ２０、Ｘ１７とＸ２１、Ｘ２０とＸ２４、及びＸ２４とＸ２８のアミノ酸対のうち、少なくとも一つのアミノ酸対においてそれぞれのアミノ酸が環を形成する、請求項１に記載の組成物。
  7. 前記ペプチドのＣ末端がアミド化した、請求項１に記載の組成物。
  8. 前記ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストは、ＧＬＰ－１（グルカゴン様ペプチド－１）受容体及びＧＩＰ（Ｇｌｕｃｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）受容体に対して活性を有するペプチドである、請求項１に記載の組成物。
  9. 前記ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体二重アゴニストは、ｔｉｒｚｅｐａｔｉｄｅ、ＮＮ９７０９、及びＳＡＲ－４３８３３５からなる群から選択される一つ以上である、請求項１に記載の組成物。
  10. 前記Ｌ中のエチレングリコール繰り返し単位部分の化学式量は１～１００ｋＤａの範囲にある、請求項２に記載の組成物。
  11. 前記メタボリックシンドロームは、耐糖能障害、高コレステロール血症、脂質異常症、肥満、糖尿、高血圧、肝疾患、脂質異常症による動脈硬化、粥状動脈硬化症、動脈硬化症、冠状動脈心疾患（冠動脈性心臓病）、及び脳卒中からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
  12. 前記肝疾患は、単純脂肪症、非アルコール性脂肪肝、肝炎症、非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ， ＮＡＳＨ）， 胆汁うっ滞性肝疾患、肝線維症、肝硬変、肝不全及び肝癌からなる群から選択される少なくとも一つの疾患である、請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記胆汁うっ滞性肝疾患は、原発性胆汁性硬変症（Ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、原発性硬化性胆管炎（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ）及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか一つである、請求項１２に記載の組成物。
  14. 前記肝疾患は、非アルコール性脂肪肝炎によるものであるか、または伴うものである、請求項１２に記載の組成物。
  15. 前記組成物は、下記特性のうちの一つ以上の特性を行う、請求項１に記載の組成物：
    （ａ）体重及び脂肪重量の減少；
    （ｂ）血中脂質数値の改善；
    （ｃ）インスリン感受性の改善；
    （ｄ）ＵＣＰ－１、及びＰＧＣ－１α遺伝子発現の減少；
    （ｅ）ＮＡＳ（ＮＡＦＬＤ ＡＣＴＩＶＩＴＹ ＳＣＯＲＥ）の減少；及び
    （ｆ）肝組織内におけるコラーゲン発現の減少。
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