JP2004059574A - インターロイキン２１を用いた免疫治療用医薬組成物 - Google Patents
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Abstract
【課題】強い副作用を惹起しない、サイトカインを用いた免疫治療用医薬組成物を提供すること。
【解決手段】ＩＬ−２１遺伝子を単独または他のサイトカインと組み合わせてｉｎ ｖｉｖｏ導入することにより、生体レベルでの強い抗腫瘍効果を得ることができる。
【選択図】 なし
【解決手段】ＩＬ−２１遺伝子を単独または他のサイトカインと組み合わせてｉｎ ｖｉｖｏ導入することにより、生体レベルでの強い抗腫瘍効果を得ることができる。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インターロイキン２１（ＩＬ−２１）を有効成分として含有する免疫治療用医薬組成物に関する。さらに詳細には、本発明は腫瘍若しくは転移性腫瘍の治療剤としてまたは腫瘍の転移抑制剤として用いる免疫治療用医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
悪性腫瘍に対する治療として、さまざまなサイトカインやサイトカイン遺伝子を用いて抗腫瘍免疫を高めることにより腫瘍細胞を攻撃するという、いわゆる免疫療法、免疫遺伝子療法が試みられている。たとえばＩＬ−１２は強力なＴｈ１誘導作用、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）とナチュラル・キラー細胞（ＮＫ細胞）の活性化作用を有し、免疫療法に広く用いられている。しかしながら、これら免疫療法は、マウスの腫瘍に対してはある程度有効であっても、ヒト患者の腫瘍には有効でない場合がほとんどであった。さらに、悪性腫瘍の治療の最大の問題は転移を抑制し転移巣を治療することにあるが、これら免疫療法で転移に対して有効であったものは多くない。また、上述のＩＬ−１２をはじめ、サイトカインを用いた免疫療法には通常強い副作用があり、そのために腫瘍に対して有効な用量を投与することができない場合が多かった。
【０００３】
ＩＬ−２１タンパク質は活性化Ｔ細胞から分泌されるサイトカインである。Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋ Ｊ．らによりｃＤＮＡが単離され、２０００年１１月の論文（非特許文献１）で、または特許文献１でその遺伝子配列が発表された。この論文には、ＩＬ−１５との協調作用、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞の増殖・分化促進活性等が報告されており、その機能は重要であると考えられている。しかしながら、それ以後現在に至るまで、このサイトカインの生理機能に関する報告はほとんどない。とくに、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＩＬ−２１の生理作用についてはほとんど明らかにされていない。さらに疾患モデル動物に対してＩＬ−２１タンパク質、またはその遺伝子を投与して治療効果を検討したという報告は全くなされていない。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２１ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｒｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ＮＫ ｃｅｌｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．”， Ｎａｔｕｒｅ， ２０００ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２， ４０８ （６８０８）， ５７−６３
【特許文献１】
米国特許第６，３０７，０２４号明細書
【非特許文献２】
Ｗｏｌｆｆ， Ｊ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｄｉｒｅｃｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｍｏｕｓｅ ｍｕｓｃｌｅ ｉｎ ｖｉｖｏ．”， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９０ Ｍａｒｃｈ ２３， ２４７ （４９４９ Ｐｔ １）， １４６５−１４６８
【非特許文献３】
Ｌｉｕ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃｓ−ｂａｓｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｎｉｍａｌｓ ｂｙ ｓｙｓｔｅｍｉｃａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ．”， Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ， １９９９ Ｊｕｌｙ， ６ （７）， １２５８−１２６６
【非特許文献４】
Ｃｕｉ， Ｆ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｍｕｒｉｎｅ ｌｉｖｅｒ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｂｙ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｋｅｄ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ （ＥＢＶ）−ｂａｓｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒｓ．”， Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ， ２００１ Ｏｃｔｏｂｅｒ， ８ （１９）， １５０８−１５１３
【非特許文献５】
Ｚｈａｎｇ， Ｇ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎａｋｅｄ ＤＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｉｎｔｒａａｒｔｅｒｉａｌｌｙ ｔｏ ｌｉｍｂ ｍｕｓｃｌｅｓ ｏｆ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ．”， Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ， ２００１ Ｍａｒｃｈ １， １２ （４）， ４２７−４３８
【非特許文献６】
Ｋａｐｌｉｔｔ， Ｍ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｒａｉｎ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｖｉａ ａ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ．”， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， １９９１， ２， ３２０−３３０
【非特許文献７】
Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ， Ｌ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｍｏｕｓｅ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅｓ ａｎｄ ｈｅａｒｔ．”， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ， １９９２ Ａｕｇｕｓｔ， ９０ （２）， ６２６−６３０
【非特許文献８】
Ｓａｍｕｌｓｋｉ， Ｒ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， ”Ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｆｒｏｍ ｗｈｉｃｈ ａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅ ｃａｎ ｂｅ ｅｘｃｉｓｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １９８７ Ｏｃｔｏｂｅｒ， ６１ （１０）， ３０９６−３１０１
【非特許文献９】
Ｓａｍｕｌｓｋｉ， Ｒ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｈｅｌｐｅｒ−ｆｒｅｅ ｓｔｏｃｋｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ： ｎｏｒｍａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｒｅｑｕｉｒｅ ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １９８９ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ， ６３ （９）， ３８２２−３８２８
【特許文献２】
米国特許第５，３９９，３４６号明細書
【特許文献３】
米国特許第４，６５０，７６４号明細書
【特許文献４】
米国特許第４，９８０，２８９号明細書
【特許文献５】
米国特許第５，１２４，２６３号明細書
【特許文献６】
国際公開第９５／０７３５８号パンフレット
【非特許文献１０】
Ｍａｎｎ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｈｅｌｐｅｒ−ｆｒｅｅ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ．”， Ｃｅｌｌ， １９８３ Ｍａｙ， ３３ （１）， １５３−１５９
【非特許文献１１】
Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， ”Ａ ｓａｆｅ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｌｉｎｅ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ： ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅｓ ｏｎ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｌａｓｍｉｄｓ．”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １９８８ Ａｐｒｉｌ， ６２ （４）， １１２０−１１２４
【非特許文献１２】
Ｋｕｏ， Ｍ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｐｒｉｍａｒｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｏｂｖｉａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｎｅｅｄ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．”， Ｂｌｏｏｄ， １９９３ Ａｕｇｕｓｔ １， ８２ （３）， ８４５−８５２
【非特許文献１３】
Ｆｅｌｇｎｅｒ， Ｐ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ： ａ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ， ｌｉｐｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＤＮＡ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ．”， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ， １９８７ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ， ８４ （２１）， ７４１３−７４１７
【非特許文献１４】
Ｍａｃｈｙ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｒｏｍ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｔｏ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．”， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ， １９８８ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ， ８５ （２１）， ８０２７−８０３１
【非特許文献１５】
Ｍａｒｕｙａｍａ−Ｔａｂａｔａ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， ”Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｙ ＥＢＶ−ｂａｓｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅ ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ．”， Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ， ２０００ Ｊａｎｕａｒｙ， ７ （１）， ５３−６０
【非特許文献１６】
Ｋｉｓｈｉｄａ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， ”Ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１８ ｇｅｎｅｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓａｇａｉｎｓｔ ｍｅｌａｎｏｍａ ｉｎ ｍｉｃｅ．”， Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ， ２００１ Ａｕｇｕｓｔ， ８ （１６）， １２３４−１２４０
【非特許文献１７】
Ｗｉｌｓｏｎ， Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｌｅａｄｓ ｔｏｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ ｉｎ ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｒａｂｂｉｔｓ．”， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９２ Ｊａｎｕａｒｙ １５， ２６７ （２）， ９６３−９６７
【非特許文献１８】
Ｗｕ， Ｇ．Ｙ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ．”， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９８８ Ｏｃｔｏｂｅｒ １５， ２６３ （２９）， １４６２１−１４６２４
【非特許文献１９】
Ａｓａｄａ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｏ ｓｅｃｒｅｔｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ （ＩＬ）−１２ ａｎｄ ＩＬ−１８ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ＥＢＶ／ｌｉｐｏｐｌｅｘ．”， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ， ２００２ Ｍａｙ， ５ （５）： ６０９−６１６
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、悪性腫瘍に対するサイトカインを用いた免疫療法はヒトの腫瘍には有効でない場合が多く、転移に対して有効な療法も多くなかった。また、サイトカインを用いた免疫療法には通常強い副作用を伴うという問題があった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは上記問題を解決するため種々の検討を行った。その結果、本発明者らは、ＩＬ−２１遺伝子を単独または他のサイトカインと組み合わせてｉｎ ｖｉｖｏ導入することにより、生体レベルでの強い抗腫瘍効果を達成できることを見出した。本発明はこの知見に基づき完成したものである。
【０００７】
したがって、本発明は、原発性または転移性腫瘍の治療、転移の予防、腫瘍の再発の予防に有効な免疫治療用医薬組成物を提供することを目的とする。
すなわち、本発明は、ＩＬ−２１を有効成分として含有する免疫治療用医薬組成物を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本明細書において、「ＩＬ−２１」とは、タンパク質だけでなく遺伝子も含むものとする。すなわち、「ＩＬ−２１」はＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−２１遺伝子を意味する。他のサイトカインについても同様とする。
【０００９】
ＩＬ−２１タンパク質は、ＩＬ−１５タンパク質と協調的に働いてＮＫ細胞を活性化するだけでなく、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞の増殖にも関与しており、これら免疫細胞の分化にかかわる因子としてもその機能は重要であると考えられている。
【００１０】
本発明の免疫治療用医薬組成物は、ＩＬ−２１を有効成分として含有する。ＩＬ−２１は単独で用いることもできるが、他のサイトカインやケモカインと組合わせて用いることもできる。他のサイトカインと組合わせて用いる場合、これらを同時に、連続して、または適当な間隔をおいて導入することができる。好ましいサイトカインとしては、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８が挙げられる。ＩＬ−２１および他のサイトカインは遺伝子でもタンパク質でもよい。
【００１１】
本発明の免疫治療用医薬組成物は、腫瘍に局所投与することにより抗腫瘍免疫応答を誘導し、その腫瘍、または遠隔の腫瘍を認識、攻撃、排除し、あるいは転移を抑制することができる。また腫瘍以外の正常臓器（たとえば肝）に投与することにより抗腫瘍効果を得ることもできる。
【００１２】
またＩＬ−２１を発現する細胞、またはあらかじめＩＬ−２１遺伝子を導入することによりＩＬ−２１を発現するように加工した細胞を含む細胞製剤として、腫瘍局所または他の臓器（たとえば肝臓）に導入することもできる。その際、ＩＬ−２１とともに少なくとも１種の他のサイトカインを発現するように加工した細胞を含む細胞製剤を用いることもできる。
【００１３】
本発明の免疫治療用医薬組成物の抗腫瘍効果は、ＩＬ−２１がＮＫ細胞に直接作用して増殖させ、それと同時にＮＫ細胞の活性化を促すことによる。活性化したＮＫ細胞は腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する分子であるＦａｓリガンド、ＴＲＡＩＬの発現を増強し、その結果、ＮＫ細胞をエフェクターとした強い抗腫瘍効果を得ることができる。また、ＩＬ−２１はＴ細胞にも作用して、特異的な抗腫瘍効果も誘導することができる。さらに、ＩＬ−２１と種々のサイトカインを組合わせて用いることにより、相乗的な抗腫瘍効果を得ることもできる。
【００１４】
また、本発明の免疫治療用医薬組成物は、他のサイトカインに比べて非常に副作用が少ないと考えられる。たとえばＩＬ−１２遺伝子をｎａｋｅｄ ＤＮＡ法にてマウスに注入すると、その用量を上げていくに従い、マウスは脾腫大と体重減少を呈し死に至る。しかしながら、本発明者らが試みた範囲では、ＩＬ−２１では全くそのような重篤な副作用は起こらなかった。このことからＩＬ−２１は、副作用を伴うことなく強い抗腫瘍免疫応答を誘導できると考えられる。したがって、本発明の免疫治療用医薬組成物は、腫瘍の免疫療法に非常に有用である。
【００１５】
本発明の免疫治療用医薬組成物はヒト、またはヒト以外の哺乳動物に用いることができる。
本発明の免疫治療用医薬組成物は、ＩＬ−２１を腫瘍細胞内または正常組織細胞内にｉｎ ｖｉｖｏ導入し、生体内の免疫細胞を活性化することによって、局所腫瘍または転移性腫瘍の治療、および転移抑制に用いることができる。
【００１６】
ＩＬ−２１遺伝子を含む本発明の免疫治療用医薬組成物は、ｎａｋｅｄ ＤＮＡ法にて導入することができるが、これらに限定されるものではない。たとえばＷｏｌｆｆらは、骨格筋にプラスミドＤＮＡを注入すると、筋細胞に遺伝子導入できることを見出した（非特許文献２参照）。Ｌｉｕらは、プラスミド・ベクターを流体力学的にマウスに注入すると、肝臓に高率に遺伝子を発現させることを報告した（ハイドロダイナミクス法）（非特許文献３参照）。発明者らは，エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）由来のプラスミド・ベクターをこのハイドロダイナミクス法にて導入すると、さらに発現が上昇し且つ延長することを報告した（非特許文献４参照）（下記実施例もハイドロダイナミクス法にて行っている）。
Ｚｈａｎｇらは、骨格筋もハイドロダイナミクス法にて導入可能であることを、サルを用いた実験で示した（非特許文献５参照）。
【００１７】
ＩＬ−２１遺伝子を含む免疫治療用医薬組成物はまた、ＤＮＡウイルス由来のベクター、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パピローマウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのウイルス由来のベクターを用いることもできる。しかし、これらに限定されるものではない。ウイルスの複製に必須の遺伝子を欠失させたｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔなウイルスを用いることが好ましい。ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔなウイルスは、細胞に導入後は感染性を有するウイルス粒子を産生しないため、適切な投与法を選べば目的外の細胞に感染することなく局所的に投与することが可能である。他方、ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔなウイルスベクターを用いることもできる。ＤＮＡウイルスベクターの例としては、欠陥単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）ベクター（非特許文献６参照）；アデノウイルスベクター（例えば非特許文献７に記載されたもの）；及びアデノ随伴ウイルスベクター（非特許文献８及び非特許文献９参照）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
ＩＬ−２１遺伝子を含む本発明の免疫治療用医薬組成物はまた、レトロウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどのＲＮＡウイルスを用いて生体内に導入することもできる。例えば、特許文献２〜６、非特許文献１０〜１２に記載されたベクターを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
また、ＩＬ−２１遺伝子を含む本発明の免疫治療用医薬組成物をカチオニックリポソーム、カチオニックリピッドやカチオニックポリマー等の合成ベクターを用いて調製することもできる（非特許文献１３〜１５参照）。合成ベクターはウイルス性ベクターに比し、工業的に生産でき、また作製・保存・輸送・使用が容易でコストも低くできるため、医薬品として用いる上で大きなメリットがある。
さらに、ウイルス性ベクターに比し、免疫原性が低くまた副作用が少ないものが多い。脂質等にペプチド（例えばホルモン又は神経伝達物質）、抗体（例えば抗トランスフェリンレセプター抗体）などのタンパク質、又は非ペプチド性分子を化学的に結合させ、標的細胞をターゲティングすることもできる。
【００２０】
ＩＬ−２１遺伝子を含む本発明の免疫治療用医薬組成物はまた、電気穿孔法、遺伝子銃等の物理的な原理を応用した非ウイルス的手法にて、腫瘍、または他臓器にｉｎ ｖｉｖｏ導入することができる（たとえば非特許文献１６参照）。これらの方法により、生体内の限局した部位（たとえば腫瘍の一部）に遺伝子導入することができる。
【００２１】
ＩＬ−２１タンパク質を含む本発明の免疫治療用医薬組成物を生体に投与する場合は、経口的にあるいは直腸内、皮下、髄腔内、筋肉内、静脈内、動脈内、経皮等、非経口的に投与することができるが、好ましくは経口的にあるいは静脈内に投与するのがよい。
【００２２】
ＩＬ−２１タンパク質を含む本発明の免疫治療用医薬組成物を生体に投与する場合、適当な剤型に製剤化して用いるのが好ましく、例えば錠剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤、チュワブル剤、液剤、乳剤、懸濁剤、坐剤、シロップ剤、ローション剤、軟膏剤、パップ剤等の製剤で用いることができる。これらの剤型に製剤化するには薬学上許容しうる適当な担体、賦形剤、添加剤等を用いて行うことができる。
【００２３】
静脈内投与する際に好ましい剤型は液剤であり、液剤を調製するには、例えば精製水、生理食塩水、エタノール・プロピレングリコール・グリセリン・ポリエチレングリコール等のアルコール類、トリアセチン等の溶媒を用いて行うことができる。このような製剤にはさらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定剤のような補助剤を加えても良い。また懸濁剤として投与することも可能である。
【００２４】
また錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、トローチ剤、チュワブル剤等の固形製剤を調製するには、例えば重炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、デンプン、ショ糖、マンニトール、カルボキシメチルセルロース等の担体、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、グリセリン等の添加剤を加えて常法により行うことができる。またセルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ポリビニルアルコールフタレート、スチレン−無水マレイン酸共重合体、メタクリル酸−メタクリル酸メチル共重合体等の腸溶性物質の有機溶媒あるいは水中溶液を吹き付けて、腸溶性被膜を施して、腸溶性製剤として製剤化することもできる。薬学上許容しうる担体には、その他通常、必要により用いられる補助剤、芳香剤、安定剤あるいは防腐剤を含む。
【００２５】
投与頻度は、月１回投与から連日投与が可能であり、好ましくは１回／２週から５回／週程度もしくは連日投与である。特に、持続的投与が好ましい。
投与量は、病態、重症度などにより異なるが、０．１〜１０００μｇ／ｋｇ／ｄａｙであり、好ましくは０．５〜２０μｇ／ｋｇ／ｄａｙである。
【００２６】
細胞にｅｘ ｖｉｖｏでＩＬ−２１遺伝子を含むベクターを導入し、形質転換細胞を生体内に戻すことも可能である。この細胞としては、患者から得た腫瘍細胞やその他臓器等由来の細胞（線維芽細胞、リンパ球など）、アロまたは異種細胞、あるいは培養細胞株（３Ｔ３細胞など）等を用いることができる。ベクターは、所望の宿主細胞に、公知の方法にしたがって導入することができる。例えば、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、レトロウイルスベクター等のウイルスベクターを用いる方法や、リポフェクション、ポリフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子銃等の非ウイルス的導入方法により、導入が可能である（非特許文献１７〜１９参照）。ＩＬ−２１遺伝子と共に薬剤耐性遺伝子を導入し、遺伝子導入後の細胞に薬剤選択を行うことにより、ＩＬ−２１高発現細胞を選別することができる。非選別、または選別後の形質転換細胞は、放射線照射等により増殖能を失わせてから患者に移植することができる。または有孔膜、有孔カプセル等の中に形質転換細胞を封入してから移植することができる。移植する部位としては、腫瘍内、他臓器内（たとえば皮下）、または体腔内（たとえば腹腔内）に移植することができる。
【００２７】
本発明の免疫治療用医薬組成物を用いることにより、原発性または転移性腫瘍の治療、転移の予防、腫瘍の再発の予防を可能にする。
【００２８】
【実施例】
以下の実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００２９】
【実施例１】
ＮＫ細胞活性
以下のようにして、５１Ｃｒリリースアッセイ法によりＮＫ細胞活性を測定した。エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来のプラスミドベクターに、マウスＩＬ−１５遺伝子（ｍＩＬ−１５）、マウスＩＬ−２１遺伝子（ｍＩＬ−２１）、またはｍＩＬ−１５およびｍＩＬ−２１（ｍＩＬ−１５＋ｍＩＬ−２１）を組み込んだ発現ユニットを有するプラスミドベクター各２５μｇを、１．６ｍｌの生理食塩水にそれぞれ溶解し、８週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（メス、Ｎ＝３）の尾静脈より高圧下で５秒以内に注入した。コントロールとしてサイトカイン遺伝子を含まないＥＢＶ由来のプラスミドベクターを用いた。注入後４８時間または７２時間に脾臓よりリンパ球を回収し、これをエフェクター細胞Ｅとした。５１ＣｒでラベルしたＹＡＣ−１（マウスリンパ腫の細胞株）を標的細胞（Ｔ）としてＥ／Ｔ比を１００：１、５０：１、２５：１及び１２．５：１に調製し、マイクロプレート上で４時間反応させた。反応後、破壊されたＴより放出された５１Ｃｒの放射活性をγ−カウンターで測定した。５１Ｃｒの特異的放出は次式により求めた。
％（５１Ｃｒ特異的放出）＝［（ＮＫ細胞による放出−非特異的放出）／（最大放出−非特異的放出）］×１００
統計的有意差はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔを用いて評価した。図１（ａ）から明らかなように、コントロール群と比較して、ｍＩＬ−２１群およびｍＩＬ−１５群において、遺伝子導入後４８時間でＮＫ細胞活性の有意な亢進が認められた（それぞれ、ｐ＜０．０５及びｐ＜０．００１）。ｍＩＬ−１５＋ｍＩＬ−２１群においてはさらに強力なＮＫ細胞活性の亢進が認められた（ｐ＜０．００１）。
【００３０】
【実施例２】
ＦＡＣＳ解析
実施例１と同様の系を用いて、注入４８時間後の肝臓のリンパ球を比重遠心法で分離採取し、フローサイトメトリーにて以下の解析を行った。
（１）ＮＫ細胞
ＮＫ細胞の表面マーカーを解析したところ、図２に示すように、ｍＩＬ−２１群、ｍＩＬ−１５群では、ＮＫ細胞の顕著な増殖が認められた。
（２）Ｆａｓリガンド陽性細胞
Ｆａｓリガンド陽性細胞を解析した結果を図３に示す。ｍＩＬ−２１群では、Ｆａｓリガンド陽性細胞数が増加していたが、ｍＩＬ−１５群では、そのような変化は認められなかった。
（３）ＴＲＡＩＬ陽性細胞
ｍＩＬ−２１＋ｍＩＬ−１５群では、ＴＲＡＩＬ陽性細胞の有意な増加が認められたが、いずれの遺伝子においても単独導入では、そのような現象は認められなかった（図４）。
【００３１】
【実施例３】
転移抑制
実施例１と同様の系を用いて（Ｎ＝５）、各発現ベクターの注入１２時間後にＲＬ♂１（マウスリンパ腫の細胞株）を尾静脈より１×１０４個移植した。移植２週間後に、マウスの肝臓を摘出し、肝臓表面の転移巣を数えてＩＬ−２１による転移抑制効果を検討した。結果を図５に示す。統計的有意差はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔを用いて評価した。ｍＩＬ−２１群およびｍＩＬ−１５群において転移巣の数はそれぞれ減少し、ｍＩＬ−１５群ではその差は有意であった（ｐ＜０．０５）。また、ｍＩＬ−２１＋ｍＩＬ−１５群では、肝臓表面の転移巣は全く認められなかった（ｐ＜０．０５）。
【００３２】
【実施例４】
生存率
（１）リンパ腫移植前導入
実施例３と同様にして各発現ベクターの注入後にＲＬ♂１を移植し、マウスの生存率について検討した。図６から明らかなように、ｍＩＬ−２１群およびｍＩＬ−１５群においても延命効果が認められたが、ｍＩＬ−２１＋ｍＩＬ−１５群では、さらに強力な延命効果が認められた。Ｌｏｇｒａｎｋ ｔｅｓｔ（Ｎ＝５）により、コントロール群との差を比較したところ、ｍＩＬ−２１群およびｍＩＬ−１５群では有意差がｐ＜０．０５であった。一方、ｍＩＬ−２１＋ｍＩＬ−１５群では、ｐ＜０．０１であった。
（２）リンパ腫移植後導入
Ｂａｌｂ／ｃマウスの尾静脈よりＲＬ♂１を１×１０４個移植した５日後に、実施例１と同様にして各発現ベクターを尾静脈より注入した。その後のマウスの生存率を観察したところ、コントロール群は２０日以内に全例死亡したのに対し、ｍＩＬ−２１＋ｍＩＬ−１５群では著明な延命効果を示した（図７）。Ｌｏｇｒａｎｋ ｔｅｓｔ（Ｎ＝５）により、コントロール群との差を比較したところ、ｍＩＬ−１５群およびｍＩＬ−２１＋ｍＩＬ−１５群の有意差はｐ＜０．０５であった。
【００３３】
【実施例５】
炎症性サイトカインの発現
実施例１と同様の系を用いて、各発現ベクターの注入４８時間後に、末梢血清中のサイトカイン濃度をＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。実施例１から明らかなように、脾臓におけるＮＫ細胞活性は上昇しているにもかかわらず、ｍＩＬ−２１群、ｍＩＬ−１５群、ｍＩＬ−２１＋ｍＩＬ−１５群のそれぞれにおいて、炎症性サイトカインであるｍＩＮＦγ、ＧＭ−ＣＳＦおよびｍＩＬ−４の発現の亢進は認められなかった（図８）。
【００３４】
【発明の効果】
ＩＬ−２１は、副作用を伴うことなく強い抗腫瘍免疫応答を誘導することが可能である。したがって、本発明の免疫治療用医薬組成物は、腫瘍の免疫療法に非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】マウスにＩＬ−２１遺伝子および／またはＩＬ−１５遺伝子を導入したときのＮＫ細胞活性の亢進を示すグラフである。
【図２】マウスにＩＬ−２１遺伝子またはＩＬ−１５遺伝子を導入したときのＮＫ細胞数の増加について、ＦＡＣＳ解析を行った結果を示す図である。
【図３】マウスにＩＬ−２１遺伝子および／またはＩＬ−１５遺伝子を導入したときのＦａｓリガンド陽性細胞数の増加について、ＦＡＣＳ解析を行った結果を示す図である。
【図４】マウスにＩＬ−２１遺伝子および／またはＩＬ−１５遺伝子を導入したときのＴＲＡＩＬ陽性細胞数の増加について、ＦＡＣＳ解析を行った結果を示す図である。
【図５】マウスにＩＬ−２１遺伝子および／またはＩＬ−１５遺伝子を導入したときの腫瘍転移抑制効果を示すグラフである。
【図６】マウスにＩＬ−２１遺伝子および／またはＩＬ−１５遺伝子を導入後、リンパ腫細胞を移植したときの生存率を示すグラフである。
【図７】マウスにリンパ腫細胞を移植後、ＩＬ−２１遺伝子および／またはＩＬ−１５遺伝子を導入したときの生存率を示すグラフである。
【図８】マウスにＩＬ−２１遺伝子および／またはＩＬ−１５遺伝子を導入したときの炎症性サイトカインの発現への影響を示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、インターロイキン２１（ＩＬ−２１）を有効成分として含有する免疫治療用医薬組成物に関する。さらに詳細には、本発明は腫瘍若しくは転移性腫瘍の治療剤としてまたは腫瘍の転移抑制剤として用いる免疫治療用医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
悪性腫瘍に対する治療として、さまざまなサイトカインやサイトカイン遺伝子を用いて抗腫瘍免疫を高めることにより腫瘍細胞を攻撃するという、いわゆる免疫療法、免疫遺伝子療法が試みられている。たとえばＩＬ−１２は強力なＴｈ１誘導作用、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）とナチュラル・キラー細胞（ＮＫ細胞）の活性化作用を有し、免疫療法に広く用いられている。しかしながら、これら免疫療法は、マウスの腫瘍に対してはある程度有効であっても、ヒト患者の腫瘍には有効でない場合がほとんどであった。さらに、悪性腫瘍の治療の最大の問題は転移を抑制し転移巣を治療することにあるが、これら免疫療法で転移に対して有効であったものは多くない。また、上述のＩＬ−１２をはじめ、サイトカインを用いた免疫療法には通常強い副作用があり、そのために腫瘍に対して有効な用量を投与することができない場合が多かった。
【０００３】
ＩＬ−２１タンパク質は活性化Ｔ細胞から分泌されるサイトカインである。Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋ Ｊ．らによりｃＤＮＡが単離され、２０００年１１月の論文（非特許文献１）で、または特許文献１でその遺伝子配列が発表された。この論文には、ＩＬ−１５との協調作用、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞の増殖・分化促進活性等が報告されており、その機能は重要であると考えられている。しかしながら、それ以後現在に至るまで、このサイトカインの生理機能に関する報告はほとんどない。とくに、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＩＬ−２１の生理作用についてはほとんど明らかにされていない。さらに疾患モデル動物に対してＩＬ−２１タンパク質、またはその遺伝子を投与して治療効果を検討したという報告は全くなされていない。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２１ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｒｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ＮＫ ｃｅｌｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．”， Ｎａｔｕｒｅ， ２０００ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２， ４０８ （６８０８）， ５７−６３
【特許文献１】
米国特許第６，３０７，０２４号明細書
【非特許文献２】
Ｗｏｌｆｆ， Ｊ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｄｉｒｅｃｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｍｏｕｓｅ ｍｕｓｃｌｅ ｉｎ ｖｉｖｏ．”， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９０ Ｍａｒｃｈ ２３， ２４７ （４９４９ Ｐｔ １）， １４６５−１４６８
【非特許文献３】
Ｌｉｕ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃｓ−ｂａｓｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｎｉｍａｌｓ ｂｙ ｓｙｓｔｅｍｉｃａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ．”， Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ， １９９９ Ｊｕｌｙ， ６ （７）， １２５８−１２６６
【非特許文献４】
Ｃｕｉ， Ｆ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｍｕｒｉｎｅ ｌｉｖｅｒ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｂｙ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｋｅｄ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ （ＥＢＶ）−ｂａｓｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒｓ．”， Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ， ２００１ Ｏｃｔｏｂｅｒ， ８ （１９）， １５０８−１５１３
【非特許文献５】
Ｚｈａｎｇ， Ｇ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎａｋｅｄ ＤＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｉｎｔｒａａｒｔｅｒｉａｌｌｙ ｔｏ ｌｉｍｂ ｍｕｓｃｌｅｓ ｏｆ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ．”， Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ， ２００１ Ｍａｒｃｈ １， １２ （４）， ４２７−４３８
【非特許文献６】
Ｋａｐｌｉｔｔ， Ｍ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｒａｉｎ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｖｉａ ａ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ．”， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， １９９１， ２， ３２０−３３０
【非特許文献７】
Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ， Ｌ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｍｏｕｓｅ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅｓ ａｎｄ ｈｅａｒｔ．”， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ， １９９２ Ａｕｇｕｓｔ， ９０ （２）， ６２６−６３０
【非特許文献８】
Ｓａｍｕｌｓｋｉ， Ｒ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， ”Ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｆｒｏｍ ｗｈｉｃｈ ａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅ ｃａｎ ｂｅ ｅｘｃｉｓｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １９８７ Ｏｃｔｏｂｅｒ， ６１ （１０）， ３０９６−３１０１
【非特許文献９】
Ｓａｍｕｌｓｋｉ， Ｒ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｈｅｌｐｅｒ−ｆｒｅｅ ｓｔｏｃｋｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ： ｎｏｒｍａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｒｅｑｕｉｒｅ ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １９８９ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ， ６３ （９）， ３８２２−３８２８
【特許文献２】
米国特許第５，３９９，３４６号明細書
【特許文献３】
米国特許第４，６５０，７６４号明細書
【特許文献４】
米国特許第４，９８０，２８９号明細書
【特許文献５】
米国特許第５，１２４，２６３号明細書
【特許文献６】
国際公開第９５／０７３５８号パンフレット
【非特許文献１０】
Ｍａｎｎ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｈｅｌｐｅｒ−ｆｒｅｅ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ．”， Ｃｅｌｌ， １９８３ Ｍａｙ， ３３ （１）， １５３−１５９
【非特許文献１１】
Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， ”Ａ ｓａｆｅ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｌｉｎｅ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ： ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅｓ ｏｎ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｌａｓｍｉｄｓ．”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １９８８ Ａｐｒｉｌ， ６２ （４）， １１２０−１１２４
【非特許文献１２】
Ｋｕｏ， Ｍ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｐｒｉｍａｒｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｏｂｖｉａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｎｅｅｄ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．”， Ｂｌｏｏｄ， １９９３ Ａｕｇｕｓｔ １， ８２ （３）， ８４５−８５２
【非特許文献１３】
Ｆｅｌｇｎｅｒ， Ｐ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ： ａ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ， ｌｉｐｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＤＮＡ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ．”， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ， １９８７ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ， ８４ （２１）， ７４１３−７４１７
【非特許文献１４】
Ｍａｃｈｙ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｒｏｍ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｔｏ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．”， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ， １９８８ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ， ８５ （２１）， ８０２７−８０３１
【非特許文献１５】
Ｍａｒｕｙａｍａ−Ｔａｂａｔａ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， ”Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｙ ＥＢＶ−ｂａｓｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅ ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ．”， Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ， ２０００ Ｊａｎｕａｒｙ， ７ （１）， ５３−６０
【非特許文献１６】
Ｋｉｓｈｉｄａ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， ”Ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１８ ｇｅｎｅｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓａｇａｉｎｓｔ ｍｅｌａｎｏｍａ ｉｎ ｍｉｃｅ．”， Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ， ２００１ Ａｕｇｕｓｔ， ８ （１６）， １２３４−１２４０
【非特許文献１７】
Ｗｉｌｓｏｎ， Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｌｅａｄｓ ｔｏｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ ｉｎ ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｒａｂｂｉｔｓ．”， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９２ Ｊａｎｕａｒｙ １５， ２６７ （２）， ９６３−９６７
【非特許文献１８】
Ｗｕ， Ｇ．Ｙ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ．”， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９８８ Ｏｃｔｏｂｅｒ １５， ２６３ （２９）， １４６２１−１４６２４
【非特許文献１９】
Ａｓａｄａ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｏ ｓｅｃｒｅｔｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ （ＩＬ）−１２ ａｎｄ ＩＬ−１８ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ＥＢＶ／ｌｉｐｏｐｌｅｘ．”， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ， ２００２ Ｍａｙ， ５ （５）： ６０９−６１６
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、悪性腫瘍に対するサイトカインを用いた免疫療法はヒトの腫瘍には有効でない場合が多く、転移に対して有効な療法も多くなかった。また、サイトカインを用いた免疫療法には通常強い副作用を伴うという問題があった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは上記問題を解決するため種々の検討を行った。その結果、本発明者らは、ＩＬ−２１遺伝子を単独または他のサイトカインと組み合わせてｉｎ ｖｉｖｏ導入することにより、生体レベルでの強い抗腫瘍効果を達成できることを見出した。本発明はこの知見に基づき完成したものである。
【０００７】
したがって、本発明は、原発性または転移性腫瘍の治療、転移の予防、腫瘍の再発の予防に有効な免疫治療用医薬組成物を提供することを目的とする。
すなわち、本発明は、ＩＬ−２１を有効成分として含有する免疫治療用医薬組成物を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本明細書において、「ＩＬ−２１」とは、タンパク質だけでなく遺伝子も含むものとする。すなわち、「ＩＬ−２１」はＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−２１遺伝子を意味する。他のサイトカインについても同様とする。
【０００９】
ＩＬ−２１タンパク質は、ＩＬ−１５タンパク質と協調的に働いてＮＫ細胞を活性化するだけでなく、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞の増殖にも関与しており、これら免疫細胞の分化にかかわる因子としてもその機能は重要であると考えられている。
【００１０】
本発明の免疫治療用医薬組成物は、ＩＬ−２１を有効成分として含有する。ＩＬ−２１は単独で用いることもできるが、他のサイトカインやケモカインと組合わせて用いることもできる。他のサイトカインと組合わせて用いる場合、これらを同時に、連続して、または適当な間隔をおいて導入することができる。好ましいサイトカインとしては、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８が挙げられる。ＩＬ−２１および他のサイトカインは遺伝子でもタンパク質でもよい。
【００１１】
本発明の免疫治療用医薬組成物は、腫瘍に局所投与することにより抗腫瘍免疫応答を誘導し、その腫瘍、または遠隔の腫瘍を認識、攻撃、排除し、あるいは転移を抑制することができる。また腫瘍以外の正常臓器（たとえば肝）に投与することにより抗腫瘍効果を得ることもできる。
【００１２】
またＩＬ−２１を発現する細胞、またはあらかじめＩＬ−２１遺伝子を導入することによりＩＬ−２１を発現するように加工した細胞を含む細胞製剤として、腫瘍局所または他の臓器（たとえば肝臓）に導入することもできる。その際、ＩＬ−２１とともに少なくとも１種の他のサイトカインを発現するように加工した細胞を含む細胞製剤を用いることもできる。
【００１３】
本発明の免疫治療用医薬組成物の抗腫瘍効果は、ＩＬ−２１がＮＫ細胞に直接作用して増殖させ、それと同時にＮＫ細胞の活性化を促すことによる。活性化したＮＫ細胞は腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する分子であるＦａｓリガンド、ＴＲＡＩＬの発現を増強し、その結果、ＮＫ細胞をエフェクターとした強い抗腫瘍効果を得ることができる。また、ＩＬ−２１はＴ細胞にも作用して、特異的な抗腫瘍効果も誘導することができる。さらに、ＩＬ−２１と種々のサイトカインを組合わせて用いることにより、相乗的な抗腫瘍効果を得ることもできる。
【００１４】
また、本発明の免疫治療用医薬組成物は、他のサイトカインに比べて非常に副作用が少ないと考えられる。たとえばＩＬ−１２遺伝子をｎａｋｅｄ ＤＮＡ法にてマウスに注入すると、その用量を上げていくに従い、マウスは脾腫大と体重減少を呈し死に至る。しかしながら、本発明者らが試みた範囲では、ＩＬ−２１では全くそのような重篤な副作用は起こらなかった。このことからＩＬ−２１は、副作用を伴うことなく強い抗腫瘍免疫応答を誘導できると考えられる。したがって、本発明の免疫治療用医薬組成物は、腫瘍の免疫療法に非常に有用である。
【００１５】
本発明の免疫治療用医薬組成物はヒト、またはヒト以外の哺乳動物に用いることができる。
本発明の免疫治療用医薬組成物は、ＩＬ−２１を腫瘍細胞内または正常組織細胞内にｉｎ ｖｉｖｏ導入し、生体内の免疫細胞を活性化することによって、局所腫瘍または転移性腫瘍の治療、および転移抑制に用いることができる。
【００１６】
ＩＬ−２１遺伝子を含む本発明の免疫治療用医薬組成物は、ｎａｋｅｄ ＤＮＡ法にて導入することができるが、これらに限定されるものではない。たとえばＷｏｌｆｆらは、骨格筋にプラスミドＤＮＡを注入すると、筋細胞に遺伝子導入できることを見出した（非特許文献２参照）。Ｌｉｕらは、プラスミド・ベクターを流体力学的にマウスに注入すると、肝臓に高率に遺伝子を発現させることを報告した（ハイドロダイナミクス法）（非特許文献３参照）。発明者らは，エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）由来のプラスミド・ベクターをこのハイドロダイナミクス法にて導入すると、さらに発現が上昇し且つ延長することを報告した（非特許文献４参照）（下記実施例もハイドロダイナミクス法にて行っている）。
Ｚｈａｎｇらは、骨格筋もハイドロダイナミクス法にて導入可能であることを、サルを用いた実験で示した（非特許文献５参照）。
【００１７】
ＩＬ−２１遺伝子を含む免疫治療用医薬組成物はまた、ＤＮＡウイルス由来のベクター、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パピローマウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのウイルス由来のベクターを用いることもできる。しかし、これらに限定されるものではない。ウイルスの複製に必須の遺伝子を欠失させたｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔなウイルスを用いることが好ましい。ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔなウイルスは、細胞に導入後は感染性を有するウイルス粒子を産生しないため、適切な投与法を選べば目的外の細胞に感染することなく局所的に投与することが可能である。他方、ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔなウイルスベクターを用いることもできる。ＤＮＡウイルスベクターの例としては、欠陥単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）ベクター（非特許文献６参照）；アデノウイルスベクター（例えば非特許文献７に記載されたもの）；及びアデノ随伴ウイルスベクター（非特許文献８及び非特許文献９参照）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
ＩＬ−２１遺伝子を含む本発明の免疫治療用医薬組成物はまた、レトロウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどのＲＮＡウイルスを用いて生体内に導入することもできる。例えば、特許文献２〜６、非特許文献１０〜１２に記載されたベクターを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
また、ＩＬ−２１遺伝子を含む本発明の免疫治療用医薬組成物をカチオニックリポソーム、カチオニックリピッドやカチオニックポリマー等の合成ベクターを用いて調製することもできる（非特許文献１３〜１５参照）。合成ベクターはウイルス性ベクターに比し、工業的に生産でき、また作製・保存・輸送・使用が容易でコストも低くできるため、医薬品として用いる上で大きなメリットがある。
さらに、ウイルス性ベクターに比し、免疫原性が低くまた副作用が少ないものが多い。脂質等にペプチド（例えばホルモン又は神経伝達物質）、抗体（例えば抗トランスフェリンレセプター抗体）などのタンパク質、又は非ペプチド性分子を化学的に結合させ、標的細胞をターゲティングすることもできる。
【００２０】
ＩＬ−２１遺伝子を含む本発明の免疫治療用医薬組成物はまた、電気穿孔法、遺伝子銃等の物理的な原理を応用した非ウイルス的手法にて、腫瘍、または他臓器にｉｎ ｖｉｖｏ導入することができる（たとえば非特許文献１６参照）。これらの方法により、生体内の限局した部位（たとえば腫瘍の一部）に遺伝子導入することができる。
【００２１】
ＩＬ−２１タンパク質を含む本発明の免疫治療用医薬組成物を生体に投与する場合は、経口的にあるいは直腸内、皮下、髄腔内、筋肉内、静脈内、動脈内、経皮等、非経口的に投与することができるが、好ましくは経口的にあるいは静脈内に投与するのがよい。
【００２２】
ＩＬ−２１タンパク質を含む本発明の免疫治療用医薬組成物を生体に投与する場合、適当な剤型に製剤化して用いるのが好ましく、例えば錠剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤、チュワブル剤、液剤、乳剤、懸濁剤、坐剤、シロップ剤、ローション剤、軟膏剤、パップ剤等の製剤で用いることができる。これらの剤型に製剤化するには薬学上許容しうる適当な担体、賦形剤、添加剤等を用いて行うことができる。
【００２３】
静脈内投与する際に好ましい剤型は液剤であり、液剤を調製するには、例えば精製水、生理食塩水、エタノール・プロピレングリコール・グリセリン・ポリエチレングリコール等のアルコール類、トリアセチン等の溶媒を用いて行うことができる。このような製剤にはさらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定剤のような補助剤を加えても良い。また懸濁剤として投与することも可能である。
【００２４】
また錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、トローチ剤、チュワブル剤等の固形製剤を調製するには、例えば重炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、デンプン、ショ糖、マンニトール、カルボキシメチルセルロース等の担体、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、グリセリン等の添加剤を加えて常法により行うことができる。またセルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ポリビニルアルコールフタレート、スチレン−無水マレイン酸共重合体、メタクリル酸−メタクリル酸メチル共重合体等の腸溶性物質の有機溶媒あるいは水中溶液を吹き付けて、腸溶性被膜を施して、腸溶性製剤として製剤化することもできる。薬学上許容しうる担体には、その他通常、必要により用いられる補助剤、芳香剤、安定剤あるいは防腐剤を含む。
【００２５】
投与頻度は、月１回投与から連日投与が可能であり、好ましくは１回／２週から５回／週程度もしくは連日投与である。特に、持続的投与が好ましい。
投与量は、病態、重症度などにより異なるが、０．１〜１０００μｇ／ｋｇ／ｄａｙであり、好ましくは０．５〜２０μｇ／ｋｇ／ｄａｙである。
【００２６】
細胞にｅｘ ｖｉｖｏでＩＬ−２１遺伝子を含むベクターを導入し、形質転換細胞を生体内に戻すことも可能である。この細胞としては、患者から得た腫瘍細胞やその他臓器等由来の細胞（線維芽細胞、リンパ球など）、アロまたは異種細胞、あるいは培養細胞株（３Ｔ３細胞など）等を用いることができる。ベクターは、所望の宿主細胞に、公知の方法にしたがって導入することができる。例えば、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、レトロウイルスベクター等のウイルスベクターを用いる方法や、リポフェクション、ポリフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子銃等の非ウイルス的導入方法により、導入が可能である（非特許文献１７〜１９参照）。ＩＬ−２１遺伝子と共に薬剤耐性遺伝子を導入し、遺伝子導入後の細胞に薬剤選択を行うことにより、ＩＬ−２１高発現細胞を選別することができる。非選別、または選別後の形質転換細胞は、放射線照射等により増殖能を失わせてから患者に移植することができる。または有孔膜、有孔カプセル等の中に形質転換細胞を封入してから移植することができる。移植する部位としては、腫瘍内、他臓器内（たとえば皮下）、または体腔内（たとえば腹腔内）に移植することができる。
【００２７】
本発明の免疫治療用医薬組成物を用いることにより、原発性または転移性腫瘍の治療、転移の予防、腫瘍の再発の予防を可能にする。
【００２８】
【実施例】
以下の実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００２９】
【実施例１】
ＮＫ細胞活性
以下のようにして、５１Ｃｒリリースアッセイ法によりＮＫ細胞活性を測定した。エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来のプラスミドベクターに、マウスＩＬ−１５遺伝子（ｍＩＬ−１５）、マウスＩＬ−２１遺伝子（ｍＩＬ−２１）、またはｍＩＬ−１５およびｍＩＬ−２１（ｍＩＬ−１５＋ｍＩＬ−２１）を組み込んだ発現ユニットを有するプラスミドベクター各２５μｇを、１．６ｍｌの生理食塩水にそれぞれ溶解し、８週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（メス、Ｎ＝３）の尾静脈より高圧下で５秒以内に注入した。コントロールとしてサイトカイン遺伝子を含まないＥＢＶ由来のプラスミドベクターを用いた。注入後４８時間または７２時間に脾臓よりリンパ球を回収し、これをエフェクター細胞Ｅとした。５１ＣｒでラベルしたＹＡＣ−１（マウスリンパ腫の細胞株）を標的細胞（Ｔ）としてＥ／Ｔ比を１００：１、５０：１、２５：１及び１２．５：１に調製し、マイクロプレート上で４時間反応させた。反応後、破壊されたＴより放出された５１Ｃｒの放射活性をγ−カウンターで測定した。５１Ｃｒの特異的放出は次式により求めた。
％（５１Ｃｒ特異的放出）＝［（ＮＫ細胞による放出−非特異的放出）／（最大放出−非特異的放出）］×１００
統計的有意差はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔを用いて評価した。図１（ａ）から明らかなように、コントロール群と比較して、ｍＩＬ−２１群およびｍＩＬ−１５群において、遺伝子導入後４８時間でＮＫ細胞活性の有意な亢進が認められた（それぞれ、ｐ＜０．０５及びｐ＜０．００１）。ｍＩＬ−１５＋ｍＩＬ−２１群においてはさらに強力なＮＫ細胞活性の亢進が認められた（ｐ＜０．００１）。
【００３０】
【実施例２】
ＦＡＣＳ解析
実施例１と同様の系を用いて、注入４８時間後の肝臓のリンパ球を比重遠心法で分離採取し、フローサイトメトリーにて以下の解析を行った。
（１）ＮＫ細胞
ＮＫ細胞の表面マーカーを解析したところ、図２に示すように、ｍＩＬ−２１群、ｍＩＬ−１５群では、ＮＫ細胞の顕著な増殖が認められた。
（２）Ｆａｓリガンド陽性細胞
Ｆａｓリガンド陽性細胞を解析した結果を図３に示す。ｍＩＬ−２１群では、Ｆａｓリガンド陽性細胞数が増加していたが、ｍＩＬ−１５群では、そのような変化は認められなかった。
（３）ＴＲＡＩＬ陽性細胞
ｍＩＬ−２１＋ｍＩＬ−１５群では、ＴＲＡＩＬ陽性細胞の有意な増加が認められたが、いずれの遺伝子においても単独導入では、そのような現象は認められなかった（図４）。
【００３１】
【実施例３】
転移抑制
実施例１と同様の系を用いて（Ｎ＝５）、各発現ベクターの注入１２時間後にＲＬ♂１（マウスリンパ腫の細胞株）を尾静脈より１×１０４個移植した。移植２週間後に、マウスの肝臓を摘出し、肝臓表面の転移巣を数えてＩＬ−２１による転移抑制効果を検討した。結果を図５に示す。統計的有意差はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔを用いて評価した。ｍＩＬ−２１群およびｍＩＬ−１５群において転移巣の数はそれぞれ減少し、ｍＩＬ−１５群ではその差は有意であった（ｐ＜０．０５）。また、ｍＩＬ−２１＋ｍＩＬ−１５群では、肝臓表面の転移巣は全く認められなかった（ｐ＜０．０５）。
【００３２】
【実施例４】
生存率
（１）リンパ腫移植前導入
実施例３と同様にして各発現ベクターの注入後にＲＬ♂１を移植し、マウスの生存率について検討した。図６から明らかなように、ｍＩＬ−２１群およびｍＩＬ−１５群においても延命効果が認められたが、ｍＩＬ−２１＋ｍＩＬ−１５群では、さらに強力な延命効果が認められた。Ｌｏｇｒａｎｋ ｔｅｓｔ（Ｎ＝５）により、コントロール群との差を比較したところ、ｍＩＬ−２１群およびｍＩＬ−１５群では有意差がｐ＜０．０５であった。一方、ｍＩＬ−２１＋ｍＩＬ−１５群では、ｐ＜０．０１であった。
（２）リンパ腫移植後導入
Ｂａｌｂ／ｃマウスの尾静脈よりＲＬ♂１を１×１０４個移植した５日後に、実施例１と同様にして各発現ベクターを尾静脈より注入した。その後のマウスの生存率を観察したところ、コントロール群は２０日以内に全例死亡したのに対し、ｍＩＬ−２１＋ｍＩＬ−１５群では著明な延命効果を示した（図７）。Ｌｏｇｒａｎｋ ｔｅｓｔ（Ｎ＝５）により、コントロール群との差を比較したところ、ｍＩＬ−１５群およびｍＩＬ−２１＋ｍＩＬ−１５群の有意差はｐ＜０．０５であった。
【００３３】
【実施例５】
炎症性サイトカインの発現
実施例１と同様の系を用いて、各発現ベクターの注入４８時間後に、末梢血清中のサイトカイン濃度をＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。実施例１から明らかなように、脾臓におけるＮＫ細胞活性は上昇しているにもかかわらず、ｍＩＬ−２１群、ｍＩＬ−１５群、ｍＩＬ−２１＋ｍＩＬ−１５群のそれぞれにおいて、炎症性サイトカインであるｍＩＮＦγ、ＧＭ−ＣＳＦおよびｍＩＬ−４の発現の亢進は認められなかった（図８）。
【００３４】
【発明の効果】
ＩＬ−２１は、副作用を伴うことなく強い抗腫瘍免疫応答を誘導することが可能である。したがって、本発明の免疫治療用医薬組成物は、腫瘍の免疫療法に非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】マウスにＩＬ−２１遺伝子および／またはＩＬ−１５遺伝子を導入したときのＮＫ細胞活性の亢進を示すグラフである。
【図２】マウスにＩＬ−２１遺伝子またはＩＬ−１５遺伝子を導入したときのＮＫ細胞数の増加について、ＦＡＣＳ解析を行った結果を示す図である。
【図３】マウスにＩＬ−２１遺伝子および／またはＩＬ−１５遺伝子を導入したときのＦａｓリガンド陽性細胞数の増加について、ＦＡＣＳ解析を行った結果を示す図である。
【図４】マウスにＩＬ−２１遺伝子および／またはＩＬ−１５遺伝子を導入したときのＴＲＡＩＬ陽性細胞数の増加について、ＦＡＣＳ解析を行った結果を示す図である。
【図５】マウスにＩＬ−２１遺伝子および／またはＩＬ−１５遺伝子を導入したときの腫瘍転移抑制効果を示すグラフである。
【図６】マウスにＩＬ−２１遺伝子および／またはＩＬ−１５遺伝子を導入後、リンパ腫細胞を移植したときの生存率を示すグラフである。
【図７】マウスにリンパ腫細胞を移植後、ＩＬ−２１遺伝子および／またはＩＬ−１５遺伝子を導入したときの生存率を示すグラフである。
【図８】マウスにＩＬ−２１遺伝子および／またはＩＬ−１５遺伝子を導入したときの炎症性サイトカインの発現への影響を示すグラフである。
Claims (8)
- ＩＬ−２１を有効成分として含有する免疫治療用医薬組成物。
- 腫瘍若しくは転移性腫瘍の治療剤としてまたは腫瘍の転移抑制剤として用いる請求項１に記載の免疫治療用医薬組成物。
- さらにＩＬ−２１以外の少なくとも１種のサイトカインを含む請求項１または２に記載の免疫治療用医薬組成物。
- 該少なくとも１種のサイトカインがケモカインである請求項３に記載の免疫治療用医薬組成物。
- 該少なくとも１種のサイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８から選ばれる少なくとも１種のサイトカインである請求項３に記載の免疫治療用医薬組成物。
- ＩＬ−２１および該少なくとも１種のサイトカインが、それぞれＩＬ−２１遺伝子およびサイトカイン遺伝子である請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫治療用医薬組成物。
- ＩＬ−２１および該少なくとも１種のサイトカインが、それぞれＩＬ−２１タンパク質およびサイトカインタンパク質である請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫治療用医薬組成物。
- ＩＬ−２１および該少なくとも１種のサイトカインを、ＩＬ−２１遺伝子単独でまたは少なくとも１種のサイトカイン遺伝子とともに発現する細胞を含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫治療用医薬組成物。
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2003
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