KR102350647B1 - 4'-포스페이트 유사체 및 이를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 - Google Patents

4'-포스페이트 유사체 및 이를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 Download PDF

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Abstract

예를 들어, 세포에서 표적 유전자의 발현을 조정하기 위해 올리고뉴클레오타이드, 예컨대, 4'-포스페이트 유사체를 갖는 핵산 저해제 분자 및 이를 사용하는 방법이 본 명세서에 개시되어 있다. 포스페이트 유사체는 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단 뉴클레오타이드의 당 모이어티(예를 들어, 리보스 또는 데옥시리보스 또는 이의 유사체)의 4'-탄소에 결합된다. 통상적으로, 포스페이트 유사체는 옥시메틸기의 산소 원자가 당 모이어티 또는 이의 유사체의 4'-탄소에 결합된 옥시메틸포스포네이트이다.

Description

4'-포스페이트 유사체 및 이를 포함하는 올리고뉴클레오타이드
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 9월 2일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/383,207호 및 2016년 9월 12일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/393,401호(이들의 전체 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함됨)의 이익을 주장하고, 이들의 출원일에 의존한다.
올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 중합체 서열(RNA, DNA 및 이의 유사체)이다. 핵산 저해제 분자는 세포내 RNA 수준을 조정하는 올리고뉴클레오타이드이고, 암, 바이러스 감염 및 유전 질환의 치료에서 초기에 가능성을 입증하였다. RNA 간섭(RNAi)을 포함하는, 핵산 저해제 분자는 기전의 다양한 세트를 통해 RNA 발현을 조정할 수 있다.
RNAi는 이중 가닥 RNA 분자(dsRNA)가 dsRNA에 상보성인 서열을 갖는 표적 유전자의 발현을 저해하는 대부분의 진핵생물에서 발견된 보존된 경로이다. 통상적인 RNAi 경로에서, 더 긴 dsRNA는 작은 간섭 RNA("siRNA")라 불리는 더 짧은 RNA 듀플렉스로 다이서(Dicer) 효소에 의해 절단된다. siRNA는, 때때로 RNA 유도된 침묵 복합체(RNA-induced silencing complex: "RISC")라 불리는, 듀플렉스를 형성하도록 다이서, 전사 촉진 반응 RNA 결합 단백질(trans-activating response RNA-binding protein: TRBP) 및 아르고노트(Argonaute) 2("Ago2")와 연관된 것으로 나타났다. Ago2는 표적 mRNA 절단의 서열 특이성을 지시하도록 siRNA의 안티센스 가닥(가이드 가닥이라고도 칭함)을 사용하여 표적 mRNA를 절단하는 엔도뉴클레아제이다.
다양한 이중 가닥 RNAi 저해제 분자 구조는 수년에 걸쳐 개발되었다. 예를 들어, RNAi 저해제 분자에 대한 초기 작업은 천연 siRNA를 모방하는 이중 가닥 핵산 분자에 집중하고, 각각의 가닥은 1개 내지 5개의 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 3'-오버행(overhang)을 갖는 19개 내지 25개의 뉴클레오타이드의 크기를 갖는다(예를 들어, 미국 특허 제8,372,968호 참조). 후속하여, RNAi 저해제 분자를 활성화하도록 다이서 효소에 의해 생체내 가공된 더 긴 이중 가닥 RNAi 저해제 분자가 개발되었다(예를 들어, 미국 특허 제8,883,996호 참조). 차후의 작업은 적어도 하나의 가닥의 적어도 하나의 말단이, 가닥의 하나가 열역학적으로 안정화시키는 테트라루프 구조를 포함하는 구조(예를 들어, 미국 특허 제8,513,207호, 미국 특허 제8,927,705호, WO 제2010/033225호 및 WO 제2016/100401호 참조)를 포함하여, 분자의 이중 가닥 표적화 영역 뒤로 연장되는, 연장된 이중 가닥 핵산 저해제 분자를 개발하였다. 이 구조는 (분자 일 측 또는 양측에서) 단일 가닥 연장 및 이중 가닥 연장을 포함한다.
단일 가닥 핵산 저해제 분자가 또한 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 최근의 노력은 ssRNAi 저해제 분자의 활성을 입증하였다(예를 들어, Matsui et al. 2016, 24(5):946-55 참조). 그리고, 안티센스 분자는 특이적 표적 유전자의 발현을 감소시키도록 수십 년 동안 사용되었다. Pelechano and Steinmetz, Nature Review Genetics, 2013, 14:880-93. 이들 구조의 공통 주제에 대한 다수의 변형이 일련의 표적에 대해 개발되었다. 다른 단일 가닥 핵산 저해제 분자는 예를 들어 마이크로RNA, 리보자임, 안타고미르(antagomir) 및 압타머(이들 모두 당해 분야에 공지되어 있음)를 포함한다.
소정의 경우에, 화학 변형은 특정한 조건, 예컨대, 생체내 투여 이후에 경험한 조건 하에 원해질 수 있는 특성을 도입하도록 핵산 저해제 분자로 도입된다. 이러한 변형은 예를 들어 뉴클레아제 또는 올리고뉴클레오타이드의 구조 또는 활성을 저해시키거나 방해하는 다른 효소에 대해 안정화시키도록, 올리고뉴클레오타이드의 세포 흡수를 증가시키도록, 또는 올리고뉴클레오타이드의 약동학적 특성을 개선하도록 설계된 것을 포함한다.
예를 들어, 합성 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 5'- 또는 3'-하이드록실 기에 의해 종결한다. 예를 들어 링커, 어댑터 또는 라벨을 부착시키기 위해 또는 또 다른 핵산에 대한 올리고뉴클레오타이드의 직접적인 결찰을 위해 사용될 수 있는 포스페이트기에 의해 말단 하이드록실 기를 대체할 수 있다. 또한, 5'-말단 포스페이트기가 소정의 핵산 저해제 분자와 Ago2 사이의 상호작용을 증대시킨다는 것이 보고되어 있다. 그러나, 5'-포스페이트기를 갖는 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 포스파타제 또는 다른 효소를 통한 분해에 민감하고, 이것은 생체내 이의 생체이용률을 제한할 수 있다.
따라서, 포스페이트기의 기능적 효과를 제공하지만, 올리고뉴클레오타이드가 대상체에게 투여될 때 노출되는 환경 조건에 더 안정한 핵산 저해제 분자와 같은 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단 뉴클레오타이드에 대한 변형을 개발하는 것이 바람직하다. 이러한 포스페이트 유사체는, 올리고뉴클레오타이드의 작용에 대한 부정적인 영향을 최소화하면서(예를 들어, RNAi 저해제 분자에서 사용될 때 유전자 표적 넉다운에서 임의의 감소를 최소화하면서), 포스파타제 및 다른 효소에 더 저항일 것이다.
본 출원은 4'-포스페이트 유사체를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 개시한다. 적합한 올리고뉴클레오타이드는 핵산 저해제 분자, 예컨대, dsRNAi 저해제 분자, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, miRNA, 리보자임, 안타고미르, 압타머 및 ssRNAi 저해제 분자를 포함한다.
본 개시내용의 포스페이트 유사체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단 뉴클레오타이드("N1 뉴클레오타이드")의 당 모이어티(예를 들어, 리보스 또는 데옥시리보스 또는 이의 유사체)의 4'-탄소에 결합된다. 통상적으로, 포스페이트 유사체는 옥시메틸기의 산소 원자가 당 모이어티 또는 이의 유사체의 4'-탄소에 결합된 옥시메틸포스포네이트이다. 다른 실시형태에서, 포스페이트 유사체는 티오메틸기의 황 원자 또는 아미노메틸기의 질소 원자가 당 모이어티 또는 이의 유사체의 4'-탄소에 결합된 티오메틸포스포네이트 또는 아미노메틸포스포네이트이다.
소정의 실시형태에서, 4'-옥시메틸포스포네이트는 -O-CH2-PO(OH)2 또는 -O-CH2-PO(OR)2(여기서, R은 H, CH3, 알킬기 또는 보호기로부터 독립적으로 선택됨)로 표시된다. 소정의 실시형태에서, 알킬기는 CH2CH3이다.
일 양태에서, 본 명세서에 기재된 포스페이트 유사체-변형된 핵산 저해제 분자는 세포에서 표적 유저자의 발현을 조정하도록 사용될 수 있다. 포스페이트 유사체-변형된 핵산 저해제 분자는 약제학적 조성물로서 약제학적으로 허용 가능한 부형제와 제제화되고, 표적 유전자의 발현을 조정하기 위해 그리고 표적 유전자의 발현의 조정을 요하는 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
소정의 양태에서, 본 개시내용은 4'-옥시메틸포스포네이트를 포함하는 5'-말단 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이고, 여기서 4'-옥시메틸포스포네이트는 -O-CH2-PO(OH)2 또는 -O-CH2-PO(OR)2이고, R은 H, CH3, 알킬기 또는 보호기로부터 독립적으로 선택된다. 소정의 실시형태에서, 알킬기는 CH2CH3이다.
소정의 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학식 I 또는 II로 표시된 5'-말단 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 소정의 실시형태에서, 5'-말단 뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 바대로 화학식 I로 표시된다. 소정의 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 화학식 I로 표시되고, X2는 OH, F, OCH2CH2OCH3 또는 OCH3이고, R8은 부재(absent)하거나, X2는 O이고, R8은 글루타티온 민감성 모이어티이다.
소정의 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학식 III으로 표시된 5'-말단 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 올리고뉴클레오타이드의 소정의 실시형태에서, X2는 OH, F 또는 OCH3이고, R8은 부재한다.
본 명세서에 기재된 올리고뉴클레오타이드의 소정의 실시형태에서, Ra 및 Rb는 수소이고; Ra는 CH3 또는 CH2CH3이고, Rb는 수소이거나; Ra 및 Rb는 각각 CH3 또는 CH2CH3이다.
소정의 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학식 IV로 표시된 5'-말단 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.
소정의 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학식 V로 표시된 5'-말단 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.
소정의 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학식 VI로 표시된 5'-말단 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 소정의 실시형태에서, 당 모이어티는 퓨라노스이다.
소정의 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 이중 가닥 RNAi 저해제 분자이고, 제1 가닥은 센스 가닥이고, 제2 가닥은 안티센스 가닥이다. 소정의 실시형태에서, 이중 가닥 RNAi 저해제 분자는 15개 내지 45개의 뉴클레오타이드의 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 상보성의 영역을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 상보성의 영역은 20개 내지 30개의 뉴클레오타이드이다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 상보성의 영역은 21개 내지 26개의 뉴클레오타이드이다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 상보성의 영역은 19개 내지 24개의 뉴클레오타이드이다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 상보성의 영역은 19개 내지 21개의 뉴클레오타이드이다.
소정의 실시형태에서, 5'-말단 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥에 위치한다. 소정의 실시형태에서, 5'-말단 뉴클레오타이드는 센스 가닥에 위치한다.
소정의 실시형태에서, 이중 가닥 RNAi 저해제 분자는 테트라루프를 함유한다.
소정의 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이다. 소정의 실시형태에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 종래의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임 또는 압타머이다.
소정의 실시형태에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 단일 가닥 RNAi 저해제 분자이다. 소정의 실시형태에서, 단일 가닥 RNAi 저해제 분자는 14개 내지 50개의 뉴클레오타이드의 길이이다. 소정의 실시형태에서, 단일 가닥 RNAi 저해제 분자는 약 16개 내지 30개, 18개 내지 22개, 또는 20개 내지 22개의 뉴클레오타이드의 길이이다.
소정의 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 1종의 전달 물질을 추가로 포함하고, 적어도 1종의 전달 물질은 세포의 외막에 걸친 올리고뉴클레오타이드의 수송을 수월하게 하도록 올리고뉴클레오타이드에 접합된다. 소정의 실시형태에서, 전달 물질은 탄수화물, 펩타이드, 지질, 비타민 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 실시형태에서, 전달 물질은 N-아세틸갈락토사민(GalNAc), 만노스-6-포스페이트, 갈락토스, 올리고당, 다당류, 콜레스테롤, 폴리에틸렌 글라이콜, 엽산, 비타민 A, 비타민 E, 리토콜린산 및 양이온성 지질로부터 선택된다.
소정의 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 지질 나노입자에 함유된다. 소정의 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 네이키드 올리고뉴클레오타이드이다.
소정의 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 4'-포스페이트 유사체를 포함하는 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 핵산 저해제 분자), 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물 및 표적 유전자의 발현을 감소시키기에 충분한 양으로 표적 유전자의 발현의 감소를 요하는 대상체에게 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 표적 유전자의 발현을 감소시키도록 이를 사용하는 방법에 관한 것이다. 소정의 실시형태에서, 투여하는 단계는 전신 투여를 포함한다.
소정의 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학식 X 또는 화학식 XI로 표시된 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트에 관한 것이다. 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트의 소정의 실시형태에서, M1은 O이고, X10은 O이다. 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트의 소정의 실시형태에서, X2는 O이고, R8은 글루타티온 민감성 모이어티이다. 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트의 소정의 실시형태에서, X2는 F, OCH2CH2OCH3 또는 OCH3이고, R8은 부재한다. 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트의 소정의 실시형태에서, Rc 및 Rd는 각각 CH3 또는 CH2CH3이다.
소정의 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학식 XII로 표시된 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트에 관한 것이다. 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트의 소정의 실시형태에서, Rc 및 Rd는 각각 독립적으로 CH3, CH2CH3 또는 보호기로부터 선택된다. 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트의 소정의 실시형태에서, X2는 F 또는 OCH3이고, R8은 부재한다. 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트의 소정의 실시형태에서, X2는 O이고, R8은 글루타티온 민감성 모이어티이다.
소정의 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학식 XIII으로 표시된 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트에 관한 것이다.
소정의 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학식 XIV로 표시된 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트에 관한 것이다.
소정의 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학식 XV로 표시된 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트에 관한 것이다. 소정의 실시형태에서, 당 모이어티는 퓨라노스이다. 소정의 실시형태에서, Rc 및 Rd는 각각 CH3 또는 CH2CH3이다.
도 1a는 실시예에 기재된 바와 같은 2개의 대표적인 대조군 이중 가닥 RNAi 저해제 분자를 도시한다: 대조군 화합물 5'-OH, 2'-F 및 대조군 화합물 5'-PO4, 2'-F. 대조군 화합물 5'-OH, 2'-F 및 대조군 화합물 5'-PO4, 2'-F는 가이드 가닥의 N1 뉴클레오타이드의 5'-OH 또는 5'-PO4를 제외하고 동일하다.
도 1b는 실시예에 기재된 바와 같은 2개의 대표적인 이중 가닥 RNAi 저해제 분자를 도시한다: 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-F 및 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F. 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-F 및 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F는 가이드 가닥의 N1 뉴클레오타이드에서의 4'-옥시메틸포스포네이트기를 제외하고 동일하고, 전자의 시험 화합물은 완전히 탈보호된 포스포네이트기를 갖고, 후자의 시험 화합물은 포스포네이트 모이어티에서의 모노메틸 보호기를 갖는다. 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-F 및 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F는 가이드 가닥의 N1 뉴클레오타이드를 제외하고 대조군 화합물 5'-OH, 2'-F 및 대조군 화합물 5'-PO4, 2'-F와 동일하고(도 1a), 대조군 화합물은 5'-OH 또는 5'-PO4를 갖고, 시험 화합물은 4'-옥시메틸포스포네이트를 갖는다.
도 1c는 실시예에 기재된 바와 같은 2개의 대표적인 대조군 이중 가닥 RNAi 저해제 분자를 도시한다: 대조군 화합물 5'-OH, 2'-OMe 및 대조군 화합물 5'-PO4, 2'-OMe. 대조군 화합물 5'-OH, 2'-OMe 및 대조군 화합물 5'-PO4, 2'-OMe는 가이드 가닥의 N1 뉴클레오타이드의 5'-OH 또는 5'-PO4를 제외하고 동일하다.
도 1d는 실시예에 기재된 바와 같은 2개의 대표적인 이중 가닥 RNAi 저해제 분자를 도시한다: 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-OMe 및 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-OMe. 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-OMe 및 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-OMe는 가이드 가닥의 N1 뉴클레오타이드에서의 4'-옥시메틸포스포네이트기를 제외하고 동일하고, 전자의 시험 화합물은 완전히 탈보호된 포스포네이트기를 갖고, 후자의 시험 화합물은 포스포네이트 모이어티에서의 모노메틸 보호기를 갖는다. 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-OMe 및 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-OMe는 가이드 가닥의 N1 뉴클레오타이드를 제외하고 대조군 화합물 5'-OH, 2'-OMe 및 대조군 화합물 5'-PO4, 2'-OMe와 동일하고(도 1c), 대조군 화합물은 5'-OH 또는 5'-PO4를 갖고, 시험 화합물은 4'-옥시메틸포스포네이트를 갖는다.
도 2a 내지 도 2d는, 실시예 8에 기재된 바대로, HEK293 세포로의 LIPOFECTAMINE(등록상표) RNAiMax(Thermo Fisher Scientific Inc.(메릴랜드주 록빌))에 의한 화합물의 형질주입 후 48시간에 표적 유전자 A mRNA의 넉다운에 의해 측정된 바대로, 대조군 화합물 5'-OH, 2'-F(도 2a) 및 대조군 화합물 5'-PO4, 2'-F(도 2b)와 비교하여, 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-F(도 2c) 및 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F(도 2d)의 효력(IC50)을 도시한다.
도 3a 내지 도 3b는, 실시예 9에 기재된 바대로, 양이온성 지질 형질주입 물질 없이 형질주입 이후에 24시간에 표적 유전자 A mRNA의 넉다운에 의해 측정된 바대로, 원숭이 간세포에서의 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-F(도 3a) 및 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F(도 3b)의 효력(IC50)을 도시한다.
도 4a 내지 도 4b는, 실시예 10에 기재된 바대로, 양이온성 지질 형질주입 물질 없이 형질주입 이후에 48시간에 표적 유전자 A mRNA의 넉다운에 의해 측정된 바대로, 인간 간세포에서의 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-F(도 4a) 및 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F(도 4b)의 효력(IC50)을 도시한다.
도 5a는, 실시예 11에 기재된 바대로, 래트 간 트리토솜(rat liver tritosome)에서의 항온처리 이후에 대조군 화합물 5'-OH, 2'-OMe; 대조군 화합물 5'-PO4, 2'-OMe; 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-OMe; 및 5'-PO4 대신에 5'-OH를 갖는 대조군 화합물 5'-PO4, 2'-OMe의 대사물질("M1")의 가이드 가닥의 상대 존재비(relative abundance)를 도시한다.
도 5b는, 실시예 11에 기재된 바대로, 래트 간 트리토솜에서의 항온처리 이후에 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F 및 이의 대사물질의 혼합물의 가이드 가닥의 상대 존재비를 도시한다. 대사물질 혼합물은 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-F의 가이드 가닥과 동일한 구조를 갖는 주요 대사물질을 포함한다.
도 5c는, 실시예 11에 기재된 바대로, 체중 1킬로그램당 3밀리그램("mpk")의 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-OMe의 생체내 투여 이후에 마우스 간 샘플에서 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-OMe 및 이의 대사물질("M2")의 가이드 가닥의 상대 존재비를 도시한다. M2는 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-OMe의 가이드 가닥과 동일한 구조를 갖는다.
도 6a는, 실시예 12에 기재된 바대로, 대조군 PBS 주입과 비교하여 체중 1킬로그램당 1밀리그램("mpk")의 대조군 화합물 5'-OH, 2'-F; 대조군 화합물 5'-PO4, 2'-F; 또는 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-F의 생체내 투여 후 3일에 표적 유전자 A mRNA의 넉다운에 의해 측정된 바대로, 마우스에서의 효력을 도시한다.
도 6b는, 실시예 12에 기재된 바대로, 대조군 PBS 주입과 비교하여 체중 1킬로그램당 1밀리그램("mpk")의 대조군 화합물 5'-OH, 2'-OMe 또는 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-OMe의 생체내 투여 후 4일에 표적 유전자 B mRNA의 넉다운에 의해 측정된 바대로, 마우스에서의 효력을 도시한다.
도 7은, 실시예 12에 기재된 바대로, 체중 1킬로그램당 0.3밀리그램("mpk"), 1mpk 및 3mpk에서 투약된 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F의 생체내 투여 후 10일에 표적 유전자 A mRNA의 넉다운에 의해 측정된 바대로, 용량 반응 연구에서 마우스에서의 생체내 효력을 도시한다.
도 8은, 실시예 12에 기재된 바대로, 체중 1킬로그램당 0.3밀리그램("mpk") 또는 1mpk에서 투약된 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-OMe 및 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-OMe의 생체내 투여 후 3일 및 10일에 표적 유전자 B mRNA의 넉다운에 의해 측정된 바대로, 마우스에서의 생체내 효력을 보여준다.
도 9a는, 실시예 13에 기재된 바대로, 체중 1킬로그램당 3밀리그램의 대조군 화합물 5'-OH, 2'-OMe 및 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-OMe의 생체내 투여 후 14일, 28일 및 56일에 표적 유전자 B mRNA의 넉다운에 의해 측정된 바대로, 사이아노몰거스 원숭이에서의 시간 경과 연구의 결과를 보여준다.
도 9b는, 실시예 13에 기재된 바대로, 체중 1킬로그램당 3밀리그램의 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-OMe 및 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-OMe의 생체내 투여 후 14일, 28일 및 56일에 표적 유전자 B mRNA의 넉다운에 의해 측정된 바대로, 사이아노몰거스 원숭이에서의 시간 경과 연구의 결과를 보여준다.
정의
본 개시내용이 더 용이하게 이해되도록, 소정의 용어가 처음에 하기에 정의된다. 하기 용어 및 다른 용어에 대한 추가적인 정의는 본 명세서에 걸쳐 기재될 수 있다. 하기에 기재된 용어의 정의가 참고로 포함된 출원 또는 특허에서의 정의와 불일치하는 경우에, 본 명세서에 기재된 정의는 용어의 의미를 이해하기 위해 사용되어야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에 사용된 바대로, 단수 형태 "일", "하나" 및 "이"는, 문맥이 명확히 달리 기재하지 않는 한, 복수 지시어를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "일 방법"에 대한 언급은 본 명세서에 기재되거나 본 개시내용을 읽을 시 당업자에게 명확해지는 유형의 하나 이상의 방법, 및/또는 단계 등을 포함한다.
5'-말단 뉴클레오타이드: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "5'-말단 뉴클레오타이드"는 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에 위치한 뉴클레오타이드를 의미한다. 5'-말단 뉴클레오타이드는 본 출원에서 "N1 뉴클레오타이드"라 또한 칭해질 수 있다.
아실: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "아실"은 알킬카보닐, 사이클로알킬카보닐 및 아릴카보닐 모이어티를 의미한다.
지방족 기: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "지방족 기"는 1개 이상의 작용기에 의해 선택적으로 치환된 포화 및 불포화, 직쇄(즉, 비분지쇄), 또는 분지쇄 탄화수소 둘 다를 의미한다. 용어 "치환된 지방족"은 치환기를 보유하는 지방족 모이어티를 의미한다.
알콕시: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "알콕시"는 산소 원자를 통해 분자 모이어티에 부착된 알킬기를 의미한다.
알켄일: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "알켄일"은 적어도 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖고, 약 2개 내지 약 20개의 탄소 원자의 범위를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 하이드로카빌기를 의미한다. "치환된 알켄일"은 1개 이상의 치환기를 추가로 보유하는 알켄일기를 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "저급 알켄일"은 2개 내지 약 6개의 탄소 원자를 갖는 알켄일 모이어티를 의미한다.
알킬: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "알킬"은 1개 내지 약 20개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 하이드로카빌기를 의미한다. 이것이 본 명세서에 보일 때마다, 숫자 범위, 예컨대, "C 1 -C 6 알킬"은 알킬기가 6개 이하의 탄소 원자를 포함하여 오직 1개의 탄소 원자, 2개의 탄소 원자, 3개의 탄소 원자 등을 포함할 수 있다는 것을 의미하지만, 용어 "알킬"은 또한 탄소 원자의 숫자 범위가 지정되지 않는 경우를 포함한다. 예를 들어, 용어 "알킬"은 C1-C10(예를 들어, C1-C6)의 하위범위를 의미할 수 있다. "치환된 알킬"은 치환기를 보유하는 알킬 모이어티를 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "저급 알킬"은 1개 내지 약 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 모이어티를 의미한다.
알킬아미노: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "알킬아미노"는 아민 작용기를 보유하는 알킬 라디칼을 의미한다. 알킬아미노는 치환되거나 비치환될 수 있다.
알킨일: 본 명세서에 사용된 바와 같은, "알킨일"은 적어도 1개의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖고, 약 2개 내지 약 20개의 탄소 원자의 범위를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 하이드로카빌기를 의미한다. "치환된 알킨일"은 1개 이상의 치환기를 추가로 보유하는 알킨일기를 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "저급 알킨일"은 약 2개 내지 약 6개의 탄소 원자를 갖는 알킨일 모이어티를 의미한다.
대략: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "대략" 또는 "약"은, 관심 대상의 하나 이상의 값에 적용되면서, 언급된 기준 값과 유사한 값을 의미한다. 소정의 실시형태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은, 달리 기재되지 않는 한 또는 문맥으로부터 달리 명확하지 않는 한(이러한 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우를 제외), 기재된 기준 값의 어느 방향에서든(초과 또는 미만) 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 이것 미만 내에 해당하는 값의 범위를 의미한다.
압타머: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "압타머"는 핵산, 단백질, 특정하나 전체 세포 또는 특정한 조직을 포함하는 특정한 표적에 대한 결합 친화도를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 압타머는 예를 들어 핵산의 큰 랜덤 서열 풀로부터의 시험관내 선택에 의해 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 얻어질 수 있다. Lee et al., Nucleic Acid Res, 2004, 32:D95-D100.
안타고미르: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "안타고미르"는 외인성 RNAi 저해제 분자 또는 천연 miRNA의 가이드 가닥을 포함하는 특정한 표적에 대한 결합 친화도를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다(Krutzfeldt et al. Nature 2005, 438(7068):685-689).
안티센스 가닥: 이중 가닥 RNAi 저해제 분자는 안티센스 가닥 및 센스 가닥인 2개의 올리고뉴클레오타이드 가닥을 포함한다. 안티센스 가닥 또는 이의 영역은 표적 핵산의 상응하는 영역에 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보성이다. 또한, 이중 가닥 RNAi 저해제 분자의 안티센스 가닥 또는 이의 영역은 이중 가닥 RNAi 저해제 분자의 센스 가닥 또는 이의 영역에 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보성이다. 소정의 실시형태에서, 안티센스 가닥은 표적 핵산 서열에 비상보성인 뉴클레오타이드를 또한 함유할 수 있다. 비상보성 뉴클레오타이드는 상보성 서열의 어느 한 측에 있을 수 있거나, 상보성 서열의 양측에 있을 수 있다. 안티센스 가닥 또는 이의 영역이 센스 가닥 또는 이의 영역에 부분적으로 또는 실질적으로 상보성인 소정의 실시형태에서, 비상보성 뉴클레오타이드는 상보성의 하나 이상의 영역(예를 들어, 하나 이상의 미스매치) 사이에 위치할 수 있다. 이중 가닥 RNAi 저해제 분자의 안티센스 가닥은 또한 가이드 가닥이라 칭해진다.
방향족 기: 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "방향족 기"는 4n+2π 전자(여기서, n은 정수임)를 함유하는 탈국소화된 π 전자 시스템을 갖는 평면 고리를 의미한다. 방향족 고리는 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 9개 초과의 원자로부터 형성될 수 있다. 용어 "방향족"은 탄소환식 아릴(예를 들어, 페닐) 및 복소환식 아릴(또는 "헤테로아릴" 또는 "헤테로방향족") 기(예를 들어, 피리딘) 둘 다를 포함하도록 의도된다. 상기 용어는 단환식 또는 융합된 고리 다환식 고리, 즉 탄소 원자의 인접한 쌍을 공유하는 고리를 포함한다. "치환된 방향족"은 1개 이상의 치환기를 추가로 보유하는 방향족 기를 의미한다.
아릴: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "아릴"은 5개 내지 19개의 탄소 원자의 범위를 갖는 방향족 단환식 또는 다환식 기를 의미한다. "치환된 아릴"은 1개 이상의 치환기를 추가로 보유하는 아릴기를 의미한다.
정규적 RNA 저해제 분자: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "정규적 RNA 저해제 분자"는 핵산의 2개의 가닥을 의미하고, 각각의 21개의 뉴클레오타이드 길이는 이중 가닥 핵산의 형성을 위해 19개의 염기 쌍 길이인 상보성의 중앙 영역 및 각각의 3' 말단에서 2개의 뉴클레오타이드 오버행을 갖는다.
상보성: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "상보성"은 2개의 뉴클레오타이드가 서로와 염기 쌍을 형성하도록 허용하는 (예를 들어, 2개의 반대의 핵산에서 또는 단일 핵산 가닥의 반대의 영역에서) 2개의 뉴클레오타이드 사이의 구조 관계를 의미한다. 예를 들어, 반대의 핵산의 피리미딘 뉴클레오타이드에 상보성인 하나의 핵산의 퓨린 뉴클레오타이드는 서로와 수소 결합을 형성함으로써 함께 염기 쌍일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상보성 뉴클레오타이드는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 방식으로 또는 안정한 듀플렉스의 형성을 허용하는 임의의 다른 방식으로 염기 쌍일 수 있다. "완전히 상보성" 또는 100% 상보성은 제1 올리고뉴클레오타이드 가닥 또는 제1 올리고뉴클레오타이드 가닥의 분절의 각각의 뉴클레오타이드 단량체가 제2 올리고뉴클레오타이드 가닥 또는 제2 올리고뉴클레오타이드 가닥의 분절의 각각의 뉴클레오타이드 단량체와 염기 쌍을 형성할 수 있는 상황을 의미한다. 100% 미만의 상보성은 2개의 올리고뉴클레오타이드 가닥(또는 2개의 올리고뉴클레오타이드 가닥의 2개의 분절)의 뉴클레오타이드 단량체의 모두가 아닌 몇몇이 서로와 염기 쌍을 형성할 수 있는 상황을 의미한다. "실질적인 상보성"은 서로와의 90% 이상의 상보성을 나타내는 2개의 올리고뉴클레오타이드 가닥(또는 2개의 올리고뉴클레오타이드 가닥의 분절)을 의미한다. "충분히 상보성"은 표적 mRNA에 의해 코딩된 단백질의 양의 감소가 있도록 표적 mRNA와 핵산 저해제 분자 사이의 상보성을 의미한다.
상보성 가닥: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "상보성 가닥"은 다른 가닥에 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보성인 이중 가닥 핵산 저해제 분자의 가닥을 의미한다.
종래의 안티센스 올리고뉴클레오타이드: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "종래의 안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 하기 기전 중 하나에 의해 표적화된 유전자의 발현을 나타내는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다: (1) 입체 장애, 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어 유전자의 전사, 프레-mRNA의 스플라이싱 및 mRNA의 번역을 직접적으로 방해함으로써 유전자 발현 및/또는 코딩된 단백질의 생성에 관여한 사건의 순서에서 몇몇 단계; (2) RNase H에 의한 표적화된 유전자의 RNA 전사체의 효소 분해의 유도; (3) RNase L에 의한 표적화된 유전자의 RNA 전사체의 효소 분해의 유도; (4) RNase P에 의한 표적화된 유전자의 RNA 전사체의 효소 분해의 유도: (5) 이중 가닥 RNase에 의한 표적화된 유전자의 RNA 전사체의 효소 분해의 유도; 및 (6) 조합된 입체 장애 및 동일한 안티센스 올리고에서 효소 분해 활성의 유도를 방해한다. 종래의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 RNAi 저해제 분자와 같이 RNAi 작용 기전을 갖지 않는다. RNAi 저해제 분자는 안티센스 가닥이 Ago2 단백질을 의도된 표적(들)에 지향시키도록 RNAi 안티센스 가닥과 조합하는 Ago2에 대한 요건을 포함하는 몇몇 방식으로 그리고 Ago2가 표적의 침묵화에 필요한 경우에서 종래의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로부터 구별될 수 있다.
CRISPR RNA: 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문구조 반복서열(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat: "CRISPR")은 침범 파지 및 플라스미드에 대한 방어에 관여된 미생물 뉴클레아제 시스템이다. Wright et al., Cell, 2016, 164:29-44. 이 원핵생물 시스템은 진핵 세포의 게놈에서 관심 대상의 표적 핵산 서열을 편집하는 데 사용하기 위해 적응되었다. Cong et al., Science, 2013, 339:819-23; Mali et al., Science, 2013, 339:823-26; Woo Cho et al., Nat. Biotechnology, 2013,31(3):230-232. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "CRISPR RNA"는 "CRISPR" RNA(crRNA) 부분 및/또는 전사 촉진 crRNA(tracrRNA) 부분을 포함하는 핵산을 의미하고, 여기서 CRISPR 부분은 표적 핵산에 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보성인 제1 서열 및 tracrRNA 부분에 충분히 상보성인 제2 서열(트레이서 메이트 서열이라고도 칭함)을 가져서, 트레이서 메이트 서열 및 tracrRNA 부분은 혼성화하여 가이드 RNA를 형성한다. 가이드 RNA는 엔도뉴클레아제, 예컨대, Cas 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9)와 복합체를 형성하고, 표적 핵산의 절단을 매개하도록 뉴클레아제를 지시한다. 소정의 실시형태에서, crRNA 부분은 tracrRNA 부분에 융합되어서 키메라 가이드 RNA를 형성한다. Jinek et al., Science, 2012, 337:816-21. 소정의 실시형태에서, crRNA 부분의 제1 서열은 표적 핵산에 혼성화하는 약 16개 내지 약 24개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 약 20개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 가이드 RNA는 약 10개 내지 500개의 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 가이드 RNA는 약 20개 내지 100개의 뉴클레오타이드이다.
사이클로알킬: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "사이클로알킬"은 3개 내지 12개 탄소, 예를 들어 3개 내지 8개의 탄소 및 예를 들어 3개 내지 6개의 탄소를 함유하는 사이클릭(즉, 고리 함유) 탄화수소 기를 의미한다. "치환된 사이클로알킬"은 1개 이상의 치환기를 추가로 보유하는 사이클로알킬기를 의미한다.
전달 물질: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "전달 물질"은 올리고뉴클레오타이드와 복합체 형성하고 이에 결합되고, 세포로의 이의 진입을 매개하는 형질주입 물질 또는 리간드를 의미한다. 상기 용어는 예를 들어 올리고뉴클레오타이드의 음전하에 결합하는 순 양이온을 갖는 양이온성 리포솜을 포함한다. 이 용어는 또한 소정의 조직에 전달을 지시하도록 올리고뉴클레오타이드에 공유 부착될 수 있는 본 명세서에 기재된 바와 같은 접합체, 예컨대, GalNAc 및 콜레스테롤을 포함한다. 추가의 특정한 적합한 전달 물질은 본 명세서에 또한 기재되어 있다.
데옥시리보뉴클레오타이드 : 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "데옥시리보뉴클레오타이드"는 당 모이어티의 2'-위치에서 수소기를 갖는 뉴클레오타이드를 의미한다.
다이설파이드: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "다이설파이드"는 기
Figure 112019031696560-pct00001
를 함유하는 화학 화합물을 의미한다. 통상적으로, 각각의 황 원자는 탄화수소 기에 공유 결합된다. 소정의 실시형태에서, 적어도 1개의 황 원자는 탄화수소 이외의 기에 공유 결합된다. 연결은 또한 SS-결합 또는 다이설파이드 브리지(bridge)라 칭해진다.
듀플렉스: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 핵산(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드)과 관련하여 용어 "듀플렉스"는 뉴클레오타이드의 2개의 역평형 서열의 상보성 염기 짝짓기를 통해 형성된 이중 나선 구조를 의미한다.
부형제: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "부형제"는 예를 들어 원하는 일치성 또는 안정화 효과를 제공하거나 기여하도록 조성물에 포함될 수 있는 비치료제를 의미한다.
퓨라노스: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "퓨라노스"는 5원 고리 구조를 갖는 탄수화물을 의미하고, 여기서 고리 구조는 4개의 탄소 원자 및 1개의 산소 원자를 갖고, 화학식 XVII로 표시된다:
Figure 112019031696560-pct00002
화학식 XVII에서, 숫자는 5원 고리 구조에서의 4개의 탄소 원자의 위치를 나타낸다.
글루타티온: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "글루타티온"(GSH)은 하기 화학식 XVIII의 구조를 갖는 트리펩타이드를 의미한다. GSH는 대략 1 내지 10mM의 농도로 세포에 존재한다. GSH는 다이설파이드 결합을 포함하여 글루타티온 민감성 결합을 환원시킨다. 공정에서, 글루타티온은 글루타티온 다이설파이드(GSSG)인 이의 산화된 형태로 전환된다. 산화되면, 글루타티온은 전자 도너로서 NADPH를 사용하여 글루타티온 환원효소에 의해 다시 환원될 수 있다.
Figure 112019031696560-pct00003
글루타티온 민감성 화합물 또는 글루타티온 민감성 모이어티: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "글루타티온 민감성 화합물" 또는 "글루타티온 민감성 모이어티"는 상호 교환되어 사용되고, 임의의 화학 화합물(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드) 또는 적어도 하나의 글루타티온 민감성 결합, 예컨대, 다이설파이드 브리지 또는 설포닐기를 함유하는 모이어티를 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "글루타티온 민감성 올리고뉴클레오타이드"는 글루타티온 민감성 결합을 함유하는 적어도 1개의 뉴클레오타이드를 함유하는 올리고뉴클레오타이드이다.
할로: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "할로" 및 "할로겐"은 상호 교환 가능하고, 불소, 염소, 브롬 및 요오드로부터 선택된 원자를 의미한다.
할로알킬: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "할로알킬"은 1개 이상의 할로겐 원자가 부착된 알킬기를 의미하고, 클로로메틸, 브로모에틸, 트리플루오로메틸 등과 같은 기에 의해 예시된다.
헤테로아릴: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "헤테로아릴"은 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 적어도 1개의 이종원자를 함유하는 방향족 고리 시스템을 의미한다. 헤테로아릴 고리는 하나 이상의 헤테로아릴 고리, 방향족 또는 비방향족 탄화수소 고리 또는 헤테로사이클로알킬 고리에 융합되거나 달리 부착될 수 있다.
헤테로사이클: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "헤테로사이클" 또는 "복소환식"은 고리 구조의 일부로서 1개 이상의 이종원자(예를 들어, N, O, S 등)를 함유하고 3개 내지 14개의 탄소 원자의 범위를 갖는 비방향족 사이클릭(즉, 고리 함유) 기를 의미한다. "치환된 복소환식" 또는 "치환된 헤테로사이클"은 1개 이상의 치환기를 추가로 보유하는 복소환식 기를 의미한다.
뉴클레오타이드간 연결기: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "뉴클레오타이드간 연결기" 또는 "뉴클레오타이드간 연결"은 2개의 뉴클레오사이드 모이어티를 공유 연결시킬 수 있는 화학 기를 의미한다. 통상적으로, 화학기는 포스포 또는 포스파이트 기를 함유하는 인 함유 연결 기이다. 포스포 연결기는 포스포다이에스터 연결, 포스포로di티오에이트연결, 포스포로티오에이트연결, 포스포트리에스터 연결, 티오노알킬포스포네이트 연결, 티온알킬포스포트리에스터 연결, 포스포르아미다이트 연결, 포스포네이트 연결 및/또는 보라노포스페이트 연결을 포함하도록 의도된다. 많은 인 함유 연결은 예를 들어 미국 특허 제3,687,808호; 제4,469,863호; 제4,476,301호; 제5,023,243호; 제5,177,196호; 제5,188,897호; 제5,264,423호; 제5,276,019호; 제5,278,302호; 제5,286,717호; 제5,321,131호; 제5,399,676호; 제5,405,939호; 제5,453,496호; 제5,455,233호; 제5,466,677호; 제5,476,925호; 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,306호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 제5,194,599호; 제5,565,555호; 제5,527,899호; 제5,721,218호; 제5,672,697호 및 제5,625,050호에 개시된 바대로 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 다른 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 인 원자를 함유하지 않는 1개 이상의 뉴클레오타이드간 연결기, 예컨대, 짧은 사슬 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오타이드간 연결, 혼합된 이종원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오타이드간 연결, 또는 1개 이상의 짧은 사슬 이종원자 또는 복소환식 뉴클레오타이드간 연결, 예를 들어 실록산 골격; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격; 폼아세틸 및 티오폼아세틸 골격; 메틸렌 폼아세틸 및 티오폼아세틸 골격; 리보아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아미드 골격; 및 아미드 골격을 갖는 것(이들로 제한되지는 않음)을 함유한다. 인 비함유 연결은 예를 들어 미국 특허 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,185,444호; 제5,214,134호; 제5,216,141호; 제5,235,033호; 제5,264,562호; 제5,264,564호; 제5,405,938호; 제5,434,257호; 제5,466,677호; 제5,470,967호; 제5,489,677호; 제5,541,307호; 제5,561,225호; 제5,596,086호; 제5,602,240호; 제5,610,289호; 제5,602,240호; 제5,608,046호; 제5,610,289호; 제5,618,704호; 제5,623,070호; 제5,663,312호; 제5,633,360호; 제5,677,437호; 제5,792,608호; 제5,646,269호 및 제5,677,439호에 개시된 바대로 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
루프: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "루프"는 특정한 단일 가닥 뉴클레오타이드 영역을 플랭킹하는 상보성 영역이 상보성 영역 사이의 단일 가닥 뉴클레오타이드 영역이 듀플렉스 형성 또는 왓슨-크릭 염기 짝짓기로부터 배제되는 방식으로 혼성화는 핵산의 단일 가닥에 의해 형성된 구조를 의미한다. 루프는 임의의 길이의 단일 가닥 뉴클레오타이드 영역이다. 루프의 예는 헤어핀 및 테트라루프와 같은 구조에 존재하는 쌍을 짓지 않은 뉴클레오타이드를 포함한다.
마이크로RNA: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "마이크로RNA", "성숙 마이크로RNA", "miRNA" 및 "miR"은 상호 교환 가능하고, 식물 및 동물의 게놈에서 코딩된 비코딩 RNA 분자를 의미한다. 통상적으로, 성숙 마이크로RNA는 약 18개 내지 25개의 뉴클레오타이드의 길이이다. 소정의 경우에, 고도로 보존된, 내인성으로 발현된 마이크로RNA는 특이적 mRNA의 3'-비번역된 영역(3'-UTR)에 결합함으로써 유전자의 발현을 조절한다. 소정의 성숙 마이크로RNA는 대개 수백 개의 뉴클레오타이드 길이인 긴 내인성 1차 마이크로RNA 전사체(프레-마이크로RNA, 프리-마이크로RNA, 프리-미르, 프리-miR 또는 프리-프레-마이크로RNA로도 공지됨)로부터 기원하는 것으로 보인다(Lee, et al., EMBO J., 2002, 21(17), 4663-4670).
변형된 뉴클레오사이드: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "변형된 뉴클레오사이드"는 1개 이상의 변형된 또는 보편적 핵염기 또는 변형된 당을 함유하는 뉴클레오사이드를 의미한다. 변형된 또는 보편적 핵염기(본 명세서에서 염기 유사체라고도 칭함)는 일반적으로 뉴클레오사이드 당 모이어티의 1'-위치에 위치하고, 1'-위치에서 아데닌, 구아닌, 사이토신, 타이민 및 유라실 이외의 핵염기를 의미한다. 소정의 실시형태에서, 변형된 또는 보편적 핵염기는 질소성 염기이다. 소정의 실시형태에서, 변형된 핵염기는 질소 원자를 함유하지 않는다. 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 제20080274462호를 참조한다. 소정의 실시형태에서, 변형된 뉴클레오타이드는 핵염기(비염기성)를 함유하지 않는다. 변형된 당(본 명세서에서 당 유사체라고도 칭함)은 예를 들어 당의 2'-, 3'-, 4'- 또는 5'-탄소 위치에서 변형이 생긴 변형된 데옥시리보스 또는 리보스 모이어티를 포함한다. 변형된 당은 또한 잠금 핵산("LNA")(예를 들어, Koshkin et al. (1998), Tetrahedron, 54,3607-3630 참조); 브릿징된 핵산("BNA")(예를 들어, 미국 특허 제7,427,672호 및 Mitsuoka et al. (2009), Nucleic Acids Res., 37(4):1225-38 참조); 및 잠금해제 핵산("UNA")(예를 들어, Snead et al. (2013), Molecular Therapy - Nucleic Acids, 2,e103(doi: 10.1038/mtna.2013.36) 참조)에 존재하는 것과 같은 비천연 대안적인 탄소 구조를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 맥락에서 적합한 변형된 또는 보편적 핵염기 또는 변형된 당은 본 명세서에 기재되어 있다.
변형된 뉴클레오타이드: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "변형된 뉴클레오타이드"는 1개 이상의 변형된 또는 보편적 핵염기, 변형된 당 또는 변형된 포스페이트를 함유하는 뉴클레오타이드를 의미한다. 변형된 또는 보편적 핵염기(본 명세서에서 염기 유사체라고도 칭함)는 일반적으로 뉴클레오사이드 당 모이어티의 1'-위치에서 위치하고, 1'-위치에서 아데닌, 구아닌, 사이토신, 타이민 및 유라실 이외의 핵염기를 의미한다. 소정의 실시형태에서, 변형된 또는 보편적 핵염기는 질소성 염기이다. 소정의 실시형태에서, 변형된 핵염기는 질소 원자를 함유하지 않는다. 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 제20080274462호를 참조한다. 소정의 실시형태에서, 변형된 뉴클레오타이드는 핵염기(비염기성)를 함유하지 않는다. 변형된 당(본 명세서에서 당 유사체라고도 칭함)은 예를 들어 당의 2'-, 3'-, 4'- 또는 5'-탄소 위치에서 변형이 생긴 변형된 데옥시리보스 또는 리보스 모이어티를 포함한다. 변형된 당은 또한 잠금 핵산("LNA")(예를 들어, Koshkin et al. (1998), Tetrahedron, 54,3607-3630 참조); 브릿징된 핵산("BNA")(예를 들어, 미국 특허 제7,427,672호 및 Mitsuoka et al. (2009), Nucleic Acids Res., 37(4):1225-38 참조); 및 잠금해제 핵산(unlocked nucleic acid: "UNA")(예를 들어, Snead et al. (2013), Molecular Therapy - Nucleic Acids, 2,e103(doi: 10.1038/mtna.2013.36) 참조)에 존재하는 것과 같은 비천연 대안적인 탄소 구조를 포함할 수 있다. 변형된 포스페이트기는 천연 뉴클레오타이드에 생기지 않고 본 명세서에 기재된 바와 같은 비천연 발생 포스페이트 모방체를 포함하는 포스페이트기의 변형을 의미한다. 변형된 포스페이트기는 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 인 함유 뉴클레오타이드간 연결기 및 인 비함유 연결기 둘 다를 포함하는 비천연 발생 뉴클레오타이드간 연결기를 포함한다. 본 개시내용의 맥락에서 적합한 변형된 또는 보편적 핵염기, 변형된 당, 또는 변형된 포스페이트는 본 명세서에 기재되어 있다.
네이키드 올리고뉴클레오타이드: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "네이키드 올리고뉴클레오타이드"는 보호성 지질 나노입자 또는 다른 보호성 제제에서 제제화되지 않고 이에 따라 생체내 투여될 때 혈액 및 엔도솜/리소좀 구획에 노출되는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
천연 뉴클레오사이드 : 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "천연 뉴클레오사이드"는 당과의 N-글라이코시드 연결에서 복소환식 질소성 염기(예를 들어, 데옥시리보스 또는 리보스 또는 이의 유사체)를 의미한다. 천연 복소환식 질소성 염기는 아데닌, 구아닌, 사이토신, 유라실 및 타이민을 포함한다.
천연 뉴클레오타이드: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "천연 뉴클레오타이드"는 포스페이트기에 연결된 당과의 N-글라이코시드 연결에서 복소환식 질소성 염기(예를 들어, 리보스 또는 데옥시리보스 또는 이의 유사체)를 의미한다. 천연 복소환식 질소성 염기는 아데닌, 구아닌, 사이토신, 유라실 및 타이민을 포함한다.
핵산 저해제 분자: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "핵산 저해제 분자"는 표적 유전자의 발현을 감소시키거나 제거하는 올리고뉴클레오타이드 분자를 의미하고, 여기서 올리고뉴클레오타이드 분자는 표적 유전자 mRNA에서 서열을 특이적으로 표적화하는 영역을 함유한다. 통상적으로, 핵산 저해제 분자의 표적화 영역은 기재된 표적 유전자에 핵산 저해제 분자의 효과를 지시하도록 표적 유전자 mRNA에서의 서열에 충분히 상보성인 서열을 포함한다. 핵산 저해제 분자는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 및/또는 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
뉴클레오사이드 : 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "뉴클레오사이드"는 천연 뉴클레오타이드 또는 변형된 뉴클레오사이드를 의미한다.
뉴클레오타이드: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "뉴클레오타이드"는 천연 뉴클레오타이드 또는 변형된 뉴클레오타이드를 의미한다.
뉴클레오타이드 위치: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "뉴클레오타이드 위치"는 5' 말단에서 뉴클레오타이드로부터 계수되면서 올리고뉴클레오타이드에서의 뉴클레오타이드의 위치를 의미한다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 1번 위치는 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단 뉴클레오타이드를 의미한다.
올리고뉴클레오타이드 : 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "올리고뉴클레오타이드"는, 본 명세서에 사용된 바대로, 2개 내지 2500개의 뉴클레오타이드의 범위의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 의미한다. 올리고뉴클레오타이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 통상적으로, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드가 유전자 치료에서 사용될 때 500개 내지 1500개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 단일 또는 이중 가닥이고, 7개 내지 100개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 단일 또는 이중 가닥이고, 15개 내지 100개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 다른 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 통상적으로, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드가 핵산 저해제 분자일 때 단일 또는 이중 가닥이고, 15개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 다른 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 통상적으로, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드가 핵산 저해제 분자일 때 단일 또는 이중 가닥이고, 25개 내지 40개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 훨씬 다른 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 통상적으로, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드가 이중 가닥 핵산 저해제 분자이고, 적어도 18개 내지 25개의 염기 쌍의 듀플렉스를 형성할 때 단일 또는 이중 가닥이고, 19개 내지 40개 또는 19개 내지 25개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 다른 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 통상적으로, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 뉴클레오타이드가 단일 가닥 RNAi 저해제 분자일 때 단일 가닥이고, 15개 내지 25개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 통상적으로, 올리고뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 1개 이상의 인 함유 뉴클레오타이드간 연결기를 함유한다. 다른 실시형태에서, 뉴클레오타이드간 연결기는 본 명세서에 기재된 바와 같은 인 비함유 연결이다.
오버행: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "오버행"은 이중 가닥 핵산 저해제 분자의 어느 한 가닥의 어느 한 말단에서 말단의 비염기 짝짓기 뉴클레오타이드(들)를 의미한다. 소정의 실시형태에서, 오버행은 제1 가닥 또는 영역이 듀플렉스를 형성하는 상보성 가닥의 말단 뒤로 연장되는 하나의 가닥 또는 영역으로부터 생긴다. 염기 쌍의 수소 결합을 통해 듀플렉스를 형성할 수 있는 2개의 올리고뉴클레오타이드 영역의 하나 또는 둘 다는 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 영역이 공유한 상보성의 3'- 및/또는 5'-말단 뒤로 연장하는 5'- 및/또는 3'-말단을 가질 수 있다. 듀플렉스의 3'-및/또는 5'-말단 뒤로 연장하는 단일 가닥 영역은 오버행이라 칭해진다.
약제학적 조성물: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "약제학적 조성물"은 약물학적 유효량의 포스페이트 유사체-변형된 올리고뉴클레오타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "약물학적 유효량", "치료학적 유효량" 또는 "유효량"은 의도된 약물학적, 치료학적 또는 예방적 결과를 생성시키기에 효과적인 본 개시내용의 포스페이트 유사체-변형된 올리고뉴클레오타이드의 양을 의미한다.
약제학적으로 허용 가능한 부형제: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "약제학적으로 허용 가능한 부형제"는 합당한 이익/위험 비율에 알맞는 부당한 불리한 부작용(예컨대, 독성, 자극 및 알레르기 반응)이 없이 인간 및/또는 동물과 사용하기에 적합하다는 것을 의미한다.
포스포르아미다이트: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "포스포르아미다이트"는 질소 함유 3가 인 유도체를 의미한다. 적합한 포스포르아미다이트의 예는 본 명세서에 기재되어 있다.
효력: 본 명세서에 사용된 바와 같은, "효력"은 세포에서 의도된 표적에 대한 활성의 특정한 수준을 얻도록 생체내 또는 시험관내 투여되어야 하는 올리고뉴클레오타이드 또는 다른 약물의 양을 의미한다. 예를 들어, 1㎎/㎏의 투약량에서 대상체에서 표적의 발현을 90% 억제하는 올리고뉴클레오타이드는 100㎎/㎏의 투약량에서 대상체에서 표적의 발현을 90% 억제하는 올리고뉴클레오타이드보다 큰 효력을 갖는다.
보호기: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "보호기"는 작용기가 원하는 반응의 소정의 조건 하에 가역적으로 비반응성이 되게 하는 기로서 종래의 화학 의미에서 사용된다. 원하는 반응 후, 보호기는 보호된 작용기를 탈보호하도록 제거될 수 있다. 모든 보호기는 합성되는 분자의 실질적인 부분을 분해하지 않는 조건 하에 제거 가능해야 한다.
리보뉴클레오타이드 : 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "리보뉴클레오타이드"는 당 모이어티의 2'-위치에서 하이드록실 기를 갖는 천연 또는 변형된 뉴클레오타이드를 의미한다.
리보자임: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "리보자임"은 DNA 또는 RNA 중 어느 하나일 수 있는 구별되는 표적 핵산 서열을 특이적으로 인식하고 절단하는 촉매 핵산 분자를 의미한다. 각각의 리보자임은 2개의 결합 도메인(1개는 촉매 도메인의 어느 한쪽에 있음)으로 이루어진 촉매 성분("촉매 도메인"이라고도 칭함) 및 표적 서열 결합 성분을 갖는다.
RNAi 저해제 분자: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "RNAi 저해제 분자"는 (a) 센스 가닥(운송) 및 안티센스 가닥(가이드)을 갖는 이중 가닥 핵산 저해제 분자("dsRNAi 저해제 분자")(여기서, 안티센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 부분은 표적 mRNA의 절단에서 아르고노트 2(Ago2) 엔도뉴클레아제에 의해 사용됨) 또는 (b) 단일 안티센스 가닥을 갖는 단일 가닥 핵산 저해제 분자("ssRNAi 저해제 분자")(여기서, 안티센스 가닥(또는 안티센스 가닥의 부분)은 표적 mRNA의 절단에서 Ago2 엔도뉴클레아제에 의해 사용됨) 중 어느 하나이다.
센스 가닥: 이중 가닥 RNAi 저해제 분자는 안티센스 가닥 및 센스 가닥인 2개의 올리고뉴클레오타이드 가닥을 포함한다. 센스 가닥 또는 이의 영역은 이중 가닥 RNAi 저해제 분자의 안티센스 가닥 또는 이의 영역에 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보성이다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥에 비상보성인 뉴클레오타이드를 또한 함유할 수 있다. 비상보성 뉴클레오타이드는 상보성 서열의 어느 한 측에 있을 수 있거나, 상보성 서열의 양측에 있을 수 있다. 센스 가닥 또는 이의 영역이 안티센스 가닥 또는 이의 영역에 부분적으로 또는 실질적으로 상보성인 소정의 실시형태에서, 비상보성 뉴클레오타이드는 상보성의 하나 이상의 영역(예를 들어, 하나 이상의 미스매치) 사이에 위치할 수 있다. 센스 가닥은 또한 운송 가닥(passenger strand)이라 칭해진다.
치환기 또는 치환된: 용어 "치환기" 또는 "치환된"은, 본 명세서에 사용된 바대로, 치환기의 라디칼에 의한 주어진 구조에서의 수소 라디칼의 대체를 의미한다. 임의의 주어진 구조에서의 하나 초과의 위치가 1개 초과의 치환기에 의해 치환될 수 있을 때, 치환기는 달리 표시되지 않는 한 모든 위치에서 동일하거나 상이할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "치환된"은 유기 화합물에 맞는 모든 허용 가능한 치환기를 포함하도록 고안된다. 허용 가능한 치환기는 유기 화합물의 비사이클릭 및 사이클릭, 분지형 및 비분지형, 탄소환식 및 복소환식, 방향족 및 비방향족 치환기를 포함한다. 본 개시내용은 유기 화합물의 허용 가능한 치환기에 의해 임의의 방식으로 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
설포닐기: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "설포닐기"는 -SO2 -인 2가 기를 함유하는 화학 화합물을 의미한다. 소정의 실시형태에서, 황 원자는 2개의 탄소 원자 및 2개의 산소 원자에 공유 결합된다. 다른 실시형태에서, 황 원자는 탄소 원자, 질소 원자 및 2개의 산소 원자에 공유 결합된다.
전신 투여: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "전신 투여"는 혈류에서의 약물의 생체내 전신 흡수 또는 축적, 이어서 전신을 통한 분포를 의미한다.
표적 부위: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "표적 부위", "표적 서열", "표적 핵산", "표적 영역", "표적 유전자"는 상호 교환되어 사용되고, 예를 들어 표적 서열에 부분적으로, 실질적으로, 또는 완벽히 또는 충분히 상보성인 가이드/안티센스 영역 내에 서열을 함유하는 RNAi 저해제 분자에 의해 매개되는 절단에 대해 "표적된" RNA 또는 DNA 서열을 의미한다.
테트라루프: 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "테트라루프"는 인접한 왓슨-크릭 혼성화된 뉴클레오타이드의 안정성에 기여하는 안정한 2차 구조를 형성하는 루프(단일 가닥 영역)를 의미한다. 이론에 제한됨이 없이, 테트라루프는 적층 상호작용에 의해 인접한 왓슨-크릭 염기 쌍을 안정화시킬 수 있다. 또한, 테트라루프에서의 뉴클레오타이드 사이의 상호작용은 비-왓슨-크릭 염기 쌍 짓기, 적층 상호작용, 수소 결합 및 접촉 상호작용을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다(Cheong et al., Nature 1990; 346(6285):680-2; Heus and Pardi, Science 1991; 253(5016):191-4). 테트라루프는 랜덤 염기로 이루어진 단순한 모델 루프 서열로부터 예상된 것보다 높은 인접한 듀플렉스의 융점(Tm)의 증가를 부여한다. 예를 들어, 테트라루프는 적어도 2개의 염기 쌍 길이의 듀플렉스를 포함하는 헤어핀으로 10mM NaHPO4 중의 적어도 50℃, 적어도 55℃., 적어도 56℃, 적어도 58℃, 적어도 60℃, 적어도 65℃ 또는 적어도 75℃의 융점을 부여할 수 있다. 테트라루프는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드, 및 이들의 조합을 함유할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 테트라루프는 4개의 뉴클레오타이드로 이루어진다. 소정의 실시형태에서, 테트라루프는 5개의 뉴클레오타이드로 이루어진다.
RNA 테트라루프의 예는 테트라루프의 UNCG 패밀리(예를 들어, UUCG), 테트라루프의 GNRA 패밀리(예를 들어, GAAA) 및 CUUG 테트라루프를 포함한다. (Woese et al., PNAS, 1990, 87(21):8467-71; Antao et al., Nucleic Acids Res., 1991, 19(21):5901-5). DNA 테트라루프의 예는 테트라루프의 d(GNNA) 패밀리(예를 들어, 테트라루프의 d(GTTA), d(GNRA)) 패밀리, 테트라루프의 d(GNAB) 패밀리, 테트라루프의 d(CNNG) 패밀리 및 테트라루프의 d(TNCG) 패밀리(예를 들어, d(TTCG))를 포함한다. (Nakano et al. Biochemistry, 2002, 41(48):14281-14292. Shinji et al., Nippon Kagakkai Koen Yokoshu, 2000, 78(2):731).
I. 도입
본 출원은 포스페이트 유사체-변형된 올리고뉴클레오타이드, 예컨대, 핵산 저해제 분자를 제공한다. 관심 대상의 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단 뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 포스페이트 함유 모이어티에 의해 변형된다. 본 변형은 혈액에 및/또는 세포, 예를 들어 세포의 엔도솜/리소좀 구획 내에 존재하는 포스파타제 및/또는 뉴클레아제, 예를 들어 엑소뉴클레아제에 대해 올리고뉴클레오타이드를 보호하는 것을 도울 수 있으므로 생체내 사용에 특히 적합하다. 통상적으로, 포스페이트 유사체-변형된 올리고뉴클레오타이드는 핵산 저해제 분자, 예컨대, dsRNAi 저해제 분자, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 압타머, miRNA 및 ssRNAi 저해제 분자이다.
본 개시내용에 따라 포스페이트 유사체를 함유하는 5'-말단 뉴클레오타이드에 의해 올리고뉴클레오타이드를 합성하기 위해 사용될 수 있는 포스포르아미다이트 모이어티를 포함하는 포스페이트 유사체-변형된 뉴클레오사이드가 또한 제공된다.
II. 포스페이트 유사체-변형된 올리고뉴클레오타이드
일 양태는 통상적으로 5'-말단 뉴클레오타이드에서 4'-포스페이트 유사체를 포함하는 올리고뉴클레오타이드, 예컨대, 핵산 저해제 분자에 관한 것이다. 통상적으로, 4'-포스페이트 유사체는 옥시메틸기의 산소 원자가 당 모이어티 또는 이의 유사체의 4'-탄소에 결합된 옥시메틸포스포네이트이다. 다른 실시형태에서, 포스페이트 유사체는 티오메틸기의 황 원자 또는 아미노메틸기의 질소 원자가 당 모이어티 또는 이의 유사체의 4'-탄소에 결합된 티오메틸포스포네이트 또는 아미노메틸포스포네이트이다.
소정의 실시형태에서, 4'-포스페이트 유사체는 옥시메틸포스포네이트이다. 통상적으로, 옥시메틸포스포네이트는 -O-CH2-PO(OH)2 또는 -O-CH2-PO(OR)2(여기서, R은 H, CH3, 알킬기, CH2CH2CN, CH2OCOC(CH3)3, CH2OCH2CH2Si(CH3)3 또는 보호기로부터 독립적으로 선택됨)로 표시된다. 소정의 실시형태에서, 알킬기는 CH2CH3이다. 더 통상적으로, R은 H, CH3, 또는 CH2CH3으로부터 독립적으로 선택된다.
1. 화학식 I 및 II
몇몇 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 하기 화학식 I 또는 화학식 II로 표시된 5'-말단 뉴클레오타이드를 포함한다:
Figure 112019031696560-pct00004
Figure 112019031696560-pct00005
식 중,
Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, CH3, CH2CH3, CH2CH2CN, CH2OCOC(CH3)3, CH2OCH2CH2Si(CH3)3 또는 보호기로부터 선택되고;
B는 천연 핵염기, 변형된 핵염기, 보편적 염기이거나, 부재하고;
M1은 O, S, NR', CR'R"이고;
R4, R5, R6 또는 R7은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, OH, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬로부터 선택되거나, R4, R5, R6 및 R7 중 2개는 함께 취해져 5원 내지 8원 고리를 형성하고, 상기 고리는 선택적으로 이종원자를 함유하고;
X1은 부재하거나, O, S, NR' 또는 CR'R"로부터 선택되고;
Y는 5'-말단 뉴클레오타이드를 올리고뉴클레오타이드에 부착시키는 뉴클레오타이드간 연결기이고;
R8은 글루타티온 민감성 모이어티이거나, 부재하고;
R8이 글루타티온 민감성 모이어티인 경우, X2는 O, S, Se 또는 NR'이거나, R8이 부재하는 경우, X2는 H, OH, SH, NH2, 할로겐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알켄일, 선택적으로 치환된 알킨일, 선택적으로 치환된 알킬티오, 선택적으로 치환된 알킬아미노 또는 다이알킬아미노이고, 알킬, 알켄일 및 알킨일 내의 1개 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO2, N(R'), C(O), N(R')C(O)O, OC(O)N(R') 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 복소환식 또는 선택적으로 치환된 사이클로알킬, O, S, Se 또는 NHR' 중 하나 이상에 의해 중단될 수 있고;
R' 및 R"는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 치환된 또는 비치환된 지방족, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클 또는 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬이다.
소정의 실시형태에서, 5'-말단 뉴클레오타이드는 화학식 I로 표시된다.
소정의 실시형태에서, 5'-말단 뉴클레오타이드는 화학식 II로 표시된다.
소정의 실시형태에서, B는 천연 핵염기이다.
소정의 실시형태에서, M1은 O이다.
소정의 실시형태에서, 할로겐은 불소이다.
소정의 실시형태에서, R4, R5, R6 및 R7은 수소, 불소, CH3 또는 C1-C6 알킬로부터 독립적으로 선택된다. 통상적으로, R4, R5, R6 및 R7은 수소이다.
소정의 실시형태에서, X1은 O이다.
소정의 실시형태에서, Ra 및 Rb는 수소이다. 소정의 실시형태에서, Ra는 CH3이고, Rb는 수소이다. 소정의 실시형태에서, Ra 및 Rb는 CH3이다. 소정의 실시형태에서, Ra는 CH2CH3이고, Rb는 수소이다. 소정의 실시형태에서, Ra 및 Rb는 CH2CH3이다.
소정의 실시형태에서, M1은 O이고, X2는 O이고, R4, R5, R6 및 R7은 수소이다.
소정의 실시형태에서, X2는 O, S, Se 또는 NHR'이고, 여기서 R'는 수소, 할로겐, 치환된 또는 비치환된 지방족, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클 또는 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬로부터 선택되고, R8은 글루타티온 민감성 모이어티이다. 통상적으로, X2는 O이고, R8은 글루타티온 민감성 모이어티이고, 5'-말단 뉴클레오타이드는 화학식 I로 표시된다.
소정의 실시형태에서, X2는 할로겐 또는 선택적으로 치환된 알콕시이고, R8은 부재한다. 통상적으로, X2는 F, OCH2CH2OCH3 또는 OCH3이고, R8은 부재하고, 5'-말단 뉴클레오타이드는 화학식 I로 표시된다.
소정의 실시형태에서, M1은 O이고, X2는 O이고, R4, R5, R6 및 R7은 수소이고, B는 천연 핵염기이고; X1은 부재하거나 O이고, 5'-말단 뉴클레오타이드는 화학식 I로 표시된다.
2. 화학식 III
소정의 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 하기 화학식 III으로 표시된 5'-말단 뉴클레오타이드를 포함한다:
Figure 112019031696560-pct00006
식 중,
Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, CH3, CH2CH3, CH2CH2CN, CH2OCOC(CH3)3, CH2OCH2CH2Si(CH3)3 또는 보호기로부터 선택되고;
B는 천연 핵염기, 변형된 핵염기, 보편적 염기이거나, 부재하고;
Y는 5'-말단 뉴클레오타이드를 올리고뉴클레오타이드에 부착시키는 뉴클레오타이드간 연결기이고;
X2는 OH, F, OCH3 또는 OCH2CH2OCH3이고, R8은 부재하거나, X2는 O이고, R8은 글루타티온 민감성 모이어티이다.
소정의 실시형태에서, B는 천연 핵염기이다.
소정의 실시형태에서, Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, CH3 및 CH2CH3으로부터 선택된다.
소정의 실시형태에서, X2는 F 또는 OCH3이고, R8은 부재한다.
소정의 실시형태에서, X2는 O이고, R8은 글루타티온 민감성 모이어티이다.
소정의 실시형태에서, Ra 및 Rb는 수소이고, R8은 부재하고, X2는 F 또는 OCH3이다.
소정의 실시형태에서, Ra는 CH3이고, Rb는 수소이고, R8은 부재하고, X2는 F 또는 OCH3이다.
소정의 실시형태에서, Ra 및 Rb는 CH3이고, R8은 부재하고, X2는 F 또는 OCH3이다.
소정의 실시형태에서, Ra는 CH2CH3이고, Rb는 수소이고, R8은 부재하고, X2는 F 또는 OCH3이다.
소정의 실시형태에서, Ra 및 Rb는 CH2CH3이고, R8은 부재하고, 및 X2는 F 또는 OCH3이다.
3. 화학식 IV
소정의 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 하기 화학식 IV로 표시된 5'-말단 뉴클레오타이드를 포함한다:
Figure 112019031696560-pct00007
식 중,
B는 천연 핵염기, 변형된 핵염기, 보편적 염기이거나, 부재하고;
Y는 5'-말단 뉴클레오타이드를 올리고뉴클레오타이드에 부착시키는 뉴클레오타이드간 연결기이고;
X2는 OH, F, OCH3 또는 OCH2CH2OCH3이다.
소정의 실시형태에서, B는 천연 핵염기이다.
소정의 실시형태에서, X2는 F 또는 OCH3이다.
4. 화학식 V
소정의 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 하기 화학식 V로 표시된 5'-말단 뉴클레오타이드를 포함한다:
Figure 112019031696560-pct00008
식 중,
B는 천연 핵염기, 변형된 핵염기, 보편적 염기이거나, 부재하고;
Y는 5'-말단 뉴클레오타이드를 올리고뉴클레오타이드에 부착시키는 뉴클레오타이드간 연결기이고;
X2는 OH, F, OCH3 또는 OCH2CH2OCH3이다.
소정의 실시형태에서, B는 천연 핵염기이다.
소정의 실시형태에서, X2는 F 또는 OCH3이다.
5. 화학식 VI
일 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 하기 화학식 VI로 표시된 5'-말단 뉴클레오타이드를 포함한다:
Figure 112019031696560-pct00009
식 중,
Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, CH3, CH2CH3, CH2CH2CN, CH2OCOC(CH3)3, CH2OCH2CH2Si(CH3)3 또는 보호기로부터 선택되고;
V는 O이고;
Z는 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오사이드이고;
Y는 5'-말단 뉴클레오타이드를 올리고뉴클레오타이드에 부착시키는 뉴클레오타이드간 연결기이고;
V는 당 모이어티의 4'-탄소에 결합된다.
통상적으로, 당 모이어티는 퓨라노스이고, V는 퓨라노스의 4'-탄소에 결합된다.
소정의 실시형태에서, Ra 및 Rb는 수소이다. 소정의 실시형태에서, Ra는 CH3이고, Rb는 수소이다. 소정의 실시형태에서, Ra 및 Rb는 CH3이다. 소정의 실시형태에서, Ra는 CH2CH3이고, Rb는 수소이다. 소정의 실시형태에서, Ra 및 Rb는 CH2CH3이다.
6. 화학식 VII
일 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 하기 화학식 VII로 표시된 5'-말단 뉴클레오타이드를 포함한다:
Figure 112019031696560-pct00010
식 중,
R1은 O 또는 S이고;
R2 및 R3은 각각 독립적으로 OH, SH, NH2, OCH3, OR9, OCH2CH2CN, OCH2OCOC(CH3)3 및 OCH2OCH2CH2Si(CH3)3으로부터 선택되고, R9는 알킬이고, OH, SH 및 NH2는 보호기에 의해 선택적으로 보호되고;
V는 O, S, NR', CR'R"이고, R' 및 R"는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 치환된 또는 비치환된 지방족, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클 또는 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬이고;
Z는 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오사이드이고;
Y는 5'-말단 뉴클레오타이드를 올리고뉴클레오타이드에 부착시키는 뉴클레오타이드간 연결기이고;
V는 당 모이어티의 4'-탄소에 결합된다.
통상적으로, 당 모이어티는 퓨라노스이고, V는 퓨라노스의 4'-탄소에 결합된다.
소정의 실시형태에서, R2 또는 R3은 각각 독립적으로 OH, OCH3 또는 OR9로부터 선택되고, R9는 C1-C6 알킬이다. 소정의 실시형태에서, R9는 CH2CH3이다.
통상적으로, R1은 O이다.
소정의 실시형태에서, R1은 O이고; R2는 OH, OCH3 또는 OCH2CH3이고; R3은 OH, OCH3 또는 OCH2CH3이다. 소정의 실시형태에서, R1은 O이고; R2는 OH이고; R3은 OH이다. 소정의 실시형태에서, R1은 O이고; R2는 OCH3 또는 OCH2CH3이고; R3은 OH이다. 소정의 실시형태에서, R1은 O이고; R2는 OCH3이고; R3은 OH이다. 소정의 실시형태에서, R1은 O이고, R2 및 R3은 OCH3이다. 소정의 실시형태에서, R1은 O이고; R2는 OCH2CH3이고; R3은 OH이다. 소정의 실시형태에서, R1은 O이고, R2 및 R3은 O CH2CH3이다.
7. 화학식 VIII 또는 IX
몇몇 실시형태에서, 본 개시내용은 하기 화학식 VIII 또는 화학식 IX로 표시된 5'-말단 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 제공한다:
Figure 112019031696560-pct00011
Figure 112019031696560-pct00012
식 중,
R1은 O 또는 S이고;
R2 및 R3은 각각 독립적으로 OH, SH, NH2, OCH3, OR9, OCH2CH2CN, OCH2OCOC(CH3)3 및 OCH2OCH2CH2Si(CH3)3으로부터 선택되고, R9는 알킬이고, OH, SH, 및 NH2는 선택적으로 보호되고;
W는 N 또는 S이고;
B, M1, R4, R5, R6, R7, R8, X1, X2 및 Y는 화학식 I 또는 II에 기재된 바와 같다.
소정의 실시형태에서, W는 N이다.
소정의 실시형태에서, W는 S이다.
소정의 실시형태에서, R1은 O이다.
소정의 실시형태에서 R2 또는 R3은 각각 독립적으로 OH, OCH3 또는 OR9로부터 선택되고, R9는 C1-C6 알킬이다. 소정의 실시형태에서, R9는 CH2CH3이다.
통상적으로, R1은 O이다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 4'-포스페이트 유사체를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 관심 대상의 임의의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 화학식 I-IX의 올리고뉴클레오타이드는 7개 내지 100개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 다른 실시형태에서, 화학식 I-IX의 올리고뉴클레오타이드는 15개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 다른 실시형태에서, 화학식 I-IX의 올리고뉴클레오타이드는 25개 내지 40개의 뉴클레오타이드를 갖는. 훨신 다른 실시형태에서, 화학식 I-IX의 올리고뉴클레오타이드는 19개 내지 25개의 뉴클레오타이드를 갖는다.
A. 핵산 저해제 분자
소정의 실시형태에서, 4'-포스페이트 유사체를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 핵산 저해제 분자이다. 다양한 올리고뉴클레오타이드 구조는 단일 가닥 및 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 저해제 분자로서 사용되고, 임의의 이들 다양한 올리고뉴클레오타이드는 화학식 I-IX 중 임의의 하나의 5'-말단 뉴클레오타이드를 포함하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 4'-포스페이트 유사체-변형된 뉴클레오타이드를 포함하도록 변형될 수 있다.
이중 가닥 핵산 저해제 분자
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 핵산 저해제 분자는 센스(또는 패신저) 가닥 및 안티센스(또는 가이드) 가닥을 갖고, 본 명세서에 기재된 바와 같은 4'-포스페이트 유사체를 갖는 적어도 1개의 뉴클레오타이드를 포함하는 이중 가닥 RNAi 저해제 분자이다. 상기 기재된 바대로, 예를 들어 (a) 1개 내지 5개의 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 3'-오버행을 갖는 19개 내지 25개의 뉴클레오타이드의 크기를 갖는 각각의 가닥을 갖는 이중 가닥 핵산 분자(예를 들어, 미국 특허 제8,372,968호 참조); (b) RNAi 저해제 분자를 활성화시키는 다이서 효소에 의해 생체내 가공되는 더 긴 이중 가닥 RNAi 저해제 분자(예를 들어, 미국 특허 제8,883,996호 참조); 및 (c) 적어도 하나의 가닥의 적어도 하나의 말단이 분자의 이중 가닥 표적화 영역 뒤로 연장된 이중 가닥 핵산 저해제 분자, 예를 들어 열역학적으로 안정화시키는 테트라루프 구조를 포함하는 구조(예를 들어, 미국 특허 제8,513,207호, 미국 특허 제8,927,705호, WO 제2010/033225호 및 WO 제2016/100401호(이들 이중 가닥 핵산 저해제 분자의 이의 개시내용을 위해 참고로 포함됨) 참조)를 포함하여, 다양한 이중 가닥 RNAi 저해제 분자 구조가 당해 분야에 공지되어 있다.
dsRNAi 저해제 분자의 몇몇 실시형태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 15개 내지 66개, 25개 내지 40개 또는 19개 내지 25개의 뉴클레오타이드의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 센스 가닥은 18개 내지 66개의 뉴클레오타이드의 길이이다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥은 18개 내지 25개의 뉴클레오타이드의 길이이다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥은 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개 또는 24개의 뉴클레오타이드의 길이이다. 소정의 이들 실시형태에서, 센스 가닥은 25개 내지 45개의 뉴클레오타이드의 길이이다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥은 30개 내지 40개의 뉴클레오타이드의 길이이다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥은 36개, 37개, 38개, 39개 또는 40개의 뉴클레오타이드의 길이이다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥은 25개 내지 30개의 뉴클레오타이드의 길이이다. 소정의 이들 실시형태에서, 센스 가닥은 25개, 26개 또는 27개의 뉴클레오타이드의 길이이다.
dsRNAi 저해제 분자의 몇몇 실시형태에서, 안티센스 가닥은 18개 내지 66개의 뉴클레오타이드의 길이이다. 통상적으로, 안티센스 가닥은 표적 유전자에 핵산 저해제 분자의 효과를 지시하도록 표적 유전자 mRNA에서의 서열에 충분히 상보성인 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 안티센스 가닥은 표적 유전자 mRNA에 함유된 서열과 완전히 상보성인 서열을 포함하고, 여기서 완전히 상보성인 서열은 18개 내기 40개의 뉴클레오타이드의 길이이다. 소정의 이들 실시형태에서, 안티센스 가닥은 20개 내지 50개의 뉴클레오타이드의 길이이다. 소정의 실시형태에서, 안티센스 가닥은 20개 내지 30개의 뉴클레오타이드의 길이이다. 소정의 실시형태에서, 안티센스 가닥은 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개 또는 28개의 뉴클레오타이드의 길이이다. 소정의 실시형태에서, 안티센스 가닥은 35개 내지 40개의 뉴클레오타이드의 길이이다. 소정의 이들 실시형태에서, 안티센스 가닥은 36개, 37개, 38개 또는 39개의 뉴클레오타이드의 길이이다.
dsRNAi 저해제 분자의 몇몇 실시형태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 15개 내지 50개의 염기 쌍을 갖는 듀플렉스 구조를 형성한다. 소정의 실시형태에서, 듀플렉스 영역은 15개 내지 45개의 염기 쌍 길이, 더 통상적으로 15개 내지 30개의 염기 쌍 길이, 예컨대, 18개 내지 30개, 더 통상적으로 18개 내지 26개 또는 21개 내지 26개, 예컨대, 19개 내지 23개, 및 소정의 경우에, 19개 내지 21개의 염기 쌍 길이이다. 소정의 실시형태에서, 이중 가닥 영역은 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개 또는 26개의 염기 쌍 길이이다.
몇몇 실시형태에서, dsRNAi 저해제 분자는 하나 이상의 단일 가닥 뉴클레오타이드 오버행(들)을 추가로 포함할 수 있다. 통상적으로, dsRNAi 저해제 분자는 1개 내지 10개, 1개 내지 4개 또는 1개 내지 2개의 뉴클레오타이드의 단일 가닥 오버행을 갖는다. 단일 가닥 오버행은 통상적으로 센스 가닥의 3' 말단 및/또는 안티센스 가닥의 3' 말단에 위치한다. 소정의 실시형태에서, 1개 내지 10개, 1개 내지 4개 또는 1개 내지 2개의 뉴클레오타이드의 단일 가닥 오버행은 안티센스 가닥의 5' 말단에 위치한다. 소정의 실시형태에서, 1개 내지 10개, 1개 내지 4개 또는 1개 내지 2개의 뉴클레오타이드의 단일 가닥 오버행은 센스 가닥의 5' 말단에 위치한다. 소정의 실시형태에서, 1개 내지 2개의 뉴클레오타이드의 단일 가닥 오버행은 안티센스 가닥의 3' 말단에 위치한다. 소정의 실시형태에서, 10개의 뉴클레오타이드의 단일 가닥 오버행은 안티센스 가닥의 5' 말단에 위치한다. 소정의 실시형태에서, dsRNAi 저해제 분자는 통상적으로 안티센스 가닥의 5' 말단에서 무딘 말단을 갖는다.
몇몇 실시형태에서, dsRNAi 저해제 분자는 19개 내지 21개의 뉴클레오타이드의 센스 및 안티센스 가닥 및 듀플렉스 영역을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 19개 내지 21개의 뉴클레오타이드 길이이고, 안티센스 가닥은 21개 내지 23개의 뉴클레오타이드 길이이고, 이의 3' 말단에서 1개 내지 2개의 뉴클레오타이드의 단일 가닥 오버행을 포함한다.
소정의 실시형태에서, dsRNAi 저해제 분자는 21개의 뉴클레오타이드 길이의 안티센스 가닥 및 21개의 뉴클레오타이드 길이의 센스 가닥을 갖고, 여기서 분자의 오른쪽 측에서 2개의 뉴클레오타이드 3'-센스 가닥 오버행(센스 가닥의 3' 말단/안티센스 가닥의 5' 말단) 및 안티센스 가닥의 3' 말단에서 2개의 뉴클레오타이드의 단일 가닥 오버행이 존재한다. 이러한 분자에서, 19개의 염기 쌍 듀플렉스 영역이 존재한다.
소정의 실시형태에서, dsRNAi 저해제 분자는 23개의 뉴클레오타이드 길이의 안티센스 가닥 및 21개의 뉴클레오타이드 길이의 센스 가닥을 갖고, 여기서 분자의 오른쪽 측에서 무딘 말단(센스 가닥의 3' 말단/안티센스 가닥의 5' 말단) 및 분자의 왼쪽 측에서 2개의 뉴클레오타이드 3'-센스 가닥 오버행(센스 가닥의 5' 말단/안티센스 가닥의 3' 말단)이 존재한다. 이러한 분자에서, 21개의 염기 쌍 듀플렉스 영역이 존재한다.
소정의 실시형태에서, dsRNAi 저해제 분자는 18개 내지 34개의 뉴클레오타이드의 센스 및 안티센스 가닥 및 듀플렉스 영역을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 25개 내지 34개의 뉴클레오타이드 길이이고, 안티센스 가닥은 26개 내지 38개의 뉴클레오타이드 길이이고, 이의 3' 말단에서 1개 내지 5개의 단일 가닥 뉴클레오타이드를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥은 26개의 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥은 38개의 뉴클레오타이드이고, 이의 3' 말단에서 2개의 뉴클레오타이드의 단일 가닥 오버행 및 이의 5' 말단에서 10개의 뉴클레오타이드의 단일 가닥 오버행을 갖고, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 26개의 뉴클레오타이드의 듀플렉스 영역을 형성한다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥은 25개의 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥은 27개의 뉴클레오타이드이고, 이의 3' 말단에서 2개의 뉴클레오타이드의 단일 가닥 오버행을 갖고, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 25개의 뉴클레오타이드의 듀플렉스 영역을 형성한다.
몇몇 실시형태에서, dsRNAi 저해제 분자는 줄기 및 루프를 포함한다. 통상적으로, dsRNAi 저해제 분자의 운송 가닥의 3'-말단 영역 또는 5'-말단 영역은 줄기 및 루프 구조를 형성한다.
몇몇 실시형태에서, dsRNAi 저해제 분자는 줄기 및 테트라루프를 함유한다. dsRNAi 저해제 분자가 줄기 및 테트라루프를 함유하는 실시형태에서, 운송 가닥은 줄기 및 테트라루프를 함유하고, 20개 내지 66개의 뉴클레오타이드 길이의 범위이다. 통상적으로, 가이드 및 운송 가닥은 인접한 올리고뉴클레오타이드를 형성하지 않는 5' 및 3' 말단을 갖는 별개의 가닥(때때로 "닉키드" 구조라 칭함)이다.
소정의 이들 실시형태에서, 가이드 가닥은 15개 내지 40개의 뉴클레오타이드의 길이이다. 소정의 실시형태에서, 줄기 및 테트라루프를 함유하는 운송 가닥의 연장된 부분은 가닥의 3' 말단에 있다. 소정의 다른 실시형태에서, 줄기 및 테트라루프를 함유하는 운송 가닥의 연장된 부분은 가닥의 5' 말단에 있다.
소정의 실시형태에서, 줄기 및 테트라루프를 함유하는 dsRNAi 저해제 분자의 운송 가닥은 34개 내지 40개의 뉴클레오타이드 길이이고, dsRNAi 저해제 분자의 가이드 가닥은 20개 내지 24개의 뉴클레오타이드를 함유하고, 여기서 운송 가닥 및 가이드 가닥은 18개 내지 24개의 뉴클레오타이드의 듀플렉스 영역을 형성한다.
소정의 실시형태에서, dsRNAi 저해제 분자는 (a) 줄기 및 테트라루프를 함유하고, 36개의 뉴클레오타이드 길이인 운송 가닥(여기서, 5' 말단으로부터의 처음의 20개의 뉴클레오타이드는 가이드 가닥에 상보성이고, 하기 16개의 뉴클레오타이드는 줄기 및 테트라루프를 형성함) 및 (b) 22개의 뉴클레오타이드 길이이고, 이의 3' 말단에서 2개의 뉴클레오타이드의 단일 가닥 오버행을 갖는 가이드 가닥(여기서, 가이드 및 운송 가닥은 인접한 올리고뉴클레오타이드를 형성하지 않는 별개의 가닥임)을 포함한다(예를 들어, 도 1a 내지 도 1d 참조).
소정의 실시형태에서, dsRNAi 저해제 분자는 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함한다. 통상적으로, dsRNAi 저해제 분자는 5개 미만의 데옥시리보뉴클레오타이드를 함유한다. 소정의 실시형태에서, dsRNAi 저해제 분자는 하나 이상의 리보뉴클레오타이드를 포함한다. 소정의 실시형태에서, dsRNAi 저해제 분자의 모든 뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드이다.
몇몇 실시형태에서, 화학식 I-IX 중 임의의 하나의 5'-말단 뉴클레오타이드는 이중 가닥 핵산 저해제 분자, 예를 들어, dsRNAi 저해제 분자의 운송 가닥에 위치한다. 다른 실시형태에서, 화학식 I-IX 중 임의의 하나의 5'-말단 뉴클레오타이드는 가이드 가닥에 위치한다. 다른 실시형태에서, 화학식 I-IX 중 임의의 하나의 5'-말단 뉴클레오타이드는 가이드 가닥 및 운송 가닥 둘 다에 위치한다. 일 실시형태에서, 화학식 I-IX 중 임의의 하나의 5'-말단 뉴클레오타이드는 듀플렉스 영역에 위치한다. 몇몇 실시형태에서, 화학식 I-IX 중 임의의 하나의 5'-말단 뉴클레오타이드는 오버행 영역에 위치한다.
단일 가닥 핵산 저해제 분자
소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자는 화학식 I-IX 중 임의의 하나에 따른 5'-말단 뉴클레오타이드를 포함하는 단일 가닥 핵산 저해제 분자이다. 단일 가닥 핵산 저해제 분자는 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 최근의 노력은 ssRNAi 저해제 분자의 활성을 입증하였다(예를 들어, 문헌[Matsui et al., Molecular Therapy, 2016,24(5):946-55] 참조). 그리고, 안티센스 분자는 특이적 표적 유전자의 발현을 감소시키도록 수십 년 동안 사용되었다. Pelechano and Steinmetz, Nature Review Genetics, 2013,14:880-93. 이들 구조의 공통 주제에 대한 다수의 변형이 일련의 표적에 대해 개발되었다. 단일 가닥 핵산 저해제 분자는 예를 들어 종래의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 마이크로RNA, 리보자임, 압타머, 안타고미르 및 ssRNAi 저해제 분자(이들 모두 당해 분야에 공지되어 있음)를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자는 14개 내지 50개, 16개 내지 30개, 또는 15개 내지 25개의 뉴클레오타이드를 갖는 ssRNAi 저해제 분자이다. 다른 실시형태에서, ssRNAi 저해제 분자는 18개 내지 22개 또는 20개 내지 22개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 소정의 실시형태에서, ssRNAi 저해제 분자는 20개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 다른 실시형태에서, ssRNAi 저해제 분자는 22개의 뉴클레오타이드를 갖는다.
소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자는 외인성 RNAi 저해제 분자 또는 천연 miRNA를 저해하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이다. 소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자는 8개 내지 80개, 14개 내지 50개, 16개 내지 30개, 12개 내지 25개, 12개 내지 22개, 14개 내지 20개, 18개 내지 22개 또는 20개 내지 22개의 뉴클레오타이드를 갖는 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 소정의 실시형태에서, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 18개 내지 22개, 예컨대, 18개 내지 20개의 뉴클레오타이드를 갖는다.
소정의 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 부분은 표적 핵산 또는 이의 특정한 부분에 완전히 상보성이다. 소정의 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 부분은 표적 핵산의 적어도 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 또는 이것 초과의 인접한 뉴클레오타이드에 상보성이다. 소정의 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산 또는 이의 부분에 대해 5개 이하, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 비상보성 뉴클레오타이드를 함유한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 길이를 감소시키고/시키거나, 활성을 제거함이 없이 미스매치 염기를 도입할 수 있다.
B. 뉴클레오타이드 변형
본 개시내용의 변형된 올리고뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 4'-포스페이트 유사체 이외에 변형을 포함할 수 있다. 통상적으로, 핵산 저해제 분자의 다수의 뉴클레오타이드 아단위는 분자의 다양한 특성, 예컨대, 뉴클레아제에 대한 내성 또는 감소된 면역원성을 개선하도록 변형된다. 예를 들어, 문헌[Bramsen et al. (2009), Nucleic Acids Res., 37, 2867-2881]을 참조한다. 많은 뉴클레오타이드 변형을 올리고뉴클레오타이드 분야에서, 특히 핵산 저해제 분자에 대해 사용한다. 이러한 변형은 당 모이어티, 포스포에스터 연결 및 핵염기를 포함하는 뉴클레오타이드의 임의의 부분에서 이루어질 수 있다. 핵산 저해제 분자의 소정의 실시형태에서, 1개 내지 모든 뉴클레오타이드는 예를 들어 당해 분야에 공지되고 본 명세서에 기재된 2'-탄소 변형을 사용하여 당 모이어티의 2'-탄소에서 변형된다. 2'-탄소 변형의 통상적인 예는 2'-F, 2'-O-메틸("2'-OMe" 또는 "2'-OCH3"), 2'-O-메톡시에틸("2'-MOE" 또는 "2'-OCH2CH2OCH3")을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 변형은 또한 뉴클레오타이드의 당 모이어티의 다른 부분, 예컨대, 본 명세서에 기재된 바와 같은 5'-탄소에서 발생할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 이전에 기재된 바와 같은 잠금 핵산("LNA") 구조, 브릿징된 핵산("BNA") 구조 및 잠금해제 핵산("UNA") 구조(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 당 모이어티의 고리 구조는 변형된다.
변형된 핵염기는 당해 분야에 공지되고 본 명세서에 기재된 바대로 1'-위치에서 아데닌, 구아닌, 사이토신, 타이민 및 유라실 이외의 핵염기를 포함한다. 변형된 핵염기의 통상적인 예는 5'-메틸사이토신이다.
RNA 및 DNA의 천연 발생 뉴클레오타이드간 연결은 3'→5' 포스포다이에스터 연결이다. 변형된 포스포다이에스터 연결은 당해 분야에 공지되고 본 명세서에 기재된 바대로 인 원자를 함유하는 뉴클레오타이드간 연결 및 인 원자를 함유하지 않는 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 비천연 발생 뉴클레오타이드간 연결기를 포함한다. 통상적으로, 핵산 저해제 분자는 본 명세서에 기재된 바와 같은 1개 이상의 인 함유 뉴클레오타이드간 연결기를 함유한다. 다른 실시형태에서, 핵산 저해제 분자의 뉴클레오타이드간 연결기의 하나 이상은 본 명세서에 기재된 바와 같은 인 비함유 연결이다. 소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자는 1개 이상의 인 함유 뉴클레오타이드간 연결기 및 하나 이상의 인 비함유 뉴클레오타이드간 연결기를 함유한다.
소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자의 1개 또는 2개의 뉴클레오타이드는 글루타티온 민감성 모이어티에 의해 가역적으로 변형된다. 통상적으로, 글루타티온 민감성 모이어티는 당 모이어티의 2'-탄소에 위치하고, 설포닐기 또는 다이설파이드 브리지를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 글루타티온 민감성 모이어티는 예를 들어 국제 특허 출원 제PCT/US2017/048239호(본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)에 기재된 바대로 포스포르아미다이트 올리고뉴클레오타이드 합성 방법에 맞다. 소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자의 2개 초과의 뉴클레오타이드는 글루타티온 민감성 모이어티에 의해 가역적으로 변형된다. 소정의 실시형태에서, 대부분의 뉴클레오타이드는 글루타티온 민감성 모이어티에 의해 가역적으로 변형된다. 소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오타이드는 글루타티온 민감성 모이어티에 의해 가역적으로 변형된다.
적어도 1개의 글루타티온 민감성 모이어티는 통상적으로 단일 가닥 핵산 저해제 분자의 5'- 또는 3'-말단 뉴클레오타이드 또는 이중 가닥 핵산 저해제 분자의 운송 가닥 또는 가이드 가닥의 5'- 또는 3'-말단 뉴클레오타이드에 위치한다. 그러나, 적어도 1개의 글루타티온 민감성 모이어티는 핵산 저해제 분자에서 관심 대상의 임의의 뉴클레오타이드에 위치할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자는 완전히 변형되고, 여기서 완전히 변형된 핵산 저해제 분자의 모든 뉴클레오타이드는 변형된다. 소정의 실시형태에서, 완전히 변형된 핵산 저해제 분자는 가역적인 변형을 함유하지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 단일 가닥 핵산 저해제 분자의 적어도 1개, 예컨대, 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개의 뉴클레오타이드 또는 이중 가닥 핵산 저해제 분자의 가이드 가닥 또는 운송 가닥은 변형된다.
소정의 실시형태에서, 완전히 변형된 핵산 저해제 분자는 하나 1개의 가역적인 글루타티온 민감성 모이어티에 의해 변형된다. 소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드는 변형된다. 소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자의 뉴클레오타이드의 절반 초과는 가역적인 변형이 아닌 화학 변형에 의해 변형된다. 소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자의 뉴클레오타이드의 절반 미만은 가역적인 변형이 아닌 화학 변형에 의해 변형된다. 변형은 핵산 저해제 분자에서 군으로 발생할 수 있거나, 상이한 변형된 뉴클레오타이드는 산재될 수 있다.
핵산 저해제 분자의 소정의 실시형태에서, 1개 내지 모든 뉴클레오타이드는 2'-탄소에서 변형된다. 소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자(또는 이의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥)는 예를 들어 당해 분야에 공지되고 본 명세서에 기재된 2'-탄소 변형을 사용하여 2'-탄소에서 부분적으로 또는 완전히 변형된다. 핵산 저해제 분자의 소정의 실시형태에서, 1개 내지 모든 인 원자는 변형되고, 1개 내지 모든 뉴클레오타이드는 2'-탄소에서 변형된다. 소정의 실시형태에서, 2' 탄소에서의 변형은 2'-F, 2'-OMe 및/또는 2'-MOE 중 하나 이상이다. 소정의 실시형태에서, 2'-탄소에서의 변형은 2'-F 및/또는 2'-OMe(즉, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드의 센스 및/또는 안티센스 가닥)이고, 2'-F 및/또는 2'-OMe에 의해 부분적으로 또는 완전히 변형된다. 소정의 실시형태에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 글루타티온 민감성 모이어티에 의해 가역적으로 변형된 1개 이상의 뉴클레오타이드를 함유한다.
C. 다른 4'-포스페이트 유사체-변형된 올리고뉴클레오타이드
본 명세서에 개시된 바와 같은 4'-포스페이트 유사체가 통상적으로 핵산 저해제 분자로 도입되지만, 다른 핵산은 본 명세서에 기재된 바와 같은 4'-포스페이트 유사체-변형된 뉴클레오타이드(예를 들어, 화학식 I-IX 중 임의의 하나의 5'-말단 뉴클레오타이드)를 포함하도록 변형될 수 있다. 본 개시내용의 변형된 올리고뉴클레오타이드는 5'-말단 뉴클레오타이드에서의 포스페이트 유사체의 존재가 바람직한 관심 대상의 임의의 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 예로서, 본 출원의 교시내용에 따라 변형될 수 있는 다른 핵산은 다른 치료학적 핵산, 예컨대, 유전자 치료 또는 유전자 편집을 위한 올리고뉴클레오타이드, 예컨대, CRISPR 핵산 분자를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Cong et al., Science, 2013, 339:819-23; Mali et al., Science, 2013, 339:823-26; Woo Cho et al., Nat. Biotechnology, 2013, 31(3):230-232]을 참조한다. 또한, 본 개시내용의 포스페이트 유사체를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 또한 시험관내 사용될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어 프로브, 프라이머, 링커, 어댑터 또는 유전자 단편을 포함한다.
III. 포스페이트 유사체를 포함하는 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트
본 개시내용의 또 다른 양태는 표준 올리고뉴클레오타이드 합성 방법에서 사용될 수 있는 본 명세서에 기재된 바와 같은 4'-포스페이트 유사체를 포함하는 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트에 관한 것이다. 통상적으로, 포스페이트 유사체는 옥시메틸기의 산소 원자가 당 모이어티 또는 이의 유사체의 4'-탄소에 결합된 옥시메틸포스포네이트이다. 다른 실시형태에서, 포스페이트 유사체는 티오메틸기의 황 원자 또는 아미노메틸기의 질소 원자가 당 모이어티 또는 이의 유사체의 4'-탄소에 결합된 티오메틸포스포네이트 또는 아미노메틸포스포네이트이다.
소정의 실시형태에서, 옥시메틸포스포네이트는 -O-CH2-PO(OR)2(여기서, R은 CH3, 알킬기, CH2CH2CN, CH2OCOC(CH3)3, CH2OCH2CH2Si(CH3)3 또는 보호기로부터 독립적으로 선택됨)로 표시된다. 소정의 실시형태에서, 알킬기는 CH2CH3이다. 더 통상적으로, R은 CH3, CH2CH3 또는 보호기로부터 독립적으로 선택된다.
1. 화학식 X 및 XI
몇몇 실시형태에서, 본 개시내용의 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트는 하기 화학식 X 또는 화학식 XI로 표시된다:
Figure 112019031696560-pct00013
Figure 112019031696560-pct00014
식 중,
B, M1, R4, R5, R6, R7, R8 및 X2는 화학식 I 또는 II에 기재된 바와 같고;
Rc 및 Rd는 각각 독립적으로 CH3, CH2CH3, CH2CH2CN, CH2OCOC(CH3)3, CH2OCH2CH2Si(CH3)3 또는 보호기로부터 선택되고;
X10은 부재하거나, O, S, NR' 또는 CR'R"로부터 선택되고;
R10은 포스포르아미다이트이다.
소정의 실시형태에서, 포스페이트 유사체-변형된 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트는 화학식 X로 표시된다.
소정의 실시형태에서, 포스페이트 유사체-변형된 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트는 화학식 XI로 표시된다.
소정의 실시형태에서, B는 천연 핵염기이다.
소정의 실시형태에서, M1은 O이다.
소정의 실시형태에서, R4, R5, R6 및 R7은 수소, 불소, CH3, 또는 C1-C6 알킬로부터 독립적으로 선택된다. 통상적으로, R4, R5, R6 및 R7은 수소이다.
소정의 실시형태에서, X2는 O, 할로겐 또는 선택적으로 치환된 알콕시이다.
소정의 실시형태에서, Rc 및 Rd는 CH3이다. 소정의 실시형태에서, Rc 및 Rd는 CH2CH3이다.
소정의 실시형태에서, M1은 O이고, X2는 O이고, R4, R5, R6 및 R7은 수소이다.
소정의 실시형태에서, X2는 O, S, Se 또는 NHR'이고, 여기서 R'는 수소, 할로겐, 치환된 또는 비치환된 지방족, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클 또는 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬로부터 선택되고, R8은 글루타티온 민감성 모이어티이다. 통상적으로, X2는 O이고, R8은 글루타티온 민감성 모이어티이다.
소정의 실시형태에서, X2는 할로겐 또는 선택적으로 치환된 알콕시이고, R8은 부재한다. 통상적으로, X2는 F, OCH2CH2OCH3 또는 OCH3이고, R8은 부재한다.
소정의 실시형태에서, Rc 및 Rd는 CH3이고, R8은 부재하고, X2는 F 또는 OCH3이다.
소정의 실시형태에서, Rc 및 Rd는 CH2CH3이고, R8은 부재하고, X2는 F 또는 OCH3이다.
소정의 실시형태에서, 포스포르아미다이트는 화학식 -P(ORx)-N(Ry)2(여기서, Rx는 선택적으로 치환된 메틸, 2-사이아노에틸 및 벤질로 이루어진 군으로부터 선택되고, 각각의 Ry는 선택적으로 치환된 에틸 및 아이소프로필로 이루어진 군으로부터 선택됨)를 갖는다.
소정의 실시형태에서, 포스페이트 유사체-변형된 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트는 뉴클레오사이드의 당 모이어티에 결합된 산소 원자가 황 또는 질소 원자에 의해 대체된다는 것을 제외하고 화학식 X 또는 XI와 동일하다.
2. 화학식 XII
몇몇 실시형태에서, 본 개시내용의 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트는 하기 화학식 XII로 표시된다:
Figure 112019031696560-pct00015
식 중,
Rc 및 Rd는 각각 독립적으로 CH3, CH2CH3, CH2CH2CN, CH2OCOC(CH3)3, CH2OCH2CH2Si(CH3)3 또는 보호기로부터 선택되고;
B는 천연 핵염기, 변형된 핵염기, 보편적 염기이거나, 부재하고;
R10은 포스포르아미다이트이고;
X2는 OH, F, OCH3, 또는 OCH2CH2OCH3이고, R8은 부재하거나, X2는 O이고, R8은 글루타티온 민감성 모이어티이다.
소정의 실시형태에서, B는 천연 핵염기이다.
소정의 실시형태에서, Rc 및 Rd는 각각 독립적으로 CH3 및 CH2CH3으로부터 선택된다.
소정의 실시형태에서, X2는 F 또는 OCH3이고, R8은 부재한다.
소정의 실시형태에서, X2는 O이고, R8은 글루타티온 민감성 모이어티.
소정의 실시형태에서, Rc 및 Rd는 CH3이고, R8은 부재하고, X2는 F 또는 OCH3이다.
소정의 실시형태에서, Rc 및 Rd는 CH2CH3이고, R8은 부재하고, X2는 F 또는 OCH3이다.
3. 화학식 XIII
소정의 실시형태에서, 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트는 하기 화학식 XIII으로 표시된다:
Figure 112019031696560-pct00016
식 중,
B는 천연 핵염기, 변형된 핵염기, 보편적 염기이거나, 부재하고;
R10은 포스포르아미다이트이고;
X2는 OH, F, OCH3 또는 OCH2CH2OCH3이다.
소정의 실시형태에서, B는 천연 핵염기이다.
소정의 실시형태에서, X2는 F 또는 OCH3이다.
4. 화학식 XIV
소정의 실시형태에서, 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트는 하기 화학식 XIV로 표시된다:
Figure 112019031696560-pct00017
식 중,
B는 천연 핵염기, 변형된 핵염기, 보편적 염기이거나, 부재하고;
R10은 포스포르아미다이트이고;
X2는 OH, F, OCH3 또는 OCH2CH2OCH3이다.
소정의 실시형태에서, B는 천연 핵염기이다.
소정의 실시형태에서, X2는 F 또는 OCH3이다.
5. 화학식 XV
몇몇 실시형태에서, 본 개시내용의 포스페이트 유사체-변형된 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트는 하기 화학식 XV로 표시된다:
식 중,
Figure 112019031696560-pct00018
식 중,
Rc 및 Rd는 각각 독립적으로 CH3, CH2CH3, CH2CH2CN, CH2OCOC(CH3)3, CH2OCH2CH2Si(CH3)3 또는 보호기로부터 선택되고;
V는 O이고;
Z1은 포스포르아미다이트 및 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오사이드이고;
V는 당 모이어티의 4'-탄소에 결합된다.
통상적으로, 당 모이어티는 퓨라노스이고, V는 퓨라노스의 4'-탄소에 결합된다.
소정의 실시형태에서, Rc 및 Rd는 CH3이다. 소정의 실시형태에서, Rc 및 Rd는 CH2CH3이다.
6. 화학식 XVI
몇몇 실시형태에서, 본 개시내용의 포스페이트 유사체-변형된 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트는 하기 화학식 XVI로 표시된다:
Figure 112019031696560-pct00019
식 중,
R1은 O 또는 S이고;
R2 및 R3은 각각 독립적으로 보호된 OH, 보호된 SH 또는 보호된 NH2, OCH3, OR9, OCH2CH2CN, OCH2OCOC(CH3)3 및 OCH2OCH2CH2Si(CH3)3으로부터 선택되고, R9는 알킬이고;
V는 O, S, NR', CR'R"이고, R' 및 R"는 독립적으로 수소, 할로겐, 치환된 또는 비치환된 지방족, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클 또는 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬이고;
Z1은 포스포르아미다이트 및 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오사이드이고;
V는 당 모이어티의 4'-탄소에 결합된다.
통상적으로, 당 모이어티는 퓨라노스이고, V는 퓨라노스의 4'-탄소에 결합된다.
통상적으로, V는 O이다.
소정의 실시형태에서 R2 또는 R3은 각각 독립적으로 보호된 OH, OCH3 또는 OR9로부터 선택되고, R9는 C1-C6 알킬이다. 소정의 실시형태에서, R9는 CH2CH3이다.
통상적으로, R1은 O이다.
소정의 실시형태에서, R1은 O이고; R2는 보호된 OH, OCH3 또는 OCH2CH3이고; R3은 OCH3 또는 OCH2CH3이다. 소정의 실시형태에서, R1은 O이고; R2는 보호된 OH이고; R3은 보호된 OH이다. 소정의 실시형태에서, R1은 O이고; R2는 OCH3 또는 OCH2CH3이고; R3은 보호된 OH이다. 소정의 실시형태에서, R1은 O이고; R2는 OCH3이고; R3은 보호된 OH이다. 소정의 실시형태에서, R1은 O이고, R2 및 R3은 OCH3이다. 소정의 실시형태에서, R1은 O이고; R2는 OCH2CH3이고; R3은 보호된 OH이다. 소정의 실시형태에서, R1은 O이고, R2 및 R3은 OCH2CH3이다.
보호기
4'-포스페이트 유사체-변형된 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트의 몇몇 실시형태에서, 보호기는 B, 즉 천연, 변형된 또는 보편적 핵염기에 부착된다. B에 적합한 보호기는 아세틸, 다이플루오로아세틸, 트리플루오로아세틸, 아이소뷰티릴, 벤조일, 9-플루오레닐메톡시카보닐, 페녹시아세틸, 다이메틸폼아미딘, 다이부틸포라미딘 및 N,N-다이페닐 카바메이트를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 보호기는 상기 기재된 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트에서 하이드록실 기에 부착된다. 상기 기재된 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트의 하이드록실 기에 적합한 보호기는 다이메톡시트리틸, 모노메톡시트리틸, 및/또는 트리틸 기(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 고상 올리고뉴클레오타이드 합성에 맞는 임의의 보호기를 포함한다. 통상적인 예는 산성 조건 하에(예를 들어, 다이클로로아세트산(DCA), 트리클로로아세트산(TCA), 트리플루오르아세트산(TFA) 또는 아세트산의 존재 하에) 용이하게 절단될 수 있는 4,4'-다이메톡시트리페닐메틸(DMTr)기이다.
다른 통상적인 하이드록실 보호기는 트리알킬 실릴기, 예컨대, tert-부틸다이메틸실릴(TBDMS)을 포함한다. TBDMS기는 합성 사이클 동안 DMT기를 제거하도록 사용된 산성 조건 하에 안정하지만, 예를 들어 테트라하이드로퓨란(THF) 중의 테트라부틸암모늄 플루오라이드(TBAF)의 용액에 의해 또는 트리에틸아민 하이드로플루오라이드에 의해 RNA 올리고머의 절단 및 탈보호 후 다양한 방법에 의해 제거될 수 있다. 다른 통상적인 하이드록실 보호기는 예를 들어 암모늄 플루오라이드에 의해 제거될 수 있는 tert-부틸다이페닐실릴 에터(TBDPS)를 포함한다.
IV. 핵염기
상기 기재된 4'-포스페이트 유사체 함유 올리고뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드에서, B는 천연 핵염기, 변형된 핵염기 또는 보편적 핵염기를 나타낸다. 적합한 천연 핵염기는 퓨린 및 피리미딘 염기, 예를 들어 아데닌(A), 타이민(T), 사이토신(C), 구아닌(G) 또는 유라실(U)을 포함한다. 적합한 변형된 핵염기는 다이아미노퓨린 및 이의 유도체, 알킬화 퓨린 또는 피리미딘, 아실화 퓨린 또는 피리미딘, 티올화 퓨린 또는 피리미딘 등을 포함한다.
다른 적합한 변형된 핵염기는 퓨린 및 피리미딘의 유사체를 포함한다. 적합한 유사체는 1-메틸아데닌, 2-메틸아데닌, N6-메틸아데닌, N6-아이소펜틸아데닌, 2-메틸티오-N6-아이소펜틸아데닌, N,N-다이메틸아데닌, 8-브로모아데닌, 2-티오사이토신, 3-메틸사이토신, 5-메틸사이토신, 5-에틸사이토신, 4-아세틸사이토신, 1-메틸구아닌, 2-메틸구아닌, 7-메틸구아닌, 2,2-다이메틸구아닌, 8-브로모구아닌, 8-클로로구아닌, 8-아미노구아닌, 8-메틸구아닌, 8-티오구아닌, 5-플루오로유라실, 5-브로모유라실, 5-클로로유라실, 5-요오도유라실, 5-에틸유라실, 5-프로필유라실, 5-메톡시유라실, 5-하이드록시메틸유라실, 5-(카복시하이드록시메틸)유라실, 5-(메틸아미노메틸)유라실, 5-(카복시메틸아미노메틸)-유라실, 2-티오유라실, 5-메틸-2-티오유라실, 5-(2-브로모비닐)유라실, 유라실-5-옥시아세트산, 유라실-5-옥시아세트산 메틸 에스터, 슈도유라실, 1-메틸슈도유라실, 쿼오신, 하이폭산틴, 잔틴, 2-아미노퓨린, 6-하이드록시아미노퓨린, 나이트로피롤릴, 나이트로인돌릴 및 다이플루오로톨릴, 6-티오퓨린 및 2,6-다이아미노퓨린 나이트로피롤릴, 나이트로인돌릴 및 다이플루오로톨릴을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
통상적으로, 핵염기는 질소성 염기를 함유한다. 소정의 실시형태에서, 핵염기는 질소 원자를 함유하지 않는다. 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 제20080274462호를 참조한다. 보편적 핵염기는 천연 발생 핵산에서 통상적으로 발견된 1개 초과의 염기와 쌍을 지을 수 있고 이에 따라 듀플렉스에서 이러한 천연 발생 염기에 대한 기질일 수 있는 염기를 의미한다. 염기는 각각의 천연 발생 염기와 쌍 짓기를 할 필요가 없다. 예를 들어, 소정의 염기는 오직 또는 선택적으로 퓨린과, 또는 오직 또는 선택적으로 피리미딘과 쌍 짓는다. 보편적 핵염기는 왓슨-크릭 또는 비-왓슨-크릭 상호작용(예를 들어, 후그스틴(Hoogsteen) 상호작용)을 통해 수소 결합을 형성함으로써 쌍 짓기를 할 수 있다. 대표적인 보편적 핵염기는 이노신 및 이의 유도체를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 1개 이상의 뉴클레오타이드는 당 고리의 1'-위치에 부착된 핵염기를 갖지 않는다. 이러한 뉴클레오타이드는 비염기성이라 칭해진다.
V. 화학식 I 내지 XVI에서의 다른 치환기
화학식 I 내지 XVI에서, 적절하게는, 적합한 지방족 기는 통상적으로 약 2개 내지 약 10개의 탄소 원자, 더 통상적으로 약 2개 내지 약 6개의 탄소 원자, 예컨대, 약 2개 내지 약 5개의 탄소 원자를 함유한다.
화학식 I 내지 XVI에서, 적절하게는, 적합한 알킬기는 통상적으로 약 1개 내지 약 10개의 탄소 원자, 더 통상적으로 약 2개 내지 약 6개의 탄소 원자, 예컨대, 약 2개 내지 약 5개의 탄소 원자를 함유한다.
화학식 I 내지 XVI에서, 적절하게는, 적합한 알콕시기는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 아이소프로폭시, n-부톡시, tert-부톡시, 네오펜톡시 및 n-헥속시 등을 포함한다.
화학식 I 내지 XVI에서, 적절하게는, 적합한 사이클로알킬은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸 등을 포함한다.
화학식 I 내지 XVI에서, 적절하게는, 적합한 이종원자는 산소, 황, 및 질소를 포함한다. 대표적인 헤테로사이클은 피롤리딘일, 피라졸린일, 피라졸리딘일, 이미다졸린일, 이미다졸리딘일, 피페리딘일, 피페라진일, 옥사졸리딘일, 이속사졸리딘일, 모르폴린일, 티아졸리딘일, 아이소티아졸리딘일 및 테트라하이드로퓨릴을 포함한다. 대표적인 헤테로아릴은 퓨란일, 티엔일, 피리딜, 피롤릴, N-저급 알킬 피롤로, 피리미딜, 피라진일, 이미다졸릴을 포함한다.
화학식 I 내지 XVI에서, 적절하게는, 적합한 알켄일기는 비닐, 알릴, 및 2-메틸-3-헵텐을 포함하고, 적합한 알킨일기는 프로핀 및 3-헥신을 포함한다.
화학식 I 내지 XVI에서, 적절하게는, 적합한 아릴기는 페닐, 나프틸 등을 포함하는 한편, 적합한 헤테로아릴기는 피리딜, 퓨란일, 이미다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 피리미딘일, 티오페닐 또는 티엔일, 퀴놀린일, 인돌릴, 티아졸릴 등을 포함한다.
화학식 I 내지 XVI에서, 적절하게는, 적합한 알킬아미노는 -CH2CH2CH2NH- 또는 CH2CH2NH-를 포함한다.
VI. 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 방법
본 명세서에 기재된 4'-포스페이트 유사체-변형된 올리고뉴클레오타이드는 표준 포스포르아미다이트 방법을 포함하는 당해 분야에 공지된 다양한 합성 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 임의의 포스포르아미다이트 합성 방법은 본 발명의 4'-포스페이트 유사체-변형된 올리고뉴클레오타이드를 합성하기 위해 이용될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 포스포르아미다이트는 반응성 중간체 포스파이트 화합물을 생성하도록 고상 합성 방법에서 사용되고, 이 화합물은 후속하여 통상적으로 포스포다이에스터 또는 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결을 갖는 포스포네이트-변형된 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위해 공지된 방법을 이용하여 산화된다. 본 개시내용의 올리고뉴클레오타이드 합성은 분야 공지된 방법을 이용하여 5'→3' 또는 3'→5' 중 어느 한 방향으로 수행될 수 있다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 4'-포스페이트 유사체-변형된 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트, 예컨대, 상기 기재되고 예를 들어 화학식 X-XVI로 표시된 것을 사용하여 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 방법에 관한 것이다. 통상적으로, 4'-포스페이트 유사체-변형된 뉴클레오사이드는 합성된 올리고뉴클레오타이드의 말단 뉴클레오타이드로서 도입된다. 더 통상적으로, 포스페이트 유사체-변형된 뉴클레오사이드는 합성된 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단 뉴클레오타이드로서 도입된다.
소정의 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 방법은 (a) 공유 연결을 통해 뉴클레오사이드를 고체 지지체에 부착시키는 것; (b) 단계 (a)의 뉴클레오사이드에서 반응성 하이드록실 기에 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트를 커플링하여서 이들 사이에 뉴클레오타이드간 결합을 형성하는 것(여기서, 고체 지지체에서의 임의의 비커플링된 뉴클레오사이드는 캡핑 시약에 의해 캡핑됨); (c) 상기 뉴클레오타이드간 결합을 산화제에 의해 산화시키는 것; 및 (d) 단계 (b) 내지 (c)를 후속하는 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트에 의해 되풀이하여 반복하여서 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 것(여기서, 적어도 단계 (a)의 뉴클레오사이드, 단계 (b)의 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트 또는 단계 (d)의 적어도 하나의 후속하는 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트는 본 명세서에 기재된 바와 같은 포스포네이트 함유 모이어티를 포함함)을 포함한다. 통상적으로, 커플링, 캡핑/산화 단계 및 선택적으로, 탈보호 단계는 올리고뉴클레오타이드가 고체 지지체로부터 절단된 후 이것이 원하는 길이 및/또는 서열에 도달할 때까지 반복된다.
VII. 약제학적 조성물
본 개시내용은 4'-포스페이트 유사체-변형된 핵산 저해제 분자 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
몇몇 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및 치료학적 유효량의 핵산 저해제 분자를 포함하고, 여기서 핵산 저해제 분자는 본 명세서에 기재된 바와 같은 포스페이트 유사체를 포함하는 적어도 1개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및 치료학적 유효량의 핵산 저해제 분자를 포함하고, 여기서 핵산 저해제 분자는 이전에 기재된 바와 같은 화학식 I-IX 중 임의의 하나로 표시된 적어도 1개의 4'-포스페이트 유사체 함유 뉴클레오타이드를 포함한다.
약제학적 조성물이 통상적으로 핵산 저해제 분자를 포함하지만, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 4'-포스페이트 유사체에 의해 변형된 다른 치료학적 핵산(예를 들어, 유전자 치료 올리고뉴클레오타이드 또는 CRISPR 올리고뉴클레오타이드)을 사용하여 또한 제조될 수 있다.
VIII. 약제학적으로 허용 가능한 부형제
본 개시내용에서 유용한 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 관습적이다. 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)]은 1종 이상의 치료학적 조성물의 약제학적 전달에 적합한 조성물 및 제제를 기재한다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제로서 작용할 수 있는 재료의 몇몇 예는 당, 예컨대, 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예컨대, 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 이의 유도체, 예컨대, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 맥아; 젤라틴; 부형제, 예컨대, 코코아 버터 및 좌제 왁스; 오일, 예컨대, 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 완충제, 예컨대, 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (등장성 식염수; 링거액); 에틸 알콜; pH 완충 용액; 폴리올, 예컨대, 글라이세롤, 프로필렌 글라이콜, 폴리에틸렌 글라이콜, 등; 및 약제학적 제제에서 사용되는 다른 비독성 상용성 물질을 포함한다.
IX. 투약 형태
4'-포스페이트-유사체 함유 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 핵산 저해제 분자)를 포함하는 약제학적 조성물은 임의의 의도된 투여 경로를 위해 종래의 부형제와 제제화될 수 있다.
통상적으로, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 4'-포스페이트 유사체 함유 핵산 저해제 분자를 포함하고, 예를 들어 피하, 근욱내, 정맥내 또는 경막외 주사에 의해 비경구 투여를 위한 액체 형태로 제제화된다. 비경구 투여에 적합한 투약 형태는 통상적으로, 예로서, 무균 수성 용액, 식염수, 저분자량 알콜, 예컨대, 프로필렌 글라이콜, 폴리에틸렌 글라이콜, 식물성 오일, 젤라틴, 지방산 에스터, 예컨대, 에틸 올레에이트 등을 포함하는 비경구 투여를 위한 1종 이상의 적합한 비히클을 포함한다. 비경구 제제는 당, 알콜, 항산화제, 완충제, 정균제, 의도된 수혜자의 혈액과 등장성이 되게 하는 용질 또는 현탁제 또는 증점제를 함유할 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 액체 제제는 무균 주사용 용액에 의한 재구성 시 차후의 사용을 위해 동결건조되고 저장될 수 있다.
약제학적 조성물은 국소 또는 경피 투여, 직장 또는 질내 투여, 눈 투여, 비강 투여, 협측 투여 또는 설하 투여를 포함하는 다른 투여 경로를 위해 또한 제제화될 수 있다.
X. 전달 물질
4'-포스페이트 유사체 함유 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 핵산 저해제 분자)는, 예를 들어, 리포솜 및 지질, 예컨대, 미국 특허 제6,815,432호, 제6,586,410호, 제6,858,225호, 제7,811,602호, 제7,244,448호 및 제8,158,601호에 개시된 것; 중합체 재료, 예컨대, 미국 특허 제6,835,393호, 제7,374,778호, 제7,737,108호, 제7,718,193호, 제8,137,695호 및 미국 공개 특허 출원 제2011/0143434호, 제2011/0129921호, 제2011/0123636호, 제2011/0143435호, 제2011/0142951호, 제2012/0021514호, 제2011/0281934호, 제2011/0286957호 및 제2008/0152661호에 개시된 것; 캡시드, 캅소이드, 또는 흡수, 분포 또는 흡수를 돕기 위한 수용체 표적화된 분자를 포함하여, 다른 분자, 분자 구조 또는 화합물의 혼합물과 혼합, 캡슐화, 접합 또는 달리 회합될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 4'-포스페이트 유사체 함유 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 핵산 저해제 분자)는 지질 나노입자(LNP)에서 제제화된다. 지질-핵산 나노입자는 통상적으로 지질을 핵산과 혼합 시 저절로 형성되어서 복합체를 형성한다. 원하는 입자 크기 분포에 따라, 생성된 나노입자 혼합물은 예를 들어 써모배럴(thermobarrel) 압출기, 예컨대, LIPEX(등록상표) Extruder(Northern Lipids, Inc)를 사용하여 폴리카보네이트 막(예를 들어, 100㎚ 컷오프)을 통해 선택적으로 압출될 수 있다. 치료학적 용도를 위한 지질 나노입자를 제조하기 위해, 예를 들어, 투석 또는 접선 흐름 여과에 의해 달성될 수 있는, 나노입자를 형성하기 위해 사용된 용매(예를 들어, 에탄올) 및/또는 교환 완충제를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 핵산 저해제 분자를 함유하는 지질 나노입자를 제조하는 방법은 예를 들어 미국 공개 특허 출원 제2015/0374842호 및 제2014/0107178호에 개시된 바대로 당해 분야에 공지되어 있다.
소정의 실시형태에서, LNP는 양이온성 리포솜 및 페길화된 지질을 포함하는 지질 코어를 포함한다. LNP는 하나 이상의 엔벨로프 지질, 예컨대, 양이온성 지질, 구조적 또는 천연 지질, 스테롤, 페길화된 지질, 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 관심 대상의 조직에 올리고뉴클레오타이드의 전달을 지시하도록 리간드에 공유 접합된다. 많은 이러한 리간드는 탐구되었다. 예를 들어, 문헌[Winkler, Ther . Deliv ., 2013,4(7): 791-809]을 참조한다. 예를 들어, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 간으로의 올리고뉴클레오타이드의 흡수를 지시하도록 다수의 당 리간드 모이어티(예를 들어, N-아세틸갈락토사민(GalNAc))에 접합될 수 있다. 예를 들어, WO 제2016/100401호를 참조한다. 사용될 수 있는 다른 리간드는 만노스-6-포스페이트, 콜레스테롤, 엽산, 트랜스페린 및 갈락토스(다른 특정한 예시적인 리간드에 대해, 예를 들어, WO 제2012/089352호 참조)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 통상적으로, 올리고뉴클레오타이드가 리간드에 접합될 때, 올리고뉴클레오타이드는 네이키드 올리고뉴클레오타이드로서 투여되고, 여기서 올리고뉴클레오타이드는 LNP 또는 다른 보호성 코팅에서 또한 제제화되지 않는다. 소정의 실시형태에서, 네이키드 올리고뉴클레오타이드 내의 각각의 뉴클레오타이드는 통상적으로 2'-F 또는 2'-OMe에 의해 당 모이어티의 2'-위치에서 변형된다.
이 약제학적 조성물은 종래의 살균 기법에 의해 살균될 수 있거나, 무균 여과될 수 있다. 생성된 수성 용액은 그대로 사용하도록 포장되거나 동결건조될 수 있고, 동결건조된 제제는 투여 전에 무균 수성 부형제와 배합된다. 제제의 pH는 통상적으로 3 내지 11, 더 바람직하게는 5 내지 9 또는 6 내지 8, 가장 바람직하게는 7 내지 8, 예컨대, 7 내지 7.5일 것이다. 고체 형태의 약제학적 조성물은 다수의 단일 용량 단위로 포장될 수 있고, 각각은 예컨대, 정제 또는 캡슐의 밀봉된 패키지에서 상기 언급된 물질 또는 물질들의 고정된 양을 함유한다. 고체 형태의 약제학적 조성물은 예컨대, 국소로 도포 가능한 크림 또는 연고에 설계된 스퀴징 가능한 관에서 유연한 분량을 위해 용기에서 또한 포장될 수 있다.
본 개시내용의 약제학적 조성물은 치료학적 용도를 위해 적용된다. 따라서, 본 개시내용의 일 양태는 유효량의 본 개시내용의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여함으로써 질병 또는 질환을 겪는 인간(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있는 약제학적 조성물을 제공한다.
소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 이를 요하는 환자의 치료를 위한 약제의 제조에서의 치료학적 유효량의 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물의 용도를 특징으로 한다.
XI. 사용 방법
본 명세서에 기재된 4'-포스페이트 유사체 함유 핵산 저해제 분자는 세포에서 표적 유전자의 발현을 조정하는 방법에서 사용될 수 있다. 통상적으로, 이러한 방법은 표적 유전자의 발현을 조정하기에 충분한 양으로 세포로 4'-포스페이트 유사체 함유 핵산 저해제 분자를 도입하는 단계를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 상기 방법은 생체내 수행된다. 상기 방법은 또한 시험관내 또는 생체외 수행될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 세포는 인간 세포(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 포유류 세포이다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 4'-포스페이트 유사체 함유 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 핵산 저해제 분자)는 치료를 요하는 환자를 치료하는 방법에서 사용될 수 있다. 통상적으로, 이러한 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 4'-포스페이트 유사체 함유 핵산 저해제 분자를 포함하는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 이를 요하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물은 이를 요하는 환자에서 바이러스 감염과 관련된 증상의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. 일 실시형태는 치료학적 유효량의 본 명세서에 기재된 바와 같은 4'-포스페이트 유사체 함유 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 핵산 저해제 분자)를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 바이러스 감염을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이러한 바이러스 감염의 비제한적인 예는 HCV, HBV, HPV, HSV 또는 HIV 감염을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물은 이를 요하는 환자에서 암과 관련된 증상의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. 일 실시형태는 치료학적 유효량의 본 명세서에 기재된 바와 같은 4'-포스페이트 유사체-변형된 핵산 저해제 분자를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이러한 암의 비제한적인 예는 담도암, 방광암, 이행 세포 암종, 요로 암종, 뇌암, 신경교종, 성상세포종, 유방 암종, 화생성 암종, 자궁경부암, 자궁경부 편평 세포 암종, 직장암, 결장직장 암종, 결장암, 유전성 비폴립증 결장직장암, 결장직장 선암, 위장관 기질 종양(gastrointestinal stromal tumor: GIST), 자궁내막 암종, 자궁내막 기질 육종, 식도암, 식도 편평 세포 암종, 식도 선암, 눈 흑색종, 포도막 흑색종, 담낭 암종, 담낭 선암, 신장 세포 암종, 투명 세포 신장 세포 암종, 이행 세포 암종, 요로 암종, 윌름스 종양, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병(acute lymocytic leukemia: ALL), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia: AML), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia: CLL), 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia: CML), 만성 골수단핵구성 백혈병(chronic myelomonocytic leukemia: CMML), 간암, 간 암종, 간세포암, 간세포 암종, 담관암종, 간모세포종, 폐암, 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer: NSCLC), 중피종, B 세포 림프종, 비호지킨 림프종, 미만성 대형 B 세포 림프종, 외투 세포 림프종, T 세포 림프종, 비호지킨 림프종, 전구체 T 림프아구성 림프종/백혈병, 말초 T 세포 림프종, 다발성 골수종, 비인두 암종(nasopharyngeal carcinoma: NPC), 신경모세포종, 구인두암, 구강 편평 세포 암종, 골육종, 난소 암종, 췌장암, 췌관 선암, 가성유두상 신생물, 포상 세포 암종, 전립선암, 전립선 선암, 피부암, 흑색종, 악성 흑색종, 피부 흑색종, 소장 암종, 위암, 위 암종, 위장관 기질 종양(GIST), 자궁암 또는 자궁 육종을 포함한다. 통상적으로, 본 개시내용은 치료학적 유효량의 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 투여함으로써 간암, 간 암종, 간세포암, 간세포 암종, 담관암종 및 간모세포종을 치료하는 방법을 특징으로 한다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물은 증식성, 염증성, 자가면역, 신경학적, 눈, 호흡기, 대사적, 피부학적, 청각적, 간, 신장, 또는 감염성 질병과 관련된 증상의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. 일 실시형태는 치료학적 유효량의 본 명세서에 기재된 바와 같은 4'-포스페이트 유사체-변형된 핵산 저해제 분자를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 증식성, 염증성, 자가면역, 신경학적, 눈, 호흡기, 대사적, 피부학적, 청각적, 간, 신장, 또는 감염성 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 통상적으로, 질병 또는 질환은 간의 질병이다.
몇몇 실시형태에서, 본 개시내용은 표적 유전자의 발현을 감소시키기에 충분한 양으로 표적 유전자의 발현의 감소를 요하는 대상체에게 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 표적 유전자의 발현을 감소시키는 방법을 제공하고, 여기서 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 4'-포스페이트 유사체-변형된 핵산 저해제 분자 및 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 4'-포스페이트 유사체-변형된 핵산 저해제 분자는 dsRNAi 저해제 분자 또는 ssRNAi 저해제 분자를 포함하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 RNAi 저해제 분자이다.
표적 유전자는 임의의 포유류로부터의 표적 유전자, 예컨대, 인간 표적 유전자일 수 있다. 임의의 유전자는 본 방법에 따라 침묵화될 수 있다. 예시적인 표적 유전자는 VII 인자, Eg5, PCSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, HBV, HCV, RSV, PDGF 베타 유전자, Erb-B 유전자, Src 유전자, CRK 유전자, GRB2 유전자, RAS 유전자, MEKK 유전자, JNK 유전자, RAF 유전자, Erk1/2 유전자, PCNA(p21) 유전자, MYB 유전자, JUN 유전자, FOS 유전자, BCL-2 유전자, 사이클린 D 유전자, VEGF 유전자, EGFR 유전자, 사이클린 A 유전자, 사이클린 E 유전자, WNT-1 유전자, 베타-카테닌 유전자, c-MET 유전자, PKC 유전자, NFKB 유전자, STAT3 유전자, 서바이빈 유전자, Her2/Neu 유전자, 토포아이소머라제 I 유전자, 토포아이소머라제 II 알파 유전자, p73 유전자, p21(WAF1/CIP1) 유전자, p27(KIP1) 유전자, PPM1D 유전자, RAS 유전자, 카베올린(caveolin) I 유전자, MIB I 유전자, MTAI 유전자, M68 유전자, 종양 억제제 유전자에서의 돌연변이, p53 종양 억제제 유전자, LDHA, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
몇몇 실시형태에서, 4'-포스페이트 유사체-변형된 핵산 저해제 분자는 표적 유전자를 침묵화시키고, 이에 의해 표적 유전자의 원치 않는 발현을 특징으로 하는 질환을 갖거나 이의 위험이 있는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, 본 4'-포스페이트 유사체-변형된 핵산 저해제 분자는 베타-카테닌 유전자를 침묵화시키고, 이에 의해 원치 않는 베타-카테닌 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어, 선암 또는 간세포 암종을 갖거나 이의 위험이 있는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
통상적으로, 본 발명의 4'-포스페이트 유사체 함유 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 핵산 저해제 분자)는 정맥내로 또는 피하로 투여된다. 그러나, 본 명세서에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물은 또한 예를 들어, 경구, 협측, 설하, 직장, 질내, 요도내, 국소, 눈내, 비강내, 및/또는 관절내를 포함하는 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 투여될 수 있고, 투여는 정제, 캡슐, 과립, 수성 현탁액, 겔, 스프레이, 좌제, 고약, 연고 등을 포함할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 대상체 또는 유기체에서의 관련 조직 또는 세포, 예컨대, 간에 대한 전신 투여를 통해(예컨대, 정맥내 또는 피하 투여를 통해) 전달된다. 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 국소 투여 또는 전신 투여를 통해 전달된다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 관련 조직 또는 세포, 예컨대, 폐 세포 및 조직에 대한 국소 투여를 통해, 예컨대, 폐 전달을 통해 전달된다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 치료학적 유효량의 화합물은 투여 경로 및 환자의 신체 특징, 예컨대, 대상체의 몸집 및 체중, 질병 진행 또는 침투의 정도, 대상체의 연령, 건강 및 성별에 따라 달라질 수 있다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 4'-포스페이트 유사체-변형된 올리고뉴클레오타이드는 매일 수혜자의 체중 1킬로그램당 20마이크로그램 내지 10밀리그램의 투약량, 매일 수혜자의 체중 1킬로그램당 100마이크로그램 내지 5밀리그램 또는 매일 수혜자의 체중 1킬로그램당 0.5 내지 2.0밀리그램으로 투여된다.
본 개시내용의 약제학적 조성물은 매일 또는 간헐적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 화합물의 간헐적 투여는 주마다 1일 내지 6일, 개월마다 1일 내지 6일, 주마다 1회, 격주마다 1회, 개월마다 1회, 격달마다 1회, 또는 년마다 1회 또는 2회 또는 다수의 년마다, 달마다, 주마다 또는 일마다의 용량으로 분할되어 투여될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 간헐적 투약은 사이클로의 투여(예를 들어, 1일, 1주 또는 연속 2주 내지 8주 동안의 매일의 투여, 이후 1주 이하, 1개월 이하, 2개월 이하, 3개월 이하 또는 6개월 이하 또는 이것 초과 동안 투여가 없는 휴식 기간)를 의미할 수 있거나, 교대 일, 주, 개월 또는 년에서의 투여를 의미할 수 있다.
본 발명의 치료의 임의의 방법에서, 화합물은 단독으로 단일치료로서 또는 당해 분야에 공지된 추가적인 치료와 조합되어 대상체에게 투여될 수 있다.
실시예
실시예 1: 포스포르아미다이트 1의 합성
하기 반응식 1은 다이에틸 보호된 옥시메틸포스포네이트를 포함하는 하기 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트의 합성을 도시한다: (2R,3S,4R,5R)-5-(3-((벤질옥시)메틸)-2,4-다이옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-2-((다이에톡시포스포릴)메톡시)-4-메톡시테트라하이드로퓨란-3-일(2-사이아노에틸) 다이아이소프로필포스포르아미다이트(포스포르아미다이트 1).
Figure 112019031696560-pct00020
( 2R,3R,4R,5R )-2-((( tert - 부틸다이메틸실릴 ) 옥시 ) 메틸 )-5-(2,4-다이옥 소 -3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-4-메톡시테트라하이드로퓨란-3-일 벤조에이트 (1B) 의 합성
피리딘(1.5ℓ) 중의 2'-O-메틸우리딘(150g, 580.9m㏖)의 용액을 얼음-욕에서 냉각시켰다. 용액에, tert-부틸클로로다이메틸실란(96.3g, 639.0m㏖)을 몇몇 분획을 통해 15분에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 얼음 욕에서 냉각시켰다. 벤조일 클로라이드(165.5g, 1.2㏖)를 반응 혼합물에 15분에 적하하였다. 반응 혼합물을 실온에서 12시간 동안 계속해서 교반한 후, 에틸 아세테이트(2ℓ)에 의해 희석하였다. 용액을 물(3ℓ x 3), 포화 NaHCO3 용액(1ℓ x 2) 및 염수(1ℓ)에 의해 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 진공에서 농축시켜 1B의 밝은 황색의 잔류물(500g, 미정제)을 생성시키고, 이것을 다음 단계에 바로 사용하였다.
( 2R,3R,4R,5R )-5-(3-(( 벤질옥시 ) 메틸 )-2,4- 다이옥소 -3,4- 디하이드로피리미딘 -1(2H)-일)-2-(((tert-부틸다이메틸실릴)옥시)메틸)-4-메톡시테트라하이드로퓨란-3-일 벤조에이트(1C)의 합성
이전의 단계 (1B)로부터의 생성물(500g, 미정제)을 DMF(5ℓ) 중에 용해시켰다. 용액을 얼음 욕에서 냉각시켰다. 벤질 클로로메틸 에터(74.2g, 1.16㏖) 및 DBU(239.8g, 1.58㏖)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온으로 가온되게 하고, 16시간 동안 교반하였다. 반응물을 0.1N HCl(2ℓ)에 의해 급랭시키고, 에틸 아세테이트(2ℓ)에 의해 희석하였다. 유기 층을 분리하였다. 이후, 이것을 물, 염수에 의해 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 진공에서 농축시켰다. 미정제 재료를 CH2Cl2:MeOH(20:1)에 의해 용리되는 실리카 겔 크로마토그래피에서 정제하여 황색의 오일로서 표제 생성물, 1C(500g, 837.9m㏖)를 생성시켰다.
1H NMR: (CD3OD, 400 MHz): δ 7.93 - 7.95 (d, J = 7.2 Hz, 2 H), 7.85 - 7.87 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.50 - 7.52 (d, J = 7.2 Hz, 1 H), 7.36 - 7.40 (t, J = 8.0 Hz, 2 H), 7.12 - 7.19 (m, 5 H), 5.90 - 5.91 (d, J = 3.2 Hz, 1 H), 5.54 - 5.56 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 5.35 (s, 2 H), 5.24 - 5.27 (t, J = 5.6 Hz, 1 H), 4.55 (d, J = 1.6 Hz, 2 H), 4.28 - 4.29 (d, J = 5.6 Hz, 1 H), 3.93 - 4.01 (m, 1 H), 3.81 - 3.93 (t, J = 6.8 Hz, 1 H), 3.32 (s, 3 H), 0.81 - 0.84 (d, J = 7.6 Hz, 10 H), 0.00 (s, 6 H); m/z 발견치 [M+H]+=597.2
( 2R,3R,4R,5R )-5-(3-(( 벤질옥시 ) 메틸 )-2,4-다이옥 소 -3,4- 디하이드로피리미딘 -1(2H)-일)-2-(하이드록시메틸)-4-메톡시테트라하이드로퓨란-3-일 벤조에이트(1D)의 합성
MeOH(1.5ℓ) 중의 1C(250g, 419m㏖)의 용액을 얼음 욕에 배치하고, 아세틸 클로라이드(24.9g, 502.7m㏖)를 15분에 적하하였다. 반응물을 실온으로 가온되게 하고, 2시간 동안 교반하였다. Ag2CO3(138.6g, 502.7m㏖)을 반응물에 첨가하고, 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과시키고, 진공에서 농축시켜 황색의 오일로서 표제 화합물, 1D(400g, 미정제)를 생성시켰다.
1H NMR: (CD3OD, 400 MHz): δ 8.02 - 8.05 (m, 3 H), 7.57 - 7.59 (d, J = 7.6 Hz, 1 H), 7.44 - 7.48 (t, J = 7.6 Hz, 2 H), 7.19 - 7.27 (q, J = 7.2 Hz, 5 H), 6.03 - 6.05 (d, J = 9.2 Hz, 1 H), 5.72 - 5.74 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 5.41 - 5.44 (t, J = 8.8 Hz, 3 H), 4.63 (s, 2 H), 4.29 - 4.31 (t, J = 2.4 Hz, 1 H), 4.17 - 4.19 (t, J = 5.2 Hz, 1 H), 3.79 - 3.88 (m, 2 H), 3.37 (s, 3 H); m/z 발견치 [M+H]+=482.2
( 2S,3S,4R,5R )-3-( 벤조일옥시 )-5-(3-(( 벤질옥시 ) 메틸 )-2,4-다이옥 소 -3,4- 디하이드로피리미딘 -1(2H)-일)-4-메톡시테트라하이드로퓨란-2-카복실산(1E)의 합성
[아세톡시(페닐)-아이오단일] 아세테이트(293.7g, 912m㏖)를 물(1ℓ) 및 CH3CN(1ℓ) 중의 1D(200g, 414.5m㏖) 및 TEMPO(15.64g, 99.48m㏖)의 현탁액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하고, 이후 에틸 아세테이트에 의해 희석하였다. 유기 층을 분리하고, 물, 염수에 의해 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 진공에서 농축시켰다. 미정제 재료를 CH2Cl2:MeOH(20:1)에 의해 용리되는 실리카 겔 크로마토그래피에서 정제하여 황색의 오일로서 표제 생성물, 1E(150g, 837.9m㏖)를 생성시켰다.
1H NMR: (CD3OD, 400 MHz): δ 8.21 - 8.23 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.93 - 7.97 (t, J = 7.6 Hz, 2 H), 7.52 (s, 1 H), 7.37 - 7.41 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 7.10 - 7.20 (m, 4 H), 7.02 - 7.06 (m, 2 H), 6.95 (s, 1 H), 6.08 - 6.09 (d, J = 5.6 Hz, 1 H), 5.69 - 5.71 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 5.60 - 5.62 (t, J = 4.0 Hz, 1 H), 5.31 - 5.36 (t, J = 9.6 Hz, 2 H), 4.54 (s, 2 H), 4.11 - 4.13 (t, J = 4.8 Hz, 1 H), 3.29 (s, 3 H); m/z 발견치 [M+H]+=497.2
( 2R,3S,4R,5R )-2- 아세톡시 -5-(3-(( 벤질옥시 ) 메틸 )-2,4-다이옥 소 -3,4- 디하이드로피리미딘 -1(2H)-일)-4-메톡시테트라하이드로퓨란-3-일 벤조에이트(1F)의 합성
건조 플라스크를 1E(20g, 40.3m㏖) 및 Pb(OAc)4(53.6g, 120.8m㏖)에 의해 충전하였다. 반응 혼합물을 아르곤에 의해 퍼징한 후, DMF(150㎖)를 첨가하였다. 반응물을 광으로부터 보호하고, 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 이것을 물(600㎖)에 의해 급랭시키고, 에틸 아세테이트(400㎖)에 의해 희석하였다. 생성된 현탁액을 셀라이트의 패드를 통해 여과시켰다. 고체를 에틸 아세테이트에 의해 세정하였다. 유기 층을 분리하고, 진공에서 농축시켰다. 미정제 재료를 석유 에터:에틸 아세테이트(3:1)에 의해 용리되는 실리카 겔 크로마토그래피에서 정제하여 α/β 혼합물로서 표제 생성물, 1F(7g, 13.7m㏖)를 생성시켰다.
1H NMR: (CD3OD, 400 MHz): δ 8.10 - 8.13 (t, J = 7.6 Hz, 3 H), 7.65 - 7.69 (t, J = 5.6 Hz, 3 H), 7.54 - 7.58 (t, J = 8.0 Hz, 3 H), 7.26 - 7.35 (m, 9 H), 6.35 - 6.37 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 5.89 - 5.91 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 5.68 - 5.69 (d, J = 4.0 Hz, 1 H), 5.48 - 5.50 (t, J = 1.6 Hz, 3 H), 4.68 - 4.71 (t, J = 7.2 Hz, 3 H), 4.54 - 4.57 (q, J = 4.8 Hz, 1 H), 3.44 (s, 4 H), 2.21 (s, 3 H); m/z 발견치 [M+H]+=511.2
( 2R,3S,4R,5R )-5-(3-(( 벤질옥시 ) 메틸 )-2,4-다이옥 소 -3,4- 디하이드로피리미딘 -1(2H)-일)-2-((다이에톡시포스포릴)메톡시)-4-메톡시테트라하이드로퓨란-3-일 벤조에이트(1G)의 합성
반응을 아르곤 하에 수행하였다. 다이에틸(하이드록시메틸)포스포네이트(26.4g, 156.7m㏖) 및 붕소 트리플루오라이드 다이에틸 에테레이트(27.8g, 196.0m㏖)를 무수 CH2Cl2(130㎖) 중의 1F(20g, 39.2m㏖)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응물을 물에 의해 급랭시키고, 에틸 아세테이트에 의해 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 염수에 의해 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 진공에서 농축시켰다. 미정제 재료를 석유 에터:에틸 아세테이트(3:1 내지 1:1)에 의해 용리되는 실리카 겔 크로마토그래피에서 정제하여 백색의 폼으로서 표제 화합물, 1G(7g, 13.7m㏖)를 생성시켰다.
1H NMR: (CD3OD, 400 MHz): δ 8.10 - 8.13 (t, J = 7.6 Hz, 3 H), 7.65 - 7.69 (t, J = 5.6 Hz, 3 H), 7.54 - 7.58 (t, J = 8.0 Hz, 3 H), 7.26 - 7.35 (m, 9 H), 6.35 - 6.37 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 5.89 - 5.91 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 5.68 - 5.69 (d, J = 4.0 Hz, 1 H), 5.48 - 5.50 (t, J = 1.6 Hz, 3 H), 4.68 - 4.71 (t, J = 7.2 Hz, 3 H), 4.54 - 4.57 (q, J = 4.8 Hz, 1 H), 3.44 (s, 4 H), 2.21 (s, 3 H); m/z 발견치 [M+H]+=619.2
( 2R,3S,4R,5R )-2-((다이에 톡시포스포릴 ) 메톡시 )-5-(2,4-다이옥 소 -3,4- 디하이드로피리미딘 -1(2H)-일)-4-메톡시테트라하이드로퓨란-3-일 벤조에이트(1H)의 합성
TFA(90㎖) 중의 1G(9g, 14.6m㏖)의 용액을 80℃에서 30분 동안 교반하고, 이후 진공에서 농축시켰다. 미정제 재료를 CH2Cl2: MeOH(70:1)에 의해 용리되는 실리카 겔 크로마토그래피에서 정제하여 백색의 폼으로서 표제 화합물, 1H(6.8g, 13.7m㏖)를 생성시켰다.
1H NMR: (CD3OD, 400 MHz): δ 11.54 (s, 1 H), 8.03 - 8.04 (d, J = 7.6 Hz, 2 H), 7.61 (s, 5 H), 6.26 - 6.28 (d, J = 6.8 Hz, 1 H), 5.73 - 5.76 (m, 1 H), 5.55 - 5.56 (d, J = 4.4 Hz, 1 H), 5.39 (s, 1 H), 4.49 - 4.50 (t, J = 4.4 Hz, 1 H), 4.02 - 4.14 (m, 11 H), 3.18 (s, 3 H), 1.24 - 1.30 (m, 6H); m/z 발견치 [M+H]+=499.2
다이에틸 ((((2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-다이옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-3-하이드록시-4-메톡시테트라하이드로퓨란-2-일)옥시)메틸)포스포네이트(1I)의 합성
메탄올(7N, 50㎖) 중의 암모니아 중의 1H(5g, 10m㏖)의 용액을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 진공에서 농축시켰다. 미정제 재료를 CH2Cl2: MeOH(70:1)에 의해 용리되는 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 백색의 폼으로서 표제 화합물, 1I(3.3g, 25.4m㏖)를 생성시켰다.
1H NMR: (CD3OD, 400 MHz): δ 11.53 (s, 1 H), 8.02 - 8.04 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 7.59 - 7.74 (m, 4 H), 6.27 - 6.28 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 5.74 - 5.76 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 5.55 - 5.56 (d, J = 4.4 Hz, 1 H), 5.39 (s, 1 H), 4.49 - 4.50 (t, J = 4.8 Hz, 1 H), 4.02 - 4.13 (m, 7 H), 3.32 (s, 3 H), 1.25 - 1.30 (m, 7 H); m/z 발견치 [M+H]+=395.1
2- 사이아노에틸 (( 2R,3S,4R,5R )-2-((다이에 톡시포스포릴 ) 메톡시 )-5-(2,4-다이옥 소 -3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-4-메톡시테트라하이드로퓨란-3-일) 다이아이소프로필포스포르아미다이트(포스포르아미다이트 1)의 합성
DIPEA(2.4g, 18.3m㏖)를 무수 CH2Cl2(40㎖) 중의 1I(4g, 10.1m㏖), 이어서 3-[클로로-(다이아이소프로필아미노)포스파닐]옥시프로판나이트릴(3.4g, 14.2m㏖)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 이후 MeOH에 의해 급랭시켰다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트에 의해 희석하고, 포화 NaHCO3, 물 및 염수에 의해 세척하였다. 유기 층을 진공에서 농축시켰다. 미정제 재료를 CH2Cl2: MeOH(70:1)에 의해 용리되는 실리카 겔 크로마토그래피에서 정제하여 백색의 고체로서 표제 화합물, 포스포르아미다이트 1(2.9 g, 10.1m㏖)을 생성하였다.
1H NMR (CD3OD, 400 MHz): δ 9.13 (s, 1 H), 7.54 - 7.59 (q, J = 8.4 Hz, 1 H), 6.17 - 6.19 (d, J = 7.2 Hz, 1 H), 5.68 - 5.70 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 5.08 - 5.16 (d, J = 28.8 Hz, 1 H), 4.38 - 4.40 (d, J = 9.2 Hz, 1 H), 4.07 - 4.12 (m, 5 H), 3.83 - 3.86 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 3.63 (s, 5 H), 3.33 - 3.37 (d, J = 14.4 Hz, 3 H), 2.66 - 2.70 (q, J = 5.6 Hz, 2 H), 1.27 - 1.30 (m, 6 H), 1.17 - 1.21 (q, J = 6.0 Hz, 2 H). 31P NMR (CD3CN, 162 MHz): δ 151.54, 150.57, 19.84; m/z 발견치 [M+H]+=595.2
실시예 2: 포스포르아미다이트 2의 합성
하기 반응식 2는 다이에틸 보호된 옥시메틸포스포네이트를 포함하는 하기 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트의 합성을 도시한다: 2-사이아노에틸 ((2R,3R,4R,5R)-2-((다이에톡시포스포릴)메톡시)-5-(2,4-다이옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-4-플루오로테트라하이드로퓨란-3-일) 다이아이소프로필포스포르아미다이트(포스포르아미다이트 2). 포스포르아미다이트 2를 실시예 1에 기재된 절차에 따라 제조하였다.
Figure 112019031696560-pct00021
포스포르아미다이트 2의 1H NMR 스펙트럼(CD3CN, 400 MHz)은 하기와 같다: δ 7.57 - 7.59 (d, J = 8.2 Hz, 1H) 6.26 - 6.35 (m, 1H) 5.70 - 5.73 (q, J = 4.8 Hz, 1H) 5.21 - 5.34 (m, 2H) 4.45 (m, 1H) 4.13 - 4.17 (m, 5H) 4.13 (m, 3H) 3.70 - 3.72 (m, 2H) 2.69 - 2.74 (m, 2H) 1.31 - 1.35 (m, 6H) 1.21 - 1.24 (q, J = 2.0 Hz, 13H). 19F NMR (CD3CN, 376MHz) 포스포르아미다이트 2의 스펙트럼은 하기와 같다: δ -212.04, -212.04 (m, 0.6F); -215.00, -215.02 (m, 0.4F). 31P NMR (162 MHz, CDCl3) 포스포르아미다이트 2의 스펙트럼은 하기와 같다: δ 19.39, 19.26, 151.9,151.3; m/z 발견치 [M+H]+=583.2
실시예 3: 포스포르아미다이트 3의 합성
하기 반응식 3은 다이메틸 보호된 옥시메틸포스포네이트를 포함하는 하기 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트의 합성을 도시한다: (2R,3S,4R,5R)-5-(3-((벤질옥시)메틸)-2,4-다이옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-2-((다이메톡시포스포릴)메톡시)-4-메톡시테트라하이드로퓨란-3-일(2-사이아노에틸) 다이아이소프로필포스포르아미다이트(포스포르아미다이트 3). 포스포르아미다이트 3을 실시예 1에 기재된 절차에 따라 제조하였다.
Figure 112019031696560-pct00022
실시예 4: 포스포르아미다이트 4의 합성
하기 반응식 4는 다이메틸 보호된 옥시메틸포스포네이트를 포함하는 하기 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트의 합성을 도시한다: 2-사이아노에틸 ((2R,3R,4R,5R)-2-((다이메톡시포스포릴)메톡시)-5-(2,4-다이옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-4-플루오로테트라하이드로퓨란-3-일) 다이아이소프로필포스포르아미다이트. 포스포르아미다이트 4를 실시예 1에 기재된 절차에 따라 제조하였다.
Figure 112019031696560-pct00023
실시예 5: 포스포르아미다이트 5 및 포스포르아미다이트 5'의 합성
4'-옥시메틸포스포네이트를 갖는 탄소환식 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트를 합성하였다. 탄소환식 뉴클레오사이드는 뉴클레오사이드 유사체에 항바이러스 특성을 부여할 수 있는 변형인 뉴클레오사이드의 테트라하이드로퓨란 고리 대신에 사이클로펜탄 고리를 보유하는 뉴클레오사이드 유사체의 종류를 나타낸다. 예를 들어, 미국 특허 제6,001,840호를 참조한다. 즉, 탄소환식 뉴클레오사이드는 당 모이어티의 퓨라노스 고리의 산소 원자가 탄소 원자에 의해 치환된 뉴클레오사이드 유사체이다.
하기 반응식 5는 다이에틸 보호된 옥시메틸포스포네이트를 포함하는 하기 탄소환식 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트 거울상이성질체의 합성을 도시한다: 1) 2-사이아노에틸((1S,2S,4R)-2-((다이에톡시포스포릴)메톡시)-4-(2,4-다이옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)사이클로펜틸) 다이아이소프로필포스포르아미다이트(포스포르아미다이트 5) 및 2) 2-사이아노에틸((1R,2R,4S)-2-((다이에톡시포스포릴)메톡시)-4-(2,4-다이옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)사이클로펜틸) 다이아이소프로필포스포르아미다이트(포스포르아미다이트 5').
Figure 112019031696560-pct00024
5I 및 5I'(반응식 5의 단계)를 합성하기 위한 시약 및 조건은 문헌[Drake et al., J. Chem . Soc ., Perkin Trans. 1, 1996, 2739]에 개시되어 있고, 하기와 같다: a) m-CPBA, DCM; b) K2CO3, Ac2O, H2O, DMSO; c) K2CO3, MeOH d) t-BuSi(OTf)2, 루티딘, DMF; e)(EtO)2POCH2OTf, n-BuLi, THF; f) NH4F, MeOH; g) 3-벤조일-2H-1l2-피리미딘-2,4(3H)-다이온; PPh3, DIAD; h) NH4OH, MeOH; 및 i) SFC 분리. 최종 단계는 5I 및 5I'를 j) 3-((클로로(다이아이소프로필아미노)포스판에일)옥시)프로판나이트릴, DIPEA, DCM과 반응시켜 포스포르아미다이트 5 및 포스포르아미다이트 5I'를 형성하는 것을 수반한다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.02 (br s, 1H), 7.62 (dd, J=1.6, 8.2 Hz, 1H), 5.62 (d, J=8.0 Hz, 1H), 5.32 - 5.14 (m, 1H), 4.46 (br d, J=9.4 Hz, 1H), 4.20 - 4.08 (m, 4H), 4.06 - 3.96 (m, 1H), 3.94 - 3.73 (m, 4H), 3.72 - 3.57 (m, 2H), 2.76 - 2.65 (m, 2H), 2.59 - 2.48 (m, 1H), 2.33 - 2.19 (m, 2H), 1.75 (br d, J=13.9 Hz, 1H), 1.32 (br t, J=7.0 Hz, 6H), 1.25 - 1.15 (m, 12H); 31P NMR (162MHz, CD3CN) δ 147.53, 20.45, 20.36; m/z 발견치 [M+H]+=563.5
실시예 6: 다이메 틸 포스포네이트 에스터 포스포르아미다이트를 사용한 5' 말단에서 4'-옥시메틸포스포네이트를 함유하는 올리고뉴클레오타이드의 합성
대조군 화합물 5'-OH, 2'-F; 대조군 화합물 5'-PO4, 2'-F; 대조군 화합물 5'-OH, 2'-OMe; 및 대조군 화합물 5'-PO4, 2'-OMe(도 1a 및 도 1c)를 2'-변형된 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트, 즉 2'-F 및 2'-OMe 변형된 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트를 사용하여 합성하였다. 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-F; 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F; 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-OMe; 및 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-OMe(도 1b 및 도 1d)를 2'-F 및 2'-OMe 변형된 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트를 사용하여 또한 합성하였다. 각각의 화합물은 22개의 뉴클레오타이드 가이드 가닥 및 36개의 뉴클레오타이드 운송 가닥을 함유하고, 여기서, 운송 가닥은 폴리에틸렌 글라이콜-GalNAc 리간드에 각각 접합된 테트라루프에서 4개의 뉴클레오타이드를 함유한다. 도 1a 내지 도 1d를 참조한다. 대조군 및 시험 화합물은 유전자 A mRNA를 표적화하는 동일한 1차 서열, 동일한 운송 가닥 및 뉴클레오타이드 위치 1을 제외하고 가이드 가닥에서 동일한 화학 변형 패턴을 공유하고, 여기서 소정의 화합물은 2'-F를 함유하고, 기타는 2'-OMe를 함유하고, 각각의 시험 화합물은 대조군 화합물에 존재하지 않는 포스페이트 유사체(4'-옥시메틸포스포네이트)를 함유한다. 도 1a 내지 도 1d를 참조한다. 각각의 화합물에서 모든 뉴클레오타이드를 당 고리의 2'-탄소에서 변형되었다.
상업적 올리고 합성기를 사용하여 3'→5' 방향으로 고체 지지체에서 올리고뉴클레오타이드 합성을 수행하였다. 표준 올리고 합성 프로토콜을 이용하였다. 커플링 시간은 활성자로서 5-에틸티오-1H-테트라졸(ETT)에 의해 300초였다. 포스파이트 트리에스터 산화에 요오드 용액을 사용하였다.
가이드 가닥의 N1 뉴클레오타이드에서 포스페이트 유사체에 의해 시험 화합물의 가이드 가닥을 합성하기 위해, 4'-옥시메틸포스포네이트를 함유하는 2'-변형된 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트를 각각의 가이드 가닥의 5' 말단에 커플링시켰다. 더 구체적으로, 하기 표시된 포스포르아미다이트 3(실시예 3) 또는 포스포르아미다이트 4(실시예 4)를 각각의 시험 화합물의 가이드 가닥의 5' 말단에 커플링시켰다.
Figure 112019031696560-pct00025
Figure 112019031696560-pct00026
포스포르아미다이트 3 및 포스포르아미다이트 4의 포스포네이트기는 각각 2개의 메틸 보호된 산소 원자를 함유한다. 그러나, 사용된 탈보호 단계에 따라, 메틸기의 하나 또는 둘 다를 제거하여서, 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F 및 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-OMe(도 1b 및 도 1d 참조)에서 표시된 바대로, 포스포네이트기 또는 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-F 및 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-OMe(도 1b 및 도 1d 참조) 둘 다에서 표시된 바대로, 완전히 탈보호된 포스포네이트기(메틸 보호된 산소 원자가 없음)에서 1개의 메틸 보호된 산소 원자를 갖는 5'-말단 뉴클레오타이드를 생성시켰다.
암모니아를 사용하여 모노메틸 보호된 4'-옥시메틸포스포네이트 올리고뉴클레오타이드를 제조할 수 있다. 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F 및 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-OMe의 가이드 가닥을 제조하기 위해, 포스포르아미다이트 3 또는 4가 커플링된 고체-지지체 결합된 올리고뉴클레오타이드를 농축 암모니아의 혼합물(28 내지 30중량%) 중에 현탁시키고, 55℃에서 17시간 동안 가열하여서 고체 지지체로부터의 절단 및 포스포네이트기의 1개의 메틸기를 포함하는 올리고뉴클레오타이드에서 보호기의 제거를 완료하였다. 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F 및 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-OMe(도 1b 및 도 1d 참조)의 가이드 가닥의 5'-말단 뉴클레오타이드는 하기 도시되어 있고, 여기서 R은 각각 F 및 OMe이다.
Figure 112019031696560-pct00027
트리메틸실릴 요오다이드 시약("TMSI")을 사용하여 완전히 탈보호된 4'-옥시메틸포스포네이트 올리고뉴클레오타이드를 제조할 수 있다. 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-F 및 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-OMe의 가이드 가닥을 제조하기 위해, 포스포르아미다이트 3 또는 4가 커플링된 고체-지지체 결합된 올리고뉴클레오타이드를 실온에서 CH2Cl2 중의 TMSI/피리딘 용액에 의해 처리하였다. 30 내지 45분 후, 반응물을 TEA/CH3CN(1:1) 중의 1M 2-머캅토에탄올 용액에 의해 급랭시켰다. 탈보호 및 고체 지지체로부터의 절단을 위한 표준 올리고뉴클레오타이드 절차를 TMSI 단계 후 적용하여서 완전히 탈보호된 4'-옥시메틸포스포네이트 올리고뉴클레오타이드 가이드 가닥을 생성시켰다. 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-F 및 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-OMe(도 1b 및 도 1d 참조)의 가이드 가닥의 5'-말단 뉴클레오타이드는 하기 도시되어 있고, 여기서 R은 각각 F 및 OMe이다.
Figure 112019031696560-pct00028
탈보호 및 절단 이후에, 미정제 올리고뉴클레오타이드를 분석하고, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)(Integrated DNA Technologies(아이오와주 코럴빌))에 의해 정제하였다. 얻은 올리고뉴클레오타이드 용액을 혼주하고, 농축시키고, 물에 의해 탈염시켰다. 마지막으로, 올리고뉴클레오타이드를 동결건조시켜 분말이 되게 하였다.
이후, 상기 기재된 공정을 반복하여 각각의 뉴클레오타이드 27 내지 30번 위치에서 1가 GalNAc 접합된 뉴클레오타이드를 갖는 상보성 올리고뉴클레오타이드 운송 가닥을 제조하였다. 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 GalNAc 리간드를 2'-탄소에 부착시키기 위해 클릭 화학 또는 아세탈 링커를 사용하여 GalNAc 접합된 포스포르아미다이트 신톤을 제조하였다(예를 들어, WO 제2016/100401호 참조). GalNAc 접합된 포스포르아미다이트 신톤을 운송 가닥의 4개의 연속적인 위치(27 내지 30)로 도입하였다. 운송 가닥은 4'-옥시메틸포스포네이트를 함유하지 않았다.
4개의 dsRNAi 저해제 분자를 얻기 위해 2개의 상보성 가닥의 각각(가이드 및 운송)을 1:1 몰비로 혼합함으로써 듀플렉스를 형성하였다: 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-F; 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F; 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-OMe; 및 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-OMe. 도 1b 및 도 1d를 참조한다.
대조군 화합물에서의 어떤 뉴클레오타이드도 4'-옥시메틸포스포네이트를 포함하지 않는다는 것을 제외하고 상기 기재된 바대로 4개의 대조군 dsRNAi 저해제 분자(대조군 화합물 5'-OH, 2'-F; 대조군 화합물 5'-PO4, 2'-F; 대조군 화합물 5'-OH, 2'-OMe; 및 대조군 화합물 5'-PO4, 2'-OMe)를 또한 제조하였다. 도 1a 및 도 1c를 참조한다. 대조군 화합물 5'-PO4, 2'-F 및 대조군 화합물 5'-PO4, 2'-OMe를 가이드 가닥의 5'-말단 뉴클레오타이드의 5'-탄소에서 천연 포스페이트(5'-PO4 2-)에 의해 합성하는 한편, 대조군 화합물 5'-OH, 2'-F 및 대조군 화합물 5'-OH, 2'-OMe는 가이드 가닥의 5'-말단 뉴클레오타이드의 5'-탄소에서 유리 하이드록실 기(5'-OH)를 함유하였다.
실시예 7: 다이에 틸 포스포네이트 에스터 포스포르아미다이트를 사용한 5' 말단에서 4'-옥시메틸포스포네이트를 함유하는 올리고뉴클레오타이드의 합성
추가적인 dsRNA 저해제 분자를 합성하기 위해 다이에틸 포스포네이트 에스터 포스포르아미다이트에 의해 실시예 6에 기재된 올리고뉴클레오타이드 합성 절차를 또한 반복하였다. 더 구체적으로, 하기 표시된 포스포르아미다이트 1(실시예 1) 또는 포스포르아미다이트 2(실시예 2)를 올리고뉴클레오타이드 가이드 가닥의 5' 말단에 커플링시켰다.
Figure 112019031696560-pct00029
Figure 112019031696560-pct00030
포스포르아미다이트 1 및 포스포르아미다이트 2의 포스포네이트기는 각각 2개의 에틸 보호된 산소 원자를 함유한다. 그러나, 사용된 탈보호 단계에 따라, 에틸기의 하나 또는 둘 다를 제거하여서, 포스포네이트기 또는 완전히 탈보호된 포스포네이트기에서 1개의 에틸 보호된 산소 원자를 갖는(에틸 보호된 산소 원자를 갖지 않음) 5'-말단 뉴클레오타이드를 생성시켰다.
암모니아를 사용하여 모노에틸 보호된 4'-옥시메틸포스포네이트 올리고뉴클레오타이드를 제조할 수 있다. 모노에틸 보호된 5'-말단 뉴클레오타이드를 갖는 올리고뉴클레오타이드 가이드 가닥을 제조하기 위해, 포스포르아미다이트 1 또는 2가 커플링된 고체-지지체 결합된 올리고뉴클레오타이드를 농축 암모니아의 혼합물(28 내지 30중량%) 중에 현탁시키고, 55℃에서 17시간 동안 가열하여서 고체 지지체로부터의 절단 및 포스포네이트기의 1개의 에틸기를 포함하는 올리고뉴클레오타이드로부터의 보호기의 제거를 완료하였다. 모노에틸 보호된 포스포네이트기를 갖는 가이드 가닥의 5'-말단 뉴클레오타이드는 하기 도시되어 있다.
Figure 112019031696560-pct00031
트리메틸실릴 요오다이드 시약("TMSI")을 사용하여 완전히 탈보호된 4'-옥시메틸포스포네이트 올리고뉴클레오타이드를 제조할 수 있다. 완전히 탈보호된 5'-말단 뉴클레오타이드를 갖는 올리고뉴클레오타이드 가이드 가닥을 제조하기 위해, 포스포르아미다이트 1 또는 2가 커플링된 고체-지지체 결합된 올리고뉴클레오타이드를 실온에서 CH2Cl2 중의 TMSI/피리딘 용액에 의해 처리하였다. 30 내지 45분 후, 반응물을 TEA/CH3CN(1:1) 중의 1M 2-머캅토에탄올 용액에 의해 급랭시켰다. 탈보호 및 고체 지지체로부터의 절단을 위한 표준 올리고뉴클레오타이드 절차를 TMSI 단계 후 적용하여서 완전히 탈보호된 4'-옥시메틸포스포네이트 올리고뉴클레오타이드 가이드 가닥을 생성시켰다. 완전히 탈보호된 가이드 가닥의 5'-말단 뉴클레오타이드는 하기 도시되어 있다.
Figure 112019031696560-pct00032
탈보호 및 절단 이후에, 미정제 올리고뉴클레오타이드를 분석하고, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)(Integrated DNA Technologies(아이오와주 코럴빌))에 의해 정제하였다. 얻은 올리고뉴클레오타이드 용액을 혼주하고, 농축시키고, 물에 의해 탈염시켰다. 마지막으로, 올리고뉴클레오타이드를 동결건조시켜 분말이 되게 하였다.
이후, 상기 기재된 공정을 반복하여 각각의 뉴클레오타이드 27 내지 30번 위치에서 1가 GalNAc 접합된 뉴클레오타이드를 갖는 상보성 올리고뉴클레오타이드 운송 가닥을 제조하였다. 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 GalNAc 리간드를 2'-탄소에 부착시키기 위해 클릭 화학 또는 아세탈 링커를 사용하여 GalNAc 접합된 포스포르아미다이트 신톤을 제조하였다(예를 들어, WO 제2016/100401호 참조). GalNAc 접합된 포스포르아미다이트 신톤을 운송 가닥의 4개의 연속적인 위치(27-30)로 도입하였다. 운송 가닥은 4'-옥시메틸포스포네이트를 함유하지 않았다.
dsRNAi 저해제 분자를 얻기 위해 2개의 상보성 가닥의 각각(가이드 및 운송)을 1:1 몰비로 혼합함으로써 듀플렉스를 형성하였다. 각각의 dsRNAi 저해제 분자는 뉴클레오타이드 위치 1에서 4'-옥시메틸포스포네이트를 갖는 22개-염기 쌍 가이드 가닥 및 임의의 4'-옥시메틸포스포네이트가 없는 36개-염기 쌍 운송 가닥을 함유하고, 여기서 운송 가닥은 폴리에틸렌 글라이콜-GalNAc 리간드에 각각 접합된 테트라루프에서 4개의 뉴클레오타이드를 함유한다.
실시예 8: 양이온성 지질 형질주입 물질을 사용한 세포로 형질주입된 시험 화합물의 시험관내 효력(IC 50 )
실시예 6에서 제조된 dsRNAi 저해제 분자를 제조사의 프로토콜에 따라 96웰 플레이트에서 LIPOFECTAMINE(등록상표) RNAiMax(Thermo Fisher Scientific Inc.(메릴랜드주 록빌))를 사용하여 HEK293 세포로 역형질주입하였다. LIPOFECTAMINE(등록상표) RNAiMax(Thermo Fisher Scientific Inc.(메릴랜드주 록빌))는 다양한 세포 유형에 걸쳐 RNAi 저해제 분자의 형질주입 효율을 증대시키도록 설계된 양이온성 지질 제제이다. HEK293 세포를 유전자 A 플라스미드에 의해 또한 형질주입하였다. dsRNAi 저해제 분자의 최종 농도는 1000pM 내지 0.0128pM의 범위였다. HEK293 세포를 12000개의 세포/웰로 96웰 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 48시간 동안 항온처리하였다. 48시간 후, 웰당 30㎕의 ISCRIPT(상표명) 용해 완충제(Bio-Rad Laboratories(캘리포니아주 허큘리스))를 첨가함으로써 세포를 용해시켰다. 다음에, 22㎕의 용해물을 새로운 플레이트로 옮기고, 고역량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems Corporation(캘리포니아주 칼스바드))를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 55℃에서 인간 SFRS9-F569(HEX) 유전자로 정상화된 표적 서열에 의해 정량적 PCR을 수행하였다. GraphPad Prism(GraphPad Software Inc.(캘리포니아주 라 졸라))을 이용하여 그래프를 작성하고, IC50 값을 계산하였다.
도 2a 내지 도 2d는 LIPOFECTAMINE(등록상표) RNAiMax(Thermo Fisher Scientific Inc.(메릴랜드주 록빌))를 사용한 HEK293 세포로의 형질주입 이후에 대조군 화합물 5'-OH, 2'-F; 대조군 화합물 5'-PO4, 2'-F; 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-F; 및 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F의 시험관내 활성을 도시한다. 5'-OH를 갖는 2'-F인 대조군 화합물 5'-OH는 약 10.3pM의 IC50을 갖고, 이는 5'-OH 대신에 5'-PO4를 갖는 대조군 화합물 5'-PO4, 2'-F의 활성(7pM의 IC50)에 필적하였다. 도 2a 내지 도 2b. 5'-PO4가 Ago2 로딩에 중요한 것으로 생각되므로, 이 결과는 대조군 화합물 5'-OH, 2'-F의 5'-OH가 형질주입된 세포의 사이토졸에서 키나제에 의해 5'-PO4로 전환된다는 것을 제안한다. 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-F는 대조군 화합물과 유사한 활성(7.8pM의 IC50)을 가져서, 완전히 탈보호된 4'-옥시메틸포스포네이트가 효율적인 포스페이트 유사체라는 것을 나타낸다. 도 2c. 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F는, 이 검정 조건 하에 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F의 메틸 보호기의 비효율적인 제거에 기인할 수 있는, 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-F(7.8pM의 IC50)보다 이 검정에서 더 낮은 활성(24.8pM의 IC50)을 보여준다. 도 2d. 어떠한 이론에 의해 구속되고자 바라지 않으면서, 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F의 4'-옥시메틸포스포네이트로부터의 메틸 보호기의 제거(완전히 탈보호된 4'-옥시메틸포스포네이트를 생성시킴)가 더 효율적인 Ago2 로딩을 허용한다고 생각된다.
실시예 9: 양이온성 지질 형질주입 물질을 사용하지 않는 원숭이 간세포로 형질주입된 시험 화합물의 시험관내 효력
1차 원숭이 간세포를 Life Technologies Corporation(캘리포니아주 칼스바드)으로부터 얻고, 해동하고 CORNING(등록상표) BIOCOAT(상표명) 96웰 플레이트에서 제조사의 프로토콜에 따라 플레이팅하였다. 플레이팅의 4 내지 6시간 후, 배지를 웰당 90㎕의 Williams E 항온처리 배지에 의해 대체하였다. 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-F 및 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F를 1μM 내지 12.8pM(5배 감소)의 농도로 시작하여 연속하여 희석하였다. 10㎕의 시험 화합물을 양이온성 지질 형질주입 물질, 예컨대, LIPOFECTAMINE(등록상표)(Thermo Fisher Scientfic, Inc.)의 부재 하에 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 항온처리하고, RNA 표적의 넉다운을 시험하였다. 표적 RNA를 추출하고, 제조사의 프로토콜에 따라 SV96 Total RNA Isolation 시스템(Promega(위스콘신주 매디스))을 사용하여 정제하였다. 고역량 cDNA Reverse Transcription 키트(Applied Biosystems Corporation(캘리포니아주 칼스바드))를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 호모 사피엔스 펩티딜 프롤릴 아이소머라제 B PPIB로 정상화된 RNA 표적에 의해 정량적 PCR을 60℃에서 수행하였다. GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad Software Inc.(캘리포니아주 라 졸라))를 이용하여 그래프를 작성하고, IC50 값을 계산하였다.
도 3a 내지 도 3b는 양이온성 지질 형질주입 물질이 없는 형질주입("자가 전달") 이후에 1차 원숭이 간세포에서 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-F 및 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F의 활성을 도시한다. 이 조건이 실시예 8에 사용된 형질주입 프로토콜보다 dsRNAi 저해제 분자가 마주치는 생체내 조건을 더 밀접히 나타낸다고 생각된다. 더 구체적으로, 봉쇄제로서 작용하고 올리고뉴클레오타이드를 보호할 수 있는 형질주입 물질, 예컨대, LIPOFECTAMINE(등록상표) RNAiMax(Thermo Fisher Scientific Inc.(메릴랜드주 록빌)) 없이, dsRNAi 저해제 분자가 세포의 엔도솜 구획의 조건 및 효소에 더 직접적인 노출을 경험할 수 있다고 생각된다. 이것은 실시예 8에 기재된 지질 형질주입과 비교하여 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F의 메틸 보호기의 예를 들어 더 효율적인 제거를 발생시킬 수 있다. 이것과 일치하게, 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-F 및 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F는 자가 전달 형질주입 프로토콜에 따라 필적하는 활성(IC50 1.2nM 및 IC50 3.4nM)을 보여주었다. 도 3a 내지 도 3b.
실시예 10: 양이온성 지질 형질주입 물질을 사용하지 않는 인간 간세포로 형질주입된 시험 화합물의 시험관내 효력
냉동보존된 인간 간세포(Triangle Research Laboratories(노스캐롤라이나 더럼); 로트 HUM4111B호)를 해동하고, 96웰 콜라겐 I 코팅된 플레이트(BD Biosciences)에서 제조사의 지시에 따라 간세포 플레이팅 배지(Triangle Research Laboratories)에서 플레이팅하였다. 4시간 후, 배지를 혈청무 유지 배지(Triangle Research Laboratories(노스캐롤라이나 더럼))로 바꾸었다. 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-F 및 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F를 1μM 내지 0.13nM의 농도에 의해 시작하여 연속하여 희석하고; 배지에 첨가하고; 양이온성 지질 형질주입 물질, 예컨대, LIPOFECTAMINE(등록상표)(Thermo Fisher Scientfic, Inc.)의 부재 하에 24시간 동안 항온처리하였다. 다음 날, 배지를 새롭게 하고, 세포를 추가적인 24시간 동안 성장시켰다.
항온처리 기간 후, 세포를 용해시키고, RNA를 제조사의 프로토콜에 따라 SV96 Total RNA Isolation 시스템(Promega(위스콘신주 매디슨))을 사용하여 제조하였다. 고역량 cDNA Reverse Transcription 키트(Applied Biosystems Corporation(캘리포니아주 칼스바드))를 사용하여 cDNA를 준비하였다. 이후, 하우스키핑 유전자 HPRT1 및 IPO8로 정규화된 유전자 A 특이적 프라이머-프로브를 사용하여 정량적 PCR을 수행하였다. 유전자 A mRNA 발현 수준을 모의 처리된 세포로 정규화하고, GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad Software Inc.(캘리포니아주 라 졸라))를 사용하여 용량 곡선을 작도하였다. 3개의 매개변수 모델을 이용하여 IC50 값을 예측하였다.
도 4a 내지 도 4b는 양이온성 지질 형질주입 물질 없이 형질주입 이후에 1차 인간 간세포에서 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-F 및 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F의 활성을 도시한다. 상기 원숭이 간세포 자가 전달 실험과 유사하게, 이 조건이 실시예 8에서 형질주입 프로토콜보다 dsRNAi 저해제 분자가 마주치는 생체내 조건을 더 밀접히 닮는다고 생각된다. 실시예 9에서의 결과와 일치하게, 시험 화합물 둘 다는 필적하는 활성(IC50 0.7nM 및 IC50 0.9nM)을 보여주어서, 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F에서의 메틸 보호기가 이 조건 하에 더 효율적으로 제거될 수 있어서, 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-F에서 포스포네이트기와 같은 완전히 탈보호된 포스포네이트기를 생성한다는 것을 제안한다. 도 4a 내지 도 4b를 참조한다.
실시예 11: 시험 화합물의 안정성
시험관내 4'-옥시메틸포스포네이트 화합물의 안정성을 평가하기 위해, 3μM의 대조군 화합물 5'-OH, 2'-OMe; 대조군 화합물 5'-PO4, 2'-OMe; 및 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-OMe를 1mg/㎖의 래트 간 트리토솜(Sekisui Xenotech(캔자스주 캔자스시티)) 중에 항온처리하였다. 래트 간 트리토솜은 Triton WR 1339(틸록사폴이라고도 함)에 의해 처리되는 래트 간 세포로부터의 리소좀이다. 2개의 대조군 화합물 및 1개의 시험 화합물을 후속하여 제조사의 지시에 따라 96웰/100㎎의 CLARITY(등록상표) OTX(상표명) 카트리지 SPE 플레이트(Phenomenex(캘리포니아주 토런스)) 및 96웰 플레이트 진공 매니폴드를 사용하여 리소좀 매트릭스로부터 추출하였다. 용리제를 TURBOVAP(등록상표)(Biotage(노스캐롤라이나주 샬럿)) 용매 증발 유닛을 사용하여 증발시키고, 물 중에 재구성하고, LC-MS를 통해 분석하였다.
ACQUITY UPLC(등록상표) 기계(Waters Corporation(매사추세츠주 밀포드))를 사용하여 ACQUITY UPLC(등록상표) 올리고뉴클레오타이드 BEH C18 칼럼 1.7㎛ 입자 크기의 역상 Ultra-Performance Liquid Chromatography(2.1 x 50㎜) 칼럼(Waters Corporation(매사추세츠주 밀포드))를 사용하여 달성된 크로마토그래피 분리에 의해 0.4㎖/분으로 완충제 첨가제를 함유하는 이동상을 전달하였다. 칼럼 온도를 70℃에서 유지시키고, 사용된 샘플 주입 용적은 10 또는 15㎕였다. 음이온 모드 및 전기분무 이온화(ESI) 조건 하에 조작되는 SYNAPT(등록상표) G2S 고해상 비행 시간 질량 분광기(Waters Corporation(매사추세츠주 밀포드))를 사용하여 대조군 및 시험 화합물 및 이의 대사물질을 검출하였다. PROMASS 데콘볼루션(상표명) 소프트웨어(Novatia(펜실베니아주 뉴턴))를 사용하여 전하 상태 데콘볼루션을 통해 0 전하 상태 분자 이온 질량을 얻었다. 대조군 및 시험 화합물 및 이의 대사물질은 실험으로 결정된 질량의 예상된 이론적 분자량과의 비교에 의해 확인되었다.
도 5a는 래트 간 트리토솜에서 항온처리 이후에 대조군 및 시험 화합물의 가이드 가닥의 안정성을 도시하다. 트리토솜에서의 포스파타제는 대조군 화합물 5'-PO4, 2'-OMe의 5'-PO4를 제거할 수 있다. 트리토솜과의 항온처리의 2시간 내에, 대조군 화합물 5'-PO4, 2'-OMe의 가이드 가닥은 검출될 수 없고, 5'-PO4 대신에 5'-OH를 갖는 대조군 화합물의 가이드 가닥의 대사물질("M1")에 의해 대체되었다. 도 5a. 대사물질의 5'-말단 뉴클레오타이드의 화학 구조는 대조군 화합물 5'-OH, 2'-OMe의 가이드 가닥의 5'-말단 뉴클레오타이드의 화학 구조와 동일하였다. 24시간 항온처리 기간 동안, 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-OMe로부터의 포스포네이트 절단이 관찰되지 않았다. 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-OMe는 또한 대조군 화합물 5'-OH, 2'-OMe와 비교하여 개선된 대사 안정성을 보여주었다. 도 5a. 이 데이터는 가이드 가닥의 5'-말단 뉴클레오타이드에 위치한 완전히 탈보호된 4'-옥시메틸포스포네이트가 포스파타제 매개된 절단에 저항이라는 것을 제안한다. 대조군 화합물 5'-PO4, 2'-OMe 및 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-OMe의 5'-말단 뉴클레오타이드의 나란한 비교가 하기 도시되어 있다.
Figure 112019031696560-pct00033
관련 실험에서, 1.7μM의 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F를 1.2U/㎖(산 포스파타제 활성)의 래트 간 트리토솜(Sekisui Xenotech(캔자스주 캔자스시티)) 중에 항온처리하였다. 샘플을 리소좀 매트릭스로부터 추출하고, 상기 기재된 바대로 UPLC에 의해 시험 화합물 및 관련 대사물질의 존재에 대해 분석하였다. 시간이 지나면서, 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F의 가이드 가닥의 수준은 꾸준히 감소하였고, 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-F와 동일한 구조를 갖는 주요 종을 포함하여 대사물질의 혼합물에 의해 샘플에서 대체되어서, 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F의 가이드 가닥이 이 조건 하에 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-F의 가이드 가닥으로 전환된다는 것을 제안한다. 도 5b. 48시간 후, 대사물질의 혼합물은 시험 화합물 완전히 모노메틸 보호된 2'-F의 원래 양의 약 80%로 존재하여서, 가이드 가닥의 5'-말단 뉴클레오타이드에 위치한 완전히 탈보호된 4'-옥시메틸포스포네이트가 포스파타제 매개된 절단에 저항한다는 것을 나타낸다. 도 5b.
생체내 4'-옥시메틸포스포네이트 화합물의 안정성을 평가하기 위해, 2마리의 수컷 CD-1 마우스는 3mpk에서 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-OMe가 투약되고, 각각의 시점에, 간은 가공처리되고, 역상 이온 쌍 짓기 초성능 액체 크로마토그래피(RP-IP-UPLC) 및 고해상 질량 분광법(HRMS)에 의해 분석되었다. 냉동된 조직을 Covaris TissueTube Extra Thick 미분화 백(Covaris(매사추세츠주 우번))으로 옮기고, 액체 질소에서 일시 냉동하고, Cryoprep Pulverizer(Covaris(매사추세츠주 우번))에 의해 미분화하였다. 이후, 샘플을 Safe-Lock Tubes(Eppendorf(뉴욕주 하우포지))로 돌려보내고, 1㎖의 CLARITY(등록상표) OTX(상표명) Lysis-Loading 완충제(Phenomenex(캘리포니아주 토런스))를 첨가하였다. 조직을 30Hz에서 3분 동안 TissueLyser II(Qiagen(메릴랜드주 프리드리히))를 사용하여 균질화하였다. 이후, 샘플을 4℃에서 15분 동안 20,000rpm에서 원심분리하였다. 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F 및 이의 대사물질을 제조사의 프로토콜에 따라 96웰 100㎎ Clarity(등록상표) OTX(상표명)(Phenomenex(캘리포니아주 토런스)) 고상 추출 플레이트를 사용하여 상청액으로부터 추출하였다. 최종 용리제를 냉동하고, 동결건조하고, RP-IP-UPLC-HRMS에 의해 분석되는 80㎕의 물 중에 재현탁시켰다.
ACQUITY UPLC(등록상표) 기계(Waters Corporation(매사추세츠주 밀포드))를 사용하여 ACQUITY UPLC(등록상표) 올리고뉴클레오타이드 BEH C18 칼럼 1.7㎛ 입자 크기의 역상 Ultra-Performance Liquid Chromatography(2.1 x 50mm) 칼럼(Waters Corporation(매사추세츠주 밀포드))를 사용하여 달성된 크로마토그래피 분리에 의해 0.4㎖/분으로 완충제 첨가제를 함유하는 이동상을 전달하였다. 칼럼 온도를 70℃에서 유지시키고, 사용된 샘플 주입 용적은 40㎕였다. 음이온 모드 및 전기분무 이온화(ESI) 조건 하에 조작되는 SYNAPT(등록상표) G2S 고해상 비행 시간 질량 분광기(Waters Corporation(매사추세츠주 밀포드))를 사용하여 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F 및 이의 대사물질의 가이드 가닥을 검출하였다. PROMASS 데콘볼루션(상표명) 소프트웨어(Novatia(펜실베니아주 뉴턴))를 사용하여 전하 상태 데콘볼루션을 통해 0 전하 상태 분자 이온 질량을 얻었다. 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-OMe 및 이의 대사물질의 가이드 가닥은 실험으로 결정된 질량의 예상된 이론적 분자량과의 비교에 의해 확인되었다. 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-OMe 및 관련 대사물질의 가이드 가닥에 대한 신호 강도는 PROMASS 데콘볼루션(상표명) 소프트웨어에 의해 계산되고, 전하 상태 데콘볼루션된 신호 강도로부터 추론된다.
48시간에, 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-OMe의 가이드 가닥의 양은 약 30%로 꾸준히 감소하였다. 도 5c. 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-OMe의 가이드 가닥의 양이 감소하면서, 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-OMe와 동일한 구조를 갖는 대사물질(M2)은 꾸준히 증가하여서, 50시간에 약 20% 및 175시간에 30% 초과에 도달하여서, 4'-옥시메틸포스포네이트의 메틸기가 생체내 하이드록실 기로 전환된다는 것을 제안한다. 도 5c.
실시예 12: 마우스에서의 시험 화합물의 생체내 활성
CD-1 암컷 마우스에 투약량 수준 및 하기 기재된 이중 가닥 핵산 저해제 분자를 사용하여 10㎕/g의 용적으로 피하로 투약하였다. 대조군에 포스페이트 완충 식염수(PBS)를 투약하였다. 동물을 치료 후 72 또는 240시간에 희생시켰다. 간의 우엽을 제거하고, 1 내지 4㎜ 펀치를 제거하고, 드라이 아이스에서 96웰 플레이트로 배치하였다. CFX384 TOUCH(상표명) Real-Time PCR Detection System(BioRad Laboratories, Inc.(캘리포니아주 허큘리스))을 사용하여 qPCR에 의해 표적 mRNA의 감소를 측정하였다. 모든 샘플을 PBS 처리된 대조군 동물로 정규화하고, GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad Software Inc.(캘리포니아주 라 졸라))를 사용하여 작도하였다.
제1 실험에서, 마우스에 대조군 화합물 5'-OH, 2'-F; 대조군 화합물 5'-PO4, 2'-F; 및 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-F에 의해 1mpk로 피하로 투약하였다. 이 3개의 화합물은, 도 1a 및 도 1b에 도시된 바대로, 가이드 가닥의 1의 위치에서의 뉴클레오타이드를 제외하고, 5'-OH 또는 5'-PO4 기를 갖는 대조군 화합물 및 완전히 탈보호된 4'-옥시메틸포스포네이트를 갖는 시험 화합물과 동일하다. 투약 후 3일에 표적 유전자 A mRNA 발현의 저해를 측정하였다. 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-F는 동일한 용량에서 2개의 대조군 화합물과 비교하여 상당히 개선된 유전자 침묵화 활성을 보여주었다. 도 6a. 이 데이터는 대사상 안정한 4'-옥시메틸포스포네이트가 RNAi 저해제 분자의 생체내 활성을 개선한다는 것을 입증한다.
제2 실험에서, CD-1 암컷 마우스에 대조군 화합물 5'-OH, 2'-OMe 및 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-OMe에 의해 1mpk로 피하로 투약하였다. 이 화합물은, 도 1c 및 도 1d에 도시된 바대로, 가이드 가닥의 1의 위치에서의 뉴클레오타이드를 제외하고, 5'-OH를 갖는 대조군 화합물 및 완전히 탈보호된 4'-옥시메틸포스포네이트를 갖는 시험 화합물과 동일하다. 투약 후 4일에 표적 유전자 B mRNA 발현의 저해를 측정하였다. 동일한 경향이 관찰되었고, 시험 화합물은 동일한 용량에서 대조군 화합물과 비교하여 상당히 개선된 유전자 침묵화 활성을 보여주어서, 4'-옥시메틸포스포네이트가 dsRNAi 저해제 분자의 생체내 활성을 개선한다는 것을 입증한다. 도 6b.
제3 실험에서, CD-1 암컷 마우스에 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F에 의해 0.3, 1 및 3mpk 체중으로 피하로 투약하였다. 투약 후 10일에 표적 유전자 A mRNA 발현의 저해를 측정하였다. 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-F는 표적 유전자 mRNA 발현의 용량 의존적 넉다운을 보여주었다. 도 7.
제4 실험에서, CD-1 암컷 마우스에 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-OMe 및 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-OMe에 의해 0.3 또는 1mpk로 피하로 투약하였다. 이 2개의 시험 화합물은, 도 1d에 도시된 바대로, 가이드 가닥의 1번 위치에서의 뉴클레오타이드에서의 4'-옥시메틸포스포네이트를 제외하고(4'-옥시메틸포스포네이트 중 1개는 완전히 탈보호되고, 다른 1개는 단일 메틸기에 의해 보호됨(즉, 모노메틸 보호됨)), 동일하다. 투약 후 3일 및 10일에 표적 유전자 B mRNA 발현의 저해를 측정하였다. 2개의 화합물은 용량 및 시점 둘 다에서 용량 의존적 넉다운 및 유사한 효력을 보여주었다. 도 8. 어떠한 이론에 의해 구속되고자 바라지 않으면서, 4'-옥시메틸포스포네이트의 모노메틸 에스터가 생체내 완전히 탈보호된 4'-옥시메틸포스포네이트로 전환될 수 있다고 믿어진다.
실시예 13: 비인간 영장류에서의 시험 화합물의 생체내 활성
제1 실험에서, 수컷 및 암컷 사이아노몰거스 원숭이에 대조군 화합물 5'-OH, 2'-OMe 및 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-OMe에 의해 체중 1킬로그램당 3밀리그램으로 투약하였다. 이 2개의 화합물은, 도 1c 및 도 1d에 도시된 바대로, 가이드 가닥의 1의 위치에서의 뉴클레오타이드를 제외하고, 5'-OH 기를 갖는 대조군 화합물 및 완전히 탈보호된 4'-옥시메틸포스포네이트를 갖는 시험 화합물과 동일하다. 제2 실험에서, 수컷 및 암컷 사이아노몰거스 원숭이에 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-OMe 및 시험 화합물 모노메틸 보호된 2'-OMe에 의해 체중 1킬로그램당 3밀리그램으로 투약하였다. 이 2개의 시험 화합물은, 도 1d에 도시된 바대로, 가이드 가닥의 1번 위치에서의 뉴클레오타이드에서의 4'-옥시메틸포스포네이트를 제외하고(4'-옥시메틸포스포네이트 중 1개는 완전히 탈보호되고, 다른 1개는 단일 메틸기에 의해 보호됨(즉, 모노메틸 보호됨)), 동일하다. 이중 가닥 핵산 저해제 분자를 10㎖/kg의 용적으로 피하로 투여하였다. 대조군에 포스페이트 완충 식염수(PBS)를 투약하였다.
동물을 모든 샘플 수집 전에 밤새 공복시켰다. 연구 -7일, 14일, 28일 및 56일에, 동물을 진정시키고, 대략 20㎎의 피부경유 간 생검 샘플을 수집하였다. 조직 샘플을 칭량하고, RNAlater(등록상표)에서 보존을 위해 반으로 나누거나, -70℃에서 저장하였다. CFX384 TOUCH(상표명) Real-Time PCR Detection System(BioRad Laboratories, Inc.(캘리포니아주 허큘리스))을 사용하여 qPCR에 의해 표적 mRNA의 감소를 측정하였다. 모든 동물 샘플을 처음에 이의 자체의 투약전 대조군 샘플, 이어서 PBS 처리된 대조군 동물로 정규화하고, GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad Software Inc.(캘리포니아주 라 졸라))를 사용하여 작도하였다.
제1 실험에서, 시험 화합물 완전히 탈보호된 2'-OMe는 14일 및 28일에 2'-OMe인 대조군 화합물 5'-OH와 비교하여 더 양호한 mRNA 감소 활성을 보여주어서, 4'-옥시메틸포스포네이트의 존재가 사이아노몰거스 원숭이에서 RNAi 저해제 분자의 생체내 활성을 개선한다는 것을 입증한다. 도 9a. 제2 실험에서, (완전히 탈보호된 및 모노메틸 보호된) 시험 화합물 둘 다는 모든 시점에서 유사한 활성을 보여주었다. 도 9b.

Claims (49)

  1. 5'-말단 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드로서, 상기 5'-말단 뉴클레오타이드는 하기 화학식 IV로 표시되는, 올리고뉴클레오타이드:
    Figure 112021068115323-pct00037

    식 중,
    B는 천연 핵염기, 변형된 핵염기, 보편적 염기이거나, 부재하고;
    Y는 상기 5'-말단 뉴클레오타이드를 올리고뉴클레오타이드에 부착시키는 뉴클레오타이드간 연결기이며;
    X2는 OH, F, OCH3 또는 OCH2CH2OCH3이다.
  2. 5'-말단 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드로서, 상기 5'-말단 뉴클레오타이드는 하기 화학식 V로 표시되는, 올리고뉴클레오타이드:
    Figure 112021068115323-pct00038

    식 중,
    B는 천연 핵염기, 변형된 핵염기, 보편적 염기이거나, 부재하고;
    Y는 상기 5'-말단 뉴클레오타이드를 올리고뉴클레오타이드에 부착시키는 뉴클레오타이드간 연결기이며;
    X2는 OH, F, OCH3 또는 OCH2CH2OCH3이다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 이중 가닥 RNAi 저해제 분자이고, 상기 제1 가닥은 센스 가닥이고, 상기 제2 가닥은 안티센스 가닥인, 올리고뉴클레오타이드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 이중 가닥 RNAi 저해제 분자는 15개 내지 45개의 뉴클레오타이드의 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 상보성의 영역을 포함하는, 올리고뉴클레오타이드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 상보성의 영역은 20개 내지 30개의 뉴클레오타이드인, 올리고뉴클레오타이드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 상보성의 영역은 21개 내지 26개의 뉴클레오타이드인, 올리고뉴클레오타이드.
  7. 제4항에 있어서, 상기 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 상보성의 영역은 19개 내지 24개의 뉴클레오타이드인, 올리고뉴클레오타이드.
  8. 제7항에 있어서, 상기 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 상보성의 영역은 19개 내지 21개의 뉴클레오타이드인, 올리고뉴클레오타이드.
  9. 제3항에 있어서, 상기 5'-말단 뉴클레오타이드는 상기 안티센스 가닥에 위치한, 올리고뉴클레오타이드.
  10. 제3항에 있어서, 상기 5'-말단 뉴클레오타이드는 상기 센스 가닥에 위치한, 올리고뉴클레오타이드.
  11. 제3항에 있어서, 상기 이중 가닥 RNAi 저해제 분자는 테트라루프를 함유하는, 올리고뉴클레오타이드.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드인, 올리고뉴클레오타이드.
  13. 제12항에 있어서, 상기 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 단일 가닥 RNAi 저해제 분자인, 올리고뉴클레오타이드.
  14. 제12항에 있어서, 상기 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 종래의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임 또는 압타머이고, 상기 종래의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 (1) 입체 장애; (2) RNase H에 의한 표적화된 유전자의 RNA 전사체의 효소 분해의 유도; (3) RNase L에 의한 표적화된 유전자의 RNA 전사체의 효소 분해의 유도; (4) RNase P에 의한 표적화된 유전자의 RNA 전사체의 효소 분해의 유도: (5) 이중 가닥 RNase에 의한 표적화된 유전자의 RNA 전사체의 효소 분해의 유도; 및 (6) 조합된 입체 장애 및 효소 분해 활성의 유도 기전 중 하나에 의해 표적화된 유전자의 발현을 억제하는 것인, 올리고뉴클레오타이드.
  15. 제13항에 있어서, 상기 단일 가닥 RNAi 저해제 분자는 14개 내지 50개의 뉴클레오타이드의 길이인, 올리고뉴클레오타이드.
  16. 제15항에 있어서, 상기 단일 가닥 RNAi 저해제 분자는 16개 내지 30개, 18개 내지 22개, 또는 20개 내지 22개의 뉴클레오타이드의 길이인, 올리고뉴클레오타이드.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 네이키드 올리고뉴클레오타이드이고, 상기 네이키드 올리고뉴클레오타이드는 보호성 지질 나노입자 또는 다른 보호성 제제에서 제제화되지 않는 것인, 올리고뉴클레오타이드.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 1종의 전달 물질을 추가로 포함하고, 상기 적어도 1종의 전달 물질은 세포의 외막에 걸친 올리고뉴클레오타이드의 수송을 수월하게 하도록 상기 올리고뉴클레오타이드에 접합된, 올리고뉴클레오타이드.
  19. 제18항에 있어서, 상기 전달 물질은 탄수화물, 펩타이드, 지질, 비타민 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된, 올리고뉴클레오타이드.
  20. 제18항에 있어서, 상기 전달 물질은 N-아세틸갈락토사민(GalNAc), 만노스-6-포스페이트, 갈락토스, 올리고당, 다당류, 콜레스테롤, 폴리에틸렌 글라이콜, 엽산, 비타민 A, 비타민 E, 리토콜린산 및 양이온성 지질로부터 선택된, 올리고뉴클레오타이드.
  21. 제3항에 따른 올리고뉴클레오타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 표적 유전자의 발현을 감소시키기에 충분한 양으로 유전자의 발현의 감소를 요하는 대상체에게 투여되는, 암, 증식성, 염증성, 자가면역, 신경학적, 눈, 호흡기, 대사적, 피부학적, 청각적, 간, 신장, 또는 감염성 질병을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 투여는 전신 투여를 포함하는, 약제학적 조성물.
  23. 하기 화학식 XIII으로 표시되는 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트:
    Figure 112021068115323-pct00043

    식 중,
    B는 천연 핵염기, 변형된 핵염기, 보편적 염기이거나, 부재하고;
    R10은 포스포르아미다이트이며;
    X2는 OH, F, OCH3, 또는 OCH2CH2OCH3이다.
  24. 하기 화학식 XIV로 표시되는 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트:
    Figure 112021068115323-pct00044

    식 중,
    B는 천연 핵염기, 변형된 핵염기, 보편적 염기이거나, 부재하고;
    R10은 포스포르아미다이트이며;
    X2는 OH, F, OCH3 또는 OCH2CH2OCH3이다.
  25. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드인, 올리고뉴클레오타이드.
  26. 제25항에 있어서, 상기 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드의 각각의 가닥은 15개 내지 100개 또는 15개 내지 50개의 뉴클레오타이드의 길이인, 올리고뉴클레오타이드.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014152622A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Mirna biogenesis in exosomes for diagnosis and therapy
EP3710588A4 (en) 2018-01-16 2021-08-18 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS TO INHIBIT ALDH2 EXPRESSION
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US20220064640A1 (en) * 2018-12-12 2022-03-03 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded nucleic acid inhibitor molecules containing a triloop
EP3947681A1 (en) 2019-03-29 2022-02-09 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the treatment of kras associated diseases or disorders
MX2021012126A (es) 2019-04-04 2022-01-06 Dicerna Pharmaceuticals Inc Composiciones y métodos para inhibir la expresión génica en el sistema nervioso central.
US20220177880A1 (en) * 2019-05-03 2022-06-09 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded nucleic acid inhibitor molecules with shortened sense strands
US20220211743A1 (en) 2019-05-17 2022-07-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oral delivery of oligonucleotides
EP3980436A4 (en) * 2019-06-06 2023-12-20 Avidity Biosciences, Inc. NUCLEIC ACID-POLYPEPTIDE COMPOSITIONS AND USES THEREOF
PE20221578A1 (es) 2020-03-06 2022-10-06 Aligos Therapeutics Inc Moleculas de acido nucleico interferente corto (sina, por sus siglas en ingles) modificadas y usos de estas
CA3172117A1 (en) 2020-03-18 2021-09-23 Bob D. Brown Compositions and methods for inhibiting angptl3 expression
AU2021251249A1 (en) 2020-04-10 2022-11-10 Aligos Therapeutics, Inc. Short interfering nucleic acid (siNA) molecules and uses thereof for coronavirus diseases
TW202221120A (zh) 2020-08-04 2022-06-01 美商黛瑟納製藥公司 用於治療代謝症候群之組成物及方法
US20230277675A1 (en) 2020-08-04 2023-09-07 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Systemic delivery of oligonucleotides
WO2022031847A2 (en) 2020-08-04 2022-02-10 Dicerna Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for inhibiting plp1 expression
JP2023536999A (ja) 2020-08-05 2023-08-30 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー Ｂ型肝炎患者のオリゴヌクレオチド処置
EP4192954A1 (en) 2020-08-05 2023-06-14 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting lpa expression
JP2023548658A (ja) 2020-10-08 2023-11-20 ディセルナ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド グリア細胞へのオリゴヌクレオチドの選択的送達
KR20230170732A (ko) 2021-04-12 2023-12-19 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 케토헥소키나제 (khk)를 억제하기 위한 조성물 및 방법
TW202300645A (zh) 2021-04-14 2023-01-01 美商戴瑟納製藥股份有限公司 用於調節ｐｎｐｌａ３表現之組合物及方法
EP4326872A2 (en) 2021-04-19 2024-02-28 Novo Nordisk A/S Compositions and methods for inhibiting nuclear receptor subfamily 1 group h member 3 (nr1h3) expression
US11655473B2 (en) 2021-05-28 2023-05-23 Novo Nordisk A/S Compositions and methods for inhibiting mitochondria amidoxime reducing component 1 (MARC1) expression
TW202315646A (zh) 2021-06-24 2023-04-16 美商美國禮來大藥廠 新穎之ｒｎａ治療劑及其用途
KR20240070519A (ko) 2021-08-05 2024-05-21 사네진 바이오 유에스에이 인크. 1'-알킬 개질된 리보스 유도체 및 사용 방법
WO2023027759A1 (en) 2021-08-25 2023-03-02 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting αlpha-1 antitrypsin expression
AU2022343115A1 (en) 2021-09-08 2024-03-14 Aligos Therapeutics, Inc. Modified short interfering nucleic acid (sina) molecules and uses thereof
CA3231695A1 (en) 2021-09-08 2023-03-16 Aligos Therapeutics, Inc. Modified short interfering nucleic acid (sina) molecules and uses thereof
WO2023049258A1 (en) 2021-09-22 2023-03-30 Sanegene Bio Usa Inc. 2'-alkyl or 3'- alkyl modified ribose derivatives for use in the in-vivo delivery of oligonucleotides
US20230227480A1 (en) 2021-10-05 2023-07-20 Sanegene Bio Usa Inc. Polyhydroxylated cyclopentane derivatives and methods of use
CA3235941A1 (en) 2021-12-01 2023-06-08 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating apoc3 expression
EP4201947A1 (en) 2021-12-22 2023-06-28 F. Hoffmann-La Roche AG Process for the backbone deprotection of oligonucleotides containing a terminal alkyl phosphonate group
WO2023131170A1 (zh) * 2022-01-05 2023-07-13 大睿生物医药科技(上海)有限公司 具有核苷酸类似物的双链rna
WO2023164464A1 (en) 2022-02-22 2023-08-31 Sanegene Bio Usa Inc. 5'-modified carbocyclic ribonucleotide derivatives and methods of use
WO2023177866A1 (en) 2022-03-18 2023-09-21 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Decarboxylative acetoxylation using mn(ii) or mn(iii) reagent for synthesis of 4'-acetoxy- nucleoside and use thereof for synthesis of corresponding 4'-(dimethoxyphosphoryl)methoxy- nucleotide
WO2023201043A1 (en) 2022-04-15 2023-10-19 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating scap activity
WO2023208023A1 (zh) * 2022-04-26 2023-11-02 上海拓界生物医药科技有限公司 氘代化学修饰和包含其的寡核苷酸
WO2023220561A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Sanegene Bio Usa Inc. Double stranded rna targeting 17-beta hydroxysteroiddehydrogenase 13 (hsd17b13) and methods of use thereof
US20230416742A1 (en) 2022-05-12 2023-12-28 Dicerna Phrmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting mapt expression
US20230416743A1 (en) 2022-05-13 2023-12-28 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting snca expression
TW202400193A (zh) 2022-06-24 2024-01-01 丹麥商諾佛 儂迪克股份有限公司 抑制跨膜絲胺酸蛋白酶６（ｔｍｐｒｓｓ６）表現的組成物及方法
WO2024015796A1 (en) 2022-07-11 2024-01-18 Sanegene Bio Usa Inc. Optimized 2'- modified ribose derivatives and methods of use
US20240052348A1 (en) 2022-08-05 2024-02-15 Sanegene Bio Usa Inc. Double stranded rna targeting angiotensinogen (agt) and methods of use thereof
WO2024040041A1 (en) 2022-08-15 2024-02-22 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Regulation of activity of rnai molecules
WO2024079071A1 (en) 2022-10-11 2024-04-18 Boehringer Ingelheim International Gmbh Dosage regimen for the treatment of nash
US20240150768A1 (en) 2022-10-11 2024-05-09 Boehringer Ingelheim International Gmbh Methods for the treatment of nash with advanced fibrosis and/or cirrhosis
US20240175026A1 (en) 2022-10-14 2024-05-30 Sanegene Bio Usa Inc. Small interfering rna targeting c3 and uses thereof
WO2024107993A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Stat3 targeting oligonucleotides and uses thereof
WO2024112865A1 (en) 2022-11-23 2024-05-30 Eli Lilly And Company Method of synthesizing 4'-phosphate analog nucleotide phosphoramidite

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0398231A2 (en) 1989-05-15 1990-11-22 Institute Of Organic Chemistry And Biochemistry Of The Academy Of Sciences Of The Czech Republic Nucleoside analogs
US20060003952A1 (en) 2002-04-09 2006-01-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds having modified phosphate groups
WO2011133871A2 (en) * 2010-04-22 2011-10-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 5'-end derivatives
WO2011139702A2 (en) 2010-04-28 2011-11-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modified nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom

Family Cites Families (98)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
JPH03503894A (ja) 1988-03-25 1991-08-29 ユニバーシィティ　オブ　バージニア　アランミ　パテンツ　ファウンデイション オリゴヌクレオチド　ｎ‐アルキルホスホラミデート
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5194599A (en) 1988-09-23 1993-03-16 Gilead Sciences, Inc. Hydrogen phosphonodithioate compositions
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5721218A (en) 1989-10-23 1998-02-24 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides with inverted polarity
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US6001840A (en) 1990-03-06 1999-12-14 Southern Research Institute Methods of treatment of viral infections using carbocyclic deoxyguanosine analogs
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5998603A (en) 1994-09-29 1999-12-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-desmethyl nucleoside analogs, and oligomers thereof
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
AU667459B2 (en) 1990-08-03 1996-03-28 Sanofi Compounds and methods for inhibiting gene expression
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
US5596086A (en) 1990-09-20 1997-01-21 Gilead Sciences, Inc. Modified internucleoside linkages having one nitrogen and two carbon atoms
US5672697A (en) 1991-02-08 1997-09-30 Gilead Sciences, Inc. Nucleoside 5'-methylene phosphonates
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
US5792608A (en) 1991-12-12 1998-08-11 Gilead Sciences, Inc. Nuclease stable and binding competent oligomers and methods for their use
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
HU9501974D0 (en) 1993-03-31 1995-09-28 Sterling Winthrop Inc Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
US5798340A (en) 1993-09-17 1998-08-25 Gilead Sciences, Inc. Nucleotide analogs
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5646269A (en) 1994-04-28 1997-07-08 Gilead Sciences, Inc. Method for oligonucleotide analog synthesis
US5977061A (en) 1995-04-21 1999-11-02 Institute Of Organic Chemistry And Biochemistry Of The Academy Of Sciences Of The Czech Republic N6 - substituted nucleotide analagues and their use
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
CA2289702C (en) 1997-05-14 2008-02-19 Inex Pharmaceuticals Corp. High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
ES2242291T5 (es) 1997-09-12 2016-03-11 Exiqon A/S Análogos de nucleósidos bicíclicos y tricíclicos, nucleótidos y oligonucleótidos
ES2356342T3 (es) 1998-01-05 2011-04-07 The University Of Washington Mejora de transporte utilizando agentes de alteración de membrana.
US7737108B1 (en) 2000-01-07 2010-06-15 University Of Washington Enhanced transport using membrane disruptive agents
IL153676A0 (en) 2000-06-30 2003-07-06 Inex Pharmaceuticals Corp Liposomal pharmaceutical compositions
ES2728168T3 (es) 2000-12-01 2019-10-22 Max Planck Gesellschaft Moléculas pequeñas de ARN que median en la interferencia de ARN
WO2003040395A2 (en) 2001-11-07 2003-05-15 Applera Corporation Universal nucleotides for nucleic acid analysis
US7247621B2 (en) 2002-04-30 2007-07-24 Valeant Research & Development Antiviral phosphonate compounds and methods therefor
ATE490788T1 (de) 2003-04-25 2010-12-15 Gilead Sciences Inc Antivirale phosphonate analoge
WO2005021570A1 (ja) 2003-08-28 2005-03-10 Gene Design, Inc. Ｎ−０結合性架橋構造型新規人工核酸
US20070265220A1 (en) 2004-03-15 2007-11-15 City Of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded RNA
AU2005251691A1 (en) 2004-05-17 2005-12-22 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Liposomal formulations comprising dihydrosphingomyelin and methods of use thereof
US7718193B2 (en) 2006-03-16 2010-05-18 University Of Washington Temperature- and pH-responsive polymer compositions
CN101500548A (zh) 2006-08-18 2009-08-05 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于体内递送多核苷酸的多缀合物
US8324179B2 (en) 2007-02-09 2012-12-04 Gilead Sciences, Inc. Nucleoside analogs for antiviral treatment
US20110250138A1 (en) 2007-08-01 2011-10-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Single-stranded and double-stranded oligonucleotides comprising a metal-chelating ligand
US9006193B2 (en) 2008-05-13 2015-04-14 University Of Washington Polymeric carrier
EP2296627A2 (en) 2008-05-13 2011-03-23 The University of Washington Micelles for intracellular delivery of therapeutic agents
MX2010012239A (es) 2008-05-13 2011-05-24 Univ Washington Montajes micelares.
WO2009140423A2 (en) 2008-05-13 2009-11-19 University Of Washington Targeted polymer bioconjugates
KR101661636B1 (ko) 2008-05-13 2016-09-30 유니버시티 오브 워싱톤 세포로의 전달을 위한 이블록 공중합체 및 그의 폴리뉴클레오티드 복합체
US9211250B2 (en) 2008-08-22 2015-12-15 University Of Washington Heterogeneous polymeric micelles for intracellular delivery
WO2010033225A2 (en) 2008-09-22 2010-03-25 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the specific inhibition of gene expression by dsrna possessing modifications
EP2358398A2 (en) 2008-10-24 2011-08-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and methods
US9464300B2 (en) 2008-11-06 2016-10-11 University Of Washington Multiblock copolymers
WO2010053597A2 (en) 2008-11-06 2010-05-14 University Of Washington/////////////////////-+ Micelles of hydrophilically shielded membrane-destabilizing copolymers
US20100184841A1 (en) 2008-12-18 2010-07-22 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Extended dicer substrate agents and methods for the specific inhibition of gene expression
WO2010093788A2 (en) 2009-02-11 2010-08-19 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Multiplex dicer substrate rna interference molecules having joining sequences
CN102625696B (zh) 2009-06-10 2015-06-03 阿尔尼拉姆医药品有限公司 改进的脂质制剂
US8927513B2 (en) 2009-07-07 2015-01-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 5′ phosphate mimics
US8470980B2 (en) * 2009-09-09 2013-06-25 Centrose, Llc Extracellular targeted drug conjugates
US9102938B2 (en) * 2010-04-01 2015-08-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 2′ and 5′ modified monomers and oligonucleotides
ES2605990T3 (es) 2010-12-29 2017-03-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugados de molécula pequeña para la administración intracelular de ácidos nucleicos
CA2885187A1 (en) 2012-09-14 2014-03-20 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the specific inhibition of myc by double-stranded rna
EP2928877B1 (en) * 2012-12-06 2020-01-22 Merck Sharp & Dohme Corp. Disulfide masked prodrug compositions and methods
EP2968149B1 (en) 2013-03-14 2024-05-08 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Process for formulating an anionic agent
US10119136B2 (en) * 2014-01-09 2018-11-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. RNAi agents modified at the 4′-C position
JP7105065B2 (ja) 2014-12-15 2022-07-22 ダイセルナ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド リガンド修飾二本鎖核酸
AU2015363042B2 (en) 2014-12-15 2021-02-25 Emory University Phosphoramidates for the treatment of Hepatitis B virus
HUE056470T2 (hu) 2014-12-26 2022-02-28 Univ Emory Vírusellenes N4-Hidroxicitidin származékok
EP3067369A1 (en) 2015-03-11 2016-09-14 Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) Methods and compositions for the treatment of anti-angiogenic resistant cancer
WO2016174081A1 (en) 2015-04-28 2016-11-03 Ku Leuven Research & Development Novel antiviral compounds, a process for their preparation, and their use for treating viral infections
JP7249080B2 (ja) 2016-08-23 2023-03-30 ディセルナ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含む組成物及びその使用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0398231A2 (en) 1989-05-15 1990-11-22 Institute Of Organic Chemistry And Biochemistry Of The Academy Of Sciences Of The Czech Republic Nucleoside analogs
US20060003952A1 (en) 2002-04-09 2006-01-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds having modified phosphate groups
WO2011133871A2 (en) * 2010-04-22 2011-10-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 5'-end derivatives
WO2011139702A2 (en) 2010-04-28 2011-11-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modified nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom

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