CN116635050A - 对胰高血糖素、glp-1和gip受体全部具有活性的新型三重激动剂及其用途 - Google Patents

Abstract

提供了对胰高血糖素、GLP‑1和GIP受体全部具有活性的三重激动剂及其用途。

Description

对胰高血糖素、GLP-1和GIP受体全部具有活性的新型三重激 动剂及其用途

技术领域

本发明涉及对胰高血糖素、GLP-1和GIP受体全部具有活性的三重激动剂及其用途。

背景技术

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)是代表性胃肠激素和神经元激素，并且是根据食物摄入参与控制血糖水平的物质。胰高血糖素是一种由胰腺分泌的肽激素，与上述两种物质一起参与控制血糖水平。

GLP-1是当被食物摄入刺激时从小肠分泌的激素，其以血糖依赖性方式促进胰腺对胰岛素的分泌，并且抑制胰高血糖素的分泌以帮助降低血糖水平。此外，GLP-1还充当一种饱因子(satiety factor)来减缓胃中的消化并延迟所消化的食物的转运时间，从而减少食物摄入。此外，据报道，当向小鼠施用时，GLP-1具有食物摄入抑制和体重减轻的效果，并且证实了在正常和肥胖状态下均观察到这些效果，证明了其作为肥胖症治疗剂的潜力。

GIP与GLP-1一起，是受食物摄入刺激而分泌的胃肠激素之一，是由小肠K细胞分泌的42个氨基酸组成的激素。GIP的功能是以血糖依赖性方式促进胰腺分泌胰岛素并帮助降低血糖水平。已有报道其增加GLP-1活性的效果。

当血糖由于药物治疗、疾病或者激素或酶不足而开始下降时，胰腺中会产生胰高血糖素。胰高血糖素对肝脏分解糖原以诱发葡萄糖释放发出信号，并在将血糖升高至正常水平方面起作用。除了增加血糖水平的效果外，胰高血糖素据报道还通过抑制动物和人的食欲，活化脂肪细胞中的激素敏感脂肪酶以促进脂肪分解和能量消耗，从而表现出抗肥胖效果。

此外，已经进行了对GLP-1受体和胰高血糖素受体都具有活性的双重激动剂的研究，作为上述基于GLP-1的治疗物质的替代物并且用于最大化体重减轻效果。据报道，由于对胰高血糖素受体的活性，与现有GLP-1单独治疗相比，双重激动剂具有优异的体重减轻效果(Jonathan W et al.,Nat Chem Bio.,2009Oct(5)；749–757)。

此外，在最近对同时作用于GLP-1、GIP和胰高血糖素受体全部的三重激动剂(或三重激动剂)的研究中，已经努力通过修饰(如氨基酸序列的取代)来增加半衰期来提高对二肽基肽酶-IV(DPP-IV)的抗性，二肽基肽酶-IV降解胃肠激素导致其活性丧失。然而，活化这三种不同受体的效果并不高，并且未显示出具有各种活性比的三重激动剂。因此，对能够高度活化GLP-1、GIP和胰高血糖素受体的新型物质的需求在增加。

开发对GLP-1、GIP和胰高血糖素受体具有各种活性比的物质的需求也在增加。例如，有必要开发一种具有高GLP-1和GIP活性的物质，用于增强血糖控制而同时具有相对低的胰高血糖素活性，从而表现出高于体重减轻效果的血糖控制效果，或者开发一种同时具有高GLP-1、GIP和胰高血糖素活性的物质，从而表现出高体重减轻效果。

同时，近年来，随着经济的增长和生活方式的改变，饮食习惯也发生了许多变化。特别是，由于西式饮食模式，超重和肥胖症正在增加。超重和肥胖症会升高血压和胆固醇水平，从而导致诸如心脏病、糖尿病、关节炎等多种疾病的发作或加重。超重和肥胖症也是增加儿童和青少年以及成人动脉硬化、高血压、高脂血症或心脏病发病率的主要因素。

如所述，肥胖症是世界性疾病且是引起各种疾病的严重疾病。然而，肥胖症的治疗并不容易，因为肥胖症是一种涉及食欲控制和能量代谢相关作用机制的复杂疾病。因此，肥胖症的治疗不仅需要患者自身的努力，还需要治疗与食欲控制和能量代谢相关的异常作用机制的方法。因此，有必要开发能够治疗异常作用机制的药物。

例如，一直在努力开发一种对GLP-1、GIP和胰高血糖素受体具有活性的物质，作为治疗肥胖症和相关代谢综合征的治疗剂。

发明内容

【技术问题】

存在开发对GLP-1、GIP和胰高血糖素受体具有不同活化率的物质的需求。

【技术方案】

本发明的一个目的是提供对胰高血糖素受体、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)受体具有活性的肽。

本发明的另一个目的是提供包括所述肽的缀合物。

本发明的又一个目的是提供编码所述肽的多核苷酸、包括所述多核苷酸的重组表达载体和包括所述多核苷酸或所述重组表达载体的转化体。

本发明的又一个目的是提供制备所述肽的方法。

本发明的又一个目的是提供用于预防或治疗代谢综合征的药物组合物，所述药物组合物包括所述肽或所述缀合物。

本发明的又一个目的是提供所述肽或所述组合物在制备药物中的用途。

本发明的又一个目的是提供预防或治疗代谢综合征的方法，所述方法包括向个体施用所述肽、所述缀合物或包括其的组合物的步骤。

【有利效果】

根据本发明的肽对胰高血糖素受体、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)受体具有活性，并且可用作代谢综合征的治疗剂。

具体实施方式

为了实现上述目的，本发明的一个方面提供了对胰高血糖素受体、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)受体具有活性的肽。

在一个具体实施方式中，所述肽的特征在于，其是包括选自SEQ ID NO:1至12的任一个序列的肽。

在另一具体实施方式中，所述肽的特征在于，与天然人GLP-1、胰高血糖素和GIP的活性相比，其对GLP-1受体、胰高血糖素受体和GIP受体具有3％或更高的活性。

根据任一项具体实施方式的肽的特征在于，与天然人GLP-1、胰高血糖素和GIP的活性相比，其对GLP-1受体、胰高血糖素受体和GIP受体具有10％或更高的活性。

根据任一项具体实施方式的肽的特征在于，与天然人GLP-1、胰高血糖素和GIP的活性相比，其对GLP-1受体、胰高血糖素受体和GIP受体具有70％或更高的活性。

根据任一项具体实施方式的肽的特征在于，与天然人GLP-1的活性相比，其对GLP-1受体具有70％或更高的活性。

根据任一项具体实施方式的肽的特征在于，与天然人胰高血糖素的活性相比，其对胰高血糖素受体具有70％或更高的活性。

根据任一项具体实施方式的肽的特征在于，与天然人GIP的活性相比，其对GIP受体具有70％或更高的活性。

根据任一项具体实施方式的肽的特征在于，与天然胰高血糖素的活性相比，其对胰高血糖素受体具有100％或更高的活性，同时与天然GLP-1和GIP的活性相比，其对GLP-1受体和GIP受体二者均具有10％或更高的活性。

根据任一项具体实施方式的肽的特征在于，与天然GIP的活性相比，其对GIP受体具有100％或更高的活性，同时与天然GLP-1和胰高血糖素的活性相比，其对GLP-1受体和胰高血糖素受体二者均具有10％或更高的活性。

根据任一项具体实施方式的肽的特征在于，从N-末端起第12位氨基酸和第16位氨基酸，或第16位氨基酸和第20位氨基酸形成环。

根据任一项具体实施方式的肽的特征在于，其C-末端被酰胺化。

根据任一项具体实施方式的肽的特征在于，其是长效缀合物的形式，其中连接了能够增加所述肽的半衰期的物质。

本发明的另一方面提供了由下列化学式1表示的长效缀合物：

[化学式1]

X–L–F

其中X表示对胰高血糖素受体、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)受体具有活性的肽；

L表示包括乙二醇重复单元的连接体，

F表示免疫球蛋白Fc区，并且

–表示X和L之间以及L和F之间的共价键合。

在一个具体实施方式中，X的特征在于，其是包括选自SEQ ID NO:1至12的任一个序列的肽。

在另一具体实施方式中，所述肽的特征在于，其在其C-末端被酰胺化。

根据任一项具体实施方式的缀合物的特征在于，所述免疫球蛋白Fc区是衍生自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的免疫球蛋白Fc区。

根据任一项具体实施方式的缀合物的特征在于，所述免疫球蛋白Fc区是衍生自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM或其组合或其杂合体的免疫球蛋白Fc区。

根据任一项具体实施方式的药物组合物的特征在于，所述免疫球蛋白Fc区衍生自IgG Fc区。

根据任一项具体实施方式的缀合物的特征在于，所述免疫球蛋白Fc区是IgG4 Fc区。

根据任一项具体实施方式的缀合物的特征在于，所述免疫球蛋白Fc区是非糖基化的(aglycosylated)。

根据任一项具体实施方式的缀合物的特征在于，所述免疫球蛋白Fc区是衍生自人IgG4的非糖基化Fc区。

根据任一项具体实施方式的缀合物的特征在于，所述免疫球蛋白Fc区选自(a)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域；(b)CH1结构域和CH2结构域；(c)CH1结构域和CH3结构域；(d)CH2结构域和CH3结构域；和(e)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域中的一个或两个或更多个结构域与免疫球蛋白铰链区或所述铰链区的部分之间的组合。

根据任一项具体实施方式的缀合物的特征在于，所述免疫球蛋白Fc区具有两条多肽链经由二硫键连接的结构，其中它们仅经由所述两条链中的一条链的氮原子连接。

根据任一项具体实施方式的缀合物的特征在于，所述免疫球蛋白Fc区具有二聚体形式。

根据任一项具体实施方式的缀合物的特征在于，所述免疫球蛋白Fc区包括具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的单体。

根据任一项具体实施方式的缀合物的特征在于，所述免疫球蛋白Fc区是具有SEQID NO:33的氨基酸序列的单体的同型二聚体。

根据任一项具体实施方式的缀合物的特征在于，所述免疫球蛋白Fc区在其N-末端经由脯氨酸的氮原子连接。

根据任一项具体实施方式的缀合物的特征在于，所述免疫球蛋白Fc区F和X未被糖基化。

根据任一项具体实施方式的缀合物的特征在于，L是包括乙二醇重复单元的连接体。

根据任一项具体实施方式的缀合物的特征在于，所述乙二醇重复单元由[OCH₂CH₂]_n表示，其中n是自然数，n被确定使得所述肽缀合物中[OCH₂CH₂]_n的平均分子量，例如数均分子量为1kDa至100kDa。

根据任一项具体实施方式的缀合物的特征在于，n的值被确定使得所述肽缀合物中[OCH₂CH₂]_n的平均分子量，例如数均分子量为10kDa。

根据任一项具体实施方式的缀合物的特征在于，L中的乙二醇重复单元部分的式量在1kDa至100kDa的范围内。

根据任一项具体实施方式的缀合物的特征在于，L是聚乙二醇。

根据任一项具体实施方式的缀合物的特征在于，L是包括乙二醇重复单元的连接体，并且F是二聚体免疫球蛋白Fc区。

根据任一项具体实施方式的缀合物的特征在于，一个X分子经由所述包括乙二醇重复单元的连接体共价连接至所述二聚体免疫球蛋白Fc区的一条Fc区链。

根据任一项具体实施方式的缀合物的特征在于，所述包括乙二醇重复单元的连接体的一端仅与所述二聚体免疫球蛋白Fc区的两条Fc区链中的一条Fc区链连接。根据任一项具体实施方式的缀合物的特征在于，F和X经由共价键彼此连接，所述共价键是分别通过使L的一端与F的胺基或硫醇基反应和通过使L的另一端与X的胺基或硫醇基反应形成的。

本发明的又一方面提供了编码所述肽的多核苷酸、包括所述多核苷酸的重组表达载体和包括所述多核苷酸或所述重组表达载体的转化体。

本发明的又一方面提供了制备所述肽或所述缀合物的方法。

本发明的又一方面提供了包括所述肽或所述缀合物的组合物。

在一个具体实施方式中，所述组合物的特征在于，其是用于预防或治疗代谢综合征的药物组合物。

在另一具体实施方式中，所述肽的特征在于，包括选自SEQ ID NO:1至12的任一个序列。

根据任一项具体实施方式的组合物的特征在于，所述肽是长效缀合物的形式，其由下列化学式1表示：

[化学式]1

X–L–F

其中X表示所述肽；

L表示包括乙二醇重复单元的连接体，

F表示免疫球蛋白Fc区，并且

–表示X和L之间以及L和F之间的共价键合。

根据任一项具体实施方式的组合物的特征在于，所述代谢综合征是选自下列的一种或多种：葡萄糖耐量不良(impaired glucose tolerance)、高胆固醇血症、血脂异常、肥胖症、糖尿病、高血压、血脂异常诱发的动脉硬化、动脉粥样硬化、动脉硬化和冠心病。

本发明的又一方面提供了预防或治疗代谢综合征的方法，所述方法包括向有需要的个体施用所述肽、所述肽的缀合物或包括其的组合物的步骤。

本发明的又一方面提供了所述肽、所述肽的缀合物或所述组合物用于预防或治疗代谢综合征的用途。

本发明的又一方面提供了所述肽、所述肽的缀合物或所述组合物在制备用于预防或治疗代谢综合征的药物中的用途。

实施本发明的方式

在下文中，将更详细地描述本发明。

与此同时，本公开所公开的各个描述和实施方式都可适用于其它描述和实施方式。即，本公开所公开的各种要素的所有组合都落入本公开的范围内。此外，本公开的范围不受下文具体描述的限制。此外，本说明书全文中参考和引用了许多文章和专利文件。引用的文章和专利文件的公开内容通过引用以其整体并入本文，以进一步阐明本发明所涉及主题的水平和范围。

贯穿整个说明书，不仅对天然存在的氨基酸使用常见的单字母或三字母代码，而且使用通常允许用于其它氨基酸的三字母代码，如2-氨基异丁酸(Aib)、N-甲基甘氨酸(Sar)和α-甲基-谷氨酸等。此外，本文中以缩写方式提到的氨基酸按照如下IUPAC-IUB规则来描述：

如本文所用，“Aib”可与“2-氨基异丁酸”或“氨基异丁酸”互换使用，并且2-氨基异丁酸和氨基异丁酸可彼此互换使用。

本发明的一个方面提供了对胰高血糖素受体、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)受体具有活性的肽。

所述对胰高血糖素、GLP-1和GIP受体具有活性的肽可与“肽”或“三重激动剂”互换使用。

在一个具体实施方式中，所述三重激动剂可包含选自SEQ ID NO:1至12的氨基酸序列、可主要由选自SEQ ID NO:1至12的氨基酸序列组成或者可由选自SEQ ID NO:1至12的氨基酸序列组成，但不限于此。

在本说明书中，尽管被描述为“由具体序列编号组成的”肽，但只要所述肽可具有与由相应序列编号的氨基酸序列组成的肽相同或相应的活性即可，在相应序列编号的氨基酸序列的上游或下游添加无意义序列、天然发生的突变或其中的沉默突变并不排除在外，并且显而易见具有这种序列添加或突变的肽也被包括在本发明的范围内。

本发明的三重激动剂可显著活化胰高血糖素受体、GLP-1受体和GIP受体中的一种或多种、两种或更多种或者全部，但不限于此。

本发明的三重激动剂的特征在于具备下列i)至iii)中的一种或多种活性，具体是显著的活性：

i)活化GLP-1受体；ii)活化胰高血糖素受体；和iii)活化GIP受体。

这里，所述受体的活化可通过下列来示例：与其天然形式相比，对所述受体表现出0.1％或更高、1％或更高、2％或更高、3％或更高、4％或更高、5％或更高、6％或更高、7％或更高、8％或更高、9％或更高、10％或更高、20％或更高、30％或更高、40％或更高、50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高、90％或更高、100％或更高、200％或更高、300％或更高、400％或更高、500％或更高、600％或更高、700％或更高、800％或更高的体外活性，但不限于此。

对胰高血糖素、GLP-1和GIP受体具有显著活性水平的所述三重激动剂可表现出，但不特别限于：与相应受体的天然配体(天然胰高血糖素、天然GLP-1和天然GIP)相比，对胰高血糖素、GLP-1和GIP受体中的一种或多种受体，具体地两种或更多种受体，以及更具体地三种受体全部具有0.1％或更高、1％或更高、2％或更高、3％或更高、4％或更高、5％或更高、6％或更高、7％或更高、8％或更高、9％或更高、10％或更高、20％或更高、30％或更高、40％或更高、50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高、90％或更高、100％或更高、200％或更高、300％或更高、400％或更高、500％或更高、600％或更高、700％或更高或者800％或更高的体外活性。

测量所述三重激动剂的体外活性的方法可参照本说明书的实施例3进行，但不特别限于此。

在一个具体实施方式中，与天然人GLP-1、胰高血糖素和GIP相比，本发明的三重激动剂对GLP-1、胰高血糖素和GIP受体可具有3％或更高的活性，但不特别限于此。

在另一具体实施方式中，与天然人GLP-1、胰高血糖素和GIP相比，本发明的三重激动剂对GLP-1、胰高血糖素和GIP受体可具有10％或更高的活性，但不特别限于此。所述三重激动剂可通过包括SEQ ID NO:1至6和SEQ ID NO:9至11的任一个氨基酸序列的肽来示例，但不限于此。

在又一具体实施方式中，与天然人GLP-1、胰高血糖素和GIP相比，本发明的三重激动剂可对GLP-1、胰高血糖素和GIP受体具有70％或更高的活性，但不特别限于此。所述三重激动剂可通过包括SEQ ID NO:2或6的氨基酸序列的肽来示例，但不限于此。

在又一具体实施方式中，与天然人GLP-1相比，本发明的三重激动剂可对GLP-1受体具有70％或更高的活性。所述三重激动剂可通过包括SEQ ID NO:2、6、7、11和12的任一个氨基酸序列的肽来示例，但不限于此。

在又一具体实施方式中，与天然人胰高血糖素相比，本发明的三重激动剂可对胰高血糖素受体具有70％或更高的活性。所述三重激动剂可通过包括SEQ ID NO:1至3、5和6的任一个氨基酸序列的肽来示例，但不限于此。

在又一具体实施方式中，与天然人GIP相比，本发明的三重激动剂可对GIP受体具有70％或更高的活性。所述三重激动剂可通过包括SEQ ID NO:1、2、4和6的任一个氨基酸序列的肽来示例，但不限于此。

本发明的三重激动剂可对GLP-1受体、胰高血糖素受体和GIP受体中的两种或更多种受体表现出显著的活性，例如10％或更高、30％或更高、50％或更高或者70％或更高，同时对另一种受体表现出特别优异的活性，例如100％或更高、150％或更高、200％或更高、300％或更高、400％或更高或者500％或更高，但不限于此。

在一个具体实施方式中，本发明的三重激动剂，与天然GLP-1和GIP相比，可对GLP-1受体和GIP受体二者具有10％或更高的活性，同时与天然胰高血糖素相比，对胰高血糖素受体具有100％或更高的活性。本发明的三重激动剂可通过包括SEQ ID NO:1、2、3和5的任一个氨基酸序列的肽来示例，但不限于此。

在另一具体实施方式中，本发明的三重激动剂，与天然GLP-1和GIP相比，可对GLP-1受体和胰高血糖素受体二者具有10％或更高的活性，同时与天然GIP相比，对GIP受体具有100％或更高的活性。本发明的三重激动剂可通过包括SEQ ID NO:2、4和6的任一个氨基酸序列的肽来示例，但不限于此。

在又一具体实施方式中，本发明的三重激动剂可包括SEQ ID NO:35的氨基酸序列，但不特别限于此。所述三重激动剂可包括SEQ ID NO:35的氨基酸序列作为从所述肽的N-末端起第27至30位的残基，并且可通过包括SEQ ID NO:1至3、8和10的任一个氨基酸序列的肽来示例，但不限于此。

在又一具体实施方式中，本发明的三重激动剂可包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列，但不特别限于此。所述三重激动剂可包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列作为从所述肽的N-末端起第27至30位的残基，并且可通过包括SEQ ID NO:5、6和11的任一个氨基酸序列的肽来示例，但不限于此。

此外，本发明的三重激动剂可包括与SEQ ID NO:1至12的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％或者更高同源性或同一性的氨基酸序列。此外，显而易见的是，氨基酸序列在所述序列的部分中具有缺失、修饰、取代、保守取代或添加的肽也可包括在本公开的范围内，只要所述氨基酸序列具有这样的同源性或同一性并且表现出的功效相应于本发明的三重激动剂的功效即可。

例如，所述肽包括在所述氨基酸序列的N-末端或C-末端和/或其内部具有不改变本发明三重激动剂的功能的序列添加或缺失、天然存在的突变、沉默突变或保守取代的肽。

“保守取代”是指一个氨基酸用具有相似结构和/或化学性质的另一个氨基酸替换。这种氨基酸取代通常可基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性上的相似性来进行。通常，保守取代可能很少影响或可能不影响蛋白质或肽的活性。

如本文所用，术语“同源性”或“同一性”是指两个给定氨基酸序列或核苷酸序列之间的相关度，并且可表示成百分比。术语“同源性”和“同一性”通常可彼此互换使用。

保守的多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可通过标准比对算法来确定，并且可与由所使用的程序建立的默认空位罚分一起使用。基本上，同源的或同一的序列通常预期在中度或高度严格条件下与全部或部分序列杂交。显而易见的是，考虑到多核苷酸中的密码子简并性，杂交还包括与含有通用密码子或密码子的多核苷酸的杂交。

任意两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性可通过已知的计算机算法如采用默认参数的“FASTA”程序确定，如Pearson et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444中那样。可选地，其可通过下列确定：Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443–453)——其利用EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件(The European Molecular Biology Open Software Suite),Rice et al.,2000,Trends Genet.16:276–277)(5.0.0版本或更高版本)的Needleman程序执行(GCG程序包(Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research 12:387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.F.,etal.,J MOLEC BIOL 215:403(1990)；Guide toHuge Computers,Martin J.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego,1994,以及CARILLOet al.(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。例如，可利用美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的BLAST或ClustalW来确定同源性、相似性或同一性。

多核苷酸或多肽的同源性、相似性或同一性可通过利用例如GAP计算机程序，如Needleman et al.(1970),J Mol Biol.48:443，公开于Smith和Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482中，比较序列信息来确定。简而言之，GAP程序将同源性、相似性或同一性定义为相似地经比对符号(即核苷酸或氨基酸)的数量除以两个序列中较短者的符号总数所获得的值。GAP程序的默认参数可包括(1)二元比较矩阵(包含同一性值1和非同一性值0)和Gribskov et al.(1986)Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵，公开于Schwartz和Dayhoff,eds.,Atlas Of Protein Sequence And Structure,National BiomedicalResearch Foundation,pp.353–358(1979)(可选地，EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)替换矩阵)；(2)每个空位3.0的罚分和每个空位中每个符号另外0.10的罚分(或10的空位开放罚分和0.5的空位扩展罚分)；和(3)末端空位无罚分。

此外，与天然GLP-1、天然胰高血糖素和天然GIP中的任一种相比，本发明的三重激动剂可具有增加的体内半衰期，但不特别限于此。例如，本发明的三重激动剂可以是通过将用于增加半衰期的生物相容性材料(例如，免疫球蛋白Fc区)直接或经由连接体与所述三重激动剂连接而具有增加的半衰期的长效缀合物的形式，但不限于此。

所述三重激动剂可以是，但不特别限于，非天然存在的三重激动剂。

本发明的三重激动剂可包括分子内桥(例如，共价交联或非共价交联)，并且具体地可以是包括环的形式。例如，所述三重激动剂可以是在所述三重激动剂的第12位和第16位氨基酸和/或第16位和第20位氨基酸之间形成环的形式，但不特别限于此。

所述环的非限制性示例可包括内酰胺交联(或内酰胺环)。

此外，所述三重激动剂包括经修饰以包括能够在所需位点形成环，从而包括了环的氨基酸的所有三重激动剂。

例如，所述三重激动剂可以是这样的三重激动剂：其中所述三重激动剂的第12位和第16位或第16位和第20位氨基酸对可分别被能够形成环的谷氨酸或赖氨酸取代，但不限于此。

所述环可在所述三重激动剂内的氨基酸的侧链之间形成，例如，以在赖氨酸侧链和谷氨酸侧链之间形成的内酰胺环的形式，但不特别限于此。

此外，在本发明的三重激动剂中，一部分氨基酸可以，但不特别限于，被另一个氨基酸或非天然化合物取代以避免被激动剂降解酶识别，从而增加体内半衰期。

具体地，本发明的三重激动剂可以是这样的肽：体内半衰期可通过经由对所述三重激动剂的氨基酸序列中第2个氨基酸序列的取代来避免被降解酶识别而得以增加。然而，为避免被体内降解酶识别的任何氨基酸取代或修饰都被非限制地包括在内。

此外，本发明的三重激动剂的修饰可包括下列全部：利用L型或D型氨基酸和/或非天然氨基酸的修饰；和/或天然序列的修饰，例如，侧链官能团的修饰、分子内共价结合(例如，侧链之间成环)、甲基化、泛素化、磷酸化、氨基己烷化(aminohexanation)、生物素化等。

此外，所述修饰还可包括向氨基末端和/或羧基末端添加一个或多个氨基酸的所有修饰。

在氨基酸的取代或添加过程中，不仅可以使用常见于人类蛋白质中的20种氨基酸，也可以使用非典型氨基酸或非天然存在的氨基酸。非典型氨基酸的商业来源可包括Sigma-Aldrich、ChemPep Inc.和Genzyme Pharmaceuticals。包含这些氨基酸的肽以及典型肽序列可被合成以及从商业供应商(例如，American Peptide Company(美国)或Antigen(韩国))购买。

可以以相同方式获得氨基酸衍生物，并且例如，可以使用4-咪唑乙酸等。

此外，根据本发明的三重激动剂可以是变体形式，其中其N-末端和/或C-末端等被化学修饰或被有机基团保护，或氨基酸可被添加到所述肽的末端，以使其在体内免受蛋白酶影响，同时提高其稳定性。

特别地，在化学合成肽的情况下，其N-末端和C-末端是带电的，因此为了去除电荷，N-末端可被乙酰化和/或C-末端可被酰胺化，但是所述三重激动剂不特别限于此。

具体地，本发明的三重激动剂的C-末端可被酰胺化或可具有游离羧基(–COOH)，或者可以不被修饰，但不限于此。

在一个具体实施方式中，所述三重激动剂可在其C-末端被酰胺化，但不限于此。

在一个具体实施方式中，所述三重激动剂可以是非糖基化的，但不限于此。

根据本发明的三重激动剂可包括所有原样的肽、其盐(例如，肽的药学上可接受的盐)或其溶剂化物。此外，所述肽可具有任何药学上可接受的形式。

所述盐的类型没有特别限制。然而，盐可以是对个体(例如，哺乳动物)安全且有效的形式，但不特别限于此。

术语“药学上可接受的”是指在医药决策的范围内可有效用于所需目的而不引起过度毒性、刺激、过敏反应等的物质。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指衍生自药学上可接受的无机酸、有机酸或碱的盐。合适的酸的示例可包括盐酸、溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、甲苯-对-磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。衍生自合适的碱的盐的示例可包括碱金属如钠、钾等；碱土金属如镁等；以及铵等。

此外，如本文所用，术语“溶剂化物”是指根据本发明的三重激动剂或其盐与溶剂分子的复合物。

本发明的三重激动剂可通过固相合成方法合成，也可通过重组方法生产，或者可商业制备，但不限于此。

此外，本发明的三重激动剂可根据其长度通过本领域公知的方法(例如，通过自动肽合成仪)合成，并且可通过基因工程技术生产。

具体地，本发明的三重激动剂可通过标准合成方法、重组表达系统或本领域已知的任何其它方法来制备。因此，本发明的三重激动剂可通过多种方法合成，包括例如下述方法：

(a)通过固相或液相方法，逐步地或通过片段组装合成肽，之后分离和纯化最终肽产物的方法；或

(b)在宿主细胞中表达编码肽的核酸构建体并从宿主细胞培养物回收表达产物的方法；或

(c)进行编码肽的核酸构建体的体外无细胞表达并从中回收表达产物的方法；或者

通过方法(a)、(b)和(c)的任意组合获得肽片段，连接这些肽片段获得肽，然后回收所述肽的方法。

这些描述也可适用于本发明的其它具体实施方式或方面，但不限于此。

本发明的另一方面提供了对胰高血糖素受体、GLP-1受体和GIP受体具有活性的肽缀合物。

在本发明中，所述对胰高血糖素受体、GLP-1受体和GIP受体具有活性的肽缀合物的形式可以是能够增加其体内半衰期的生物相容性物质与所述对胰高血糖素受体、GLP-1受体和GIP受体具有活性的肽连接。在本发明中，所述生物相容性物质可与运载体互换使用。

在本发明中，所述肽的缀合物与未连接运载体的肽相比，可表现出功效持续时间的增加，而在本发明中，这种缀合物被称为“长效缀合物”。

同时，所述缀合物可以是非天然存在的缀合物。

在本发明的一个具体实施方式中，所述长效缀合物的形式可以是作为生物相容性材料的免疫球蛋白Fc区与所述三重激动剂连接。具体地，在所述缀合物中，所述免疫球蛋白Fc区经由连接体与所述三重激动剂共价连接，但不特别限于此。

在本发明的一个具体实施方式中，所述缀合物可以是由下列化学式1表示的缀合物：

[化学式1]

X-L-F

其中

X表示包含选自SEQ ID NO:1至12的任一个序列的肽；

L表示包括乙二醇重复单元的连接体；

F表示免疫球蛋白Fc区；并且

“-”表示共价键合。

在化学式1的长效缀合物中，X和F之间的键合可以是物理键或化学键，或非共价键或共价键，具体是共价键，但不限于此。

更具体地，X和L以及L和F可经由共价键彼此连接。在这方面，所述缀合物是这样的缀合物：X、L和F分别经由共价键、按化学式1的顺序连接。

化学式1的长效缀合物的X可以是上述对胰高血糖素受体、GLP-1受体和GIP受体具有活性的肽(三重激动剂)，具体地是包括SEQ ID NO:1至12的任一个氨基酸序列的肽，或是主要由或由SEQ ID NO:1至12的任一个氨基酸序列组成的肽，但不限于此。

在本发明中，所述“对胰高血糖素受体、GLP-1受体和GIP受体具有活性的肽”可以是构成所述缀合物的一个部分的元件，并且具体地，它可对应于化学式1中的X，并且可对应于本发明的三重激动剂。所述三重激动剂与上述相同。

本发明的长效缀合物可对GLP-1受体、胰高血糖素受体和GIP受体表现出显著的活性，即使是以所述缀合物的形式。

具体地，本发明的缀合物与其天然物相比可具有对GLP-1受体、胰高血糖素受体和/或GIP受体0.01％或更高、0.1％或更高、0.2％或更高、0.5％或更高、0.7％或更高、1％或更高、2％或更高、3％或更高、4％或更高、5％或更高、6％或更高、7％或更高、8％或更高、9％或更高、10％或更高、20％或更高、30％或更高、40％或更高、50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高、90％或更高、100％或更高的体外活性，但不限于此。

关于本发明的目的，所述三重激动剂或其缀合物与其天然物相比可具有对GLP-1受体、胰高血糖素受体和/或GIP受体0.1％或更高、0.2％或更高、0.5％或更高、0.7％或更高、1％或更高、2％或更高、3％或更高、4％或更高、5％或更高、10％或更高、20％或更高、30％或更高、40％或更高、50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高、90％或更高、100％或更高的活性，但不限于此。

化学式1的长效缀合物的形式可以是包括SEQ ID NO:1至12的任一个氨基酸序列的肽(X)与能够增加其半衰期的材料(F，例如，免疫球蛋白Fc区)经由连接体彼此连接，其中与包括SEQ ID NO:1至12的任一个氨基酸序列的、未与能够增加半衰期的材料(F，例如，免疫球蛋白Fc区)的肽(X)相比，所述缀合物可表现出增加的功效持续时间。

本发明的长效缀合物可以是在其C-末端被酰胺化的所述三重激动剂与所述免疫球蛋白Fc区经由连接体彼此连接的缀合物，但不限于此。

包括与选自SEQ ID NO:1至12的任一个序列相同的序列或包括其的序列的肽的C-末端可被酰胺化，或者可具有游离羧基(-COOH)，或者可以不被修饰，但不限于此。

在所述缀合物中，F是能够增加X，即所述对胰高血糖素受体、GLP-1受体和GIP受体具有活性的肽或三重激动剂的半衰期的材料，并且它对应于构成本发明缀合物的一个部分的元件。

F和X可经由共价键彼此连接，并且F和X可经由L通过共价化学键彼此连接。

能够增加X的半衰期的材料可以是生物相容性材料，例如FcRn结合材料，但不特别限于此。

就更具体的示例而言，所述FcRn结合材料可以是免疫球蛋白Fc区，更具体地是IgGFc区，或非糖基化IgG4 Fc区，但不特别限于此。

本发明的肽内的一个或多个氨基酸侧链可与所述生物相容性材料附连以增加其体内溶解度和/或半衰期，和/或增加其生物利用度。这些修饰可以降低治疗蛋白和肽的清除率。

上述生物相容性材料可以是可溶的(两亲的或亲水的)和/或无毒的和/或药学上可接受的。

在一个具体实施方式中，在本发明的长效缀合物中，所述三重激动剂和所述免疫球蛋白Fc区可彼此连接，但不限于此。

具体地，在化学式1的长效缀合物中，F可以是免疫球蛋白Fc区，并且更具体地，所述免疫球蛋白Fc区可衍生自IgG，但不特别限于此。

在本发明的一个具体实施方式中，F(免疫球蛋白Fc区)是由两条多肽链组成的二聚体，并且具有L的一端仅与两条多肽链中的一条多肽链连接的结构，但不限于此。

在本发明中，所述“免疫球蛋白Fc区”是指包括重链恒定区2(CH2)和/或重链恒定区3(CH3)，而不包括所述免疫球蛋白的重链和轻链可变区的区域。所述免疫球蛋白Fc区可以是构成本发明的缀合物部分的元件。具体地，所述免疫球蛋白Fc区对应于化学式1中的F。

如本文所用，所述Fc区不仅包括通过木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白获得的天然序列，还包括其衍生物，例如，天然序列中的一个或多个氨基酸残基通过缺失、插入、非保守或保守取代或其组合而被转变并因此不同于天然序列的变体等等。要求上述衍生物、取代物和变体保留FcRn结合能力。在本发明中，F可以是人免疫球蛋白区域，但不限于此。F(例如，免疫球蛋白Fc区)具有这样的结构：两条多肽链经由二硫键、仅经由这两条链中的一条链的氮原子彼此连接。经由氮原子的键合可经由对赖氨酸的ε氨基或N-末端氨基进行还原胺化来连接。

还原胺化反应是指这样的反应：其中一个反应物的胺基或氨基与另一反应物的醛(即能够还原胺化的官能团)反应产生胺，然后通过还原反应形成胺键。这是本领域公知的有机合成反应。

在本发明的三重激动剂的长效缀合物的一个具体实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区经由其N-末端的氮原子与连接体连接。

这样的免疫球蛋白Fc区可包括重链恒定区中的铰链区，但不限于此。

在本发明中，所述免疫球蛋白Fc区可在N-末端包括特定的铰链序列。

如本文所用，术语“铰链序列”是指位于重链且通过二硫键形成所述免疫球蛋白Fc区的二聚体的区域。

在本发明中，所述铰链序列可通过缺失铰链序列的具有下列氨基酸序列的部分而变为仅具有一个半胱氨酸残基，但不限于此：

Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO:13)。

所述铰链序列可通过使SEQ ID NO:13的铰链序列中第8位或第11位半胱氨酸残基缺失而仅包含一个半胱氨酸残基。本发明的铰链序列可仅包含一个半胱氨酸残基并且可由3至12个氨基酸组成，但不限于此。更具体地，本发明的铰链序列可具有下列序列：Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO:14)、Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro–Ser–Pro(SEQ ID NO:15)、Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro–Ser(SEQID NO:16)、Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro–Pro(SEQ ID NO:17)、Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro–Ser(SEQ ID NO:18)、Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys(SEQ ID NO:19)、Glu–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys(SEQ ID NO:20)、Glu–Ser–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ IDNO:21)、Glu–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO:22)、Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO:23)、Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO:24)、Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO:25)、Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO:26)、Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys(SEQ ID NO:27)、Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro(SEQID NO:28)、Glu–Ser–Lys–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO:29)、Glu–Ser–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO:30)、Glu–Pro–Ser–Cys(SEQ ID NO:31)、Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO:32)。

更具体地，所述铰链序列可包括SEQ ID NO:23(Pro–Ser–Cys–Pro)或SEQ ID NO:32(Ser–Cys–Pro)的氨基酸序列，但不限于此。

在本发明的三重激动剂的长效缀合物的更具体实施方式中，在所述缀合物中，所述免疫球蛋白Fc区的N-末端是脯氨酸。在此缀合物中，所述Fc区经由脯氨酸的氮原子与连接体连接。

在本发明的三重激动剂的长效缀合物的一个实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区可具有二聚体形式，其中由于铰链序列的存在，所述免疫球蛋白Fc区的两条链形成同型二聚体或异二聚体。本发明的化学式1的缀合物的形式可以是连接体的一端与二聚体的免疫球蛋白Fc区的一条链连接，但不限于此。

如本文所用，术语“N-末端”是指蛋白质或多肽的氨基端，并且包括氨基端的最外端，或包括从该最外端起上至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸。本发明的免疫球蛋白Fc区可在N-末端处包括铰链序列，但不限于此。

此外，本发明的免疫球蛋白Fc区可以是延伸的Fc区，其包括重链恒定区1(CH1)和/或轻链恒定区1(CL1)的部分或全部，不包括免疫球蛋白的重链和轻链可变区，只要其具有与其天然形式相比基本上等同或改善的效果即可。此外，所述免疫球蛋白Fc区可以是对应于CH2和/或CH3的相当长的氨基酸序列的一部分被去除的区域。

例如，本发明的免疫球蛋白Fc区可以是1)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域，2)CH1结构域和CH2结构域，3)CH1结构域和CH3结构域，4)CH2结构域和CH3结构域，5)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域当中的一个或者两个或更多个结构域与免疫球蛋白铰链区(或所述铰链区的部分)之间的组合，和6)重链恒定区和轻链恒定区的每个结构域之间的二聚体，但不限于此。

在本发明中，所述免疫球蛋白Fc区可以是由相同来源的结构域组成的单链免疫球蛋白组成的二聚体或多聚体，但不限于此。

此外，在一个具体实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区F是由两条多肽链组成的二聚体，其中二聚体Fc区F和X可经由一个相同的连接体L(包括乙二醇重复单元)彼此共价连接。在一个具体实施方式中，X仅经由连接体L与二聚体Fc区F的两条多肽链中的一条多肽链共价连接。在一个更具体实施方式中，仅一个X分子经由L共价连接至二聚体Fc区F的两条多肽链中连接了X的一条多肽链。在最具体的实施方式中，F是同型二聚体。

在另一个实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区F是由两条多肽链组成的二聚体，并且L的一端仅与这两条多肽链中的一条多肽链连接，但不限于此。

在本发明另一个实施方式的长效缀合物中，两分子X可以以二聚体形式对称地结合至一个Fc区。在这方面，所述免疫球蛋白Fc区和X可经由连接体(L)彼此连接，但不限于上述示例。

此外，本发明的免疫球蛋白Fc区包括天然氨基酸序列以及其序列衍生物。氨基酸序列衍生物是指天然氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基因缺失、插入、非保守或保守取代或其组合而具有不同的序列。

例如，在IgG Fc中已知对于键合重要的第214至238位、第297至299位、第318至322位或第327至331位的氨基酸残基可用作适于变异的位点。

此外，各种类型的衍生物也是可能的，例如，去除能够形成二硫键的位点的衍生物、几个N-末端氨基酸从天然Fc中去除的衍生物、甲硫氨酸残基被添加到天然Fc的N-末端的衍生物等。此外，为了去除效应物功能，可去除补体结合位点(例如，C1q结合位点)，或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)位点。用于制备所述免疫球蛋白Fc区的序列衍生物的技术被公开在国际公开号WO 97/34631、WO 96/32478等中。

蛋白质或肽中不改变分子整体活性的氨基酸交换在本领域是公知的(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常见的交换发生在氨基酸残基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly之间。在某些情况下，可通过磷酸化、硫酸化、丙烯酸化(acrylation)、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化、酰胺化等修饰氨基酸。

上述Fc衍生物可以是表现出与本发明的Fc区相同的生物活性的Fc衍生物，并且所述Fc区对热、pH等具有增加的结构稳定性。

此外，这种Fc区可从分离自人类或动物如牛、山羊、猪、小鼠、兔子、仓鼠、大鼠、豚鼠等的天然形式获得，也可以是从转化的动物细胞或微生物获得的其重组体或衍生物。在本文中，从天然形式获得的方法是从人类或动物生物体分离完整的免疫球蛋白，然后用蛋白酶处理它们的方法。当用木瓜蛋白酶处理时，天然形式被消化成Fab和Fc，而当用胃蛋白酶处理时，其被切割成pF′c和F(ab)₂。可利用尺寸排阻色谱法等分离出Fc和pF′c。在更具体实施方式中，所述Fc区可以是重组免疫球蛋白Fc区，其中人源Fc区获自微生物。

此外，所述免疫球蛋白Fc区可具有天然聚糖，或与天然形式相比增加或减少的聚糖，或是去糖基化的形式。所述免疫球蛋白Fc的聚糖的增加、减少或去除可通过本领域经常使用的任何方法如化学法、酶促法和使用微生物的基因工程法实现。在这方面，通过去除聚糖获得的免疫球蛋白Fc区显示出对补体c1q的结合亲和力显著降低和抗体依赖性细胞毒性或补体依赖性细胞毒性的降低或丧失，因此从而不会在活生物体内诱导不必要的免疫反应。在此基础上，鉴于本发明的目的，去糖基化或非糖基化的免疫球蛋白Fc区可能更适合作为药物运载体。

如本文所用，术语“去糖基化”是指使用酶从中除去聚糖的Fc区，而术语“非糖基化”是指未糖基化的且在原核生物中，更具体地是在大肠杆菌(E.coli)中产生的Fc区。

同时，所述免疫球蛋白Fc区可衍生自人类或动物，包括牛、山羊、猪、小鼠、兔子、仓鼠、大鼠、豚鼠等，而在更具体的实施方式中，其可衍生自人类。

此外，所述免疫球蛋白Fc区可以是衍生自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或其组合或杂合体的Fc区。在更具体的实施方式中，其可衍生自IgG或IgM——人类血液中最丰富的蛋白质，而在甚至更具体的实施方式中，其可衍生自IgG——已知增加配体结合蛋白的半衰期。在更具体的实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区可以是IgG4 Fc区，而在最具体的实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区是衍生自人IgG4的非糖基化Fc区，但不限于此。

此外，在一个具体实施方式中，免疫球蛋白Fc片段可以是人IgG4 Fc片段，同型二聚体形式，其中两个单体经由在半胱氨酸——各单体的第3位氨基酸——之间形成的二硫键(链间)彼此连接。在这方面，同型二聚体的各单体具有或者可以具有独立的两个内二硫键(链内)，即在第35和95位半胱氨酸之间形成的二硫键以及在第141和199位半胱氨酸之间形成的二硫键。

各单体可由221个氨基酸组成，并且构成所述同型二聚体的氨基酸数量可以是总共442个，但不限于此。具体地，所述免疫球蛋白Fc片段可以是同型二聚体的形式：其中各自具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列(由221个氨基酸组成)的两个单体经由在各单体第3位的半胱氨酸之间的二硫键彼此连接，其中同型二聚体的单体各自独立地具有形成在第35和95位半胱氨酸之间的链内二硫键以及形成在第141和199位半胱氨酸之间的链内二硫键，但不限于此。

化学式1的F可包括SEQ ID NO:33的氨基酸序列的单体，并且F可以是SEQ ID NO:33的氨基酸序列的单体的同型二聚体，但不限于此。

例如，所述免疫球蛋白Fc区可以是包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列(由442个氨基酸组成)的同型二聚体，但不限于此。

在一个具体实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区和X可以不是糖基化的，但不限于此。

同时，如本文所用，术语“组合”是指编码相同来源的单链免疫球蛋白Fc区的多肽与不同来源的单链多肽连接形成二聚体或多聚体。换句话说，二聚体或多聚体可由选自IgGFc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc和IgE的Fc区的两个或更多个片段制备。

如本文所用，术语“杂合体”意为对应于不同来源的两个或更多个免疫球蛋白Fc区的序列存在于单链免疫球蛋白恒定区中。在本发明中，各种杂合体形式都是可能的。换句话说，杂合体结构域可由选自IgG Fc、IgM Fc、IgAFc、IgE Fc和IgD Fc的CH1、CH2、CH3和CH4的一至四个结构域组成，并且可包括铰链区。

同时，IgG也可分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类，并且本发明可包括其组合或其杂合体，具体地是IgG2和IgG4亚类，并且更具体地是IgG4的Fc片段，其几乎没有效应物功能如补体依赖性细胞毒性(CDC)。

此外，上述缀合物可具有与天然多肽或未经F修饰的X相比增加的功效持续时间，并且这种缀合物不仅可以呈上述形式，而且可以呈其被包封在可生物降解纳米颗粒中的形式，但不限于此。

在化学式1中，L是非肽基连接体。

如本文所用，术语“非肽基连接体”包括缀合了两个或更多个重复单元的生物相容性聚合物。重复单元通过任何共价键而非肽键彼此连接。所述非肽基连接体可以是构成本发明缀合物部分的元件，并且对应于化学式1中的L。

适用于本发明的非肽基连接体可以非限制地使用，只要它是在体内对蛋白水解酶具有抗性的聚合物即可。在本发明中，所述非肽基连接体可与非肽基聚合物互换使用。

此外，与对应于F的多肽结合的本发明的非肽基连接体可以是一种类型的聚合物以及不同类型的聚合物的组合。

在一个具体实施方式中，所述缀合物可以是F和X经由所述非肽基连接体共价连接在一起的缀合物，在两端包括能够结合F(具体是所述免疫球蛋白Fc区)和X(具体是所述三重激动剂)的反应性基团。

具体地，在本发明中，所述非肽基连接体可在其端部包括反应性基团，以通过与构成缀合物的其它组成部分的反应形成所述缀合物。当两端具有反应性官能团的非肽基连接体经由各自的反应性基团与化学式1的X和F结合形成所述缀合物时，所述非肽基连接体或非肽基聚合物可被称为非肽基聚合物连接体部分或非肽基连接体部分。

此外，在一个具体实施方式中，所述缀合物可以是F和X经由所述非肽基连接体(L)共价连接在一起的缀合物，在两端包括能够结合F(具体是所述免疫球蛋白Fc区)和X(具体是肽药物)的反应性基团。

所述非肽基连接体可以是，但不特别限于包括乙二醇重复单元(例如，聚乙二醇)的连接体。本领域已知的其衍生物和本领域普通技术人员容易制备的衍生物也包括在本发明的范围内。

如本文所用，“聚乙二醇连接体”包括结合了两个或更多个乙二醇重复单元的生物相容性聚合物。重复单元不是通过肽键而是通过任何共价键彼此连接的。所述聚乙二醇连接体可以是构成本发明缀合物部分的元件，并且对应于化学式1中的L。

具体地，L(聚乙二醇连接体)可以是包括乙二醇重复单元(例如，聚乙二醇)的连接体，但不限于此。如本文所用，聚乙二醇是包括乙二醇同聚物、PEG共聚物或单甲基取代PEG聚合物(mPEG)全部的术语，但不特别限于此。本领域已知的其衍生物和本领域普通技术人员容易制备的衍生物也包括在本发明的范围内。

所述聚乙二醇连接体可包括乙二醇重复单元，同时在其端部包括在形成缀合物之前用于制备所述缀合物的官能团。在根据本发明的长效缀合物中，X和F可通过官能团彼此连接，但不限于此。在本发明中，所述非肽基连接体可包括两个或三个或更多个官能团，其中各个官能团彼此相同或不同，但不限于此。

具体地，所述连接体可以是由下列化学式2表示的聚乙二醇(PEG)，但不限于此：

[化学式2]

这里，n＝10至2400，n＝10至480，或n＝50至250，但不限于此。

在所述长效缀合物中，PEG部分可包括–(CH₂CH₂O)_n–结构和插在连接元件与–(CH₂CH₂O)_n–之间的氧原子，但不限于此。

在一个具体实施方式中，所述乙二醇重复单元可由例如[OCH₂CH₂]_n表示，其中n的值是自然数，并且可被确定使得所述肽缀合物中[OCH₂CH₂]_n位点的平均分子量，例如，数均分子量大于0kDa至约100kDa，但不限于此。在另一个实施方式中，n的值是自然数，并且可被确定使得所述肽缀合物中[OCH₂CH₂]_n位点的平均分子量，例如，数均分子量可为约1kDa至约100kDa、约1kDa至约80kDa、约1kDa至约50kDa、约1kDa至约30kDa、约1kDa至约25kDa、约1kDa至约20kDa、约1kDa至约15kDa、约1kDa至约13kDa、约1kDa至约11kDa、约1kDa至约10kDa、约1kDa至约8kDa、约1kDa至约5kDa、约1kDa至约3.4kDa、约3kDa至约30kDa、约3kDa至约27kDa、约3kDa至约25kDa、约3kDa至约22kDa、约3kDa至约20kDa、约3kDa至约18kDa、约3kDa至约16kDa、约3kDa至约15kDa、约3kDa至约13kDa、约3kDa至约11kDa、约3kDa至约10kDa、约3kDa至约8kDa、约3kDa至约5kDa、约3kDa至约3.4kDa、约8kDa至约30kDa、约8kDa至约27kDa、约8kDa至约25kDa、约8kDa至约22kDa、约8kDa至约20kDa、约8kDa至约18kDa、约8kDa至约16kDa、约8kDa至约15kDa、约8kDa至约13kDa、约8kDa至约11kDa、约8kDa至约10kDa、约9kDa至约15kDa、约9kDa至约14kDa、约9kDa至约13kDa、约9kDa至约12kDa、约9kDa至约11kDa、约9.5kDa至约10.5kDa或约10kDa，但不限于此。

此外，在一个具体实施方式中，所述缀合物可具有所述三重激动剂(X)和所述免疫球蛋白Fc区(F)经由包括乙二醇重复单元的连接体(L)彼此共价连接的结构，但不限于此。

此外，在一个具体实施方式中，所述长效缀合物可具有本发明的肽(X)和所述免疫球蛋白Fc区(F)经由包括乙二醇重复单元的连接体(L)彼此共价连接的结构，但不限于此。

在另一具体实施方式中，在所述长效缀合物中，L可以是包括乙二醇重复单元的连接体，并且F可以是二聚体免疫球蛋白Fc区。更具体地，一个X分子经由包括乙二醇重复单元的连接体共价连接到二聚体免疫球蛋白Fc区的一个Fc区，但不限于此。在又一个具体实施方式中，包括乙二醇重复单元的连接体的一端可以仅连接到二聚体免疫球蛋白Fc区的两条Fc区链中的一条Fc区链，但不限于此。

可用于本发明的非肽基连接体可以非限制地使用，只要它是在体内对蛋白水解酶具有抗性的聚合物即可。具体地，所述非肽基聚合物的分子量可在大于0kDa和约200kDa的范围内，具体地在约1kDa至约100kDa的范围内，更具体地在约1kDa至约50kDa的范围内，再更具体地或在约1kDa至约20kDa的范围内，再又更具体地在约3.4kDa至10kDa的范围内，以及甚至再又更具体地为3.4kDa，但不限于此。

如本文所用，术语“约”包括包含±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1等的范围的全部，并且包括在等于或近似于术语“约”之后的值的范围内的所有值，但不限于此。

具体地，在F和X不与其结合的状态下，所述非肽基连接体可在其两端具有反应性基团，并且可经由所述反应性基团与F和X结合。

在一个具体实施方式中，所述连接体的两端可结合至所述免疫球蛋白Fc区的硫醇基、氨基或羟基和所述肽(X)的硫醇基、氨基、叠氮基或羟基，但不限于此。

具体地，所述连接体可在其两端包括能够分别与所述免疫球蛋白Fc区和所述肽(X)结合的反应性基团，具体是能够与所述免疫球蛋白Fc区的半胱氨酸的硫醇基；位于N-末端、赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和/或组氨酸的氨基；和/或位于C-末端的羟基；以及所述肽(X)的半胱氨酸的硫醇基；赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和/或组氨酸的氨基；叠氮-赖氨酸(azido-lysine)的叠氮基；和/或羟基结合的反应性基团，但不限于此。

更具体地，所述连接体的反应性基团可以是选自醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物中的一种或多种，但不限于此。

在上文中，所述醛基的示例可包括丙醛基或丁醛基，但不限于此。

在上文中，所述琥珀酰亚胺衍生物的示例可包括琥珀酰亚胺戊酸酯、琥珀酰亚胺甲基丁酸酯、琥珀酰亚胺甲基丙酸酯、琥珀酰亚胺丁酸酯、琥珀酰亚胺丙酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺、羟基琥珀酰亚胺基、琥珀酰亚胺基羧基甲基或琥珀酰亚胺基碳酸酯，但不限于此。

所述连接体可经由这些反应性基团与所述免疫球蛋白Fc区F和所述肽(三重激动剂)X连接，以转化为连接体部分。

此外，经由醛键通过还原胺化产生的最终产物比经由通过酰胺键形成的键合获得的最终产物要更稳定。醛反应性基团选择性地在低pH下与N-末端反应，同时在高pH(例如，在pH 9.0)下与赖氨酸残基形成共价键。

另外，所述非肽基连接体两端的反应性基团可以彼此相同或不同，例如，醛基可被提供在两端，而马来酰亚胺基可被提供在一端并且醛基、丙醛基或丁醛基可被提供在另一端。然而，这些反应性基团并不特别限于此，只要F——具体是所述免疫球蛋白Fc区，以及X可与所述非肽基连接体的端部分别连接即可。

例如，所述非肽基连接体可在一端包括马来酰亚胺基作为反应性基团，而在另一端包括醛基、丙醛基或丁醛基作为反应性基团。

当两端均具有羟基反应性基团的聚乙二醇用作所述非肽基聚合物时，可通过已知的化学反应将羟基活化成各种反应性基团，或者通过利用具有修饰的反应性基团的商业可获得的聚乙二醇来制备本发明的长效蛋白质缀合物。

在一个具体实施方式中，所述非肽基聚合物可连接至X的半胱氨酸残基，更具体地是半胱氨酸的–SH基团，但不限于此。

例如，所述非肽基聚合物可连接至对应于X的肽中第10位半胱氨酸残基、第24位半胱氨酸残基或第40位半胱氨酸残基，但不特别限于此。具体地，所述非肽基聚合物的反应性基团可与半胱氨酸残基的–SH基团连接，并且所有上述反应性基团将均适用于所述反应性基团。

具体地，所述非肽基聚合物的反应性基团可与半胱氨酸残基的–SH基团连接，并且所有上述反应性基团将均适用于所述反应性基团。当采用马来酰亚胺–PEG–醛时，马来酰亚胺基可经由硫醚键与X的–SH基团连接，而醛基可经由还原胺化与F(具体是所述免疫球蛋白Fc)的–NH₂基团连接，但不限于此。这仅仅是一个示例。

在另一具体实施方式中，所述非肽基聚合物可连接到X的赖氨酸残基，更具体地连接到赖氨酸的氨基，但不限于此。

此外，在所述缀合物中，所述非肽基聚合物的反应性基团可连接到位于所述免疫球蛋白Fc区N-末端的–NH₂，但这仅仅是一个示例。

当采用马来酰亚胺–PEG–醛时，马来酰亚胺基可经由硫醚键与所述肽的–SH基团连接，而醛基可经由还原烷基化与所述免疫球蛋白Fc区的–NH₂基团连接，但不限于此。这仅仅是一个示例。

通过这种还原烷基化，所述免疫球蛋白Fc区的N-末端氨基通过具有–CH₂CH₂CH₂–结构的连接体官能团与位于PEG一端的氧原子连接形成一种–PEG–O–CH₂CH₂CH₂NH–免疫球蛋白Fc结构。通过硫醚键，可形成PEG一端与位于所述肽的半胱氨酸中的硫原子连接的结构。上述硫醚键可包含下列结构：

然而，本发明不特别限于上述示例，而这仅仅是一个示例。

此外，在所述缀合物中，所述连接体的反应性基团可连接至位于所述免疫球蛋白Fc区的N-末端的–NH₂，而这仅仅是一个示例。

此外，在所述缀合物中，根据本发明的肽可经由C-末端与具有反应性基团的连接体连接，而这仅仅是一个示例。

如本文所用，术语“C-末端”是指所述肽的羧基端，而就本发明的目的而言，其是指能够与所述连接体结合的位点。例如，C-末端可包括C-末端最外端的氨基酸残基和C-末端附近的氨基酸残基全部，并且具体是从最外端起第1位至第20位氨基酸残基，但C-末端不限于此。

此外，与X未经F修饰相比，上述缀合物可具有功效持续时间的增加，并且这种缀合物不仅可以呈上述形式，而且可以呈其被包封在可生物降解的纳米颗粒中的形式。

同时，关于上述三重激动剂及其长效缀合物，国际公开号WO 2017/116204和WO2017/116205的公开内容通过引用以其整体并入本文。

本发明的又一方面提供了编码所述肽(三重激动剂)或缀合物的多核苷酸、包括所述多核苷酸的重组表达载体和包括所述多核苷酸或所述重组表达载体的转化体。

所述肽和缀合物与上述相同。

此外，编码所述肽或缀合物的分离的多核苷酸可包括与本发明范围内的相应序列具有75％或更高，具体是85％或更高，更具体是90％或更高，以及再更具体是95％或更高序列同一性的多核苷酸序列。

如本文所用，术语“重组载体”是指靶肽(例如，肽)可操作地连接到适合的调控序列以使所述靶肽(例如，肽)能够在适合的宿主中表达的DNA构建体。

调控序列包括能够起始转录的启动子、用于调控这种转录的任何操纵序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及用于调控转录和翻译的终止的序列。重组载体可被转化到适合的宿主细胞中，然后可以不管宿主基因组如何而进行复制或发挥功能，或者可被整合到其基因组中。

本发明中使用的重组载体没有特别限制，只要其在宿主细胞中能复制，并且可使用本领域已知的任何载体制备即可。通常使用的载体的示例可包括天然或重组质粒、黏粒、病毒和噬菌体。适用于本发明的载体没有特别限制，并且可使用任何已知的表达载体。

为了生产本发明的肽或缀合物，使用重组载体转化宿主细胞。此外，作为本发明的一部分的经转化细胞，可以是用于增殖本发明的核酸片段和载体或用于重组生产本发明的肽或缀合物的经培养细胞或细胞系。

本文所用，“转化”是指将包括编码靶蛋白的多核苷酸的重组载体以所述多核苷酸编码的蛋白在宿主细胞中表达的方式导入所述宿主细胞。只要经转化多核苷酸可在宿主细胞中表达，它就可以被插入并位于宿主细胞的染色体中或存在于染色体外，或者它可在任何情况下存在。

此外，所述多核苷酸包括编码靶蛋白的DNA和RNA。所述多核苷酸可以以任何形式导入，只要其被导入宿主细胞中并在其中表达即可。例如，所述多核苷酸可以以表达盒的形式被导入宿主细胞中，表达盒是包括其自主表达所需的所有元件的基因构建体。通常，表达盒可包括可操作地连接到所述多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。所述表达盒可以是可自我复制的表达载体的形式。此外，所述多核苷酸按其原样可被导入宿主细胞中并且在宿主细胞中被可操作地连接到表达所需的序列，但不限于此。

如本文所用，术语“可操作地连接”是指起始和介导编码本公开的肽或缀合物的多核苷酸的转录的启动子序列与多核苷酸序列之间的功能性连接。

适用于本发明的宿主不受特别限制，只要其允许表达本发明的多核酸即可。适用于本发明的宿主的具体示例可包括：埃希氏菌(Escherichia)属的细菌，如大肠杆菌；芽孢杆菌(Bacillus)属的细菌，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；假单胞菌(Pseudomonas)属的细菌，如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；酵母，如毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；昆虫细胞，如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9)；以及动物细胞，如CHO、COS、BSC等。

本发明的又一方面提供了制备所述肽或所述缀合物的方法。

所述肽和所述缀合物与上述相同。

本发明的肽可根据其长度通过本领域公知的方法(例如，通过自动肽合成仪)合成，并且也可通过基因工程技术生产。

具体地，本发明的肽可通过标准合成方法、重组表达系统或本领域已知的任何其它方法来制备。因此，本发明的肽可通过多种方法合成，包括例如下述方法：

(a)通过固相或液相方法，逐步地或通过片段组装合成肽，之后分离和纯化最终肽产物的方法；或

(b)在宿主细胞中表达编码肽的核酸构建体并从宿主细胞培养物回收表达产物的方法；或

(c)进行编码肽的核酸构建体的体外无细胞表达并从中回收表达产物的方法；或者

通过方法(a)、(b)和(c)的任意组合获得肽片段，连接这些肽片段获得肽，然后回收所述肽的方法。

就更具体的示例而言，所期望的肽可通过基因操纵——通过制备编码包括融合配偶体和所述肽的融合蛋白的融合基因，将所述融合基因转化到宿主细胞中，以融合蛋白的形式表达所述融合基因，并使用蛋白酶或化合物从所述融合蛋白中切割和分离所述肽——来生产。为此目的，例如，可被蛋白酶如因子Xa或肠激酶，或化合物如CNBr或羟胺切割的编码氨基酸残基的DNA序列可插入在融合配偶体和编码所述肽的多核苷酸之间。

本发明的缀合物可通过同时或顺序反应将所述肽与所述连接体和所述生物相容性材料连接来制备。只要所述缀合物具有所述肽和所述生物相容性材料经由所述连接体连接的形式作为最终产物即可，键合序列、方法、反应条件等没有特别限制。

本发明的又一方面提供了包括所述肽或所述缀合物的组合物。

所述肽和所述缀合物与上述相同。

本发明的包括所述肽或所述长效缀合物的组合物可以是用于预防或治疗代谢综合征的组合物，具体是用于预防或治疗代谢综合征的药物组合物。例如，所述组合物可以是用于预防或治疗代谢综合征的药物组合物，所述药物组合物包括药学上可接受的赋形剂；和药学有效量的所述肽或所述长效缀合物，但不限于此。

如本文所用，术语“药学有效量”可指安全施用剂量，其中所述肽或其缀合物对代谢综合征表现出预防或治疗效果，但对患者不显示出毒性或副作用。具体地，所述药学有效量可指能够对GLP-1受体、胰高血糖素受体和GIP受体表现出显著活性的剂量，但不限于此。

在本发明的一个具体实施方式中，所述组合物可以是用于预防或治疗代谢综合征的药物组合物，其包括包含选自SEQ ID NO:1至12的氨基酸序列的肽或其长效缀合物，但不限于此。

所述“肽”和“缀合物”与上述相同。

如本文所用，术语“预防”是指与通过施用所述肽、缀合物或包括其的组合物来抑制或延迟代谢综合征发作相关的所有种类的行为，而术语“治疗”是指与通过施用所述肽、缀合物或包括其的组合物来改善或有利改变代谢综合征症状相关的所有种类的行为。

如本文所用，术语“施用”是指通过适当的方式将特定物质引入患者中。所述组合物可以，但不限于通过能够将所述组合物递送至体内靶组织的一般途径施用，例如，腹膜内、静脉内、肌内、皮下、皮内、口服、局部、鼻内、肺内以及直肠内施用。

如本文所用，术语“代谢综合征”是指由慢性代谢障碍引起的各种疾病单独或联合发生的症状。特别地，对应于代谢综合征的疾病可包括葡萄糖耐量不良、高胆固醇血症、血脂异常、肥胖症、糖尿病、高血压、血脂异常诱发的动脉硬化、动脉粥样硬化、动脉硬化和冠心病等，但不限于此。

如本文所用，术语“肥胖症”是指体内脂肪组织的过度积累，并且被定义为25岁以上的体重指数(体重(kg)除以身高(m)的平方)。肥胖症通常是由营养物过度摄入和能量消耗之间的长期能量失衡引起的。肥胖症是一种影响全身的代谢性疾病，并且会增加患糖尿病和高脂血症的风险，以及患性功能障碍、关节炎、心血管疾病的风险，而在某些情况下还与癌症有关。

如本文所用，术语“糖尿病”是一种代谢性疾病，如缺乏胰岛素分泌或功能异常，并且以当血液中的葡萄糖水平升高时发生的高血糖症为特征。糖尿病是指高血糖症引起各种症状及体征，并导致葡萄糖排泄到尿中的疾病。本发明的糖尿病不仅可包括1型糖尿病和2型糖尿病，还可包括肥胖型糖尿病、糖尿病并发症等。

如本文所用，术语“肥胖型糖尿病”是指具有引起糖尿病(特别是2型糖尿病)的肥胖症症状或2型糖尿病患者的肥胖症症状的糖尿病。大约80％到90％的2型糖尿病患者具有肥胖症症状，并且这些患者的特征是胰岛素抗性。适当的运动、饮食和药物疗法可预防和减轻肥胖型糖尿病。在本发明中，肥胖型糖尿病可由肥胖症引起。

如本文所用，术语“糖尿病并发症”是指当血糖水平长时间保持高水平时在体内发生的各种病理症状，并且糖尿病并发症的示例是视网膜病、肾功能障碍、神经病、血管障碍引起的中风、肾脏或心脏疾病或者糖尿病足溃疡以及心血管疾病，但不限于此。当血糖水平长时间保持高水平时，视网膜病、肾功能障碍、神经病、血管障碍引起的中风、肾脏或心脏疾病或者糖尿病足溃疡以及心血管疾病的风险会增大。因此，有效的血糖管理对预防这些并发症至关重要。

如本文所用，术语“血脂异常”是指胆固醇和甘油三酯水平超出正常范围的状态，具体地是指血液中总胆固醇、LDL胆固醇和甘油三酯升高或HDL胆固醇降低的状态。

本发明的药物组合物还可包括药学上可接受的运载体、赋形剂或稀释剂。这种药学上可接受的运载体、赋形剂或稀释剂可以是非天然存在的运载体、赋形剂或稀释剂。

如本文所用，术语“药学上可接受的”是指这样的量：足以表现出治疗效果而不引起副作用，并且可以容易地由本领域普通技术人员根据医学领域公知的因素如疾病类型、患者的年龄、体重、健康状况、性别和药物敏感性、施用途径、施用方法、施用频率、治疗持续时间以及组合或同时使用的药物来确定。

本发明的包括所述三重激动剂的药物组合物可包括药学上可接受的运载体。虽然运载体没有特别限制，但是粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂和调味剂可用于口服施用，缓冲剂、防腐剂、镇痛剂、增溶剂、等渗剂和稳定剂可组合用于可注射制剂，以及碱、赋形剂、润滑剂、防腐剂等可用于局部施用。

本发明的组合物可与上述药学上可接受的运载体组合配制成各种形式。例如，对于口服施用，所述组合物可配制成片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、晶片(wafer)等。对于可注射制剂，所述组合物可被配制成单剂安瓿或多剂形式。所述组合物还可被配制成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂等。

同时，适用于制剂的运载体、赋形剂和稀释剂的示例可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁或矿物油。此外，所述组合物还可包括填充剂、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、调味剂、防腐剂等。

此外，本发明的药物组合物可具有选自下列的任一种制剂：片剂、丸剂、粉末、颗粒、胶囊、悬浮液、内用制剂、乳液、糖浆、无菌水溶液、非水性溶剂、冻干制剂和栓剂。

此外，根据本领域常用的方法，所述组合物可被配制成适合向患者身体中施用的单位剂型，具体地可被配制成用于蛋白质药物施用的形式，并且可采用本领域常用的施用方法通过口服施用途径或肠胃外施用途径如皮内、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、肺内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、胃内、局部、舌下、阴道或直肠途径施用，但不限于此。

此外，可与各种批准作为药物的运载体如盐水溶液或有机溶剂组合来使用所述三重激动剂或其缀合物。作为所述药物，为了提高稳定性或可吸收性，可以使用碳水化合物如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖、抗氧化剂如抗坏血酸或谷胱甘肽、螯合剂、低分子量蛋白质或其它稳定剂。

本发明的药物组合物的施用剂量和频率根据作为活性成分的药物的类型以及各种相关因素来确定，这些因素诸如待治疗的疾病、施用途径、患者的年龄、性别和体重以及疾病严重程度。

本发明组合物的总有效量可以以单剂向患者施用，也可以根据分级治疗方案以多剂长时期施用。在本发明的药物组合物中，活性成分的含量可根据疾病严重程度而改变。具体地，本发明的缀合物的优选总日剂量可以是每1kg患者体重约0.0001mg至约500mg。然而，所述缀合物的有效剂量是考虑了除所述药物组合物的施用途径和治疗频率外的各种因素包括患者的年龄、体重、健康状况、性别、疾病严重程度、饮食和排泄率确定的。在这方面，本领域技术人员可容易地确定适用于本发明组合物的具体用途的有效剂量。根据本发明的药物组合物不特别限于配制和施用途径及方式，只要其显示出本发明的效果即可。

本发明的药物组合物可具有优异的体内持续时间和滴度，从而显著减少本发明药物制剂的施用次数和频率。

具体地，本发明的三重激动剂、其长效缀合物或包括其的组合物可每周施用一次、每两周施用一次、每四周施用一次或每月施用一次，但不限于此。

本发明的又一个方面提供了预防或治疗代谢综合征的方法，所述方法包括向有需要的个体施用所述肽或所述肽的缀合物或包括其的组合物的步骤。

所述肽或包括其的组合物、所述代谢综合征、所述预防和所述治疗与上述相同。

在本发明中，所述个体是指疑似患有代谢综合征的个体，而所述疑似患有代谢综合征的个体是指患有代谢综合征或处于患有代谢综合征的风险的哺乳动物如人类、大鼠、家畜等，但是可以非限制地包括可用本发明的肽、缀合物或包括其的组合物治疗的任何个体。

本发明的方法可包括施用药学有效量的包括所述肽的药物组合物。适当的总日剂量可由医师在正确的医疗决策范围内确定，并可施用一次或分成几个剂量施用。然而，就本发明的目的而言，优选的是特定患者的具体治疗有效量将取决于各种因素包括待实现的响应的类型和程度、具体组合物(包括在某些情况下是否使用了其它剂)、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、所述组合物的施用时间、施用途径和排泄率、治疗持续时间、与所述具体组合物一起或同时使用的药物以及医学领域公知的类似因素来施加。

具体地，本发明的三重激动剂、其长效缀合物或包括其的组合物可每周施用一次、每两周施用一次、每四周施用一次或每月施用一次，但不限于此。

本发明的又一方面提供了所述肽、所述肽的缀合物或包括其的组合物在预防或治疗代谢综合征中的用途。

本发明的又一方面提供了所述肽、所述肽的缀合物或包括其的组合物在制备用于代谢综合征的预防剂或治疗剂中的用途。

所述肽、所述肽的缀合物或包括其的组合物以及代谢综合征的预防和治疗与上述相同。

在下文中，将参考下列实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于说明的目的，并且本发明的范围并不旨在由这些实施例限定。

实施例1：三重激动剂的制备

制备了对GLP-1、GIP和胰高血糖素受体全部表现出活性的三重激动剂，并且其序列显示在下表1中。

[表1]

在表1描述的序列中，X表示的氨基酸代表非天然氨基酸Aib(氨基异丁酸)，而下划线和粗体氨基酸意为下划线和粗体氨基酸彼此成环。同时，使用合成仪通过固相肽合成法制备了所述肽。当使用合成仪通过固相肽合成法制备C-末端酰胺化的三重激动剂时，使用酰胺树脂进行C-末端酰胺化。

实施例2：三重激动剂的长效缀合物的制备

(1)三重激动剂的长效缀合物的制备实施例1

为了将两端分别具有马来酰亚胺基和醛基的10kDa PEG，即马来酰亚胺–PEG–醛(10kDa,NOF,日本)聚乙二醇化到实施例1的各三重激动剂的半胱氨酸残基中，使各三重激动剂和马来酰亚胺–PEG–醛以1:1至3的摩尔比，1mg/mL至5mg/mL的蛋白质浓度，在低温下反应0.5至3小时。在此情况下，反应在包括向其中添加了20％至60％异丙醇的50mM Tris缓冲液(pH 7.5)的环境中进行。反应完成后，将反应溶液施加至SP琼脂糖凝胶HP(GEHealthcare,USA)以纯化单聚乙二醇化到半胱氨酸上的各三重激动剂。

接下来，使纯化的单聚乙二醇化三重激动剂与免疫球蛋白Fc以1:1至5的摩尔比，和10mg/mL至50mg/mL的蛋白质浓度，在4℃至8℃下进行反应12至18小时。反应在向100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)中添加作为还原剂的10mM至50mM氰基硼氢化钠和10％至30％异丙醇的环境中进行。反应完成后，通过施加至丁基琼脂糖凝胶FF纯化柱(GE Healthcare,USA)和Source ISO纯化柱(GE Healthcare,USA)，将包括三重激动剂和免疫球蛋白Fc的各缀合物从反应溶液中纯化。

关于免疫球蛋白区域，各自具有SEQ ID NO:33(由221个氨基酸组成)的氨基酸序列的两个单体经由各单体第3位的半胱氨酸氨基酸之间的二硫键形成同型二聚体，其中同型二聚体的单体均独立地形成在第35和95位半胱氨酸之间的内二硫键以及在第141和199位半胱氨酸之间的内二硫键。

在制备后，通过反相色谱法、尺寸排阻色谱法和离子交换色谱法分析的纯度为95％或更高。

(2)三重激动剂的长效缀合物的制备实施例2

为了将3.4kDa或10kDa ALD(2)PEG(聚乙二醇，其中两端的氢被丙醛基修饰；NOF,日本)聚乙二醇化到实施例1的各三重激动剂的赖氨酸残基或N-末端中，使各三重激动剂和PEG以1:5–1:20的摩尔比，5mg/mL至10mg/mL的蛋白质浓度，在2℃至8℃下反应4至16小时。在这种情况下，反应在20mM HEPES(pH 7.5)和乙醇中进行，并通过加入作为还原剂的20mM氰基硼氢化钠进行。通过使用Source 15S柱(GE,US)，采用氯化钾浓度梯度和含柠檬酸钠(pH 2.0)与乙醇的缓冲液，从反应溶液中纯化单聚乙二醇化的三重激动剂。

根据与制备实施例1相同的反应条件和纯化条件制备和纯化经纯化的单聚乙二醇化的三重激动剂和免疫球蛋白Fc区的缀合物。

实施例3：三重激动剂的体外活性的测量

为了测量实施例1中制备的三重激动剂的活性，利用各自转化有GLP-1受体、胰高血糖素(GCG)受体或GIP受体的细胞系在体外测量细胞活性。

各细胞系均经转化，以在中国仓鼠卵巢(CHO)中表达人GLP-1受体、人胰高血糖素受体或人GIP受体基因，因此适合测量GLP-1、胰高血糖素或GIP的活性。因此，使用转化具有各受体的细胞系来测量对各受体的活性。

为了测量实施例1中制备的三重激动剂的GLP-1、胰高血糖素和GIP活性，将人GLP-1、胰高血糖素、GIP和实施例1中制备的三重激动剂进行从50nM到0.000048nM的4倍连续稀释。将表达人GLP-1、胰高血糖素或GIP受体的CHO细胞各自在384孔板中培养24小时。将培养基从中去除，并将各连续稀释的材料分别以5μL的量加入板中。此后，加入5μL含有cAMP抗体的缓冲液，之后在室温下温育15分钟。然后，向其中加入10μL含有细胞裂解缓冲液的检测混合物以裂解细胞，并在室温下反应90分钟。反应完成后，将细胞裂解物施加到LANCE cAMP试剂盒(PerkinElmer,USA)以通过累积的cAMP计算EC₅₀值，并将这些值相互比较。结果，其相对于人GLP-1、胰高血糖素和GIP的活性示于表2中。表2中，SEQ ID NO:1至12的三重激动剂肽(其活性已得到证实)是C-末端酰胺化的三重激动剂。

[表2]

三重激动剂的相对活性

以上制备的肽具有能够活化GLP-1受体、GIP受体和胰高血糖素受体全部的三重激动剂功能。

上述实验结果表明，本发明的三重激动剂起到能够活化胰高血糖素、GLP-1和GIP受体全部的三重激动剂的作用，表明了其作为代谢综合征治疗剂的潜力。

基于以上描述，本领域技术人员将理解，在不改变本公开的技术精神或本质特征的情况下，本公开可以以不同的具体形式实现。在这方面，应当理解上述实施方式不是限制性的，而在所有方面都是说明性的。本公开的范围由所附权利要求而非由在其之前的描述来限定，因此落入这些权利要求的边界或此类边界的等同物之内的所有变化和修改因此都意图被这些权利要求所囊括。

<110> 韩美药品株式会社

<120> 对胰高血糖素、GLP-1和GIP受体全部具有活性的新型三重激动剂及其用途

<130> OPA21385

<150> KR 10-2020-0183576

<151> 2020-12-24

<160> 36

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 三角激动剂

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa是氨基异丁酸 (Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 第16和20位的氨基酸成环

<400> 1

Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu

1 5 10 15

Gln Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Leu Asp His His Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Gln Pro Pro Pro Ser Cys

35 40

<210> 2

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 三角激动剂

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa是氨基异丁酸 (Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 第16和20位的氨基酸成环

<400> 2

Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Leu Asp His His Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Gln Pro Pro Pro Ser Cys

35 40

<210> 3

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 三角激动剂

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa是氨基异丁酸 (Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 第16和20位的氨基酸成环

<400> 3

Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu

1 5 10 15

Gln Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Leu Asp His His Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Gln Pro Pro Pro Ser Cys

35 40

<210> 4

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 三角激动剂

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa是氨基异丁酸 (Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 第16和20位的氨基酸成环

<400> 4

Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Leu Asp Glu

1 5 10 15

Gln Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Leu Ala His His Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Gln Pro Pro Pro Ser Cys

35 40

<210> 5

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 三角激动剂

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa是氨基异丁酸 (Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 第16和20位的氨基酸成环

<400> 5

Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu

1 5 10 15

Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Leu Asp Gln His Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Gln Pro Pro Pro Ser Cys

35 40

<210> 6

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 三角激动剂

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa是氨基异丁酸 (Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 第16和20位的氨基酸成环

<400> 6

Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Ala Leu Asp Glu

1 5 10 15

Lys Ala Ala Lys Asp Phe Val Gln Trp Leu Leu Asp Gln His Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Gln Pro Pro Pro Ser Cys

35 40

<210> 7

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 三角激动剂

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa是氨基异丁酸 (Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 第16和20位的氨基酸成环

<400> 7

Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Ala Leu Asp Glu

1 5 10 15

Lys Ala Ala Lys Asp Phe Val Gln Trp Leu Lys Asp Gln His Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Gln Pro Pro Pro Ser Cys

35 40

<210> 8

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 三角激动剂

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa是氨基异丁酸 (Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 第16和20位的氨基酸成环

<400> 8

Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Cys Ser Lys Tyr Leu Asp Glu

1 5 10 15

Lys Ala Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Leu Asp His His Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Gln Pro Pro Pro Ser

35

<210> 9

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 三角激动剂

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa是氨基异丁酸 (Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(16)

<223> 第16和20位的氨基酸成环

<400> 9

Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Glu Tyr Met Glu Lys

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35

<210> 10

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 三角激动剂

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa是氨基异丁酸 (Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 第16和20位的氨基酸成环

<400> 10

Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu

1 5 10 15

Arg Ala Ser Lys Asp Phe Val Gln Trp Leu Leu Asp His His Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Gln Pro Pro Pro Ser Cys

35 40

<210> 11

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 三角激动剂

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa是氨基异丁酸 (Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 第16和20位的氨基酸成环

<400> 11

Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Leu Asp Glu

1 5 10 15

Lys Ala Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Leu Asp Gln His Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Gln Pro Pro Pro Ser Cys

35 40

<210> 12

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 三角激动剂

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa是氨基异丁酸 (Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (20)

<223> Xaa是氨基异丁酸 (Aib)

<400> 12

Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Gln Leu Asp Lys

1 5 10 15

Gln Ala Ala Xaa Ala Phe Val Gln Trp Leu Ile Ala Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys

35 40

<210> 13

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人

<400> 13

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro

1 5 10

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 14

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Pro Ser Cys Pro

1 5 10

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 15

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Pro

1 5 10

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 16

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser

1 5 10

<210> 17

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 17

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

1 5 10

<210> 18

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 18

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser

1 5

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 19

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

1 5

<210> 20

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 20

Glu Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

1 5

<210> 21

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 21

Glu Ser Pro Ser Cys Pro

1 5

<210> 22

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 22

Glu Pro Ser Cys Pro

1 5

<210> 23

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 23

Pro Ser Cys Pro

1

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 24

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Ser Cys Pro

1 5 10

<210> 25

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 25

Lys Tyr Gly Pro Pro Pro Ser Cys Pro

1 5

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 26

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Ser Cys Pro

1 5

<210> 27

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 27

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

1 5

<210> 28

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 28

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro

1 5

<210> 29

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 29

Glu Ser Lys Pro Ser Cys Pro

1 5

<210> 30

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 30

Glu Ser Pro Ser Cys Pro

1 5

<210> 31

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 31

Glu Pro Ser Cys

1

<210> 32

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 32

Ser Cys Pro

1

<210> 33

<211> 221

<212> PRT

<213> 智人

<400> 33

Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

1 5 10 15

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

20 25 30

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

35 40 45

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

50 55 60

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

65 70 75 80

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

85 90 95

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

100 105 110

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

115 120 125

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

130 135 140

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

145 150 155 160

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

165 170 175

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

180 185 190

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

195 200 205

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215 220

<210> 34

<211> 442

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(442)

<223> 第1至442位的氨基酸形成人免疫球蛋白G4 Fc片段 (同型二聚体)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(221)

<223> 第1至221位的氨基酸形成一个单体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (222)..(442)

<223> 第222至442位的氨基酸形成一个单体

<220>

<221> DISULFID

<222> (3)..(224)

<223> 第3位和第224位的氨基酸形成间二硫键

<220>

<221> DISULFID

<222> (35)..(95)

<223> 第35位和第95位的氨基酸形成链内二硫键

<220>

<221> DISULFID

<222> (141)..(199)

<223> 第141位和第199位的氨基酸形成链内二硫键

<220>

<221> DISULFID

<222> (256)..(316)

<223> 第256位和第316位的氨基酸形成链内二硫键

<220>

<221> DISULFID

<222> (362)..(420)

<223> 第362位和第420位的氨基酸形成链内二硫键

<400> 34

Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

1 5 10 15

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

20 25 30

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

35 40 45

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

50 55 60

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

65 70 75 80

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

85 90 95

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

100 105 110

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

115 120 125

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

130 135 140

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

145 150 155 160

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

165 170 175

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

180 185 190

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

195 200 205

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Pro Ser Cys

210 215 220

Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

225 230 235 240

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

245 250 255

Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp

260 265 270

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

275 280 285

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

290 295 300

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

305 310 315 320

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

325 330 335

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu

340 345 350

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

355 360 365

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

370 375 380

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

385 390 395 400

Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

405 410 415

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

420 425 430

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440

<210> 35

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 三角激动剂的部分序列 (X27-X30)

<400> 35

Leu Asp His His

1

<210> 36

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 三角激动剂的部分序列 (X27-X30)

<400> 36

Leu Asp Gln His

1

Claims (23)

1.对胰高血糖素受体、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)受体具有活性的肽，所述肽包含选自SEQ ID NO:1至12的任一个序列。

2.根据权利要求1所述的肽，其中与天然人GLP-1、胰高血糖素和GIP的活性相比，所述肽对GLP-1受体、胰高血糖素受体和GIP受体具有10％或更高的活性。

3.根据权利要求1所述的肽，其中与天然人GLP-1、胰高血糖素和GIP的活性相比，所述肽对GLP-1受体、胰高血糖素受体和GIP受体具有70％或更高的活性。

4.根据权利要求1所述的肽，其中与天然人GLP-1的活性相比，所述肽对GLP-1受体具有70％或更高的活性。

5.根据权利要求1所述的肽，其中与天然人胰高血糖素的活性相比，所述肽对胰高血糖素受体具有70％或更高的活性。

6.根据权利要求1所述的肽，其中与天然人GIP的活性相比，所述肽对GIP受体具有70％或更高的活性。

7.根据权利要求1所述的肽，其中与天然胰高血糖素的活性相比，所述肽对胰高血糖素受体具有100％或更高的活性，同时与天然GLP-1和GIP的活性相比，所述肽对GLP-1受体和GIP受体二者均具有10％或更高的活性。

8.根据权利要求1所述的肽，其中与天然GIP的活性相比，所述肽对GIP受体具有100％或更高的活性，同时与天然GLP-1和胰高血糖素的活性相比，所述肽对GLP-1受体和胰高血糖素受体二者均具有10％或更高的活性。

9.根据权利要求1所述的肽，其中从N-末端起第12位氨基酸和第16位氨基酸，或第16位氨基酸和第20位氨基酸形成环。

10.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽的C-末端被酰胺化。

11.由下列化学式1表示的长效缀合物：

[化学式1]

X–L–F

其中X表示权利要求1至10中任一项所述的肽；

L表示包括乙二醇重复单元的连接体，

F表示免疫球蛋白Fc区，并且

–表示X和L之间以及L和F之间的共价键合。

12.根据权利要求11所述的长效缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是衍生自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM或其组合或其杂合体的免疫球蛋白Fc区。

13.根据权利要求11所述的长效缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是IgG4 Fc区。

14.根据权利要求11所述的长效缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是非糖基化的。

15.根据权利要求11所述的长效缀合物，其中L中的乙二醇重复单元部分的式量在1kDa至100kDa的范围内。

16.根据权利要求11所述的长效缀合物，其中L是聚乙二醇。

17.根据权利要求11所述的长效缀合物，其中F是二聚体免疫球蛋白Fc区。

18.根据权利要求17所述的长效缀合物，其中一个X分子经由包括乙二醇重复单元的连接体共价连接至所述二聚体免疫球蛋白Fc区的一个Fc区。

19.根据权利要求17所述的长效缀合物，其中所述包括乙二醇重复单元的连接体的一端仅与所述二聚体免疫球蛋白Fc区的两条Fc区链中的一条Fc区链连接。

20.用于预防或治疗代谢综合征的药物组合物，所述药物组合物包括权利要求1至10中任一项所述的肽。

21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述肽是长效缀合物的形式，其由下列化学式1表示：

[化学式1]

X–L_a–F

其中X表示权利要求1至10中任一项所述的肽；

L表示包括乙二醇重复单元的连接体，

F表示免疫球蛋白Fc区，并且

–表示X和L之间以及L和F之间的共价键合。

22.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述代谢综合征是选自下列的一种或多种：葡萄糖耐量不良、高胆固醇血症、血脂异常、肥胖症、糖尿病、高血压、血脂异常诱发的动脉硬化、动脉粥样硬化、动脉硬化和冠心病。

23.多核苷酸，其编码权利要求1至10中任一项所述的肽。