CN115803015A - 胰高血糖素衍生物的长效缀合物的液体制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种胰高血糖素衍生物的长效缀合物的液体制剂及其制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种胰高血糖素衍生物的长效缀合物的液体制剂及其制备方法。
背景技术
由于近年来的经济增长和饮食习惯的改变等，包括各种疾病比如肥胖、高脂血症、高血压、动脉粥样硬化、高胰岛素血症、糖尿病或肝病的代谢综合征相关疾病的发病率正在迅速增加。这些疾病可能独立发生，但在一般情况下，它们大多彼此密切相关，并伴有各种症状。
世界卫生组织(WHO)报告说，全世界有超过10亿成年人超重，并且其中有300多万人被临床诊断为肥胖症，并且特别是欧洲每年有25万人，全世界有超过250万人死于超重或肥胖相关的疾病。
肥胖症现在被认为是一种在全球范围内流行的严重疾病，并且是各种疾病的原因之一，但人们相信通过依靠自身的努力可以克服它。然而，肥胖症并不容易治愈，因为它是一种与食欲控制和能量代谢机制相关的复杂疾病。因此，治疗肥胖症不仅需要患者自身的努力，而且还需要一种能够治疗与食欲控制和能量代谢相关的异常机制的方法。因此，人们一直在努力开发治疗这种异常机制的药物。
作为这些努力的结果，已经开发了抗肥胖药物，比如
等，但它们具有严重不良反应或抗肥胖效果非常弱的缺点。因此，人们进行了许多广泛的研究来开发新型的肥胖症治疗药物，其可用于解决传统抗肥胖症药物的问题。最近，胰高血糖素衍生物受到了广泛关注。
胰高血糖素是当血糖水平因其他药物或疾病，或激素或酶的缺乏而下降时由胰腺产生的。胰高血糖素刺激肝脏中的糖原分解，并促进葡萄糖释放，使血糖水平提高到正常范围。此外，胰高血糖素已被证明对治疗低血糖症有效。胰高血糖素的降血糖治疗作用是刺激糖原降解为葡萄糖(糖原分解)或增加源自氨基酸前体的葡萄糖生产(葡萄糖生物合成)的结果，导致从肝脏流出的葡萄糖增加。
除了提高血糖水平的作用外，胰高血糖素还能抑制食欲，并激活脂肪细胞的激素敏感脂肪酶，以促进脂肪分解，从而显示出抗肥胖的作用。然而，由于胰高血糖素的低溶解度和在中性pH值下沉淀的特性，其作为治疗剂的使用受到限制。
因此，由于肝脏中的脂肪分解和β-氧化增加，仅具有改进性质的胰高血糖素可以有效地用于治疗严重的低血糖症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、血脂异常等。
治疗低血糖症的药物包括二氮嗪、奥曲肽、胰高血糖素等。其中，胰高血糖素由于溶解度低并且在中性pH值下是沉淀物(这是不方便的，因为在使用前需要溶解在溶剂中)而当前被用作冻干制剂。此外，当胰高血糖素被用作用于治疗先天性高胰岛素症的治疗剂时，由于其半衰期短而需要长期治疗，由于频繁施用而使胰高血糖素的使用受到限制。
在此背景下，本发明人开发了对胰高血糖素的氨基酸序列进行部分修饰的胰高血糖素衍生物，用于通过改善胰高血糖素的物理特性来提高胰高血糖素对低血糖和肥胖症的治疗效果(国际公布号：WO2016/108586和WO2017/003191)。通过体外活性测定，证实所开发的胰高血糖素衍生物能够激活胰高血糖素受体。此外，还开发了增加体内半衰期的胰高血糖素衍生物的长效缀合物，并证实由于改变了pI(与天然胰高血糖素的pI不同)，该长效缀合物可以在中性pH下表现出提高的溶解度和高稳定性(国际公开号：WO2017/003191)。
发明内容
技术问题
需要开发一种稳定的液体制剂，其能够长期储存胰高血糖素衍生物的长效缀合物而不担心病毒污染。
技术方案
本发明的一个目的是提供一种胰高血糖素衍生物的长效缀合物的液体制剂。
本发明的另一个目的是提供一种用于制备液体制剂的方法。
有益效果
根据本发明的液体制剂具有在简单制剂中为具有大分子量的本发明的缀合物提供储存稳定性的经济优势。
附图说明
图1a和1b显示了根据缓冲剂的类型证实胰高血糖素衍生物的长效缀合物的稳定性的结果。具体来说，将实施例2的表3中所示的组合物(表3中的组合物#1、#3和#5)分别用作胰高血糖素衍生物的长效缀合物的液体制剂，并在25℃下储存7周，并且测量稳定性作为结果。在结果中，作为缓冲剂的乙酸钠和组氨酸制剂在25℃下7周的稳定性最高。
具体实施方式
实施本发明的一个方面提供了胰高血糖素衍生物的长效缀合物的液体制剂。长效缀合物指其中对胰高血糖素衍生物具有活性的肽与免疫球蛋白Fc片段通过接头共价键合的物质。
在一个实施方式中，本发明涉及胰高血糖素衍生物肽的长效缀合物的液体制剂，其中液体制剂包括：药理学有效量的胰高血糖素衍生物肽的长效缀合物，其中胰高血糖素衍生物肽和免疫球蛋白Fc片段彼此连接；和不含白蛋白的稳定剂，其包括i)缓冲剂，和ii)糖醇、糖或其组合。长效缀合物可以指其中胰高血糖素衍生物肽与免疫球蛋白Fc片段共价键合的物质。
在一个实施方式中，液体制剂是包括下述化学式1的长效缀合物；缓冲剂；和糖醇、糖或其组合的液体制剂：
[化学式1]
X–La–F
在上述化学式1中，
X为胰高血糖素衍生物肽；
L为接头；
a是0或自然数，条件是当a是2或更大时，每个L是彼此独立的；
F是免疫球蛋白Fc片段；和
–表示共价键：
[通式1]
Y–X2–QGTF–X7–SD–X10–S–X12–X13–X14–X15–X16–X17–X18–X19–X20–X21–F–X23–X24–W–L–X27–X28–T–X30(通式1，SEQ ID NO：46)
在上述通式1中，
X2是α-甲基-谷氨酸、氨基异丁酸(Aib)、D-丙氨酸、甘氨酸、Sar(N-甲基甘氨酸)、丝氨酸或D-丝氨酸；
X7是苏氨酸(T)、缬氨酸(V)或半胱氨酸(C)；
X10是酪氨酸(Y)或半胱氨酸(C)；
X12是赖氨酸(K)或半胱氨酸(C)；
X13是酪氨酸(Y)或半胱氨酸(C)；
X14是亮氨酸(L)或半胱氨酸(C)；
X15是天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)或半胱氨酸(C)；
X16是谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、丝氨酸(S)、α-甲基-谷氨酸或半胱氨酸(C)或不存在；
X17是天冬氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、半胱氨酸(C)或缬氨酸(V)或不存在；
X18是丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、精氨酸(R)、缬氨酸(V)或半胱氨酸(C)或不存在；
X19是丙氨酸(A)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、缬氨酸(V)或半胱氨酸(C)或不存在；
X20是赖氨酸(K)、组氨酸(H)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、天冬氨酸(D)、精氨酸(R)、α-甲基-谷氨酸或半胱氨酸(C)或不存在；
X21是天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)，亮氨酸(L)、缬氨酸(V)或半胱氨酸(C)或不存在；
X23是异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)或精氨酸(R)或不存在；
X24是缬氨酸(V)、精氨酸(R)、丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、谷氨酰胺(Q)、α-甲基-谷氨酸或亮氨酸(L)或不存在；
X27是异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、赖氨酸(K)，甲硫氨酸(M)、谷氨酰胺(Q)或精氨酸(R)或不存在；
X28是谷氨酰胺(Q)、赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)或精氨酸(R)或不存在；
X30是半胱氨酸(C)或不存在(条件是当通式1的氨基酸序列与SEQ ID NO：1和SEQIDNO：12相同时，不包括在内)。
Aib是指氨基异丁酸。在本说明书中，“Aib”可以与“2-氨基异丁酸”或“氨基异丁酸”互换使用。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，胰高血糖素衍生物肽的长效缀合物中的胰高血糖素衍生物肽的特征在于其包括下述通式2的氨基酸序列：
Y–Aib–QGTF–X7–SD–X10–S–X12–Y–L–X15–X16–X17–R–A–X20–X21–F–V–X24–W–L–M–N–T–X30(通式2，SEQ ID NO：47)
在上述通式2中，
X7是苏氨酸(T)、缬氨酸(V)或半胱氨酸(C)；
X10是酪氨酸(Y)或半胱氨酸(C)；
X12是赖氨酸(K)或半胱氨酸(C)；
X15是天冬氨酸(D)或半胱氨酸(C)；
X16是谷氨酸(E)或丝氨酸(S)；
X17是赖氨酸(K)或精氨酸(R)；
X20是谷氨酰胺(Q)或赖氨酸(K)；
X21是天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)；
X24是缬氨酸(V)或谷氨酰胺(Q)；
X30是半胱氨酸(C)或不存在(条件是当通式2的氨基酸序列与SEQ ID NO：1和SEQID NO：12相同时，不包括在内)。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的特征在于其是长效缀合物的液体制剂，其包括：18nmol/mL至936nmol/mL的化学式1的长效缀合物；用于将液体制剂的pH维持在4.8至6.5的范围内的量的缓冲剂；和1.0％(w/v)至20％(w/v)的糖醇、糖或其组合。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的特征在于其进一步包括选自糖、糖醇、非离子表面活性剂和氨基酸的一种或多种组分。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的特征在于其是进一步包括糖或糖醇、氨基酸或二者的胰高血糖素衍生物肽的长效缀合物的液体制剂。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的特征在于其包括缓冲剂、糖或糖醇和氨基酸。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的特征在于其包括缓冲剂、糖或糖醇、非离子表面活性剂、氨基酸。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的特征在于其进一步包括非离子表面活性剂、氨基酸或二者。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的特征在于其包括i)糖或糖醇，ii)非离子表面活性剂，或其组合。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，胰高血糖素衍生物肽的特征在于其包括选自SEQ ID NO：2至11和13至45的氨基酸序列。
肽可以包括选自SEQ ID NO：2至11和13至45的氨基酸序列，并且可以(基本上)由SEQ ID NO：2至11和13至45的氨基酸序列组成，但不限于此。
这种肽的实例包括，但不特别限于，包括选自SEQ ID NO：13，15和36至44的氨基酸序列或(基本上)由选自SEQ ID NO：13，15和36至44的氨基酸序列组成的肽。作为另一个实例，肽可以是包括选自SEQ ID NO：37的氨基酸序列或(基本上)由其组成的肽，但不特别限于此。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，L的特征在于其是聚乙二醇。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，L中乙二醇重复单元部分的分子量在1kDa至100kDa的范围内。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，上述化学式1的结构的特征在于其由下述化学式2的结构表示：
[化学式2]
其中，X和F如化学式1中所定义。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，乙二醇重复单元具有式[OCH2CH2]n，其中n为自然数，并且肽中[OCH2CH2]n区的平均分子量，例如数均分子量被确定为1kDa至100kDa。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，n值的特征在于其被确定为使肽缀合物中[OCH2CH2]n区的平均分子量，例如数均分子量为10kDa。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，X的特征在于其在C-末端被酰胺化。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，X的特征在于其经由肽中半胱氨酸的硫原子被连接。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，免疫球蛋白Fc片段的特征在于其源自IgG4。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，F的特征在于其是其中两条多肽链通过二硫键连接并且仅通过两条链中的一条中的氮原子连接的结构。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，F的特征在于其包括SEQ ID NO：51的氨基酸序列的单体。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，F的特征在于其为SEQ ID NO：51的氨基酸序列的单体的同源二聚体。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，F的特征在于其通过在其N-末端的脯氨酸的氮原子连接。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，免疫球蛋白Fc片段和X的特征在于其是非糖基化的。
在根据前述实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的特征在于其不进一步包括选自非离子表面活性剂和氨基酸的一种或多种组分。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，缓冲剂的特征在于其选自柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐以及其组合。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，缓冲剂的特征在于其是乙酸及其盐。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的pH的特征在于其是4.8至6.5。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的pH的特征在于其是4.8至6.0。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的pH的特征在于其是4.8至5.5。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，缓冲剂的浓度的特征在于其是5mM至100mM，用于将液体制剂的pH维持在4.8至6.5的范围内。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，糖或糖醇的特征在于其是选自蔗糖、甘露糖醇和山梨糖醇中的一种或多种。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，糖或糖醇的特征在于其以1％(w/v)至20％(w/v)的浓度存在于液体制剂中。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，长效缀合物的特征在于其以18nmol/mL至2,807nmol/mL、18nmol/mL至936nmol/mL、90nmol/mL至562nmol/mL、187nmol/mL至562nmol/mL、187nmol/mL至2,807nmol/mL或93nmol/mL至936nmol/mL的浓度存在于液体制剂中。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，糖的特征在于其为葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖或其组合。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，糖的特征在于其为蔗糖。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，糖的特征在于其以3％(w/v)至15％(w/v)的浓度存在。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，糖醇的特征在于其为选自甘露糖醇和山梨糖醇中的一种或多种。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的特征在于其进一步包括选自非离子表面活性剂和氨基酸的一种或多种组分。
在根据前述实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的特征在于其不包括等渗剂。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，非离子表面活性剂的特征在于其为泊洛沙姆、聚山梨醇酯或其组合。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，非离子表面活性剂的特征在于其选自泊洛沙姆188、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80，以及其组合。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，非离子表面活性剂的特征在于其以0.001％(w/v)至0.5％(w/v)的浓度存在于液体制剂中。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，氨基酸的特征在于其选自甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、赖氨酸以及其组合。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，氨基酸的特征在于其以0.01mg/mL至1mg/mL的浓度存在于液体制剂中。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的特征在于其包括：90nmol/mL至562nmol/mL的化学式1的肽缀合物；5mM至25mM的选自柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐以及其组合的缓冲剂，使得液体制剂的pH为4.8至6.5；1％(w/v)至20％(w/v)的糖醇、糖或其组合；0.01％(w/v)至0.1％(w/v)的选自泊洛沙姆、聚山梨醇酯或其组合的非离子表面活性剂；和0.01mg/mL至1mg/mL的选自甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、赖氨酸以及其组合的稳定剂。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的特征在于其包括：90nmol/mL至562nmol/mL的化学式1的肽缀合物；5mM至25mM的选自柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐以及其组合的缓冲剂，使得液体制剂的pH为4.8至6.5；4％(w/v)至10％(w/v)的糖醇、糖或其组合；0.01％(w/v)至0.1％(w/v)的选自泊洛沙姆、聚山梨醇酯或其组合的非离子表面活性剂；和0.01mg/mL至1mg/mL的选自甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、赖氨酸以及其组合的稳定剂。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的特征在于其包括：90nmol/mL至562nmol/mL的化学式1的肽缀合物；5mM至25mM的选自柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐以及其组合的缓冲剂，使得液体制剂的pH为4.8至6.0；4％(w/v)至10％(w/v)的糖醇、糖或其组合；0.01％(w/v)至0.1％(w/v)的选自泊洛沙姆、聚山梨醇酯或其组合的非离子表面活性剂；和0.01mg/mL至1mg/mL的选自甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、赖氨酸以及其组合的稳定剂。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的特征在于其包括：90nmol/mL至562nmol/mL的化学式1的肽缀合物；5mM至25mM的选自柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐以及其组合的缓冲剂，使得液体制剂的pH为4.8至5.5；4％(w/v)至10％(w/v)的糖醇、糖或其组合；0.01％(w/v)至0.1％(w/v)的选自泊洛沙姆、聚山梨醇酯或其组合的非离子表面活性剂；和0.01mg/mL至1mg/mL的选自甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、赖氨酸以及其组合的稳定剂。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的特征在于其包括pH在4.8至6.5的范围内的缓冲剂；选自蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇以及其组合的糖或糖醇；选自甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、赖氨酸以及其组合的氨基酸；和作为非离子表面活性剂的聚山梨醇酯。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，胰高血糖素衍生物肽的长效缀合物中的胰高血糖素衍生物肽的特征在于其包括下述通式1的氨基酸序列：
Y–X2–QGTF–X7–SD–X10–S–X12–X13–X14–X15–X16–X17–X18–X19–X20–X21–F–X23–X24–W–L–X27–X28–T–X30(通式1，SEQ ID NO：46)
在上述通式1中，
X2是α-甲基-谷氨酸、氨基异丁酸(Aib)、D-丙氨酸、甘氨酸、Sar(N-甲基甘氨酸)、丝氨酸或D-丝氨酸；
X7是苏氨酸(T)、缬氨酸(V)或半胱氨酸(C)；
X10是酪氨酸(Y)或半胱氨酸(C)；
X12是赖氨酸(K)或半胱氨酸(C)；
X13是酪氨酸(Y)或半胱氨酸(C)；
X14是亮氨酸(L)或半胱氨酸(C)；
X15是天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)或半胱氨酸(C)；
X16是谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、丝氨酸(S)、α-甲基-谷氨酸或半胱氨酸(C)或不存在；
X17是天冬氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、半胱氨酸(C)或缬氨酸(V)或不存在；
X18是丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、精氨酸(R)、缬氨酸(V)或半胱氨酸(C)或不存在；
X19是丙氨酸(A)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、缬氨酸(V)或半胱氨酸(C)或不存在；
X20是赖氨酸(K)、组氨酸(H)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、天冬氨酸(D)、精氨酸(R)、α-甲基-谷氨酸或半胱氨酸(C)或不存在；
X21是天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)，亮氨酸(L)、缬氨酸(V)或半胱氨酸(C)或不存在；
X23是异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)或精氨酸(R)或不存在；
X24是缬氨酸(V)、精氨酸(R)、丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、谷氨酰胺(Q)、α-甲基-谷氨酸或亮氨酸(L)或不存在；
X27是异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、赖氨酸(K)，甲硫氨酸(M)、谷氨酰胺(Q)或精氨酸(R)或不存在；
X28是谷氨酰胺(Q)、赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)或精氨酸(R)或不存在；
X30是半胱氨酸(C)或不存在(条件是当通式1的氨基酸序列与SEQ ID NO：1和SEQID NO：12相同时，不包括在内)。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，在上述通式1中，
X2是丝氨酸(S)或氨基异丁酸(Aib)；
X7是苏氨酸(T)、缬氨酸(V)或半胱氨酸(C)；
X10是酪氨酸(Y)或半胱氨酸(C)；
X12是赖氨酸(K)或半胱氨酸(C)；
X13是酪氨酸(Y)或半胱氨酸(C)；
X14是亮氨酸(L)或半胱氨酸(C)；
X15是天冬氨酸(D)或半胱氨酸(C)；
X16是谷氨酸(E)、丝氨酸(S)或半胱氨酸(C)；
X17是天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、半胱氨酸(C)或缬氨酸(V)；
X18是天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、精氨酸(R)或半胱氨酸(C)；
X19是丙氨酸(A)或半胱氨酸(C)；
X20是谷氨酰胺(Q)、天冬氨酸(D)、赖氨酸(K)或半胱氨酸(C)；
X21是天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)，亮氨酸(L)、缬氨酸(V)或半胱氨酸(C)；
X23是异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)或精氨酸(R)；
X24是缬氨酸(V)、精氨酸(R)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、谷氨酰胺(Q)或亮氨酸(L)；
X27是异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、甲硫氨酸(M)、谷氨酰胺(Q)或精氨酸(R)；
X28是谷氨酰胺(Q)、赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)或精氨酸(R)；
X30是半胱氨酸(C)或不存在(条件是当通式1的氨基酸序列与SEQ ID NO：1和SEQID NO：12相同时，不包括在内)。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，在上述通式1中，
X2是丝氨酸(S)或氨基异丁酸(Aib)；
X7是胱氨酸(C)、苏氨酸(T)或缬氨酸(V)；
X10是酪氨酸(Y)或半胱氨酸(C)；
X12是赖氨酸(K)或半胱氨酸(C)；
X13是酪氨酸(Y)或半胱氨酸(C)；
X14是亮氨酸(L)或半胱氨酸(C)；
X15是天冬氨酸(D)或半胱氨酸(C)；
X16是谷氨酸(E)、丝氨酸(S)或半胱氨酸(C)；
X17是谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、半胱氨酸(C)或缬氨酸(V)；
X18是精氨酸(R)或半胱氨酸(C)；
X19是丙氨酸(A)或半胱氨酸(C)；
X20是谷氨酰胺(Q)或赖氨酸(K)；
X21是天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、缬氨酸(V)或半胱氨酸(C)；
X23是缬氨酸(V)；
X24是缬氨酸(V)或谷氨酰胺(Q)；
X27是甲硫氨酸(M)；
X28是天冬酰胺(N)或精氨酸(R)；
X30是半胱氨酸(C)或不存在(条件是当通式1的氨基酸序列与SEQ ID NO：1和SEQID NO：12相同时，不包括在内)。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，在上述通式1中，
X2是氨基异丁酸(Aib)；
X7是胱氨酸(C)、苏氨酸(T)或缬氨酸(V)；
X10是酪氨酸(Y)或半胱氨酸(C)；
X12是赖氨酸(K)；
X13是酪氨酸(Y)或半胱氨酸(C)；
X14是亮氨酸(L)或半胱氨酸(C)；
X15是天冬氨酸(D)或半胱氨酸(C)；
X16是谷氨酸(E)、丝氨酸(S)或半胱氨酸(C)；
X17是赖氨酸(K)、精氨酸(R)、半胱氨酸(C)或缬氨酸(V)；
X18是精氨酸(R)或半胱氨酸(C)；
X19是丙氨酸(A)或半胱氨酸(C)；
X20是谷氨酰胺(Q)或赖氨酸(K)；
X21是天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)或半胱氨酸(C)；
X23是缬氨酸(V)；
X24是谷氨酰胺(Q)；
X27是甲硫氨酸(M)；
X28是天冬酰胺(N)或精氨酸(R)；
X30是半胱氨酸(C)或不存在(条件是当通式1的氨基酸序列与SEQ ID NO：1和SEQID NO：12相同时，不包括在内)。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，在上述通式1中，
X2是丝氨酸(S)或氨基异丁酸(Aib)；
X7是胱氨酸(C)、苏氨酸(T)或缬氨酸(V)；
X10是酪氨酸(Y)或半胱氨酸(C)；
X12是赖氨酸(K)或半胱氨酸(C)；
X13是酪氨酸(Y)或半胱氨酸(C)；
X14是亮氨酸(L)或半胱氨酸(C)；
X15是天冬氨酸(D)或半胱氨酸(C)；
X16是谷氨酸(E)、丝氨酸(S)或半胱氨酸(C)；
X17是天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、半胱氨酸(C)或缬氨酸(V)；
X18是天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、精氨酸(R)或半胱氨酸(C)；
X19是丙氨酸(A)或半胱氨酸(C)；
X20是谷氨酰胺(Q)、天冬氨酸(D)或赖氨酸(K)；
X21是天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)；
X23是缬氨酸(V)；
X24是缬氨酸(V)或谷氨酰胺(Q)；
X27是异亮氨酸(I)或甲硫氨酸(M)；
X28是天冬酰胺(N)或精氨酸(R)；
X30是半胱氨酸(C)或不存在(条件是当通式1的氨基酸序列与SEQ ID NO：1和SEQID NO：12相同时，不包括在内)。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，在上述通式1中，
X2是氨基异丁酸(Aib)；
X7是苏氨酸(T)；
X10是酪氨酸(Y)；
X12是赖氨酸(K)；
X13是酪氨酸(Y)；
X14是亮氨酸(L)；
X15是天冬氨酸(D)或半胱氨酸(C)；
X16是谷氨酸(E)、丝氨酸(S)或半胱氨酸(C)；
X17是赖氨酸(K)或精氨酸(R)；
X18是精氨酸(R)；
X19是丙氨酸(A)；
X20是谷氨酰胺(Q)、胱氨酸(C)或赖氨酸(K)；
X21是天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、缬氨酸(V)或谷氨酸(E)；
X23是缬氨酸(V)或精氨酸(R)；
X24是谷氨酰胺(Q)或亮氨酸(L)；
X27是甲硫氨酸(M)；
X28是天冬酰胺(N)或精氨酸(R)；
X30不存在(条件是当通式1的氨基酸序列与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：12相同时，不包括在内)。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，胰高血糖素衍生物肽的长效缀合物中的胰高血糖素衍生物肽的特征在于其包括下述通式2的氨基酸序列：
Y–Aib–QGTF–X7–SD–X10–S–X12–Y–L–X15–X16–X17–R–A–X20–X21–F–V–X24–W–L–M–N–T–X30(通式2，SEQ ID NO：47)
在上述通式2中，
X7是苏氨酸(T)、缬氨酸(V)或半胱氨酸(C)；
X10是酪氨酸(Y)或半胱氨酸(C)；
X12是赖氨酸(K)或半胱氨酸(C)；
X15是天冬氨酸(D)或半胱氨酸(C)；
X16是谷氨酸(E)或丝氨酸(S)；
X17是赖氨酸(K)或精氨酸(R)；
X20是谷氨酰胺(Q)或赖氨酸(K)；
X21是天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)；
X24是缬氨酸(V)或谷氨酰胺(Q)；
X30是半胱氨酸(C)或不存在(条件是当通式2的氨基酸序列与SEQ ID NO：1和SEQID NO：12相同时，不包括在内)。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，胰高血糖素衍生物肽的特征在于其包括选自SEQ ID NO：2至45的氨基酸序列。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，胰高血糖素衍生物肽的特征在于其包括选自SEQ ID NO：13、15和36至44的氨基酸序列。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，胰高血糖素衍生物肽的特征在于其包括选自SEQ ID NO：37的氨基酸序列。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，胰高血糖素衍生物肽的特征在于其具有与天然胰高血糖素的pI(pI为6.8)不同的pI，例如，pI为6.5或更低或7.0或更高。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，胰高血糖素衍生物肽的特征在于其在其C-末端具有羧基(COOH)。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，胰高血糖素衍生物肽的特征在于其为能够激活胰高血糖素受体的天然胰高血糖素的衍生物。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，胰高血糖素衍生物肽的pI的特征在于其是6至7，并且与天然胰高血糖素相比，在胰高血糖素衍生物肽的长效缀合物中的相对体外活性为200％或更高。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，上述通式1或2中的氨基酸对X10和X14、X12和X16、X16和X20、X17和X21、X20和X24以及X24和X28中的至少一个氨基酸对中的每一个氨基酸的特征在于其被能够形成环的谷氨酸或赖氨酸取代。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，通式1或2中的氨基酸对X12和X16、氨基酸对X16和X20或氨基酸对X17和X21中的每一个氨基酸的特征在于其被能够形成环的谷氨酸或赖氨酸取代。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，通式1或2中氨基酸对X10和X14、X12和X16、X16和X20、X17和X21、X20和X24以及X24和X28中的至少一个氨基酸对的特征在于其在每一个氨基酸之间形成环。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，环的特征在于其为内酰胺环。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，在通式1或2中，X16的特征在于其是谷氨酸，X20是赖氨酸，并且X16和X20的侧链形成内酰胺环。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，免疫球蛋白Fc区的特征在于其为IgG-、IgA-、IgD-、IgE-或IgM-衍生的Fc片段。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，免疫球蛋白Fc区的特征在于其选自(a)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域；(b)CH1结构域和CH2结构域；(c)CH1结构域和CH3结构域；(d)CH2结构域和CH3结构域；(e)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域中的一个或两个或更多个结构域与免疫球蛋白铰链区或铰链区的一部分之间的组合；和(f)重链恒定区和轻链恒定区的每个结构域之间的二聚体。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，免疫球蛋白Fc片段的每个结构域的特征在于其为具有不同来源的结构域的杂合体，其源自选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，免疫球蛋白Fc片段的特征在于其为由单链免疫球蛋白组成的二聚体或多聚体的形式，该单链免疫球蛋白由相同来源的结构域组成。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，免疫球蛋白Fc片段的特征在于其为IgG4 Fc片段。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，免疫球蛋白Fc片段的特征在于其为人无糖基化的IgG4 Fc片段。
在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，免疫球蛋白Fc片段的特征在于其为天然Fc衍生物，包括：其中除去能够形成分子间二硫键的位点的修饰；除去其中天然Fc的几个N-末端氨基酸的修饰；其中将甲硫氨酸残基添加到天然Fc的N-末端的修饰；其中除去补体结合位点的修饰；其中除去抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)位点的修饰，或其组合。
实施本发明的另一个方面提供了用于制备液体制剂的方法。
在一个实施方式中，本发明涉及用于制备液体制剂的方法，其包括：将(i)胰高血糖素衍生物肽的长效缀合物，其中胰高血糖素衍生物肽和免疫球蛋白Fc片段彼此连接，与(ii)(a)缓冲剂和(b)糖醇、糖或其组合混合。
在根据前述实施方式所述的方法中，稳定剂的特征在于其进一步包括选自糖、糖醇、非离子表面活性剂和氨基酸的一种或多种组分。
在根据前述任一个实施方式所述的方法中，液体制剂的特征在于其是进一步包括糖或糖醇、氨基酸或二者的胰高血糖素衍生物肽的长效缀合物的液体制剂。
在根据前述任一个实施方式所述的方法中，液体制剂的特征在于其包括缓冲剂、糖或糖醇和氨基酸。
在根据前述任一个实施方式所述的方法中，液体制剂的特征在于其包括缓冲剂、糖或糖醇、非离子表面活性剂和氨基酸。
具体实施方式
下文将对本发明进行更详细的描述。
同时，本文公开的每个解释和示例性实施方式都可以适用于其他每个解释和示例性实施方式。即，本文公开的各种因素的所有组合属于本发明的范围。此外，本发明的范围不应受到下文提供的具体公开内容的限制。
此外，本领域普通技术人员只需使用常规实验就能认识或证实本文所述的本发明的许多特定方面的等效物。此外，还意欲将这些等效物包括在本发明中。
在本发明的整篇说明书中，不仅使用了天然存在的氨基酸的常规单字母和三字母编码，而且还使用了其他氨基酸通常允许的那些三字母编码，比如α-氨基异丁酸(Aib)、Sar(N-甲基甘氨酸)和α-甲基-谷氨酸等。此外，根据IUPAC-IUB命名规则，本文提到的氨基酸被缩写如下：
丙氨酸Ala、A 精氨酸Arg、R
天冬酰胺Asn、N 天冬氨酸Asp、D
半胱氨酸Cys、C 谷氨酸Glu、E
谷氨酰胺Gln、Q 甘氨酸Gly、G
组氨酸His、H 异亮氨酸Ile、I
亮氨酸Leu、L 赖氨酸Lys、K
甲硫氨酸Met、M 苯丙氨酸Phe、F
脯氨酸Pro、P 丝氨酸Ser、S
苏氨酸Thr、T 色氨酸Trp、W
酪氨酸Tyr、Y 缬氨酸Val、V
实施本发明的一个方面提供了一种胰高血糖素衍生物的长效缀合物的液体制剂。
具体地，本发明涉及胰高血糖素衍生物的长效缀合物的液体制剂，其包括药理学有效量的胰高血糖素衍生物肽的长效缀合物，其中胰高血糖素衍生物肽和免疫球蛋白Fc片段彼此连接；以及缓冲剂；以及糖醇、糖或其组合。
具体地，本发明提供了一种液体制剂，其包括下述化学式1的长效缀合物；缓冲剂；和糖醇、糖或其组合。
[化学式1]
X–La–F
在上述化学式1中，
X为胰高血糖素衍生物肽；
L为接头；
a是0或自然数，条件是当a是2或更大时，每个L是彼此独立的；
F是免疫球蛋白Fc片段；和
–表示共价键：
[通式1]
Y–X2–QGTF–X7–SD–X10–S–X12–X13–X14–X15–X16–X17–X18–X19–X20–X21–F–X23–X24–W–L–X27–X28–T–X30(通式1，SEQ ID NO：46)
在上述通式1中，
X2是α-甲基-谷氨酸、氨基异丁酸(Aib)、D-丙氨酸、甘氨酸、Sar(N-甲基甘氨酸)、丝氨酸或D-丝氨酸；
X7是苏氨酸(T)、缬氨酸(V)或半胱氨酸(C)；
X10是酪氨酸(Y)或半胱氨酸(C)；
X12是赖氨酸(K)或半胱氨酸(C)；
X13是酪氨酸(Y)或半胱氨酸(C)；
X14是亮氨酸(L)或半胱氨酸(C)；
X15是天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)或半胱氨酸(C)；
X16是谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、丝氨酸(S)、α-甲基-谷氨酸或半胱氨酸(C)或不存在；
X17是天冬氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、半胱氨酸(C)或缬氨酸(V)或不存在；
X18是丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、精氨酸(R)、缬氨酸(V)或半胱氨酸(C)或不存在；
X19是丙氨酸(A)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、缬氨酸(V)或半胱氨酸(C)或不存在；
X20是赖氨酸(K)、组氨酸(H)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、天冬氨酸(D)、精氨酸(R)、α-甲基-谷氨酸或半胱氨酸(C)或不存在；
X21是天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)，亮氨酸(L)、缬氨酸(V)或半胱氨酸(C)或不存在；
X23是异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)或精氨酸(R)或不存在；
X24是缬氨酸(V)、精氨酸(R)、丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、谷氨酰胺(Q)、α-甲基-谷氨酸或亮氨酸(L)或不存在；
X27是异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、赖氨酸(K)，甲硫氨酸(M)、谷氨酰胺(Q)或精氨酸(R)或不存在；
X28是谷氨酰胺(Q)、赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)或精氨酸(R)或不存在；
X30是半胱氨酸(C)或不存在(条件是当通式1的氨基酸序列与SEQ ID NO：1和SEQIDNO：12相同时，不包括在内)。
如在本文中使用的，术语“液体制剂”是指配制成液体形式的药物，并且旨在包括所有内部使用的液体制剂和外部使用的制剂。
本发明的液体制剂包括显示药理作用的化学式1的长效缀合物，和当其被配制为液体形式时能够将显示药理作用的缀合物稳定维持和/或储存一定时间段的物质。除了化学式1的长效缀合物之外，还可以将所包括的展现液体制剂的药理作用的组分与稳定剂混合。
在本发明的化学式1的长效缀合物的液体制剂中，储存稳定性对于确保精确的剂量很重要。
证实了通过包括特定浓度的化学式1的长效缀合物(其为展现出药理作用的物质)；将pH维持在4.8至6.5的范围内的量的缓冲剂；和1.0％(w/v)至20％(w/v)的糖醇、糖或其组合，化学式1的长效缀合物即使在长时间储存时也是稳定的，从而提供本发明的新型制剂。
包括在本发明的液体制剂中的胰高血糖素衍生物肽的长效缀合物的浓度可以为约18nmol/mL至约2,810nmol/mL、约18nmol/mL至约2,807nmol/mL、约18nmol/mL至约2,623nmol/mL、约18nmol/mL至约2,436nmol/mL、约18nmol/mL至约2,248nmol/mL、约18nmol/mL至约2,061nmol/mL、约18nmol/mL至约1,874nmol/mL、约18nmol/mL至约1,686nmol/mL、约18nmol/mL至约1,499nmol/mL、约18nmol/mL至约1,312nmol/mL、约18nmol/mL至约1,124nmol/mL、约18nmol/mL至约940nmol/mL、约18nmol/mL至约936nmol/mL、约18nmol/mL至约843nmol/mL、约18nmol/mL至约750nmol/mL、约18nmol/mL至约656nmol/mL、约18nmol/mL至约570nmol/mL、约18nmol/mL至约562nmol/mL、约18nmol/mL至约469nmol/mL、约18nmol/mL至约375nmol/mL、约18nmol/mL至约281nmol/mL、约18nmol/mL至约188nmol/mL、约18nmol/mL至约94nmol/mL、约187nmol/mL、约188nmol/mL、约187.09nmol/mL、约187.1nmol/mL、约93nmol/mL至约188nmol/mL、约93nmol/mL至约281nmol/mL、约93nmol/mL至约375nmol/mL、约93nmol/mL至约469nmol/mL、约93nmol/mL至约562nmol/mL、约93nmol/mL至约656nmol/mL、约93nmol/mL至约750nmol/mL、约93nmol/mL至约843nmol/mL、约93nmol/mL至约940nmol/mL、约93nmol/mL至约936nmol/mL、约187nmol/mL至约281nmol/mL、约187nmol/mL至约375nmol/mL、约187nmol/mL至约469nmol/mL、约187nmol/mL至约570nmol/mL或约187nmol/mL至约562nmol/mL，但不限于此。在一个实施方式中，长效缀合物的浓度可以是18nmol/mL至936nmol/mL，但不限于此。如在本文中使用的，术语“稳定剂”是指将制剂中诸如活性成分的组分稳定地维持特定时间段的物质。
本发明的稳定剂优选地不含白蛋白。可用作蛋白质稳定剂的人血清白蛋白由人血液制备，并且因此可能被人类致病病毒污染，并且明胶或牛血清白蛋白可能会在一些患者中引起疾病或可能会引起过敏反应。本发明的无白蛋白稳定剂不含外源蛋白比如人或动物血清白蛋白或纯化的明胶，并且因此不容易受到病毒感染。
在本发明中，稳定剂具体是指使胰高血糖素衍生物的长效缀合物稳定地储存的物质。在胰高血糖素衍生物的长效缀合物中，储存稳定性不仅对确保精确的剂量很重要，而且对于抑制针对胰高血糖素衍生物的抗原物质的潜在生成也很重要。
缓冲剂(其为包括在本发明的液体制剂中的一种组分)可以维持溶液的pH，使得液体制剂的pH不快速改变，以使化学式1的长效缀合物稳定。缓冲剂也可以被称为缓冲系统，并且缓冲剂或缓冲系统用于维持液体制剂的pH。可以没有限制地使用能够维持可以稳定化学式1的长效缀合物的pH的缓冲剂，该缀合物为稳定的目标材料。
缓冲剂可以是pH缓冲液，包括磷酸和其共轭碱(即，碱金属盐比如磷酸盐：磷酸钠、磷酸钾或其氢盐或二氢盐)、柠檬酸及其盐(例如，柠檬酸钠)、乙酸及其盐(例如，乙酸钠)或组氨酸及其盐，并且还可以使用这些缓冲液的混合物，但是缓冲剂不限于此。
本发明的液体制剂可以包括含有缓冲剂的缓冲溶液作为液体制剂的溶剂，具体地，缓冲溶液可以选自柠檬酸盐缓冲溶液(例如，柠檬酸钠缓冲溶液)、乙酸盐缓冲溶液(例如，乙酸钠缓冲溶液)、磷酸盐缓冲溶液(例如，磷酸钠缓冲溶液)、组氨酸缓冲溶液，以及其组合。此外，可以以足以维持液体制剂的目标pH的浓度包含液体制剂中的缓冲溶液或缓冲剂(柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐、或其组合)。
液体制剂的pH可以为约4.6至约6.5，例如，约4.8至约6.5、约4.8至约6.4、约4.8至约6.3、约4.8至约6.2、约4.8至约6.1、约4.8至约6.0、约4.8至约5.9、约4.8至约5.8、约4.8至5.7、约4.8至约5.6、约4.8至5.5、约4.8至约5.4、约4.8至约5.3、约4.8至约5.2、约4.8至约5.1、约4.9至约6.5、约4.9至约6.4、约4.9至约6.3、约4.9至约6.2、约4.9至约6.1、约4.9至约6.0、约4.9至约5.9、约4.9至约5.8、约4.9至5.7、约4.9至约5.6、约4.9至5.5、约4.9至约5.4、约4.9至约5.3、约4.9至约5.2、约4.9至约5.1或约5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5，但不特别限于此。
达到目标pH的液体制剂的浓度可以为约1mM至约200mM，更具体地约5mM至约100mM、约5mM至约80mM、约5mM至约40mM、约8mM至约40mM、约5mM至约30mM或约5mM至约25mM、约10mM至约25mM、约15mM至约25mM、约18mM至约24mM、约18mM至约22mM或约20mM，但不特别限于此。
在一个实施方式中，缓冲剂可以是乙酸及其盐，但不限于此。
在另一个实施方式中，缓冲溶液可以是乙酸盐缓冲溶液(例如，乙酸钠缓冲溶液)或柠檬酸盐缓冲溶液(例如，柠檬酸钠缓冲溶液)，但不特别限于此。
同时，在制备液体制剂中，将各组分溶解在水(例如，WFI)中，并且可以使用HCl和/或NaOH等将缓冲溶液或制剂的pH调解至所需的pH，这是本领域已经常用的方法。因此，即使权利要求书中没有另外提及pH调节剂，本领域技术人员也会理解，通过这种方法，制剂可以具有调节的pH。
糖醇(其为包括在本发明的稳定剂中的一种组分)是指含有多个羟基的物质，并且可以以包括其中糖的醛基和/或酮基被醇基取代的物质，以及含有多个羟基的糖。糖或糖醇可以增加胰高血糖素衍生物的长效缀合物的稳定性。例如，糖醇可以是选自甘露糖醇和山梨糖醇的一种或多种，但不限于此。
糖(其为包括在本发明的液体制剂中的一种组分)指单糖、二糖、多糖、寡糖等，并且可以增加胰高血糖素衍生物肽的长效缀合物的稳定性。具体实例可以包括单糖比如甘露糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、岩藻糖和木糖；二糖比如乳糖、麦芽糖和蔗糖；和多糖比如棉子糖和葡聚糖，但不限于此。
在一个实施方式中，糖可以是葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖或其组合，但不限于此。
例如，糖可以是蔗糖，但不特别限于此。
相对于液体制剂的总溶液，糖醇、糖或其组合可以以约0.5％(w/v)至约20％(w/v)、约0.5％(w/v)至约15％(w/v)、约0.5％(w/v)至约10％(w/v)、约0.5％(w/v)至约8％(w/v)、约1％(w/v)至约20％(w/v)、约1％(w/v)至15％(w/v)、约1％(w/v)至10％(w/v)、约1％(w/v)至8％(w/v)、约2％(w/v)至约15％(w/v)、约2％(w/v)至约12％(w/v)、约2％(w/v)至约12％(w/v)、约3％(w/v)至约10％(w/v)、约4％(w/v)至约10％(w/v)、约4％(w/v)至约8％(w/v)、约4％(w/v)至约6％(w/v)、约5％(w/v)至约10％(w/v)、约6％(w/v)至约10％(w/v)、约7％(w/v)至约10％(w/v)、约7％(w/v)至约9％(w/v)、约8％(w/v)至约9％(w/v)或约1.0％(w/v)、约3.0％(w/v)、约5.0％(w/v)或约8.0％(w/v)的浓度存在，但不特别限于此。此外，液体制剂可以进一步包括选自非离子表面活性剂和氨基酸的一种或多种组分，但不特别限于此。
因此，液体制剂的稳定剂可以基本上由i)缓冲剂和ii)糖或糖醇组成，而且还可以基本上由以下组成i)缓冲剂、ii)糖或糖醇和iii)非离子表面活性剂；i)缓冲剂、ii)糖或糖醇、iii)氨基酸和iv)非离子表面活性剂；i)缓冲剂、ii)糖或糖醇、iii)氨基酸；和i)缓冲剂、ii)糖或糖醇、iii)非离子表面活性剂和iv)氨基酸，但不特别限于此。这里，很明显上面或下面描述的所有内容都适用于构成稳定剂的每种组分的类型、浓度或pH。
尽管不特别限于此，非离子表面活性剂(其为包括在液体制剂中的一种组分)降低蛋白质溶液的表面张力，从而防止蛋白质在疏水表面的吸附或聚集。
可用于本发明的非离子表面活性剂的具体实例可以包括聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20(聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯)、聚山梨醇酯40(聚氧乙烯(20)失水山梨醇单棕榈酸酯)、聚山梨醇酯60(聚氧乙烯(20)失水山梨醇单硬脂酸酯)、聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯)(聚氧乙烯基团后面的数值20是指氧乙烯基团–(CH2CH2O)–)的总数)；泊洛沙姆(PEO–PPO–PEO共聚物；PEO：聚(环氧乙烷)，PPO：聚(环氧丙烷))、聚乙二醇–聚丙二醇、聚氧乙烯化合物(例如，聚氧乙烯–硬脂酸酯，聚氧乙烯烷基醚(烷基：C1–C30)、聚氧乙烯单烯丙基醚、烷基苯基聚氧乙烯共聚物(烷基：C1–C30)等)、十二烷基硫酸钠(SDS)等、或聚山梨醇酯或泊洛沙姆。这些也可以单独使用或其两种或更多种组合使用。
具体地，非离子表面活性剂可以是聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯20或泊洛沙姆188，并且这些可以组合使用，但不特别限于此。
在本发明中，优选地不包含高浓度的非离子表面活性剂，并且具体地，所包含的非离子表面活性剂的浓度可以为约0.2％(w/v)或更低，例如约0.001％(w/v)至约0.2％(w/v)、约0.001％(w/v)至约0.1％(w/v)、约0.001％(w/v)至约0.05％(w/v)、约0.005％(w/v)至约0.08％(w/v)、约0.002％(w/v)至约0.05％(w/v)、约0.005％(w/v)至约0.05％(w/v)、约0.01％(w/v)至约0.05％(w/v)、约0.01％(w/v)至约0.04％(w/v)、约0.01％(w/v)至约0.03％(w/v)、约0.01％(w/v)至约0.1％(w/v)或约0.02％(w/v)，但是浓度不特别限于此。
氨基酸(作为可以添加到液体制剂的任选组分的稳定剂类型)可以是甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、赖氨酸或其组合，但不限于此。
氨基酸可以抑制由于蛋白质的氧化反应而可能发生的杂质生成，但不特别限于此。
氨基酸可以以约0.01mg/mL至约1mg/mL、约0.01mg/mL至约0.8mg/mL、约0.01mg/mL至约0.5mg/mL、约0.02mg/mL至约0.5mg/mL或约0.02mg/mL至约0.4mg/mL或约0.1mg/mL的浓度存在于液体制剂中，但不特别限于此。
在一个实施方式中，液体制剂包括缓冲剂，并且糖或糖醇可以包括或可以不包括等渗剂，并且可以不进一步包括选自非离子表面活性剂和氨基酸的一种或多种组分，但不限于此。
同时，除了糖醇、糖或其组合；和缓冲剂(其为上述液体制剂的基本组分)；和非离子表面活性剂和氨基酸(其为任选地组分)之外，本发明的液体制剂可以任选地进一步包括在不损害本发明的效果的范围内的本领域已知的其他组分或材料，但不限于此。
同时，液体制剂可以进一步包括多元醇，但不特别限于此。
例如，液体制剂可以包括i)缓冲剂和ii)糖或糖醇以及多元醇，并且可以进一步在基本上由i)缓冲剂、ii)糖或糖醇和iii)非离子表面活性剂；i)缓冲剂、ii)糖或糖醇、iii)氨基酸和iv)非离子表面活性剂；i)缓冲剂、ii)糖或糖醇、iii)氨基酸；和i)缓冲剂、ii)糖或糖醇、iii)非离子表面活性剂和iv)氨基酸组成的稳定剂中包括多元醇。
可以进一步包括在本发明的液体制剂中的多元醇的实例可以包括丙二醇和低分子量聚乙二醇、甘油、低分子量聚丙二醇等，并且这些可以以其一种或两种或更多种组合使用，但不限于此。
在本发明中，化学式1的长效缀合物为包括在本发明的液体制剂中的活性成分，并且可以以药学上有效的量包括在其中。例如，制剂中的长效缀合物的浓度可以为约18nmol/mL至约2,810nmol/mL、约18nmol/mL至约2,807nmol/mL、约18nmol/mL至约2,623nmol/mL、约18nmol/mL至约2,436nmol/mL、约18nmol/mL至约2,248nmol/mL、约18nmol/mL至约2,061nmol/mL、约18nmol/mL至约1,874nmol/mL、约18nmol/mL至约1,686nmol/mL、约18nmol/mL至约1,499nmol/mL、约18nmol/mL至约1,312nmol/mL、约18nmol/mL至约1,124nmol/mL、约18nmol/mL至约940nmol/mL、约18nmol/mL至约936nmol/mL、约18nmol/mL至约843nmol/mL、约18nmol/mL至约750nmol/mL、约18nmol/mL至约656nmol/mL、约18nmol/mL至约570nmol/mL、约18nmol/mL至约562nmol/mL、约18nmol/mL至约469nmol/mL、约18nmol/mL至约375nmol/mL、约18nmol/mL至约281nmol/mL、约18nmol/mL至约188nmol/mL、约18nmol/mL至约94nmol/mL、约187nmol/mL、约188nmol/mL、约187.09nmol/mL、约187.1nmol/mL、约93nmol/mL至约188nmol/mL、约93nmol/mL至约281nmol/mL、约93nmol/mL至约375nmol/mL、约93nmol/mL至约469nmol/mL、约93nmol/mL至约562nmol/mL、约93nmol/mL至约656nmol/mL、约93nmol/mL至约750nmol/mL、约93nmol/mL至约843nmol/mL、约93nmol/mL至约940nmol/mL、约93nmol/mL至约936nmol/mL、约187nmol/mL至约281nmol/mL、约187nmol/mL至约375nmol/mL、约187nmol/mL至约469nmol/mL、约187nmol/mL至约570nmol/mL或约187nmol/mL至约562nmol/mL、但不特别限于此。
如在本文中使用的，术语“约”是指包括所有的±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1等的范围，并且包括与这些值后面的值相当或相似的所有值，但是范围不限于此。
在一个实施方式中，液体制剂可以是含有以下的液体制剂：化学式1的肽缀合物；选自柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐以及其组合的缓冲剂，使得液体制剂的pH为4.8至6.5；糖；选自泊洛沙姆、聚山梨醇酯或其组合的非离子表面活性剂；和选自甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、赖氨酸以及其组合的稳定剂。
在一个实施方式中，液体制剂可以是含有以下的液体制剂：90nmol/mL至562nmol/mL的化学式1的肽缀合物；5mM至25mM的选自柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐以及其组合的缓冲剂，使得液体制剂的pH为4.8至5.5；1％(w/v)至20％(w/v)的糖醇、糖或其组合；0.01％(w/v)至0.1％(w/v)的选自泊洛沙姆、聚山梨醇酯或其组合的非离子表面活性剂；和0.01mg/mL至1mg/mL的选自甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、赖氨酸以及其组合的稳定剂。
在一个实施方式中，液体制剂可以是含有以下的液体制剂：90nmol/mL至562nmol/mL的化学式1的肽缀合物；5mM至25mM的选自柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐以及其组合的缓冲剂，使得液体制剂的pH为4.8至5.5；4％(w/v)至10％(w/v)的糖；0.01％(w/v)至0.1％(w/v)的选自泊洛沙姆、聚山梨醇酯或其组合的非离子表面活性剂；和0.01mg/mL至1mg/mL的选自甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、赖氨酸以及其组合的稳定剂。
同时，下文将更详细地描述胰高血糖素衍生物肽的长效缀合物，其为包括在本发明的液体制剂中的活性成分。
如在本文中使用的，术语“胰高血糖素衍生物的长效缀合物”或“胰高血糖素衍生物肽的长效缀合物”是指其中免疫球蛋白Fc片段和胰高血糖素衍生物彼此连接的形式。具体地，胰高血糖素衍生物可以通过缀合物中的接头与免疫球蛋白Fc片段共价连接，但不特别限于此。
与没有与免疫球蛋白缀合的肽相比，缀合物可以展现出增加的药效持续时间，并且在本发明中，根据通式1的肽的化学式1的缀合物被称为“长效缀合物”，并且可以与“肽缀合物”或“化学式1的长效缀合物”互换使用。
在一个实施方式中，免疫球蛋白Fc片段和X可以不是糖基化的，但不限于此。
同时，缀合物可以是非天然存在的缀合物。
本发明的长效缀合物可以是其中胰高血糖素衍生物肽和免疫球蛋白Fc片段彼此连接的形式，并且连接方法不特别限于此，但是肽和免疫球蛋白Fc片段可以通过接头彼此连接。
在一个实施方式中，本发明的长效缀合物具有下述化学式1的结构：
[化学式1]
X–La–F
在上述化学式1中，
X是通式1的肽；
L是包含乙二醇重复单元的接头；
a是0或自然数，条件是当a是2或更大时，每个L是彼此独立的；
F是免疫球蛋白Fc片段；和
–表示共价键。
化学式1的长效缀合物的X可以是对胰高血糖素衍生物具有活性的肽。“对胰高血糖素衍生物具有活性的肽”包括对胰高血糖素衍生物具有显著活性水平的各种物质，例如，各种肽。
更具体地，对胰高血糖素衍生物具有活性的肽为包括下述通式1的序列的对胰高血糖素衍生物具有活性的肽：
[通式1]
Y–X2–QGTF–X7–SD–X10–S–X12–X13–X14–X15–X16–X17–X18–X19–X20–X21–F–X23–X24–W–L–X27–X28–T–X30(通式1，SEQ ID NO：46)
在上述通式1中，
X2是α-甲基-谷氨酸、氨基异丁酸(Aib)、D-丙氨酸、甘氨酸、Sar(N-甲基甘氨酸)、丝氨酸或D-丝氨酸；
X7是苏氨酸(T)、缬氨酸(V)或半胱氨酸(C)；
X10是酪氨酸(Y)或半胱氨酸(C)；
X12是赖氨酸(K)或半胱氨酸(C)；
X13是酪氨酸(Y)或半胱氨酸(C)；
X14是亮氨酸(L)或半胱氨酸(C)；
X15是天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)或半胱氨酸(C)；
X16是谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、丝氨酸(S)、α-甲基-谷氨酸或半胱氨酸(C)或不存在；
X17是天冬氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、半胱氨酸(C)或缬氨酸(V)或不存在；
X18是丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、精氨酸(R)、缬氨酸(V)或半胱氨酸(C)或不存在；
X19是丙氨酸(A)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、缬氨酸(V)或半胱氨酸(C)或不存在；
X20是赖氨酸(K)、组氨酸(H)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、天冬氨酸(D)、精氨酸(R)、α-甲基-谷氨酸或半胱氨酸(C)或不存在；
X21是天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)，亮氨酸(L)、缬氨酸(V)或半胱氨酸(C)或不存在；
X23是异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)或精氨酸(R)或不存在；
X24是缬氨酸(V)、精氨酸(R)、丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、谷氨酰胺(Q)、α-甲基-谷氨酸或亮氨酸(L)或不存在；
X27是异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、赖氨酸(K)，甲硫氨酸(M)、谷氨酰胺(Q)或精氨酸(R)或不存在；
X28是谷氨酰胺(Q)、赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)或精氨酸(R)或不存在；
X30是半胱氨酸(C)或不存在(条件是当通式1的氨基酸序列与SEQ ID NO：1和SEQIDNO：12相同时，不包括在内)。
作为根据上述任一个实施方式所述的液体制剂，在胰高血糖素衍生物肽的长效缀合物中，胰高血糖素衍生物肽包括下述通式2的氨基酸序列：
Y–Aib–QGTF–X7–SD–X10–S–X12–Y–L–X15–X16–X17–R–A–X20–X21–F–V–X24–W–L–M–N–T–X30(通式2，SEQ ID NO：47)
在上述通式2中，
X7是苏氨酸(T)、缬氨酸(V)或半胱氨酸(C)；
X10是酪氨酸(Y)或半胱氨酸(C)；
X12是赖氨酸(K)或半胱氨酸(C)；
X15是天冬氨酸(D)或半胱氨酸(C)；
X16是谷氨酸(E)或丝氨酸(S)；
X17是赖氨酸(K)或精氨酸(R)；
X20是谷氨酰胺(Q)或赖氨酸(K)；
X21是天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)；
X24是缬氨酸(V)或谷氨酰胺(Q)；
X30是半胱氨酸(C)或不存在(条件是当通式2的氨基酸序列与SEQ ID NO：1和SEQID NO：12相同时，不包括在内)。
肽可以包括SEQ ID NO：2至11和13至45的氨基酸序列并且可以(基本上)由选自SEQ ID NO：2至11和13至45的氨基酸序列组成，但不限于此。
肽的实例可以包括包含选自SEQ ID NO：13、15和36至44的氨基酸序列的或(基本上)由其组成的肽，但不特别限于此。在另一个实例中，肽可以是包括选自SEQ ID NO：37的氨基酸序列的或(基本上)由其组成的肽，但不特别限于此。
此外，胰高血糖素衍生物可以包括分子内桥，例如，共价桥或非共价桥，并且具体地为包括环的形式。它可以是其中在第16位的谷氨酸和第20位的赖氨酸残基之间形成环的形式，其在上述通式1中加了下划线，但不特别限于此。环的非限制性实例可以包括内酰胺桥(或内酰胺环)。
此外，根据本发明的肽可以包括肽本身、其盐(例如，肽的药学上可接受的盐)或其溶剂化物的形式的所有那些。此外，肽可以是任何药学上可接受的形式。
盐的种类没有特别限制。然而，盐优选地为对受试者(例如，哺乳动物)安全且有效的盐，但不特别限于此。
术语“药学上可接受的”是指在药物医学决策的范围内可有效地用于预定用途，而不会引起过度的毒性、刺激或过敏反应等的材料。
如在本文中使用的，术语“药学上可接受的盐”是指源自药学上可接受的无机酸、有机酸或碱的盐。合适的盐的实例可以包括盐酸、溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、甲苯-对-磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲烷磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。源自合适的碱的盐的实例可以包括碱金属比如钠、钾等；碱土金属比如镁；铵等。
此外，如在本文中使用的，术语“溶剂化物”是指根据本发明的肽或其盐与溶剂分子之间形成的复合物。
此外，尽管在本发明中被描述为“由特定SEQ ID NO组成的肽”，但是不排除通过在相应的SEQ ID NO的氨基酸序列的上游或下游添加无意义的序列而可能发生的突变，或可能天然发生的突变，或其沉默突变，只要该肽具有与由相应SEQ ID NO的氨基酸序列组成的肽相同或相应的活性，并且即使在存在序列添加或突变时也显然属于本发明的范围。
同时，肽可以是非天然存在的肽。
肽的C-末端可以是酰胺化的肽或具有游离羧基(–COOH)的肽或可以包括具有未修饰的C-末端的肽，但不限于此。
在一个实施方式中，X可以在C-末端被酰胺化，但不限于此。
在一个实施方式中，Q/X可以是非糖基化的，但不限于此。
本发明的通式1的肽可以通过固相合成方法合成，可以通过重组方法生产，并且可以通过商业上生产，但不限于此。
如在本文中使用的，术语“化学式1的长效缀合物”为包括在本发明的液体制剂中的活性成分，可以以药理学有效的量包括在液体制剂中。具体地，缀合物为其中对胰高血糖素衍生物具有活性的肽和免疫球蛋白Fc区通过接头彼此连接的形式，并且可以展现出与没有与免疫球蛋白Fc区连接的对胰高血糖素衍生物具有活性的肽相比增强的药效持续时间。
此外，在化学式1的长效缀合物中，X(对胰高血糖素衍生物具有活性的肽)和免疫球蛋白Fc片段之间的连接可以通过物理或化学键、非共价或共价键，并且具体地共价键来实现，但不限于此。
此外，在化学式1的肽缀合物中，连接X(对胰高血糖素衍生物具有活性的肽)和免疫球蛋白Fc片段的方法没有特别限制，但是对胰高血糖素衍生物具有活性的肽和免疫球蛋白Fc片段可以通过接头彼此连接。
具体地，包括在本发明的液体制剂中的长效缀合物可以是由上述化学式1表示的缀合物。
在上述化学式1中，X和F可以通过L由共价键彼此连接。
更具体地，X和L，以及L和F可以通过共价键彼此连接，并且具体而言，缀合物可以是其中X、L和F通过共价键按化学式1的顺序彼此连接的缀合物。
此外，X可以与F直接连接(即，在上述化学式1中a是0)或者可以通过接头(L)连接。
在一个实施方式中，La(其为化学式1的长效缀合物的一种组分)可以是包含乙二醇重复单元的接头，例如(聚乙二醇)，并且此外，那些在本领域已知的衍生物和可以在本领域技术人员的技术水平下容易制备的衍生物包括在本发明的范围内。
L(其为包含乙二醇重复单元的接头)可以在末端包括官能团，其用于制备缀合物，然后将其形成为缀合物。根据本发明的长效缀合物可以是其中X和F通过官能团连接的形式，但不限于此。在本发明中，含有乙二醇重复单元的接头可以包括两个或三个或更多个官能团，并且每个官能团可以是彼此相同或不同的，但不限于此。
具体地，接头可以是由下述化学式3表示的聚乙二醇(PEG)，但不限于此：
[化学式3]
其中n是10至2,400，n是10至480，或n是50至250，但是n的范围不限于此。
在上述长效缀合物中，PEG部分不仅可以包括–(CH2CH2O)n–结构，而且还可以包括插入连接元素和–(CH2CH2O)n–结构之间的氧原子，但是PEG部分不限于此。
聚乙二醇是包括所有形式的乙二醇均聚物、PEG共聚物和单甲基取代的PEG聚合物(mPEG)(但不特别限于此)的通用术语。
在一个实施方式中，乙二醇重复单元可以由例如[OCH2CH2]n表示，并且n值为自然数，并且肽缀合物中[OCH2CH2]n区的平均分子量，例如数均分子量，可以确定为大于0kDa至约100kDa，但不限于此。在另一个实例中，n值为自然数，并且肽缀合物中[OCH2CH2]n区的平均分子量，例如数均分子量，可以为约1kDa至约100kDa、约1kDa至约80kDa、约1kDa至约50kDa、约1kDa至约30kDa、约1kDa至约25kDa、约1kDa至约20kDa、约1kDa至约15kDa、约1kDa至约13kDa、约1kDa至约11kDa、约1kDa至约10kDa、约1kDa至约8kDa、约1kDa至约5kDa、约1kDa至约3.4kDa、约3kDa至约30kDa、约3kDa至约27kDa、约3kDa至约25kDa、约3kDa至约22kDa、约3kDa至约20kDa、约3kDa至约18kDa、约3kDa至约16kDa、约3kDa至约15kDa、约3kDa至约13kDa、约3kDa至约11kDa、约3kDa至约10kDa、约3kDa至约8kDa、约3kDa至约5kDa、约3kDa至约3.4kDa、约8kDa至约30kDa、约8kDa至约27kDa、约8kDa至约25kDa、约8kDa至约22kDa、约8kDa至约20kDa、约8kDa至约18kDa、约8kDa至约16kDa、约8kDa至约15kDa、约8kDa至约13kDa、约8kDa至约11kDa、约8kDa至约10kDa、约9kDa至约15kDa、约9kDa至约14kDa、约9kDa至约13kDa、约9kDa至约12kDa、约9kDa至约11kDa、约9.5kDa至约10.5kDa或约10kDa，但不限于此。
在一个实施方式中，接头的两端可以与免疫球蛋白Fc区的硫醇基、氨基或羟基结合，并且可以与通式1的肽的硫醇基、氨基、叠氮基或羟基结合。
具体地，接头可以包括能够在两端与免疫球蛋白Fc和通式1的肽中的每一个结合的反应性基团。具体地，接头可以包括可以与半胱氨酸的硫醇基；位于赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和/或组氨酸的N-末端的氨基；和/或位于免疫球蛋白Fc片段的C-末端并且可以与硫醇基结合的羟基；赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和/或组氨酸的氨基；叠氮基-赖氨酸的叠氮基；和/或通式1的肽的羟基结合的反应性基团，但是反应性基团不限于此。
更具体地，接头的反应性基团可以是选自醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物的一种或多种，但不限于此。
在上述中，作为醛基的实例，可以使用丙醛基或丁醛基，但是醛基不限于此。
在上述中，作为琥珀酰亚胺衍生物，可以使用羧甲基琥珀酰亚胺、琥珀酰亚胺戊酸酯、琥珀酰亚胺基丁酸甲酯、琥珀酰亚胺基丙酸甲酯、琥珀酰亚胺丁酸酯、琥珀酰亚胺丙酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺、羟基琥珀酰亚胺或琥珀酰亚胺碳酸酯，但是琥珀酰亚胺衍生物不限于此。
接头可以通过反应性基团与F(免疫球蛋白Fc)和X(通式1的肽)连接，以转化为接头部分。
此外，通过醛键还原胺化产生的最终产物比通过酰胺键连接的最终产物要稳定得多。醛反应性基团在低pH下在N-末端选择性反应，而在高pH(例如，pH 9.0)下可以与赖氨酸残基形成共价键，但不限于此。
本发明的接头的末端反应性基团可以是彼此相同或不同的。接头可在两端具有醛反应性基团。可选地，接头可在每一端具有醛基和马来酰亚胺基，或可在每一端具有醛基和琥珀酰亚胺反应性基团，但不限于此。
例如，接头可以在一端具有马来酰亚胺基，并且在另一端具有醛基、丙醛基或丁醛基。作为另一个实例，接头可以在一端具有琥珀酰亚胺基，并且在另一端具有丙醛基或丁醛基。
当将在丙醛端具有羟基反应性基团的聚乙二醇用作接头时，可以通过已知的化学反应将羟基活化为各种反应性基团或通过使用具有改性反应性基团的商业上可获得的聚乙二醇来制备本发明的缀合物。
在具体实施方式中，接头的反应性基团可以与通式1的肽的半胱氨酸残基，更具体地与半胱氨酸的–SH基团连接，但是接头不限于此。
当使用马来酰亚胺–PEG–醛时，马来酰亚胺基团可以通过硫醚键与通式1的肽的的–SH基团连接，并且醛基可以通过还原烷基化与免疫球蛋白Fc的–NH2基团连接，但不限于此，并且这仅仅是一个实施方式。
通过还原烷基化，可以通过具有–CH2CH2CH2–结构的接头反应性基团将在免疫球蛋白Fc片段的N-末端的氨基与位于PEG的一端的氧原子连接形成诸如–PEG–O–CH2CH2CH2NH–免疫球蛋白Fc的结构；并且可以形成其中通过硫醚键将PEG的一端与位于通式1的肽的半胱氨酸的硫原子连接的结构。上述硫醚键可以包括下述结构：
然而，接头并不特别限于上述实施方式，并且这仅仅是一个实施方式。
此外，在上述缀合物中，接头的反应性基团可以与位于免疫球蛋白Fc片段的N-末端的–NH2连接，但是这仅仅是一个实施方式。
此外，在缀合物中，通式1的肽可以通过C-末端与具有反应性基团的接头连接，但是这仅仅是一个实施方式。
如在本文中使用的，术语“C-末端”是指肽的羧基末端，并且是指出于本发明的目的能够与接头结合的位置。例如，C-末端可以包括在C-末端的最末端处的氨基酸残基以及在C-末端附近的氨基酸残基，并且具体地，可以包括从最末端开始的第1至20个氨基酸残基，尽管C-末端不限于此。
在一个实施方式中，化学式1的缀合物可以具有下述化学式2的结构：
[化学式2]
在化学式2中，X是上述化学式1的肽；
F是免疫球蛋白Fc片段；和
n可以是自然数。具体而言，对n的描述与上文所述相同。
在一个实施方式中，化学式2的长效缀合物具有其中SEQ ID NO：46的通式1的肽X和免疫球蛋白Fc片段F通过乙二醇重复单元共价连接的结构，其中每个X可以与化学式2的琥珀酰亚胺环连接，并且F可以与化学式2的氧丙烯基连接。
在上述化学式2中，n值可以确定为使得肽缀合物中[OCH2CH2]n区的平均分子量，例如数均分子量为1kDa至100kDa、或1kDa至20kDa、或10kDa，但不限于此。
肽缀合物的X可以是对胰高血糖素衍生物具有活性的肽。
在一个实施方式中，X与化学式2的琥珀酰亚胺环连接的部分可以是X的C-末端半胱氨酸的硫原子。
F是人免疫球蛋白Fc片段，并且本说明书中的人免疫球蛋白Fc片段不仅包括由免疫球蛋白的木瓜蛋白酶消化获得的天然序列，而且还包括其衍生物、取代基，例如，变体，其中天然序列中的一个或多个氨基酸残基通过删除、插入、非保守或保守取代、或其组合被修饰，并且因此序列变得与天然序列不同，等等，条件是上述衍生物、取代基和变体保留FcRn结合能力。
F中与氧丙烯基连接的部分没有具体限制。在本发明的一个实施方式中，F中与氧丙烯基连接的部分可以是F中残基的N-末端氮或氮原子(例如，赖氨酸的ε氮)。在本发明的一个具体实施方式中，其中F与化学式1的氧丙烯基连接的部分可以是F的N-末端脯氨酸，但不限于此。
F可以具有其中两条多肽链通过分子间二硫键连接并且F通过两条链中的仅一条中的氮原子连接的结构，但不限于此。通过氮原子的连接可以通过还原胺化与赖氨酸的ε氨基原子或N-末端氨基连接，但不限于此。
还原胺化反应是指这样的反应，其中一种反应物的胺基或氨基与另一种反应物的醛(即，能够还原胺化的官能团)反应以产生胺，并且此后通过还原反应形成胺键。还原胺化反应是本领域广泛知晓的有机合成反应。
在一个实施方式中，F可以通过其N-末端脯氨酸的氮原子连接，但不限于此。
作为胰高血糖素衍生物肽的种类，可以提及国际专利公开号WO 2016/108586和WO2017/003191中描述的种类，并且国际专利公开的整篇说明书通过引用并入本文。此外，在WO 2017/003191中描述了用于制备胰高血糖素衍生物肽的长效缀合物的方法，并且显而易见国际专利公开的整篇说明书也通过引用并入本文。
这种胰高血糖素衍生物可以是通过具有相对于天然胰高血糖素的改变的pI而具有改善的物理特性的衍生物。此外，胰高血糖素衍生物可以是具有提高的溶解度同时具有激活胰高血糖素受体的活性的衍生物，但不限于此。
此外，胰高血糖素衍生物可以是非天然存在的衍生物。
同时，天然胰高血糖素可以具有下述氨基酸序列：
His–Ser–Gln–Gly–Thr–Phe–Thr–Ser–Asp–Tyr–Ser–Lys–Tyr–Leu–Asp–Ser–Arg–Arg–Ala–Gln–Asp–Phe–Val–Gln–Trp–Leu–Met–Asn–Thr(SEQ ID NO：1)
如在本文中使用的，术语“等电点”或“pI”是指诸如多肽或肽的分子没有净电荷(0)时的pH值。在具有各种带电官能团的多肽的情况下，在pH值与pI相同的点处总的多肽的净电荷为“0”。在pH值高于pI的情况下，多肽的净电荷为负，而在pH值低于pI的情况下，多肽的净电荷则为正。
pI值可以在由聚丙烯酰胺、淀粉或琼脂糖组成的固定化pH梯度凝胶上通过等电电泳来确定，或者可以通过例如使用ExPASy服务器中的pI/MW工具(http://expasy.org/tools/pi_tool.html；Gasteiger等，2003)从氨基酸序列中估计。
如本文所用，术语“改变的pI”是指由于用具有负电荷或正电荷的氨基酸残基取代了天然胰高血糖素的部分氨基酸序列而与天然胰高血糖素不同的pI，即降低或提高的pI值。具有这种改变的pI的肽作为胰高血糖素衍生物可以在中性pH下表现出提高的溶解度和/或高稳定性，但不特别限于此。
更具体地，胰高血糖素衍生物可以具有改变的pI值，而不是天然胰高血糖素的pI值(6.8)，并且甚至更具体地小于6.8，更具体地6.7或更低，更具体地6.5或更低的pI值，并且此外，超过6.8，7或更高，更具体地，7.5或更高的pI值，但不限于此，并且不同于天然胰高血糖素的任何pI值将属于本发明的范围。具体而言，当pI值与天然胰高血糖素不同，并且因此展现出与天然胰高血糖素相比在中性pH值下提高的溶解度，从而显示出低水平的聚集时，它将特别属于本发明的范围
更具体地，胰高血糖素衍生物可以具有4至6.5和/或7至9.5，具体地7.5至9.5，和更具体地8.0至9.3的pI值，但是pI值不限于此。在这种情况下，由于与天然胰高血糖素相比，pI值较低或较高，与天然胰高血糖素相比，因此在中性pH值下可以展现出提高的溶解度和高稳定性，但不特别限于此。
具体来说，天然胰高血糖素的衍生物可以通过取代、添加、缺失和修饰的任何一种方法或其组合对天然胰高血糖素的部分氨基酸进行修饰。这种氨基酸的取代一般可根据残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性而发生，用这些具有相似性质的氨基酸进行保守的取代可望产生相同或相似的活性。
通过上述方法的组合制备的胰高血糖素衍生物的实例包括这样的肽，与天然胰高血糖素相比在于氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基上不同，并且其中N-末端氨基酸残基被脱氨，具有激活胰高血糖素受体的功能等，但不限于此，并且适用于本发明的天然胰高血糖素衍生物可以通过用于制备衍生物的各种方法的组合来制备。
此外，这种用于制备天然胰高血糖素衍生物的修饰可以包括使用L型或D型氨基酸和/或非原生型氨基酸的所有修饰；和/或天然序列的修饰，例如，官能团、分子内共价键(例如，侧链之间的环形成)、甲基化、酰基化、泛素化、磷酸化、氨基己烷化、生物素化的修饰，等等。此外，修饰还可以包括取代为非天然化合物。
此外，天然胰高血糖素衍生物还可以包括其中将一个或多个氨基酸添加到天然胰高血糖素的氨基和/或羧基末端的所有那些修饰。
对于被取代或添加的氨基酸，不仅可以使用人类蛋白质中常见的20种氨基酸，而且还可以使用非典型氨基酸或不天然存在的那些。非典型氨基酸的商业来源可以包括Sigma-Aldrich、ChemPep Inc.和Genzyme Pharmaceuticals。包括这些氨基酸和典型肽序列的肽可以合成并从商业供应商例如American Peptide Company、Bachem(美国)或Anygen(韩国)购买。
氨基酸衍生物也可以用类似的方式获得，例如，可以使用4-咪唑并乙酸等。
由于胰高血糖素的pH约为7，因此它不溶于具有生理pH(pH为4至8)的溶液，并倾向于在中性pH下沉淀。在pH为3或更低的水溶液中，胰高血糖素在初始阶段是溶解的，但在一小时内通过形成凝胶而沉淀。由于凝胶化的胰高血糖素主要由β-片状原纤维组成，因此经由注射针头或静脉注射的方式施用这样沉淀的胰高血糖素会阻塞血管，并且因此不适合作为注射剂使用。为了延缓沉淀过程，通常使用酸性(pH为2至4)的制剂，并且通过这样做，可以使胰高血糖素在短时间内保持相对不聚集的状态。然而，胰高血糖素在低pH值下可以非常迅速地形成原纤维，并且因此这些酸性制剂在制备后必须进行注射。
在这方面，本发明人通过取代具有负电荷和正电荷的氨基酸残基来改变天然胰高血糖素的pI，开发了具有延长的作用特性的胰高血糖素衍生物。通过与天然胰高血糖素相比具有改变的pI，本发明的胰高血糖素衍生物的特征在于与天然胰高血糖素相比，在中性pH下具有提高的溶解度和/或高稳定性。
在本发明的具体实施方式中，胰高血糖素衍生物可以是包括下述通式1的氨基酸序列的肽：
Y–X2–QGTF–X7–SD–X10–S–X12–X13–X14–X15–X16–X17–X18–X19–X20–X21–F–X23–X24–W–L–X27–X28–T–X30(通式1，SEQ ID NO：46)
在上述通式中，
X2是α-甲基-谷氨酸、氨基异丁酸(Aib)、D-丙氨酸、甘氨酸、Sar(N-甲基甘氨酸)、丝氨酸或D-丝氨酸；
X7是苏氨酸、缬氨酸或半胱氨酸；
X10是酪氨酸或半胱氨酸；
X12是赖氨酸或半胱氨酸；
X13是酪氨酸或半胱氨酸；
X14是亮氨酸或半胱氨酸；
X15是天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸；
X16是谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、α-甲基-谷氨酸或半胱氨酸或不存在；
X17是天冬氨酸、谷氨酰胺，谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或缬氨酸或不存在；
X18是丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺，精氨酸、缬氨酸或半胱氨酸或不存在；
X19是丙氨酸、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸或半胱氨酸或不存在；
X20是赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、精氨酸、α-甲基-谷氨酸或半胱氨酸或不存在；
X21是天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、缬氨酸或半胱氨酸或不存在；
X23是异亮氨酸、缬氨酸或精氨酸或不存在；
X24是缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、α-甲基-谷氨酸或亮氨酸或不存在；
X27是异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺或精氨酸或不存在；
X28是谷氨酰胺、赖氨酸、天冬酰胺或精氨酸或不存在；和
X30是半胱氨酸或不存在(条件是当通式1的氨基酸序列与SEQ ID NO：1和SEQIDNO：12相同时，不包括在内)。
更具体地，
在上述通式1中，
X2是丝氨酸或氨基异丁酸(Aib)；
X7是苏氨酸、缬氨酸或半胱氨酸；
X10是酪氨酸或半胱氨酸；
X12是赖氨酸或半胱氨酸；
X13是酪氨酸或半胱氨酸；
X14是亮氨酸或半胱氨酸；
X15是天冬氨酸或半胱氨酸；
X16是谷氨酸、丝氨酸或半胱氨酸；
X17是天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或缬氨酸；
X18是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或半胱氨酸；
X19是丙氨酸或半胱氨酸；
X20是谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸或半胱氨酸；
X21是天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、缬氨酸或半胱氨酸；
X23是异亮氨酸、缬氨酸或精氨酸；
X24是缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺或亮氨酸；
X27是异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺或精氨酸；
X28是谷氨酰胺、赖氨酸、天冬酰胺或精氨酸；和
X30是半胱氨酸或不存在(条件是当通式1的氨基酸序列与SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：12相同时，不包括在内)。
例如，胰高血糖素衍生物肽可以是包括选自SEQ ID NO：2至45的氨基酸序列的肽，并且具体地是(基本上)由选自SEQ ID NO：2至45的氨基酸序列组成的肽，但不限于此。
此外，尽管在本发明中被描述为“由特定SEQ ID NO组成的肽”，但是不排除通过在相应的SEQ ID NO的氨基酸序列的上游或下游添加无意义的序列而可能发生的突变，或可能天然发生的突变，或其沉默突变，只要该肽具有与由相应SEQ ID NO的氨基酸序列组成的肽相同或相应的活性，并且即使在存在序列添加或突变时也显然属于本发明的范围。
上面描述的那些也可以应用于本发明的其他具体实施方式或方面，但不限于此。
具体地，在上述通式1中，
X2可以是丝氨酸或氨基异丁酸(Aib)；
X7可以是半胱氨酸、苏氨酸或缬氨酸；
X10可以是酪氨酸或半胱氨酸；
X12可以是赖氨酸或半胱氨酸；
X13可以是酪氨酸或半胱氨酸；
X14可以是亮氨酸或半胱氨酸；
X15可以是天冬氨酸或半胱氨酸；
X16可以是谷氨酸、丝氨酸或半胱氨酸；
X17可以是谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸或缬氨酸；
X18可以是精氨酸或半胱氨酸；
X19可以是丙氨酸或半胱氨酸；
X20可以是谷氨酰胺或赖氨酸；
X21可以是天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸或半胱氨酸；
X23可以是缬氨酸；
X24可以是缬氨酸或谷氨酰胺；
X27可以是甲硫氨酸；
X28可以是天冬酰胺或精氨酸；和
X30可以是半胱氨酸或不存在(条件是当通式1的氨基酸序列与SEQ ID NO：1和SEQID NO：12相同时，不包括在内)。
例如，胰高血糖素衍生物肽可以是包括选自SEQ ID NO：3、11至17、19至27、29、31、33和35至44的氨基酸序列的肽，并且具体地是(基本上)由选自SEQ ID NO：3、11至17、19至27、29、31、33和35至44的氨基酸序列组成的肽，但不限于此。
具体地，在上述通式1中，
X2可以是氨基异丁酸(Aib)；
X7可以是半胱氨酸、苏氨酸或缬氨酸；
X10可以是酪氨酸或半胱氨酸；
X12可以是赖氨酸；
X13可以是酪氨酸或半胱氨酸；
X14可以是亮氨酸或半胱氨酸；
X15可以是天冬氨酸或半胱氨酸；
X16可以是谷氨酸、丝氨酸或半胱氨酸；
X17可以是赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸或缬氨酸；
X18可以是精氨酸或半胱氨酸；
X19可以是丙氨酸或半胱氨酸；
X20可以是谷氨酰胺或赖氨酸；
X21可以是天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸；
X23可以是缬氨酸；
X24可以是谷氨酰胺；
X27可以是甲硫氨酸；
X28可以是天冬酰胺或精氨酸；和
X30可以是半胱氨酸或不存在(条件是当通式1的氨基酸序列与SEQ ID NO：1和SEQID NO：12相同时，不包括在内)。
例如，胰高血糖素衍生物肽可以是包括选自SEQ ID NO：14、17、19至25、27、29、33、35至38、40至42和44的氨基酸序列的肽，并且具体地为(基本上)由选自SEQ ID NO：14、17、19至25、27、29、33、35至38、40至42和44的氨基酸序列组成的肽，但不限于此。
具体地，在上述通式1中，
X2可以是丝氨酸或氨基异丁酸(Aib)；
X7可以是苏氨酸、缬氨酸或半胱氨酸；
X10可以是酪氨酸或半胱氨酸；
X12可以是赖氨酸或半胱氨酸；
X13可以是酪氨酸或半胱氨酸；
X14可以是亮氨酸或半胱氨酸；
X15可以是天冬氨酸或半胱氨酸；
X16可以是谷氨酸、丝氨酸或半胱氨酸；
X17可以是天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或缬氨酸；
X18可以是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或半胱氨酸；
X19可以是丙氨酸或半胱氨酸；
X20可以是谷氨酰胺、天冬氨酸或赖氨酸；
X21可以是天冬氨酸或谷氨酸；
X23可以是缬氨酸；
X24可以是缬氨酸或谷氨酰胺；
X27可以是异亮氨酸或甲硫氨酸；
X28可以是天冬酰胺或精氨酸；
X29可以是苏氨酸；和
X30可以是半胱氨酸或可以不存在(条件是当通式1的氨基酸序列与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：12相同时，不包括在内)。
例如，胰高血糖素衍生物肽可以是包括选自SEQ ID NO：2至13、15、17、20至24、26至30和32至44的氨基酸序列的肽，并且具体地为(基本上)由选自SEQ ID NO：2至13、15、17、20至24、26至30和32至44的氨基酸序列组成的肽，但不限于此。
具体地，在上述通式1中，
X2可以是氨基异丁酸(Aib)；
X7可以是苏氨酸；
X10可以是酪氨酸；
X12可以是赖氨酸；
X13可以是酪氨酸；
X14可以是亮氨酸；
X15可以是天冬氨酸或半胱氨酸；
X16可以是谷氨酸、丝氨酸或半胱氨酸；
X17可以是赖氨酸或精氨酸；
X18可以是精氨酸；
X19可以是丙氨酸；
X20可以是谷氨酰胺、半胱氨酸或赖氨酸；
X21可以是天冬氨酸、半胱氨酸、缬氨酸或谷氨酸；
X23可以是缬氨酸或精氨酸；
X24可以是谷氨酰胺或亮氨酸；
X27可以是甲硫氨酸；
X28可以是天冬酰胺或精氨酸；
X29可以是苏氨酸；和
X30可以不存在(条件是当通式1的氨基酸序列与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：12相同时，不包括在内)。
例如，胰高血糖素衍生物肽可以是包括选自SEQ ID NO：14、16、18、19、25和31的氨基酸序列的肽，并且具体地为(基本上)由选自SEQ ID NO：14、16、18、19、25和31的氨基酸序列组成的肽，但不限于此。
更具体地，胰高血糖素衍生物肽可以是包括下述通式2的氨基酸序列的肽：
Y–Aib–QGTF–X7–SD–X10–S–X12–Y–L–X15–X16–X17–R–A–X20–X21–F–V–X24–W–L–M–N–T–X30(通式2，SEQ ID NO：47)
在上述通式2中，
X7可以是苏氨酸、缬氨酸或半胱氨酸；
X10可以是酪氨酸或半胱氨酸；
X12可以是赖氨酸或半胱氨酸；
X15可以是天冬氨酸或半胱氨酸；
X16可以是谷氨酸或丝氨酸；
X17可以是赖氨酸或精氨酸；
X20可以是谷氨酰胺或赖氨酸；
X21可以是天冬氨酸或谷氨酸；
X24可以是缬氨酸或谷氨酰胺；和
X30可以是半胱氨酸或可以不存在(条件是当通式1的氨基酸序列与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：12相同时，不包括在内)。
例如，胰高血糖素衍生物肽可以是包括选自SEQ ID NO：13、15和36至44的氨基酸序列的肽，并且具体地为(基本上)由选自SEQ ID NO：13、15和36至44的氨基酸序列组成的肽，但不限于此。更具体地，肽可以是包括SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：37的氨基酸序列或(基本上)由相应的氨基酸序列组成的肽，但不限于此。
具体地，在上述通式2中，
X7可以是苏氨酸、缬氨酸或半胱氨酸；
X10可以是酪氨酸或半胱氨酸；
X12可以是赖氨酸；
X15可以是天冬氨酸；
X16可以是谷氨酸或丝氨酸；
X17可以是赖氨酸或精氨酸；
X20可以是谷氨酰胺或赖氨酸；
X21可以是天冬氨酸或谷氨酸；
X24可以是谷氨酰胺；和
X30可以是半胱氨酸或可以不存在(条件是当通式1的氨基酸序列与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：12相同时，不包括在内)，但不特别限于此。
例如，肽可以是包括选自SEQ ID NO：36至38、40至42和44的氨基酸序列的肽，并且具体地为(基本上)由选自SEQ ID NO：36至38、40至42和44的氨基酸序列组成的肽，但不限于此。
上述胰高血糖素衍生物可以包括分子内桥(例如，共价桥或非共价桥)，并且具体地为包括环的形式。例如，在胰高血糖素衍生物的第16和20位的氨基酸之间可以形成环，但不特别限于此。
环的非限制性实例可以包括内酰胺桥(或内酰胺环)。
此外，胰高血糖素衍生物包括被修饰为包括能够在所需位置形成环，从而包括环的氨基酸的所有那些肽。
这样的环可以在胰高血糖素衍生物中的氨基酸侧链之间形成，例如，在赖氨酸侧链和谷氨酸侧链之间可以形成内酰胺环，但不特别限于此。
例如，包括上述通式1或2的氨基酸序列的肽可以是其中通式1或2的氨基酸对X10和X14、X12和X16、X16和X20、X17和X21、X20和X24以及X24和X28中的每个酸对的每个氨基酸可以用谷氨酸或赖氨酸取代的肽，但不限于此。在Xn(n为整数)中，n是指从提供的氨基酸序列的N-末端开始的氨基酸的位置。
此外，包括通式1或2的氨基酸序列的肽可以是其中每个氨基酸对X12和X16或氨基酸对X16和X20或氨基酸对X17和X21中的每个氨基酸分别被谷氨酸或赖氨酸(其能够形成环)取代的肽。
此外，在通式1或2中，肽可以是其中在氨基酸对X10和X14、X12和X16、X16和X20、X17和X21、X20和X24以及X24和X28中的至少一个氨基酸对中的每个氨基酸对中的每个氨基酸之间形成环(例如，内酰胺环)的肽，但不限于此。
此外，在通式1或2中，X16可以是谷氨酸，X20可以是赖氨酸，并且X16和X20的侧链可以形成内酰胺环，但是它们不限于此。
此外，根据本发明的胰高血糖素衍生物肽可以是其中N-末端和/或C-末端未被修饰的形式，然而，其中肽的氨基末端和/或羧基末端等被化学修饰或被有机基团保护，或其中将氨基酸添加到肽端以保护其在体内不被蛋白酶破坏同时增加其稳定性的那些变体也可以包括在本发明的肽的范围内。在其中C-末端未被修饰的情况中，根据本发明的肽端可以具有羧基，但不特别限于此。
具体而言，在化学合成的肽的情况下，其N-和C-末端是带电的，并且因此肽的N-和C-末端可以是乙酰化和/或酰胺化的，但是肽不特别限于此。
除非在本发明中另有规定，否则在具体实施方式或权利要求书中关于根据本发明的“胰高血糖素衍生物肽”或“缀合物”(其中这样的肽与免疫球蛋白Fc片段共价连接)的描述可适用于各种形式，其不仅包括相应的肽或缀合物，而且还包括相应的肽或缀合物的盐(例如，其药学上可接受的盐)或其溶剂化物。因此，即使在本发明中描述了“肽”或“缀合物”的情况下，该描述也可同样适用于其特定的盐、其特定的溶剂化物和其特定的盐的特定溶剂化物。这些盐可以是，例如，使用任何药学上可接受的盐的形式。盐的种类不被限制。然而，盐优选地为对受试者，例如，哺乳动物安全且有效的盐，但不特别限于此。
如在本文中使用的，术语“免疫球蛋白Fc片段”是指不包括免疫球蛋白的重链和轻链可变区域的重链恒定区。具体地，免疫球蛋白Fc片段可以包括重链恒定区2(CH2)和/或重链恒定区3(CH3)部分，并且更具体地可以进一步包括铰链区(铰链区的全部或部分)。
免疫球蛋白Fc片段可以是构成本发明的化学式1的肽缀合物的部分的结构。具体地，它可以对应于上述化学式1中的F。这种免疫球蛋白Fc片段可以包括重链恒定区中的铰链区，但不限于此。
在本发明中，免疫球蛋白Fc片段可以在N-末端包括特定铰链序列。
如在本文中使用的，术语“铰链序列”是指位于重链中并通过分子间二硫键形成免疫球蛋白Fc片段的二聚体的区域。
在本发明中，铰链序列可以被修饰，使得具有下述氨基酸序列的铰链序列的一部分被删除，并且因此在该序列中只有一个半胱氨酸残基，但不限于此：
Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO：48)。
铰链序列可以这样的序列，其中SEQ ID NO：48的铰链序列的第8个或第11个半胱氨酸残基被删除并且因此在该序列中仅包括一个半胱氨酸残基。本发明的铰链序列可以由3至12个氨基酸(仅包括一个半胱氨酸残基)组成，但是铰链序列不限于此。更具体地，本发明的铰链序列可以具有下述序列：Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQID NO：52)、Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro–Ser–Pro(SEQ ID NO：53)、Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro–Ser(SEQ ID NO：54)、Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro–Pro(SEQ ID NO：55)、Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro–Ser(SEQ ID NO：56)、Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys(SEQ ID NO：57)、Glu–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys(SEQ IDNO：58)、Glu–Ser–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO：59)、Glu–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO：60)、Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO：61)、Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQID NO：62)、Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO：63)、Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO：64)、Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys(SEQ ID NO：65)、Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro(SEQ ID NO：66)、Glu–Ser–Lys–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQID NO：67)、Glu–Ser–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO：68)、Glu–Pro–Ser–Cys(SEQ ID NO：69)、SEQ ID NO：49(Ser–Cys–Pro)或SEQ ID NO：50(Pro–Ser–Cys–Pro)。更具体地，铰链序列可以包括SEQ ID NO：49(Ser–Cys–Pro)或SEQ ID NO：50(Pro–Ser–Cys–Pro)的氨基酸序列，但不限于此。
本发明的免疫球蛋白Fc片段可以是其中由于其中存在铰链序列而使免疫球蛋白Fc链的两个分子形成二聚体的形式，并且另外，本发明的化学式1的长效缀合物可以是其中接头的一端与二聚体免疫球蛋白Fc片段的一条链连接的形式，但是免疫球蛋白Fc片段和缀合物不限于此。
如在本文中使用的，术语“N-末端”是指蛋白质或多肽的氨基末端，并且它可以包括从最末端开始的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个氨基酸或氨基末端的最末端。本发明的免疫球蛋白Fc片段可以包括N-末端的铰链序列，但不限于此。
此外，本发明的免疫球蛋白Fc片段可以是扩展的Fc片段，其包括重链恒定区1(CH1)和/或轻链恒定区1(CL1)的全部或部分，不包括免疫球蛋白的重链和轻链可变区，只要它与其天然类型相比具有基本上相当或改善的效果。此外，本发明的免疫球蛋白Fc片段可以是其中对应于CH2和/或CH3的一些相当长的氨基酸序列被移除的区域。
例如，本发明的免疫球蛋白Fc片段可以是：1)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域；2)CH1结构域和CH2结构域；3)CH1结构域和CH3结构域；4)CH2结构域和CH3结构域；5)(i)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域中的一个或两个或更多个结构域和(ii)免疫球蛋白铰链区(或铰链区的一部分)的组合；或6)重链恒定区和轻链恒定区的每个结构域的二聚体，但是免疫球蛋白Fc区不限于此。
此外，在一个实施方式中，免疫球蛋白Fc片段可以具有二聚体形式，并且通式1的肽的一个分子可以与二聚体形式的一个Fc区共价连接，具体而言，免疫球蛋白Fc和通式1的肽可以通过含有乙二醇重复单元的接头彼此共价连接。同时，还有可能将通式1的肽的两个分子与二聚体形式的一个Fc区对称缀合。具体而言，免疫球蛋白Fc和通式1的肽可以通过含有乙二醇重复单元的接头彼此连接，但不限于上述实施方式。
此外，本发明的免疫球蛋白Fc片段包括天然氨基酸序列以及其序列衍生物。氨基酸序列衍生物是指由于在天然氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基的删除、插入、非保守或保守取代、或其组合而使该序列与天然氨基酸序列不同。
例如，已知对连接很重要的IgG Fc中第214至238、297至299、318至322或327至331位的氨基酸残基可用作适合变异的位点。
此外，可以获得各种类型的衍生物，例如，其中去除能够形成分子间二硫键的位点的衍生物；其中从天然Fc去除几个N-末端氨基酸的衍生物；其中将甲硫氨酸残基添加到天然Fc的N-末端的衍生物，等等。此外，可以去除补体结合位点(例如，C1q结合位点)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)位点以消除效应器功能。在国际公开号WO 97/34631、WO96/32478等中公开了用于制备这些免疫球蛋白Fc片段的序列衍生物的技术。
蛋白质或肽中不改变分子的整体活性的氨基酸取代在本领域是众所周知的(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常见的取代发生在以下的氨基酸残基之间：Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。在一些情况下，氨基酸可以通过磷酸化、硫酸盐化、丙烯酰化、糖基化、甲基化、法尼酰化、乙酰化、酰胺化等被修饰。
上述Fc衍生物可以是展现出与本发明的Fc片段相同的生物活性并具有增加的Fc片段对热、pH等的结构稳定性的那些。
此外，这种Fc片段可以获得自从人或动物(例如，母牛、山羊、猪、小鼠、兔子、仓鼠、大鼠、豚鼠等)分离的天然类型或可以是从转化的动物细胞或微生物获得的重组体或其衍生物。具体而言，Fc区可以通过从活人或动物分离出整个免疫球蛋白并用蛋白酶处理分离出的免疫球蛋白而从天然免疫球蛋白获得。当用木瓜蛋白酶处理整个免疫球蛋白时，它被裂解为Fab和Fc片段，而当用胃蛋白酶处理时，它被裂解为pF′c和F(ab)2片段。Fc或pF′c可以使用尺寸排阻色谱法等分离。在更具体实施方式中，Fc片段可以是重组免疫球蛋白Fc片段，其中人衍生的Fc片段从微生物中获得。
此外，免疫球蛋白Fc片段可以是天然聚糖的形式、与天然类型相比增加或减少的聚糖、或去糖基化形式。免疫球蛋白Fc聚糖的增加、减少或去除可以通过常规方法比如化学方法、酶法以及使用微生物的基因工程方法来实现。具体而言，其中从Fc中除去聚糖的免疫球蛋白Fc片段显示出对补体(C1q)的结合亲和力显著下降以及抗体依赖性细胞毒性或补体依赖性细胞毒性的降低或去除，并且因此它在体内不会诱发不必要的免疫反应。在这方面，去糖基化或无糖基化形式的免疫球蛋白Fc片段可能更适合满足本发明作为药物载体的初始目的。
如在本文中使用的，术语“去糖基化”是指其中用酶除去聚糖的Fc片段，和术语“无糖基化”是指在原核生物中产生的非糖基化的Fc片段，并且在更具体的实施方式中是大肠埃希杆菌。
同时，免疫球蛋白Fc片段可以源自人或动物(例如，母牛、山羊、猪、小鼠、兔子、仓鼠、大鼠、豚鼠等)，并且在更具体的实施方式中，它可以源自人。
此外，免疫球蛋白Fc片段可以源自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或其组合或杂合体。在更具体实施方式中，免疫球蛋白Fc片段可以源自IgG或IgM，它们是人类血液中最丰富的蛋白质之一，并且在甚至更具体的实施方式中，它可以源自IgG，已知它能够提高配体结合蛋白的半衰期。在甚至更具体的实施方式中，免疫球蛋白Fc片段可以是IgG4 Fc片段，并且在最具体的实施方式中，它可以是源自人IgG4的无糖基化的Fc片段，但不限于此。
此外，在具体实施方式中，免疫球蛋白Fc片段(为人IgG4 Fc片段)可以是同源二聚体的形式，其中两个单体通过半胱氨酸(其为每个单体的第3个氨基酸)之间的分子间二硫键(链间形式)连接。具体而言，同源二聚体的每个单体独立地具有/或可以具有在第35和95位的半胱氨酸之间的分子内二硫键；和在第141和199位的半胱氨酸之间的分子内二硫键(即，两个内部二硫键(链内形式))。关于氨基酸的数量，每个单体可以由221个氨基酸组成，并且形成同源二聚体的氨基酸可以由总共442个氨基酸组成，但是氨基酸的数量不限于此。具体地，免疫球蛋白Fc片段可以是这样的片段，其中具有SEQ ID NO：79的氨基酸序列的两个单体(由221个氨基酸组成)通过半胱氨酸(其为每个单体的第3个氨基酸)之间的分子间二硫键形成同源二聚体，并且其中同源二聚体的单体独立地形成在第35和95位的半胱氨酸之间的内部二硫键和在第141和199位的半胱氨酸之间的内部二硫键，但是免疫球蛋白Fc片段不限于此。
化学式1中的F可以包括SEQ ID NO：51的氨基酸序列的单体，并且F可以是SEQ IDNO：51的氨基酸序列的单体的同源二聚体，但不限于此。
在一个实施例中，免疫球蛋白Fc片段可以是包括SEQ ID NO：70的氨基酸序列的同源二聚体(由442个氨基酸组成)，但不限于此。
同时，如在本文中使用的，术语“组合”是指编码同一来源的单链免疫球蛋白Fc片段的多肽与不同来源的单链多肽连接以形成二聚体或多聚体。即，可以由选自IgG Fc片段、IgA Fc片段、IgM Fc片段、IgD Fc片段和IgE Fc片段的两个或更多个片段制备二聚体或多聚体。
如在本文中使用的，术语“杂合”是指在免疫球蛋白恒定区的一条链中存在对应于两个或多个不同来源的免疫球蛋白Fc片段的序列。在本发明中，各种杂合形式都是可能的。例如，杂合结构域可以由选自IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc和IgD Fc的CH1、CH2、CH3和CH4的1至4个结构域组成，并且可以进一步包括铰链区。
同时，IgG也可以划分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类，并且本发明可以包括其组合或杂合。优选的是IgG2和IgG4亚类，并且最优选的是IgG4的Fc片段，它很少具有效应功能，比如补体依赖性细胞毒性(CDC)。
同时，液体制剂可用于预防或治疗先天性高胰岛素血症、低血糖症或代谢综合症。
如在本文中使用的，术语“预防”是指通过施用上述胰高血糖素衍生物、包括其的缀合物或组合物抑制或延迟预期的疾病，例如先天性高胰岛素血症、低血糖症或代谢综合症的发生的所有活动，和术语“治疗”是指通过施用上述胰高血糖素衍生物、包括其的缀合物或组合物来改善或有利地改变预期的疾病，例如先天性高胰岛素血症、低血糖症或代谢综合症的症状的所有活动。
如在本文中使用的，术语“施用”是指通过任何适当的方法将特定材料引入患者体内，并且组合物的施用途径没有特别限制，但是可以是能够将组合物输送到体内目标的任何常规途径(例如，腹膜内施用、静脉内施用、肌内施用、皮下施用、皮内施用、口服施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用、直肠内施用等)。
如在本文中使用的，术语“低血糖症”是指其中血糖水平低于正常人水平的健康状态，并且通常是指当血糖水平为50mg/dL或更低时的状态，但不特别限于此。当服用口服降糖药或胰岛素的人吃得比平时少，或进行的活动或运动比平时多时，经常会引起低血糖症。此外，由于饮酒、使用降糖药物、严重的身体疾病、诸如肾上腺皮质激素和胰高血糖素的激素缺乏、分泌胰岛素的胰腺肿瘤、胰岛素自身免疫性疾病、胃切除术患者、碳水化合物代谢障碍的先天性错误等，都会发生低血糖。
在本发明中，低血糖症包括急性低血糖症和慢性低血糖症。
低血糖症的症状包括虚弱、颤抖、皮肤苍白、出冷汗、头晕、兴奋、焦虑、心脏跳动、空腹、头痛、疲劳等。如果是持续的低血糖，可能会导致抽搐或癫痫发作，并可能引起休克，并且因此导致昏厥。
更具体地，低血糖症可能是由遗传缺陷导致的持续高胰岛素症引起的。由于遗传缺陷导致的高胰岛素血症的已知原因的实例可能包括位于染色体11p15.1的SUR基因或Kir6.2基因的突变，或位于染色体7p15-p13的GK基因突变导致的葡萄糖激酶(GK)活性增加，由于谷氨酸脱氢酶(GDH)基因突变导致的GDH激活，导致胰岛β细胞中ATP增加，等等。
同时，先天性高胰岛素症是导致新生儿和儿童严重和持续低血糖症的主要原因之一。它可能是由于低出生体重的婴儿或来自糖尿病母亲的婴儿的胰岛素分泌暂时增加或基因突变而导致的胰腺细胞功能异常等引起的。众所周知，胰高血糖素可用于治疗先天性高胰岛素症。
此外，本发明的胰高血糖素衍生物或包括其的缀合物可作为药物药剂，不仅可用于防止体重增加、促进体重下降、减少超重和治疗包括病态肥胖的肥胖症(例如通过控制食欲、摄取、食物摄入、卡路里摄入和/或能量消耗)，而且还用于治疗与肥胖有关的炎症、与肥胖有关的胆囊疾病和肥胖引起的睡眠呼吸暂停，但不限于此，并且还可用于治疗其相关疾病或健康状况。本发明的胰高血糖素衍生物或包括该衍生物的缀合物也可用于治疗除肥胖以外的代谢综合征，即与肥胖有关的疾病，比如糖耐量受损、高胆固醇血症、血脂异常、肥胖症、高血压、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、血脂异常引起的动脉粥样硬化、动脉粥样硬化、冠心病、中风等。然而，根据本发明的胰高血糖素衍生物或其缀合物的作用可以完全或部分地由上述与体重有关的作用所介导，或者也可以与之无关。
实施本发明的另一个方面提供了一种用于制备液体制剂的方法。
该液体制剂和构成该制剂的组分如上所述。
具体地，该制备方法可以包括：将(i)胰高血糖素衍生物肽的长效缀合物，其中胰高血糖素衍生物肽和免疫球蛋白Fc片段彼此连接，与(ii)包括(a)缓冲剂和(b)糖醇、糖或组合的稳定剂混合。
稳定剂可以进一步包括选自糖或糖醇、非离子表面活性剂和氨基酸的一种或多种组分，并且更具体地可以进一步包括糖或糖醇、氨基酸或二者。例如，稳定剂可以包括缓冲剂、糖或糖醇和氨基酸，但不限于此。
长效粘合剂、缓冲剂、糖、糖醇或其组合、非离子表面活性剂、氨基酸和无白蛋白的稳定剂与上述相同。
用于实施本发明的另一个方面提供了液体制剂在制备用于预防或治疗先天性高胰岛素症、低血糖症或代谢综合征的药物中的用途。
实施本发明的又另一个方面提供了液体制剂用于预防或治疗先天性高胰岛素血症、低血糖症或代谢综合症的用途。
实施本发明的又另一个方面提供了用于预防或治疗先天性高胰岛素血症、低血糖症或代谢综合症的方法，其包括：将液体制剂施用至有需要的受试者。
液体制剂、先天性高胰岛素血症、低血糖症和代谢综合症如上所述。
受试者是指需要施用本发明的液体制剂的受试者，并且包括但不限于任何可以用本发明的液体制剂治疗的受试者，并且具体包括人类或哺乳动物，包括大鼠、家畜等。
本发明的治疗方法可以包括以药学有效量施用该液体制剂。液体制剂的适当的每日总剂量可在执业医师正确的医疗判断范围内确定，并且液体制剂可一次或多次分次施用。然而，出于本发明的目的，优选的是任何特定患者的液体制剂的具体治疗有效剂量根据要达到的反应的种类和程度、具体组合物(包括是否偶尔与其他药剂一起使用)、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、施用时间、施用途径、组合物的排泄率、治疗持续时间、包括药物与具体组合物联合或同时使用的各种因素以及在医学领域众所周知的类似因素而不同地应用。
下文将参照以下实施例对本发明进行更详细的描述。然而，这些实施例仅用于说明目的，并且本发明的范围不受这些实施例的限制。
制备例：胰高血糖素衍生物肽的长效缀合物的制备
胰高血糖素衍生物肽的长效缀合物按下述方法制备。
使马来酰亚胺-PEG-醛(Japan NOF Inc.)(其为一种分子量为10kDa的线性改性聚乙二醇，其中两端的氢分别被3-(3-马来酰亚胺丙酰胺)丙基和3-氧代丙基(丙醛基)取代)与上述胰高血糖素衍生物中具有半胱氨酸的衍生物反应，以使马来酰亚胺-PEG-醛的马来酰亚胺端的胰高血糖素衍生物肽的半胱氨酸残基PEG化。具体地，SEQ ID NO：37的胰高血糖素衍生物肽和马来酰亚胺-PEG-醛以1:1至5的摩尔比以3mg/mL至10mg/mL的蛋白质浓度在低温下反应1至3小时。具体而言，反应是在向50mM Tris缓冲液(pH 7.5)中加入20％至60％的异丙醇的环境下进行的。在反应完成后，将反应溶液应用于SP Sepharose HP(GEHealthcare，美国)以纯化半胱氨酸被单PEG化的胰高血糖素衍生物。
通过在国际专利公开号WO2007/021129中描述的方法，使用在N-末端具有Pro-Ser-Cys-Pro序列的铰链区的免疫球蛋白Fc片段(49.8kDa，SEQ ID NO：51的两条链通过分子内二硫键连接的同源二聚体)来制备免疫球蛋白Fc片段。
然后，将纯化的单PEG化的胰高血糖素衍生物肽和免疫球蛋白Fc以1:2至10的摩尔比以10mg/mL至50mg/mL的蛋白浓度在4℃至8℃下反应12至18小时。反应是在其中在100mM磷酸钾黄油(pH 6.0)中加入10mM至50mM氰硼氢化钠(还原剂)和10％至20％异丙醇的环境中进行的。在反应完成后，将反应溶液应用于Butyl Sepharose FF纯化柱(GE Healthcare，美国)和Source ISO纯化柱(GE Healthcare，美国)，以纯化胰高血糖素衍生物肽的长效缀合物，其中单PEG化的胰高血糖素衍生物肽的醛侧的聚乙二醇端与免疫球蛋白Fc同源二聚体的两条链中的一条的N-末端脯氨酸处的氮连接。
在制备完成后，通过反相色谱法、尺寸排除色谱法和离子交换色谱法分析的纯度显示为95％或更高。
具体而言，将其中胰高血糖素衍生物肽和免疫球蛋白Fc片段通过PEG连接的缀合物被命名为“胰高血糖素衍生物肽的长效缀合物”。
实施例1：评估根据pH以及糖或糖醇的类型的胰高血糖素衍生物肽的长效缀合物
的稳定性
基于由缓冲剂、作为表面活性剂的聚山梨醇酯20、糖或糖醇以及甲硫氨酸组成的液体制剂，在不同的pH值和稳定剂下比较胰高血糖素衍生物肽(以下“胰高血糖素衍生物”)的稳定性。
使用表1中显示的组分将上述制备例中获得的胰高血糖素衍生物肽的长效缀合物制备成液体制剂(长效缀合物的浓度为187.09nmol/mL)并在25℃下储存6周，然后通过离子交换高效液相色谱法(IE-HPLC)和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)分析其稳定性。
在表2中，IE-HPLC(％)和RP-HPLC(％)表示测量时的面积％除以在保存试验期间的初始面积％的比率(面积％/初始面积％)，表示从胰高血糖素衍生物的长效缀合物的初始浓度(187.09nmol/mL)开始的残留比率。
[表1]
[表2]
*N/D：由于蛋白质沉淀，无法进行分析
从上述结果可以看出，证实具有柠檬酸钠的组成和pH值为5.0的制剂(#1、#4、#7)显示出稳定性。
此外，当包括分别为5％、5％和8％的甘露糖醇、山梨糖醇和蔗糖(其为可以包括以增加具有柠檬酸钠的组成和pH 5.0的制剂的储存稳定性的糖或糖醇)时显示出类似的稳定性。在pH为4.5的比较例1、2和3的情况下，证实在第6周时发生沉淀。
实施例2：评估根据缓冲剂、糖或糖醇的类型的胰高血糖素衍生物的长效缀合物的
稳定性
基于液体制剂的组分(柠檬酸钠、聚山梨醇酯20和甲硫氨酸)，根据缓冲剂的类型和pH比较了胰高血糖素衍生物的长效缀合物的稳定性。其中，根据实施例1中证实的甘露糖醇、山梨醇和蔗糖，比较了胰高血糖素衍生物的长效缀合物的稳定性。具体而言，甘露糖醇、山梨糖醇和蔗糖的浓度是在考虑到商业上可获得的制剂的最大允许范围和许可机构推荐的范围后选择的。
使用表3中显示的组分将上述制备例中获得的胰高血糖素衍生物肽的长效缀合物制备成液体制剂(长效缀合物的浓度为187.09nmol/mL)，并在25℃下保存7周，并且然后通过离子交换高效液相色谱法(IE-HPLC)和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)分析其稳定性。
在表4中，IE-HPLC(％)和RP-HPLC(％)表示测量时的面积％除以保存试验期间的初始面积％的比率(面积％/初始面积％)，表示从胰高血糖素衍生物的长效缀合物的初始浓度(187.09nmol/mL)开始的残留比率。
[表3]
[表4]
*N/D：由于蛋白质沉淀，无法进行分析
从上述结果可以看出，具有乙酸钠的组成和pH 5.0的制剂(#3、#9、#15)和具有组氨酸的组成和pH 5.5的制剂(#5、#11、#17)在25℃下7周内显示出高稳定性。然而，在pH为4.5的组合物的制剂(#2、#8、#14)的情况下证实在7周内发生沉淀。
此外，当包括分别为5％、5％和8％的甘露糖醇、山梨糖醇和蔗糖(其为可以包括以增加储存胰高血糖素衍生物的长效缀合物的稳定性的糖或糖醇)时显示出类似的稳定性。
实施例3：评估根据非离子表面活性剂的类型的胰高血糖素衍生物的长效缀合物
的稳定性
基于实施例1或2中证实的液体制剂(乙酸钠、蔗糖和甲硫氨酸)组分，根据非离子表面活性剂的类型比较了胰高血糖素衍生物的长效缀合物的稳定性。其中，根据实施例1中证实的甘露糖醇、山梨糖醇和蔗糖，比较了胰高血糖素衍生物的长效缀合物的稳定性。具体而言，考虑到商业上可获得的的制剂，选择了作为非离子表面活性剂的聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆188的浓度。
使用表5中显示的组分将上述制备例中获得的胰高血糖素衍生物肽的长效缀合物制备成液体制剂(长效缀合物的浓度为187.09nmol/mL)并在25℃下储存4周，并且然后通过离子交换高效液相色谱法(IE-HPLC)和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)分析其稳定性。
在表6中，IE-HPLC(％)和RP-HPLC(％)表示测量时的面积％除以保存试验期间的初始面积％的比率(面积％/初始面积％)，表示从胰高血糖素衍生物的长效缀合物的初始浓度(187.09nmol/mL)开始的残留比率。
[表5]
[表6]
从上述结果可以看出，证实分别包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆188作为非离子表面活性剂的制剂表现出稳定性。
实施例4：评估根据非离子表面活性剂和氨基酸的存在或不存在的胰高血糖素衍
生物的长效缀合物的稳定性
比较了当液体制剂含有或不含非离子表面活性剂或氨基酸稳定剂时，胰高血糖素衍生物的长效缀合物的稳定性。
使用表7中显示的组分将上述制备例中获得的胰高血糖素衍生物的长效缀合物制备成液体制剂(长效缀合物的浓度为187.09nmol/mL)并在25℃下储存4周，并且然后用离子交换高效液相色谱法(IE-HPLC)和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)分析其稳定性。
在表8中，IE-HPLC(％)和RP-HPLC(％)表示测量时的面积％除以在保存试验期间的初始面积％的比率(面积％/初始面积％)，表示从胰高血糖素衍生物的长效缀合物的初始浓度(187.09nmol/mL)开始的残留比率。
[表7]
[表8]
从上述结果可以看出，证实了含有氨基酸的制剂(#1、#2)显示出稳定性。此外，证实含有非离子表面活性剂的制剂和不包括其的制剂展现出彼此类似的稳定性。
实施例5：评估根据pH值、糖浓度和氨基酸类型的胰高血糖素衍生物的长效缀合物
的稳定性
基于实施例1至4中证实的液体制剂的组分(乙酸钠、蔗糖、聚山梨醇酯20和甲硫氨酸)，根据不发生蛋白质异物或沉淀的pH范围、作为糖的蔗糖浓度以及除甲硫氨酸以外的氨基酸类型评估了胰高血糖素衍生物的长效缀合物的稳定性。
使用表9中显示的组分将上述制备例中获得的胰高血糖素衍生物肽的长效缀合物制备成液体制剂(长效缀合物的浓度为187.09nmol/mL)并在25℃下储存7周，并且然后通过离子交换高效液相色谱法(IE-HPLC)和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)分析其稳定性。
在表10中，IE-HPLC(％)和RP-HPLC(％)表示测量时的面积％除以保存试验期间的初始面积％的比率(面积％/初始面积％)，表示从胰高血糖素衍生物的长效缀合物的初始浓度(187.09nmol/mL)开始的残留比率。
[表9]
[表10]
从上述结果可以看出，当具有乙酸钠的组成作为缓冲剂的制剂的pH值范围为pH4.6至pH 5.0时，具有pH 5.0的组成的制剂(#3)显示出比其他pH的组成更好的稳定性。此外，在具有pH为4.6的制剂(#1)中，当在25℃下储存2周时生成小颗粒，并且在储存5周时小颗粒的数量增加。作为根据蔗糖浓度证实胰高血糖素衍生物的长效缀合物的稳定性的结果，当包含0％(#4)至15％(#8)的蔗糖时，观察到随着蔗糖浓度增加，稳定性越高。
此外，作为根据氨基酸的类型证实胰高血糖素衍生物的长效缀合物的稳定性的结果，证实了在含有精氨酸(#9)、组氨酸(#10)和赖氨酸(#11)的制剂中的稳定性。
即，这些结果表明，根据不同的pH值范围、糖浓度和氨基酸的类型，胰高血糖素衍生物的长效缀合物在本发明的液体制剂的组成中具有稳定性。
从上述内容来看，本发明所涉及领域的技术人员能够理解，本发明可以在不修改本发明的技术概念或基本特征的情况下以其他具体形式体现出来。在这方面，本文公开的示例性实施方式仅用于说明目的，并且不应解释为限制本发明的范围。相反，本发明旨在不仅包括示例性实施方式，而且还包括可能包括在本发明的精神和范围内的各种替代方案、修改方案、等同方案和其他实施方式，如所附的权利要求书所限定。
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<223> 胰高血糖素衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(19)
<223> 在第15和19位的氨基酸形成环
<400> 32
Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu Cys
1 5 10 15
Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 33
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰高血糖素衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa是氨基异丁酸(Aib)
<400> 33
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 34
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰高血糖素衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa是氨基异丁酸(Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 在第16和20位的氨基酸形成环
<400> 34
Trp Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Cys Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 35
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰高血糖素衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa是氨基异丁酸(Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 在第16和20位的氨基酸形成环
<400> 35
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Cys Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 36
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰高血糖素衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa是氨基异丁酸(Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 在第16和20位的氨基酸形成环
<400> 36
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Cys Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 37
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰高血糖素衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa是氨基异丁酸(Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 在第16和20位的氨基酸形成环
<400> 37
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys
20 25 30
<210> 38
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰高血糖素衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa是氨基异丁酸(Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 在第16和20位的氨基酸形成环
<400> 38
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Cys Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 39
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰高血糖素衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa是氨基异丁酸(Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 在第16和20位的氨基酸形成环
<400> 39
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Val Ser Asp Cys Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 40
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰高血糖素衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa是氨基异丁酸(Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 在第16和20位的氨基酸形成环
<400> 40
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Val Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys
20 25 30
<210> 41
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰高血糖素衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa是氨基异丁酸(Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 在第16和20位的氨基酸形成环
<400> 41
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Cys Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 42
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰高血糖素衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa是氨基异丁酸(Aib)
<400> 42
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Cys Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 43
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰高血糖素衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa是氨基异丁酸(Aib)
<400> 43
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Cys Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 44
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰高血糖素衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa是氨基异丁酸(Aib)
<400> 44
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys
20 25 30
<210> 45
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰高血糖素类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa=氨基异丁酸(Aib)
<400> 45
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Cys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 46
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰高血糖素衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)
<223> Xaa是组氨酸、去氨基组氨酸、N-二甲基-组氨酰、β-羟基咪唑丙酰、
4-咪唑乙酰、β-羧基咪唑丙酰、色氨酸或酪氨酸或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa是α-甲基-谷氨酸、氨基异丁酸(Aib)、D-丙氨酸、
甘氨酸、Sar (N-甲基甘氨酸)、丝氨酸或D-丝氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)
<223> Xaa是苏氨酸、缬氨酸或半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)
<223> Xaa是酪氨酸或半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)
<223> Xaa是赖氨酸或半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)
<223> Xaa是酪氨酸或半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)
<223> Xaa是亮氨酸或半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)
<223> Xaa是天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)
<223> Xaa是谷氨酸、天冬氨酸、 丝氨酸、α-甲基-谷氨酸或半胱氨酸或不存在;
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)
<223> Xaa是天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、
丝氨酸、半胱氨酸或缬氨酸或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)
<223> Xaa是丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸,
精氨酸、缬氨酸或半胱氨酸或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)
<223> Xaa是丙氨酸、精氨酸、 丝氨酸、缬氨酸或半胱氨酸或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)
<223> Xaa是赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、
精氨酸、α-甲基-谷氨酸或半胱氨酸或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)
<223> Xaa是天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、缬氨酸或半胱氨酸或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)
<223> Xaa是异亮氨酸、缬氨酸或精氨酸或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)
<223> Xaa是缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、
赖氨酸、谷氨酰胺、α-甲基-谷氨酸或亮氨酸或不存在；
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)
<223> Xaa是异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、
谷氨酰胺或精氨酸或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)
<223> Xaa是谷氨酰胺, 赖氨酸、天冬酰胺或精氨酸或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)
<223> Xaa是赖氨酸、丙氨酸、甘氨酸或苏氨酸或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)
<223> Xaa是半胱氨酸或不存在
<400> 46
Xaa Xaa Gln Gly Thr Phe Xaa Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
<210> 47
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰高血糖素衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa是氨基异丁酸(Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)
<223> Xaa是苏氨酸、缬氨酸或半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)
<223> Xaa是酪氨酸或半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)
<223> Xaa是赖氨酸或半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)
<223> Xaa是天冬氨酸或半胱氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)
<223> Xaa是谷氨酸或丝氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)
<223> Xaa是赖氨酸或精氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)
<223> Xaa是谷氨酰胺或赖氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)
<223> Xaa是天冬氨酸或谷氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)
<223> Xaa是缬氨酸或谷氨酰胺
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)
<223> Xaa是半胱氨酸或不存在
<400> 47
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Xaa Ser Asp Xaa Ser Xaa Tyr Leu Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Arg Ala Xaa Xaa Phe Val Xaa Trp Leu Met Asn Thr Xaa
20 25 30
<210> 48
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 48
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 49
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 49
Ser Cys Pro
1
<210> 50
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 50
Pro Ser Cys Pro
1
<210> 51
<211> 221
<212> PRT
<213> 智人
<400> 51
Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
1 5 10 15
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
20 25 30
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
35 40 45
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
50 55 60
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
65 70 75 80
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
85 90 95
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
100 105 110
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
115 120 125
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
130 135 140
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
145 150 155 160
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
165 170 175
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
180 185 190
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
195 200 205
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215 220
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 52
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 53
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 53
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Pro
1 5 10
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 54
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser
1 5 10
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 55
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
1 5 10
<210> 56
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 56
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser
1 5
<210> 57
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 57
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
1 5
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 58
Glu Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
1 5
<210> 59
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 59
Glu Ser Pro Ser Cys Pro
1 5
<210> 60
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 60
Glu Pro Ser Cys Pro
1 5
<210> 61
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 61
Pro Ser Cys Pro
1
<210> 62
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 62
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 63
Lys Tyr Gly Pro Pro Pro Ser Cys Pro
1 5
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 64
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Ser Cys Pro
1 5
<210> 65
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 65
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
1 5
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 66
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 67
Glu Ser Lys Pro Ser Cys Pro
1 5
<210> 68
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 68
Glu Ser Pro Ser Cys Pro
1 5
<210> 69
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 69
Glu Pro Ser Cys
1
<210> 70
<211> 442
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(442)
<223> 在第1至442位的氨基酸形成 人免疫球蛋白G4 Fc
片段(同源二聚体)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(221)
<223> 在第1至221位的氨基酸形成一个单体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (222)..(442)
<223> 在第222至442位的氨基酸形成一个单体
<220>
<221> DISULFID
<222> (3)..(224)
<223> 在第3和224位的氨基酸形成分子间二硫键
<220>
<221> DISULFID
<222> (35)..(95)
<223> 在第35和95位的氨基酸形成分子内二硫键
<220>
<221> DISULFID
<222> (141)..(199)
<223> 在第141和199位的氨基酸形成链内二硫键
<220>
<221> DISULFID
<222> (256)..(316)
<223> 在第256和316的氨基酸形成链内二硫键
<220>
<221> DISULFID
<222> (362)..(420)
<223> 在第362和420的氨基酸形成链内二硫键
<400> 70
Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
1 5 10 15
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
20 25 30
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
35 40 45
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
50 55 60
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
65 70 75 80
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
85 90 95
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
100 105 110
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
115 120 125
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
130 135 140
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
145 150 155 160
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
165 170 175
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
180 185 190
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
195 200 205
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Pro Ser Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
Claims (31)
1.一种长效缀合物的液体制剂，其中所述液体制剂包括：
18nmol/mL至936nmol/mL的下述化学式1的长效缀合物；
将所述液体制剂的pH维持在4.8至6.5的范围内的量的缓冲剂；和
1.0％(w/v)至20％(w/v)的糖醇、糖或其组合：
[化学式1]
X–La–F
在上述化学式1中，
X为胰高血糖素衍生物肽；
L为接头；
a是0或自然数，条件是当a是2或更大时，每个L是彼此独立的；
F是免疫球蛋白Fc片段；和
–表示共价键：
[通式2]
Y–Aib–QGTF–X7–SD–X10–S–X12–Y–L–X15–X16–X17–R–A–X20–X21–F–V–X24–W–L–M–N–T–X30(通式2，SEQ ID NO：47)
在上述通式2中，
X7是苏氨酸(T)、缬氨酸(V)或半胱氨酸(C)；
X10是酪氨酸(Y)或半胱氨酸(C)；
X12是赖氨酸(K)或半胱氨酸(C)；
X15是天冬氨酸(D)或半胱氨酸(C)；
X16是谷氨酸(E)或丝氨酸(S)；
X17是赖氨酸(K)或精氨酸(R)；
X20是谷氨酰胺(Q)或赖氨酸(K)；
X21是天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)；
X24是缬氨酸(V)或谷氨酰胺(Q)；和
X30是半胱氨酸(C)或不存在(条件是当通式2的氨基酸序列与SEQ ID NO：1和SEQIDNO：12相同时，不包括在内)。
2.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述肽是选自SEQ ID NO：2至11和13至45的任一种氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述肽是选自SEQ ID NO：13、15和36至44的任一种氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述肽是SEQ ID NO：37。
5.根据权利要求1所述的液体制剂，其中X在C-末端被酰胺化。
6.根据权利要求1所述的液体制剂，其中X经由半胱氨酸的硫原子被连接。
7.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc片段源自IgG4。
8.根据权利要求1所述的液体制剂，其中F是其中两条多肽链通过二硫键连接并且仅通过两条链中的一条中的氮原子连接的结构。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的液体制剂，其中F是SEQ ID NO：51的氨基酸序列的单体的同源二聚体。
10.根据权利要求8所述的液体制剂，其中F通过在其N-末端的脯氨酸的氮原子连接。
11.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc片段和X是非糖基化的。
12.根据权利要求1所述的液体制剂，其中L是聚乙二醇。
13.根据权利要求1所述的液体制剂，其中L中乙二醇重复单元部分的分子量在1kDa至100kDa的范围内。
14.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述缓冲剂选自柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐以及其组合。
15.根据权利要求14所述的液体制剂，其中所述缓冲剂是乙酸及其盐。
16.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述液体制剂的pH为4.8至6.5。
17.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述液体制剂的pH为4.8至6.0。
18.根据权利要求17所述的液体制剂，其中所述液体制剂的pH为4.8至5.5。
19.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述缓冲剂的浓度为5mM至100mM，用于将所述液体制剂的pH维持在4.8至6.5的范围内。
20.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述糖是葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖或其组合。
21.根据权利要求20所述的液体制剂，其中所述糖是蔗糖。
22.根据权利要求20所述的液体制剂，其中所述糖以3％(w/v)至15％(w/v)的浓度存在。
23.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述糖醇是选自甘露糖醇和山梨糖醇中的一种或多种。
24.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述液体制剂进一步包括选自非离子表面活性剂和氨基酸的一种或多种组分。
25.根据权利要求24所述的液体制剂，其中所述非离子表面活性剂在所述液体制剂中以0.01％(w/v)至0.1％(w/v)的浓度包含。
26.根据权利要求24所述的液体制剂，其中所述非离子表面活性剂是泊洛沙姆、聚山梨醇酯或其组合。
27.根据权利要求26所述的液体制剂，其中所述非离子表面活性剂选自泊洛沙姆188、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80，以及其组合。
28.根据权利要求24所述的液体制剂，其中所述氨基酸进一步包括选自甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、赖氨酸以及其组合的稳定剂。
29.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述液体制剂不包括等渗剂。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的液体制剂，其中所述液体制剂包括：
90nmol/mL至562nmol/mL的化学式1的肽缀合物；
5mM至25mM的选自柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐以及其组合的缓冲剂，使得所述液体制剂的pH为4.8至5.5；
1％(w/v)至20％(w/v)的糖醇、糖或其组合；
0.01％(w/v)至0.1％(w/v)的选自泊洛沙姆、聚山梨醇酯或其组合的非离子表面活性剂；和
0.01mg/mL至1mg/mL的选自甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、赖氨酸以及其组合的稳定剂。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的液体制剂，其中所述液体制剂包括：
90nmol/mL至562nmol/mL的化学式1的肽缀合物；
5mM至25mM的选自柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐以及其组合的缓冲剂，使得所述液体制剂的pH为4.8至5.5；
4％(w/v)至10％(w/v)的糖；
0.01％(w/v)至0.1％(w/v)的选自泊洛沙姆、聚山梨醇酯或其组合的非离子表面活性剂；和
0.01mg/mL至1mg/mL的选自甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、赖氨酸以及其组合的稳定剂。
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