KR102530513B1 - 가역적으로 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 그의 용도 - Google Patents

가역적으로 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드 및 그의 사용 방법이 본원에 개시된다. 핵산 억제제 분자와 같은, 생체내 전달을 위해 사용된 올리고뉴클레오티드를 포함한 임의의 관심 올리고뉴클레오티드는 글루타티온-감수성 모이어티로 변형될 수 있다. 전형적으로, 글루타티온-감수성 모이어티는 올리고뉴클레오티드 내 하나 이상의 뉴클레오티드에서 당 모이어티의 2'-탄소를 가역적으로 변형시키는데 사용되지만, 다른 탄소 위치도 또한 글루타티온-감수성 모이어티로 변형될 수 있다. 또한 예를 들어, 표준 올리고뉴클레오티드 합성 방법에 사용될 수 있는 글루타티온-감수성 뉴클레오시드 포스포르아미다이트를 포함한, 글루타티온-감수성 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 단량체도 개시된다. 게다가, 포스포르아미다이트 없는 글루타티온-감수성 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 단량체는 치료적으로, 예를 들어, 항바이러스제로서 사용될 수 있다.

Description

가역적으로 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 그의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 8월 23일자로 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/378,635의 이익을 주장하고, 그의 출원일에 따르며, 그의 전체 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
올리고뉴클레오티드는 분자 생물학에서, 예를 들어, 프로브, 프라이머, 또는 링커로서의 용도를 포함한 다양한 용도를 갖는다. 올리고뉴클레오티드는 또한 치료적으로, 예를 들어, 게놈 DNA 서열을 편집하기 위해 (예를 들어, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 "CRISPR"), 유전자 요법 기술을 사용하여 결손 또는 누락 유전자를 회복시키기 위해, 또는 핵산 억제제 분자로서 다양한 세트의 메카니즘을 통해 세포내 RNA 수준을 조정하기 위해 사용될 수 있다. 소형 간섭 RNA ("siRNA"), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 마이크로RNA, 안타고미르, 및 압타머는 모두 암, 바이러스 감염, 및 유전 장애의 치료에서 초기 가능성이 입증된 핵산 분자의 예이다. 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 유사체는 또한 치료적으로, 특히 항바이러스제 또는 항암제로서 통상적으로 사용된다.
다른 약물과 마찬가지로, 치료적 올리고뉴클레오티드는, 그 중에서도, 생물계에서의 안정성 및 의도된 작용 부위에서의 충분한 효력을 필요로 한다. 생체내 환경은 치료적 올리고뉴클레오티드의 안정성에 대한 도전과제를 제시하는데, 이는 이들 분자가 신체를 통한 및 표적 세포의 시토졸 내로의 그들의 길을 탐색할 때 그들이 경험하는 조건 때문이다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 3'-엑소뉴클레아제를 포함한, 혈청 내 뉴클레아제에 의한 분해에 취약하다. 문헌 [Behlke, M.A., Oligonucleotides, 2008,18:305-320] 참조. 단일-가닥 3'-오버행을 갖는 핵산 억제제 분자, 예컨대 특정 정규 21-mer siRNA 및 관련 기술분야에 알려져 있고 본원에 기재된 다른 siRNA 디자인은, 결과적으로, 이러한 3'-엑소뉴클레아제에 의한 분해에 특히 취약하다. 문헌 [Behlke, M.A., Oligonucleotides, 2008,18:305-320]. 게다가, RNase A-유사 활성은 혈청 내 siRNA의 분해에 연루된 바 있다.
게다가, 올리고뉴클레오티드가 혈청의 환경을 통해 관심 표적 세포 내로 진입할지라도, 이는 여전히 올리고뉴클레오티드의 안정성을 손상시키는 효소 또는 조건 (예를 들어, pH)에 노출될 수 있다. 예를 들어, pH-의존성 리보뉴클레아제 및 데옥시리보뉴클레아제는 세포의 소포, 예를 들어, 리소솜, 엔도솜 및 융합된 엔도솜/리소솜 소포 내에 존재한다.
수년에 걸쳐, 상이한 접근법이 이들 환경 조건으로부터 치료적 올리고뉴클레오티드를 보호하기 위한 시도로 추구된 바 있다. 핵산 억제제 분자의 생체내 투여와 연관된 문제를 해결하기 위한 주요 접근법은 핵산 분자 내의 하나 이상의 뉴클레오티드에 특정 비가역적, 공유 화학적 변형을 도입한 바 있다. 많은 유형의 비가역적 뉴클레오티드 화학적 변형은 수년에 걸쳐 보고된 바 있다. 예를 들어, 문헌 [Bramsen et al., Nucleic Acids Res.,2009, 37:2867-2881] 참조. 이러한 비가역적 화학적 변형은 종종 뉴클레오티드의 당 모이어티에 대한 변화를 수반한다.
통상적으로, 뉴클레오티드의 당 모이어티의 2'-탄소 (C2')는 2'-히드록실 (2'-OH) 기가 리보뉴클레오티드를 특정 리보뉴클레아제에 보다 취약하게 만들기 때문에 비가역적으로 변형된 바 있다. 예를 들어, 많은 기는 히드록실 기에서 2'-플루오로 (2'-F) 또는 2'-O-메틸 (2'-OMe)로 당 모이어티의 2' 위치를 변형시키고, 이러한 변화는 RNA 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 저항성을 효과적으로 증가시켰다. 문헌 [Behlke, M.A., Oligonucleotides, 2008,18:305-320] 참조.
올리고뉴클레오티드의 5'-단부는 비가역적 방식으로 통상적으로 변형된 또 다른 위치이다. 핵산 억제제 분자의 5'-단부에서의 전형적인 비가역적 변형은 포스포르아미데이트 또는 포스페이트 기의 정전기적 및 입체 특성을 모방하는 화학적 모이어티 ("포스페이트 모방체")를 포함한다. 문헌 [Prakash et al., 2015,43(6):2993-3011] 참조. 전형적으로, 이들 5'-포스페이트 모방체는 포스파타제-저항성 연결을 함유한다.
올리고뉴클레오티드의 백본을 비가역적으로 변형시키는 것이 또한 가능하다. 예를 들어, 포스포로티오에이트 (PS) 백본 변형은 비-가교 산소 원자를 황 원자로 대체하고, 혈장 내 올리고뉴클레오티드의 반감기를 수분 내지 수일로 확장할 수 있다. 문헌 [Shen et al. Nucleic Acids Res., 2015,43:4569-4578; Eckstein, F. Nucleic Acid Thera., 2014,24(6):374-387] 참조.
종종 동일한 핵산 억제제 분자 내의 하나 이상의 뉴클레오티드 위치를 하나 초과 유형의 비가역적 변형으로 비가역적으로 변형시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, siRNA 분자를 다중 2'-F, 2'-OMe, 및 포스포로티오에이트 변형으로 변형시키는 것이 통상적이다. 문헌 [Podbevsek et al., Nucleic Acid Res., 2010,38(20):7298-7307] 참조.
이들 비가역적 변형은, 변형된 뉴클레오티드의 위치 및/또는 변형의 수에 따라, 핵산의 안정성을 개선시키고/거나 혈청 내 또는 세포 내 효소로부터 그를 보호하는 것을 도울 수 있지만, 이들 비가역적 변형은 또한 일단 핵산 억제제 분자가 세포의 시토졸에 도달하면 그의 효력 또는 활성을 감소시킬 수 있다. 문헌 [Behlke, M.A., Oligonucleotides, 2008,18:305-320] 참조. 게다가, 이들 변형은 세포내 조건 하에 비가역적이기 때문에, 이들은 세포의 시토졸에서 그의 생물학적 활성을 발휘하기 전에 핵산 억제제 분자로부터 제거되지 않는다. 비가역적 변형이 감소된 효력 또는 활성을 생성하는 경우에, 이들은 이들을 함유하는 핵산 억제제 분자의 치료적 효능을 제한할 수 있다.
연구 및 약물 개발 노력은 핵산 억제제 분자를 보호하기 위한 비가역적 변형에 초점을 맞춰 왔지만, 또한 보다 작은 규모로, 가역적이고 올리고뉴클레오티드가 세포에 진입한 후에 제거될 수 있는 화학적 변형을 함유하는 올리고뉴클레오티드의 보고가 있어 왔다. 가역적 변형은, 예를 들어, 세포내 효소의 작용에 의해 또는 세포 내부의 화학적 조건에 의해 (예를 들어, 세포내 글루타티온에 의한 환원을 통해) 제거될 수 있다. 전형적으로, 핵산 분자는 뉴클레오티드간 디포스페이트 연결에 의해 생성된 음전하를 차폐하고 세포 흡수 및 뉴클레아제 저항성을 개선시키도록 시클릭 디술피드 모이어티로 화학적으로 변형된 바 있다. 트라베르사 테라퓨닉스, 인크.(Traversa Therapeutics, Inc.)에 원래 양도된 미국 공개 출원 번호 2011/0294869 ("트라베르사"), 솔스티스 바이올로직스, 리미티드.(Solstice Biologics, Ltd.)의 PCT 공개 번호 WO 2015/188197 ("솔스티스"), 문헌 [Meade et al., Nature Biotechnology, 2014,32:1256-1263] ("미드(Meade)"), 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션(Merck Sharp & Dohme Corp.)의 PCT 공개 번호 WO 2014/088920 참조. 뉴클레오티드간 디포스페이트 연결의 이러한 가역적 변형은 시토졸의 환원 환경 (예를 들어 글루타티온)에 의해 세포내로 절단되는 것으로 디자인된다. 보다 초기의 예는 세포 내부를 절단가능할 것으로 보고되었던 포스포트리에스테르 변형을 중화시키는 것을 포함한다 (Dellinger et al. J. Am. Chem. Soc. 2003,125:940-950).
관련 기술분야에서는 뉴클레오티드의 당 모이어티 내 다른 위치, 예컨대 2'-탄소 (또한 C2'으로도 지칭됨)를 가역적으로 변형시키는데 덜 노력하여 왔다. C2'은 효소적 절단 (Lavergne et al., J. Org. Chem., 2011,76:5719-5731) 및 광-자극된 절단 (Johnsson et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters, 2011,21:3721-25)에 감수성인 변형을 사용하여 가역적으로 변형된 바 있다. 매우 최근에, 가역적 디술피드 변형은 2' 탄소에서의 RNA 분자에 적용되었다. 보다 특히, 글루타티온에 의해 세포내로 절단가능한 디술피드 가교를 갖는 특정한 2'-O-메틸디티오메틸 (2'-O MDTM) RNA가 디자인되었고, 단리된 A549 세포 내에서의 외인성으로 첨가된 루시페라제 유전자의 발현을 억제할 수 있는 것으로 시험관내에서 제시되었다. 문헌 [Ochi et al., Bioorganic Medicinal Chemistry Letters, 2016,26:845-848] 참조. 그러나, 상기 문헌 [Ochi]의 저자들은 2'-O-MDTM 기를 함유하는 뉴클레오시드 포스포르아미다이트가 표준 올리고뉴클레오티드 고체 상 합성과 비적합성이라는 것을 밝혀내었다. 문헌 [Ochi 2016] 참조; 또한 문헌 [Ochi et al., Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem., 2015,(62):4.63.1-4.63.20] 참조. 따라서, 상기 문헌 [Ochi]의 저자들은 그들의 2'-O-MDTM-변형된 RNA 분자를 합성하기 위해 합성후 접근법을 사용하여야 했다. 문헌 [Ochi 2016] 참조; 또한 2'-O-MDTM 기를 함유하는 뉴클레오시드 포스포르아미다이트 내의 디술피드 결합의 불안정성을 피하기 위한 방식으로서 2'-O-MDTM-변형된 RNA 분자를 제조하기 위해 상기 문헌 [Ochi]의 합성후 접근법을 인식하고 다양한 2'-알킬디티오메틸 기를 함유하는 RNA를 제조하기 위한 대안적인 합성후 접근법을 제안하는 문헌 [Biscans et al., Org. Biomol. Chem., 2016,14:7010-17] 참조.
올리고뉴클레오티드의 안정성을 개선시키고/거나 혈청 내 또는 세포 내 효소로부터 그들을 보호하기 위해 관련 기술분야에서 이루어진 진전에도 불구하고, 핵산 분자의 가역적 변형, 특히 표준 포스포르아미다이트 올리고뉴클레오티드 합성과 적합성인 가역적 변형을 위한 개선된 전략에 대한 관련 기술분야에서의 필요가 남아있다.
본 출원은 siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 마이크로RNA, 리보자임, 안타고미르, 및 압타머와 같은 핵산 억제제 분자를 포함한 임의의 관심 올리고뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있는 다양한 새로운 글루타티온-감수성, 가역적으로 변형된 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드를 개시한다. 이들은 또한 다른 올리고뉴클레오티드, 예컨대, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) 핵산, 유전자 요법을 위한 핵산, DNA 편집을 위한 핵산, 프로브, 또는 생체내 투여될 다른 올리고뉴클레오티드를 포함한, 뉴클레아제 및/또는 가혹한 환경 조건 (예를 들어, pH)에 의한 분해에 취약한 임의의 다른 올리고뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있다.
본 발명의 글루타티온-감수성 가역적 변형은 또한, 예를 들어, 표준 올리고뉴클레오티드 합성 방법에서 사용될 수 있는 글루타티온-감수성 뉴클레오시드 포스포르아미다이트를 포함한, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 단량체를 가역적으로 변형시키는데 사용될 수 있다. 게다가, 포스포르아미다이트 없는 글루타티온-감수성 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 단량체는 치료적으로, 예를 들어 항바이러스제로서 사용될 수 있다.
전형적으로, 글루타티온-감수성 모이어티는 뉴클레오티드 내 당 모이어티의 2'-탄소를 가역적으로 변형시키는데 사용될 수 있지만, 다른 탄소 위치가 또한 글루타티온-감수성 모이어티로 변형될 수 있다. 하나 이상의 글루타티온-감수성 뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 내로 혼입되어 올리고뉴클레오티드가 뉴클레아제 및 다른 가혹한 환경 조건 (예를 들어, pH)에 노출될 경우에 생체내 투여 (예를 들어, 혈액 및/또는 세포의 리소솜/엔도솜 구획을 통한 전이) 동안에 올리고뉴클레오티드를 보호하는 것을 도울 수 있다. 가역적으로 변형된 올리고뉴클레오티드가 시토졸 내로 방출될 때, 높은 수준의 글루타티온을 포함한, 세포내 조건은 올리고뉴클레오티드로부터 제거될 글루타티온-감수성 모이어티를 야기한다. 특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티의 제거는 2'-탄소 위치에 히드록실 기를 산출하며, 이는 해당 위치에서의 리보뉴클레오티드에 대한 천연 치환기이다 (예를 들어, 실시예 3의 반응식 7 참조).
본 출원의 교시에 따른 가역적, 글루타티온-감수성 모이어티를 사용하면, 비가역적 화학적 변형을 사용하여 이용가능한 옵션과 비교하여 입체적으로 더 큰 화학적 기를 관심 올리고뉴클레오티드 내로 도입하는 것이 가능하다. 이는 이들 더 큰 화학적 기가 시토졸에서 제거될 것이고, 따라서, 세포의 시토졸 내부의 올리고뉴클레오티드의 생물학적 활성을 간섭하지 않아야 하기 때문이다. 그 결과, 이들 더 큰 화학적 기는 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 다양한 이점, 예컨대 뉴클레아제 저항성, 친지성, 전하, 열적 안정성, 특이성, 및 감소된 면역원성을 부여하도록 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티의 구조는 그의 방출의 동역학을 변형시키도록 조작될 수 있다.
더욱이, 본원의 가역적으로 변형된, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 통상적인 고체-상 합성을 사용하여 합성될 수 있다. 따라서, 이들 가역적으로 변형된, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 용이하게 제조되고, 치료적 적용에서 사용하기에 적합하다. 게다가, 핵산은 통상적인 고체-상 합성을 사용하여 합성될 수 있기 때문에, 글루타티온-감수성 뉴클레오티드는 목적하는 효과에 따라 올리고뉴클레오티드 내 선택된 위치에서 핵산 분자 내로 혼입될 수 있다. 올리고뉴클레오티드, 예컨대 핵산 억제제 분자의 특정한 위치에서의 글루타티온-감수성 모이어티의 혼입은 올리고뉴클레오티드의 특성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 글루타티온-감수성 모이어티는 핵산 억제제 분자의 뉴클레오티드 위치 1 (즉, 5'-말단 뉴클레오티드)에서 혼입될 수 있으며, 이는 뉴클레오티드 위치 1에 2'-F를 갖는 분자와 비교하여 분자의 안정성을 증가시킨다.
이러한 기술로, 하나 이상의 관심 뉴클레오티드 위치에서 혼입된 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 치료적으로 유용한, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드를 용이하게 합성하는 것이 현재 가능하다. 이에 따라, 한 측면에서, 본원에 기재된 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 약제로서 사용되고, 제약 조성물로서 함께 허용되는 부형제로 제제화되고, 예를 들어, 게놈 DNA를 편집하거나 또는 표적 유전자의 발현을 조정하고 그를 필요로 하는 환자를 치료하는데 사용될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 하나 이상의 가역적으로 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이며, 여기서 가역적으로 변형된 뉴클레오티드는 당 고리 (또는 그의 유사체)의 2'-탄소에 부착된 글루타티온-감수성 모이어티를 포함한다. 특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는, 본원에 기재된 바와 같은, 화학식 II, III, 또는 IV, 또는, 예를 들어, 화학식 IIa, IIIa, IIIa(i), IIIb, 및 IIIb(i); 화학식 IVa, IVb, IVc, IVd, 또는 IVe; 화학식 IVa(i), IVb(i), IVb(ii), IVc(i), 또는 IVd(i); 또는 화학식 IVe(i), IVe(ii), IVe(iii), IVe(iv), IVe(v), IVe(vi), IVe(vii), IVe(viii), IVe(ix), IVe(x), 또는 IVe(xi)을 포함한, 임의의 그의 하위 화학식에 의해 나타내어진다. 올리고뉴클레오티드가 하나 초과의 가역적으로 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 실시양태에서, 각각의 가역적으로 변형된 뉴클레오티드는 동일한 글루타티온-감수성 모이어티를 포함할 수 있거나 또는 가역적으로 변형된 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 올리고뉴클레오티드의 다른 가역적으로 변형된 뉴클레오티드 내의 적어도 하나의 글루타티온-감수성 모이어티와 상이한 글루타티온-감수성 모이어티를 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 각각의 가역적으로 변형된 뉴클레오티드는 상이한 글루타티온-감수성 모이어티를 포함한다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 제약상 허용되는 담체 및 당 모이어티 (또는 그의 유사체)의 2'-탄소에 부착된 글루타티온-감수성 모이어티를 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하는 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드의 치료 유효량을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는, 본원에 기재된 바와 같은, 화학식 I에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 L은, 본원에 기재된 바와 같은, 화학식 II, III, 또는 IV, 또는, 예를 들어, 화학식 IIa, IIIa, IIIa(i), IIIb, 및 IIIb(i); 화학식 IVa, IVb, IVc, IVd, 또는 IVe; 화학식 IVa(i), IVb(i), IVb(ii), IVc(i), 또는 IVd(i); 또는 화학식 IVe(i), IVe(ii), IVe(iii), IVe(iv), IVe(v), IVe(vi), IVe(vii), IVe(viii), IVe(ix), IVe(x), 또는 IVe(xi)을 포함한, 본원에 기재된 바와 같은, 임의의 그의 하위 화학식으로부터 선택된 글루타티온-감수성 모이어티이다.
글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드의 특정 실시양태에서, L은, 본원에 기재된 바와 같은, 화학식 II에 의해 나타내어지며, 여기서 Y는 O이고; 여기서 Z는 NR'이며, 여기서 R'은 수소 또는 치환 또는 비치환된 지방족이고; 여기서 V는 C이고, 임의로, 여기서 X2 및 X3은 독립적으로 수소, 할로겐, 니트로 또는 아미노로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, L은, 본원에 기재된 바와 같은, 화학식 IIa에 의해 나타내어진다.
글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드의 특정 실시양태에서, L은, 본원에 기재된 바와 같은, 화학식 III에 의해 나타내어지며, 여기서 Y는 O, S 또는 NH이고; 여기서 Z1은 N 또는 CH이고; 여기서 V는 C이고; 임의로, 여기서 M1 및 M2는 치환 또는 비치환된 C2 내지 C6 알킬이거나, 또는 P1 내지 Q1과 함께 5-8 원 고리를 형성하며, 여기서 고리는 치환 또는 비치환된 시클로알킬이다.
특정 실시양태에서, L은, 본원에 기재된 바와 같은, 화학식 IIIa에 의해 나타내어지며, 여기서 Y는 O, S 또는 NH이고; Z1은 N 또는 CR'이며, 여기서 R'은 수소, 할로겐, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택된다. 한 실시양태에서, Y는 O이고, Z1은 N이다 (화학식 IIIa(i) 참조).
특정 실시양태에서, L은, 본원에 기재된 바와 같은, 화학식 IIIb에 의해 나타내어지며, 여기서 Y는 O, S 또는 NH이고; Z1은 N 또는 CR'이며, 여기서 R'은 수소, 할로겐, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되고; Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 부재하거나, 또는 CH3, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클 또는 스페이서를 통해 황 원자에 임의로 연결된 리간드로부터 선택된다. 한 실시양태에서, L은, 본원에 기재된 바와 같은, 화학식 IIIb(i)에 의해 나타내어진다.
글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드의 특정 실시양태에서, L은, 본원에 기재된 바와 같은, 화학식 IV에 의해 나타내어지며, 여기서 Y는 O, S 또는 NH이고; 여기서 Z는 NH 또는 NCH3이고; 여기서 V는 C이고; 여기서 G는 CH2이고 E는 부재하거나, 또는 G는 부재하고 E는 CH2이고; 임의로, 여기서 M3 및 M4는 독립적으로 치환 또는 비치환된 C2 내지 C6 알킬이거나, 또는 함께 5-8 원 고리를 형성하며, 여기서 고리는 치환 또는 비치환된 시클로알킬이다.
특정 실시양태에서, L은, 본원에 기재된 바와 같은, 화학식 IVa에 의해 나타내어지며, 여기서 Y는 O, S, NH이고; 여기서 Z는 O, S 또는 NH이고, 여기서 R5, R6, 및 R7은 각각 독립적으로 O아실, NHR', NR', CR'R"으로부터 선택되며, 여기서 R' 및 R"은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, CH2, CH, 치환된 지방족 또는 비치환된 지방족, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릭으로부터 선택되거나, 또는 함께 헤테로시클릭 고리를 형성할 수 있고; 여기서 T는 분지형 또는 비분지형 C2-C6 알킬 또는 스페이서를 통해 황 원자에 임의로 연결된 리간드이다. 한 실시양태에서, L은, 본원에 기재된 바와 같은, 화학식 IVa(i)에 의해 나타내어진다.
특정 실시양태에서, L은 화학식 IVb에 의해 나타내어지며, 여기서 Y는 O, S, NH이고; Z는 O, S 또는 NH이고; V는 C이고; M3 및 M4는 수소이고; K는 CH 또는 치환 또는 비치환된 지방족이고; E는 NH 또는 NR'이며, 여기서 R'은 치환 또는 비치환된 지방족이고; n은 0-5이고; T는 치환 또는 비치환된 C2 내지 C6 알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이거나, 또는 T는 스페이서를 통해 황 원자에 임의로 연결된 리간드이다. 특정 실시양태에서, L은, 본원에 기재된 바와 같은, 화학식 IVb(i) 또는 IVb(ii)에 의해 나타내어지며, 여기서 R은 수소, CH3, 치환 또는 비치환된 지방족, 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬 또는 헤테로사이클로부터 선택되거나, 또는 R은 스페이서를 통해 임의로 연결된 표적화 리간드이다.
특정 실시양태에서, L은, 본원에 기재된 바와 같은, 화학식 IVc에 의해 나타내어지며, 여기서 Y는 O, S, NH이고; Z는 O, S, 또는 NR'이며, 여기서 R'은 수소, 할로겐, CH3, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되고; V는 C이고; M3 및 M4는 함께 5-8 원 고리를 형성하며, 여기서 고리는 헤테로원자로 임의로 치환되는, 치환 또는 비치환된 시클로알킬이고; K는 분지형 또는 비분지형 치환 또는 비치환된 C2 내지 C6 알킬이고; n은 0-5이고; T는 치환 또는 비치환된 C2 내지 C6 알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이거나, 또는 T는 스페이서를 통해 임의로 연결된 리간드이고; 여기서 R은 수소, CH3, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 시클로알킬, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되거나, 또는 R은 스페이서를 통해 임의로 연결된 표적화 리간드이다. 한 실시양태에서, L은, 본원에 기재된 바와 같은, 화학식 IVc(i)에 의해 나타내어지며, 여기서 R은 수소, CH3, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 시클로알킬, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되거나, 또는 R은 스페이서를 통해 임의로 연결된 표적화 리간드이다.
특정 실시양태에서, L은, 본원에 기재된 바와 같은, 화학식 IVd에 의해 나타내어지며, 여기서 Y는 O, S, NH이고; Z는 O, S, NH, 또는 NCH3으로부터 선택되고; T는 치환 또는 비치환된 C2 내지 C6 알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이거나, 또는 T는 스페이서를 통해 황 원자에 임의로 연결된 리간드이고; 여기서 R은 수소, CH3 또는 치환 또는 비치환된 C2 내지 C6 알킬로부터 선택된다. 한 실시양태에서, L은, 본원에 기재된 바와 같은, 화학식 IVd(i)에 의해 나타내어진다.
글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드의 특정 실시양태에서, L은, 본원에 기재된 바와 같은, 화학식 IVe에 의해 나타내어지며, 여기서 Y는 O, S, NH이고; Z는 O, S, 또는 NR'으로부터 선택되며, 여기서 R'은 수소, 할로겐, CH3, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되고; V는 C 또는 SO이고; G 및 E는 각각 독립적으로 부재하거나, 또는 CH2, CHR', CR'R", NH, NR'으로부터 선택될 수 있으며, 여기서 R' 및 R"은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되거나, 또는 R' 및 R"은 함께 헤테로시클릭 고리를 형성하고; K는 C 또는 CH이고; n은 0-5이고; T는 치환 또는 비치환된 C2 내지 C6 알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이거나, 또는 T는 스페이서를 통해 임의로 연결된 리간드이고; 여기서 R은 수소, CH3, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 시클로알킬, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되거나, 또는 R은 스페이서를 통해 임의로 연결된 표적화 리간드이다. 특정 실시양태에서, Z는 NH 또는 NCH3이고, G 및 E 중 하나 또는 둘 다는 부재하거나, CH2, 또는 CR'R", NH, NR'이며, 여기서 R' 및 R"은 각각 독립적으로 수소 또는 치환 또는 비치환된 지방족으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, L은, 본원에 기재된 바와 같은, 화학식 IVe(i), IVe(ii), IVe(iii), IVe(iv), IVe(v), IVe(vi), IVe(vii), IVe(viii), IVe(ix), IVe(x), 또는 IVe(xi)에 의해 나타내어지며, 여기서 R은 수소, CH3, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 시클로알킬, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되거나, 또는 R은 스페이서를 통해 임의로 연결된 표적화 리간드이다.
특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 화학식 VIIe(ix)에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 A는 부재하거나, 수소, 포스페이트 기, 또는 포스페이트 모방체이고; 여기서 U1은 O 또는 화학식 VIIe(ix)에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기이고; 여기서 B는 천연 핵염기이고; 여기서 U2는 O이고; 여기서 W는 수소 또는 화학식 VIIe(ix)에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기이며, 여기서 U1 또는 W 중 적어도 하나는 화학식 VIIe(ix)에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기이며, 단 U1이 뉴클레오티드간 연결기인 경우에, A는 부재하고; 여기서 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 이중-가닥 RNAi 억제제 분자이다.
특정 실시양태에서, A는 수소이고, W는 화학식 VIIe(ix)에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기이고, 화학식 VIIe(ix)에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 위치 1에 위치한다.
특정 실시양태에서, A는 부재하고; W는 화학식 VIIe(ix)에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 제1 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기이고; U1은 화학식 VIIe(ix)에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 제2 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기이고; 화학식 VIIe(ix)에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 위치 14에 위치한다.
특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 화학식 VIIe(xi)에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 A는 부재하거나, 수소, 포스페이트 기, 또는 포스페이트 모방체이고; 여기서 U1은 O 또는 화학식 VIIe(xi)에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기이고; 여기서 B는 천연 핵염기이고; 여기서 U2는 O이고; 여기서 W는 수소 또는 화학식 VIIe(xi)에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기이며, 여기서 U1 또는 W 중 적어도 하나는 화학식 VIIe(xi)에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기이며, 단 U1이 뉴클레오티드간 연결기인 경우에, A는 부재하고; 여기서 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 이중-가닥 RNAi 억제제 분자이다.
특정 실시양태에서, 뉴클레오티드간 연결기는 인 원자를 함유한다.
특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드이다.
특정 실시양태에서, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드는 이중-가닥 RNAi 억제제 분자이고, 제1 가닥은 센스 가닥을 포함하고, 제2 가닥은 안티센스 가닥을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이중 가닥 RNAi 억제제 분자는 약 15 내지 45개, 20 내지 30개, 21 내지 26개, 19 내지 24개, 또는 19 내지 21개 뉴클레오티드의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 사이의 상보성의 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 화학식 I에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드는 안티센스 가닥 상에 위치한다. 특정 실시양태에서, 화학식 I에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드는 센스 가닥 상에 위치한다.
특정 실시양태에서, 화학식 I에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 위치 1에 위치한다. 특정 실시양태에서, 화학식 I에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 위치 14에 위치한다. 특정 실시양태에서, 화학식 I에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드는 센스 가닥의 Ago2 절단 부위에서의 또는 그에 인접한 하나 이상의 뉴클레오티드 위치에 위치한다. 특정 실시양태에서, 화학식 I에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드는 Ago2 절단 부위의 바로 5' 또는 3'인 1, 2 또는 3개 뉴클레오티드에 위치한다. 특정 실시양태에서, 화학식 I에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드는 Ago2 절단 부위의 양측 상에, 예를 들어, Ago2 절단 부위의 바로 5'인 하나 이상의 뉴클레오티드에 및 Ago2 절단 부위의 바로 3'인 하나 이상의 뉴클레오티드에 위치한다.
특정 실시양태에서, 이중 가닥 RNAi 억제제 분자는 테트라루프를 함유한다.
특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 RNAi 억제제 분자이다. 특정 실시양태에서, 단일-가닥 올리고뉴클레오티드는 통상적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 마이크로RNA, 안타고미르, 또는 압타머이다. 특정 실시양태에서, 단일 가닥 RNAi 억제제 분자는 약 14-50개, 16-30개, 18-22개, 또는 20-22개 뉴클레오티드 길이이다.
특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 화학식 I에 의해 나타내어진 1-5개 뉴클레오티드를 함유한다. 특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드는 변형되고, 여기서 글루타티온-감수성 모이어티로 변형되지 않는 모든 뉴클레오티드는 비가역적 변형으로 변형된다.
특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 전달 작용제를 추가로 포함하며, 여기서 전달 작용제는 세포의 외막을 가로지르는 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드의 수송을 용이하게 한다. 특정 실시양태에서, 전달 작용제는 탄수화물, 펩티드, 지질, 비타민 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 전달 작용제는 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc), 만노스-6-포스페이트, 갈락토스, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 콜레스테롤, 폴리에틸렌 글리콜, 폴레이트, 비타민 A, 비타민 E, 리토콜산 및 양이온성 지질로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 지질 나노입자 내에 함유된다. 특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 네이키드 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드이다.
특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 당 모이어티의 2'-탄소에 공유적으로 결합되어 있는 산소 원자에 결합된 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 뉴클레오시드 포스포르아미다이트를 사용하는 포스포르아미다이트-기반 올리고뉴클레오티드 합성 방법에 의해 제조된다.
특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 세포 내 표적 서열과 혼성화할 수 있는 제1 부분을 갖는 crRNA 서열 및/또는 crRNA 서열의 제2 부분과 혼성화하여 가이드 서열을 형성하는 tracrRNA 서열을 갖는 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 "CRISPR" 핵산 서열이다. 특정 실시양태에서, 가이드 서열은 키메라 가이드 서열이며, 여기서 crRNA 서열은 tracrRNA 서열에 융합된다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물 및 그를 사용하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 글루타티온-감수성 뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 글루타티온-감수성 뉴클레오티드는 리보스 또는 그의 유사체의 2'-탄소에서의 히드록실 기의 글루타티온-감수성 모이어티로의 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥 RNAi 억제제 분자이다. 특정 측면에서, 본 개시내용은 표적 유전자의 발현의 감소를 필요로 하는 대상체에게 글루타티온-감수성 이중-가닥 RNAi 억제제 분자를 포함하는 제약 조성물을 표적 유전자의 발현을 감소시키기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 표적 유전자의 발현을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 투여는 전신 투여를 포함한다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 포스포르아미다이트 및 글루타티온-감수성 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드에 관한 것이며, 여기서 뉴클레오시드는 포스포르아미다이트-기반 올리고뉴클레오티드 합성과 적합성이다. 특정 실시양태에서, 포스포르아미다이트는 뉴클레오시드의 당 모이어티의 5'- 또는 3'-탄소에 결합되어 있고, 글루타티온-감수성 모이어티는 뉴클레오시드의 당 모이어티의 2'-탄소에 공유적으로 결합되어 있는 산소 원자에 결합된다. 뉴클레오시드 포스포르아미다이트의 특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는, 본원에 기재된 바와 같은, 화학식 II, 화학식 III, 또는 화학식 IV, 또는 화학식 IIa, IIIa, IIIb, IIIa(i), IIIb(i), IVa, IVb, IVc, IVd, IVe, IVa(i), IVb(i), IVb(ii), IVc(i), IVd(i), IVe(i), IVe(ii), IVe(iii), IVe(iv), IVe(v), IVe(vi), IVe(vii), IVe(viii), IVe(ix), IVe(x), 또는 IVe(xi)를 포함한, 임의의 그의 하위 화학식에 의해 나타내어진다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 글루타티온-감수성 뉴클레오시드 포스포르아미다이트에 관한 것이며, 여기서 뉴클레오시드 포스포르아미다이트는, 본원에 기재된 바와 같은, 화학식 VIII에 의해 나타내어진다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오시드 포스포르아미다이트는 화학식 IX에 의해 나타내어진다. 특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티 (L1)는 디술피드 가교 또는 술포닐 기를 포함한다.
특정 실시양태에서, 뉴클레오시드 포스포르아미다이트는 화학식 VIII에 의해 나타내어지며, 여기서 J는 O이고; B는 천연 핵염기이고; U2는 O이고; I는 CH2이고; W1은 포스포르아미다이트이고; A1은 보호기, 수소, 또는 고체 지지체이고; U3은 O이고 임의로, 여기서 X는 O이고, R1, R2, R3 및 R4는 수소이다.
특정 실시양태에서, 뉴클레오시드 포스포르아미다이트는 화학식 VIII에 의해 나타내어지며, 여기서 J는 O이고; B는 천연 핵염기이고; U2는 O이고; I는 CH2이고; W1은 보호기, 수소 또는 고체 지지체이고; A1은 포스포르아미다이트이고, U3은 O이고 임의로, 여기서 X는 O이고, R1, R2, R3 및 R4는 수소이다.
특정 실시양태에서, 뉴클레오시드 포스포르아미다이트는 화학식 X에 의해 나타내어지며, 여기서 R8은 H 또는 보호기이고; R7은 포스포르아미다이트이고; B는 천연 핵염기이고; X는 O이고; 여기서 L1은 화학식 IVe(ix)에 의해 나타내어진다.
특정 실시양태에서, 뉴클레오시드 포스포르아미다이트는 화학식 X에 의해 나타내어지며, 여기서 R8은 H 또는 보호기이고; R7은 포스포르아미다이트이고; B는 천연 핵염기이고; X는 O이고; 여기서 L1은 화학식 IVe(xi)에 의해 나타내어진다.
특정 실시양태에서, 포스포르아미다이트는 화학식 -P(ORx)-N(Ry)2를 가지며, 여기서 Rx는 임의로 치환된 메틸, 2-시아노에틸 및 벤질로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 각각의 Ry는 임의로 치환된 에틸 및 이소프로필로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법에 관한 것이다: (a) 뉴클레오시드를 공유 연결을 통해 고체 지지체에 부착시키는 단계; (b) 본원에 기재된 바와 같은, 글루타티온-감수성 뉴클레오시드 포스포르아미다이트를 단계 (a)의 뉴클레오시드 상의 히드록실 기에 커플링시켜 그 사이에 인 뉴클레오시드 연결을 형성하며, 여기서 고체 지지체 상의 임의의 비커플링된 뉴클레오시드는 캡핑 시약으로 캡핑되는 것인 단계; (c) 상기 인 뉴클레오시드 연결을 산화 시약으로 산화시키는 단계; 및 (d) 단계 (b) 내지 (d)를, 본원에 기재된 바와 같은, 하나 이상의 후속 글루타티온-감수성 뉴클레오시드 포스포르아미다이트, 또는 글루타티온-감수성 모이어티를 함유하지 않는 하나 이상의 후속 뉴클레오시드 포스포르아미다이트로 되풀이하여 반복하여, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드를 형성하는 단계; 및 (f) 임의로, 상기 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드를 상기 고체 지지체로부터 제거하는 단계. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 방법에 의해 만들어진 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 화학식 II, III, 또는 IV, 또는, 본원에 기재된 바와 같은, 화학식 IIa, IIIa, IIIb, IIIa(i), IIIb(i), IVa, IVb, IVc, IVd, IVe, IVa(i), IVb(i), IVb(ii), IVc(i), IVd(i), IVe(i), IVe(ii), IVe(iii), IVe(iv), IVe(v), IVe(vi), IVe(vii), IVe(viii), IVe(ix), IVe(x), 또는 IVe(xi)를 포함한, 임의의 그의 하위 화학식에 의해 나타내어진 글루타티온-감수성 모이어티를 포함한 글루타티온-감수성 모이어티는 디술피드 가교 또는 술포닐 기를 포함한다. 특정 측면에서, 본 개시내용은 포스포르아미다이트를 함유하지 않는 글루타티온-감수성 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드에 관한 것이며, 여기서 글루타티온-감수성 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 당 모이어티의 2'-탄소에 공유적으로 결합되어 있는 산소 원자에 결합된 글루타티온-감수성 모이어티를 포함하고; 여기서 글루타티온-감수성 모이어티는, 본원에 기재된 바와 같은, 화학식 II, 화학식 III, 또는 화학식 IV, 또는 임의의 그의 하위 화학식에 의해 나타내어진다.
특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는, 본원에 기재된 바와 같은, 화학식 XI에 의해 나타내어진다. 특정 실시양태에서, J는 O이고; X는 O이고; L2는 화학식 II, III, 또는 IV에 의해 나타내어진 글루타티온-감수성 모이어티이고; W2는 수소, 할로겐, OR', SR', NR'R", 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클이며, 여기서 R' 및 R"은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 치환 또는 비치환된 지방족, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클로부터 선택되거나, 또는 함께 헤테로시클릭 고리를 형성하고; A2는 부재하거나, 수소, 포스페이트 기, 포스페이트 모방체, 또는 포스포르아미데이트이고; 임의로, 여기서 R1, R2, R3, 및 R4는 수소이고; U2는 산소이고; W2는 수소이고; I는 CH2이고; U3은 O이고; A2는 수소 또는 포스페이트 기이다.
도 1a-1b는 실시예에 기재된 바와 같은 4가지 대표적인 이중 가닥 RNAi 억제제 분자의 예를 도시한다: 대조군 화합물 A 및 대조군 화합물 B (도 1a) 및 시험 화합물 1 및 시험 화합물 2 (도 1b). 시험 화합물 1 및 2는, 본 개시내용에 따르면, 이중 가닥 RNAi 억제제 분자의 가이드 가닥의 각각 뉴클레오티드 위치 1 ("가이드 위치 1") 및 14 ("가이드 위치 14")의 2'-탄소에 나타낸 글루타티온-감수성 모이어티를 함유한다. 각각의 시험 화합물 1 및 2의 가이드 가닥의 뉴클레오티드 위치 1 및 14에서의 글루타티온-감수성 뉴클레오티드를 제외하고는, 시험 화합물 1 및 2 내 남아있는 뉴클레오티드는 2'-F 또는 2'-OMe 중 어느 하나로 가역적으로 변형되었다. 대조군 화합물 A 및 B는 가이드 가닥의 위치 1 및 14에서의 뉴클레오티드를 제외하고는 시험 화합물 1 및 2와 동일하다. 대조군 화합물 A 및 B는 가이드 가닥의 뉴클레오티드 위치 1 ("가이드 위치 1")에서 2'-F를 함유한다. 대조군 화합물 A는 가이드 가닥의 5'-말단 뉴클레오티드의 5'-탄소에 천연 포스페이트 (5'-PO4 2-)를 함유하기 때문에 대조군 화합물 B와 상이한 반면에, 대조군 화합물 B는 가이드 가닥의 5'-말단 뉴클레오티드의 5'-탄소에 유리 히드록실 기 (5'-OH)를 함유한다. 대조군 화합물 A 및 B의 가이드 가닥은 동일한 뉴클레오티드 서열을 함유하고, 따라서, 시험 화합물 1 및 2와 동일한 표적 mRNA 서열을 인식한다.
도 2는, 실시예 3에 기재된 바와 같은, 글루타티온과의 인큐베이션 후, 본 개시내용에 따른 2'-탄소에서의 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 가역적으로-변형된 우리딘으로부터의 우리딘의 방출 속도를 도시한다.
도 3은, 실시예 3에 기재된 바와 같은, 글루타티온과의 인큐베이션 후 시험 화합물 2의 소멸 속도를 도시한다.
도 4는, 실시예 4에 기재된 바와 같은, 화합물의 뮤린 간세포 내로의 형질감염으로부터 48시간 후 표적 mRNA의 녹다운에 의한 측정 시, 대조군 화합물 (화합물 A 및 화합물 B)과 비교한 시험 화합물 1의 효력 (IC50 포함)을 도시한다.
도 5는, 실시예 4에서 기재된 바와 같은, 형질감염으로부터 24시간 후 표적 mRNA의 녹다운에 의한 측정 시, 원숭이 간세포에서의 시험 화합물 1의 효력 (IC50 포함)을 도시한다.
도 6은, 실시예 5에 기재된 바와 같은, 대조군 PBS 주사와 비교한 시험 화합물 1의 생체내 투여 후, 표적 mRNA의 녹다운에 의한 측정 시, 마우스에서의 효력 및 효과의 지속기간을 도시한다.
도 7은, 실시예 5에 기재된 바와 같은, 대조군 PBS 주사와 비교한 시험 화합물 2의 생체내 투여 후, 표적 mRNA의 녹다운에 의한 측정 시, 마우스에서의 효력 및 효과의 지속기간을 도시한다.
정의
본 개시내용이 보다 용이하게 이해되도록, 특정 용어를 먼저 하기에 정의한다. 하기 용어 및 다른 용어에 대한 추가적인 정의는 명세서 전반에 걸쳐 제시될 수 있다. 하기 제시된 용어의 정의가 참조로 포함된 출원 또는 특허의 정의와 일치하지 않는 경우에, 본 출원에 제시된 정의가 용어의 의미를 이해하는데 사용되어야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 이에 따라 예를 들어, "방법"에 대한 언급은 본원에 기재된 유형의 하나 이상의 방법, 및/또는 단계를 포함하고/거나 이는 본 개시내용 등을 읽는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
아실: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "아실"은 알킬카르보닐, 시클로알킬카르보닐 및 아릴카르보닐 모이어티를 지칭한다.
지방족 기: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "지방족 기"는, 1개 이상의 관능기로 임의로 치환되는, 포화 및 불포화 둘 다의 직쇄 (즉, 비분지형), 또는 분지형, 탄화수소를 지칭한다. 용어 "치환된 지방족"은 치환기를 보유하는 지방족 모이어티를 지칭한다.
알콕시: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "알콕시"는 산소 원자를 통해 분자 모이어티에 부착된 알킬 기를 지칭한다.
알케닐: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "알케닐"은 적어도 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖고 약 2 내지 약 20개 범위의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 히드로카르빌 기를 지칭한다. "치환된 알케닐"은 1개 이상의 치환기를 추가로 보유하는 알케닐 기를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, "저급 알케닐"은 2 내지 약 6개의 탄소 원자를 갖는 알케닐 모이어티를 지칭한다.
알킬: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "알킬"은 1 내지 약 20개 이하의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 히드로카르빌 기를 지칭한다. 본원에 나타낸 모든 경우에, 수치 범위, 예컨대 "C 1 -C 6 알킬"은 알킬 기가 단지 1개의 탄소 원자, 2개의 탄소 원자, 3개의 탄소 원자 등 내지 6개 이하의 탄소 원자를 포함할 수 있다는 것을 의미하지만, 용어 "알킬"은 또한 탄소 원자의 수치 범위가 지정되지 않은 경우를 포함한다. 예를 들어, 용어 "알킬"은 C1-C10 사이의 하위 범위 (예를 들어 C1-C6)를 지칭할 수 있다. "치환된 알킬"은 치환기를 보유하는 알킬 모이어티를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, "저급 알킬"은 1 내지 약 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 모이어티를 지칭한다.
알킬아미노: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "알킬아미노"는 아민 관능기를 보유하는 알킬 라디칼을 지칭한다. 알킬아미노는 치환 또는 비치환될 수 있다.
알키닐: 본원에 사용된 바와 같은, "알키닐"은 적어도 1개의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖고 약 2 내지 약 20개 범위의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 히드로카르빌 기를 지칭한다. "치환된 알키닐"은 1개 이상의 치환기를 추가로 보유하는 알키닐 기를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, "저급 알키닐"은 약 2 내지 약 6개의 탄소 원자를 갖는 알키닐 모이어티를 지칭한다.
대략: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "대략" 또는 "약"은, 하나 이상의 관심 값에 적용되었을 때, 언급된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 언급되거나 또는 달리 맥락으로부터 분명하지 않는 한, 언급된 참조 값의 어느쪽 방향으로든 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만에 속하는 (더 크거나 또는 더 적은) 값의 범위를 지칭한다 (이러한 수치가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우는 제외함).
압타머: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "압타머"는 핵산, 단백질, 특이적 전세포 또는 특정한 조직을 포함한 특이적 표적에 대해 결합 친화도를 갖는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 압타머는 관련 기술분야에 알려진 방법을 사용하여, 예를 들어, 핵산의 큰 랜덤 서열 풀로부터의 시험관내 선택에 의해 수득될 수 있다. 문헌 [Lee et al., Nucleic Acid Res., 2004,32:D95-D100].
안타고미르: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "안타고미르"는 외인성 RNAi 억제제 분자 또는 천연 miRNA의 가이드 가닥을 포함한 특이적 표적에 대해 결합 친화도를 갖는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다 (Krutzfeldt et al. Nature 2005,438(7068):685-689).
안티센스 가닥: 이중 가닥 RNAi 억제제 분자는 2개 올리고뉴클레오티드 가닥을 포함한다: 안티센스 가닥 및 센스 가닥. 안티센스 가닥 또는 그의 영역은 표적 핵산의 상응하는 영역에 대해 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보적이다. 게다가, 이중 가닥 RNAi 억제제 분자의 안티센스 가닥 또는 그의 영역은 이중 가닥 RNAi 억제제 분자의 센스 가닥 또는 그의 영역에 대해 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보적이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 또한 표적 핵산 서열에 대해 비-상보적인 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 비-상보적 뉴클레오티드는 상보적 서열의 어느 한측 상에 있을 수 있거나, 또는 상보적 서열의 양측 상에 있을 수 있다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥 또는 그의 영역이 센스 가닥 또는 그의 영역에 대해 부분적으로 또는 실질적으로 상보적인 경우에, 비-상보적 뉴클레오티드는 상보성의 하나 이상의 영역 (예를 들어, 하나 이상의 미스매치) 사이에 위치할 수 있다. 이중 가닥 RNAi 억제제 분자의 안티센스 가닥은 또한 가이드 가닥으로서 지칭된다.
방향족 기: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "방향족 기"는 4n+2π 전자를 함유하는 비편재화된 π-전자 시스템을 갖는 평면 고리를 지칭하며, 여기서 n은 정수이다. 방향족 고리는 5, 6, 7, 8, 9개, 또는 9개 초과의 원자로부터 형성될 수 있다. 용어 "방향족"은 카르보시클릭 아릴 (예를 들어, 페닐) 및 헤테로시클릭 아릴 (또는 "헤테로아릴" 또는 "헤테로방향족") 기 (예를 들어, 피리딘) 둘 다를 포괄하도록 의도된다. 용어는 모노시클릭 또는 융합된-고리 폴리시클릭 고리, 즉, 탄소 원자의 인접 쌍을 공유하는 고리를 포함한다. "치환된 방향족"은 1개 이상의 치환기를 추가로 보유하는 방향족 기를 지칭한다.
아르지방족: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "아르지방족", "아릴 지방족," 또는 "방향족 지방족"은 상호교환가능하게 사용되고 하나 이상의 방향족 모이어티 및 하나 이상의 지방족 모이어티를 함유하는 화합물을 지칭한다.
아릴: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "아릴"은 5 내지 19개 이하 범위의 탄소 원자를 갖는 방향족 모노시클릭 또는 멀티시클릭 기를 지칭한다. "치환된 아릴"은 1개 이상의 치환기를 추가로 보유하는 아릴 기를 지칭한다.
카르복실릭: 본원에 사용된 바와 같은, "카르복실릭", "카르복시" 또는 "카르복실"은 일반적으로 라디칼 C(O)OH를 지칭한다.
정규 RNA 억제제 분자: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "정규 RNA 억제제 분자"는, 각각의 가닥이 이중 가닥 핵산의 형성을 위한 19개 염기-쌍 길이인 상보성의 중추 영역 및 각각의 3'-단부에서의 2개 뉴클레오티드 오버행을 갖는 21개 뉴클레오티드 길이인 2개 가닥의 핵산을 지칭한다.
상보적: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "상보적"은 2개 뉴클레오티드가 서로 염기 쌍을 형성하도록 하는 (예를 들어, 2개의 대향하는 핵산 상의 또는 단일 핵산 가닥의 대향하는 영역 상의) 2개 뉴클레오티드 사이의 구조적인 관계를 지칭한다. 예를 들어, 대향하는 핵산의 피리미딘 뉴클레오티드에 상보적인 하나의 핵산의 퓨린 뉴클레오티드는 서로 수소 결합을 형성함으로써 함께 염기 쌍형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상보적 뉴클레오티드는 왓슨-크릭 방식으로 또는 안정한 듀플렉스의 형성을 가능하게 하는 임의의 다른 방식으로 염기 쌍형성할 수 있다. "완전 상보성" 또는 100% 상보성은 제1 올리고뉴클레오티드 가닥 또는 제1 올리고뉴클레오티드 가닥의 절편의 각각의 뉴클레오티드 단량체가 제2 올리고뉴클레오티드 가닥 또는 제2 올리고뉴클레오티드 가닥의 절편의 각각의 뉴클레오티드 단량체와 염기 쌍을 형성할 수 있는 상황을 지칭한다. 100% 미만의 상보성은 2개 올리고뉴클레오티드 가닥 (또는 2개 올리고뉴클레오티드 가닥의 2개 절편)의 일부, 그러나 전체는 아닌 뉴클레오티드 단량체가 서로 염기 쌍을 형성할 수 있는 상황을 지칭한다. "실질적 상보성"은 서로에 대해 90% 이상의 상보성을 나타내는 2개 올리고뉴클레오티드 가닥 (또는 2개 올리고뉴클레오티드 가닥의 절편)을 지칭한다. "충분히 상보적인"은 표적 mRNA에 의해 코딩된 단백질의 양에서의 감소가 있도록 하는 표적 mRNA 및 핵산 억제제 분자 사이의 상보성을 지칭한다.
상보적 가닥: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "상보적 가닥"은 서로 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보적인 이중 가닥 핵산 억제제 분자의 가닥을 지칭한다.
통상적인 안티센스 올리고뉴클레오티드: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "통상적인 안티센스 올리고뉴클레오티드"는 표적화된 유전자의 발현을 하기 메카니즘 중 하나에 의해 억제하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 지칭한다: (1) 입체 장애, 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 유전자의 전사, 프리-mRNA의 스플라이싱 및 mRNA의 번역을 직접적으로 간섭함으로써 유전자 발현 및/또는 코딩된 단백질의 생산에 수반된 일련의 이벤트 중 일부 단계를 간섭함; (2) RNase H에 의한 표적화된 유전자의 RNA 전사체의 효소적 소화의 유도; (3) RNase L에 의한 표적화된 유전자의 RNA 전사체의 효소적 소화의 유도; (4) RNase P에 의한 표적화된 유전자의 RNA 전사체의 효소적 소화의 유도; (5) 이중 가닥 RNase에 의한 표적화된 유전자의 RNA 전사체의 효소적 소화의 유도; 및 (6) 조합된 입체 장애 및 동일한 안티센스 올리고 내의 효소적 소화 활성의 유도. 통상적인 안티센스 올리고뉴클레오티드는 RNAi 억제제 분자와 같은 RNAi 작용 메카니즘을 갖지 않는다. RNAi 억제제 분자는 안티센스 가닥이 의도된 표적(들)에 Ago2 단백질을 지시하도록 하는 RNAi 안티센스 가닥과 조합하는 Ago2에 대한 요건을 포함한 여러 방식으로 통상적인 안티센스 올리고뉴클레오티드로부터 구별될 수 있고 이때 Ago2는 표적의 침묵에 요구된다.
CRISPR RNA: 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 ("CRISPR")는 침입 파지 및 플라스미드에 대해 방어하는데 수반된 미생물 뉴클레아제 시스템이다. 문헌 [Wright et al., Cell, 2016,164:29-44]. 이러한 원핵 시스템은 진핵 세포의 게놈 내의 관심 표적 핵산 서열을 편집하는데 사용하도록 적합화된 바 있다. 문헌 [Cong et al., Science, 2013,339:819-23; Mali et al., Science, 2013,339:823-26; Woo Cho et al., Nat. Biotechnology, 2013,31(3):230-232]. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "CRISPR RNA"는 "CRISPR" RNA (crRNA) 부분 및/또는 트랜스 활성화 crRNA (tracrRNA) 부분을 포함하는 핵산을 지칭하며, 여기서 CRISPR 부분은 표적 핵산에 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보적인 제1 서열 및 제2 서열 (또한 트레이서 메이트 서열로도 불림)로서, tracrRNA 부분에 충분히 상보적이어서 트레이서 메이트 서열 및 tracrRNA 부분이 혼성화하여 가이드 RNA를 형성하도록 하는 제2 서열을 갖는다. 가이드 RNA는 엔도뉴클레아제, 예컨대 Cas 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)와 복합체를 형성하고 뉴클레아제가 표적 핵산의 절단을 매개하도록 지시한다. 특정 실시양태에서, crRNA 부분은 tracrRNA 부분에 융합되어 키메라 가이드 RNA를 형성한다. 문헌 [Jinek et al., Science, 2012,337:816-21]. 특정 실시양태에서, crRNA 부분의 제1 서열은 표적 핵산에 혼성화하는 약 16 내지 약 24개 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 20개 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 가이드 RNA는 약 10-500개 뉴클레오티드이다. 다른 실시양태에서, 가이드 RNA는 약 20-100개 뉴클레오티드이다.
시클로알킬: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "시클로알킬"은 3 내지 12개의 탄소, 예를 들어, 3 내지 8개의 탄소 및, 예를 들어, 3 내지 6개의 탄소를 함유하는 시클릭 (즉, 고리-함유) 탄화수소 기를 지칭한다. "치환된 시클로알킬"은 1개 이상의 치환기를 추가로 보유하는 시클로알킬 기를 지칭한다.
전달 작용제: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "전달 작용제"는 올리고뉴클레오티드와 복합체화되거나 또는 그에 결합되어 세포 내로의 그의 진입을 매개하는 형질감염 작용제 또는 리간드를 지칭한다. 용어는, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 음전하에 결합하는 알짜 양전하를 갖는 양이온성 리포솜을 포괄한다. 이러한 용어는 또한 올리고뉴클레오티드에 공유적으로 부착되어 특정 조직에 직접 전달할 수 있는 본원에 기재된 바와 같은 접합체, 예컨대 GalNAc 및 콜레스테롤을 포괄한다. 추가로 특정한 적합한 전달 작용제가 또한 본원에 기재된다.
데옥시리보뉴클레오티드: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "데옥시리보뉴클레오티드"는 당 모이어티의 2'-위치에 수소 기를 갖는 천연 또는 변형된 뉴클레오티드를 지칭한다.
디술피드: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "디술피드"는 기
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를 함유하는 화학적 화합물을 지칭한다. 전형적으로, 각각의 황 원자는 탄화수소 기에 공유적으로 결합된다. 특정 실시양태에서, 적어도 1개의 황 원자는 탄화수소 이외의 기에 공유적으로 결합된다. 연결은 또한 SS-결합 또는 디술피드 가교로 불린다.
듀플렉스: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "듀플렉스"는, 핵산 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)과 관련하여, 뉴클레오티드의 2개의 역평행 서열의 상보적 염기 쌍형성을 통해 형성된 이중 나선 구조를 지칭한다.
부형제: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "부형제"는, 예를 들어 목적하는 점조도 또는 안정화 효과를 제공하거나 또는 그에 기여하기 위해 제약 조성물에 포함될 수 있는 비-치료적 작용제를 지칭한다.
글루타티온: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "글루타티온" (GSH)은 하기 화학식 XIII의 구조를 갖는 트리펩티드를 지칭한다. GSH는 대략 1-10 mM의 농도로 세포 내에 존재한다. GSH는 디술피드 결합을 포함한, 글루타티온-감수성 결합을 환원시킨다. 그 과정에서, 글루타티온은 그의 산화된 형태인 글루타티온 디술피드 (GSSG)로 전환된다. 일단 산화되면, 글루타티온은 NADPH를 전자 공여체로서 사용하여 글루타티온 리덕타제에 의해 다시 환원될 수 있다.
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글루타티온-감수성 화합물 또는 글루타티온-감수성 모이어티: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "글루타티온-감수성 화합물", 또는 "글루타티온-감수성 모이어티"는 상호교환가능하게 사용되고, 디술피드 가교 또는 술포닐 기와 같은 적어도 하나의 글루타티온-감수성 결합을 함유하는 임의의 화학적 화합물 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오시드) 또는 모이어티를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, "글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드"는 글루타티온-감수성 결합을 함유하는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드이다.
반감기: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "혈청 반감기", "혈장 반감기" 및 "소포 반감기"는 분자, 예컨대 가역적으로 변형된 올리고뉴클레오티드의 양의 절반이 특정한 조건 하에, 예를 들어 혈청, 혈장 또는 엔도솜 또는 리소솜 소포의 존재 하에 분해되거나 또는 제거되는 시간의 양을 지칭한다.
할로: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "할로" 및 "할로겐"은 상호교환가능하고 플루오린, 염소, 브로민 및 아이오딘으로부터 선택된 원자를 지칭한다.
할로알킬: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "할로알킬"은 그에 부착된 1개 이상의 할로겐 원자를 갖는 알킬 기를 지칭하고, 클로로메틸, 브로모에틸, 트리플루오로메틸 등과 같은 기에 의해 예시된다.
헤테로아릴: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "헤테로아릴"은 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 적어도 1개의 헤테로원자를 함유하는 방향족 고리계를 지칭한다. 헤테로아릴 고리는 1개 이상의 헤테로아릴 고리, 방향족 또는 비-방향족 탄화수소 고리 또는 헤테로시클로알킬 고리에 융합되거나 또는 달리 부착될 수 있다.
헤테로사이클: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "헤테로사이클" 또는 "헤테로시클릭"은 고리 구조의 일부로서 1개 이상의 헤테로원자 (예를 들어, N, O, S 등)를 함유하고 3 내지 14개 이하 범위의 탄소 원자를 갖는 비-방향족 시클릭 (즉, 고리-함유) 기를 지칭한다. "치환된 헤테로시클릭" 또는 "치환된 헤테로사이클"은 1개 이상의 치환기를 추가로 보유하는 헤테로시클릭 기를 지칭한다.
IC 50 : 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "IC50"은 주어진 생물학적 과정 (예를 들어 mRNA의 발현)을 절반으로 억제하는데 얼마나 많은 특정한 약물 또는 다른 물질 (억제제)이 필요한지를 나타내는 정량적 척도를 지칭한다.
뉴클레오티드간 연결기: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "뉴클레오티드간 연결기" 또는 "뉴클레오티드간 연결"은 2개의 뉴클레오시드 모이어티를 공유적으로 연결할 수 있는 화학적 기를 지칭한다. 전형적으로, 화학적 기는 포스포 또는 포스파이트 기를 함유하는 인-함유 연결기이다. 포스포 연결기는 포스포디에스테르 연결, 포스포로디티오에이트 연결, 포스포로티오에이트 연결, 포스포트리에스테르 연결, 티오노알킬포스포네이트 연결, 티오알킬포스포트리에스테르 연결, 포스포르아미다이트 연결, 포스포네이트 연결 및/또는 보라노포스페이트 연결을 포함하는 것을 의미한다. 많은 인-함유 연결은, 예를 들어, 미국 특허 번호 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,194,599; 5,565,555; 5,527,899; 5,721,218; 5,672,697 및 5,625,050에 개시된 바와 같이, 관련 기술분야에 널리 알려져 있다. 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 인 원자를 함유하지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드간 연결기, 예컨대 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오티드간 연결, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오티드간 연결, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 뉴클레오티드간 연결 예를 들어 비제한적으로 실록산 백본; 술피드, 술폭시드 및 술폰 백본; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 리보아세틸 백본; 알켄 함유 백본; 술파메이트 백본; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 백본; 술포네이트 및 술폰아미드 백본; 및 아미드 백본을 갖는 것들을 함유한다. 비-인 함유 연결은, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 5,792,608; 5,646,269 및 5,677,439에 개시된 바와 같이, 관련 기술분야에 널리 알려져 있다.
루프: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "루프"는 핵산의 단일 가닥에 의해 형성된 구조를 지칭하며, 여기서 특정한 단일 가닥 뉴클레오티드 영역에 플랭킹하는 상보적 영역은 상보적 영역 사이의 단일 가닥 뉴클레오티드 영역이 듀플렉스 형성 또는 왓슨-크릭 염기 쌍형성으로부터 배제되는 방식으로 혼성화한다. 루프는 임의의 길이의 단일 가닥 뉴클레오티드 영역이다. 루프의 예는 헤어핀 또는 테트라루프와 같은 구조로 존재하는 쌍형성되지 않은 뉴클레오티드를 포함한다.
마이크로RNA: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "마이크로RNA" "성숙 마이크로RNA" "miRNA" 및 "miR"은 상호교환가능하고, 식물 및 동물의 게놈에서 코딩된 비-코딩 RNA 분자를 지칭한다. 전형적으로, 성숙 마이크로RNA는 약 18-25개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 경우에서, 고도로 보존된 내인성으로 발현된 마이크로RNA는 특정한 mRNA의 3'-비번역 영역 (3'-UTR)에 결합함으로써 유전자의 발현을 조절한다. 특정 성숙 마이크로RNA는 종종 수백개 뉴클레오티드 길이인 긴 내인성 일차 마이크로RNA 전사체 (또한 프리-마이크로RNA, 일차-마이크로RNA, 일차-mir, 일차-miR 또는 일차-프리-마이크로RNA)로부터 기원하는 것으로 보인다 (Lee, et al., EMBO J., 2002, 21(17), 4663-4670).
변형된 뉴클레오시드: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "변형된 뉴클레오시드"는 변형된 또는 범용 핵염기 또는 변형된 당 중 하나 이상을 함유하는 뉴클레오시드를 지칭한다. 변형된 또는 범용 핵염기 (또한 본원에서 염기 유사체로도 지칭됨)는 일반적으로 뉴클레오시드 당 모이어티의 1'-위치에 위치하고, 1'-위치에서의 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 및 우라실 이외의 핵염기를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 변형된 또는 범용 핵염기는 질소함유 염기이다. 특정 실시양태에서, 변형된 핵염기는 질소 원자를 함유하지 않는다. 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 번호 20080274462 참조. 특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 핵염기를 함유하지 않는다 (무염기성). 변형된 당 (또한 본원에서 당 유사체로도 지칭됨)은 변형된 데옥시리보스 또는 리보스 모이어티를 포함하며, 예를 들어, 여기서 변형은 당의 2'-, 3'-, 4'-, 또는 5'-탄소 위치에서 발생한다. 변형된 당은 또한 비-천연 대안적 탄소 구조 예컨대 잠금 핵산 ("LNA") (예를 들어, 문헌 [Koshkin et al. (1998), Tetrahedron, 54,3607-3630] 참조); 가교 핵산 ("BNA") (예를 들어, 미국 특허 번호 7,427,672 및 문헌 [Mitsuoka et al. (2009), Nucleic Acids Res., 37(4):1225-38] 참조) 및 비잠금 핵산 ("UNA") (예를 들어, 문헌 [Snead et al. (2013), Molecular Therapy - Nucleic Acids, 2,e103(doi: 10.1038/mtna.2013.36)] 참조)으로 존재하는 것들을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 맥락에서 적합한 변형된 또는 범용 핵염기 또는 변형된 당이 본원에 기재된다.
변형된 뉴클레오티드: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "변형된 뉴클레오티드"는 변형된 또는 범용 핵염기, 변형된 당, 또는 변형된 포스페이트 기 중 하나 이상을 함유하는 뉴클레오티드를 지칭한다. 변형된 또는 범용 핵염기 (또한 본원에서 염기 유사체로서도 지칭됨)는 일반적으로 뉴클레오시드 당 모이어티의 1'-위치에 위치하고, 1'-위치에서의 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 및 우라실 이외의 다른 핵염기를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 변형된 또는 범용 핵염기는 질소함유 염기이다. 특정 실시양태에서, 변형된 핵염기는 질소 원자를 함유하지 않는다. 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 번호 20080274462 참조. 특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 핵염기를 함유하지 않는다 (무염기성). 변형된 당 (또한 본원에서 당 유사체로도 지칭됨)은 변형된 데옥시리보스 또는 리보스 모이어티를 포함하며, 예를 들어, 여기서 변형은 당의 2'-, 3'-, 4'-, 또는 5'-탄소 위치에서 발생한다. 변형된 당은 또한 비-천연 대안적 탄소 구조 예컨대 잠금 핵산 ("LNA") (예를 들어, 문헌 [Koshkin et al. (1998), Tetrahedron, 54,3607-3630] 참조), 가교 핵산 ("BNA") (예를 들어, 미국 특허 번호 7,427,672 및 문헌 [Mitsuoka et al. (2009), Nucleic Acids Res., 37(4):1225-38] 참조) 및 비잠금 핵산 ("UNA") (예를 들어, 문헌 [Snead et al. (2013), Molecular Therapy - Nucleic Acids, 2,e103(doi: 10.1038/mtna.2013.36)] 참조)으로 존재하는 것들을 포함할 수 있다. 변형된 포스페이트 기는 천연 뉴클레오티드에서 발생하지 않는 포스페이트 기의 변형을 지칭하고, 인 원자를 포함하는 포스페이트 모방체 및 포스페이트를 포함하지 않는 음이온성 포스페이트 모방체 (예를 들어 아세테이트)를 포함한, 본원에 기재된 바와 같은 비-천연 발생 포스페이트 모방체를 포함한다. 변형된 포스페이트 기는 또한, 본원에 기재된 바와 같은, 인-함유 뉴클레오티드간 연결기 및 비-인 함유 연결기 둘 다를 포함한, 비-천연 발생 뉴클레오티드간 연결기를 포함한다. 본 개시내용의 맥락에서 적합한 변형된 또는 범용 핵염기, 변형된 당, 또는 변형된 포스페이트가 본원에 기재된다.
네이키드 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "네이키드 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드"는 보호성 지질 나노입자 또는 다른 보호성 제제로 제제화되지 않고 이에 따라 생체내 투여될 때 혈액 및 엔도솜/리소솜 구획에 노출되는, 본원에 기재된 바와 같은 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
천연 뉴클레오시드: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "천연 뉴클레오시드"는 당 (예를 들어, 데옥시리보스 또는 리보스 또는 그의 유사체)과 N-글리코시드 연결 상태의 헤테로시클릭 질소함유 염기를 지칭한다. 천연 헤테로시클릭 질소함유 염기는 아데닌, 구아닌, 시토신, 우라실 및 티민을 포함한다.
천연 뉴클레오티드: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "천연 뉴클레오티드"는 포스페이트 기에 연결되어 있는 당 (예를 들어, 리보스 또는 데옥시리보스 또는 그의 유사체)과 N-글리코시드 연결 상태의 헤테로시클릭 질소함유 염기를 지칭한다. 천연 헤테로시클릭 질소함유 염기는 아데닌, 구아닌, 시토신, 우라실 및 티민을 포함한다.
핵산 억제제 분자: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "핵산 억제제 분자"는 표적 유전자의 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 올리고뉴클레오티드 분자를 지칭하며, 여기서 올리고뉴클레오티드 분자는 표적 유전자 mRNA 내의 서열을 특이적으로 표적화하는 영역을 함유한다. 전형적으로, 핵산 억제제 분자의 표적화 영역은 표적 유전자 mRNA 상의 서열에 충분히 상보적이어서 명시된 표적 유전자에 대한 핵산 억제제 분자의 효과를 지시하는 서열을 포함한다. 핵산 억제제 분자는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 및/또는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
뉴클레오시드: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "뉴클레오시드"는 천연 뉴클레오시드 또는 변형된 뉴클레오시드를 지칭한다.
뉴클레오티드: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "뉴클레오티드"는 천연 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드를 지칭한다.
뉴클레오티드 위치: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "뉴클레오티드 위치"는 5'-말단에서의 뉴클레오티드로부터 카운팅될 때 올리고뉴클레오티드 내 뉴클레오티드의 위치를 지칭한다.
올리고뉴클레오티드: 본원에 사용된 바와 같은, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "올리고뉴클레오티드"는 2 내지 2500개 뉴클레오티드 범위의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 전형적으로, 예를 들어, 500-1500개 뉴클레오티드를 가지며, 여기서 올리고뉴클레오티드는 유전자 요법에서 사용된다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 단일 또는 이중 가닥이고, 7-100개 뉴클레오티드를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 단일 또는 이중 가닥이고, 전형적으로, 예를 들어, 15-50개 뉴클레오티드를 가지며, 여기서 올리고뉴클레오티드는 핵산 억제제 분자이다. 또 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 단일 또는 이중 가닥이고, 전형적으로, 예를 들어, 19-40 또는 19-25개 뉴클레오티드를 가지며, 여기서 올리고뉴클레오티드는 이중-가닥 핵산 억제제 분자이고, 적어도 18-26개 염기 쌍의 듀플렉스를 형성한다. 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥이고, 전형적으로, 예를 들어, 15-25개 뉴클레오티드를 가지며, 여기서 올리고뉴클레오티드 뉴클레오티드는 단일 가닥 RNAi 억제제 분자이다. 전형적으로, 올리고뉴클레오티드는, 본원에 기재된 바와 같은, 하나 이상의 인-함유 뉴클레오티드간 연결기를 함유한다. 다른 실시양태에서, 뉴클레오티드간 연결기는, 본원에 기재된 바와 같은, 비-인 함유 연결이다.
오버행: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "오버행"은 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 어느 한 가닥의 어느 한 단부에서의 말단 비-염기 쌍형성 뉴클레오티드(들)를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 오버행은 제1 가닥 또는 영역이 듀플렉스를 형성하는 상보적 가닥의 말단을 넘어 확장하는 하나의 가닥 또는 영역으로부터 생성된다. 염기 쌍의 수소 결합을 통해 듀플렉스를 형성할 수 있는 2개 올리고뉴클레오티드 영역 중 하나 또는 둘 다는 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 영역에 의해 공유된 상보성의 3'- 및/또는 5'-단부를 넘어 확장하는 5'- 및/또는 3'-단부를 가질 수 있다. 듀플렉스의 3'- 및/또는 5'-단부를 넘어 확장하는 단일-가닥 영역은 오버행으로서 지칭된다.
제약 조성물: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "제약 조성물"은 약리학상 유효량의 즉시 가역적으로-변형된 올리고뉴클레오티드 또는 다른 생물활성제 및 제약상 허용되는 부형제를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "약리학상 유효량" "치료 유효량" 또는 "유효량"은 의도된 약리학적, 치료적 또는 예방적 결과를 생산하는데 효과적인 본 개시내용의 가역적으로 변형된 올리고뉴클레오티드 또는 다른 활성제의 양을 지칭한다.
제약상 허용되는 부형제: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "제약상 허용되는 부형제"는 합리적인 이익/위험 비에 부합하는 과도한 유해 부작용 (예컨대 독성, 자극, 및 알레르기 반응) 없이 인간 및/또는 동물에 사용하기에 적합한 부형제를 의미한다.
포스페이트 모방체: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "포스페이트 모방체"는 포스페이트 기의 정전기 및 입체 특성을 모방하는 화학적 모이어티를 지칭한다. 전형적으로, 포스페이트 유사체는 종종 효소적 제거에 취약한 5'-포스페이트 대신에 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 뉴클레오티드에 위치된다. 일부 실시양태에서, 이들 5'-포스페이트 모방체는 포스파타제-저항성 연결을 함유한다. 적합한 포스페이트 모방체는 5'-포스포네이트, 예컨대 5'-메틸렌포스포네이트 (5'-MP) 및 5'-(E)-비닐포스포네이트 (5'-VP), 및 올리고뉴클레오티드의 5'-말단 뉴클레오티드의 당 모이어티 (예를 들어, 리보스 또는 데옥시리보스 또는 그의 유사체)의 4'-탄소에 결합되어 있는 4'-포스페이트 유사체, 예컨대 4'-옥시메틸포스포네이트, 4'-티오메틸포스포네이트, 또는 4'-아미노메틸포스포네이트 (본원에 전문이 참조로 포함된 미국 가출원 번호 62/393,401에 기재된 바와 같음)를 포함한다. 다른 변형은 올리고뉴클레오티드의 5'-단부에 대해 개발된 바 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,927,513; 문헌 [Prakash et al. Nucleic Acids Res., 2015,43(6):2993-3011]; WO 2011/133871 참조).
포스포르아미다이트: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "포스포르아미다이트"는 질소 함유 3가 인 유도체를 지칭한다. 적합한 포스포르아미다이트의 예가 본원에 기재된다.
효력: 본원에 사용된 바와 같은, "효력"은 세포 내의 의도된 표적에 대해 특정한 수준의 활성을 수득하기 위해 생체내 또는 시험관내 투여되어야 하는 올리고뉴클레오티드 또는 다른 약물의 양을 지칭한다. 예를 들어, 1 mg/kg의 투여량으로 대상체에서 90%만큼 그의 표적의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드는 100 mg/kg의 투여량으로 대상체에서 90%만큼 그의 표적의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드보다 더 큰 효력을 갖는다.
보호기: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "보호기"는 목적하는 반응의 특정 조건 하에 가역적으로 관능기를 비반응성으로 만드는 기로서 통상적인 화학적 의미에서 사용된다. 목적하는 반응 후에, 보호기를 제거하여 보호된 관능기를 탈보호할 수 있다. 모든 보호기는 합성되는 분자의 실질적인 비율을 분해하지 않는 조건 하에 제거가능하여야 한다.
리보뉴클레오티드: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "리보뉴클레오티드"는 당 모이어티의 2'-위치에 히드록실 기를 갖는 천연 또는 변형된 뉴클레오티드를 지칭한다.
리보자임: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "리보자임"은 DNA 또는 RNA일 수 있는 별개의 표적 핵산 서열을 특이적으로 인식하고 절단하는 촉매적 핵산 분자를 지칭한다. 각각의 리보자임은 촉매적 구성성분 (또한 "촉매적 도메인"으로서도 지칭됨) 및 촉매적 도메인의 어느 한측 상에 하나씩 있는 2개의 결합 도메인으로 이루어진 표적 서열-결합 구성성분을 갖는다.
RNAi 억제제 분자: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "RNAi 억제제 분자"는 (a) 센스 가닥 (패신저) 및 안티센스 가닥 (가이드)을 가지며, 여기서 안티센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 부분은 표적 mRNA의 절단에서 아르고노트 2 (Ago2) 엔도뉴클레아제에 의해 사용되는 것인 이중 가닥 핵산 억제제 분자 ("dsRNAi 억제제 분자"), 또는 (b) 단일 안티센스 가닥을 가지며, 여기서 안티센스 가닥 (또는 해당 안티센스 가닥의 부분)은 표적 mRNA의 절단에서 Ago2 엔도뉴클레아제에 의해 사용되는 것인 단일 가닥 핵산 억제제 분자 ("ssRNAi 억제제 분자") 중 어느 하나를 지칭한다.
센스 가닥: 이중 가닥 RNAi 억제제 분자는 2개 올리고뉴클레오티드 가닥을 포함한다: 안티센스 가닥 및 센스 가닥. 센스 가닥 또는 그의 영역은 이중 가닥 RNAi 억제제 분자 또는 그의 영역의 안티센스 가닥에 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보적이다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 또한 안티센스 가닥에 비-상보적인 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 비-상보적 뉴클레오티드는 상보적 서열의 어느 한측 상에 있을 수 있거나, 또는 상보적 서열의 양측 상에 있을 수 있다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥 또는 그의 영역이 안티센스 가닥 또는 그의 영역에 부분적으로 또는 실질적으로 상보적인 경우에, 비-상보적 뉴클레오티드는 상보성의 하나 이상의 영역 (예를 들어, 하나 이상의 미스매치) 사이에 위치할 수 있다. 센스 가닥은 또한 패신저 가닥으로 불린다.
고체 지지체: 본원에 사용된 바와 같은, "고체 지지체"는 화학적 화합물 예컨대 올리고뉴클레오티드가 부착할 수 있는 비-액체 및 비-기체상 물질을 지칭한다. 용어는 겔, 수지, 비드, 플라스틱, 유리, 실리콘, 금속 및 셀룰로스를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 물질을 포괄한다.
스페이서: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "스페이서"는 리간드를 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오시드에 커플링시키는 분자를 지칭한다. 스페이서는 -(CH2)n-, -(CH2)nN-, -(CH2)nO-, -(CH2)nS-, O(CH2CH2O)nCH2CH2OH (예를 들어, n=3 또는 6), 탄수화물, 펩티드, 아미드, 카르복시, 아민, 옥시아민, 옥시이민, 티오에테르, 디술피드, 티오우레아, 술폰아미드, 모르폴리노 또는 비오틴을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
치환기 또는 치환된: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "치환기" 또는 "치환된"은 주어진 구조 내 수소 라디칼의 치환기의 라디칼로의 대체를 지칭한다. 임의의 주어진 구조 내 하나 초과의 위치가 하나 초과의 치환기로 치환될 수 있을 때, 치환기는 달리 나타내지 않는 한 모든 위치에서 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "치환된"은 유기 화합물과 적합성인 모든 허용가능한 치환기를 포함하는 것으로 고려된다. 허용가능한 치환기는 유기 화합물의 비-시클릭 및 시클릭, 분지형 및 비분지형, 카르보시클릭 및 헤테로시클릭, 방향족 및 비방향족 치환기를 포함한다. 본 개시내용은 유기 화합물의 허용가능한 치환기에 의해 임의의 방식으로 제한되는 것으로 의도되지는 않는다.
술포닐 기: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "술포닐 기"는 2가 기, -SO2-를 함유하는 화학적 화합물을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 황 원자는 2개의 탄소 원자 및 2개 산소 원자에 공유적으로 결합된다. 다른 실시양태에서, 황 원자는 탄소 원자, 질소 원자, 및 2개 산소 원자에 공유적으로 결합된다.
전신 투여: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "전신 투여"는 혈류 내 약물의 생체내 전신 흡수 또는 축적에 이어서 전체 신체를 통한 분포를 지칭한다.
표적 부위: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "표적 부위" "표적 서열", "표적 핵산", "표적 영역", "표적 유전자"는 상호교환가능하게 사용되고, 예를 들어, 표적 서열에 부분적으로, 실질적으로, 또는 완전히 또는 충분히 상보적인 그의 가이드/안티센스 영역 내 서열을 함유하는 RNAi 분자에 의해 매개되는 절단에 대해 "표적화되는" RNA 또는 DNA 서열을 지칭한다.
테트라루프: 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "테트라루프"는 인접 왓슨-크릭 혼성화된 뉴클레오티드의 안정성에 기여하는 안정한 이차 구조를 형성하는 루프 (단일 가닥 영역)를 지칭한다. 이론에 한정되지 않으면서, 테트라루프는 스태킹 상호작용에 의해 인접 왓슨-크릭 염기 쌍을 안정화시킬 수 있다. 게다가, 테트라루프 내 뉴클레오티드 중에서의 상호작용은 비-왓슨-크릭 염기 쌍형성, 스태킹 상호작용, 수소 결합, 및 접촉 상호작용을 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (Cheong et al., Nature, 1990,346(6285):680-2; Heus and Pardi, Science, 1991,253(5016):191-4). 테트라루프는 랜덤 염기로 이루어진 단순 모델 루프 서열로부터 예상되는 것보다 더 높은 인접 듀플렉스의 용융 온도 (Tm)에서의 증가를 부여한다. 예를 들어, 테트라루프는 적어도 2개 염기 쌍 길이의 듀플렉스를 포함하는 헤어핀에 10 mM NaHPO4 중 적어도 50℃, 적어도 55℃, 적어도 56℃, 적어도 58℃, 적어도 60℃, 적어도 65℃ 또는 적어도 75℃의 용융 온도를 부여할 수 있다. 테트라루프는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드, 및 그의 조합을 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 테트라루프는 4개 뉴클레오티드로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 테트라루프는 5개 뉴클레오티드로 이루어진다.
RNA 테트라루프의 예는 UNCG 패밀리의 테트라루프 (예를 들어, UUCG), GNRA 패밀리의 테트라루프 (예를 들어, GAAA), 및 CUUG 테트라루프를 포함한다. (Woese et al., PNAS, 1990,87(21):8467-71; Antao et al., Nucleic Acids Res., 1991,19(21):5901-5). DNA 테트라루프의 예는 d(GNNA) 패밀리의 테트라루프 (예를 들어, d(GTTA)), d(GNRA) 패밀리의 테트라루프, d(GNAB) 패밀리의 테트라루프, d(CNNG) 패밀리의 테트라루프, 및 d(TNCG) 패밀리의 테트라루프 (예를 들어, d(TTCG))를 포함한다. (Nakano et al. Biochemistry, 2002,41(48):14281-14292. Shinji et al., Nippon Kagakkai Koen Yokoshu, 2000,78(2):731).
I. 도입부
본 출원은 dsRNAi, 안티센스, miRNA, 및 ssRNAi 작용제와 같은 핵산 억제제 분자를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 관심 올리고뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있는 다양한 새로운 글루타티온-감수성 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드, 뿐만 아니라 표적 유전자의 발현을 조정하고 그를 필요로 하는 환자를 치료하기 위해 글루타티온-감수성 핵산 억제제 분자를 사용하는 방법을 제공한다. 본 출원의 개시내용에 따른 하나 이상의 글루타티온-감수성 모이어티로 가역적으로 변형될 수 있는 다른 올리고뉴클레오티드는 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) 핵산, 유전자 요법을 위한 핵산, DNA 편집을 위한 핵산, 및 프로브를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
가역적으로 변형된 올리고뉴클레오티드는, 전형적으로 당 모이어티의 2'-탄소에, 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 내 하나 이상의 글루타티온-감수성 뉴클레오티드는 혈액 및 세포의 리소솜/엔도솜 구획을 통한 전이 동안에 올리고뉴클레오티드를 안정화시키는 것을 돕고 생체내 투여 동안에 직면한 뉴클레아제 및 다른 환경 조건 (예를 들어, pH)으로부터 올리고뉴클레오티드를 보호한다. 치료적 올리고뉴클레오티드를 보호하기 위해 사용된 비가역적 접근법과는 달리, 본원에 개시된 가역적, 글루타티온-감수성 변형은 세포의 시토졸의 환원 환경에 도달할 때 올리고뉴클레오티드로부터 제거된다. 특정 실시양태에서, 2'-탄소에서의 글루타티온-감수성 모이어티를 제거하는 것은 2'-탄소에 히드록실 기를 남겨두며, 이는 해당 위치에서의 리보뉴클레오티드에 대한 천연 치환기이다. 그 결과, 그들이 세포의 시토졸에 도달할 때, 가역적으로 변형된, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 시토졸에서 제거된 가역적, 글루타티온-감수성 모이어티로부터의 어떠한 간섭 없이 그들의 의도된 생물학적 활성을 수행할 수 있다. 본 출원에 개시된 가역적, 글루타티온-감수성 변형은 세포의 시토졸 내에서 증진된 생물학적 활성을 갖는 안정한 올리고뉴클레오티드를 발생시키기 위해 비가역적 변형 대신에 또는 그와 조합하여 사용될 수 있는 합성 올리고뉴클레오티드에 대한 강력한 새로운 도구를 제공한다.
더욱이, 본원에 개시된 글루타티온-감수성 뉴클레오시드 포스포르아미다이트는 통상적인 고체-상 합성과 적합성이다. 이에 따라, 본 가역적으로 변형된, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 통상적인 포스포르아미다이트 기반 합성 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 이러한 합성 접근법을 사용하면, 글루타티온-감수성 뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드 내로 혼입되는 뉴클레오티드 위치를 선택할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 내 특정한 뉴클레오티드 위치를 변형시키는 것이 바람직할 수 있으므로, 이러한 발견은 특정한 관심 뉴클레오티드 위치에 가역적 변형을 갖는 올리고뉴클레오티드의 합리적 디자인을 용이하게 한다.
본 출원은 또한 치료적 작용제 (예를 들어, 항바이러스제 또는 항암제)로서 사용될 수 있는 글루타티온-감수성 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드를 제공한다.
II. 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드
본 개시내용의 한 측면은 적어도 하나의 글루타티온-감수성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 전형적으로, 글루타티온-감수성 모이어티는 뉴클레오티드의 당 모이어티, 예를 들어 데옥시리보스 또는 리보스 (또는 그의 유사체)에 부착된다. 전형적으로, 글루타티온-감수성 모이어티는 데옥시리보스 또는 리보스 (또는 그의 유사체)의 2'-탄소에 위치한다. 일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는, 특히 변형된 뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드의 5'-말단 뉴클레오티드일 때, 리보스 또는 데옥시리보스 (또는 그의 유사체)의 5'-탄소에 위치한다. 다른 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는, 특히 변형된 뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드의 3'-말단 뉴클레오티드일 때, 리보스 또는 데옥시리보스 (또는 그의 유사체)의 3'-탄소에 위치한다.
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 술포닐 기를 포함한다. 다른 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 디술피드 가교를 포함한다.
특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 당 모이어티 (예를 들어, 리보스)의 2'-탄소에 공유적으로 결합되어 있는 산소 원자에 공유적으로 결합된 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 화학식 II, III, 또는 IV에 의해 나타내어진다. 특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 화학식 IIa, IIIa, IIIb, IIIa(i), IIIb(i), IVa, IVb, IVc, IVd, IVe, IVa(i), IVb(i), IVb(ii), IVc(i), IVd(i), IVe(i), IVe(ii), IVe(iii), IVe(iv), IVe(v), IVe(vi), IVe(vii), IVe(viii), IVe(ix), IVe(x), 또는 IVe(xi)에 의해 나타내어진다.
1. 화학식 I
한 실시양태에서, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 화학식 I에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다:
Figure 112019027874923-pct00003
여기서 X는 O, S, Se 또는 NR'이며, 여기서 R'은 수소, 할로겐, 치환 또는 비치환된 지방족, 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴 또는 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되고;
여기서 R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, OH, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬로부터 선택되거나, 또는 여기서 R1, R2, R3 및 R4 중 2개는 함께 5-8 원 고리를 형성하며, 여기서 고리는 임의로 헤테로원자를 함유하고;
여기서 J는 O, S, NR', CR'R"이며, 여기서 각각의 R' 및 R"은 독립적으로 수소, 할로겐, 치환 또는 비치환된 지방족, 아릴 또는 헤테로아릴로부터 선택되고;
여기서 B는 수소, 천연 핵염기, 변형된 핵염기 또는 범용 핵염기로부터 선택되고;
여기서 U2는 부재하거나, 또는 O, S, NR', 또는 CR'R"으로부터 선택되며, 여기서 R' 및 R"은 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클 또는 치환 또는 비치환된 시클로알킬이고;
여기서 W는 수소, 포스페이트 기, 화학식 I에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기, 할로겐, OR', SR', NR'R", 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클이며, 여기서 R' 및 R"은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 치환 또는 비치환된 지방족, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클로부터 선택되거나, 또는 함께 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
여기서 I는 부재하거나, 또는 O, S, NR', CR'R"으로부터 선택되며, 여기서 R' 및 R"은 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클 및 치환 또는 비치환된 시클로알킬이고;
여기서 U1은 부재하거나, 수소, 화학식 I에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기이거나, 또는 O, S, NR' 또는 CR'R"으로부터 선택되며, 여기서 R' 및 R"은 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클 및 치환 또는 비치환된 시클로알킬이고, 여기서 U1 또는 W 중 적어도 하나는 화학식 I에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기이며, 단 U1이 뉴클레오티드간 연결기인 경우에, A는 부재하고;
여기서 I 및 U1은 조합되어 CR'-CR" 알킬, CR'-CR" 알케닐, CR'-CR" 알키닐, 치환 또는 비치환된 지방족, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클을 형성할 수 있거나, 또는 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클릭 고리를 형성할 수 있고;
여기서 A는 부재하거나, 수소, 포스페이트 기, 포스페이트 모방체 또는 포스포르아미데이트이고;
여기서 L은, 하기 기재된 바와 같은, 화학식 II, III, 또는 IV로부터 선택된 글루타티온-감수성 모이어티이다.
특정 실시양태에서, X는 O이다.
특정 실시양태에서, R1, R2, R3 및 R4는 수소이다.
특정 실시양태에서, J는 O이다.
특정 실시양태에서, B는 천연 핵염기이다.
특정 실시양태에서, U2는 부재하거나, 또는 O이다.
특정 실시양태에서, W는 수소, 포스페이트 기, 화학식 I에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기이다. 전형적으로, W는 화학식 I에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기이다.
특정 실시양태에서, I는 CH2이다.
특정 실시양태에서, U1은 수소, 또는 화학식 I에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기이다. 전형적으로, U1은 화학식 I에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기이고, A는 부재한다.
특정 실시양태에서, A는 부재하거나, 포스페이트 기 또는 포스페이트 모방체이다. 일부 실시양태에서, 포스페이트 기는 모노포스페이트, 디포스페이트 또는 트리포스페이트이다. 일부 실시양태에서, 포스페이트 모방체는 비닐포스포네이트, 5'-메틸렌포스포네이트, 또는 4'-옥시메틸포스페이트이다.
특정 실시양태에서, A는 수소이고, U1은 O이다.
특정 실시양태에서, X는 O이고, R1, R2, R3 및 R4는 수소이고, J는 O이다. 특정 실시양태에서, X는 O이고; R1, R2, R3 및 R4는 수소이고; J는 O이고; B는 천연 핵염기이고; U2는 부재하거나, 또는 O이고; A는 부재하고; I는 CH2이고; W는 수소, 포스페이트 기, 또는 화학식 I에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기이고; U1은 수소, 또는 화학식 I에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기이며, 여기서 U1 또는 W 중 적어도 하나는 화학식 I에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기이다.
특정 실시양태에서, 화학식 I의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 2-2500개 뉴클레오티드를 갖는다. 특정 실시양태에서, 화학식 I의 올리고뉴클레오티드는 500-1500개 뉴클레오티드를 갖는다. 특정 실시양태에서, 화학식 I의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드 7-100개 뉴클레오티드를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 I의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드 15-50개 뉴클레오티드를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 I의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드 19-25개 뉴클레오티드를 갖는다.
특정 실시양태에서, 화학식 I의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드는, 출원 전반에 걸쳐 추가의 세부사항에서 논의된 바와 같은, 핵산 억제제 분자이다. 다른 실시양태에서, 화학식 I의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 CRISPR 핵산, 유전자 요법을 위한 핵산, DNA 편집을 위한 핵산, 프로브, 또는 생체내 투여될 다른 올리고뉴클레오티드를 포함한, 뉴클레아제 및/또는 가혹한 환경 조건 (예를 들어, pH)에 의한 분해에 취약한 임의의 다른 올리고뉴클레오티드이다.
특정 실시양태에서, 핵산 억제제 분자 내 적어도 하나의 뉴클레오티드의 당 모이어티의 고리 구조는 변형되고, 예를 들어, 이전에 논의된 바와 같은, 잠금 핵산 ("LNA") 구조, 가교 핵산 ("BNA") 구조, 및 비잠금 핵산 ("UNA") 구조를 포괄한다.
a. 글루타티온-감수성 모이어티 - 화학식 II
상기 논의된 바와 같은, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 화학식 I에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 글루타티온-감수성 모이어티는 화학식 II, III, 또는 IV로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 하기와 같은 화학식 II에 의해 나타내어진다:
Figure 112019027874923-pct00004
여기서 Y는 O, S, Se, 또는 NR'이며, 여기서 R'은 수소, 할로겐, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되고;
여기서 Z는 O, S, NR', 또는 CR'R"이며, 여기서 R' 및 R"은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, CH3, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되거나, 또는 R' 및 R"은 함께 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
여기서 V는 C 또는 SO이고;
여기서 X2 및 X3은 독립적으로 수소, 할로겐, 니트로, 아미노, 아실, 치환 또는 비치환된 지방족, OR10, COR10, CO2R10, NQ1Q2로부터 선택되며; 여기서 R10은 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환된 지방족, 히드록실 또는 알콕시 치환된 지방족, 아릴지방족, 히드록실 또는 알콕시 치환된 아릴 또는 알콕시 치환된 헤테로시클릭이고;
여기서 P 및 Q는 함께 디술피드 가교 또는 술포닐 기를 형성하고;
여기서 T는 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이거나, 또는 T는 스페이서를 통해 P 또는 Q에 임의로 연결된 리간드이다.
특정 실시양태에서, 상기 디술피드 가교 또는 상기 술포닐 기는 적어도 약 7.5의 pH에서 글루타티온에 의해 시토졸에서 절단가능하다.
일부 실시양태에서, Y는 O, S 또는 NH이다. 전형적으로, Y는 O이다.
일부 실시양태에서, Z는 O, S 또는 NR'이다. 전형적으로, Z는 NH이다.
일부 실시양태에서, V는 SO이다. 전형적으로, V는 C이다.
일부 실시양태에서, X2 및 X3은 독립적으로 수소, 할로겐, 니트로, 아미노 또는 아실, 또는 C3 내지 C6 분지형 또는 비분지형 알킬로부터 선택된다. 전형적으로, X2 및 X3은 독립적으로 수소, 할로겐, 니트로 또는 아미노로부터 선택된다.
전형적으로, P 및 Q는 함께 디술피드 결합을 형성한다.
일부 실시양태에서, T는 C3 내지 C6 분지형 또는 비분지형 알킬이거나, 또는 T는 스페이서를 통해 P 또는 Q에 임의로 연결된 리간드이다. 전형적으로, T는 C4 분지형 알킬이다.
특정 실시양태에서, 화학식 II의 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오티드는 2-2500개 뉴클레오티드를 갖는다. 특정 실시양태에서, 화학식 II의 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오티드는 500-1500개 뉴클레오티드를 갖는다. 특정 실시양태에서, 화학식 II의 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오티드는 7-100개 뉴클레오티드를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 II의 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오티드는 15-50개 뉴클레오티드를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 II의 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오티드는 19-25개 뉴클레오티드를 갖는다.
특정 실시양태에서, 화학식 II의 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오티드는, 출원 전반에 걸쳐 추가의 세부사항에서 논의된 바와 같은, 핵산 억제제 분자이다. 다른 실시양태에서, 화학식 II의 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오티드는 CRISPR 핵산, 유전자 요법을 위한 핵산, DNA 편집을 위한 핵산, 프로브, 또는 생체내 투여될 다른 올리고뉴클레오티드를 포함한, 뉴클레아제 및/또는 가혹한 환경 조건 (예를 들어, pH)에 의한 분해에 취약한 임의의 다른 올리고뉴클레오티드이다.
i. 화학식 IIa
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 하기 화학식에 의해 나타내어진다:
Figure 112019027874923-pct00005
b. 글루타티온-감수성 모이어티 - 화학식 III
화학식 I에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하는 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드의 다른 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 하기와 같은 화학식 III에 의해 나타내어진다:
Figure 112019027874923-pct00006
여기서 Y는 O, S, Se, 또는 NR'이며, 여기서 R'은 수소, 할로겐, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되고;
여기서 Z1은 N 또는 CR'이며, 여기서 R'은 수소, 할로겐, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되고;
여기서 V는 C 또는 SO이고;
여기서 M1 및 M2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 방향족, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 시클로알킬로부터 선택되고;
여기서 P1 및 Q1은 함께 디술피드 가교 또는 술포닐 기를 형성하거나, 또는 여기서 P1 및 Q1은 각각 독립적으로 디술피드 가교 또는 술포닐 기이고;
여기서 P1 및 Q1이 디술피드 가교를 형성할 때, M1, M2, P1, 및 Q1은 4-9 원 고리를 형성할 수 있으며, 여기서 고리는 치환 또는 비치환된 방향족, 치환 또는 비치환된 시클로알킬이며, 여기서 방향족 또는 시클로알킬 고리는 임의로 헤테로원자를 함유할 수 있고;
여기서 Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 부재하거나, 또는 CH3, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클 또는 임의의 스페이서를 통해 P1 또는 Q1에 임의로 연결된 리간드로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, M1, M2, P1, 및 Q1은 함께 알콕시 치환된 아릴지방족, 알콕시 치환된 헤테로아릴 또는 알콕시 치환된 헤테로시클릭을 함유하는 5-8 원 고리를 형성한다.
일부 실시양태에서, Y는 O, S 또는 NH이다. 전형적으로, Y는 O이다.
일부 실시양태에서, Z1은 N 또는 CH이다. 전형적으로, Z1은 N이다.
일부 실시양태에서, V는 SO이다. 전형적으로, V는 C이다.
일부 실시양태에서, M1 및 M2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 지방족으로부터 선택되거나; 또는 M1, M2, P1, 및 Q1은 함께 4-9 원 고리를 형성하며, 여기서 고리는 치환 또는 비치환된 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클이다. 전형적으로, M1 및 M2는 치환 또는 비치환된 C2 내지 C6 알킬이거나, 또는 P1 및 Q1과 함께 5-8 원 고리를 형성하며, 여기서 고리는 치환 또는 비치환된 시클로알킬이다.
일부 실시양태에서, P1 및 Q1은 함께 디술피드 가교 또는 술포닐 기를 형성한다. 전형적으로, P1 및 Q1은 함께 디술피드 가교를 형성한다. 일부 실시양태에서, 디술피드 가교 또는 술포닐 기는 적어도 약 7.5의 pH에서 글루타티온에 의해 시토졸에서 절단가능하다.
일부 실시양태에서, Ta 및 Tb는 부재하거나, 또는 각각 독립적으로 부재하거나, 또는 CH3, 분지형 또는 비분지형 C3 내지 C6 알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클 또는 임의의 스페이서를 통해 P1 또는 Q1에 임의로 연결된 리간드로부터 선택된다. 전형적으로, Ta 및 Tb는 부재하거나, 분지형 C3 내지 C6 알킬 또는 임의의 스페이서를 통해 P1 또는 Q1에 연결된 리간드이다.
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 화학식 III에 의해 나타내어지며, 여기서 Y는 O, S 또는 NH이고; Z1은 N이고; V는 C이고; M1 및 M2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 방향족, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택되거나; 또는 M1, M2, P1, 및 Q1은 함께 4-9 원 고리를 형성하며, 여기서 고리는 치환 또는 비치환된 방향족, 치환 또는 비치환된 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이고; P1 및 Q1은 함께 디술피드 가교를 형성하고; Ta 및 Tb는 부재하거나, 또는 임의의 스페이서를 통해 P1 또는 Q1에 임의로 연결된 리간드이다.
전형적으로, 글루타티온-감수성 모이어티는 화학식 III에 의해 나타내어지며, 여기서 Y는 O, S 또는 NH이고; Z1은 N이고; V는 C이고; M1, M2, P1, 및 Q1은 함께 5-8 원 고리를 형성하며, 여기서 고리는 치환 또는 비치환된 방향족 고리 또는 치환 또는 비치환된 시클로알킬이며, 여기서 방향족 고리 또는 시클로알킬은 임의로 임의의 헤테로원자를 함유할 수 있고; P1 및 Q1은 함께 디술피드 가교를 형성하고; Ta 및 Tb는 부재하거나, 또는 임의의 스페이서를 통해 P1 또는 Q1에 임의로 연결된 리간드이다.
보다 전형적으로, 글루타티온-감수성 모이어티는 화학식 III에 의해 나타내어지며, 여기서 Y는 O, S 또는 NH이고; Z1은 N이고; V는 C이고; M1, M2, P1, 및 Q1은 함께 7 원 고리를 형성하며, 여기서 고리는 치환 또는 비치환된 시클로알킬이고; P1 및 Q1은 함께 디술피드 가교를 형성하고; Ta 및 Tb는 부재한다.
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 화학식 III에 의해 나타내어지며, 여기서 Y는 O, S 또는 NH이고; Z1은 N이고; V는 C이고; M1 및 M2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 방향족, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택되고; P1 및 Q1은 각각 독립적으로 디술피드 가교이고; Ta 및 Tb는 CH3, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클 또는 임의의 스페이서를 통해 P1 또는 Q1에 임의로 연결된 리간드로부터 선택된다.
보다 전형적으로, 글루타티온-감수성 모이어티는 화학식 III에 의해 나타내어지며, 여기서 Y는 O, S 또는 NH이고; Z1은 N이고; V는 C이고; M1 및 M2는 치환 또는 비치환된 지방족이고; P1 및 Q1은 각각 독립적으로 디술피드 가교이고; Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 CH3, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클 또는 임의의 스페이서를 통해 P1 또는 Q1에 임의로 연결된 리간드로부터 선택된다.
또한 보다 더 전형적으로, 글루타티온-감수성 모이어티는 화학식 III에 의해 나타내어지며, 여기서 Y는 O, S 또는 NH이고; Z1은 N이고; V는 C이고; M1 및 M2는 치환 또는 비치환된 지방족이고; P1 및 Q1은 각각 독립적으로 디술피드 가교이고; Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 부재하거나, 또는 CH3, 분지형 또는 비분지형 C3 내지 C6 알킬, 또는 임의의 스페이서를 통해 P1 또는 Q1에 임의로 연결된 리간드로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 화학식 III의 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오티드는 2-2500개 뉴클레오티드를 갖는다. 특정 실시양태에서, 화학식 III의 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오티드는 500-1500개 뉴클레오티드를 갖는다. 특정 실시양태에서, 화학식 III의 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오티드는 7-100개 뉴클레오티드를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 III의 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오티드는 15-50개 뉴클레오티드를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 III의 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오티드는 19-25개 뉴클레오티드를 갖는다.
특정 실시양태에서, 화학식 III의 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오티드는, 출원 전반에 걸쳐 추가의 세부사항에서 논의된 바와 같은, 핵산 억제제 분자이다. 다른 실시양태에서, 화학식 III의 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오티드는 CRISPR 핵산, 유전자 요법을 위한 핵산, DNA 편집을 위한 핵산, 프로브, 또는 생체내 투여될 다른 올리고뉴클레오티드를 포함한, 뉴클레아제 및/또는 가혹한 환경 조건 (예를 들어, pH)에 의한 분해에 취약한 임의의 다른 올리고뉴클레오티드이다.
i. 화학식 IIIa
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 하기 화학식에 의해 나타내어진다:
Figure 112019027874923-pct00007
여기서 Y는 O, S 또는 NH이고; Z1은 N 또는 CR'이며, 여기서 R'은 수소, 할로겐, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택된다.
보다 전형적으로, 글루타티온-감수성 모이어티는 하기 화학식에 의해 나타내어진다:
Figure 112019027874923-pct00008
ii. 화학식 IIIb
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 하기 화학식에 의해 나타내어진다:
Figure 112019027874923-pct00009
여기서 Y는 O, S 또는 NH이고; Z1은 N 또는 CR'이며, 여기서 R'은 수소, 할로겐, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되고; Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 부재하거나, 또는 CH3, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클 또는 임의의 스페이서를 통해 황 원자에 임의로 연결된 리간드로부터 선택된다.
보다 전형적으로, 글루타티온-감수성 모이어티는 하기 화학식에 의해 나타내어진다:
Figure 112019027874923-pct00010
c. 글루타티온-감수성 모이어티 - 화학식 IV
화학식 I에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하는 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드의 또 다른 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 하기와 같은 화학식 IV에 의해 나타내어진다:
Figure 112019027874923-pct00011
여기서 Y는 O, S, Se, 또는 NR'이며, 여기서 R'은 수소, 할로겐, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되고;
여기서 Z는 O, S, NR', 또는 CR'R"으로부터 선택되며, 여기서 R' 및 R"은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, CH3, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되거나, 또는 R' 및 R"은 함께 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
여기서 V는 C 또는 SO이고;
여기서 G 및 E는 각각 독립적으로 부재하거나, 또는 CH2, CHR', CR'R", NH, 또는 NR'으로부터 선택될 수 있으며, 여기서 R' 및 R"은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되거나, 또는 R' 및 R"은 함께 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
여기서 M3 및 M4는 함께 4-9 원 고리를 형성할 수 있으며, 여기서 고리는 치환 또는 비치환된 방향족, 치환 또는 비치환된 시클로알킬일 수 있으며, 여기서 방향족 또는 시클로알킬 고리는 임의로 헤테로원자를 함유할 수 있거나, 또는 M3 및 M4는 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 방향족, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 시클로알킬 또는 COOR로부터 선택되며, 여기서 R은 수소, CH3, 또는 치환 또는 비치환된 지방족으로부터 선택되고;
여기서 K는 C, CH, 또는 치환 또는 비치환된 지방족이고;
여기서 n은 0 - 5이고;
여기서 P 및 Q는 함께 디술피드 가교 또는 술포닐 기를 형성하고;
여기서 T는 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이거나, 또는 T는 임의의 스페이서를 통해 P 또는 Q에 임의로 연결된 리간드일 수 있다.
일부 실시양태에서, Y는 O, S 또는 NH이다. 전형적으로, Y는 O이다.
일부 실시양태에서, Z는 O, S, NH, NR' 또는 CR'R"이며, 여기서 R' 및 R"은 각각 독립적으로 수소, CH3, 또는 치환 또는 비치환된 지방족으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, Z는 NH 또는 N-CH3이다.
일부 실시양태에서, V는 SO이다. 전형적으로, V는 C이다.
일부 실시양태에서, M3 및 M4는 각각 독립적으로 수소 또는 치환 또는 비치환된 지방족, 예컨대 C2 내지 C6 알킬로부터 선택되거나; 또는 M3 및 M4는 함께 4-9 원 고리를 형성하며, 여기서 고리는 치환 또는 비치환된 시클로알킬 또는 치환 또는 비치환된 헤테로사이클이다. 전형적으로, M3 및 M4는 독립적으로 치환 또는 비치환된 C2 내지 C6 알킬이거나, 또는 함께 5-8 원 고리를 형성하며, 여기서 고리는 치환 또는 비치환된 시클로알킬이다.
일부 실시양태에서, G는 부재하거나, CH2, 또는 CHR'이며, 여기서 R'은 치환 또는 비치환된 지방족이다. 전형적으로, G는 부재하거나, 또는 CH2이다.
일부 실시양태에서, E는 부재하거나, NH, NR', CH2, 또는 CHR'이며, 여기서 R'은 치환 또는 비치환된 지방족이다. 전형적으로, E는 부재하거나, NH, 또는 CH2이다.
일부 실시양태에서, G 및 E는 부재한다.
일부 실시양태에서, K는 C, 또는 CH이다. 전형적으로, K는 CH이다.
일부 실시양태에서, n은 0이다.
일부 실시양태에서, P 및 Q는 함께 디술피드 가교 또는 술포닐 기를 형성한다. 전형적으로, P 및 Q는 함께 디술피드 가교를 형성한다. 일부 실시양태에서, 디술피드 가교 또는 술포닐 기는 적어도 약 7.5의 pH에서 글루타티온에 의해 시토졸에서 절단가능하다.
일부 실시양태에서, T는 치환 또는 비치환된 C2-C6 알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이거나, 또는 T는 임의의 스페이서를 통해 P 또는 Q에 임의로 연결된 리간드이다. 전형적으로, T는 치환 또는 비치환된 C2-C6 알킬 또는 임의의 스페이서를 통해 P 또는 Q에 임의로 연결된 리간드이다.
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 화학식 IV에 의해 나타내어지며, 여기서 Y는 O, S, NH이고; 여기서 Z는 O, S, NH, 또는 NCH3이고; V는 C이고; G는 CH2이고 E는 부재하거나, 또는 G는 부재하고 E는 CH2이고; M3 및 M4는 함께 5-8 원 고리를 형성하며, 여기서 고리는 헤테로원자로 치환된 시클로알킬 또는 비치환된 시클로알킬이거나, 또는 M3 및 M4는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C2 내지 C6 알킬이고; K는 CH이고; n은 0이고; P 및 Q는 함께 디술피드 가교를 형성하고; T는 CH3, 치환 또는 비치환된 C2 내지 C6 알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이거나, 또는 T는 임의의 스페이서를 통해 P 또는 Q에 임의로 연결된 리간드이다.
특정 실시양태에서, 화학식 IV의 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오티드는 2-2500개 뉴클레오티드를 갖는다. 특정 실시양태에서, 화학식 IV의 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오티드는 500-1500개 뉴클레오티드를 갖는다. 특정 실시양태에서, 화학식 IV의 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오티드는 7-100개 뉴클레오티드를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 IV의 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오티드는 15-50개 뉴클레오티드를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 IV의 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오티드는 19-25개 뉴클레오티드를 갖는다.
특정 실시양태에서, 화학식 IV의 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오티드는, 출원 전반에 걸쳐 추가의 세부사항에서 논의된 바와 같은, 핵산 억제제 분자이다. 다른 실시양태에서, 화학식 IV의 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오티드는 CRISPR 핵산, 유전자 요법을 위한 핵산, DNA 편집을 위한 핵산, 프로브, 또는 생체내 투여될 다른 올리고뉴클레오티드를 포함한, 뉴클레아제 및/또는 가혹한 환경 조건 (예를 들어, pH)에 의한 분해에 취약한 임의의 다른 올리고뉴클레오티드이다.
i. 화학식 IVa
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 하기 화학식에 의해 나타내어질 수 있다:
Figure 112019027874923-pct00012
여기서 Y는 O, S, NH이고; 여기서 Z는 O, S 또는 NH이고, 여기서 R5, R6, 및 R7은 각각 독립적으로 O아실, NHR', NR', 또는 CR'R"으로부터 선택되며, 여기서 R' 및 R"은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 치환된 지방족 또는 비치환된 지방족, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릭으로부터 선택되거나, 또는 함께 헤테로시클릭 고리를 형성할 수 있고;
여기서 T는 분지형 또는 비분지형 C2-C6 알킬 또는 임의의 스페이서를 통해 황 원자에 임의로 연결된 리간드이다.
예를 들어, 글루타티온-감수성 모이어티는 하기 화학식에 의해 나타내어질 수 있다:
Figure 112019027874923-pct00013
ii. 화학식 IVb
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 하기 화학식에 의해 나타내어질 수 있다:
Figure 112019027874923-pct00014
여기서 Y는 O, S, NH이고; Z는 O, S 또는 NH이고; V는 C이고; M3 및 M4는 수소이고; K는 CH 또는 치환 또는 비치환된 지방족이고; E는 NH 또는 NR'이며, 여기서 R'은 치환 또는 비치환된 지방족이고; n은 0-5이고; T는 치환 또는 비치환된 C2 내지 C6 알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이거나, 또는 T는 임의의 스페이서를 통해 임의로 연결된 리간드이다.
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 화학식 IVb에 의해 나타내어지며, 여기서 Y는 O이고, Z는 NH이고; V는 C이고; M3 및 M4는 수소이고; K는 CH이고; E는 NH이고; n은 1이고; P 및 Q는 함께 술포닐 기를 형성하고; T는 치환된 아릴이다.
예를 들어, 글루타티온-감수성 모이어티는 하기 화학식에 의해 나타내어질 수 있다:
Figure 112019027874923-pct00015
여기서 R은 수소, CH3, NO2, 치환 또는 비치환된 지방족, 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬 또는 헤테로사이클로부터 선택되거나, 또는 R은 임의의 스페이서를 통해 임의로 연결된 표적화 리간드이다.
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 화학식 IVb에 의해 나타내어지며, 여기서 Y는 O이고, Z는 NH이고; V는 C이고; M3 및 M4는 수소이고; K는 CH이고; E는 NH이고; n은 0이고; P 및 Q는 함께 술포닐 기를 형성하고; T는 치환된 아릴이다.
예를 들어, 글루타티온-감수성 모이어티는 하기 화학식에 의해 나타내어질 수 있다:
Figure 112019027874923-pct00016
여기서 R은 수소, CH3, NO2, 치환 또는 비치환된 지방족, 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬 또는 헤테로사이클로부터 선택되거나, 또는 R은 임의의 스페이서를 통해 임의로 연결된 표적화 리간드이다. 특정 실시양태에서, R은 수소이다.
iii. 화학식 IVc
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 화학식 IV에 의해 나타내어지며, 여기서 Y는 O, S, NH이고; Z는 O, S, 또는 NR'이며, 여기서 R'은 수소, 할로겐, CH3, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되고; G 및 E는 부재하고; V는 C이고; M3 및 M4는 함께 5-8 원 고리를 형성하며, 여기서 고리는 헤테로원자로 임의로 치환되는, 치환 또는 비치환된 시클로알킬이고; K는 CH이고; n은 0-5이고; P 및 Q는 함께 디술피드 가교를 형성하고; T는 치환 또는 비치환된 C2 내지 C6 알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이거나, 또는 T는 임의의 스페이서를 통해 임의로 연결된 리간드이다. 전형적으로, Y는 O이고, Z는 NH 또는 NCH3이다.
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 하기 화학식에 의해 나타내어진다:
Figure 112019027874923-pct00017
여기서 Y는 O, S, NH이고; Z는 O, S, 또는 NR'으로부터 선택되며, 여기서 R'은 수소, 할로겐, CH3, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되고; V는 C이고; M3 및 M4는 함께 5-8 원 고리를 형성하며, 여기서 고리는 헤테로원자로 임의로 치환되는, 치환 또는 비치환된 시클로알킬이고; K는 분지형 또는 비분지형 치환 또는 비치환된 C2 내지 C6 알킬이고; n은 0 또는 1이고; T는 치환 또는 비치환된 C2 내지 C6 알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이거나, 또는 T는 임의의 스페이서를 통해 임의로 연결된 리간드이고; 여기서 R은 수소, CH3, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 시클로알킬, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되거나, 또는 R은 임의의 스페이서를 통해 임의로 연결된 표적화 리간드이다. 전형적으로, Y는 O이고, Z는 NH 또는 NCH3이다.
예를 들어, 글루타티온-감수성 모이어티는 하기 화학식에 의해 나타내어질 수 있다:
Figure 112019027874923-pct00018
여기서 R은 수소, CH3, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 시클로알킬, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되거나, 또는 R은 임의의 스페이서를 통해 임의로 연결된 표적화 리간드이다.
iv. 화학식 IVd
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 화학식 IV에 의해 나타내어지며, 여기서 Y는 O, S, NH이고; 여기서 Z는 O, S, 또는 NR'으로부터 선택되며, 여기서 R'은 수소, 할로겐, CH3, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되고; V는 C이고; G 및 E는 부재하고; M3은 COOR이며, 여기서 R은 수소, CH3, 또는 치환 또는 비치환된 C2 내지 C6 알킬로부터 선택되고; M4는 수소이고; K는 CH이고; n은 0이고; P 및 Q는 함께 디술피드 가교를 형성하고; T는 치환 또는 비치환된 C2 내지 C6 알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이거나, 또는 T는 임의의 스페이서를 통해 P 또는 Q에 임의로 연결된 리간드이다. 전형적으로, Y는 O이고, Z는 NH 또는 NCH3이다.
한 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 하기 화학식에 의해 나타내어진다:
Figure 112019027874923-pct00019
여기서 Y는 O, S, NH이고; Z는 O, S, NH, 또는 NCH3이고; T는 치환 또는 비치환된 C2 내지 C6 알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이거나, 또는 T는 임의의 스페이서를 통해 임의로 연결된 리간드이고; R은 수소, CH3, 또는 치환 또는 비치환된 C2 내지 C6 알킬로부터 선택된다.
예를 들어, 글루타티온-감수성 모이어티는 하기 화학식에 의해 나타내어질 수 있다:
Figure 112019027874923-pct00020
v. 화학식 IVe
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 화학식 IV에 의해 나타내어지며, 여기서 Y는 O, S, NH이고; Z는 O, S, 또는 NR'으로부터 선택되며, 여기서 R'은 수소, 할로겐, CH3, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되고; V는 C 또는 SO이고; n은 0이고; M3 및 M4는 함께 4-9 원 고리를 형성하며, 여기서 고리는 치환 또는 비치환된 아릴이고; K는 C, CH, N, NH, 또는 분지형 또는 비분지형 치환 또는 비치환된 C2 내지 C6 알킬이고; T는 치환 또는 비치환된 C2 내지 C6 알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이거나, 또는 T는 임의의 스페이서를 통해 임의로 연결된 리간드이다. 전형적으로, Y는 O이고, Z는 NH 또는 NCH3이다.
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 하기 화학식에 의해 나타내어진다:
Figure 112019027874923-pct00021
여기서 Y는 O, S, NH이고; Z는 O, S, 또는 NR'으로부터 선택되며, 여기서 R'은 수소, 할로겐, CH3, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되고; V는 C 또는 SO이고; G 및 E는 각각 독립적으로 부재하거나, 또는 CH2, CHR', CR'R", NH, NR'으로부터 선택될 수 있으며, 여기서 R' 및 R"은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되거나, 또는 R' 및 R"은 함께 헤테로시클릭 고리를 형성하고; K는 C 또는 CH이고; n은 0-5이고; T는 치환 또는 비치환된 C2 내지 C6 알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이거나, 또는 T는 임의의 스페이서를 통해 임의로 연결된 리간드이고; 여기서 R은 수소, CH3, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 시클로알킬, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되거나, 또는 R은 임의의 스페이서를 통해 임의로 연결된 표적화 리간드이다.
특정 실시양태에서, Z는 NR'이며, 여기서 R'은 수소, CH3, 또는 치환 또는 비치환된 지방족이다. 전형적으로, Z는 NH 또는 NCH3이다. 특정 실시양태에서, Z는 S이다.
특정 실시양태에서, Y는 O, S, 또는 NH이고, V는 C이다. 한 실시양태에서, V는 SO이고, Y는 O이다.
특정 실시양태에서, G 및 E 중 하나 또는 둘 다는 부재하거나, CH2, 또는 CR'R"이며, 여기서 R' 및 R"은 독립적으로 수소 또는 치환 또는 비치환된 지방족으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, G 및 E 둘 다는 부재하거나, 또는 G는 CH2이고 E는 부재하거나, 또는 G는 부재하고 E는 CH2 또는 분지형 알킬이다.
예를 들어, 글루타티온-감수성 모이어티는 하기 화학식 중 하나에 의해 나타내어질 수 있다:
Figure 112019027874923-pct00022
Figure 112019027874923-pct00023
Figure 112019027874923-pct00024
Figure 112019027874923-pct00025
여기서 R은 수소, CH3, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 시클로알킬, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되거나, 또는 R은 임의의 스페이서를 통해 임의로 연결된 표적화 리간드이다.
2. 화학식 V (화학식 II 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오티드)
다른 실시양태에서, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 하기와 같은 화학식 V에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다:
Figure 112019027874923-pct00026
여기서 A, U1, I, B, W, 및 U2는 화학식 I에 기재된 바와 같고;
여기서 Y, V, Z, X2, X3, P, Q 및 T는 화학식 II에 기재된 바와 같다.
특정 실시양태에서, U1은 부재하거나, 산소, 또는 화학식 V에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기, 또는 수소이고; U2는 부재하거나, 또는 O이고; W는 수소, 포스페이트 기, 또는 화학식 V에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기이며, 단 U1 또는 W 중 적어도 하나는 화학식 V에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기이며, 단 U1이 뉴클레오티드간 연결기인 경우에, A는 부재한다.
특정 실시양태에서, I는 CH2이다. 특정 실시양태에서, B는 천연 핵염기이다. 특정 실시양태에서, I는 CH2이고, B는 천연 핵염기이다.
특정 실시양태에서, A는 수소, 포스페이트 기 또는 포스페이트 모방체이다. 특정 실시양태에서, A는 수소이고, U1은 산소이다. 특정 실시양태에서, A는 수소이고, U1은 산소이고, I는 CH2이다.
a. 화학식 Va
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다:
Figure 112019027874923-pct00027
여기서 A, U1, U2, I, W, 및 B는 화학식 V에 대해 상기 기재된 바와 같다.
특정 실시양태에서, 화학식 V의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 2-2500개 뉴클레오티드를 갖는다. 특정 실시양태에서, 화학식 V의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 500-1500개 뉴클레오티드를 갖는다. 특정 실시양태에서, 화학식 V의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 7-100개 뉴클레오티드를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 V의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 15-50개 뉴클레오티드를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 V의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 19-25개 뉴클레오티드를 갖는다.
특정 실시양태에서, 화학식 V의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드는, 출원 전반에 걸쳐 추가의 세부사항에서 논의된 바와 같은, 핵산 억제제 분자이다. 다른 실시양태에서, 화학식 V의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 CRISPR 핵산, 유전자 요법을 위한 핵산, DNA 편집을 위한 핵산, 프로브, 또는 생체내 투여될 다른 올리고뉴클레오티드를 포함한, 뉴클레아제 및/또는 가혹한 환경 조건 (예를 들어, pH)에 의한 분해에 취약한 임의의 다른 올리고뉴클레오티드이다.
3. 화학식 VI (화학식 III 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오티드)
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 하기와 같은 화학식 VI에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다:
Figure 112019027874923-pct00028
여기서 A, U1, I, B, W, 및 U2는 화학식 I에 기재된 바와 같고;
여기서 Y, V, Z1, M1, M2, P1, Q1, Ta 및 Tb는 화학식 III에 기재된 바와 같다.
특정 실시양태에서, U1은 부재하거나, 산소, 또는 화학식 VI에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기, 또는 수소이고; U2는 부재하거나, 또는 O이고; W는 수소, 포스페이트 기, 또는 화학식 VI에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기이며, 단 U1 또는 W 중 적어도 하나는 화학식 VI에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기이며, 단 U1이 뉴클레오티드간 연결기인 경우에, A는 부재한다.
특정 실시양태에서, I는 CH2이다. 특정 실시양태에서, B는 천연 핵염기이다. 특정 실시양태에서, I는 CH2이고, B는 천연 핵염기이다.
특정 실시양태에서, A는 수소, 포스페이트 기 또는 포스페이트 모방체이다. 특정 실시양태에서, A는 수소이고, U1은 산소이다. 특정 실시양태에서, A는 수소이고, U1은 산소이고, I는 CH2이다.
특정 실시양태에서, 화학식 VI의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 2-2500개 뉴클레오티드를 갖는다. 특정 실시양태에서, 화학식 VI의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 500-1500개 뉴클레오티드를 갖는다. 특정 실시양태에서, 화학식 VI의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 7-100개 뉴클레오티드를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 VI의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 15-50개 뉴클레오티드를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 VI의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 19-25개 뉴클레오티드를 갖는다.
특정 실시양태에서, 화학식 VI의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드는, 출원 전반에 걸쳐 추가의 세부사항에서 논의된 바와 같은, 핵산 억제제 분자이다. 다른 실시양태에서, 화학식 VI의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 CRISPR 핵산, 유전자 요법을 위한 핵산, DNA 편집을 위한 핵산, 프로브, 또는 생체내 투여될 다른 올리고뉴클레오티드를 포함한, 뉴클레아제 및/또는 가혹한 환경 조건 (예를 들어, pH)에 의한 분해에 취약한 임의의 다른 올리고뉴클레오티드이다.
a. 화학식 VIa
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다:
Figure 112019027874923-pct00029
여기서 A, U1, U2, W, I 및 B는 화학식 VI에 대해 상기 기재된 바와 같고, Y 및 Z1은 화학식 IIIa에 대해 상기 기재된 바와 같다.
보다 전형적으로, 본 발명의 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다:
Figure 112019027874923-pct00030
여기서 A, U1, U2, W, 및 B는 화학식 VI에 대해 상기 기재된 바와 같다.
b. 화학식 VIb
일부 실시양태에서, 본 발명의 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다:
Figure 112019027874923-pct00031
여기서 A, U1, U2, W, I, 및 B는 화학식 VI에 대해 상기 기재된 바와 같고, 여기서 Y, Z1 및 Ta 및 Tb는 화학식 IIIb에 대해 상기 기재된 바와 같다.
보다 전형적으로, 본 발명의 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다:
Figure 112019027874923-pct00032
여기서 A, U1, U2, W, 및 B는 화학식 VI에 대해 상기 기재된 바와 같다.
4. 화학식 VII (화학식 IV 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오티드)
일부 실시양태에서, 본 발명의 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 하기와 같은 화학식 VII에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다:
Figure 112019027874923-pct00033
여기서 A, U1, I, B, W, 및 U2는 화학식 I에 기재된 바와 같고;
여기서 Y, Z, V, K, G, E, n, M3, M4, P, Q, 및 T는 화학식 IV에 상기 기재된 바와 같다.
특정 실시양태에서, U1은 부재하거나, 산소, 또는 화학식 VII에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기, 또는 수소이고; U2는 부재하거나, 또는 O이고; W는 수소, 포스페이트 기, 또는 화학식 VII에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기이며, 단 U1 또는 W 중 적어도 하나는 화학식 VII에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기이며, 단 U1이 뉴클레오티드간 연결기인 경우에, A는 부재한다.
특정 실시양태에서, I는 CH2이다. 특정 실시양태에서, B는 천연 핵염기이다. 특정 실시양태에서, I는 CH2이고, B는 천연 핵염기이다.
특정 실시양태에서, A는 수소, 포스페이트 기 또는 포스페이트 모방체이다. 특정 실시양태에서, A는 수소이고, U1은 산소이다. 특정 실시양태에서, A는 수소이고, U1은 산소이고, I는 CH2이다.
특정 실시양태에서, 화학식 VII의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 2-2500개 뉴클레오티드를 갖는다. 특정 실시양태에서, 화학식 VII의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 500-1500개 뉴클레오티드를 갖는다. 특정 실시양태에서, 화학식 VII의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 7-100개 뉴클레오티드를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 VII의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 15-50개 뉴클레오티드를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 VII의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 19-25개 뉴클레오티드를 갖는다.
특정 실시양태에서, 화학식 VII의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드는, 출원 전반에 걸쳐 추가의 세부사항에서 논의된 바와 같은, 핵산 억제제 분자이다. 다른 실시양태에서, 화학식 VII의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 CRISPR 핵산, 유전자 요법을 위한 핵산, DNA 편집을 위한 핵산, 프로브, 또는 생체내 투여될 다른 올리고뉴클레오티드를 포함한, 뉴클레아제 및/또는 가혹한 환경 조건 (예를 들어, pH)에 의한 분해에 취약한 임의의 다른 올리고뉴클레오티드이다.
a. 화학식 VIIa
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 변형된 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다:
Figure 112019027874923-pct00034
여기서 A, U1, U2, W, I 및 B는 화학식 VII에 대해 상기 기재된 바와 같고; 여기서 Y, Z, R5, R6, 및 R7, 및 T는 화학식 IVa에 상기 기재된 바와 같다. 특정 실시양태에서, B는 천연 핵염기이다.
보다 전형적으로, 본 발명의 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다:
Figure 112019027874923-pct00035
여기서 A, U1, U2, W, 및 B는 화학식 VII에 대해 상기 기재된 바와 같다.
b. 화학식 VIIb
일부 실시양태에서, 본 발명의 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다:
Figure 112019027874923-pct00036
여기서 A, U1, U2, W, I, 및 B는 화학식 VII에 대해 상기 기재된 바와 같고; 여기서 Y, V, Z, K, E, M3, M4, n 및 T는 화학식 IVb에 대해 상기 기재된 바와 같다. 특정 실시양태에서, B는 천연 핵염기이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다:
Figure 112019027874923-pct00037
여기서 A, U1, U2, W, 및 B는 화학식 VII에 대해 상기 기재된 바와 같고; 여기서 R은 화학식 IVb(i)에 기재된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다:
Figure 112019027874923-pct00038
여기서 A, U1, U2, W, 및 B는 화학식 VII에 대해 상기 기재된 바와 같고; 여기서 R은 화학식 IVb(ii)에 기재된 바와 같다.
c. 화학식 VIIc
일부 실시양태에서, 본 발명의 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다:
Figure 112019027874923-pct00039
여기서 A, U1, U2, W, I 및 B는 화학식 VII에 대해 상기 기재된 바와 같고; 여기서 Y, Z, V, K, n, T, 및 R은 화학식 IVc에 대해 상기 기재된 바와 같다. 특정 실시양태에서, B는 천연 핵염기이다.
보다 전형적으로, 본 발명의 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다:
Figure 112019027874923-pct00040
여기서 A, U1, U2, W 및 B는 화학식 VII에 대해 상기 기재된 바와 같고; 여기서 R은 화학식 IVc(i)에 기재된 바와 같다.
d. 화학식 VIId
일부 실시양태에서, 본 발명의 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다:
Figure 112019027874923-pct00041
여기서 A, U1, U2, W, I, 및 B는 화학식 VII에 대해 상기 기재된 바와 같고; 여기서 Y, Z, R 및 T는 화학식 IVd에 대해 상기 기재된 바와 같다. 특정 실시양태에서, B는 천연 핵염기이다.
보다 전형적으로, 본 발명의 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다:
Figure 112019027874923-pct00042
여기서 A, U1, U2, W, 및 B는 화학식 VII에 대해 상기 기재된 바와 같다.
e. 화학식 VIIe
일부 실시양태에서, 본 발명의 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다:
Figure 112019027874923-pct00043
여기서 A, U1, U2, W, I, 및 B는 화학식 VII에 대해 상기 기재된 바와 같고, 여기서 V, Y, Z, G, E, T, K, n, R, 및 T는 화학식 IVe에 대해 상기 기재된 바와 같다. 특정 실시양태에서, B는 천연 핵염기이다.
보다 전형적으로, 본 발명의 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식 중 하나로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다:
Figure 112019027874923-pct00044
Figure 112019027874923-pct00045
Figure 112019027874923-pct00046
Figure 112019027874923-pct00047
여기서 A, U1, U2, W, 및 B는 화학식 VII에 대해 상기 기재된 바와 같고;
여기서 R은 수소, CH3, 치환 또는 비치환된 지방족, 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬 또는 헤테로사이클로부터 선택되거나, 또는 R은 임의의 스페이서를 통해 임의로 연결된 표적화 리간드이다.
A. 글루타티온-감수성 핵산 억제제 분자
특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 핵산 억제제 분자 내로 혼입된다. 다양한 올리고뉴클레오티드 구조가 단일 가닥 및 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함한, 핵산 억제제 분자로서 사용되고 있고, 임의의 이들 다양한 올리고뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 글루타티온-감수성 뉴클레오티드를 포함하도록 변형될 수 있다.
특정 실시양태에서, 핵산 억제제 분자는 센스 (또는 패신저) 가닥 및 안티센스 (또는 가이드 가닥)를 포함하는 이중-가닥 RNAi 억제제 분자이다. 다양한 이중 가닥 RNAi 억제제 분자 구조는 관련 기술분야에 알려져 있다. 예를 들어, RNAi 억제제 분자에 대한 초기 작업은 각각의 가닥이 1 내지 5개 뉴클레오티드의 적어도 하나의 3'-오버행을 갖는 19-25개 뉴클레오티드의 크기인 이중-가닥 핵산 분자에 초점을 맞추었다 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,372,968 참조). 후속적으로, 활성 RNAi 억제제 분자로 다이서 효소에 의해 생체내 가공된 더 긴 이중-가닥 RNAi 억제제 분자가 개발되었다 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,883,996 참조). 후기 작업은 가닥 중 하나가 열역학적-안정화 테트라루프 구조를 포함하는 구조를 포함한, 적어도 하나의 가닥의 적어도 하나의 단부가 분자의 이중-가닥 표적화 영역을 넘어 확장되어 있는 확장된 이중-가닥 핵산 억제제 분자를 개발하였다 (예를 들어, 이들 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 그들의 개시내용에 대해 참조로 혼입된 미국 특허 번호 8,513,207, 미국 특허 번호 8,927,705, WO 2010/033225, 및 WO 2016/100401 참조). 그러한 구조는 (분자의 한측 또는 양측 상의) 단일-가닥 확장 및 이중-가닥 확장을 포함한다.
dsRNAi 억제제 분자의 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 15-66개, 25-40개, 또는 19-25개 뉴클레오티드 범위이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 18 내지 66개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 18 내지 25개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24개 뉴클레오티드 길이이다. 특정한 그러한 실시양태에서, 센스 가닥은 25 내지 45개 뉴클레오티드 길이다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 30 내지 40개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 36, 37, 38, 39, 또는 40개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 25 내지 30개 뉴클레오티드 길이이다. 특정한 그러한 실시양태에서, 센스 가닥은 25, 26, 또는 27개 뉴클레오티드 길이이다.
dsRNAi 억제제 분자의 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 18 내지 66개 뉴클레오티드 길이이다. 전형적으로, 안티센스 가닥은 표적 유전자 mRNA 내의 서열에 충분히 상보적이어서 표적 유전자에 대한 핵산 억제제 분자의 효과를 지시하는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 완전 상보적 서열이 18 내지 40개 뉴클레오티드 길이인 표적 유전자 mRNA 내에 함유된 서열과 완전 상보적 서열을 포함한다. 특정한 그러한 실시양태에서, 안티센스 가닥은 20 내지 50개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 20 내지 30개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 35 내지 40개 뉴클레오티드 길이이다. 특정한 그러한 실시양태에서, 안티센스 가닥은 36, 37, 38, 또는 39개 뉴클레오티드 길이이다.
dsRNAi 억제제 분자의 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 15 내지 50개 염기 쌍의 듀플렉스 구조를 형성한다. 특정 실시양태에서, 듀플렉스 영역은 15 내지 30개 염기 쌍 길이, 예컨대 19 내지 30개, 보다 전형적으로 18 내지 26개, 예컨대 19 내지 23개, 및 특정 경우에 19 내지 21개 염기 쌍 길이이다. 특정 실시양태에서, 이중-가닥 영역은 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 또는 26개 염기 쌍 길이이다.
일부 실시양태에서, dsRNAi 억제제 분자는 하나 이상의 단일-가닥 뉴클레오티드 오버행(들)을 추가로 포함할 수 있다. 전형적으로, dsRNAi 억제제 분자는 1-10개, 1-4개, 또는 1-2개 뉴클레오티드의 단일-가닥 오버행을 갖는다. 단일 가닥 오버행은 전형적으로 센스 가닥의 3'-단부 및/또는 안티센스 가닥의 3'-단부에 위치한다. 특정 실시양태에서, 1-10개, 1-4개, 또는 1-2개 뉴클레오티드의 단일-가닥 오버행은 안티센스 가닥의 5'-단부에 위치한다. 특정 실시양태에서, 1-10개, 1-4개, 또는 1-2개 뉴클레오티드의 단일-가닥 오버행은 센스 가닥의 5'-단부에 위치한다. 특정 실시양태에서, 1-2개 뉴클레오티드의 단일-가닥 오버행은 안티센스 가닥의 3'-단부에 위치한다. 특정 실시양태에서, 10개 뉴클레오티드의 단일-가닥 오버행은 안티센스 가닥의 5'-단부에 위치한다. 특정 실시양태에서, dsRNA 억제제 분자는 전형적으로 안티센스 가닥의 5'-단부에서 평활 말단을 갖는다.
특정 실시양태에서, dsRNAi 억제제 분자는 센스 및 안티센스 가닥, 및 19-21개 뉴클레오티드의 듀플렉스 영역을 포함하며, 여기서 센스 가닥은 19-21개 뉴클레오티드 길이이고, 안티센스 가닥은 21-23개 뉴클레오티드 길이이고, 그의 3'-말단에서 1-2개 뉴클레오티드의 단일-가닥 오버행을 포함한다.
특정 실시양태에서, dsRNAi 억제제 분자는 21개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 가닥 및 21개 뉴클레오티드 길이의 센스 가닥을 가지며, 여기서 분자의 우측 상에 2개 뉴클레오티드 3'-패신저 가닥 오버행 (센스 가닥의 3'-단부/안티센스 가닥의 5'-단부) 및 분자의 좌측 상에 2개 뉴클레오티드 3'-가이드 가닥 오버행 (센스 가닥의 5'-단부/안티센스 가닥의 3'-단부)이 있다. 이러한 분자에서, 19개 염기 쌍 듀플렉스 영역이 있다.
특정 실시양태에서, dsRNAi 억제제 분자는 23개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 가닥 및 21개 뉴클레오티드 길이의 센스 가닥을 가지며, 여기서 분자의 우측 상에 평활 말단 (센스 가닥의 3'-단부/안티센스 가닥의 5'-단부) 및 분자의 좌측 상에 2개 뉴클레오티드 3'-가이드 가닥 오버행 (센스 가닥의 5'-단부/안티센스 가닥의 3'-단부)이 있다. 이러한 분자에서, 21개 염기 쌍 듀플렉스 영역이 있다.
특정 실시양태에서, dsRNAi 억제제 분자는 센스 및 안티센스 가닥, 및 18-34개 뉴클레오티드의 듀플렉스 영역을 포함하며, 여기서 센스 가닥은 25-34개 뉴클레오티드 길이이고, 안티센스 가닥은 26-38개 뉴클레오티드이고, 그의 3' 말단에서 1-5개 단일-가닥 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 26개 뉴클레오티드이고, 안티센스 가닥은 38개 뉴클레오티드이고, 그의 3' 말단에서 2개 뉴클레오티드의 단일-가닥 오버행 및 그의 5' 말단에서 10개 뉴클레오티드의 단일-가닥 오버행을 갖고, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 26개 뉴클레오티드의 듀플렉스 영역을 형성한다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 25개 뉴클레오티드이고, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드이고, 그의 3' 말단에서 2개 뉴클레오티드의 단일-가닥 오버행을 갖고, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 25개 뉴클레오티드의 듀플렉스 영역을 형성한다.
일부 실시양태에서, dsRNAi 억제제 분자는 스템 및 루프를 포함한다. 전형적으로, dsRNAi 억제제 분자의 패신저 가닥의 3'-말단 영역 또는 5'-말단 영역은 단일 가닥 스템 및 루프 구조를 형성한다.
일부 실시양태에서, dsRNAi 억제제 분자는 스템 및 테트라루프를 포함한다. dsRNAi 억제제 분자가 스템 및 테트라루프를 함유하는 실시양태에서, 패신저 가닥은 스템 및 테트라루프를 포함하고 20-66개 뉴클레오티드 길이 범위이다. 전형적으로, 가이드 및 패신저 가닥은 별개 가닥이며, 각각이 인접 올리고뉴클레오티드 (때때로 "닉킹된" 구조로서 지칭됨)를 형성하지 않는 5' 및 3' 단부를 갖는다.
특정한 그러한 실시양태에서, 가이드 가닥은 15 내지 40개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 스템 및 테트라루프를 함유하는 패신저 가닥의 확장된 부분은 가닥의 3'-단부 상에 있다. 특정의 다른 실시양태에서, 스템 및 테트라루프를 함유하는 패신저 가닥의 확장된 부분은 가닥의 5'-단부 상에 있다.
특정 실시양태에서, 스템 및 테트라루프를 함유하는 dsRNAi 억제제 분자의 패신저 가닥은 34 내지 40개 뉴클레오티드 길이이고, dsRNAi 억제제 분자의 가이드 가닥은 20 내지 24개 뉴클레오티드를 함유하며, 여기서 패신저 가닥 및 가이드 가닥은 18-24개 뉴클레오티드의 듀플렉스 영역을 형성한다.
특정 실시양태에서, dsRNAi 억제제 분자는 (a) 스템 및 테트라루프를 함유하고 36개 뉴클레오티드 길이인 패신저 가닥으로서, 여기서 5'-단부로부터의 처음 20개 뉴클레오티드는 가이드 가닥에 상보적이고 이후 16개 뉴클레오티드는 스템 및 테트라루프를 형성하는 것인 패신저 가닥 및 (b) 22개 뉴클레오티드 길이이고 그의 3' 단부에서 2개 뉴클레오티드의 단일-가닥 오버행을 갖는 가이드 가닥을 포함하며, 여기서 가이드 및 패신저 가닥은 인접 올리고뉴클레오티드를 형성하지 않는 별개 가닥이다 (예를 들어, 도 1a 및 1b 참조).
특정 실시양태에서, 핵산 억제제 분자는 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함한다. 전형적으로, 핵산 억제제 분자는 5개 미만의 데옥시리보뉴클레오티드를 함유한다. 특정 실시양태에서, 핵산 억제제 분자는 하나 이상의 리보뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 핵산 억제제 분자의 뉴클레오티드 중 모두가 리보뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 이중 가닥 핵산 억제제 분자, 예를 들어, dsRNAi 억제제 분자의 적어도 하나의 글루타티온-감수성 뉴클레오티드는 패신저 가닥 상에 위치한다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 글루타티온-감수성 뉴클레오티드는 가이드 가닥 상에 위치한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 글루타티온-감수성 뉴클레오티드는 듀플렉스 영역 내에 위치한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 글루타티온-감수성 뉴클레오티드는 오버행 영역 내에 위치한다.
특정 실시양태에서, 핵산 억제제 분자는, 본원에 기재된 바와 같은, 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하는 단일-가닥 핵산 억제제 분자이다. 단일 가닥 핵산 억제제 분자는 관련 기술분야에 알려져 있다. 예를 들어, 최근의 노력은 ssRNAi 억제제 분자의 활성을 입증하였다 (예를 들어, 문헌 [Matsui et al., Molecular Therapy, 2016,24(5):946-55] 참조). 그리고, 안티센스 분자는 특정한 표적 유전자의 발현을 감소시키기 위해 수십년간 사용되어 왔다. 문헌 [Pelechano and Steinmetz, Nature Review Genetics, 2013,14:880-93]. 이들 구조의 공통 주제에 대한 다수의 변경이 다양한 표적에 대해 개발된 바 있다. 단일 가닥 핵산 억제제 분자는, 예를 들어, 통상적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 마이크로RNA, 리보자임, 압타머, 안타고미르, 및 ssRNAi 억제제 분자를 포함하며, 이들 모두는 관련 기술분야에 알려져 있다.
특정 실시양태에서, 핵산 억제제 분자는 14-50개, 16-30개, 또는 15-25개 뉴클레오티드를 갖는 ssRNAi 억제제 분자이다. 다른 실시양태에서, ssRNAi 억제제 분자는 18-22개 또는 20-22개 뉴클레오티드를 갖는다. 특정 실시양태에서, ssRNAi 억제제 분자는 20개 뉴클레오티드를 갖는다. 다른 실시양태에서, ssRNAi 억제제 분자는 22개 뉴클레오티드를 갖는다. 특정 실시양태에서, 핵산 억제제 분자는 외인성 RNAi 억제제 분자 또는 천연 miRNA를 억제하는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드이다.
특정 실시양태에서, 핵산 억제제 분자는 8-80개, 14-50개, 16-30개, 12-25개, 12-22개, 14-20개, 18-22개, 또는 20-22개 뉴클레오티드를 갖는 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드는 18-22개, 예컨대 18-20개 뉴클레오티드를 갖는다.
특정 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그의 일부는 표적 핵산 또는 그의 특정한 부분에 완전히 상보적이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그의 일부는 표적 핵산의 적어도 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개, 또는 그 초과의 인접 뉴클레오티드에 상보적이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 또는 그의 일부에 대하여 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 비-상보적 뉴클레오티드를 함유한다. 활성을 제거하지 않으면서 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이를 감소시키고/거나 미스매치 염기를 도입하는 것이 가능하다.
본원에 기재된 바와 같은, 하나 이상의 뉴클레오티드의 당 모이어티는, 전형적으로 당 모이어티의 2'-탄소에서, 글루타티온-감수성 모이어티로 변형될 수 있다. 전형적으로 핵산 억제제 분자의 1 또는 2개 뉴클레오티드는 글루타티온-감수성 모이어티로 가역적으로 변형된다. 특정 실시양태에서, 핵산 억제제 분자의 2개 초과의 뉴클레오티드, 예컨대 3, 4, 5개, 또는 그 초과의 뉴클레오티드는 글루타티온-감수성 모이어티로 가역적으로 변형된다. 특정 실시양태에서, 대부분의 뉴클레오티드는 글루타티온-감수성 모이어티로 가역적으로 변형된다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 중 모두 또는 실질적으로 모두가 글루타티온-감수성 모이어티를 함유한다.
특정 실시양태에서, dsRNAi 억제제 분자의 패신저 가닥은 글루타티온-감수성 모이어티로 가역적으로 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드를 함유한다. 특정 실시양태에서, dsRNAi 억제제 분자의 가이드 가닥은 글루타티온-감수성 모이어티로 가역적으로 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드를 함유한다. 특정 실시양태에서, dsRNAi 억제제 분자의 가이드 및 패신저 가닥은 각각 글루타티온-감수성 모이어티로 가역적으로 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드를 함유한다.
일부 실시양태에서, 핵산 억제제 분자에서 적어도 하나의 글루타티온-감수성 모이어티의 존재는, 예를 들어, 혈청 내 뉴클레아제, 및/또는 세포 내, 예를 들어, 소포 예컨대 엔도솜 소포, 리소솜 소포 및/또는 융합된 엔도솜/리소솜 소포 내 뉴클레아제로부터 생성된 올리고뉴클레오티드의 분해를 감소시킨다. 예를 들어, 핵산 억제제 분자의 5'- 또는 3'-말단 뉴클레오티드에 글루타티온-감수성 모이어티를 배치하는 것은 뉴클레아제로부터의 분해에 대하여 보호할 수 있다. 게다가, 특정 이중 가닥 핵산 억제제 분자는 패신저 또는 가이드 가닥 중 어느 하나 또는 둘 다 상에 단일 가닥 오버행 영역을 함유하며, 이는 뉴클레아제 분해에 보다 취약하다. 이러한 단일 가닥 오버행 영역을 변형시키는 것은 이러한 이중 가닥 핵산 억제제 분자를 뉴클레아제로부터의 분해에 대하여 보호할 수 있다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 글루타티온-감수성 모이어티는 단일 가닥 핵산 억제제 분자의 5'-말단 뉴클레오티드 또는 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 패신저 가닥 또는 가이드 가닥의 5'-말단 뉴클레오티드에 위치한다. 특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 5'-말단 뉴클레오티드의 5'-탄소에 위치한다. 다른 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 5'-말단 뉴클레오티드의 2'-탄소에 위치한다. 이중 가닥 핵산 억제제 분자의 특정 실시양태에서, 패신저 또는 가이드 가닥의 5'-말단 뉴클레오티드에 위치한 글루타티온-감수성 모이어티는 오버행 영역 내에 있다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 글루타티온-감수성 모이어티는 단일 가닥 핵산 억제제 분자의 3'-말단 뉴클레오티드 또는 이중 가닥 핵산 억제제 분자의 패신저 가닥 또는 가이드 가닥의 3'-말단 뉴클레오티드에 위치한다. 특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 3'-말단 뉴클레오티드의 3'-탄소에 위치한다. 다른 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 3'-말단 뉴클레오티드의 2'-탄소에 위치한다. 이중 가닥 핵산 억제제 분자의 특정 실시양태에서, 패신저 또는 가이드 가닥의 3'-말단 뉴클레오티드에 위치한 글루타티온-감수성 모이어티는 오버행 영역 내에 있다.
RNAi 억제제 분자의 뉴클레오티드 위치 2 및 위치 14에서의 비가역적 화학적 변형, 예컨대 당의 2'-탄소에서의 변형은, 일반적으로 널리 허용되지 않는다. 임의의 이론에 얽매이려는 의도 없이, 이들 뉴클레오티드 위치가 입체적 벌크에 감수성인 것이 가능하다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 글루타티온-감수성 모이어티는 단일 가닥 핵산 억제제 분자의 뉴클레오티드 위치 2 또는 이중 가닥 핵산 억제제 분자의 가이드 가닥의 위치 2에 위치한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 글루타티온-감수성 모이어티는 단일 가닥 핵산 억제제 분자의 뉴클레오티드 위치 14 또는 이중 가닥 핵산 억제제 분자의 가이드 가닥의 위치 14에 위치한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 글루타티온-감수성 모이어티는 dsRNAi 억제제 분자의 패신저 가닥의 Ago2 절단 부위에 위치하거나 또는 그에 인접한 하나 이상의 뉴클레오티드 상에 있다. 전형적으로, Ago2는, 가이드 가닥의 5'-단부로부터 측정 시, 가이드 가닥의 뉴클레오티드 위치 10 및 11에 대향하는 2개 뉴클레오티드 사이의 포스포디에스테르 결합에서 패신저 가닥을 절단한다. 이에 따라, 예를 들어, 가이드 가닥이 22개 뉴클레오티드 및 2-염기 쌍 오버행 (또는 20개 뉴클레오티드 및 오버행 없음)을 갖는 경우에, Ago2는 패신저 가닥의 뉴클레오티드 위치 10 및 11 사이를 절단하여야 한다. 가이드 가닥이 21개 뉴클레오티드 및 2-염기 쌍 오버행 (또는 19개 뉴클레오티드 및 오버행 없음)을 갖는 경우에, Ago2는 패신저 가닥의 뉴클레오티드 위치 9 및 10 사이를 절단하여야 한다. 특정 실시양태에서, dsRNAi 억제제 분자는 Ago2 절단 부위의 바로 5'인 1, 2, 또는 3개 뉴클레오티드 상에 글루타티온-감수성 모이어티를 함유한다. 특정 실시양태에서, dsRNAi 억제제 분자는 Ago2 절단 부위의 바로 3'인 1, 2, 또는 3개 뉴클레오티드 상에 글루타티온-감수성 모이어티를 함유한다. 특정 실시양태에서, dsRNAi 억제제 분자는, 예를 들어, Ago2 절단 부위의 바로 5'인 1, 2, 또는 3개 뉴클레오티드 상 및 Ago2 절단 부위의 바로 3'인 1, 2, 또는 3개 뉴클레오티드 상을 포함한, Ago2 절단 부위의 양측 상에 글루타티온-감수성 모이어티를 함유한다.
B. 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드의 다른 변형
본원에 기재된 바와 같은 가역적 글루타티온-감수성 모이어티로 변형된 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 본원에 기재된 비가역적 변형을 포함한, 관련 기술분야에 알려진 다른 뉴클레오티드 변형을 사용하여 하나 이상의 뉴클레오티드 상에서 추가로 변형될 수 있다. 전형적으로, 관심 올리고뉴클레오티드의 다중 뉴클레오티드 서브유닛은 분자의 다양한 특징 예컨대 뉴클레아제에 대한 저항성 또는 저하된 면역원성을 개선시키도록 변형된다. 예를 들어, 문헌 [Bramsen et al. (2009), Nucleic Acids Res., 37, 2867-2881] 참조. 많은 뉴클레오티드 변형이 올리고뉴클레오티드 분야에서, 특히 핵산 억제제 분자에 대해 사용되어 왔다. 이러한 비가역적 변형은 당 모이어티, 포스포디에스테르 연결, 및 핵염기를 포함한, 뉴클레오티드의 임의의 부분 상에서 이루어질 수 있다. 뉴클레오티드 변형의 전형적인 예는 2'-F, 2'-O-메틸 ("2'-OMe" 또는 "2'-OCH3"), 2'-O-메톡시에틸 ("2'-MOE" 또는 "2'-OCH2CH2OCH3"), 및 5'-메틸시토신을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 비가역적 변형은, 본원에 기재된 바와 같은, 뉴클레오티드의 다른 부분, 예컨대 5'-탄소에서 발생할 수 있다.
특정 실시양태에서, 이전에 논의된 바와 같은, 잠금 핵산 ("LNA") 구조, 가교 핵산 ("BNA") 구조, 및 비잠금 핵산 ("UNA") 구조를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 당 모이어티의 고리 구조가 변형된다.
변형된 핵염기는, 관련 기술분야에 알려져 있는 바와 같고 본원에 기재된 바와 같은, 1'-위치에서의 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 및 우라실 이외의 핵염기를 포함한다. 변형된 핵염기의 전형적인 예는 5'-메틸시토신이다.
RNA 및 DNA의 천연 발생 뉴클레오티드간 연결은 3' 내지 5' 포스포디에스테르 연결이다. 변형된 포스포디에스테르 연결은, 관련 기술분야에 알려진 바와 같고 본원에 기재된 바와 같은, 인 원자를 함유하는 뉴클레오티드간 연결 및 인 원자를 함유하지 않는 뉴클레오티드간 연결을 포함한, 비-천연 발생 뉴클레오티드간 연결기를 포함한다. 전형적으로, 올리고뉴클레오티드는, 본원에 기재된 바와 같은, 하나 이상의 인-함유 뉴클레오티드간 연결기를 함유한다. 다른 실시양태에서, 핵산 억제제 분자의 뉴클레오티드간 연결기 중 하나 이상은, 본원에 기재된 바와 같은, 비-인 함유 연결이다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 인-함유 뉴클레오티드간 연결기 및 하나 이상의 비-인 함유 뉴클레오티드간 연결기를 함유한다.
글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드의 5'-단부는 천연 치환기, 예컨대 히드록실 또는 포스페이트 기를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 히드록실 기는 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드의 5'-말단 단부에 부착된다. 특정 실시양태에서, 포스페이트 기는 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드의 5'-말단 단부에 부착된다. 전형적으로, 포스페이트는 올리고뉴클레오티드 합성 전에 단량체에 첨가된다. 다른 실시양태에서, 5'-인산화는 개시내용의 올리고뉴클레오티드가, 예를 들어, 시토졸 Clp1 키나제에 의해 시토졸 내로 도입된 후에 천연적으로 달성된다. 일부 실시양태에서, 5'-말단 포스페이트는 포스페이트 기, 예컨대 5'-모노포스페이트 [(HO)2(O)P-O-5'], 5'-디포스페이트 [(HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'] 또는 5'-트리포스페이트[(HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5']이다.
글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드의 5'-단부는 또한 변형될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드의 5'-단부는 포스포르아미데이트 [(HO)2(O)P-NH-5', (HO)(NH2)(O)P-O-5']에 부착된다. 특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드의 5'-말단 단부는 포스페이트 모방체에 부착된다. 적합한 포스페이트 모방체는 5'-포스포네이트, 예컨대 5'-메틸렌포스포네이트 (5'-MP) 및 5'-(E)-비닐포스포네이트 (5'-VP)를 포함한다. 문헌 [Lima et al., Cell, 2012, 150-883-94; WO2014/130607]. 다른 적합한 포스페이트 모방체는, 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 가출원 번호 62/393,401에 기재된 바와 같은, 올리고뉴클레오티드의 5'-말단 뉴클레오티드의 당 모이어티 (예를 들어, 리보스 또는 데옥시리보스 또는 그의 유사체)의 4'-탄소에 결합되어 있는 4'-포스페이트 유사체를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 핵산 억제제 분자의 5'-단부는 옥시메틸포스페이트에 부착되며, 여기서 옥시메틸 기의 산소 원자는 당 모이어티 또는 그의 유사체의 4'-탄소에 결합된다. 특정 실시양태에서, 4'-옥시메틸포스페이트는 화학식 -O-CH2-PO(OH)2 또는 -O-CH2-PO(OR)2에 의해 나타내어지며, 여기서 R은 독립적으로 H, CH3, 알킬 기, 또는 보호기로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 알킬 기는 CH2CH3이다. 보다 전형적으로, R은 독립적으로 H, CH3, 또는 CH2CH3으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 포스페이트 유사체는 티오메틸포스포네이트 또는 아미노메틸포스포네이트이며, 여기서 티오메틸 기의 황 원자 또는 아미노메틸 기의 질소 원자는 당 모이어티 또는 그의 유사체의 4'-탄소에 결합된다.
특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 완전히 변형되며, 여기서 완전히 변형된 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드는, 본원에 기재된 바와 같은, 비가역적 변형 또는 가역적, 글루타티온-감수성 모이어티 중 어느 하나로 변형된다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드는 변형되며, 여기서 글루타티온-감수성 모이어티로 변형되지 않는 모든 뉴클레오티드는 비가역적 변형으로 변형된다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드를 함유하고 올리고뉴클레오티드 내 모든 리보뉴클레오티드는, 본원에 기재된 바와 같은, 비가역적 변형 또는 가역적, 글루타티온-감수성 모이어티 중 어느 하나로 변형된다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드의 실질적으로 모두가 변형된다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드의 절반 초과가 변형된다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드의 절반 초과가 비가역적 변형을 함유한다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드의 절반 미만이 변형된다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드의 절반 미만이 비가역적 변형을 함유한다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 글루타티온-감수성 뉴클레오티드 이외의 임의의 변형을 함유하지 않는다. 변형은 올리고뉴클레오티드 쇄 상의 기에서 발생할 수 있거나 또는 상이한 변형된 뉴클레오티드는 산재될 수 있다.
일부 실시양태에서, 비가역적 화학적 변형은 글루타티온-감수성 모이어티를 함유하는 것과 동일한 뉴클레오티드에 위치한다. 다른 실시양태에서, 비가역적 화학적 변형은 글루타티온-감수성 모이어티를 함유하지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드에 위치한다.
일부 실시양태에서, 단일 가닥 핵산 억제제 분자 내 또는 이중 가닥 핵산 억제제 분자의 가이드 가닥 또는 패신저 가닥 내 뉴클레오티드 중 모두는, 하나의 뉴클레오티드가 본원에 기재된 바와 같은 글루타티온-감수성 모이어티로 가역적으로 변형된 것을 제외하고는, 비가역적 화학적 변형으로 변형된다. 다른 실시양태에서, 단일 가닥 핵산 억제제 분자, 또는 이중 가닥 핵산 억제제 분자의 가이드 가닥 또는 패신저 가닥 중 적어도 하나, 예컨대 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 뉴클레오티드는 글루타티온-감수성 모이어티로 가역적으로 변형되고, 단일 가닥 핵산 억제제 분자, 또는 이중 가닥 핵산 억제제 분자의 가이드 가닥 또는 패신저 가닥 중 적어도 하나, 예컨대 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 뉴클레오티드는 비가역적 화학적 변형으로 화학적으로 변형된다. 일부 실시양태에서, 단일 가닥 핵산 억제제 분자, 또는 이중 가닥 핵산 억제제 분자의 가이드 가닥 또는 패신저 가닥의 뉴클레오티드 중 모두는 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 글루타티온-감수성 모이어티 또는 적어도 하나의 비가역적 변형을 함유한다.
핵산 억제제 분자의 특정 실시양태에서, 모든 뉴클레오티드는 2'-탄소에서 변형된다. 핵산 억제제 분자 (또는 그의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥)의 특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티로 변형되지 않는 모든 뉴클레오티드는 2'-F, 2'-O-Me, 및/또는 2'-MOE로 변형된다. 핵산 억제제 분자의 특정 실시양태에서, 하나 내지 모든 인 원자는 변형되고, 하나 내지 모든 리보뉴클레오티드는 2'-탄소에서 변형된다.
III. 글루타티온-감수성 단량체 (뉴클레오시드 및 뉴클레오티드)
본 개시내용의 한 측면은 표준 올리고뉴클레오티드 합성 방법에서 사용될 수 있는 글루타티온-감수성 뉴클레오시드 포스포르아미다이트 및 예를 들어, 항바이러스제로서 치료적 유용성을 갖는 포스포르아미다이트 기가 없는 글루타티온-감수성 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함한, 글루타티온-감수성 모이어티를 포함하는 가역적으로 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드에 관한 것이다. 전형적으로, 가역적 변형은 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드의 당 모이어티, 예를 들어 데옥시리보스 또는 리보스 (또는 그의 유사체)에 글루타티온-감수성 모이어티를 포함한다. 전형적으로, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 내 글루타티온-감수성 모이어티는 데옥시리보스 또는 리보스 (또는 그의 유사체)의 2'-탄소에 위치한다. 다른 실시양태에서, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 내 글루타티온-감수성 모이어티는 리보스 또는 데옥시리보스 (또는 그의 유사체)의 5'-탄소에 위치한다. 또 다른 실시양태에서, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 내 글루타티온-감수성 모이어티는 리보스 또는 데옥시리보스 (또는 그의 유사체)의 3'-탄소에 위치한다.
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 술포닐 기를 포함한다. 다른 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 디술피드 가교를 포함한다.
A. 글루타티온-감수성 뉴클레오시드 포스포르아미다이트
본 출원은 글루타티온-감수성 모이어티로 가역적으로 변형되고 포스포르아미다이트 올리고뉴클레오티드 합성 방법과 적합성인 뉴클레오시드를 개시한다. 이에 따라, 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 글루타티온-감수성 모이어티를 포함하는 가역적으로 변형된 뉴클레오시드 포스포르아미다이트 및 이들 글루타티온-감수성 뉴클레오시드 포스포르아미다이트를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 뉴클레오시드는 포스포르아미다이트 및 글루타티온-감수성 모이어티를 포함하며, 여기서 뉴클레오시드는 포스포르아미다이트 올리고뉴클레오티드 합성 방법과 적합성이다. 전형적으로, 포스포르아미다이트는 뉴클레오시드의 당 모이어티의 5'- 또는 3'-탄소에 결합되고, 글루타티온-감수성 모이어티는 뉴클레오시드의 당 모이어티 (예를 들어, 리보스)의 2'-탄소에 공유적으로 결합되어 있는 산소 원자에 결합된다. 일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 II에 의해 나타내어진다. 특정 실시양태에서, 화학식 II는, 본원에 기재된 바와 같은, 화학식 IIa이다. 다른 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 III에 의해 나타내어진다. 일부 실시양태에서, 화학식 III은, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IIIa 또는 IIIb로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 화학식 III은, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IIIa(i) 또는 IIIb(i)로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IV에 의해 나타내어진다. 일부 실시양태에서, 화학식 IV는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IVa, IVb, IVc, IVd, 또는 IVe로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 화학식 IV는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IVa(i), IVb(i), IVb(ii), IVc(i), 또는 IVd(i)로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 화학식 IVe는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IVe(i), IVe(ii), IVe(iii), IVe(iv), IVe(v), IVe(vi), IVe(vii), IVe(viii), IVe(ix), IVe(x), 또는 IVe(xi)로부터 선택된다.
1. 화학식 VIII
일부 실시양태에서, 뉴클레오시드 포스포르아미다이트는 하기 화학식에 의해 나타내어진다:
Figure 112019027874923-pct00048
여기서 L1은 글루타티온-감수성 모이어티이고;
여기서 A1은 부재하거나, 수소, 포스페이트 기, 포스페이트 모방체, 포스포르아미데이트, 포스포르아미다이트, 보호기, 또는 고체 지지체이고;
여기서 W1은 포스포르아미다이트, 보호기, 고체 지지체, 수소, 할로겐, OR', SR', NR'R", 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클이며, 여기서 R' 및 R"은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 치환 또는 비치환된 지방족, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클로부터 선택되거나, 또는 함께 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
여기서 U3은 수소이거나, 또는 O, S, NR' 또는 CR'R"으로부터 선택되며, 여기서 R' 및 R"은 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클 및 치환 또는 비치환된 시클로알킬이고;
여기서 적어도 A1은 포스포르아미다이트이고 U3은 O이거나, 또는 적어도 W1은 포스포르아미다이트이고 U2는 O이고;
여기서 X는 O, S, Se 또는 NR'이며, 여기서 R'은 수소, 할로겐, 치환 또는 비치환된 지방족, 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되고;
여기서 R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, OH, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬로부터 선택되거나, 또는 여기서 R1, R2, R3 및 R4 중 2개는 함께 5-8 원 고리를 형성하며, 여기서 고리는 임의로 헤테로원자를 함유하고;
여기서 J는 O, S, NR', CR'R"이며, 각각의 R' 및 R"은 독립적으로 수소, 할로겐, 치환 또는 비치환된 지방족, 아릴 또는 헤테로아릴로부터 선택되고;
여기서 B는 수소, 치환 또는 비치환된 지방족, 천연 핵염기, 변형된 핵염기 또는 범용 핵염기로부터 선택되고;
여기서 U2는 부재하거나, 또는 O, S, NR', 또는 CR'R"으로부터 선택되며, 여기서 R' 및 R"은 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클, 또는 치환 또는 비치환된 시클로알킬이고;
여기서 I는 부재하거나, 또는 O, S, NR', CR'R"으로부터 선택되며, 여기서 R' 및 R"은 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클 및 치환 또는 비치환된 시클로알킬이고;
여기서 I 및 U3은 조합되어 CR'-CR" 알킬, CR'-CR" 알케닐, CR'-CR" 알키닐, 치환 또는 비치환된 지방족, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클을 형성할 수 있거나, 또는 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클릭 고리를 형성할 수 있다.
전형적으로, 글루타티온-감수성 모이어티 (L1)는 디술피드 가교 또는 술포닐 기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 디술피드 가교를 포함한다. 다른 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 술포닐 기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티 (L1)는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 II, 화학식 III, 또는 화학식 IV에 의해 나타내어진다.
특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티 (L1)는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IIa에 의해 나타내어진다.
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티 (L1)는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IIIa 또는 IIIb에 의해 나타내어진다.
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티 (L1)는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IIIa(i) 또는 IIIb(i)에 의해 나타내어진다.
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티 (L1)는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IVa, IVb, IVc, IVd, 또는 IVe에 의해 나타내어진다.
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티 (L1)는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IVa(i), IVb(i), IVb(ii), IVc(i), 또는 IVd(i)에 의해 나타내어진다.
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티 (L1)는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IVe(i), IVe(ii), IVe(iii), IVe(iv), IVe(v), IVe(vi), IVe(vii), IVe(viii), IVe(ix), IVe(x), 또는 IVe(xi)에 의해 나타내어진다.
특정 실시양태에서, X는 O이다.
특정 실시양태에서, R1, R2, R3 및 R4는 수소이다.
특정 실시양태에서, J는 O이다.
특정 실시양태에서, B는 천연 핵염기이다.
특정 실시양태에서, U2는 O이다.
특정 실시양태에서, W1은 포스포르아미다이트, 보호기, 또는 수소이다.
특정 실시양태에서, A1은 포스포르아미다이트, 보호기, 또는 수소이다.
특정 실시양태에서, W1은 포스포르아미다이트이고, A1은 보호기이다.
특정 실시양태에서, W1은 보호기이고, A1은 포스포르아미다이트이다.
특정 실시양태에서, I는 CH2이다.
특정 실시양태에서, U3은 O이다.
특정 실시양태에서, X는 O이고, R1, R2, R3 및 R4는 수소이고, J는 O이다.
특정 실시양태에서, X는 O이고; R1, R2, R3 및 R4는 수소이고; J는 O이고; B는 천연 핵염기이고; U2는 O이고; I는 CH2이고; W1은 포스포르아미다이트이고, A1은 보호기이고, U3은 O이다.
특정 실시양태에서, X는 O이고; R1, R2, R3 및 R4는 수소이고; J는 O이고; B는 천연 핵염기이고; U2는 O이고; I는 CH2이고; W1은 보호기이고, A1은 포스포르아미다이트이고, U3은 O이다.
특정 실시양태에서, 포스포르아미다이트는 화학식 -P(ORx)-N(Ry)2를 가지며, 여기서 Rx는 임의로 치환된 메틸, 2-시아노에틸 및 벤질로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 각각의 Ry는 임의로 치환된 에틸 및 이소프로필로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, Rx는 2-시아노에틸이고, Ry는 이소프로필이다.
2. 화학식 IX
특정 실시양태에서, 뉴클레오시드 포스포르아미다이트는 하기 화학식에 의해 나타내어진다:
Figure 112019027874923-pct00049
여기서 L1은 글루타티온-감수성 모이어티이고;
여기서 R9는 포스포르아미다이트이고;
여기서 X는 O, S, Se 또는 NR'이며, 여기서 R'은 수소, 할로겐, 치환 또는 비치환된 지방족, 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴 또는 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되고;
여기서 R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, OH, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬로부터 선택되거나, 또는 여기서 R1, R2, R3 및 R4 중 2개는 함께 5-8 원 고리를 형성하며, 여기서 고리는 임의로 헤테로원자를 함유하고;
여기서 J는 O, S, NR', CR'R"이며, 각각의 R' 및 R"은 독립적으로 수소, 할로겐, 치환 또는 비치환된 지방족, 아릴 또는 헤테로아릴로부터 선택되고;
여기서 B는 수소, 천연 핵염기, 변형된 핵염기 또는 범용 핵염기이고;
여기서 I는 부재하거나, 또는 O, S, NR', CR'R"으로부터 선택되며, 여기서 R' 및 R"은 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클 및 치환 또는 비치환된 시클로알킬이고;
여기서 U3은 수소이거나, 또는 O, S, NR' 또는 CR'R"으로부터 선택되며, 여기서 R' 및 R"은 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클 및 치환 또는 비치환된 시클로알킬이고;
여기서 I 및 U3은 조합되어 CR'-CR" 알킬, CR'-CR" 알케닐, CR'-CR" 알키닐, 치환 또는 비치환된 지방족, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클을 형성할 수 있거나, 또는 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클릭 고리를 형성할 수 있고;
여기서 A3은 부재하거나, 수소, 포스페이트 기, 포스페이트 모방체, 포스포르아미데이트, 보호기, 또는 고체 지지체이다.
전형적으로, L1은 디술피드 가교 또는 술포닐 기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 디술피드 가교를 포함한다. 다른 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 술포닐 기를 포함한다.
일부 실시양태에서, L1은, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 II에 의해 나타내어진다. 일부 실시양태에서, L1은, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IIa에 의해 나타내어진다.
다른 실시양태에서, L1은, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 III에 의해 나타내어진다. 일부 실시양태에서, 화학식 III은, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IIIa, IIIa(i), IIIb, 또는 IIIb(i)로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, L1은, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IV에 의해 나타내어진다. 일부 실시양태에서, 화학식 IV는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IVa, IVb, IVc, IVd, 또는 IVe로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 화학식 IV는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IVa(i), IVb(i), IVb(ii), IVc(i), 또는 IVd(i)로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 화학식 IVe는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IVe(i), IVe(ii), IVe(iii), IVe(iv), IVe(v), IVe(vi), IVe(vii), IVe(viii), IVe(ix), IVe(x), 또는 IVe(xi)로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, X는 O이다.
특정 실시양태에서, R1, R2, R3 및 R4는 수소이다.
특정 실시양태에서, J는 O이다.
특정 실시양태에서, B는 천연 핵염기이다.
특정 실시양태에서, A3은 보호기 또는 수소이다.
특정 실시양태에서, I는 CH2이다.
특정 실시양태에서, U3은 O이다.
특정 실시양태에서, X는 O이고, R1, R2, R3 및 R4는 수소이고, J는 O이다.
특정 실시양태에서, X는 O이고; R1, R2, R3 및 R4는 수소이고; J는 O이고; B는 천연 핵염기이고; I는 CH2이고; A3은 보호기이고, U3은 O이다.
특정 실시양태에서, 포스포르아미다이트는 화학식 -P(ORx)-N(Ry)2를 가지며, 여기서 Rx는 임의로 치환된 메틸, 2-시아노에틸 및 벤질로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 각각의 Ry는 임의로 치환된 에틸 및 이소프로필로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, Rx는 2-시아노에틸이고, Ry는 이소프로필이다.
3. 화학식 X
특정 실시양태에서, 뉴클레오시드 포스포르아미다이트는 하기 화학식에 의해 나타내어진다:
Figure 112019027874923-pct00050
L1은 글루타티온-감수성 모이어티이고;
R8은 H, 보호기, 고체 지지체, 또는 포스포르아미다이트이고;
R7은 H, 보호기, 고체 지지체, 또는 포스포르아미다이트이고;
여기서 R8이 포스포르아미다이트인 경우에, R7은 H, 고체 지지체, 또는 보호기이거나, 또는 R8이 H, 고체 지지체, 또는 보호기인 경우에, R7은 포스포르아미다이트이고;
여기서 B는 천연 핵염기, 변형된 핵염기 또는 범용 핵염기이고;
여기서 X는 O, S, Se, NR'이며, 여기서 R'은 수소, 할로겐, 지방족 또는 치환된 지방족, 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로시클릭으로부터 선택될 수 있다.
전형적으로, L1은 디술피드 가교 또는 술포닐 기를 포함한다. 특정 실시양태에서, L1은 디술피드 가교를 포함한다. 다른 실시양태에서, L1은 술포닐 기를 포함한다.
일부 실시양태에서, L1은, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 II에 의해 나타내어진다. 일부 실시양태에서, L1은, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IIa에 의해 나타내어진다.
다른 실시양태에서, L1은, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 III에 의해 나타내어진다. 일부 실시양태에서, 화학식 III은, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IIIa, IIIa(i), IIIb, 또는 IIIb(i)로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, L1은, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IV에 의해 나타내어진다. 일부 실시양태에서, 화학식 IV는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IVa, IVb, IVc, IVd, 또는 IVe로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 화학식 IV는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IVa(i), IVb(i), IVb(ii), IVc(i), 또는 IVd(i)로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 화학식 IVe는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IVe(i), IVe(ii), IVe(iii), IVe(iv), IVe(v), IVe(vi), IVe(vii), IVe(viii), IVe(ix), IVe(x), 또는 IVe(xi)로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, X는 O이다.
특정 실시양태에서, B는 천연 핵염기이다.
특정 실시양태에서, 포스포르아미다이트는 화학식 -P(ORx)-N(Ry)2를 가지며, 여기서 Rx는 임의로 치환된 메틸, 2-시아노에틸 및 벤질로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 각각의 Ry는 임의로 치환된 에틸 및 이소프로필로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, Rx는 2-시아노에틸이고, Ry는 이소프로필이다.
특정 실시양태에서, R8은 화학식 -P(ORx)-N(Ry)2를 갖는 포스포르아미다이트이고, R9는 H 또는 보호기이다.
특정 실시양태에서, R9는 화학식 -P(ORx)-N(Ry)2를 갖는 포스포르아미다이트이고, R8은 H 또는 보호기이다.
특정 실시양태에서, X는 O이고; B는 천연 핵염기이고; R8은 보호기이고, R9는 화학식 -P(ORx)-N(Ry)2를 갖는 포스포르아미다이트이다.
특정 실시양태에서, X는 O이고; B는 천연 핵염기이고; R8은 화학식 -P(ORx)-N(Ry)2를 갖는 포스포르아미다이트이고, R9는 보호기이다. 특정 실시양태에서, Rx는 2-시아노에틸이고, Ry는 이소프로필이다.
B. 포스포르아미다이트 없는 글루타티온-감수성 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드
일부 실시양태에서, 가역적으로 변형된, 글루타티온-감수성 단량체 (뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 또는 그의 유사체)는 당 모이어티의 3'-탄소 또는 5'-탄소에 포스포르아미다이트 기를 함유하지 않는다. 이러한 글루타티온-감수성 단량체는 치료제로서, 예를 들어 항바이러스 활성을 갖는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체로서 사용될 수 있다. 전형적으로, 가역적 변형은 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 (또는 그의 유사체)의 당 모이어티, 예를 들어 데옥시리보스 또는 리보스 (또는 그의 유사체)에 글루타티온-감수성 모이어티를 포함한다. 전형적으로, 글루타티온-감수성 모이어티는 데옥시리보스 또는 리보스 (또는 그의 유사체)의 2'-탄소에 위치한다. 일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 리보스 또는 데옥시리보스 (또는 그의 유사체)의 5'-탄소에 위치한다. 다른 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 리보스 또는 데옥시리보스 (또는 그의 유사체)의 3'-탄소에 위치한다.
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 술포닐 기를 포함한다. 다른 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는 디술피드 가교를 포함한다.
특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 단량체는 단량체의 당 모이어티 (예를 들어, 리보스)의 2'-탄소에 공유적으로 결합되어 있는 산소 원자에 결합된 글루타티온-감수성 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 II에 의해 나타내어진다. 특정 실시양태에서, 화학식 II는, 본원에 기재된 바와 같은, 화학식 IIa이다. 다른 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 III에 의해 나타내어진다. 일부 실시양태에서, 화학식 III은, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IIIa, IIIa(i), IIIb, 또는 IIIb(i)로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IV에 의해 나타내어진다. 일부 실시양태에서, 화학식 IV는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IVa, IVb, IVc, IVd, 또는 IVe로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 화학식 IV는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IVa(i), IVb(i), IVb(ii), IVc(i), 또는 IVd(i)로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 화학식 IVe는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IVe(i), IVe(ii), IVe(iii), IVe(iv), IVe(v), IVe(vi), IVe(vii), IVe(viii), IVe(ix), IVe(x), 또는 IVe(xi)로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 단량체 (뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 또는 그의 유사체)는, 하기 추가로 상세히 기재된 바와 같은, 글루타티온-감수성 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 (또는 그의 유사체)의 치료 유효량 및 제약상 담체를 포함하는 제약 조성물로 제제화된다.
1. 화학식 XI
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는 하기 화학식에 의해 나타내어진다:
Figure 112019027874923-pct00051
여기서 L2는 화학식 II, III 또는 IV에 의해 나타내어진 글루타티온-감수성 모이어티이거나, 또는 A2 또는 W2 중 1개가 글루타티온-감수성 모이어티인 경우에 부재하고;
여기서 L2가 글루타티온-감수성 모이어티인 경우에, X는 O, S, Se, 또는 NR'이며, 여기서 R'은 수소, 할로겐, 치환 또는 비치환된 지방족, 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되거나, 또는 L2가 부재하는 경우에, X는 H, OH, SH, NH2, 할로겐, 임의로 치환된 알콕시, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 알킬티오, 임의로 치환된 알킬아미노 또는 디알킬아미노이며, 여기서 알킬, 알케닐, 및 알키닐 내 하나 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO2, N(R'), C(O), N(R')C(O)O, OC(O)N(R'), 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 헤테로시클릭, 또는 임의로 치환된 시클로알킬, O, S, Se 또는 NHR' 중 하나 이상으로 개재될 수 있으며, 여기서 R'은 수소, 할로겐, 치환 또는 비치환된 지방족, 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로부터 선택되고;
여기서 R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, OH, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬로부터 선택되거나, 또는 여기서 R1, R2, R3 및 R4 중 2개는 함께 5-8 원 고리를 형성하며, 여기서 고리는 임의로 헤테로원자를 함유하고;
여기서 J는 O, S, NR', CR'R"이며, 각각의 R' 및 R"은 독립적으로 수소, 할로겐, 치환 또는 비치환된 지방족, 아릴 또는 헤테로아릴로부터 선택되고;
여기서 B는 수소, 천연 핵염기, 변형된 핵염기 또는 범용 핵염기로부터 선택되고;
여기서 U2는 부재하거나, 또는 O, S, NR', 또는 CR'R"으로부터 선택되며, 여기서 R' 및 R"은 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클, 또는 치환 또는 비치환된 시클로알킬이고;
여기서 W2는 화학식 II, III 또는 IV에 의해 나타내어진 글루타티온-감수성 모이어티; 수소, 할로겐, OR', SR', NR'R", 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클이며, 여기서 R' 및 R"은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 치환 또는 비치환된 지방족, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클로부터 선택되거나, 또는 함께 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
여기서 I는 부재하거나, 또는 O, S, NR', CR'R"으로부터 선택되며, 여기서 R' 및 R"은 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클 및 치환 또는 비치환된 시클로알킬이고;
여기서 U3은 수소이거나, 또는 O, S, NR' 또는 CR'R"으로부터 선택되며, 여기서 R' 및 R"은 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클 및 치환 또는 비치환된 시클로알킬이고;
여기서 I 및 U3은 조합되어 CR'-CR" 알킬, CR'-CR" 알케닐, CR'-CR" 알키닐, 치환 또는 비치환된 지방족, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클을 형성할 수 있거나, 또는 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클릭 고리를 형성할 수 있고;
여기서 A2는 부재하거나, 수소, 포스페이트 기, 포스페이트 모방체, 포스포르아미데이트, 또는 화학식 II, III 또는 IV에 의해 나타내어진 글루타티온-감수성 모이어티이다.
일부 실시양태에서, A2는 화학식 II, III 또는 IV에 의해 나타내어진 글루타티온-감수성 모이어티이다. 일부 실시양태에서, W2는 화학식 II, III 또는 IV에 의해 나타내어진 글루타티온-감수성 모이어티이다. 일부 실시양태에서, L2는 화학식 II, III 또는 IV에 의해 나타내어진 글루타티온-감수성 모이어티이고, A2도 W2도 화학식 II, III 또는 IV에 의해 나타내어진 글루타티온-감수성 모이어티가 아니다.
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 II에 의해 나타내어진다. 일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IIa에 의해 나타내어진다.
다른 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 III에 의해 나타내어진다. 일부 실시양태에서, 화학식 III은, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IIIa, IIIa(i), IIIb, 또는 IIIb(i)로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 글루타티온-감수성 모이어티는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IV에 의해 나타내어진다. 일부 실시양태에서, 화학식 IV는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IVa, IVb, IVc, IVd, 또는 IVe로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 화학식 IV는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IVa(i), IVb(i), IVb(ii), IVc(i), 또는 IVd(i)로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 화학식 IVe는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IVe(i), IVe(ii), IVe(iii), IVe(iv), IVe(v), IVe(vi), IVe(vii), IVe(viii), IVe(ix), IVe(x), 또는 IV(xi)로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, X는 O이다.
특정 실시양태에서, R1, R2, R3 및 R4는 수소이다.
특정 실시양태에서, J는 O이다.
특정 실시양태에서, B는 천연 핵염기이다.
특정 실시양태에서, U2는 O이다.
특정 실시양태에서, W2는 수소이다.
특정 실시양태에서, U3은 O이다.
특정 실시양태에서, I는 CH2이다.
특정 실시양태에서, A2는 수소 또는 포스페이트 기이다.
특정 실시양태에서, X는 O이고, R1, R2, R3 및 R4는 수소이고, J는 O이다.
특정 실시양태에서, X는 O이고; R1, R2, R3 및 R4는 수소이고; J는 O이고; B는 천연 핵염기이고; U2는 O이고; I는 CH2이고; W2는 수소이고, U3은 O이고; A2는 수소 또는 포스페이트 기이다.
2. 화학식 XII
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 단량체는 하기 화학식에 의해 나타내어진다:
Figure 112019027874923-pct00052
여기서 R10은 히드록실, 포스페이트 모방체, 또는 포스페이트 기이고;
여기서 L은, 상기 기재된 바와 같은, 화학식 II, III 또는 IV로부터 선택되고;
여기서 B는 수소, 천연 핵염기, 변형된 핵염기 또는 범용 핵염기이다.
일부 실시양태에서, L은, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 II에 의해 나타내어진다. 일부 실시양태에서, L은, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IIa에 의해 나타내어진다.
다른 실시양태에서, L은, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 III에 의해 나타내어진다. 일부 실시양태에서, 화학식 III은, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IIIa, IIIa(i), IIIb, 또는 IIIb(i)로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, L은, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IV에 의해 나타내어진다. 일부 실시양태에서, 화학식 IV는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IVa, IVb, IVc, IVd, 또는 IVe로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 화학식 IV는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IVa(i), IVb(i), IVb(ii), IVc(i), 또는 IVd(i)로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 화학식 IVe는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 IVe(i), IVe(ii), IVe(iii), IVe(iv), IVe(v), IVe(vi), IVe(vii), IVe(viii), IVe(ix), IVe(x), 또는 IVe(xi)로부터 선택된다.
C. 보호기
글루타티온-감수성 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 일부 실시양태에서, 보호기는 B, 즉, 천연, 변형된 또는 범용 핵염기에 부착된다. B에 대한 적합한 보호기는 아세틸, 디플루오로아세틸, 트리플루오로아세틸, 이소부티릴, 벤조일, 9-플루오레닐메톡시카르보닐, 페녹시아세틸, 디메틸포름아미딘, 디부틸포름아미딘 및 N, N 디페닐 카르바메이트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 보호기는, 특히 뉴클레오시드 포스포르아미다이트의 경우에, 상기 기재된 뉴클레오시드 내 히드록실 기에 부착된다. 상기 기재된 뉴클레오시드의 히드록실 기에 대한 적합한 보호기는 디메톡시트리틸, 모노메톡시트리틸, 및/또는 트리틸 기를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 고체 상 올리고뉴클레오티드 합성과 적합성인 임의의 보호기를 포함한다. 전형적인 예는 산성 조건 하에 (예를 들어 디클로로아세트산 (DCA), 트리클로로아세트산 (TCA), 트리플루오르아세트산 (TFA) 또는 아세트산의 존재 하에) 용이하게 절단될 수 있는 4,4'-디메톡시트리페닐메틸 (DMTr) 기이다.
다른 전형적인 히드록실 보호기는 트리알킬 실릴 기, 예컨대 tert부틸디메틸실릴 (TBDMS)을 포함한다. TBDMS 기는 합성 사이클 동안에 DMT 기를 제거하기 위해 사용된 산성 조건 하에 안정하지만, RNA 올리고머의 절단 및 탈보호 후에 다양한 방법에 의해, 예를 들어, 테트라히드로푸란 (THF) 중 테트라부틸암모늄 플루오라이드 (TBAF)의 용액으로 또는 트리에틸아민 히드로플루오라이드로 제거될 수 있다. 다른 전형적인 히드록실 보호기는, 예를 들어, 암모늄 플루오라이드로 제거될 수 있는 tert-부틸디페닐실릴 에테르 (TBDPS)를 포함한다.
IV. 핵염기
상기 기재된 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 및 뉴클레오시드에서, B는 천연 핵염기, 변형된 핵염기 또는 범용 핵염기를 나타낸다.
적합한 천연 핵염기는 퓨린 및 피리미딘 염기, 예를 들어 아데닌 (A), 티민 (T), 시토신 (C), 구아닌 (G), 또는 우라실 (U)을 포함한다.
적합한 변형된 핵염기는 디아미노퓨린 및 그의 유도체, 알킬화 퓨린 또는 피리미딘, 아실화 퓨린 또는 피리미딘, 티올화 퓨린 또는 피리미딘 등을 포함한다.
다른 적합한 변형된 핵염기는 퓨린 및 피리미딘의 유사체를 포함한다. 적합한 유사체는 1-메틸아데닌, 2-메틸아데닌, N6-메틸아데닌, N6-이소펜틸아데닌, 2-메틸티오-N6-이소펜틸아데닌, N,N-디메틸아데닌, 8-브로모아데닌, 2-티오시토신, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, 5-에틸시토신, 4-아세틸시토신, 1-메틸구아닌, 2-메틸구아닌, 7-메틸구아닌, 2,2-디메틸구아닌, 8-브로모구아닌, 8-클로로구아닌, 8-아미노구아닌, 8-메틸구아닌, 8-티오구아닌, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-아이오도우라실, 5-에틸우라실, 5-프로필우라실, 5-메톡시우라실, 5-히드록시메틸우라실, 5-(카르복시히드록시메틸)우라실, 5-(메틸아미노메틸)우라실, 5-(카르복시메틸아미노메틸)-우라실, 2-티오우라실, 5-메틸-2-티오우라실, 5-(2-브로모비닐)우라실, 우라실-5-옥시아세트산, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 슈도우라실, 1-메틸슈도우라실, 퀘오신, 하이포크산틴, 크산틴, 2-아미노퓨린, 6-히드록시아미노퓨린, 니트로피롤릴, 니트로인돌릴 및 디플루오로톨릴, 6-티오퓨린 및 2,6-디아미노퓨린 니트로피롤릴, 니트로인돌릴 및 디플루오로톨릴을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
전형적으로 핵염기는 질소함유 염기를 함유한다. 특정 실시양태에서, 핵염기는 질소 원자를 함유하지 않는다. 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 번호 20080274462 참조.
범용 핵염기는 천연 발생 핵산에서 전형적으로 발견되는 염기 중 하나 초과와 쌍형성할 수 있고 이에 따라 듀플렉스에서 이러한 천연 발생 염기를 치환할 수 있는 염기를 지칭한다. 염기는 각각의 천연 발생 염기와 쌍형성할 필요가 없다. 예를 들어, 특정 염기는 단지 또는 선택적으로 퓨린과, 또는 단지 또는 선택적으로 피리미딘과 쌍형성한다. 범용 핵염기는 왓슨-크릭 또는 비-왓슨-크릭 상호작용 (예를 들어, 후그스틴 상호작용)을 통해 수소 결합을 형성함으로써 염기 쌍형성할 수 있다. 대표적인 범용 핵염기는 이노신 및 그의 유도체를 포함한다.
V. 화학식 I-XII에서의 다른 치환기
화학식 I-XII에서, 적절한 경우에, 적합한 지방족 기는 전형적으로 약 2 내지 약 10개의 탄소 원자, 보다 전형적으로 약 2 내지 약 6개의 탄소 원자, 예컨대 약 2 내지 약 5개의 탄소 원자를 함유한다.
화학식 I-XII에서, 적절한 경우에, 적합한 알킬 기는 전형적으로 약 1 내지 약 10개의 탄소 원자, 보다 전형적으로 약 2 내지 약 6개의 탄소 원자, 예컨대 약 2 내지 약 5개의 탄소 원자를 함유한다.
화학식 I-XII에서, 적절한 경우에, 적합한 알콕시 기는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, tert-부톡시, 네오펜톡시 및 n-헥속시 등을 포함한다.
화학식 I-XII에서, 적절한 경우에, 적합한 시클로알킬은 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸 등을 포함한다.
화학식 I-XII에서, 적절한 경우에, 적합한 헤테로원자는 산소, 황, 및 질소를 포함한다. 대표적인 헤테로사이클은 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 및 테트라히드로푸릴을 포함한다. 대표적인 헤테로아릴은 푸라닐, 티에닐, 피리딜, 피롤릴, N-저급 알킬 피롤로, 피리미딜, 피라지닐, 이미다졸릴을 포함한다.
화학식 I-XII에서, 적절한 경우에, 적합한 알케닐 기는 비닐, 알릴, 및 2-메틸-3-헵텐을 포함하고, 적합한 알키닐 기는 프로핀, 및 3-헥신을 포함한다.
화학식 I-XII에서, 적절한 경우에, 적합한 아릴 기는 페닐, 나프틸 등을 포함하는 반면에, 적합한 헤테로아릴 기는 피리딜, 푸라닐, 이미다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 피리미디닐, 티오페닐 또는 티에닐, 퀴놀리닐, 인돌릴, 티아졸릴 등을 포함한다.
화학식 I-XII에서, 적절한 경우에, 적합한 알킬아미노는 -CH2CH2CH2NH- 또는 CH2CH2NH-를 포함한다.
VI. 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법
상기 논의된 바와 같이, 본 출원은 표준, 포스포르아미다이트-기반 올리고뉴클레오티드 합성 방법과 적합성인 글루타티온-감수성 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드를 개시한다.
본 출원에서 기재된 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드는 표준 포스포르아미다이트 방법을 포함한, 관련 기술분야에 알려진 다양한 합성 방법을 사용하여 만들어질 수 있다. 임의의 포스포르아미다이트 합성 방법은 본 발명의 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 포스포르아미다이트는 고체 상 합성 방법에 사용되어 반응성 중간체 포스파이트 화합물을 산출하며, 이는 알려진 방법을 사용하여 후속적으로 산화되어, 전형적으로 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드를 생산한다. 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드 합성은 관련 기술분야에 알려진 방법을 사용하여 어느 한 방향: 5'에서 3'으로 또는 3'에서 5'으로 수행될 수 있다.
이에 따라, 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 글루타티온-감수성 뉴클레오시드 포스포르아미다이트, 예컨대 상기 논의되고, 예를 들어 화학식 VIII, IX, 또는 X에 의해 나타내어진 것들을 사용하여 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법에 관한 것이다. 전형적으로, 예를 들어, 화학식 II, III, 및 IV에 의해 나타내어진 글루타티온-감수성 모이어티를 포함한 글루타티온-감수성 모이어티는 리보스 또는 데옥시리보스 (또는 그의 유사체)의 2'-탄소에 위치하고, 술포닐 기 또는 디술피드 가교를 포함한다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법은 (a) 뉴클레오시드를 공유 연결을 통해 고체 지지체에 부착시키는 단계; (b) 뉴클레오시드 포스포르아미다이트를 단계 (a)의 뉴클레오시드 상의 반응성 히드록실 기에 커플링시켜 그 사이에 뉴클레오티드간 결합을 형성하며, 여기서 고체 지지체 상의 임의의 비커플링된 뉴클레오시드는 캡핑 시약으로 캡핑되는 것인 단계; (c) 상기 뉴클레오시드간 결합을 산화 시약으로 산화시키는 단계; 및 (d) 단계 (b) 내지 (c)를 후속 뉴클레오시드 포스포르아미다이트로 되풀이하여 반복하여, 올리고뉴클레오티드를 형성하는 단계를 포함하며, 여기서 적어도 단계 (a)의 뉴클레오시드, 단계 (b)의 뉴클레오시드 포스포르아미다이트, 또는 단계 (d)의 후속 뉴클레오시드 포스포르아미다이트 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같은 글루타티온-감수성 모이어티를 포함한다. 전형적으로, 커플링, 캡핑/산화 단계 및 임의로, 탈보호 단계는 올리고뉴클레오티드가 목적하는 길이 및/또는 서열에 도달할 때까지 반복되고, 그 후에 고체 지지체로부터 절단된다.
특정 측면에서, 올리고뉴클레오티드는 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하고, 적어도 하나의 글루타티온-감수성 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드 포스포르아미다이트를 사용하는 포스포르아미다이트-기반 올리고뉴클레오티드 합성 방법에 의해 제조된다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 (a) 뉴클레오시드를 공유 연결을 통해 고체 지지체에 부착시키는 단계; (b) 뉴클레오시드 포스포르아미다이트를 단계 (a)의 뉴클레오시드 상의 반응성 히드록실 기에 커플링시켜 그 사이에 뉴클레오티드간 결합을 형성하며, 여기서 고체 지지체 상의 임의의 비커플링된 뉴클레오시드는 캡핑 시약으로 캡핑되는 것인 단계; (c) 상기 뉴클레오시드간 결합을 산화 시약으로 산화시키는 단계; (d) 단계 (b) 내지 (c)를 후속 뉴클레오시드 포스포르아미다이트로 되풀이하여 반복하여 올리고뉴클레오티드를 형성하는 단계; 및 (e) 임의로, 올리고뉴클레오티드를 고체 지지체로부터 절단하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되며, 여기서 적어도 단계 (a)의 뉴클레오시드, 단계 (b)의 뉴클레오시드 포스포르아미다이트, 또는 단계 (d)의 후속 뉴클레오시드 포스포르아미다이트 중 적어도 하나는 글루타티온-감수성 모이어티를 포함한다.
VII. 제약 조성물
본 개시내용은 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드 또는 글루타티온-감수성 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 부형제 및 핵산 억제제 분자의 치료 유효량을 포함하며, 여기서 핵산 억제제 분자는, 본원에 기재된 바와 같은, 글루타티온-감수성 모이어티를 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 곳에서 기재된 바와 같이, 예컨대, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 II, III, 또는 IV에 의해 나타내어진 글루타티온-감수성 모이어티를 포함한 글루타티온-감수성 모이어티는 전형적으로 뉴클레오티드의 당 모이어티의 2'-탄소에 위치하고, 전형적으로 술포닐 기 또는 디술피드 가교를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 부형제 및 핵산 억제제 분자의 치료 유효량을 포함하며, 여기서 핵산 억제제 분자는, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 I, V, VI, 또는 VII에 의해 나타내어진 적어도 하나의 글루타티온-감수성 뉴클레오티드를 포함한다.
다른 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 부형제 및, 예를 들어, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 XI 및 XII에 의해 나타내어진 바와 같은, 글루타티온-감수성 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드의 치료 유효량을 포함한다.
A. 제약상 허용되는 부형제
본 개시내용에 유용한 제약상 허용되는 부형제는 통상적이다. 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)]은 하나 이상의 치료적 조성물의 제약 전달에 적합한 조성물 및 제제를 기재하고 있다. 제약상 허용되는 부형제로서의 역할을 할 수 있는 물질의 일부 예는 하기를 포함한다: 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 그의 유도체, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 맥아; 젤라틴; 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스; 오일, 예컨대 땅콩 오일, 목화씨 오일, 홍화 오일, 참깨 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 대두 오일; 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (등장성 염수; 링거 용액); 에틸 알콜; pH 완충 용액; 폴리올, 예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등; 및 제약 제제에 이용된 다른 비-독성 적합성 물질.
B. 투여 형태
제약 조성물은 통상의 실시에 따라 선택될 수 있는 임의의 의도된 투여 경로를 위한 통상적인 부형제로 제제화될 수 있다.
한 실시양태에서, 제약 조성물은, 본원에 기재된 바와 같은, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드 또는 글루타티온-감수성 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 함유하고, 비경구 투여에 적합하다. 전형적으로, 올리고뉴클레오티드를 함유하는 본 개시내용의 제약 조성물은, 예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내 또는 경막외 주사에 의해 비경구 투여를 위한 액체 형태로 제제화된다. 비경구 투여에 적합한 투여 형태는 전형적으로, 예로서, 멸균 수성 용액, 염수, 저분자량 알콜 예컨대 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 젤라틴, 지방산 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트 등을 포함한 비경구 투여를 위한 하나 이상의 적절한 비히클을 포함한다. 비경구 제제는 당, 알콜, 항산화제, 완충제, 정균제, 제제가 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 되게 만드는 용질, 또는 현탁화제 또는 증점제를 함유할 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 액체 제제는 멸균 주사가능한 용액으로 재구성 시 후속 사용을 위해 동결건조되고 저장될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은, 본원에 기재된 바와 같은, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드 또는 글루타티온-감수성 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 함유하고, 경구 투여에 적합하다. 전형적으로, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 함유하는 본 개시내용의 제약 조성물은 경구 투여를 위해 제제화된다. 경구 투여에 대해 적합한 제약 조성물은 캡슐, 정제, 환제, 로젠지, 카쉐, 당의정, 분말, 과립 등의 형태일 수 있다.
제약 조성물은 또한 널리 알려진 기술을 사용하여 국소 또는 경피 투여, 직장 또는 질 투여, 안구 투여, 비강 투여, 협측 투여, 또는 설하 투여를 포함한 다른 투여 경로를 위해 제제화될 수 있다.
C. 전달 작용제
글루타티온-감수성 핵산 억제제 분자, 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오시드는 예를 들어, 리소솜 및 지질 예컨대 미국 특허 번호 6,815,432, 6,586,410, 6,858,225, 7,811,602, 7,244,448 및 8,158,601에 개시된 것들; 중합체 물질 예컨대 미국 특허 번호 6,835,393, 7,374,778, 7,737,108, 7,718,193, 8,137,695 및 미국 공개 특허 출원 번호 2011/0143434, 2011/0129921, 2011/0123636, 2011/0143435, 2011/0142951, 2012/0021514, 2011/0281934, 2011/0286957 및 2008/0152661에 개시된 것들; 캡시드, 캡소이드, 또는 섭취, 분포 또는 흡수를 보조하는 수용체 표적화된 분자를 포함한, 다른 분자, 분자 구조 또는 화합물의 혼합물과 혼합되거나, 그로 캡슐화되거나, 그와 접합되거나 또는 달리 그와 회합될 수 있다.
특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 핵산 억제제 분자, 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오시드는 지질 나노입자 (LNP)로 제제화된다. 지질-핵산 나노입자는 전형적으로 지질과 핵산을 혼합할 때 자발적으로 형성되어 복합체를 형성한다. 목적하는 입자 크기 분포에 따라, 생성된 나노입자 혼합물은, 예를 들어, 써모배럴 압출기, 예컨대 리펙스(LIPEX)® 압출기 (노던 리피즈, 인크(Northern Lipids, Inc))를 사용하여 폴리카르보네이트 막 (예를 들어, 100 nm 컷-오프)을 통해 임의로 압출될 수 있다. 치료적 용도를 위한 지질 나노입자를 제조하기 위해, 나노 입자를 형성하고/거나, 예를 들어, 투석 또는 접선 흐름 여과에 의해 달성될 수 있는 완충제를 교환하는데 사용된 용매 (예를 들어, 에탄올)를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 핵산 간섭 분자를 함유하는 지질 나노입자를 제조하는 방법은, 예를 들어 미국 공개 특허 출원 번호 2015/0374842 및 2014/0107178에 개시된 바와 같이, 관련 기술분야에 알려져 있다.
특정 실시양태에서, LNP는 양이온성 지질 및 PEG화 지질을 포함하는 지질 코어를 포함한다. LNP는 하나 이상의 외피 지질, 예컨대 양이온성 지질, 구조적 또는 중성적 지질, 스테롤, PEG화 지질, 또는 그의 혼합물을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 관심 조직의 전달을 지시하는 리간드에 공유적으로 접합된다. 많은 이러한 리간드가 조사된 바 있다. 예를 들어, 문헌 [Winkler, Ther. Deliv., 4(7): 791-809 (2013)] 참조. 예를 들어, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 간 내로의 흡수를 지시하는 다중 당 리간드 모이어티 (예를 들어, N-아세틸갈락토사민 (GalNAc))에 접합될 수 있다. 예를 들어, WO 2016/100401 참조. 사용될 수 있는 다른 리간드는 만노스-6-포스페이트, 콜레스테롤, 폴레이트, 트랜스페린, 및 갈락토스를 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (다른 특정한 예시적 리간드에 대하여, 예를 들어, WO 2012/089352 참조). 전형적으로, 올리고뉴클레오티드가 리간드에 접합될 때, 올리고뉴클레오티드는 네이키드 올리고뉴클레오티드로서 투여되며, 여기서 올리고뉴클레오티드는 또한 LNP 또는 다른 보호 코팅으로 제제화되지 않는다. 특정 실시양태에서, 네이키드 올리고뉴클레오티드는 글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 함유하며, 네이키드 올리고뉴클레오티드의 남아있는 뉴클레오티드의 당 모이어티의 2'-위치는 전형적으로 2'-F 또는 2'-OMe로 변형된다.
이들 제약 조성물은 통상적인 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있거나, 또는 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수성 용액은 사용을 위해 그대로, 또는 동결건조시켜 패키징될 수 있고, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 수성 담체와 조합된다. 제제의 pH는 전형적으로 3 내지 11, 보다 바람직하게는 5 내지 9 또는 6 내지 8, 가장 바람직하게는 7 내지 8, 예컨대 7 내지 7.5일 것이다. 고체 형태의 제약 조성물은 각각이 고정량의 상기 언급된 작용제 또는 작용제들을 함유하는 다중 단일 용량 단위로, 예컨대 정제 또는 캡슐의 밀봉 패키지로 패키징될 수 있다. 고체 형태의 제약 조성물은 또한 탄력적인 양을 위한 용기 내에, 예컨대 국소적으로 적용가능한 크림 또는 연고용으로 디자인된 짤 수 있는 튜브 내에 패키징될 수 있다.
본 개시내용의 제약 조성물은 치료적 용도에 적용된다. 이에 따라, 본 개시내용의 한 측면은 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체에게 유효량의 본 개시내용의 제약 조성물을 투여함으로써, 질환 또는 병태를 앓고 있는 인간을 포함하나 이에 제한되지는 않는 상기 대상체를 치료하는데 사용될 수 있는 제약 조성물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 환자의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물의 치료 유효량의 용도를 특색으로 한다.
VIII. 투여/치료의 방법
본원에 기재된 제약 조성물은 전형적으로 경구로 또는 비경구로 투여된다. 본 발명의 글루타티온-감수성 핵산 억제제 분자를 함유하는 제약 조성물은 전형적으로 정맥내로 또는 피하로 투여된다. 본 발명의 글루타티온-감수성 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 함유하는 제약 조성물은 전형적으로 경구로 투여된다. 그러나, 본원에 개시된 제약 조성물은 또한, 예를 들어, 협측, 설하, 직장, 질, 요도내, 국소, 안내, 비강내, 및/또는 내심방을 포함한, 관련 기술분야에 알려진 임의의 방법에 의해 투여될 수 있으며, 투여는 정제, 캡슐, 과립, 수성 현탁액, 겔, 스프레이, 좌제, 살브, 연고 등을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 제약 조성물은 바이러스 감염과 관련된 증상의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에서 바이러스 감염과 관련된 증상의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. 한 실시양태는 대상체에게, 본원에 기재된 바와 같은, 글루타티온-감수성 핵산 억제제 분자, 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오시드의 치료 유효량을 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 바이러스 감염을 치료하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은, 예를 들어, 이전에 기재된 바와 같은, 화학식 XI 및 XII에 의해 나타내어진 바와 같은, 글루타티온-감수성 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 바이러스 감염의 비제한적인 예는 HCV, HBV, HPV, HSV 또는 HIV 감염을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 제약 조성물은 암과 관련된 증상의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에서 암과 관련된 증상의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. 한 실시양태는, 대상체에게, 본원에 기재된 바와 같은, 글루타티온-감수성 핵산 억제제 분자의 치료 유효량을 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이러한 암의 비제한적인 예는 담관암, 방광암, 이행세포 암종, 요로상피 암종, 뇌암, 신경교종, 성상세포종, 유방 암종, 화생 암종, 자궁경부암, 자궁경부 편평세포 암종, 직장암, 결장직장 암종, 결장암, 유전성 비-폴립증 결장직장암, 결장직장 선암종, 위장관 기질 종양 (GIST), 자궁내막 암종, 자궁내막 기질 육종, 식도암, 식도 편평세포 암종, 식도 선암종, 안구 흑색종, 포도막 흑색종, 담낭 암종, 담낭 선암종, 신세포 암종, 투명세포 신세포 암종, 이행세포 암종, 요로상피 암종, 윌름스 종양, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 골수단핵구성 백혈병 (CMML), 간암, 간 암종, 간세포암, 간세포성 암종, 담관암종, 간모세포종, 폐암, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 중피종, B-세포 림프종, 비-호지킨 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 외투세포 림프종, T-세포 림프종, 비-호지킨 림프종, 전구체 T-림프모구성 림프종/백혈병, 말초 T-세포 림프종, 다발성 골수종, 비인두 암종 (NPC), 신경모세포종, 구인두암, 구강 편평세포 암종, 골육종, 난소 암종, 췌장암, 췌장관 선암종, 가유두상 신생물, 선방세포 암종, 전립선암, 전립선 선암종, 피부암, 흑색종, 악성 흑색종, 피부 흑색종, 소장 암종, 위암, 위 암종, 위장관 기질 종양 (GIST), 자궁암, 또는 자궁 육종을 포함한다. 전형적으로, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물의 치료 유효량을 투여함으로써 간암, 간 암종, 간세포암, 간세포성 암종, 담관암종 및 간모세포종을 치료하는 방법을 특색으로 한다.
특정 실시양태에서 본원에 개시된 제약 조성물은 증식성, 염증성, 자가면역, 신경학적, 안구, 호흡, 대사, 피부과적, 청각, 간, 신장, 또는 감염성 질환과 관련된 증상의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. 한 실시양태는 대상체에게, 본원에 기재된 바와 같은, 글루타티온-감수성 핵산 억제제 분자의 치료 유효량을 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 증식성, 염증성, 자가면역, 신경학적, 안구, 호흡, 대사, 피부과적, 청각, 간, 신장, 또는 감염성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 전형적으로, 질환 또는 병태는 간의 질환이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 표적 유전자의 발현의 감소를 필요로 하는 대상체에게 제약 조성물을 표적 유전자의 발현을 감소시키기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 표적 유전자의 발현을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 제약 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 글루타티온-감수성 핵산 억제제 분자 및 또한 본원에 기재된 바와 같은 제약상 허용되는 부형제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 핵산 억제제 분자는 ssRNAi 억제제 분자 또는 dsRNAi 억제제 분자를 포함한, 본원에 기재된 바와 같은 RNAi 억제제 분자이다.
표적 유전자는 임의의 포유동물로부터의 표적 유전자, 예컨대 인간 표적 유전자일 수 있다. 임의의 유전자는 본 발명의 방법에 따라 침묵될 수 있다. 예시적인 표적 유전자는 인자 VII, Eg5, PCSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, HBV, HCV, RSV, PDGF 베타 유전자, Erb-B 유전자, Src 유전자, CRK 유전자, GRB2 유전자, RAS 유전자, MEKK 유전자, JNK 유전자, RAF 유전자, Erk1/2 유전자, PCNA(p21) 유전자, MYB 유전자, JUN 유전자, FOS 유전자, BCL-2 유전자, 시클린 D 유전자, VEGF 유전자, EGFR 유전자, 시클린 A 유전자, 시클린 E 유전자, WNT-1 유전자, 베타-카테닌 유전자, c-MET 유전자, PKC 유전자, NFKB 유전자, STAT3 유전자, 서바이빈 유전자, Her2/Neu 유전자, 토포이소머라제 I 유전자, 토포이소머라제 II 알파 유전자, p73 유전자, p21(WAF1/CIP1) 유전자, p27(KIP1) 유전자, PPM1D 유전자, RAS 유전자, 카베올린 I 유전자, MIB I 유전자, MTAI 유전자, M68 유전자, 종양 억제 유전자에서의 돌연변이, p53 종양 억제 유전자, LDHA, 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서 글루타티온-감수성 핵산 억제제 분자는 표적 유전자를 침묵시키고, 이에 따라 표적 유전자의 원치 않는 발현을 특징으로 하는 장애를 갖거나 또는 그의 위험이 있는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 글루타티온-감수성 핵산 억제제 분자는 베타-카테닌 유전자를 침묵시키고, 이에 따라 원치 않는 베타-카테닌 발현을 특징으로 하는 장애, 예를 들어, 선암종 또는 간세포성 암종을 갖거나 또는 그의 위험이 있는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 전신 투여를 통해 (예컨대 정맥내 또는 피하 투여를 통해) 대상체 또는 유기체에서의 적절한 조직 또는 세포, 예컨대 간에 전달된다. 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 국부 투여 또는 전신 투여를 통해 전달된다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 국부 투여를 통해 적절한 조직 또는 세포, 예컨대 폐 세포 및 조직에, 예컨대 폐 전달을 통해 전달된다.
본원에 개시된 화합물의 치료 유효량은 투여 경로 및 환자의 물리적 특징, 예컨대 대상체의 크기 및 체중, 질환 진행 또는 침투의 정도, 대상체의 연령, 건강, 및 성별에 의존할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 치료 유효량은 치료되는 환자의 질환 또는 병태 증상을 예방하거나, 완화하거나, 또는 호전시키는데 효과적인 화합물 또는 화합물들의 양을 의미한다.
특정 실시양태에서, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드는 1일에 수용자의 킬로그램 체중당 20 마이크로그램 내지 10 밀리그램, 킬로그램당 100 마이크로그램 내지 5 밀리그램, 킬로그램당 0.25 밀리그램 내지 2.0 밀리그램, 또는 킬로그램당 0.5 내지 2.0 밀리그램의 투여량으로 투여된다.
본 개시내용의 제약 조성물은 매일, 또는 간헐적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 화합물의 간헐적 투여는 1주에 1 내지 6일, 1개월에 1 내지 6일, 매주 1회, 격주마다 1회, 매월 1회, 격월마다 1회, 또는 연간 1회 또는 2회 투여일 수 있거나, 또는 다중의 매년, 매월, 매주, 또는 매일 용량으로 분할될 수 있다. 일부 실시양태에서, 간헐적 투여는 사이클 (예를 들어, 1일, 1주 또는 연속 2 내지 8주 동안 매일 투여, 이어서 최대 1주, 최대 1개월, 최대 2개월, 최대 3개월, 또는 최대 6개월 또는 그 초과 동안 투여 없이 휴지 기간)에서의 투여를 의미할 수 있거나, 또는 이는 격일, 격주, 격월 또는 격년으로의 투여를 의미할 수 있다.
본 발명의 임의의 치료 방법에서, 화합물은 대상체에게 단독으로 단독요법으로서 또는 관련 기술분야에 알려진 추가의 요법과 조합하여 투여될 수 있다.
실시예
실시예 1. 글루타티온-감수성 화합물의 합성
모든 비-가수분해성 반응은, 달리 나타내지 않는 한, 시그마-알드리치 코포레이션(Sigma-Aldrich Corporation) (미주리주 세인트 루이스)으로부터 구입한 건조 용매에서 수행하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)는, 아미다이트를 제외하고는, 달리 동일한 조건 하에 개질제로서 포름산암모늄 (3 밀리몰)을 이용하는 애질런트 조르박스(Agilent ZORBAX)® 이클립스 플러스 (애질런트 테크놀로지스 캄파니(Agilent Technologies Company), 캘리포니아주 산타 클라라) C18, 21 x 50 밀리미터 (mm), 1.8 마이크로미터 칼럼, 100 x 4.6 mm, 2.7 마이크로미터 칼럼을 사용하여 60℃에서 수행하였다. UV 트레이스는 220 나노미터 (nm)에서 기록하였고, 질량 스펙트럼은 애질런트 테크놀로지스 6140 사중극자 LC/MS 질량 분광계를 양성 및 음성 이온 모드 둘 다로 사용하여 수득하였다. 정제용 정제는 사전-패킹된 칼럼 (텔레다인 이스코, 인크.(Teledyne Isco, Inc.), 네브래스카주 링컨)을 사용하여 텔레다인 이스코 콤비플래쉬(Teledyne Isco COMBIFLASH)® Rf 상의 구배 크로마토그래피에 의해 수행하였다. NMR 스펙트럼은 배리안 유니티(Varian UNITY)® 600, 500 또는 400 분광계, 배리안 인크.(Varian, Inc.) (캘리포니아주 팔로 알토) 상에 기록하였다.
화합물 8b
하기 반응식 1은 디술피드 가교를 포함하는 글루타티온-감수성 화합물: (2R,3R,4R,5R)-5-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-4-(((2 시아노에틸)(디이소프로필아미노)포스피노)옥시)-2-(2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)테트라히드로푸란-3-일 (2-(tert-부틸디술파닐)페닐)카르바메이트 (화합물 8b)의 합성을 도시한다. 화합물 8b의 글루타티온-감수성 모이어티는 화학식 IVe에 의해 포괄되고, 보다 구체적으로는 화학식 IVe(ix)에 의해 나타내어진다. 이러한 화합물을 제조하는 실행가능성을 입증하기 위해, 8개 뉴클레오티드를 갖는 단순 모델 올리고머를 합성하였다. 주요 중간체인 포스포르아미다이트 8b를 하기 반응식에 제시된 절차에 따라 합성하였다. 간략하게, 상업적으로 입수가능한 tert 부틸 티올을 활성화된 티오술포네이트 2b로 전환시키고, 이를 후속적으로 2-아미노티오페놀과 반응시켜 디술피드 화합물 4b를 수득하였다. 4b 화합물을 다음에 트리포스겐으로 처리하여 이소시아네이트 중간체 5b를 발생시켰다. 이전 단리 없이, 이소시아네이트 5b 화합물을 5'-디메톡시트리틸 (DMtr)-보호된 우리딘과 "계내 반응시켜 2',3'-보호된 카르바메이트의 혼합물을 수득하였다. 본 발명자들은 크로마토그래피 정제 동안에 2'-위치에서 3'-위치로의 카르바메이트의 이동을 관찰하였다. 이러한 목적하지 않는 이동을 피하기 위해, 1% 피리딘 용액을 실리카 겔 정제 동안에 사용하였다. 목적하지 않는 이성질체의 분리 후에, 화합물 7b를, 합성된 포스포르아미다이트와 전형적으로 사용된 바와 같은, 아인산화 조건에 적용하였다. 이어서 화합물 8b를 표준 시아노에틸 기-함유 포스포르아미다이트의 정제 동안에 통상적으로 사용된 바와 같은 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 화합물 8b는 표준 포스포르아미다이트 화합물과 안정성을 포함한 유사한 생리화학적 거동을 나타내었다.
Figure 112019027874923-pct00053
S-tert-부틸 메탄술포노티오에이트 (2b)의 합성
건조 피리딘 (100 mL, Ald. 무수) 중 tert-부틸티올 (1b) (20 그램 (g), 0.22 몰 (mol), 1 당량 (equiv.) 알데히드 (Ald.))의 용액에 메탄술포닐 클로라이드 (17.1 밀리리터 (mL), 0.22 mol, Ald.)를 적가하였다. 반응물을 실온에서 교반하고, 박층 크로마토그래피 (TLC): 헥산:EtOAc = 6:1에 의해 모니터링하고; 포스포몰리브데넘산 (PMA), 지연 인자 (Rf) = 0.44로 가시화하였다. 하룻밤 후에, 반응을 완결하고, 반응물을 Et2O로 희석하고, 이어서 4N HCl로 산성화하였다. 수성 상을 Et2O로 추출하고, 분리하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 로터리 이바포레이터 (회전증발기)로 농축시킨 후에, 조 생성물을 이스코 크로마토그래피 (이스코 레디셉(ISCO REDISEP)® (텔레다인 이스코, 인크), 330 g)에 의해 정제하고, 헥산 중 0%에서 100%로의 EtOAc로 용리하였다 (UV: 254 nm, 280 nm에 의해 모니터링함). 목적하는 분획을 조합하고 증발시켜 무색 오일의 2b (20 g, 53%)를 수득하였으며; 양성자 핵 자기 공명 (1H NMR) (300 메가헤르츠 (MHz), 클로로포름-d (CDCl3) 스펙트럼은 하기와 같다: 3.33 (s, 3H), 1.58 (s, 9H)).
2-(tert-부틸디술파닐)아닐린 (4b)의 합성
MeOH (200 mL, Ald. 무수) 중 오르토-아미노벤젠티올 (3)(12.8 mL, 0.12 mol, 1 equiv. 아크로스(Acros))의 용액에 S-tert-부틸 메탄술포노티오에이트 2b (20 g, 0.12 mol, 1 equiv.)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 N2 하에 교반하였다. 반응물을 TLC 및 질량 분광측정법 (MS): 헥산:EtOAc = 6:1에 의해 모니터링하고; PMA, Rf = 0.68; MS 대기압 화학적 이온화 (APCI) [M+1]: 214.0 (100%)로 가시화하였다. 2시간 후에, 반응을 완결하고, 회전증발기에 의해 농축시켰다. 조 생성물을 이스코 크로마토그래피 (이스코 레디셉®, 330 g)에 의해 정제하고, 헥산 중 0%에서 100%로의 EtOAc로 용리하였다 (UV: 254 nm, 280 nm에 의해 모니터링함). 목적하는 분획을 조합하고 증발시켜 무색 오일의 4b (25 g, 98%)를 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) 스펙트럼은 하기와 같다: 7.50 (dd, J = 7.68, 1.38 Hz, 1H), 7.09 (td, J = 7.41, 1.38 Hz, 1H), 6.67 (m, 2H), 1.34 (s, 9H). MS: (APCI+) M+1 = 214.0.
1-(tert-부틸)-2-(2-이소시아네이토페닐)디술판 (5b)의 합성
0℃ 빙수조 하에, CH2Cl2 (500 mL, Ald. 무수) 중 2-(tert-부틸디술파닐)아닐린 (4b) (10 g, 46.8 mmol, 1 equiv.)의 용액에 트리포스겐 (13.9 g, 46.8 mmol, 1 equiv, 아크로스)을 첨가하고, 이어서 Et3N (65.3 mL, 0.46 mol, 10 equiv, Ald. 무수)을 첨가하고, 반응물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응물을 회전증발기에 의해 농축시키고 (수조: 실온), 수득한 조 고체를 후속 단계에 직접 사용하였다.
(2R,3R,4R,5R)-5-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-2-(2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-4-히드록시테트라히드로푸란-3-일 (2-(tert-부틸디술파닐)페닐)카르바메이트 (7b)의 합성
0℃ 빙수조 하에, CH2Cl2 (500 mL, Ald. 무수) 중 조 1-(tert-부틸)-2-(2-이소시아네이토페닐)디술판 (5b) (조, 2 equiv.)의 용액에 1-((2R,3R,4S,5R)-5-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-3,4-디히드록시테트라히드로푸란-2-일)피리미딘-2,4(1H,3H)-디온 6 (13 g, 23.78 mmol, 1 equiv, 카르보신트(carbosynth))을 첨가하고, 반응물을 0℃ 내지 실온으로 하면서 1.5시간 동안 교반하였다. 반응물을 TLC, 헥산:EtOAc = 1:2에 의해 모니터링하고; PMA로 가시화하였다. TLC는 생성물 7b (Rf = 0.38) 뿐만 아니라 7b' (위치이성질체, Rf = 0.19) 및 7b" (디카르바메이트, Rf = 0.61)를 제시하였다. 1.5시간 후에, 반응물을 농축시키고, EtOAc (100 mL)와 혼합하고, 불용성 염을 여과하였다. 여과물을 EtOAc (500 mL)로 희석하고, 포화 NaHCO3, H2O, 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 회전증발기에 의한 농축 후에, 조 생성물을 사전-평형시킨 실리카-겔 칼럼 상에 로딩하고, 이스코 크로마토그래피 (이스코 레디셉®, 120 g, 0.5% 피리딘/헥산으로 사전-평형시킴)1에 의해 정제하고, 헥산 중 0%에서 100%로의 EtOAc로 용리하였다 (UV: 254 nm, 280 nm에 의해 모니터링함). 목적하는 분획을 조합하고 증발시켜 94%의 순도 (HPLC)를 갖는 무색 발포체 2.6 g의 7b (14%)를 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 스펙트럼은 하기와 같다: 11.42 (s, 1H), 9.38 (s, 1H), 7.72 (m, 2H), 7.24 - 7.38 (m, 13H), 6.88 - 6.91 (m, 4H), 6.01 (d, J = 4.95 Hz, 1H), 5.70 (d, J = 5.79 Hz, 1H), 5.37 (dd, J = 7.95, 2.19 Hz, 1H), 5.30 (t, J = 3.09 Hz, 1H), 4.41 (dd, J = 11.01, 5.49 Hz, 1H), 3.73 (s, 6H), 3.21 - 3.30 (m, 2H), 1.21 (s, 9H). MS: (APCI-) M-1 = 784.2.
(단계 5): (2R,3R,4R,5R)-5-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-4-(((2-시아노에틸)(디이소프로필아미노)포스피노)옥시)-2-(2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)테트라히드로푸란-3-일 (2-(tert-부틸디술파닐)페닐)카르바메이트 (8b)의 합성
CH2Cl2 (40 mL, Ald. 무수) 중 (2R,3R,4R,5R)-5-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-2-(2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-4-히드록시테트라히드로푸란-3-일 (2-(tert-부틸디술파닐)페닐)카르바메이트 (7b) (1.6 g, 2.03 mmol, 1 equiv.)의 용액에 피리딘 (0.16 mL, 2.03 mmol, 1 equiv, Ald. 무수) 및 5-(에틸티오)-1H-테트라졸 (265 mg, 2.03 mmol, 1 equiv, Ald.)을 실온에서 N2 하에 첨가하였다. 이어서, O-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필 포스포로디아미다이트 (674.9mg, 2.23 mmol, 1.1 equiv, 켐진스 코포레이션(ChemGenes Corporation), 매사추세츠주 윌밍톤)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 교반하고, TLC: 헥산:EtOAc = 1:2에 의해 모니터링하고; PMA, Rf = 0.51로 가시화하였다. 2시간 후에, 반응을 완결하고, 반응물을 CH2Cl2 (400 mL)로 희석하고, 포화 (sat.) NaHCO3, H2O, 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 회전증발기에 의한 농축 후에, 조 생성물은 사전-평형시킨 실리카-겔 칼럼 상에 로딩하고, 이스코 크로마토그래피 (이스코 레디셉®, 40 g, 헥산 중 1.0% Et3N으로 사전-평형시킴)에 의해 정제하고, 헥산 중 0%에서 100%로의 EtOAc (1% Et3N)로 용리하였다 (UV: 254 nm, 280 nm에 의해 모니터링함). 목적하는 분획을 조합하고 증발시켜 97%의 순도 (HPLC)를 갖는 무색 발포체 1.6 g의 8b (77%)를 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 스펙트럼은 하기와 같다: 11.47 (s, 1H), 9.45 (m, 1H), 7.74 (m, 2H), 7.25 - 7.38 (m, 13H), 6.87 - 6.90 (m, 4H), 6.02 (m, 1H), 5.40 - 5.49 (m, 2H), 4.62 (m, 1H), 4.21 (m, 1H), 3.73 (s, 6H), 3.48 - 3.65 (m, 4H), 3.32 (m, 1H), 2.73 (m, 1H), 2.62 (t, J = 6.3 Hz, 1H), 1.19 (s, 9H), 0.94 - 1.12 (m, 12H). 31P NMR (161 MHz, DMSO-d6) 150.44, 150.08. MS: (APCI-) M-1 = 984.4.
화합물 8d
하기 반응식 3은 디술피드 가교를 포함하는 글루타티온-감수성 화합물: (2R,3R,4R,5R)-5-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-4-(((2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스피노)옥시)-2-(2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)테트라히드로푸란-3-일 (2-((tert-부틸디술파닐)메틸)페닐)카르바메이트 (화합물 8d)의 합성을 도시한다. 화합물 8d의 글루타티온-감수성 모이어티는 화학식 IVe에 의해 포괄되고, 보다 구체적으로는 화학식 IVe(ii)에 의해 나타내어진다. 뉴클레오시드 포스포르아미다이트 8d는 8b의 합성에 대해 기재된 유사한 절차를 따름으로써 합성하였다. 간략하게, 상업적으로 입수가능한 2-아미노 벤질 알콜을 Boc 기로 일시적으로 보호하여 1d-2를 수득하였다. 티오아세트산의 존재 하의 1d-2의 미츠노부 반응으로 티오에스테르 중간체 1d-2를 수득하였다. 티오에스테르를 NaOMe/MeOH로 선택적 가수분해하고 이어서 S-tert-부틸 메탄술포노티오에이트로 처리하여 화합물 3d를 수득하였다. 트리플루오르아세트산 (TFA)으로의 Boc 탈보호 후에, 4d를 이소시아네이트 중간체 5d로 전환시키고, 5'-디메톡시트리페닐메틸 (DMTr)-보호된 우리딘과 "계내" 반응시켜 2'- 및 3'-보호된 카르바메이트 7d 및 7d'의 혼합물을 수득하였다. 칼럼 크로마토그래피 분리 후에, 7d를 아인산화시켜 요구된 포스포르아미다이트 8d를 무색 발포체로서 50% 수율로 수득하였다.
Figure 112019027874923-pct00054
(단계 1): tert-부틸 (2-(히드록시메틸)페닐)카르바메이트 (1d-1)의 합성
테트라히드로푸란 (THF) (200 mL, Ald. 무수) 중 (2-아미노페닐)메탄올 (1d) (10 g, 81.2 mmol, 1 equiv. Ald.)의 용액에 Boc2O (18.6 g, 85.2 mmol, 1.1 equiv. 에이케이 사이언티픽(AK scientific))를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 교반하고, TLC: 헥산:EtOAc = 6:1에 의해 모니터링하고, PMA, Rf = 0.2로 가시화하였다. 하룻밤 후에, 반응을 완결하고, 반응물을 EtOAc (500 mL)로 희석하고, 포화 NaHCO3, H2O, 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 회전증발기에 의한 농축 후에, 조 생성물을 이스코 크로마토그래피 (이스코 레디셉®, 220 g)에 의해 정제하고, 헥산 중 0%에서 100%로의 EtOAc로 용리하였다 (UV: 254 nm, 280 nm에 의해 모니터링함). 목적하는 분획을 조합하고 증발시켜 무색 발포체 15 g의 1d-1 (82%)을 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) 스펙트럼은 하기와 같다: 7.90 (d, J = 7.98 Hz, 1H), 7.61 (s, 1H), 7.30 (t, J = 7.68 Hz, 1H), 7.16 (d, J = 7.41 Hz, 1H), 7.00 (t, J = 7.41 Hz, 1H), 4.68 (s, 2H), 1.51 (s, 9H).
(단계 2): S-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)벤질 에탄티오에이트 (1d-2)의 합성
THF (300 mL) 중 Ph3P (23.6 g, 90.3 mmol, 2.1 equiv. Ald.)의 용액에 0℃에서 디이소프로필 아조디카르복실레이트 (DIAD) (17.7 mL, 90.3 mmol, 2.1 equiv. Ald.)를 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 교반하였다. THF (100 mL) 중 tert-부틸 (2-(히드록시메틸)페닐)카르바메이트 (1d-1) (9.6 g, 43 mmol, 1 equiv.) 및 티오아세트산 (6.3 mL, 90.3 mmol, 2.1 equiv. Ald.)의 혼합물을 상기 반응 혼합물에 적가하였다. 반응물을 실온으로 가온하도록 하면서 교반하고, TLC: 헥산:EtOAc = 6:1에 의해 모니터링하고, PMA, Rf = 0.47로 가시화하였다. 하룻밤 후에, 혼합물을 EtOAc (500 mL)로 희석하고, sat. NaHCO3, H2O, 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 회전증발기에 의한 농축 후에, 조 생성물을 이스코 크로마토그래피 (이스코 레디셉®, 220 g)에 의해 정제하고, 헥산 중 0%에서 100%로의 EtOAc로 용리하였다 (UV: 254 nm, 280 nm에 의해 모니터링함). 목적하는 분획을 조합하고 증발시켜 무색 발포체 10 g의 1d-2 (88%)를 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 스펙트럼은 하기와 같다: 8.64 (s, 1H), 7.19 - 7.30 (m, 3H), 7.05 (t, J = 7.41 Hz, 1H), 4.10 (s, 2H), 2.28 (s, 3H), 1.41 (s, 9H).
(단계 3): tert-부틸 (2-(메르캅토메틸)페닐)카르바메이트 (1d-3)의 합성
MeOH (200 mL) 중 S-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)벤질 에탄티오에이트 (1d-2) (11.8 g, 41.9 mmol, 1 equiv.)의 용액에 NaOMe (2.2 g, 41.9 mmol, 1 equiv. Ald.)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 교반하고, TLC: 헥산:EtOAc = 6:1에 의해 모니터링하고, PMA, Rf = 0.5로 가시화하였다. 2시간 후에, 반응을 완결하고, 1N HCl로 pH ~6까지 산성화하고, 이어서 회전증발기에 의해 농축시켰다. 조 생성물을 EtOAc (500 mL)에 용해시키고, H2O, 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 농축 후에, 조 생성물 1d-3을 후속 단계에 직접 사용하였다.
(단계 4): 2-((tert-부틸디술파닐)메틸)아닐린 (3d)의 합성
MeOH (200 mL, Ald. 무수) 중 tert-부틸 (2-(메르캅토메틸)페닐)카르바메이트 (1d-3)(10 g, 41.9 mmol, 1 equiv.)의 용액에 S-tert-부틸 메탄술포노티오에이트 2b (9.2 g, 54.5 mmol, 1.3 equiv.)를 첨가하고, 이어서 Et3N (17.5 mL, 125.8 mmol, 3 equiv. Ald, 무수)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 N2 하에 교반하고, TLC: 헥산:EtOAc = 6:1에 의해 모니터링하고, PMA, Rf = 0.6으로 가시화하였다. 2시간 후에, 반응을 완결하고, 회전증발기에 의해 농축시켰다. 조 생성물을 이스코 크로마토그래피 (이스코 레디셉®, 80 g)에 의해 정제하고, 헥산 중 0%에서 100%로의 EtOAc로 용리하였다 (UV: 254 nm, 280 nm에 의해 모니터링함). 목적하는 분획을 조합하고 증발시켜 백색 고체의 3d (5.8 g, 42%)를 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 스펙트럼은 하기와 같다: 8.62 (s, 1H), 7.19 - 7.30 (m, 3H), 7.05 (t, J = 7.41 Hz, 1H), 4.02 (s, 2H), 1.41 (s, 9H), 1.21 (s, 9H).
(단계 5): 2-((tert-부틸디술파닐)메틸)아닐린 (4d)의 합성
2-((tert-부틸디술파닐)메틸)아닐린 (3d) (3 g, 9.16 mmol, 1 equiv.)을 TFA/CH2Cl2 (15 mL/45mL)의 혼합물 용액에 첨가하고, 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응물을 회전증발기에 의해 농축시키고 (수조: 실온), 수득한 조 생성물 4d를 후속 단계에 직접 사용하였다.
(단계 6): 1-(tert-부틸)-2-(2-이소시아네이토벤질)디술판 (5d)의 합성
0℃ 빙수조 하에, CH2Cl2 (100 mL, Ald. 무수) 중 2-((tert-부틸디술파닐)메틸)아닐린 (4d) (조, 2 g, 8.8 mmol, 1 equiv.)의 용액에 트리포스겐 (2.6 g, 8.8 mmol, 1 equiv., 아크로스)을 첨가하고, 이어서 Et3N (12.3 mL, 0.09 mol, 10 equiv., Ald. 무수)을 첨가하고, 반응물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응물을 회전증발기에 의해 농축시키고 (수조: 실온), 수득한 조 고체 5d를 후속 단계에 직접 사용하였다.
(단계 7): (2R,3R,4R,5R)-5-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-2-(2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-4-히드록시테트라히드로푸란-3-일 (2-((tert-부틸디술파닐)메틸)페닐)카르바메이트 (7d)의 합성
0℃ 빙수조 하에, CH2Cl2 (100 mL, Ald. 무수) 중 조 1-(tert-부틸)-2-(2-이소시아네이토벤질)디술판 (5d) (조, 2 equiv.)의 용액에 1-((2R,3R,4S,5R)-5-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-3,4-디히드록시테트라히드로푸란-2-일)피리미딘-2,4(1H,3H)-디온 6 (2.4 g, 4.39 mmol, 1 equiv, 카르보신트)을 첨가하고, 반응물을 0℃ 내지 실온으로 하면서 교반하였다. 반응물을 TLC, 헥산:EtOAc = 1:4에 의해 모니터링하고, PMA로 가시화하였다. TLC는 생성물 7d (Rf = 0.35) 뿐만 아니라 7d' (위치이성질체, Rf = 0.18) 및 7d" (디카르바메이트, Rf = 0.71)을 제시하였다. 하룻밤 후에, 반응물을 농축시키고, EtOAc (100 mL)와 혼합하고, 불용성 염을 여과하였다. 여과액을 EtOAc (500 mL)로 희석하고, sat. NaHCO3, H2O, 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 회전증발기에 의한 농축 후에, 조 생성물을 사전-평형시킨 실리카-겔 칼럼 상에 로딩하고, 이스코 크로마토그래피 (이스코 레디셉®, 80 g, 0.5% 피리딘/헥산으로 사전-평형시킴) 1 에 의해 정제하고, 헥산 중 0%에서 100%로의 EtOAc로 용리하였다 (UV: 254 nm, 280 nm에 의해 모니터링함). 목적하는 분획을 조합하고 증발시켜 79.3%의 순도 (HPLC) 2, 3 를 갖는 무색 발포체 339 mg의 7d (10%)를 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 스펙트럼은 하기와 같다: 11.45 (s, 1H), 9.27(s, 1H), 7.73 (d, J = 8.25 Hz, 1H), 7.23 - 7.40 (m, 13H), 6.88 - 6.96 (m, 4H), 6.04 (d, J = 4.65 Hz, 1H), 5.72 (d, J = 5.49 Hz, 1H), 5.38 (d, J = 7.98 Hz, 1H), 5.26 (t, J = 5.22 Hz, 1H), 4.45 (dd, J = 10.44, 5.22 Hz, 1H), 4.05 (m, 1H), 3.72 (s, 6H), 3.32 (m, 1H), 3.26 (m, 1H), 1.21 (s, 9H).
(단계 8): (2R,3R,4R,5R)-5-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-4-(((2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스피노)옥시)-2-(2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)테트라히드로푸란-3-일 (2-((tert-부틸디술파닐)메틸)페닐)카르바메이트 (8d)의 합성
CH2Cl2 (10 mL, Ald. 무수) 중 (2R,3R,4R,5R)-5-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-2-(2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-4-히드록시테트라히드로푸란-3-일 (2-((tert-부틸디술파닐)메틸)페닐)카르바메이트 (7d) (239 mg, 0.30 mmol, 1 equiv)의 용액에 피리딘 (0.02 mL, 0.30 mmol, 1 equiv, Ald. 무수) 및 5-(에틸티오)-1H-테트라졸 (38.9 mg, 0.30 mmol, 1 equiv, 콤비-블록스(Combi-Blocks))을 실온에서 N2 1 하에 첨가하였다. 이어서, O-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필 포스포로디아미다이트 (99.1 mg, 0.33 mmol, 1.1 equiv, 켐진스 코포레이션)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 교반하고, TLC: 헥산:EtOAc = 1:4에 의해 모니터링하고, PMA, Rf = 0.69로 가시화하였다. 6시간 후에, 반응은 예상 생성물을 주요 스폿으로서 제시하였고, 반응물을 CH2Cl2 (200 mL)로 희석하고, sat. NaHCO3, H2O, 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 회전증발기에 의한 농축 후에, 조 생성물을 사전-평형시킨 실리카-겔 칼럼 상에 로딩하고, 이스코 크로마토그래피 (이스코 레디셉®, 24 g, 헥산 중 1.0% Et3N으로 사전-평형시킴)에 의해 정제하고, 헥산 (1% Et3N) 중 0%에서 100%로의 EtOAc로 용리하였다 (UV: 254 nm, 280 nm에 의해 모니터링함). 목적하는 분획을 조합하고 증발시켜 94.4%의 순도 (HPLC) 2 를 갖는 무색 발포체 151 mg의 8d (50%)를 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 스펙트럼은 하기와 같다: 11.49 (s, 1H), 9.41 (m, 1H), 7.71 (m, 1H), 7.13 - 7.40 (m, 14H), 6.87 - 6.90 (m, 4H), 6.05 (m, 1H), 5.41 - 5.45 (m, 2H), 4.68 (m, 1H), 4.25 (m, 1H), 4.08 (m, 1H), 3.98 (m, 1H), 3.72 (s, 6H), 3.52 - 3.65 (m, 4H), 3.34 (m, 1H), 2.63 (m, 1H), 2.53 (m, 1H), 1.21 (s, 9H), 0.96 - 1.12 (m, 12H). 31P NMR (161 MHz, DMSO-d6) 150.45, 150.34. MS: (APCI-) M-1 = 999.4.
화합물 8h
하기 반응식 4는 디술피드를 포함하는 글루타티온-감수성 화합물 (화합물 8h): 에틸 N-((((2R,3R,4R,5R)-5-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-4-(((2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)프로파닐)옥시)-2-(2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)테트라히드로푸란-3-일)옥시)카르보닐)-S-(tert-부틸티오)-L-시스테이네이트의 합성을 도시한다. 화합물 8h의 글루타티온-감수성 모이어티는 화학식 IVd에 의해 포괄되고, 보다 구체적으로는 화학식 IVd(i)에 의해 나타내어진다.
Figure 112019027874923-pct00055
화합물 8i
하기 반응식 5는 술폰을 포함하는 글루타티온-감수성 화합물 (화합물 8i): (2R,3R,4R,5R)-5-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-4-(((2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스파닐)옥시)-2-(2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)테트라히드로푸란-3-일 (2-(페닐술폰아미도)에틸)카르바메이트의 합성을 도시한다. 화합물 8i의 글루타티온-감수성 모이어티는 화학식 IVb에 의해 포괄되고, 보다 구체적으로는 화학식 IVb(ii)에 의해 나타내어지며, 여기서 R은 수소이다.
Figure 112019027874923-pct00056
실시예 2. 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드의 합성
올리고뉴클레오티드를 상업적 올리고 합성기 상에서 합성하였다. 시험 화합물 1 및 2 (도 1b)를 2'-변형된 뉴클레오시드 포스포르아미다이트 즉, 2'-F 및 2'-OMe 변형된 뉴클레오시드 포스포르아미다이트, 및 2'-글루타티온-감수성 뉴클레오시드 포스포르아미다이트를 사용하여 합성하였다. 시험 화합물 1 및 2는 2'-탄소에서의 가역적, 글루타티온-감수성 변형을 갖는 하나의 뉴클레오티드를 함유하는 반면에, 남아있는 뉴클레오티드는 비가역적 2'-F 또는 2'-OMe 변형을 함유하였다.
올리고뉴클레오티드 합성을 고체 지지체 상에서 3'에서 5' 방향으로 수행하였다. 표준 올리고뉴클레오티드 합성 프로토콜을 이용하였다. 커플링 시간은 활성화제로서 5-에틸티오-1H-테트라졸 (ETT)을 사용하여 300초였다. 아이오딘 용액을 포스파이트 트리에스테르 산화에 사용하였다. 합성된 올리고뉴클레오티드를 진한 수성 암모늄으로 55℃에서 10시간 동안 처리하였다. 현탁액 중 암모니아의 제거 후에, CPG를 여과에 의해 제거하였다. 트리에틸암모늄 아세테이트 (TEAA)의 첨가 후에, 조 올리고뉴클레오티드를 강음이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피 (SAX-HPLC)에 의해 분석하고 정제하였다. 수득한 올리고뉴클레오티드 용액을 풀링하여 농축시키고, 물로 탈염화하였다. 최종적으로, 올리고뉴클레오티드를 분말로 동결건조시켰다.
올리고뉴클레오티드 가이드 가닥을 2개 시험 화합물 중 각각에 대해 합성하였다. 하나의 가이드 가닥은 뉴클레오티드 위치 1 (즉, 5'-말단 뉴클레오티드)에 위치한 단일 2'-글루타티온-감수성 뉴클레오시드를 갖는다. 다른 가이드 가닥은 뉴클레오티드 위치 14에 위치한 단일 2'-글루타티온-감수성 뉴클레오시드를 갖는다. 2개 가이드 가닥은 표적 mRNA 서열에 상보적인 동일한 뉴클레오티드 서열을 함유하였다. 따라서, 시험 화합물 1 및 2에 대한 2개 올리고뉴클레오티드 가이드 가닥은 2'-글루타티온-감수성 뉴클레오시드 모이어티의 뉴클레오티드 위치를 제외하고는 동일하였다.
이어서 상기 기재된 프로세스를 반복하여 글루타티온-감수성 모이어티를 함유하지 않는 상보적 올리고뉴클레오티드 패신저 가닥을 제조하였다. 패신저 가닥은 포스포르아미다이트를 스페이서를 통해 폴리에틸렌 글리콜-GalNAc 리간드에 접합시킴으로써 추가로 변형시켰다. GalNAc 말단 폴리에틸렌 글리콜을 관련 기술분야에 알려진 방법을 사용하여 클릭 화학을 통해 패신저 가닥 중 테트라루프 구조의 4개 뉴클레오티드의 2'-탄소에 접합시켰다 (예를 들어, WO 2016/100401 참조).
2개 상보적 가닥 (가이드 및 패신저)의 각각을 1:1 몰비로 혼합하여 2개 dsRNAi 억제제 분자: 시험 화합물 1 및 시험 화합물 2를 수득함으로써 듀플렉스를 형성하였다. 도 1b 참조. 시험 화합물 1은 뉴클레오티드 위치 1에 2'-글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 22-염기 쌍 가이드 가닥 및 임의의 글루타티온-감수성 모이어티 없는 36-염기 쌍 패신저 가닥을 함유하며, 여기서 패신저 가닥은 폴리에틸렌 글리콜-GalNAc 리간드에 각각 접합되어 있는 테트라루프 중 4개 뉴클레오티드를 함유한다 (도 1b 참조). 시험 화합물 1은 또한 가이드 가닥의 5'-단부에서 5'-탄소에 유리 히드록실 기 (5'-OH)를 갖는다. 가이드 가닥의 뉴클레오티드 위치 1에서의 글루타티온-감수성 뉴클레오티드를 제외하고는, 시험 화합물 1 내 남아있는 뉴클레오티드는 2'-F 또는 2'-OMe 중 어느 하나로 비가역적으로 변형되었다.
시험 화합물 2는 뉴클레오티드 위치 14에 2'-글루타티온-감수성 모이어티를 갖는 22-염기 쌍 가이드 가닥 및 임의의 글루타티온-감수성 모이어티 없는 36-염기 쌍 패신저 가닥을 함유하며, 여기서 패신저 가닥은 폴리에틸렌 글리콜-GalNAc 리간드에 각각 접합되어 있는 테트라루프 중 4개 뉴클레오티드를 함유한다 (도 1b 참조). 가이드 가닥의 뉴클레오티드 위치 14에서의 글루타티온-감수성 뉴클레오티드를 제외하고는, 시험 화합물 2 내 남아있는 뉴클레오티드는 2'-F 또는 2'-OMe 중 어느 하나로 비가역적으로 변형되었다.
벌키한 2'-변형된 뉴클레오시드가 일반적으로 이중 가닥 RNAi 억제제 분자의 뉴클레오티드 위치 14에서 널리 허용되지 않고 (Zheng et al., FASEB Journal, 2013, 27(2):1-10), 2'-F 또는 2'-OMe와 같은 작은 관능성 모이어티가 바람직하게는 위치 14에서의 뉴클레오시드를 변형시키는데 사용되는 것으로 보고된 바 있다. 시험 화합물 2에서, 위치 14에서의 벌키한 2'-글루타티온-감수성 모이어티는 시토졸성 글루타티온에 의해 절단되어 2'-탄소에서의 훨씬 더 작은 히드록실 기를 산출하며, 이는 또한 해당 탄소 위치에서의 리보뉴클레오티드에 대한 천연 치환기일 수 있다. 이에 따라, 달리 글루타티온-감수성 모이어티가 시험 화합물 2로부터 방출되지 않는 한 시험 화합물 2는 RNA 억제 활성을 거의 내지 전혀 갖지 않을 것으로 예상되었다. 이와 같이, 시험 화합물 2는 글루타티온-감수성 모이어티의 생체내 제거에 대한 시험을 제공한다.
2개 대조군 이중 가닥 RNAi 억제제 분자 (대조군 화합물 A 및 대조군 화합물 B)를 또한 대조군 화합물 중 어떠한 뉴클레오티드도 글루타티온-감수성 모이어티를 포함하지 않는 것을 제외하고는 상기 기재된 바와 같이 제조하였다. 도 1a 참조. 대조군 화합물 내 모든 뉴클레오티드는 (글루타티온-감수성 모이어티로 변형된 위치 이외의) 시험 화합물과 동일한 패턴으로 2'-F 또는 2'-OMe로 비가역적으로 변형되었다. 대조군 화합물 A는 가이드 가닥의 5'-말단 뉴클레오티드의 5'-탄소에서 천연 포스페이트 (5'-PO4 2-)로 합성되었던 반면에, 대조군 화합물 B는 가이드 가닥의 5'-말단 뉴클레오티드의 5'-탄소에 유리 히드록실 기 (5'-OH)를 함유하였다. 대조군 화합물 A 및 B의 가이드 가닥은 동일한 뉴클레오티드 서열을 함유하였고, 따라서, 시험 화합물 1 및 2와 동일한 표적 mRNA 서열을 인식하였다.
실시예 3. 2'-가역적으로 변형된 뉴클레오시드 및 올리고뉴클레오티드의 방출 동역학
하기 반응식 7에서 제시된 바와 같이, 2'-탄소에 글루타티온-감수성 모이어티를 함유하는 가역적으로-변형된 뉴클레오시드 (우리딘)를 제조하였다. 2'-글루타티온-감수성 우리딘의 방출 연구는 변형된 뉴클레오시드를 pH 7.5에서 500-배 과량의 글루타티온 (5 mM 글루타티온)을 함유하는 PBS 완충제 중에 용해시킴으로써 수행하였다. 디술피드 방출 연구의 진행을 RP-HPLC에 의해 모니터링하였다. RP-HPLC는, 하기 반응식 7에 도시된, 중간체 종 "int. A" 및 "int. B"에 상응하는 2개 새로운 피크를 제시하였다. 중간체 종을, 하기 반응식 7에 제시된 바와 같이, 목적하는 우리딘 및 벤조티아졸론 방출 생성물로 서서히 전환시켰다.
하기 반응식 7에 제시된 바와 같이, 2'-글루타티온-감수성 우리딘에 대한 방출 메카니즘은 2-단계 반응을 통해 진행된다. 제1 단계는 글루타티온에 대한 노출을 빠르게 한 후에 디술피드 교환 반응이고, 30-60분 이내에 글루타티온 부가물에 대한 완전 전환을 생성한다. 초기 디술피드 절단은 2종의 중간체 "int. A" 및 "int. B"를 생성한다. 제2 단계는 O->S 아실 전달 반응을 통해 뉴클레오시드로부터 벤조티아졸론을 방출하기 위한 빠른 분자내 고리화이며, 이는 뉴클레오시드의 2'-위치에 히드록실 기를 남겨둔다. 벤조티아졸론 형성에 대한 반응 동역학적 데이터는 우리딘 형성의 2상 프로파일을 지지하였다. 벤조티아졸론의 고리화 및 방출 (유리 우리딘을 생성함)에 대한 반감기 (t ½)는 대략 4시간이었다. 도 2 참조.
Figure 112019027874923-pct00057
방출 속도를 또한 남아있는 시험 화합물 2의 백분율의 시간 경과를 제시하는, 도 3에 제시된 바와 같은, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드 (즉, 시험 화합물 2)에 대해 결정하였다. 500 당량의 글루타티온 (21 mg)을 pH 7.5에서 10 mM 포스페이트 완충제 (10 mL의 부피) 중 시험 화합물 2 (1 mg)에 첨가하였다. 시험 화합물 2 소멸의 속도를 RP-HPLC에 의해 모니터링하였다. 도 3에서 명백한 바와 같이, 반응은 2상이다. 시험 화합물 2로부터의 글루타티온-감수성 모이어티의 고리화 및 방출에 대한 반감기 (t½)는 대략 6.5시간 (약 400분)이었다. 도 3 참조.
실시예 4. 시험 화합물 1의 시험관내 효력
뮤린 간세포
표적 mRNA의 녹다운 발현에 대한 시험 화합물 1의 능력을 시험관내에서 시험하였다. 상기 언급된 바와 같이, 시험 올리고뉴클레오티드 및 대조군 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적 서열을 인식한다. 시험 화합물 1, 및 대조군 화합물 A 및 B를 제조업체의 프로토콜에 따라 96 웰 플레이트에서 리포펙타민(LIPOFECTAMINE)® RNAiMax (써모 피셔 사이언티픽 인크.(Thermo Fisher Scientific Inc.), 메릴랜드주 록빌)를 사용하여 뮤린 간세포 내로 역 형질감염시켰다. 시험 및 대조군 올리고뉴클레오티드의 최종 농도는 1000pM 내지 0.06pM 범위였다. 12000개 세포/웰을 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 48시간의 종료 시, 웰당 이스크립트(ISCRIPT)™ 용해 완충제 30μl를 첨가함으로써 세포를 용해시켰다. 용해물 22 μl을 새로운 플레이트로 옮기고, 제조업체의 프로토콜에 따라 cDNA를 만드는데 사용하였다. 정량적 PCR을 55℃에서 인간 SFR69 유전자 (hSFRS9-F569 (헥스(HEX)))로 정규화된 표적 서열로 수행하였다. 그래프를 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) (그래프패드 소프트웨어 인크.(GraphPad Software Inc.), 캘리포니아주 라호야)을 사용하여 플롯팅하였고, IC50 값을 계산하였다.
도 4는 48시간 후 지질 형질감염 검정에서의 상이한 농도의 시험 화합물 1의 효력을 도시한다. 대조군 화합물 A (가이드 가닥의 5'-말단 뉴클레오티드에 5'-천연 포스페이트를 가짐)는 약 8.7 pM의 IC50을 갖는 반면에, 대조군 화합물 B (가이드 가닥의 5'-말단 뉴클레오티드에 5'-히드록실을 가짐)는 약 24.5 pM의 IC50으로 표적 mRNA의 발현을 감소시키는데 덜 효과적이었다. 시험 화합물 1의 경우에, IC50은 약 13.5 pM이었다. 시험 화합물 1의 이러한 IC50 값은 대조군 화합물 A에 대해 보다 필적할만하며, 이는 시험 화합물 1의 가이드 가닥의 5'-말단 뉴클레오티드에서의 5'-히드록실이 시토졸에서 키나제에 의해 인산화되었다는 것을 시사한다. 시토졸에서의 시험 화합물 1의 가이드 가닥의 뉴클레오시드 위치 1의 2'-탄소에서의 글루타티온-감수성 모이어티의 방출은 5'-히드록실이 키나제 인산화를 보다 잘 받아들일 수 있도록 만들며, 이는 차례로 표적 mRNA 녹다운을 위한 가이드 가닥의 Ago2-매개 RISC 로딩을 용이하게 하여야 하는 것으로 예상된다.
원숭이 간세포
일차 원숭이 간세포를 라이프 테크놀로지 코포레이션(Life Technologies Corporation) (캘리포니아주 칼스배드)으로부터 수득하고, 해동시키고, 코닝(CORNING)® 바이오코트(BIOCOAT)™ 96 웰 플레이트에 제조업체의 프로토콜에 따라 플레이팅하였다. 4-6시간의 플레이팅 후에, 배지를 웰당 윌리암스 E 인큐베이션 배지 90μl로 대체하였다. 시험 화합물 1을 1μM의 농도로 출발하여 12.8pM까지 (5-배 감소) 연속적으로 희석하였다. 10μl의 시험 화합물 1을 리포펙타민® (써모 피셔 사이언티픽, 인크.)의 부재 하에 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 인큐베이션하고, RNA 표적의 녹다운을 24시간째에 시험하였다. 24시간의 종료 시, 표적 RNA를 추출하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 SV96 총 RNA 단리 시스템 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨)을 사용하여 정제하였다. cDNA를 고용량 cDNA 역전사 키트 (어플라이드 바이오시스템즈 코포레이션(Applied Biosystems Corporation))를 사용하여 제조하였다. 정량적 PCR을 60℃에서 호모 사피엔스 펩티딜 프롤릴 이소머라제 B PPIB로 정규화된 표적 서열로 수행하였다. 그래프를 그래프패드 프리즘 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어 인크.)를 사용하여 플롯팅하였고, IC50 값을 계산하였다. 도 5는 임의의 지질 형질감염제의 부재 하에 일차 원숭이 간세포에 전달된 상이한 농도의 시험 화합물 1의 24시간에서의 효력을 제시한다. 시험 화합물 1은 24시간째에 1.6 nM의 IC50을 가졌다.
실시예 5. 시험 화합물 1 및 2에 대한 생체내 효력 및 효과의 지속기간
시험 화합물 1 및 시험 화합물 2를 1 mg/kg 작업 용액으로 PBS에 희석하였다. PBS 희석과 동일한 날에, CD-1 암컷 마우스를 단일 1 mg/kg 용량의 시험 화합물 1, 시험 화합물 2, 또는 대조군 PBS 용액으로 피하로 주사하였다. 투여후 (제3, 10, 21 및 28일) 동물을 CO2에서의 안락사 후에 심장 천자에 의해 방혈시켰다. 간의 좌측 내측엽을 제거하고, 1-4 mm 펀치를 제거하고, 드라이 아이스 상의 96 웰 플레이트에 배치하였다. 모든 샘플을 수집한 후에, RNA 및 cDNA를 정량적 PCR (qPCR)을 위해 제조하였다. 모든 샘플을 삼중으로 제조하고, qPCR을 CFX384 터치(CFX384 TOUCH)™ 실시간 PCR 검출 시스템 (바이오라드 래보러토리즈, 인크.(BioRad Laboratories, Inc.), 캘리포니아주 허큘레스)을 사용하여 수행하였다. 이어서 모든 샘플을 PBS 처리된 대조군 동물로 정규화하고, 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 블롯팅하였다.
도 6은 시험 화합물 1의 생체내 지속기간 연구를 도시한다. 1 mg/kg으로 시험 화합물 1의 피하 주사는 제3일에 표적 RNA의 50% 초과의 녹다운을 생성하였다. 표적 RNA 녹다운의 증가된 수준을 제10일에 관찰하였으며, 이는 글루타티온-감수성 모이어티의 느린 방출이 키나제 인산화 및 표적 유전자 녹다운을 위한 후속 Ago-2 매개된 RISC 로딩을 보다 잘 받아들일 수 있는 올리고뉴클레오티드 기질을 발생시킨다는 것을 시사한다. 이들 결과는 글루타티온-감수성 모이어티를 dsRNAi 억제제 분자의 가이드 가닥의 위치 1에서의 뉴클레오시드의 2'-탄소에 접합시키는 것이 세포의 시토졸로의 전이 동안에 dsRNAi 억제제 분자를 안정화시키고, 시토졸에서 표적 RNA의 효과적인 녹다운을 용이하게 할 수 있으며, 여기서 올리고뉴클레오티드의 글루타티온-감수성 모이어티는 글루타티온의 존재 하에 제거된다는 것을 나타낸다.
도 7은 시험 화합물 2의 생체내 지속기간 연구를 도시한다. 상기 언급된 바와 같이, 시험 화합물 2를, 일반적으로 2'-탄소에서 벌키한 변형을 허용하지 않는 뉴클레오티드 위치인 가이드 가닥의 뉴클레오티드 위치 14에서의 2'-탄소에서 글루타티온-감수성 모이어티로 변형시킨다 (도 1b 참조). 이에 따라, 시험 화합물 2는, 달리 벌키한 글루타티온-감수성 모이어티가 시험 화합물 2로부터 방출되지 않는 한 RNA 녹다운 효과를 거의 내지 전혀 갖지 않을 것으로 예상되었다. 도 7에 제시된 바와 같이, 1 mg/kg으로 시험 화합물 2의 피하 주사는 제10일까지 표적 RNA의 약 50% 녹다운을 생성하였으며, 이는 시토졸에서의 글루타티온-감수성 모이어티의 느린 생체내 방출이 가이드 가닥의 뉴클레오티드 위치 14에서의 가역적, 글루타티온-감수성 모이어티 대신에 천연 2'-OH를 발생시킨다는 것을 시사한다.

Claims (97)

  1. 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드로서, 화학식 I에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하는 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드:
    Figure 112022098061721-pct00058

    여기서 X는 O이고;
    여기서 R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소이고;
    여기서 J는 O이며;
    여기서 B는 수소, 천연 핵염기, 변형된 핵염기 또는 범용 핵염기이고;
    여기서 U2는 O이고;
    여기서 W는 수소이거나, 포스페이트 기이거나, 또는 화학식 I에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기이고;
    여기서 I는 CH2이고;
    여기서 U1은 부재하거나, 수소이거나, 화학식 I에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기이거나, 또는 O이고, 여기서 U1 또는 W 중 적어도 하나는 화학식 I에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 뉴클레오티드간 연결기이며, 단 U1이 뉴클레오티드간 연결기인 경우에, A는 부재하고;
    여기서 A는 부재하거나, 수소, 포스페이트 기, 포스페이트 모방체 또는 포스포르아미데이트이고;
    여기서 L은 하기 화학식 IVe(ix)에 의해 나타내어진 글루타티온-감수성 모이어티임;
    Figure 112022098061721-pct00100
    .
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 뉴클레오티드간 연결기가 인 원자를 함유하는 것인 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드인 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드.
  5. 제4항에 있어서, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드가 이중 가닥 RNAi 억제제 분자이고, 제1 가닥이 센스 가닥을 포함하고, 제2 가닥이 안티센스 가닥을 포함하는 것인 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드.
  6. 제5항에 있어서, 화학식 I에 의해 나타내어진 적어도 하나의 뉴클레오티드가 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 위치 1, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 위치 14, 또는 센스 가닥의 Ago2 절단 부위에서의 또는 그에 인접한 뉴클레오티드 위치에 위치하는 것인 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드.
  7. 제5항에 있어서, 이중 가닥 RNAi 억제제 분자가 테트라루프를 함유하는 것인 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드.
  8. 제1항 또는 제3항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 단일 가닥 올리고뉴클레오티드인 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드.
  9. 제8항에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드가 단일 가닥 RNAi 억제제 분자인 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드.
  10. 제8항에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드가 통상적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 마이크로RNA, 안타고미르, 또는 압타머인 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드.
  11. 제1항 또는 제3항에 있어서, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드가 화학식 I에 의해 나타내어진 1-5개 뉴클레오티드를 함유하는 것인 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드.
  12. 제1항 또는 제3항에 있어서, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드가 변형되고, 글루타티온-감수성 모이어티로 변형되지 않은 모든 뉴클레오티드가 비가역적 변형으로 변형되는 것인 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드.
  13. 제5항에 따른 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하기 위한 제약 조성물.
  14. 화학식 VIII에 의해 나타내어진 뉴클레오시드 포스포르아미다이트:
    Figure 112022098061721-pct00081

    여기서 L1은 하기 화학식 IVe(ix)에 의해 나타내어진 글루타티온-감수성 모이어티이고;
    Figure 112022098061721-pct00101

    여기서 A1은 수소, 포스페이트 기, 포스페이트 모방체, 포스포르아미데이트, 포스포르아미다이트, 보호기, 또는 고체 지지체이고;
    여기서 W1은 포스포르아미다이트, 보호기, 고체 지지체, 또는 수소이고;
    여기서 U3은 O이고;
    여기서 적어도 A1은 포스포르아미다이트이고 U3은 O이거나, 또는 적어도 W1은 포스포르아미다이트이고 U2는 O이고;
    여기서 X는 O이고;
    여기서 R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소이고;
    여기서 J는 O이며;
    여기서 B는 수소, 치환 또는 비치환된 지방족, 천연 핵염기, 변형된 핵염기 또는 범용 핵염기이고;
    여기서 U2는 O이고;
    여기서 I는 CH2임.
  15. 삭제
  16. 제14항에 있어서,
    a) B가 천연 핵염기이고; W1이 포스포르아미다이트이고; A1이 보호기, 수소, 또는 고체 지지체이거나;
    b) B가 천연 핵염기이고; W1이 보호기, 수소 또는 고체 지지체이고; A1이 포스포르아미다이트이거나;
    c) B가 천연 핵염기이고; W1이 포스포르아미다이트이고; A1이 수소 또는 보호기이거나; 또는
    d) W1이 포스포르아미다이트이고; A1이 수소, 포스페이트 기, 포스페이트 모방체, 포스포르아미데이트, 보호기, 또는 고체 지지체인
    뉴클레오시드 포스포르아미다이트.
  17. 제14항 또는 제16항에 있어서, 포스포르아미다이트가 화학식 -P(ORx)-N(Ry)2를 가지며, 여기서 Rx는 임의로 치환된 메틸, 2-시아노에틸 및 벤질로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 각각의 Ry는 임의로 치환된 에틸 및 이소프로필로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 뉴클레오시드 포스포르아미다이트.
  18. 하기 단계를 포함하는, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법:
    (a) 뉴클레오시드를 공유 연결을 통해 고체 지지체에 부착시키는 단계;
    (b) 제14항 또는 제16항에 따른 뉴클레오시드 포스포르아미다이트를 단계 (a)의 뉴클레오시드 상의 히드록실 기에 커플링시켜 그 사이에 인 뉴클레오시드 연결을 형성하며, 여기서 고체 지지체 상의 임의의 비커플링된 뉴클레오시드는 캡핑 시약으로 캡핑되는 것인 단계;
    (c) 상기 인 뉴클레오시드 연결을 산화 시약으로 산화시키는 단계; 및
    (d) 단계 (b) 내지 (c)를 제14항 또는 제16항에 따른 하나 이상의 후속 뉴클레오시드 포스포르아미다이트 또는 글루타티온-감수성 모이어티를 함유하지 않는 하나 이상의 후속 뉴클레오시드 포스포르아미다이트로 되풀이하여 반복하여, 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드를 형성하는 단계; 및
    (f) 임의로, 상기 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드를 상기 고체 지지체로부터 제거하는 단계.
  19. 제18항의 방법에 의해 제조된 글루타티온-감수성 올리고뉴클레오티드.
  20. 화학식 XI에 의해 나타내어진 글루타티온-감수성 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드:
    Figure 112022098061721-pct00083

    여기서 L2는 하기 화학식 IVe(ix)에 의해 나타내어진 글루타티온-감수성 모이어티이고;
    화학식 IVe(ix):
    Figure 112022098061721-pct00102

    여기서 X는 O이고;
    여기서 R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소이고;
    여기서 J는 O이며;
    여기서 B는 수소, 천연 핵염기, 변형된 핵염기 또는 범용 핵염기이고;
    여기서 U2는 O이고;
    여기서 W2는 수소이고;
    여기서 I는 CH2이고;
    여기서 U3은 O이고;
    여기서 A2는 수소, 포스페이트 기, 포스페이트 모방체, 또는 포스포르아미데이트이다.
  21. 삭제
  22. 제20항에 있어서,
    a) A2가 수소 또는 포스페이트 기이거나;
    b) B가 천연 핵염기이고; A2가 포스페이트 기 또는 포스페이트 모방체이거나;
    c) B가 천연 핵염기이고; A2가 수소이고; 여기서 글루타티온-감수성 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드가 이중 가닥 RNAi 억제제 분자의 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 위치 1에 위치하거나; 또는
    d) B가 천연 핵염기이고; A2가 수소이고; 여기서 글루타티온-감수성 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드가 이중 가닥 RNAi 억제제 분자의 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 위치 14에 위치하는 것인
    글루타티온-감수성 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드.
  23. 삭제
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